TW201808951A - 丙烯酸類衍生物及其製備方法和其在醫藥上的用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種通式(I)所示的丙烯酸類衍生物、其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，它們的製備方法，含有它們的藥物組合物，以及它們作為治療劑，特別是作為選擇性雌激素受體下調劑(SERD)的用途，其中通式(I)中的R1、R2、R3、R4的定義如說明書所述。

Description

丙烯酸類衍生物及其製備方法和其在醫藥上的用途
本發明屬於醫藥領域，具體涉及一種新的丙烯酸類衍生物、其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，它們的製備方法，含有它們的藥物組合物，以及它們作為治療劑、特別是作為雌激素受體拮抗劑或雌激素受體α下調劑的用途。
雌激素受體(estrogen receptor，ER)是配體啟動的轉錄調節蛋白，它通過與內源性雌激素的相互作用媒介轉導多種生物效應的誘導，內源性雌激素包括17β-雌二醇和雌酮。已發現ER具有兩種亞型雌激素受體α(ERα、ESR1和NR3A)和雌激素受體β(ERβ、ESR2和NR3b)。雌激素受體α和雌激素受體β是甾體激素受體的成員，其為細胞核受體家族中的一員。與細胞核受體的機構很相似，ERα是由6個功能結構域(命名為A-F)組成，為配體啟動的轉錄因數，因為在其與特定的配體結合後，包括內源性雌激素17β雌二醇(E2)，與基因組序列結合成複合物，即雌激素受體應答元件和共調節因數結合，來調節靶向基因的轉錄。ERα基因位於6q25.1，編碼595A蛋白，根據剪切位元點和轉錄轉錄起始點的不同，而得到不同的亞型。除了DNA結合域(域C)和配體結合域(域E)之外，受體還包含N-端(A/B)域，鉸鏈區(D，其連接C和E域)和碳端(F域)。ERα和ERβ的C和E結構域具有一致性，A/B，D和F域中一致性較低。兩種受體都與女性生殖道的調節和生長有關係，同時在中樞神經系統、心腦血管系統和骨代謝中也發揮著重要的作用。雌激素與受體結合可以導致多種細胞的變化，其調節機制可以劃分為兩種途徑：基因組和非基因組途徑。ER媒介轉導的基因組途徑包括雌激素受體二聚體的形成，與雌激素調控基因啟動子中的ERE的結合，媒介轉導其他調節 蛋白向啟動子的聚集，最後導致該基因mRNA水準的升高或降低。雌激素媒介轉導的非基因組途徑中，雌激素能過與存在於或鄰近ERs的細胞膜，甚至無ERs的細胞膜的雌激素結合蛋白進行反應。雌激素通過非基因組途徑導致的細胞反應，可以使細胞內的鈣離子和NO水準增加，以及多種細胞內激酶的啟動，包括MAPK、PI3K、PKA和PKC，使nER磷酸化而啟動。
約70%的乳腺癌患者中表達ER和/或黃體酮受體，表明此腫瘤細胞的生長為激素依賴性的，其他的腫瘤如卵巢癌和子宮內膜癌的生長也對ERα具有依賴性。對於這些疾病的治療可以通過各種方式來抑制ER信號傳導，包括拮抗配體和ER的結合，拮抗或下調ERα，阻斷雌激素的合成等。同時在內分泌腫瘤如腎上腺皮質腫瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲狀腺癌，消化道系統腫瘤如結腸癌、食管癌、肝癌和胰腺癌，以及肺癌中都表達ERα和ERβ。雖然上述的治療方法在ER陽性的腫瘤患者中起了一定的作用，但也會產生耐藥性，最近報導，ESR1的突變可能是轉移性ER陽性的乳腺癌患者產生耐藥性的原因之一(Toy et al.,Nat.Genetic 2013,45：1439-1445；Li,S.et al Cell Rep.4,1116-1130(2013))。然而論述的可能的耐藥性機制中，腫瘤的生長存在ER依賴性活性，因此通過選擇性下調ERα的機制提供了一種較好的方法來阻滯ERα活性媒介轉導早期的、轉移性和耐藥性的癌症。
目前已經公開了多個可作為選擇性雌激素受體下調劑(selective estrogen receptor downregulator(degrader)，SERD)的藥物，其中包括基因特克公司的GDC-0810和GDC-0927分別處於臨床II期和臨床I期；阿斯利康公司的AZD-9496，處於臨床I期，同時也公開了一系列的SERD的專利申請，包括WO2011156518、WO2012037410、WO2015082990等。但是，習知技術中的雌激素受體下調劑仍不夠令人滿意，為了獲得更好的效果和避免耐藥機制，仍有必要研究和開發新的雌激素受體α下調劑。
本發明的目的之一在於提供一種與習知技術結構不同的，具有雌激素受體拮抗作用的丙烯酸類衍生物。
因此，根據本發明的第一方面，本發明提供了一種通式(I)所示的化合物、其立體異構體、互變異構體、或者它們的可藥用鹽：
其中：R1和R2各自獨立地選自氫原子或鹵素，其中所述的鹵素優選為F；R3選自烷基，其中所述的烷基進一步被一個或多個鹵素的取代基所取代；R4各自獨立地選自鹵素、烷基、烷氧基、三氟甲基、氰基、-C(O)NR5R6、-C(O)R7、-SO2R7、-C(O)OR7或-NR5C(O)R6，其中所述的烷基或烷氧基任選進一步被一個或多個選自鹵素、-C(O)NR5R6、-C(O)R7、-SO2R7、-C(O)OR7或-NR5C(O)R6的取代基所取代；R5選自氫原子或烷基；R6選自氫原子、烷基、環烷基、芳基或雜芳基，其中所述的烷基、環烷基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代；或者，R5、R6與其相連接的原子一起形成4~8元雜環基，其中所述的雜環基任選進一步被一個或多個選自烷基、鹵素、羥基、氰基、硝基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代；R7選自氫原子、烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代；R8、R9和R10各自獨立地選自氫原子、烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基任選進一步被一 個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、羧酸或羧酸酯的取代基所取代；且n為1、2、3或4。
在本發明的另一實施方案中，通式(I)所述的化合物、其立體異構體、互變異構體、或者其的可藥用的鹽，其為通式(II)所述的化合物、其立體異構體、互變異構體、或者其的可藥用的鹽：
其中：R1、R2、R3、R4和n的定義如通式(I)中所述。
在本發明的一個優選實施方案中，通式(I)或(II)所述的化合物、或其立體異構體、互變異構體、或者它們的可藥用鹽，其中：所述的烷基優選為C1-C10烷基，更優選為C1-C6烷基，最優選為C1-C3烷基；所述的烷氧基優選為C1-C10烷氧基，更優選為C1-C6烷氧基，最優選為C1-C3烷氧基；所述的環烷基優選為C3-C12環烷基，更優選為C3-C8環烷基，最優選為C3-C6環烷基；所述的雜環基優選為C3-C10雜環基，更優選為C5-C7單環雜環基或者C7-C10雙環或三環雜環基；所述的芳基優選為C6-C10芳基，更優選為苯基和萘基；所述的雜芳基優選為5元-10元雜芳基，更優選為5至6元單環雜芳基或9至10元雙環雜芳基。
在本發明的一個實施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立體異構體、互變異構體、或者它們的可藥用鹽，其中R1和R2各自獨立地選自鹵素，其中所述鹵素優選為F。
在本發明的一個實施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立體異構體、互變異構體、或者它們的可藥用鹽，其中R3為C1-C4烷基，優選為異丙基， 其中所述的烷基進一步被一個或多個選自F、Cl、Br或I的取代基所取代，優選為F或Cl，更優選為F。
在本發明的一個實施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立體異構體、互變異構體、或者它們的可藥用鹽，其中R4各自獨立地選自C1-C4烷基、鹵素、烷氧基、三氟甲基或氰基。
在本發明的一個實施方案中，通式(I)或(II)所述化合物、其立體異構體、互變異構體、或者它們的可藥用鹽，其中：R1和R2各自獨立地選自鹵素，其中所述鹵素優選為F；R3選自鹵素取代的C1-C4烷基，優選為F取代C1-C4烷基；更優選為氟代異丙基；R4為C1-C4烷基、鹵素、烷氧基、三氟甲基或氰基。
本發明的典型化合物包括但不限於如表1所述化合物：
或其立體異構體、互變異構體、或者它們的可藥用鹽。
本發明的另一方面提供了通式(I)所述的化合物或其鹽的製備方法，包括以下步驟：
通式(Ia)化合物在鹼性條件下，在醋酸鈀和三鄰甲苯基膦存在下，與通式(1b)反應，得到通式(IB)化合物；通式(Ic)化合物與通式(Id)化合物在鹼性條件下反應，得到通式(IA)化合物；通式(IA)化合物與通式(IB)化合物在酸性條件下反應，進一步酯水解，得到通式(I)化合物；其中：X為鹵素，優選為溴；Ra為烷基；Rb為離去基團，優選為鹵素 和磺酸酯基，更優選為Br或甲磺酸酯基；R1~R4和n的定義如通式(I)中所述。
本發明的另一方面提供了通式(II)所述的化合物或其鹽的製備方法，包括以下步驟：
通式(IIa)化合物與通式(Id)化合物在鹼性條件下反應，得到通式(IIA)化合物；通式(IIA)化合物與通式(IB)化合物在酸性條件下反應，進一步酯水解，得到通式(II)化合物；其中：Ra為烷基；Rb為離去基團，優選為鹵素和磺酸酯基，更優選為Br或甲磺酸酯基；R1、R2、R3、R4和n的定義如通式(I)中所述。
上述製備方法中，提供酸性條件的試劑為無機酸或有機酸，無機酸優選自鹽酸、硫酸、磷酸，更優選為鹽酸；有機酸優選自甲酸、乙酸，更優選為乙酸。
上述製備方法中，鹼性條件由有機堿或無機堿提供，有機堿優選自二異丙基乙胺、二異丙胺、吡啶、三乙胺、呱啶、N-甲基呱嗪、4-二甲氨吡啶，更優選為二異丙胺和三乙胺；無機堿優選自碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸銫、氫氧化鈉、氫氧化鉀，更優選為碳酸鈉和氫氧化鈉。
更進一步，本發明提供一種藥物組合物，所述的藥物組合物包含有效劑量的通式(I)或(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，及可藥用的載體、賦形劑或它們的組合。該組合物任選進一步包括抗氧化劑或金屬螯合劑。
本發明提供一種通式(I)或(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，或其藥物組合物在製備在製備用於治療雌激素受體媒介轉導的疾病的藥物中的用途，其中所述的疾病優選為癌症，其中所述的癌症優選為乳腺癌和婦科癌症，其中所述的婦科癌症優選為卵巢癌和子宮內膜癌，其中所述的雌激素受體優選為雌激素受體α。
本發明提供一種通式(I)或(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，或其藥物組合物在製備選擇性雌激素受體下調劑中的用途，優選為雌激素受體α下調劑。
本發明提供一種通式(I)或(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，或其藥物組合物，其可以與一種或多種其他適宜的抗腫瘤藥物聯合用藥治療雌激素受體媒介轉導的疾病，其中所述的疾病為優選為癌症，其中所述的癌症優選為乳腺癌或婦科癌症，其中所述的婦科癌症優選為卵巢癌或子宮內膜癌，其中所述的雌激素受體優選為雌激素受體α，其中所述其他抗腫瘤藥物包括烷化劑、抗代謝類藥物、具有抗腫瘤活性的天然產物及其衍生物、細胞毒素類藥物或阻滯免疫細胞遷移類藥物。
適宜的其他抗腫瘤藥物包括烷化劑(但不限於氮芥、環乙亞胺(ethylenimine)衍生物、磺酸烷基酯、亞硝基脲和三氮烯)，例如烏拉莫司汀、氮芥、環磷醯胺、異環磷醯胺、美法侖、苯丁酸氮芥、呱泊溴烷、賽替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、鏈佐星、達卡巴嗪和替莫唑胺。
適宜的其他抗腫瘤藥物也包括例如抗代謝類藥物(包括但不限於葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物和腺苷脫氨酶抑制劑)，例如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫尿嘧啶、磷酸氟達拉濱、噴司他丁和吉西他濱。
適宜的其他抗腫瘤藥物還包括例如某些具有抗腫瘤活性的天然產物及其衍生物(例如長春花生物鹼、抗腫瘤抗生素、酶、淋巴因數等)，例如長春堿、長春新堿、長春醯胺、博來黴素、放線菌素D、柔紅黴素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、阿糖胞苷、紫杉醇、普卡黴素、去氧考福黴素、絲裂黴素-C、L-天冬醯胺酶、干擾素(尤其IFN-a)、依託泊苷和替尼泊苷。
適宜的其他抗腫瘤藥物還包括細胞毒素類藥物，所述細胞毒素類藥物包括諾維本、CPT-11、阿那曲唑、來曲唑、卡培他濱和屈洛昔芬、拓撲異構酶抑制劑、丙卡巴肼、米托蒽醌、鉑配位絡合物例如順鉑和卡鉑；生物反應調節物；生長抑制劑；抗激素治療藥物；亞葉酸；替加氟和造血生長因數也適用。
此外，適宜的其他抗腫瘤藥物還包括抗體治療藥物例如曲妥單抗、共同刺激性分子的抗體例如CTLA-4、4-1BB和PD-1或細胞因數的抗體 (IL-10，IGF-β等)；阻滯免疫細胞遷移的藥物，例如趨化因數受體拮抗劑，包括CCR2和CCR4；還包括增強免疫系統的藥物，例如輔藥或過繼T細胞轉移；抗癌疫苗，包括樹突細胞、合成肽、DNA疫苗和重組病毒。
本發明提供一種選擇性下調雌激素受體的方法，其中包括將通式(I)或(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，或其藥物組合物與雌激素受體相接觸，所述的雌激素受體優選為雌激素受體α。
本發明進一步提供了一種治療雌激素受體媒介轉導的疾病的方法，包括給有此需要的物件施用通式(I)或(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽或其藥物組合物。在所述治療方法中，所述雌激素受體優選為雌激素受體α；所述雌激素受體媒介轉導的疾病優選為癌症，其中所述癌症優選為乳腺癌和婦科癌症，所述婦科癌症優選為卵巢癌和子宮內膜癌。
本發明還涉及通式(I)或(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽、或其藥物組合物在治療雌激素受體媒介轉導的疾病中的應用，其中所述的疾病為癌症，其中所述的癌症優選為乳腺癌或婦科癌症，其中所述的婦科癌症優選為卵巢癌或子宮內膜癌，其中所述的雌激素受體優選為雌激素受體α。
本領域技術人士已知的安全有效的給予大多數化療藥物(抗腫瘤藥物)的方法。另外，它們的給藥標準在標準文獻中已有論述，如“physicians desk reference”(PDR,e.g.1996 edition,medical Economics Company,Montvale，NJ)中闡述了多種化療藥物的給藥方法，其公開內容通過引用結合到本文中。
除非另有說明，否則本發明在說明書和申請專利範圍中所使用的部分術語定義如下：
“烷基”當作一基團或一基團的一部分時是指包括C1-C20直鏈或者帶有支鏈的脂肪烴基團。優選為C1-C10烷基，更優選為C1-C6烷基，最優選為C1-C3烷基。烷基基團的實施例包括但不限於甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、 2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代或未取代的。
“環烷基”是指飽和或部分飽和的單環、稠環、橋環和螺環的碳環，即包括單環環烷基、稠環烷基、橋環烷基和螺環烷基。優選為C3-C12環烷基，更優選為C3-C8環烷基，最優選為C3-C6環烷基。單環環烷基的實施例包括但不限於環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等，優選環丙基、環己烯基。
“螺環烷基”指5至18元，兩個或兩個以上環狀結構，且單環之間彼此共用一個碳原子(稱螺原子)的多環基團，環內含有1個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子的芳香系統。優選為6至14元，更優選為7至10元。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺環烷基分為單螺、雙螺或多螺環烷基，優選為單螺和雙螺環烷基，優選為4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元。“螺環烷基”的非限制性實例包括但不限於：螺[4.5]癸基、螺[4.4]壬基、螺[3.5]壬基、螺[2.4]庚基。
“稠環烷基”指5至18元，含有兩個或兩個以上環狀結構彼此公用一對碳原子的全碳多環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子的芳香系統，優選為6至12元，更優選為7至10元。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠環烷基，優選為雙環或三環，更優選為5元/5元或5元/6元雙環烷基。“稠環烷基”的非限制性實例包括但不限於：二環[3.1.0]己基、二環[3.2.0]庚-1-烯基、二環[3.2.0]庚基、十氫化萘基或十四氫菲基。
“橋環烷基”指5至18元，含有兩個或兩個以上環狀結構，彼此共用兩個不直接相連接碳原子的全碳多環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子的芳香系統，優選為6至12元，更優選為7至10元。優選為6至14元，更優選為7至10元。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋環烷基，優選為雙環、三環或四環，更有選為雙環或三環。“橋環烷基”的非限制性實例包括但不限於：(1s,4s)-二環[2.2.1]庚基、二環[3.2.1]辛基、(1s,5s)-二環[3.3.1]壬基、二環[2.2.2]辛基、(1r,5r)-二環[3.3.2]癸基。
所述環烷基環可以稠合於芳基、雜芳基或雜環基環上，其中與母體結 構連接在一起的環為環烷基，非限制性實例包括茚滿基、四氫萘基、苯並環庚烷基等。環烷基可以是任選取代的或未取代的。
“雜環基”、“雜環”或“雜環的”在本申請中可交換使用，都是指非芳香性雜環基，其中一個或多個成環的原子是雜原子，如氧、氮、硫原子等，包括單環、稠環、橋環和螺環，即包含單環雜環基、橋雜環基、稠雜環基和螺雜環基。優選具有5至7元單環或7至10元雙-或三環，其可以包含1，2或3個選自氮、氧和/或硫中的原子。“雜環基”的實例包括但不限於嗎啉基，硫代嗎啉基，四氫吡喃基，1，1-二氧代-硫代嗎啉基，呱啶基，2-氧代-呱啶基，吡咯烷基，2-氧代-吡咯烷基，呱嗪-2-酮，8-氧雜-3-氮雜-雙環[3.2.1]辛基和呱嗪基。雜環基可以是取代或未取代的。
“螺雜環基”指5至18元，兩個或兩個以上環狀結構，且單環之間彼此共用一個原子的多環基團，環內含有1個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子的芳香系統，其中一個或多個環原子選自氮、氧或S(O)m(其中m選自0、1或2)的雜原子，其餘環原子為碳。優選為6至14元，更優選為7至10元。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺雜環基分為單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，優選為單螺雜環基和雙螺雜環基。更優選為4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元單螺雜環基。“螺雜環基”的非限制性實例包括但不限於：1,7-二氧雜螺[4.5]癸基、2-氧雜-7-氮雜螺[4.4]壬基、7-氧雜螺[3.5]壬基和5-氧雜螺[2.4]庚基。
“稠雜環基”指含有兩個或兩個以上環狀結構彼此公用一對原子的全碳多環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子的芳香系統，，其中一個或多個環原子選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。優選為6至14元，更優選為7至10元。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，優選為雙環或三環，更優選為5元/5元或5元/6元雙環稠雜環基。“稠雜環基”的非限制性實例包括但不限於：八氫吡咯並[3,4-c]吡咯基、八氫-1H-異吲哚基，3-氮雜二環[3.1.0]己基，八氫苯並[b][1,4]二噁英(dioxine)。
“橋雜環基”指5至14元，5至18元，含有兩個或兩個以上環狀結構，彼此共用兩個不直接相連接的原子的多環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子的芳香系統，其中一 個或多個環原子選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。優選為6至14元，更優選為7至10元。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，優選為雙環、三環或四環，更有選為雙環或三環。“稠雜環基”的非限制性實例包括但不限於：2-氮雜二環[2.2.1]庚基，2-氮雜二環[2.2.2]辛基和2-氮雜二環[3.3.2]癸基。
所述雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基。雜環基可以是任選取代的或未取代的。
“芳基”是指含有一個或者兩個環的碳環芳香系統，其中所述環可以以稠合的方式連接在一起。術語“芳基”包括比如苯基、萘基、四氫萘基的芳香基團。優選芳基為C6-C10芳基，更優選芳基為苯基和萘基，最優選為苯基。芳基可以是取代或未取代的。所述“芳基”可與雜芳基、雜環基或環烷基稠合，其中與母體結構連接在一起的為芳基環，非限制性實例包括但不限於：
“雜芳基”是指芳香族5至6元單環或9至10元雙環，其可以包含1至4個選自氮、氧和/或硫中的原子。“雜芳基”的實施例包括但不限於呋喃基，吡啶基，2-氧代-1,2-二氫吡啶基，噠嗪基，嘧啶基，吡嗪基，噻吩基，異噁唑基，噁唑基，噁二唑基，咪唑基，吡咯基，吡唑基，三唑基，四唑基，噻唑基，異噻唑基，1,2,3-噻二唑基，苯並間二氧雜環戊烯基，苯並咪唑基，吲哚基，異吲哚基，1,3-二氧代-異吲哚基，喹啉基，吲唑基，苯並異噻唑基，苯並噁唑基和苯並異噁唑基。雜芳基可以是取代或未取代的。所述雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，非限制性實例包括但不限於：
“烷氧基”是指(烷基-O-)的基團。其中，烷基見本文有關定義。C1-C6的烷氧基為優先選擇。其實例包括，但不限於：甲氧基、乙氧基、正丙氧 基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基等。
“羥基”指-OH基團。
“鹵素”是指氟、氯、溴和碘，優選氯、溴和碘。
“氨基”指-NH2。
“氰基”指-CN。
“硝基”指-NO2。
“苄基”指-CH2-苯基。
“羧基”指-C(O)OH。
“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基的定義如上所述。
“磺酸酯基”指-S(O)2O(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基的定義如上所述。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，優選為最多5個，更優選為1~3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(通過實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
本說明書所述的“取代”或“取代的”，如無特別指出，均是指可被一個或多個選自以下的基團取代：烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、鹵素、疏基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、氨基、鹵代烷基、羥烷基、羧基、羧酸酯基、-NR5R6、-C(O)NR5R6、-C(O)R7、-SO2R7、-C(O)OR7或-NR5C(O)R6，其中，R5選自氫原子或烷基；R6選自氫原子、烷基、環烷基、芳基或雜芳基，其中所述的烷基、環烷基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代；或者，R5、R6與其相連接的原子一起形成4~8元雜環基，其中所述的雜環基任選進一步被一個或多個選自烷基、鹵素、羥基、氰基、硝基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代； 其中，R7選自氫原子、烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代；其中，R8、R9和R10各自獨立地選自氫原子、烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、羧酸或羧酸酯的取代基所取代。
“可藥用的鹽”是指上述化合物能保持原有生物活性並且適合於醫藥用途的某些鹽類。本發明化合物的可藥用的鹽可以為金屬鹽、與合適的酸形成的胺鹽，金屬鹽優選鹼金屬、鹼土金屬鹽，合適的酸包括無機酸和有機酸，例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、檸檬酸、乙磺酸、富馬酸、葡糖酸、谷氨酸、氫溴酸、鹽酸、羥乙磺酸、乳酸、蘋果酸、馬來酸、扁桃酸、甲磺酸、硝酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、對甲苯磺酸等。特別優選的是鹽酸、氫溴酸、磷酸和硫酸，最優選的是鹽酸鹽。
“藥物組合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
圖1為測試例7中實施例4化合物和AZD-9496對乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠腫瘤生長抑制率圖。
以下結合實施例進一步描述本發明，應當理解的是，這些實施例並不構成對本發明之發明範圍的限制。
製備實施例
以下實施例給出了本發明代表性化合物的製備及相關結構鑒定資料。
1H NMR圖譜是用Bruker儀器(400MHz)測定而得，化學位移用ppm 表示。使用四甲基矽烷內標準(0.00ppm)。1H NMR的表示方法：s=單峰，d=雙重峰，t=三重峰，m=多重峰，br=變寬的，dd=雙重峰的雙重峰，dt=三重峰的雙重峰。若提供偶合常數時，其單位為Hz。
質譜是用LC/MS儀測定得到，離子化方式可為ESI或APCI。
薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)
使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm。
柱層析使用煙臺黃海矽膠200~300目矽膠為載體。
在下列實例中，除非另有指明，所有溫度為攝氏溫度；除非另有指明，各種起始原料和試劑來自市售或者是根據已知的方法合成，市售原料和試劑均不經進一步純化直接使用；除非另有指明，市售廠家包括但不限於Aldrich Chemical Company，ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organics，廣贊化工科技有限公司，景顏化工科技有限公司和上海常豐生物科技有限公司等。
CD3OD：氘代甲醇。
CDCl3：氘代氯仿。
DMSO-d6：氘代二甲基亞碸。
氬氣氛由反應瓶連接一個約1L容積的氬氣氣球提供。
若實施例中無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。
實施例1
(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
第一步
(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯
將4-溴-2,6-二氟苯甲醛1a(6.5g，75.0mmol，根據WO2014191726公開的方法製備得到)，三乙胺(21.0ml，150.0)，醋酸鈀(840mg，3.75mmol)和三鄰甲苯基膦(1.96g，7.50mmol)溶於100mL二甲基甲醯胺中，攪拌下加入丙烯酸甲酯1b(10.0mL，112.5mmol)，反應液加熱至100℃，反應20小時。將反應液冷卻，將體系溶劑濃縮至幹，加入水(200mL)，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，合併的有機相依次用1N鹽酸(200mL)，飽和食鹽水洗滌(20mL×2)，無水硫酸鈉乾燥，過濾，減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：環己烷和乙酸乙酯體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯1c(10.0g，黃色固體)，產率：59%。
MS m/z(ESI)：227.2[M+1]
第二步
2-氟-2-甲基丙-1-醇
將2-氟-2-甲基丙酸甲酯1d(24.0g，200.0mmol)溶於500mL乙醚中，冷卻至0℃，分批加入氫化鋁鋰(9.10g，240.0mmol)，持續1.5小時，加完後在0℃反應1.5小時。向反應液中依次加入9mL水、9mL氫氧化鈉溶液(15%)和18mL水淬滅反應，攪拌15分鐘，加入無水硫酸鎂(30.0g)乾燥，攪拌15分鐘，過濾，濾餅用乙醚洗滌，濾液減壓濃縮，得到2-氟-2-甲基丙-1-醇1e(12.6g，無色液體)，產率：68%。
第二步
2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯
將2-氟-2-甲基丙-1-醇1e(12.6g，137.0mmol)溶於295mL二氯甲烷(氫化鈣乾燥過)中，冷卻至-10℃，滴加三氟甲磺酸酐(24.3mL，144.0mmol)和吡啶(13.2mL，164.0mmol)，然後在0℃反應1.5小時。向反應液中依次用2N鹽酸溶液(200mL x2)和水(200mL x2)洗滌，無水硫酸鎂乾燥，過濾，減壓濃縮，得到2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(18.2g，紅色油狀物)，產率：59%。
第三步
(Z)-4-甲基-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚
將4-甲基-1H-吲哚-3-甲醛1g(1.0g，6.3mmol)、14.7mL硝基乙烷、乙酸銨(243mg，3.15mmol)溶於6.3mL乙酸中，氬氣保護下，110℃反應3小時。反應液減壓濃縮，加入20mL碳酸氫鈉溶液，用乙酸乙酯(20mL x3)萃取，加入無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到(Z)-4-甲基-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚1h(1.0g，黃色固體)，產率：73.5%。
MS m/z(ESI)：217.0[M+1]
第四步
1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-胺
將氫化鋁鋰(0.70g，18.5mmol)溶於24mL無水四氫呋喃中，冰浴下緩慢加入(Z)-4-甲基-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚1h(1.0g，4.6mmol)6mL溶於四氫呋喃的溶液，然後加熱至回流反應6小時。冰浴下，向反應液中依次加入0.7mL水、0.7mL氫氧化鈉溶液(15%)和1.4mL水淬滅反應， 無水硫酸鎂乾燥，過濾，過濾，減壓濃縮，得到1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-胺1i(728mg，類白色固體)，產率：84%。
MS m/z(ESI)：189.0[M+1]
第五步
2-氟-2-甲基-N-(1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-基)丙-1-胺
氬氣保護下，將1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-胺1i(258mg,1.37mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(369mg,1.64mmol)溶和二異丙基乙胺(0.34mL,2.05mmol)於3mL1,4二氧六環中，加熱至105℃反應10小時，冷卻至室溫，減壓濃縮除去溶劑，加入用25mL乙酸乙酯，依次用水(15mL)和飽和氯化鈉溶液(15mL)洗滌，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：二氯甲烷：甲醇體系)，得到2-氟-2-甲基-N-(1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-基)丙-1-胺1j(679mg，褐色油狀物)，產率：67%。
MS m/z(ESI)：263.0[M+1]
第六步
(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
氬氣保護下，將2-氟-2-甲基-N-(1-(4-甲基-1H-吲哚-3-基)丙-2-基)丙-1-胺1j(527mg,2.0mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯1c(454mg,2.0mmol)和乙酸(0.492mL，4.0mmol)溶於5mL甲苯中，80℃反應10小時，冷卻至室溫，減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：石油醚：乙酸乙酯體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯1k(773mg，紅色油狀物)，產率：82%。
MS m/z(ESI)：471.0[M+1]
第七步
(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
將(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡 咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯1k(773mg,1.64mmol)溶於15mL四氫呋喃和甲醇(V/V=2/1)的混合溶液，緩慢加入7.5M氫氧化鈉溶液2.2mL，室溫反應12小時，用2N鹽酸溶液調反應液pH=7，減壓濃縮除去溶劑，用2M鹽酸調節溶液pH=2，分層，水相用乙酸乙酯(20mL)萃取，合併有機相，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液在減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：二氯甲烷：甲醇體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,5二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸1(260mg，淡黃色固體)，產率：35%。
MS m/z(ESI)：455.0[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=1.04-1.13(m,5 H)1.17(d,J=9.03Hz,3 H)1.24(s,2 H)2.29-2.42(m,1 H)2.58(s,3 H)2.77-2.92(m,2 H)3.15(d,J=11.29Hz,1 H)3.46(d,J=6.02Hz,1 H)5.22(s,1 H)6.62-6.70(m,2 H)6.84(t,J=7.65Hz,1 H)6.98(d,J=8.03Hz,1 H)7.45(d,J=10.54Hz,2 H)7.53(d,J=16.06Hz,1 H)10.50(s,1 H).
實施例2
(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
第一步
(Z)-6-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚
將6-氟-1H-吲哚-3-甲醛2a(1.0g，6.1mmol)、14.2mL硝基乙烷、乙酸銨(235mg，3.05mmol)溶於6.0mL乙酸中，氬氣保護下，110℃反應6小時。反應液減壓濃縮，加入20mL乙酸乙酯，用飽和碳酸氫鈉溶液(20mL)洗滌，水相用乙酸乙酯(15mL)萃取，合併無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到(Z)-6-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚2b(1.31g，褐色固體)，產率：98%。
第二步
1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺
將氫化鋁鋰(0.95g，23.6mmol)溶於20mL無水四氫呋喃中，冰浴下，緩慢加入(Z)-6-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚2b(1.31g，5.9mmol)溶於10mL四氫呋喃的溶液，然後加熱至回流反應6小時。向反應液中依次加入0.95mL水、0.95mL氫氧化鈉溶液(15%)和1.8mL水淬滅反應，無水硫酸鎂(3.0g)攪拌15分鐘，過濾，減壓濃縮，得到1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺2c(1.20g，褐色油狀物)，產率：100%。
MS m/z(ESI)：193.0[M+1]
第三步
2-氟-N-(1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺
氬氣保護下，將1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺2c(1.20g,6.20 mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(1.67g,7.44mmol)溶和二異丙基乙胺(1.50mL,9.30mmol)於12mL1,4二氧六環中，加熱至105℃反應10小時，冷卻至室溫，減壓濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：二氯甲烷：甲醇體系)，得到2-氟-N-(1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺2d(1.65g，褐色油狀物)，產率：100%。
MS m/z(ESI)：267.0[M+1]
第四步
(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
氬氣保護下，將2-氟-N-(1-(6-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺2d(1.65g,6.20mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯1c(1.27g,5.63mmol)和乙酸(0.645mL，11.3mmol)溶於10mL甲苯中，80℃反應5小時，冷卻至室溫，減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：石油醚：乙酸乙酯體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯2e(1.00g，類白色固體)，產率：38.5%。
MS m/z(ESI)：474.9[M+1]
第五步
(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
將(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯2e(1.00g,2.10mmol)溶於19.5mL四氫呋喃和甲醇(V/V=2/1)的混合溶液，緩慢加入7.5M氫氧化鈉溶液2.8mL，室溫反應3小時，用2N鹽酸溶液調反應液pH=6~7，減壓濃縮除去溶劑，加入10mL水和20mL乙酸乙酯，用2M鹽酸調節溶液pH=2，分層，水相用乙酸乙酯(15mL x2)萃取，合併有機相，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液在減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：石油醚：乙酸乙酯體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(7-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸2(180 mg，淡黃色固體)，產率：18.6%。
MS m/z(ESI)：460.9[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=12.60(br.s.,1 H),10.71(s,1 H),7.54(d,J=16.1Hz,1 H),7.46(d,J=10.5Hz,2 H),7.39(dd,J=5.6,8.4Hz,1 H),6.95(dd,J=2.0,10.0Hz,1 H),6.85-6.77(m,1 H),6.67(d,J=15.8Hz,1 H),5.19(s,1 H),3.49(d,J=5.5Hz,1 H),2.93-2.80(m,2 H),2.56(dd,J=4.4,15.4Hz,1 H),2.40-2.27(m,1 H),1.24-1.16(m,3 H),1.16-1.08(m,3 H),1.04(d,J=6.5Hz,3 H).
實施例3
(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
第一步
(Z)-5-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚
將5-氟-1H-吲哚-3-甲醛3a(1.0g，6.1mmol)、14.2mL硝基乙烷、乙酸銨(235mg，3.05mmol)溶於6.0mL乙酸中，氬氣保護下，110℃反應6小時。反應液減壓濃縮，加入20mL乙酸乙酯，用飽和碳酸氫鈉溶液(15mL)洗滌，水相用乙酸乙酯(15mL)萃取，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到(Z)-5-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚3b(1.30g，褐色固體)，產率：97%。
第二步
1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺
將氫化鋁鋰(0.90g，23.6mmol)溶於30mL無水四氫呋喃中，冰浴下，緩慢加入(Z)-5-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚3b(1.30g，5.9mmol)溶於10mL四氫呋喃的溶液，然後加熱至回流反應6小時。向反應液中依次加入0.90mL水、0.90mL氫氧化鈉溶液(15%)和1.8mL水淬滅反應，無水硫酸鎂(3.0g)攪拌15分鐘，過濾，減壓濃縮，得到1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺3c(1.18g，褐色油狀物)，產率：100%。
MS m/z(ESI)：193.0[M+1]
第三步
2-氟-N-(1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺
氬氣保護下，將1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺3c(1.18g,6.20mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(1.67g,7.44mmol)溶和二異丙基乙胺(1.50mL,9.30mmol)於12mL1,4二氧六環中，加熱至105℃反應10小時，冷卻至室溫，減壓濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：二氯甲烷：甲醇體系)，得到2-氟-N-(1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺3d(1.155g，褐色油狀物)，產率：70%。
MS m/z(ESI)：267.0[M+1]
第四步
(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
氬氣保護下，將2-氟-N-(1-(5-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺3d(1.155g,4.34mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯1c (0.98g,5.63mmol)和乙酸(0.52g，8.68mmol)溶於10mL甲苯中，85℃反應5小時，冷卻至室溫，減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：石油醚：乙酸乙酯體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯3e(0.95g，黃色泡沫狀固體)，產率：47.5%。
MS m/z(ESI)：474.9[M+1]
第五步
(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
將(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯3e(0.95g,2.00mmol)溶於19.5mL四氫呋喃和甲醇(V/V=2/1)的混合溶液，緩慢加入7.5M氫氧化鈉溶液2.7mL，室溫反應2小時，用2N鹽酸溶液調反應液pH=6~7，減壓濃縮除去溶劑，加入10mL水和20mL乙酸乙酯，用2M鹽酸調節溶液pH=2，分層，水相用乙酸乙酯(15mL x2)萃取，合併有機相，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液在減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：石油醚：乙酸乙酯體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(6-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸3(320mg，淡黃色固體)，產率：34.4%。
MS m/z(ESI)：460.9[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=12.61(br.s.,1 H),10.70(s,1 H),7.54(d,J=16.1Hz,1 H),7.47(d,J=10.5Hz,2 H),7.19-7.14(m,2 H),6.87-6.80(m,1 H),6.67(d,J=16.1Hz,1 H),5.21(s,1 H),3.50(d,J=5.3Hz,1 H),2.93-2.81(m,2 H),2.57(d,J=4.3Hz,1 H),2.41-2.27(m,1 H),1.24-1.16(m,3 H),1.16-1.08(m,3 H),1.04(d,J=6.5Hz,3 H).
實施例4
(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫 -1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
第一步
(Z)-4-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚
將4-氟-1H-吲哚-3-甲醛4a(1.0g，6.1mmol)、14.2mL硝基乙烷、乙酸銨(235mg，3.05mmol)溶於6.0mL乙酸中，氬氣保護下，110℃反應6小時。反應液減壓濃縮，加入20mL乙酸乙酯，用飽和碳酸氫鈉溶液(15mL)洗滌，水相用乙酸乙酯(15mL)萃取，合併有機相，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，得到(Z)-4-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚4b(1.374g，棕色固體)，產率：100%。
第二步
1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺
將氫化鋁鋰(0.95g，25.0mmol)溶於20mL無水四氫呋喃中，冰浴下緩慢加入(Z)-4-氟-3-(2-硝基丙-1-烯-1-基)-1H-吲哚4b(1.374g，6.20mmol)溶於10mL四氫呋喃的溶液，然後加熱至回流反應6小時。向反應液中依次加入0.95mL水、0.95mL氫氧化鈉溶液(15%)和19mL水淬滅反應， 無水硫酸鎂(5.0g)攪拌15分鐘，過濾，用四氫呋喃(5mL x3)洗滌濾餅，濾液減壓濃縮，得到1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺4c(1.20g，褐色油狀物)，產率：100%。
MS m/z(ESI)：193.0[M+1]
第三步
2-氟-N-(1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺
氬氣保護下，將1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺4c(1.20g,6.20mmol)、2-氟-2-甲基丙基三氟甲磺酸酯1f(1.67g,7.44mmol)溶和二異丙基乙胺(1.50mL,9.30mmol)於12mL1,4二氧六環中，加熱至105℃反應10小時，冷卻至室溫，減壓濃縮，加入20mL乙酸乙酯溶解，依次用水(15mL)和飽和氯化鈉溶液(15mL)洗滌，無水硫酸鎂乾燥，過濾，減壓濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：二氯甲烷：甲醇體系)，得到2-氟-N-(1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺4d(1.07g，褐色油狀物)，產率：65%。
MS m/z(ESI)：267.0[M+1]
第四步
(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
(E)-3-(3,5-二氟-4-((1S,3S)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
氬氣保護下，將2-氟-N-(1-(4-氟-1H-吲哚-3-基)丙烷-2-基)-2-甲基丙烷-1-胺4d(1.07g,4.00mmol)、(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯1c(0.90g,4.00mmol)和乙酸(0.46mL，8.00mmol)溶於9mL甲苯中，85℃反應7小時。冷卻至室溫，減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：石油醚：乙酸乙酯體系)，所得油狀物加入10mL二氯甲烷中緩慢攪拌，有大量固體析出，過濾，濾餅用少量冰冷的二氯甲烷洗滌，濾餅乾燥，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(0.68g，白色固體)，產率：36%，通過臨界流體色譜(SFC)法，用製備設備和手性柱對手性異構體 進行拆分(手性柱ChiralCel OJ,250×30mm I.D.50mL/min；流動相A：CO2；B：甲醇)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯4e(325.68mg，白色固體)和(E)-3-(3,5-二氟-4-((1S,3S)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯4f(313.33mg，白色固體)。
MS m/z(ESI)：474.9[M+1]
第五步
(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
將(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯4e(325.68mg,0.686mmol)溶於6mL四氫呋喃和甲醇(V/V=2/1)的混合溶液，緩慢加入7.5M氫氧化鈉溶液0.9mL，室溫反應1小時，用2N鹽酸溶液調反應液pH=6~7，減壓濃縮除去溶劑，加入5mL水和10mL乙酸乙酯，用2M鹽酸調節溶液pH=2，分層，水相用乙酸乙酯(5mL x2)萃取，合併有機相，無水硫酸鎂乾燥，過濾，濾液在減壓下濃縮，得到的殘留物通過矽膠柱層析進一步分離純化(洗脫劑：石油醚：乙酸乙酯體系)，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-5-氟-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡咯並[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸4(295mg，淡黃色固體)，產率：93%。
MS m/z(ESI)：460.9[M+1]
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=10.92(br.s.,1 H),7.54(d,J=16.1Hz,1 H),7.47(d,J=10.5Hz,2 H),7.05-6.99(m,1 H),6.98-6.91(m,1 H),6.73-6.64(m,2 H),5.22(br.s.,1 H),3.47(d,J=5.0Hz,1 H),3.15-2.99(m,1 H),2.93-2.81(m,1 H),2.71(dd,J=4.1,15.2Hz,1 H),2.41-2.29(m,1 H),1.18(br.s.,3 H),1.16-1.09(m,3 H),1.07(d,J=6.5Hz,3 H).
生物學評價
測試例1 雌激素受體ERα配位分析
本發明利用Lantha ScreenTM時控螢光共振能量轉移技術(TR-FRET)對化 合物和分離得到的雌激素受體ERα配體作用域之間的競爭性配位作用進行評價。在TR-FRET配位評價技術中用的螢光團(Fluormone ES2，產品序號P2645)和重組人雌激素受體ERα配體作用域(產品序號PV4543)是從Invitrogen公司購買。本測試的設計原理如下，雌激素受體ERα-LBD(GST)和含有螢光團的配體形成一個受體/螢光團複合物，然後加入鋱(Tb)標記的抗GST抗體(產品序號PV3551)，通過和受體上的GST連結來實現受體的間接螢光標記，通過檢測螢光標記ERα上的發色團(Tb-抗GST抗體)和螢光配體(Fluormone ES2)之間的TR-FRET效應的減弱來評價測試化合物和螢光配體同受體之間的競爭性配位能力。採用如下的樣品製備和測試方法對合成化合物進行了上述測試。所用的儀器為Beckman Coulter BioPAPTR FRD微流動工作儀。
(1)將120nL測試化合物通過超聲分散到黑色小容量384孔分析板。
(2)在ES2的緩衝液中製備1x ER α-LBD/Tb-抗GST抗體複合物並在其中培養20分鐘。
(3)測試之前往上述ER α-LBD/Tb-抗GST抗體複合物溶液中再加入1x ES2待用。
(4)將步驟3製備的ER α-LBD/Tb-抗GST抗體複合物溶液12μL加入到分析板孔中。
(5)將分析板避光保存，在室溫下培養一個小時。
(6)在337nm的激發光下，用BMG Phera STAR檢測490nm和520nm兩個波段的發射光。
用Labcyte Echo550將在微板上配製好的各種不同濃度(10mM,0.1mM,1μM和10nM)的測試化合物轉移到分析板上。每個測試化合物的120nL的DMSO溶液被加入到分析板孔中，十二個不同濃度被分別測試(100,29.17,10.42,2.083,1,0.292,0.104,0.02083,0.01,0.0029,0.00104,0.001μM)。得到的TR-FRET原始螢光測試資料借助於Origin或是Genedata等資料處理軟體得到擬合曲線。採用每個化合物的半抑制濃度IC50來表徵測試化合物與雌激素受體ERα的競爭性配位作用。IC50代表螢光團(ES2)與雌激素受體配位作用下降50%時所推算的測試化合物濃度，測定的IC50如表2所示。
測試例2 MCF-7細胞ERα下調降解測試
本發明優選化合物對ERα蛋白水準的下調作用是在人體管乳腺癌細胞株MCF-7中通過免疫螢光分析來評價的。實驗所用到的MCF-7細胞是直接從冷凍細胞(約5x106個)復蘇過來用的。從Sigma購買的MCF-7冷凍細胞株(Sigma D5921)是保存在2mM L-谷氨酸的DMEM培養液中。在復蘇的MCF-7細胞中加入5%(v/v)Charcoal/Dextran處理過的牛血清胚胎細胞，並用Coulter Counter來測定細胞濃度。測試所用的細胞用培養液稀釋到3.75x104個/mL，移取40uL/孔上述細胞液到黑色透明底的384孔板上，然後孔板在37℃,5%的CO2下培養過夜。10mM的測試化合物溶液被用於不同濃度測試液(10mM,0.1mM,1μM,0.01μM)的配製。往各種不同濃度的測試化合物和MCF-7細胞培養液(40μL)中加入20μL的11.1%(v/v)的甲醛水溶液(磷酸PBS緩衝液)，最後溶液中甲醛的濃度為3.7%(v/v)。細胞在室溫下固定20分鐘後，用250μL的PBS/Proclin洗兩次，再加入40μL的PBS/Proclin後於4℃下冷藏。蛋白的免疫染色分析法是用自動AutoElisa試劑盒完成的。從各個板孔中移取PBS/Proclin液，然後加入40μL含0.5%TweenTM 20(v/v)的PBS進行細胞透性化處理，一小時後，孔板用250μL的PBS/0.05% Tween 20/Proclin清洗三遍，加入20μL的ERα兔單克隆抗體(Thermofisher)的PBS/TweenTM 20/3%(w/v)BSA溶液(1：1000)。分析孔板在4℃下培養過夜，用250uL的PBS/TweenTM 20/Proclin清洗三次，然後每孔中加入20μL的山羊抗兔IgG AlexaFluor 594或是山羊抗兔IgG AlexaFluor 488抗體(含有Hoechst染色劑)的PBS/TweenTM 20/3%(w/v)BSA溶液(1：5000)，體系在室溫下培養一個小時。分析孔板用250μL的PBS/0.05%(v/v)TweenTM 20/Proclin清洗三次，加入20μL的PBS溶液，孔板於4℃下避光保存。通過Cellomics Arrayscan檢測孔板594nm(24小時時間點)和488nm(5小時時間點)兩個發射波段的螢光發射強度來計算MCF-7細胞中雌激素受體ERα的水準。每個細胞的平均螢光發射強度與該細胞的ERα受體水平正相關。得到的原始螢光測試資料借助於Origin或是Genedata等資料處理軟體得到擬合曲線。我們用半抑制濃度IC50來表徵測試化合物的對雌激素受體ERα的下調作用，IC50是指螢光發射強度降低為平均最大螢光強度的50%時測試化合物的濃度，測定的IC50如表2所示。
表2 雌激素受體ERα配位分析測試結果和ERα下調降解試驗測試結果
備註：IC50範圍0.1nMA10nM。
結論：本發明優選化合物與雌激素受體能夠較好的配位，且對於ERα具有較好的下調作用。
測試例3 雌激素受體ERα與本發明優選化合物競爭性結合分析
本發明利用Fluorescece polarizationTM(FP)螢光偏振技術對化合物和純化得到的雌激素受體ERα配體作用域之間的競爭性結合作用進行評價。
在FP配位評價技術中用的PolarScreen ER Alpha competitor Assay試劑盒是從Invitrogen公司購買(貨號A15883)，主要成分有螢光團(Fluormone ES2，貨號P2645)和重組人雌激素受體ERα配體作用域(貨號A15674)。
本測試的設計原理如下，雌激素受體ERα與含有螢光團的配體Fluormone ES2形成一個受體/螢光團複合物，經激發後會產生高偏振光信號值(△mP)，通過檢測△mP的減弱來評價測試化合物和螢光配體同受體之間的競爭性結合能力。
採用如下的樣品製備和測試方法對受試化合物進行了上述測試：(1)Labcyte 384孔板(貨號P-05525)中用DMSO梯度稀釋10mM的測試化合物溶液(第一個濃度為33.33μM，3倍稀釋，10個濃度)；(2)用Echo550轉移60nL到黑色小容量384孔分析板(購買自Corning，貨號3676)；(3)在ES2 Screening Buffer中稀釋ERα和FluormoneTM ES2，終濃度：ERα=150nM,FluormoneTM ES2=4.5nM，輕輕混勻，Apricot轉移20μL到384孔分析板；(4)封板膜封板，避光25℃孵育60分鐘；(5)Envision讀取fluorescence polarization value(mP)；得到的mP值經Graphpad Prism 6.0處理軟體得到擬合曲線。
採用半抑制濃度IC50來表徵測試化合物與雌激素受體ERα的競爭性結合作用。IC50代表螢光團(ES2)與雌激素受體結合作用下降50%時所計算的測試化合物濃度，測定的IC50如表3所示。
結論：本發明優選化合物與雌激素受體有較好親和力。
測試例4 本發明優選化合物在MCF-7細胞中下調降解ERα蛋白量測試
本發明中優選化合物對ERα蛋白水準的下調作用是在人體管乳腺癌細胞株MCF-7中通過免疫螢光分析來評價的。
實驗所用到的MCF-7細胞(購買自ATCC，貨號HTB-22)凍存在含有20%的胎牛血清(FBS，購買自GIBCO，貨號10099-141)和10% DMSO(購買自Solarbio，貨號D8371)的DMEM(購買自GIBCO，貨號11995-063)培養液中。冷凍細胞(約2x106個)復蘇後在含有10% FBS和1% Pen/Step(購買自Gibco，貨號15140-122)的DMEM培養液中培養，傳代兩次後用於實驗。用含有2% Activated charcoal(購買自Sigma，貨號C3345)處理過的FBS和1% Pen/Step的DMEM培養液重懸細胞，細胞計數儀(購買自Invitrogen，型號C10281)測定細胞濃度後用測試培養液稀釋到3.75×104個/mL，移取40μL/孔上述細胞懸液到黑色底透的384孔板(購買自BD，貨號356663)中，在37℃,5%的CO2細胞培養箱中培養過夜。在Labcyte 384孔板中用DMSO梯度稀釋10mM的測試化合物溶液(10mM稀釋300倍後得到33.33μM作為第一個濃度，依次做3倍稀釋，10個濃度)，再用Echo550(購買自Echo，型號550)轉移120nL到40μL細胞培養基中，DMSO終濃度為0.3%，測試化合物第一個濃度為100nM，室溫1000rpm離心1min後細胞置於37℃,5%的CO2細胞培養箱中培養過夜。用Apricot(購買自Apricot Designs，型號PPA-384-E)吸出細胞培養板中的培養基，加入40μL PBS浸洗細胞一次，吸出PBS後加入40μL 3.7%(v/v)的甲醛水溶液(購買自Sigma，貨號F1635，用PBS稀釋)，細胞在25℃固定20分鐘；吸出甲醛水溶液後用40μL PBS浸洗細胞一次，加入40μL終濃度為0.5%的Tween-20(PBS稀釋)25℃滲透1h；吸出滲透液後用PBS-T(含有0.05% Tween-20的PBS)浸洗細胞一次， 加入25μL ER抗體(購買自CST，貨號8644S)稀釋液(1：1000，用PBS-T中含有1%的milk稀釋)，25℃孵育1.5h；PBS-T浸洗細胞3次，加入二抗(購買自ThermoFisher，貨號A-11008)稀釋液(1：1000，用PBS中含有1%的milk稀釋)2μg/mL的Hochest 33342(購買自Molecular Probe，貨號H3570)，25℃避光孵育40min；PBS-T浸洗細胞3次，PBS浸洗細胞2次，最終加入40μL PBS後用Acumen讀取ERα蛋白信號值與細胞核信號值的比率(相對螢光強度)，用Graphpad Prism 6.0處理軟體得到擬合曲線。
採用半抑制濃度IC50來表徵測試化合物的對雌激素受體ERα的下調作用，IC50指ERα蛋白相對螢光強度降低為平均最大相對螢光強度的50%時測試化合物的濃度，測定的IC50如表4所示。
結論：本發明優選化合物對ERα蛋白量有較好的下調作用。
測試例5本發明優選化合物在MCF-7細胞中ERα功能活性下調測試
本發明中優選化合物對ERα蛋白功能活性的下調作用是在人體管乳腺癌細胞株MCF-7中通過免疫螢光分析來評價的。
實驗所用到的MCF-7細胞凍存在含有20%的胎牛血清和10% DMSO的DMEM培養液中。冷凍細胞(約2x106個)復蘇後在含有10% FBS和1% Pen/Step的DMEM培養液中培養，傳代兩次後用於實驗。用含有10%(v/v)Activated charcoal處理過的FBS和1% Pen/Step的DMEM培養液重懸細胞，細胞計數儀測定細胞濃度後用測試培養液稀釋到3.75×104個/mL，移取40μL/孔上述細胞懸液到黑色底透的384孔板中，在37℃,5%的CO2細胞培養箱中培養過夜。在Labcyte 384孔板中用DMSO梯度稀釋20mM的Estradiol的儲液到33.33nM，再用Echo550轉移120nL到40μL細胞培養基中，Estradiol終濃度0.1nM，DMSO終濃度為0.3%，在37℃,5%的CO2細胞培養箱中孵育30min；在Labcyte 384孔板中用DMSO梯度稀釋10mM的測試化合物溶液(第一個濃度為33.33μM，3倍稀釋，10個濃度)，再用Echo550(購買自Echo，型號550)轉移120nL到40μL細胞培養基中，DMSO終濃度為0.6%，測試化合物第一個濃度為100nM，室溫1000 rpm離心1min後細胞置於37℃,5%的CO2細胞培養箱中培養過夜。用Apricot吸出細胞培養板中的培養基，加入40μL PBS浸洗細胞一次，吸出PBS後加入40μL 3.7%(v/v)的甲醛水溶液，細胞在25℃固定20分鐘；吸出甲醛水溶液後用40μL PBS浸洗細胞一次，加入40μL終濃度為0.5%的Tween-20(PBS稀釋)25℃滲透1h；吸出滲透液後用PBS-T浸洗細胞一次，加入25μL PR抗體稀釋液(1：2500，用PBS-T中含有1%的milk稀釋)，25℃孵育1.5h；PBS-T浸洗細胞3次，加入二抗(稀釋液(1：1000，用PBS中含有1%的milk稀釋)2μg/mL的Hochest 33342，25℃孵育40min；PBS-T浸洗細胞3次，PBS浸洗細胞2次，最終加入40μL PBS後用Acumen讀取ERα蛋白信號值與細胞核信號值的比率(相對螢光強度)，用Graphpad Prism 6.0處理軟體得到擬合曲線。
採用半抑制濃度IC50來表徵測試化合物的對雌激素受體ERα的下調作用，IC50指ERα蛋白相對螢光強度降低為平均最大相對螢光強度的50%時測試化合物的濃度，測定的IC50如表5所示。
結論：本發明優選化合物對雌激素受體ERα的功能活性有較好的下調作用。
測試例6本發明實施例化合物對MCF-7細胞抑制IC 50 值測定
1 試劑和耗材
Cell Counting Kit-8(Cat# CK04-13，Dojindo)
96孔培養板(Cat# 3599，Corning Costar)
培養基和胎牛血清(GIBCO)
臺式酶標儀SpectraMax M5 Microplate Reader(Molecular Devices)
MCF-7人乳腺癌細胞株(購買於中科院上海細胞資源中心)
2 試劑配製
培養基的配製：MEM+10%FBS+0.01mg/ml human recombinant insulin
化合物的製備：用DMSO稀釋化合物使終濃度為10mM；
3 實驗步驟
(1)收集對數生長期細胞，計數，用完全培養基重新懸浮細胞，調整細胞濃度至合適濃度(依照細胞密度優化試驗結果確定)，接種96孔板，每孔加100μL細胞懸液。細胞在37℃，100%相對濕度，5% CO2培養箱中孵育24小時；(2)用培養基將待測化合物稀釋至所設置的相應作用濃度，按25μL/孔加入細胞。化合物的作用終濃度從1μM開始，4倍梯度稀釋，9個濃度點；(3)細胞置於37℃，100%相對濕度，5% CO2培養箱中孵育72小時；(4)吸棄培養基，加入含10% CCK-8的完全培養基置於37℃培養箱中孵育1~5小時；(5)輕輕震盪後在SpectraMax M5 Microplate Reader上測定450nm波長處的吸光度，以650nm處吸光度作為參比，計算抑制率。
4 資料處理
按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率：腫瘤細胞生長抑制率%=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%
As：樣品的OA(細胞+CCK-8+待測化合物)
Ac：陰性對照的OA(細胞+CCK-8+DMSO)
Ab：陽性對照的OA(培養基+CCK-8+DMSO)
運用軟體Graphpad Prism 5並採用計算公式log(inhibitor)vs.response-variable slope進行IC50曲線擬合併計算出本發明優選化合物對MCF-7細胞抑制IC50值，如表6所示。
結論：本發明優選化合物對MCF-7細胞增殖具有明顯的抑制作用。
測試例7 本發明優選化合物對MCF-7荷瘤SCID鼠移植瘤的生長抑制作用測試
1．實驗目的
本測試用來評價連續21天每天一次口服給予受試物對MCF-7荷瘤SCID鼠移植瘤的生長抑制作用
2. 受試物配製
溶劑：20%PEG400，80%去離子水；
受試物的配製：稱取適量實施例4化合物和AZD-9496，溶解於PEG400(20%)，溶解後加入80%量滅菌去離子水，震盪均勻。受試藥每天於給藥前新鮮配製。
3. 實驗動物
品種和品系：SCID鼠，SPF，雌性，7-9周齡(16~22克)，100只，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，健康狀況良好的100只用於實驗，適應環境時間5~7天。
4. MCF-7腫瘤細胞培養
MCF-7細胞培養於含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中。培養在37℃，5%CO2培養箱內。接種前取對數生長期細胞，以0.25%胰蛋白酶消化後PBS洗滌，用不含血清的培養基重新懸浮細胞計數，調整細胞濃度至7.5×10^7cells/mL(1：1 Matrigel，Extracellular Matrix Proteins，356234，BD)。
5 動物接種及分組
每個小鼠在無菌狀態下，右側腋下皮下接種0.2mL細胞懸液(1.5×10^7cells/mouse)。接種後皮下給予雌激素。待腫瘤長至體積150~250mm3左右時，選出腫瘤體積相近、形狀較好的小鼠(形狀儘量為單一圓球形，無不規則的形狀或多個腫瘤聚在一起)每組10只。
6 動物給藥和觀察
各組動物按上表每天固定時間根據動物體重給予受試物1天1次(qd)，口服給藥(po)，連續21天，並記錄每天動物體重。
觀察各組動物接種部位腫瘤的形成狀況，每週2次用遊標卡尺測量腫瘤結節的長徑(Y)和短徑(X)，並按如下公式計算：腫瘤結節的體積(V)：V=(X2Y)/2。
抗腫瘤活性的評價指標：腫瘤生長抑制率TGI(%)，相對腫瘤增殖率T/C(%)。
腫瘤生長抑制率TGI(%)：TGI(%)=(Vc-Vt)/Vc×100。其中Vc為模型對照組腫瘤體積，Vt為受試物組腫瘤體積。
相對腫瘤體積(relative tumor volume，RTV)：RTV=Vn/V0。其中V0為分組給藥時的腫瘤體積，Vn為測量時的腫瘤體積。
相對腫瘤增殖率T/C(%)：T/C(%)=TRTV/CRTV×100。其中TRTV為治療組RTV，CRTV為陰性對照組RTV。
7 結果
本發明優選化合物對乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠腫瘤生長抑制率(TGI%)如表7所示。
在10mg/kg劑量下，本發明實施例4在21天內對於乳腺癌MCF-7具有明顯的抑制作用，其TGI%在29.4~80.4，優於AZD-9496。
實施例4化合物和AZD-9496在10mg/kg劑量下，對乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠腫瘤生長抑制率如圖1所示，實施例4化合物對於腫瘤體積的抑制率明顯優於AZD-9496。

Claims (15)

  1. 一種通式(I)所示的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽： 其中：R1和R2各自獨立地選自氫原子或鹵素；R3選自烷基，其中所述的烷基進一步被一個或多個鹵素所取代；R4各自獨立地選自鹵素、烷基、烷氧基、三氟甲基、氰基、-C(O)NR5R6、-C(O)R7、-SO2R7、-C(O)OR7或-NR5C(O)R6，其中所述的烷基或烷氧基任選進一步被一個或多個選自鹵素、-C(O)NR5R6、-C(O)R7、-SO2R7、-C(O)OR7或-NR5C(O)R6的取代基所取代；R5選自氫原子或烷基；R6選自氫原子、烷基、環烷基、芳基或雜芳基，其中所述的烷基、環烷基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代；或者，R5、R6與其相連接的原子一起形成4~8元雜環基，其中所述的雜環基任選進一步被一個或多個選自烷基、鹵素、羥基、氰基、硝基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代；R7選自氫原子、烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、-NR8R9、-C(O)NR8R9、-C(O)R10、-SO2R10、-C(O)OR10或-NR8C(O)R9的取代基所取代； R8、R9和R10各自獨立地選自氫原子、烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基任選進一步被一個或多個選自羥基、鹵素、鹵代烷基、硝基、氰基、烷基、烷氧基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、羧酸或羧酸酯的取代基所取代；且n為1、2、3或4。
  2. 如請求項1所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，其為通式(II)所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽： 其中：R1、R2、R3、R4和n的定義如請求項1中所述。
  3. 如請求項1或2所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，其中：所述的烷基為C1-C10烷基；所述的烷氧基為C1-C10烷氧基；所述的環烷基為C3-C12環烷基；所述的雜環基為C3-C10雜環基；所述的芳基為C6-C10芳基；所述的雜芳基為5元-10元雜芳基。
  4. 如請求項1~3任一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，其中R1和R2為F。
  5. 如請求項1~3任一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，其中R3為C1-C4烷基，優選為異丙基，其中所述的烷基進一步被一個或多個選自F、Cl、Br或I的取代基所取代，優選為F或Cl，更優選為F。
  6. 如請求項1~3任一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體 或其可藥用的鹽，其中R4各自獨立地選自C1-C4烷基、鹵素、烷氧基、三氟甲基或氰基。
  7. 如請求項1~3任一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，其中：R1和R2各自獨立地選自鹵素，其中所述鹵素優選為F；R3選自鹵素取代的C1-C4烷基，優選為F取代C1-C4烷基；更優選為氟代異丙基；R4為C1-C4烷基、鹵素、烷氧基、三氟甲基或氰基。
  8. 如請求項1~7任一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，其中所述的化合物選自：
  9. 如請求項1所述的通式(I)化合物的製備方法，所述方法包括： 通式(IA)和通式(IB)在酸性條件下反應，進一步酯水解，得到通式(I)化合物；其中：Ra為烷基；R1、R2、R3、R4和n的定義如請求項1中所述。
  10. 如請求項2所述的通式(II)化合物的製備方法，所述方法包括： 通式(IIA)和通式(IB)在酸性條件下反應，進一步酯水解，得到通式(II)化合物；其中：Ra為烷基；R1、R2、R3、R4和n的定義如請求項1中所述。
  11. 一種藥物組合物，所述的藥物組合物含有有效劑量的如請求項1~8任何一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，及可藥用的載體、賦形劑或它們的組合。
  12. 如請求項11所述的藥物組合物，該藥物組合物進一步包括抗氧化劑或金屬螯合劑。
  13. 如請求項1~8任何一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，或如請求項11~12任何一項所述的藥物組合物在製備用於治療雌激素受體媒介轉導的疾病的藥物中的用途，其中所述的疾病為癌症，其中所述的癌症優選為乳腺癌或婦科癌症，其中所述的婦科癌症優選為卵巢癌或子宮內膜癌，其中所述的雌激素受體優選為雌激素受體α。
  14. 如請求項1~8任何一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽，或如請求項11~12任何一項所述的藥物組合物在製備選擇性雌激素受體下調劑中的用途，其中所述的選擇性雌激素受體下調劑優選為雌激素受體α下調劑。
  15. 如請求項1~8任何一項所述的化合物或其立體異構體、互變異構體或其可藥用的鹽或如請求項11~12任何一項所述的藥物組合物與一種或多種其他抗腫瘤藥物聯合用於製備治療雌激素受體媒介轉導的疾病的藥物中的用途，其中所述的疾病為癌症，其中所述的癌症優選為乳腺癌或婦科癌症，其中所述的婦科癌症優選為卵巢癌或子宮內膜癌，其中所述的雌激素受體優選為雌激素受體α，其中所述其他抗腫瘤藥物包括烷化劑、抗代謝類 藥物、具有抗腫瘤活性的天然產物及其衍生物、細胞毒素類藥物或阻滯免疫細胞遷移類藥物。
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