TW202327576A - 吡咯烷類化合物的鹽、晶型及其製備方法 - Google Patents

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Abstract

本公開提供一種理化性質和/或藥學性質優異的式(I)化合物的可藥用鹽及其結晶、其製備方法和用途，其中，所述可藥用鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、己二酸鹽、富馬酸鹽、L-蘋果酸鹽和檸檬酸鹽，優選苯甲酸鹽、琥珀酸鹽和己二酸鹽。

Description

吡咯烷類化合物的鹽、晶型及其製備方法
本公開屬於醫藥領域，涉及吡咯烷類化合物的可藥用鹽、所述可藥用鹽的結晶以及相應的製備方法和用途。
雌激素(E2)及雌激素α受體（ERα）是乳腺癌發生發展的重要驅動因數。在乳腺癌患者中有超過2/3的患者表達ER轉錄因數，並且在大多數ER陽性患者中，即使經過早期的內分泌治療後進展的腫瘤中，ER仍是一個關鍵的驅動因數，因此ER是乳腺癌治療的一個主要靶點(Pharmacology & Therapeutics 186 (2018) 1–24)。內分泌治療目的是降低ER活性，主要有三類，包括選擇性雌激素受體調節劑（SERMs），比如他莫昔芬（tamoxifen），是ER的別構調節劑，同ER結合後抑制其轉錄活性；芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitors, AIs), 通過抑制雄激素轉化為雌激素，減低體內雌激素水準；以及選擇性雌激素受體下調劑，比如氟維司群（fulvestrant），不僅作為ER的拮抗劑抑制其活性，還具有誘導ER蛋白降解的作用。雖然內分泌治療是雌激素受體陽性乳腺癌患者的首選，但是約有30%的治療後病人會發生復發，並且幾乎所有的轉移性乳腺癌患者都會產生耐藥而發生進展。
臨床上，約70-80%的乳腺癌檢測雌激素受體（ER）呈陽性，這類乳腺癌細胞的增殖嚴重依賴ER，且50%的乳腺癌死亡病例均為該類分型。早期ER陽性乳腺癌預後較好，5年生存率超過90%。術後內分泌治療（TAM或AI藥物）的病人10年內約30%出現復發，但仍然可以接受標準的內分泌治療。
氟維司群是首個也是唯一經臨床批准用於他莫昔芬或芳香化酶抑制劑進展後治療ER 陽性、轉移性乳腺癌的絕經後患者的SERD類藥物。多項研究資料顯示經氟維司群治療的患者體內並未能完全實現ER的降解，此外肌肉注射方式造成的注射部位疼痛、腫脹、發紅等明顯反應，且吸收緩慢、體內暴露量受限等特點限制了其臨床應用，因此ER陽性乳腺癌患者亟需新的治療選擇。
PCT/CN2021/093736（申請日2021年5月14日）描述了一種化合物 N-(( S)-1-(3-氟丙基)吡咯烷-3-基)-6-((1 S,3 R)-3-甲基-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3,4,9-四氫-1 H-吡啶並[3,4- b]吲哚-1-基）吡啶-3-胺（式（I）化合物），所述式（I）化合物為選擇性雌激素受體下調劑，體內外模型顯示（I）化合物對ER陽性細胞具有廣泛的抑制效果。
本公開提供了式(I)化合物的可藥用鹽， 其中，所述可藥用鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、己二酸鹽、富馬酸鹽、L-蘋果酸鹽和檸檬酸鹽。
本公開還提供了上述式(I)化合物的己二酸鹽C晶型，所述C晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、8.90±0.2º、19.10±0.2º處有衍射峰。
本公開還提供了上述式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型，所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.39±0.2º、18.78±0.2º處有衍射峰。
本公開還提供了上述式(I)化合物的琥珀酸鹽A晶型，所述A晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.13±0.2º、9.30±0.2º、11.29±0.2º、15.51±0.2º、19.89±0.2º處有衍射峰。
本公開還提供了製備上述式(I)化合物的可藥用鹽的方法，所述製備方法包括了式(I)所示化合物與相應酸成鹽反應的步驟。
本公開還提供了製備上述C晶型的方法，包含以下步驟： （1-a）將己二酸和溶劑混合； （2-a）將式(I)化合物和溶劑混合； （3-a）混合步驟（1-a）的混合物與步驟（2-a）的混合物； （4-a）將混合了所述已二酸和所述式(I)化合物的所得混合物攪拌，析晶； （5-a）過濾出固體，收集濾餅，乾燥。
本公開還提供了製備上述B晶型的方法，包含以下步驟： （1-b）將式(I)化合物和溶劑混合； （2-b）向步驟（1-b）的混合物中加入苯甲酸； （3-b）將混合了所述式(I)化合物和所述苯甲酸的所得混合物攪拌，析晶； （4-b）過濾出並收集固體。
本公開還提供了製備上述A晶型的方法，包含以下步驟： （1-c）將式(I)化合物和溶劑混合； （2-c）向步驟（1-c）的混合物中加入琥珀酸； （3-c）將混合了所述式(I)化合物和所述琥珀酸的所得混合物攪拌，析出固體； （4-c）過濾出並收集固體。
本公開還提供了一種藥物組合物，其包含上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型，以及藥學上可接受的輔料。
本公開還提供了上述式(I)化合物的可藥用鹽、上述晶型或上述藥物組合物在製備用於預防或者治療雌激素受體相關疾病的藥物中的用途。
本公開提供一種理化性質和/或藥學性質優異的式(I)化合物的可藥用鹽及其結晶，
本公開提供了式(I)所示化合物的可藥用鹽，其中，所述可藥用鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、己二酸鹽、富馬酸鹽、L-蘋果酸鹽和檸檬酸鹽，優選苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、己二酸鹽、富馬酸鹽、L-蘋果酸鹽和檸檬酸鹽，更優選苯甲酸鹽、琥珀酸鹽和己二酸鹽。
在一些實施方案中，所述式(I)化合物的可藥用鹽中，式(I)化合物與酸分子的莫耳比約為0.5~2。
在一些實施方案中，所述式(I)化合物的可藥用鹽中，式(I)化合物與酸分子的莫耳比約為0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0。
在一些實施方案中，所述式(I)化合物的可藥用鹽中，式(I)化合物與酸分子的莫耳比約為0.5、1.0、1.5和2.0。
在一些實施方案中，上述式(I)化合物的琥珀酸鹽如式(II)所示，其中，x選自0.5~2，
在一些實施方案中，上述式(I)化合物的苯甲酸鹽如式(III)所示，其中，y選自0.5~2，
在一些實施方案中，上述式(I)化合物的己二酸鹽如式(IV)所示，其中，z選自0.5~2，
在一些實施方案中，x、y、z獨立地選自0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0。
在一些實施方案中，x、y、z獨立地選自0.8、0.9、1.0、1.1和1.2。
在一些實施方案中，x、y、z獨立地選自1.0。
本公開還提供了製備上述式(I)化合物可藥用鹽的方法，包括：式(I)所示化合物與酸成鹽的步驟，所述酸選自硫酸、磷酸、苯甲酸、琥珀酸、己二酸、富馬酸、L-蘋果酸和檸檬酸，優選苯甲酸、琥珀酸、己二酸、富馬酸、L-蘋果酸和檸檬酸，更優選苯甲酸、琥珀酸和己二酸。
本公開所述成鹽反應所用溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種，優選異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種。
在可選實施方案中，製備上述式(I)化合物可藥用鹽的方法還包括揮發溶劑或攪拌析晶、過濾、乾燥等中的一種或其組合的步驟。
本公開還提供了式(I)化合物的己二酸鹽的晶型。
在一些實施方案中，式(I)化合物的己二酸鹽的晶型為無水合物。
本公開提供了上述式(I)化合物己二酸鹽的C晶型，所述C晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、8.90±0.2º和19.10±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述C晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、7.03±0.2º、8.90±0.2º、16.45±0.2º、17.78±0.2º、19.10±0.2º和21.03±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述C晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、7.03±0.2º、8.90±0.2º、10.65±0.2º、11.95±0.2º、12.55±0.2º、13.34±0.2º、14.20±0.2º、16.02±0.2º、16.45±0.2º、17.78±0.2º、18.33±0.2º、19.10±0.2º、19.77±0.2º、20.12±0.2º、21.03±0.2º、21.62±0.2º、24.30±0.2º、25.97±0.2º、27.39±0.2º和27.98±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述C晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、7.03±0.2º、8.90±0.2º、10.65±0.2º、11.95±0.2º、12.55±0.2º、12.96±0.2º、13.34±0.2º、14.20±0.2º、15.20±0.2º、16.02±0.2º、16.45±0.2º、17.78±0.2º、18.33±0.2º、19.10±0.2º、19.77±0.2º、20.12±0.2º、21.03±0.2º、21.62±0.2º、22.44±0.2º、22.52±0.2º、22.54±0.2º、23.35±0.2º、23.98±0.2º、24.30±0.2º、24.86±0.2º、25.37±0.2º、25.97±0.2º、27.39±0.2º、27.98±0.2º和28.81±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述C晶型，其X-射線粉末衍射圖譜與圖2基本上一致。
在一些實施方案中，所述C晶型的DSC譜圖在149.89±5℃處具有吸熱峰。
在一些實施方案中，所述C晶型的DSC譜圖與圖3基本上一致。
本公開還提供了式(I)化合物的己二酸鹽C晶型的製備方法，包括式(I)化合物與己二酸成鹽反應步驟。
本公開的一些方案中，上述C晶型的製備方法包括以下步驟： （1-a）將己二酸和溶劑混合； （2-a）將式(I)化合物和溶劑混合； （3-a）混合步驟（1-a）的混合物與步驟（2-a）的混合物； （4-a）將混合了所述已二酸和所述式(I)化合物的所得混合物攪拌，析晶； （5-a）過濾出固體，收集濾餅(即所述固體)，乾燥。
在一些實施方案中，步驟（1-a）和步驟（2-a）中的溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種，優選異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，更優選異丙醇。
在一些實施方案中，所述式(I)化合物與己二酸的莫耳比為1:2~2:1，優選莫耳比為1: 1。
在一些實施方案中，所述步驟（1-a）在加熱條件下進行。
在一些實施方案中，所述步驟（1-a）在加熱溫度約為40-80℃，優選60℃下進行。
在一些實施方案中，所述步驟（4-a）在15-30℃條件下進行，優選在20-25℃條件下進行。
本公開還提供了式(I)化合物的苯甲酸鹽的晶型。
在一些實施方案中，式(I)化合物的苯甲酸鹽的晶型為無水合物。
本公開提供了式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型，所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.39±0.2º、18.78±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述B晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.39±0.2º、18.78±0.2º和20.09±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.39±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º、20.09±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述B晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.69±0.2º、6.34±0.2º、7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.39±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º和20.09±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述B晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.69±0.2º、6.34±0.2º、7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.11±0.2º、11.39±0.2º、14.78±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.25±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º、20.09±0.2º、20.80±0.2º、21.66±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.69±0.2º、6.34±0.2º、7.19±0.2º、9.83±0.2º、10.01±0.2º、11.11±0.2º、11.39±0.2º、14.78±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.25±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º、20.09±0.2º、20.80±0.2º、21.66±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述B晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.69±0.2º、4.91±0.2º、6.34±0.2º、7.19±0.2º、9.37±0.2º、9.83±0.2º、10.01±0.2º、10.32±0.2º、11.11±0.2º、11.39±0.2º、12.06±0.2º、12.69±0.2º、13.52±0.2º、14.07±0.2º、14.36±0.2º、14.78±0.2º、17.30±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.25±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º、20.09±0.2º、20.80±0.2º、21.15±0.2º、21.66±0.2º、22.35±0.2º、23.57±0.2º、23.70±0.2º、24.63±0.2º、25.68±0.2º、27.05±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述B晶型，其X-射線粉末衍射圖譜與圖5基本上一致。
在一些實施方案中，所述B晶型的DSC譜圖在150.08±5℃處具有吸熱峰。
在一些實施方案中，所述B晶型的DSC譜圖與圖6基本上一致。
本公開還提供了式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型的製備方法，包括式(I)化合物與苯甲酸成鹽反應步驟。
本公開的一些方案中，上述B晶型的製備方法包括以下步驟： （1-b）將式(I)化合物和溶劑混合； （2-b）向步驟（1-b）的混合物中加入苯甲酸； （3-b）將混合了所述式(I)化合物和所述苯甲酸的所得混合物攪拌，析晶； （4-b）過濾出並收集固體。
在一些實施方案中，步驟（1-b）中的溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種，優選異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，更優選異丙醚。
在一些實施方案中，所述式(I)化合物與苯甲酸的莫耳比為1:2~2:1，優選莫耳比為1: 1。
在一些實施方案中，所述步驟（1-b）在15-30℃條件下進行，優選在20-25℃條件下進行。
在一些實施方案中，所述步驟（3-b）的攪拌在加熱條件下進行，優選加熱溫度約為40-68℃，更優選60-68℃。
進一步，式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型的製備方法還包括以下步驟： （5-b）將步驟（4-b）收集的固體和溶劑混合； （6-b）將所得混合物攪拌； （7-b）過濾出並收集固體，乾燥。
在一些實施方案中，步驟（5-b）中的溶劑選自異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，優選異丙醚。
在一些實施方案中，所述步驟（6-b）在15-30℃條件下進行，優選在20-25℃條件下進行。
本公開還提供了式(I)化合物琥珀酸鹽的晶型。
在一些實施方案中，式(I)化合物琥珀酸鹽的晶型為無水合物。
本公開提供了式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型，所述A晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.13±0.2º、9.30±0.2º、11.29±0.2º、15.51±0.2º、19.89±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述A晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.13±0.2º、9.30±0.2º、11.29±0.2º、15.51±0.2º、17.10±0.2º、19.89±0.2º、20.26±0.2º、20.91±0.2º、21.51±0.2º、22.69±0.2º、23.58±0.2º、25.42±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述A晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在5.01±0.2º、7.13±0.2º、9.30±0.2º、10.09±0.2º、11.29±0.2º、11.73±0.2º、13.75±0.2º、14.30±0.2º、15.18±0.2º、15.51±0.2º、16.00±0.2º、17.10±0.2º、18.25±0.2º、18.69±0.2º、19.89±0.2º、20.26±0.2º、20.91±0.2º、21.12±0.2º、21.51±0.2º、22.69±0.2º、23.05±0.2º、23.58±0.2º、24.58±0.2º、25.42±0.2º、26.66±0.2º、27.24±0.2º和29.47±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述A晶型，以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在5.01±0.2º、7.13±0.2º、9.30±0.2º、10.09±0.2º、11.29±0.2º、11.73±0.2º、13.75±0.2º、14.30±0.2º、15.18±0.2º、15.51±0.2º、16.00±0.2º、17.10±0.2º、18.25±0.2º、18.69±0.2º、19.89±0.2º、20.26±0.2º、20.91±0.2º、21.12±0.2º、21.51±0.2º、22.69±0.2º、23.05±0.2º、23.58±0.2º、24.58±0.2º、25.42±0.2º、26.66±0.2º、27.24±0.2º、28.65±0.2º、29.47±0.2º、30.90±0.2º、32.31±0.2º、34.45±0.2º處有衍射峰。
在一些實施方案中，所述A晶型的X-射線粉末衍射圖譜與圖8基本上一致。
在一些實施方案中，所述A晶型的DSC譜圖在186.82±5℃處具有吸熱峰。
在一些實施方案中，所述A晶型的DSC譜圖與圖9基本上一致。
在一些實施方案中，所述A晶型的晶胞參數為a= 24.6731(4) Å，b= 24.6731(4) Å，c= 10.2575(3)Å，α=90°，β= 90°，γ=90°。
本公開還提供了製備式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的方法，包括以下步驟： （1-c）將式(I)化合物和溶劑混合； （2-c）向步驟（1-c）的混合物中加入琥珀酸； （3-c）將混合了所述式(I)化合物和所述琥珀酸的所得混合物攪拌，析出固體； （4-c）過濾出並收集固體。
在一些實施方案中，步驟（1-c）中的溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種，優選異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，更優選異丙醚。
在一些實施方案中，所述式(I)化合物與琥珀酸的莫耳比為1:2~2:1，優選莫耳比為1: 1。
在一些實施方案中，所述步驟（3-c）在15-30℃條件下進行，優選在20-25℃條件下進行。
在一些實施方案中，所述步驟（3-c）的反應時間為1-48小時，優選3-24小時，更優選8-16小時。
進一步，式(I)化合物的琥珀酸鹽A晶型的製備方法還包括以下步驟： （5-c）將步驟（4-c）收集的固體和溶劑混合； （6-c）將所得混合物攪拌析晶； （7-c）過濾出並收集固體，乾燥。
在一些實施方案中，步驟（5-c）中的溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、四氫呋喃和水中的至少一種，優選乙醇/水的混合溶劑。
在一些實施方案中，乙醇/水的體積比約為1:1~50:1，優選2:1~20:1；在本公開的一些具體實施方案中，乙醇/水的體積比約為10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1或4:1。
在一些實施方案中，所述步驟（6-c）在15-30℃條件下進行，優選在20-25℃條件下進行。
在一些實施方案中，所述步驟（6-c）的攪拌析晶時間為0.5-48小時，優選1-12小時，更優選2-4小時。
本公開還提供藥物組合物，其包含上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型和藥學上可接受的輔料。
本公開還涉及上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、或上述藥物組合物在製備用於預防或者治療雌激素受體相關疾病的藥物中的用途。
進一步，本公開涉及上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、或上述藥物組合物在預防或者治療雌激素受體相關疾病中的用途。
進一步，本公開涉及用於預防或者治療雌激素受體相關疾病的上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、或上述藥物組合物。
本公開還涉及治療雌激素受體相關疾病的方法，該方法包括給以個體治療上有效劑量的上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、上述藥物組合物或者包含本公開上述式(I)化合物可藥用鹽或上述晶型的藥物製劑。
本公開還涉及上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、或上述藥物組合物在製備用於預防或者治療腫瘤的藥物中的用途。
進一步，本公開涉及上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、或上述藥物組合物在預防或者治療腫瘤中的用途。
進一步，本公開涉及用於預防或者治療腫瘤的上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、或上述藥物組合物。
本公開還涉及治療腫瘤的方法，該方法包括給以個體治療上有效劑量的上述式(I)化合物的可藥用鹽或上述晶型、上述藥物組合物或者包含本公開上述式(I)化合物可藥用鹽或上述晶型的藥物製劑。
在一些實施方案中，所述的雌激素受體相關疾病包括但不限於腫瘤。
在一些實施方案中，所述的雌激素受體相關疾病或腫瘤為乳腺癌。
在一些實施方案中，所述的雌激素受體相關疾病或腫瘤為ER陽性乳腺癌。
在一些實施方案中，所述的雌激素受體相關疾病或腫瘤為ER陽性乳腺癌腦轉移。
在一些實施方案中，所述個體為腫瘤患者。
在一些實施方案中，所述個體為乳腺癌患者。
在一些實施方案中，所述個體為ER陽性乳腺癌患者。
在一些實施方案中，所述個體為ER陽性乳腺癌腦轉移患者。
技術效果
本公開提供的式(I)化合物的可藥用鹽及其結晶具有下述至少一種優勢：
本公開提供的式(I)化合物的可藥用鹽及其結晶具有水溶性好、純度高、穩定性好、吸濕性小等中的至少一種優點；
相對於游離鹼或其它鹽型，式(I)化合物的苯甲酸鹽、琥珀酸鹽或己二酸鹽及其晶型還能夠有效抑制異構體的產生，和/或具有更優的熱穩定性；
本公開提供的式(I)化合物的可藥用鹽或其晶型還具有製備方法簡便、結晶條件溫和、結晶度高、溶解性好、穩定性好和不易吸濕等中的至少一種優點，適合製備成為所期望的藥物組合物。
定義和說明
本公開的式(I)化合物的可藥用鹽每天給藥的劑量為0.01mg/kg到200mg/kg體重，優選為0.05mg/kg到50mg/kg體重，更優選0.1mg/kg到30mg/kg體重，以單獨或分開劑量的形式。
本公開的可藥用鹽或其晶型或它們的多晶型物，或它們的多晶型物的組合物，或它們的藥物組合物的典型給藥途徑包括但不限於口服、直腸、局部、吸入、腸胃外、舌下、陰道內、鼻內、眼內、腹膜內、肌內、皮下、靜脈內給藥。
在可選的實施方案中，藥物組合物是口服形式。對於口服給藥，可以通過將活性化合物與本領域熟知的藥學上可接受的輔料混合，來配製該藥物組合物。這些輔料能使本申請的化合物被配製成片劑、丸劑、錠劑、糖衣劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、漿劑、懸浮劑等，用於對患者的口服給藥。
可以通過常規的混合、填充或壓片方法來製備固體口服組合物。例如，可通過下述方法獲得：將所述的活性化合物與固體輔料混合，任選地碾磨所得的混合物，如果需要則加入其它合適的輔料，然後將該混合物加工成顆粒，得到了片劑或糖衣劑的核心。適合的輔料包括但不限於：黏合劑、稀釋劑、崩解劑、潤滑劑、助流劑、甜味劑或矯味劑等。
術語“約”在本公開中用於指近似地、在……左右。當術語“約”與數位範圍結合使用時，通過擴大所陳述的數位範圍的上下限值來對該範圍來進行修飾。除非另作說明，否則術語“約”在本文中用於以10%偏差的數位值修飾所陳述的值的上限和下限。
除非另作說明，否則術語“包括（comprise）”、“含有（comprise）”或“包含（comprise）”及其英文變體例如comprises或comprising應理解為開放的、非排他性的意義，即“包括但不限於”。
在整個本說明書中提到的“一些實施方案”、“可選實施方案”或“實施方案”是指在至少一實施方案中包括與該實施方案所述的相關的具體參考要素、結構或特徵。因此，在整個說明書中不同位置出現的短語“一些實施方案”、“可選實施方案”或“實施方案”不必全部指同一實施方案。此外，具體要素、結構或特徵可以任何適當的方式在一個或多個實施方案中結合。
本公開所述室溫是指20±5 oC。
本公開中所述的範圍“m~n”表示m到n之間的任意實數組合的縮略表示，其中m和n都是實數。數值範圍“0.5~2”包括但不限於本文中已經列出了其中的0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0。
本公開中所述的“X-射線粉末衍射圖譜”為使用Cu-Kα輻射測量得到。
本公開中所述的“X-射線粉末衍射圖譜或XRPD圖譜”是指根據布拉格公式2d Sin θ= nλ（式中，λ為X射線的波長，λ=1.54060Å，衍射的級數n為任何正整數，一般取一級衍射峰，n=1），當X射線以掠角 θ（入射角的餘角，又稱為布拉格角）入射到晶體或部分晶體樣品的某一具有d點陣平面間距的原子面上時，就能滿足布拉格方程，從而測得了這組X射線粉末衍射圖。
本公開公開的晶型為大致純的結晶。本申請使用的術語“大致純的”是指所述晶型的純度至少為85wt%，優選至少為90wt%、更優選至少為95 wt%。
對於同種化合物的同種晶型，其XRPD圖譜的峰位置在整體上具有相似性，相對強度誤差可能較大。還應指出的是，在混合物的鑒定中，由於含量下降等因素會造成部分衍射線的缺失，此時，無需依賴高純試樣中觀察到的全部衍射峰，甚至一個衍射峰也可能對給定的晶體而言是特徵性的。
本公開中所述的“2 θ或2 θ角度”是指衍射角， θ為布拉格角，單位為º或度；每個衍射峰2 θ的誤差範圍為±0.20º。
本公開中所述的“差示掃描量熱分析或DSC”是指在樣品升溫或恆溫過程中，測量樣品與參考物之間的溫度差、熱流差，以表徵所有與熱效應有關的物理變化和化學變化，得到樣品的相變資訊。
本公開中所述乾燥溫度一般為20 oC~100 oC，優選25 oC~70 oC，更優選40 oC~60 oC，可以常壓乾燥，也可以減壓乾燥。優選地，在減壓下乾燥。
對於本領域技術人員而言，本公開化合物與酸分子的莫耳比測定存在一定程度的誤差，一般而言，±10%均屬於合理誤差範圍內。隨其所用之處的上下文而有一定程度的誤差變化，該誤差變化不超過±10%，優選±5%。
術語“治療”意為將本申請所述化合物或製劑進行給藥以改善或消除疾病或與所述疾病相關的一個或多個症狀，且包括： (i)抑制疾病或疾病狀態，即遏制其發展； (ii)緩解疾病或疾病狀態，即使該疾病或疾病狀態消退。
術語“預防”意為將本申請所述化合物或製劑進行給藥以預防疾病或與所述疾病相關的一個或多個症狀，且包括：
預防疾病或疾病狀態在物件(例如哺乳動物)中出現，特別是當這類物件易患有該疾病狀態，但尚未被診斷為已患有該疾病狀態時。
術語“治療上有效劑量”是指(i)治療特定疾病、病況或障礙，(ii)減輕、改善或消除特定疾病、病況或障礙的一種或多種症狀，或(iii)延遲本文中所述的特定疾病、病況或障礙的一種或多種症狀發作的本公開化合物的用量。構成“治療上有效劑量”的本公開化合物的量取決於該化合物、疾病狀態及其嚴重性、給藥方式以及待被治療的哺乳動物的年齡而改變，但可例行性地由本領域技術人員根據其自身的知識及本公開內容而確定。
術語“藥學上可接受的輔料”是指對有機體無明顯刺激作用，而且不會損害該活性化合物的生物活性及性能的那些輔料。合適的輔料是本領域技術人員熟知的，例如碳水化合物、蠟、水溶性和/ 或水可膨脹的聚合物、親水性或疏水性材料、明膠、油、溶劑、水等。
本申請中，術語“個體”或“患者”包括哺乳動物和非哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於哺乳動物綱的任何成員：人，非人的靈長類動物(例如黑猩猩和其它猿類和猴)；家畜，例如牛、馬、綿羊、山羊、豬；家養動物，例如兔、狗和貓；實驗室動物，包括齧齒類動物，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非人哺乳動物的實例包括但不限於鳥類和魚類等。
本公開實驗所用儀器的測試條件： 1、差示掃描量熱儀（Differential Scanning Calorimeter, DSC） 儀器型號：TA DSC2500 吹掃氣：氮氣 樣品盤：鋁盤，非密封壓蓋 方法：線性升溫 升溫速率：10 oC/min 溫度範圍：30 oC~設置終點溫度 2、X-射線粉末衍射譜（X-ray Powder Diffraction, XRPD） 儀器型號：Bruker D8 Focus 射線：Cu Kα，Kα1（Å）：1.54060； Kα2（Å）：1.54439 Kα1/Kα2：2 狹縫（°）：2.5 掃描方式：θ/2θ，掃描範圍：3-40° 停留時間（秒）：0.12 掃描步長（°2θ）：0.01 電壓：40 kV，電流：40 mA 3、熱重分析（Thermogravimetric Analysis, TGA） 儀器型號：TA TGA550 吹掃氣：氮氣 樣品盤：鉑金，敞口 方法：線性升溫 升溫速率：10 oC/min 溫度範圍：30 oC~設置終點溫度 4、飽和溶解度試驗的高效液相色譜（HPLC） 色譜柱：Water XBridge C18（4.6*100 mm,3.5μm） 流動相A：0.01 mol/L氯化銨溶液（pH10.0） 流動相B：乙腈 等度條件：流動相A：B=50：50，等度15 min 流速：1.5 mL/min 波長：260 nm 柱溫：35℃ 進樣量：10 µl 稀釋劑：乙腈 5、異構體雜質檢測的高效液相色譜（HPLC） 色譜柱：CHIRALPAK AD-H（4.6*250mm,5μm） 流動相A：正己烷 流動相B：0.1%二乙胺-乙醇 等度條件：流動相A：流動相B=70：30，等度運行15min 流速：1.0mL/min 波長：260 nm 柱溫：35℃ 進樣量：10 µl 稀釋劑：0.1%二乙胺-乙醇 式(I)化合物可藥用鹽穩定性考察試驗的高效液相色譜（HPLC） 色譜柱：Water XBridge C18（4.6*150mm，3.5μm） 流動相A：0.01mol/L氯化銨溶液（氨水調pH10.0） 流動相B：乙腈 流速：1.0mL/min 波長：285 nm 柱溫：35℃ 進樣量：20 µl
本領域技術人員認識到對於同一化合物的給定結晶形式的XRPD峰位置和/或強度的測量資料將在誤差範圍內變化。2 θ值允許適當的誤差範圍。通常，誤差範圍是由“±”表示。例如，5.92±0.2º 2 θ表示在約6.12至5.72範圍內。取決於樣品製備技術、應用於儀器的校準技術、人類操作偏差等，本領域技術人員認識到對於XRPD衍射角（2 θ）的適當的誤差範圍可為約±0.20º、±0.15º、±0.10º、±0.05º或更小。當用於描述XRPD圖時，術語“基本上一致”或“基本上如……所示”是指包括至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少90%或至少99%的衍射角在±0.2º 2 θ的標準差範圍內的衍射峰的圖。
由於本領域技術人員認識到對於同一化合物的給定結晶形式的DSC熱譜圖的測量資料將在誤差容限內變化。單峰峰值（以攝氏度表示）允許適當的誤差範圍。通常，誤差範圍是由“±”表示。對於同種化合物的同種晶型，在連續的分析中，熱轉變溫度和熔點誤差典型地在約±5.0 ℃之內。例如，“186.82±5℃”的峰值表示在181.82至191.82範圍內。取決於樣品製備技術、應用於儀器的校準技術、人類操作偏差等，本領域技術人員認識到對於單峰峰值的適當的誤差範圍可為±5.0、±4.0、±3.0、±2.0或更小。
勒克斯（lux，法定符號lx）是照度（luminance）的單位。被光均勻照射的物體，在1平方米面積上所得的光通量是1流明時，它的照度是1勒克斯。
實施例
以下實施例詳細說明發明的技術方案，但本公開的保護範圍包括但不限於此。
化合物的結構是通過核磁共振（NMR）和/或質譜（MS）來確定的。NMR位移的單位為10 -6（ppm）。NMR測定的溶劑為氘代二甲基亞碸、氘代氯仿、氘代甲醇等，內標為四甲基矽烷（TMS）；“IC 50”指半數抑制濃度，指達到最大抑制效果一半時的濃度。
實施例1：N-（（S）（1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-基）-6-（（1S, 3R）-3-甲基-2-（2, 2，2-三氟乙基）-2，3，4，9-四氫-1H-吡啶並[3,4-b]吲哚-1-基）吡啶-3-胺（式(I)化合物）的合成
合成方法：
步驟1：（S）-叔丁基（1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-基）氨基甲酯的合成
將（S）-叔丁基吡咯烷-3-基氨基甲酯（500.00mg，2.68mmol）溶於四氫呋喃（10mL）中，加入氫氧化鈉溶液（5mol﹒L -1，1.07mL）和1-碘-3-氟丙烷（529.88mg，2.82mmol）。反應液於25℃攪拌反應16小時。TLC檢測原料反應完全後，將反應液用乙酸乙酯（50mL）稀釋後，用飽和氯化銨溶液(10mL)洗滌，分別收集水相和有機相。水相用乙酸乙酯(20mL)萃取三次後，將所有有機相合併，用硫酸鈉乾燥後，有機相減壓濃縮乾，然後柱層析純化（二氧化矽，二氯甲烷/甲醇 =100/1）得到產物（S）-叔丁基（1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-基）氨基甲酯（480.00mg）。
1H NMR (400 MHz, METHANOL- d 4) δ 4.58-4.53 (m, 1H), 4.46-4.40 (m, 1H), 4.14-4.04 (m, 1H), 2.93-2.85 (m, 1H), 2.77-2.67 (m, 1H), 2.61 (dd, J =7.78, 5.52 Hz, 3H), 2.47-2.40 (m, 1H), 2.29-2.17 (m, 1H), 1.99-1.82 (m, 2H), 1.71-1.61 (m, 1H), 1.45 (s, 9H).
步驟2：（S）-1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-胺鹽酸鹽的合成
將（S）-叔丁基（1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-基）氨基甲酯（480.00mg，1.93mmol）溶於1，4-二氧六環（3mL）中，然後加入鹽酸-1，4-二氧六環溶液（4moL﹒L -1，4.94mL），反應液為黃色透明溶液。反應液在25℃下攪拌3小時。TLC檢測原料反應完全後，將反應溶液減壓濃縮得化合物（S）-1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-胺鹽酸鹽（450.00mg）。
1H NMR (400 MHz, DMSO- d 6) δ 8.80-8.42 (m, 3H), 4.62 (s, 1H), 4.51 (s, 1H), 4.12-3.45 (m, 3H), 3.17 (br s, 3H), 2.35-1.99 (m, 4H).
步驟3：(R)-1-(1H-吲哚-3-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)丙烷-2-胺的合成
將(2R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙烷-2-胺(600mg，3.44mmol)和N,N-二異丙基乙胺(445.05mg，3.44mmol)溶於1,4-二氧六環(10mL)中，在25℃下加入溶在1,4-二氧六環(5mL)中的三氟甲磺酸三氟乙酯(1.20g，5.17mmol)，反應液於75℃攪拌反應16小時。將反應液減壓濃縮至乾。然後柱層析純化（二氧化矽，石油醚/乙酸乙酯=3/1）得到產物(R)-1-(1H-吲哚-3-基)-N-(2,2,2-三氟乙基)丙烷-2-胺（0.69g）。
MS m/z (ESI): 257.2 [M+H] +;
1H NMR (400MHz, METHANOL-d 4) δ 7.56-7.54 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.36-7.34 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.12-7.08 (m, 2H), 7.03-7.00 (m, 1H), 3.26-3.23 (m, 2H), 3.12-3.10 (m, 1H), 2.93-2.88 (m, 1H), 2.80-2.78 (m, 1H), 1.11 (d, J= 6.0 Hz, 3H)
步驟4：（1S，3R）-1-（5-溴吡啶-2-基）-3-甲基-2-（2，2，2-三氟乙基）-2，3，4，9-四氫-1H-吡啶並[3，4-b]吲哚的合成
將（R）-1-（1H-吲哚-3-基）-N-（2，2，2-三氟乙基）丙烷-2-胺（120.00mg，468.26μmol）溶於甲苯（2mL）中，加入5-溴-吡啶-2-甲醛（87.10mg，468.26μmol）和乙酸（562.40mg，9.37mmol），反應液為黃色透明溶液。反應液在90℃下攪拌10小時。LCMS檢測反應完成後，將反應溶液冷卻至室溫後，減壓濃縮乾，經薄層層析純化（二氧化矽，石油醚/乙酸乙酯=4/1）得（1S，3R）-1-（5-溴吡啶-2-基）-3-甲基-2-（2，2，2-三氟乙基）-2，3，4，9-四氫-1H-吡啶並[3，4-b]吲哚（110.00mg）。
MS m/z (ESI):424.1, 426.1 [M+H] +。
1H NMR (400 MHz, METHANOL- d 4) δ 8.59 (s, 1H), 8.01-7.94 (m, 1H), 7.54 (d, J =8.53 Hz, 1H), 7.46 (d, J =7.78 Hz, 1H), 7.30 (d, J =8.03 Hz, 1H), 7.08 (d, J =7.59 Hz, 1H), 7.03-6.96 (m, 1H), 5.08 (s, 1H), 3.58-3.46 (m, 1H), 3.38-3.34 (m, 1H), 3.13-2.99- (m, 1H), 2.80 (d, J =4.52 Hz, 1H), 2.70-2.61 (m, 1H), 1.26 (d, J =6.78 Hz, 3H).
步驟5：N-（（S）-1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-基）-6-（（（1S,3R）-3-甲基-2-（2,2,2-三氟乙基）-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶並[3,4-b]吲哚-1-基）吡啶-3-胺(式(I)化合物)的合成
將（1S,3R）-1-（5-溴吡啶-2-基）-3-甲基-2-（2,2,2-三氟乙基）-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶並[3,4-b]吲哚（140.00mg，263.99μmol）溶於四氫呋喃（3mL）中，加入（S）-1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-胺鹽酸鹽（86.77mg，316.79μmol），叔丁醇鈉（152.22mg，1.58mmol）和甲烷磺酸（2-二環己基膦）-3，6-二甲氧基-2，4，6-三異丙基-1，1-聯苯）（2-氨基-1，1-聯苯-2-基）鈀（II）（23.93mg，26.40μmol），氮氣環境下反應液在80℃攪拌4小時。LCMS檢測反應完成後，冷卻至室溫，過濾，濾液減壓濃縮後，經過製備液相色譜純化（Phenomenex Gemini C18柱，3um二氧化矽，30mm直徑，75mm長度）；（使用水（含有0.225%甲酸）和乙腈的極性遞減的混合物作為洗脫液）純化得到化合物N-（（S）-1-（3-氟丙基）吡咯烷-3-基）-6-（（（1S,3R）-3-甲基-2-（2,2,2-三氟乙基）-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶並[3,4-b]吲哚-1-基）吡啶-3-胺（37.79mg）。
MS m/z (ESI): 365.1 [M+H] +。
1H NMR (400 MHz, METHANOL- d 4) δ 7.89 (d, J =2.76 Hz, 1H), 7.46 (d, J =7.78 Hz, 1H), 7.25 (d, J =8.53 Hz, 2H), 7.09-7.03 (m, 2H), 7.02-6.97 (m, 1H), 4.98 (s, 1H), 4.60 (t, J =5.65 Hz, 1H), 4.49 (t, J =5.65 Hz, 1H), 4.18 (br s, 1H), 3.51-3.35 (m, 4H), 3.14-2.99 (m, 5H), 2.92 (dd, J =15.18, 4.89 Hz, 1H), 2.65 (dd, J =16.06, 6.78 Hz, 1H), 2.53-2.42 (m, 1H), 2.12-1.92 (m, 3H), 1.20 (d, J =6.78 Hz, 3H).
式(I)化合物的絕對構型鑒定
NOESY圖譜(圖1)顯示，式(I)化合物的3位上的甲基氫與1位上的氫有明顯的NOE效應，證明兩者在同側，1位上的吡啶基與3位上的甲基在6元呱啶環上的相對構型為反式，已知3位碳原子的絕對構型為R，因此1位碳原子的絕對構型為S。
實施例2：式(I)化合物硫酸鹽的製備
將500mg式(I)化合物、10ml異丙醚加入50ml單口瓶中，室溫攪拌至固體完全溶清，加入100mg濃硫酸，升溫至反應液回流，保溫反應1h，降至室溫攪拌過夜，抽濾，固體40℃真空乾燥3h，得0.58g固體。
實施例3：式(I)化合物磷酸鹽的製備
將0.5g式(I)化合物、10ml異丙醚加入50ml單口瓶中，室溫攪拌至固體完全溶清，加入118mg磷酸，升溫至反應液回流，保溫反應1h，降至室溫攪拌過夜，抽濾，固體40℃真空乾燥3h，得0.53g固體。
實施例4：式(I)化合物富馬酸鹽的製備
將0.5g式(I)化合物、10ml異丙醇加入50ml單口瓶中，室溫攪拌至固體完全溶清，加入118.5mg富馬酸，升溫至反應液回流，保溫反應1h，降至室溫攪拌過夜，抽濾，固體40℃真空乾燥3h，得0.3g固體。
實施例5：式(I)化合物L-蘋果酸鹽的製備
將50mg式(I)化合物、1ml異丙醚加入5ml離心管，室溫攪拌至固體完全溶清，加入13.7mg L-蘋果酸，室溫攪拌過夜，抽濾，固體室溫真空乾燥3h，得30mg固體。
實施例6：式(I)化合物檸檬酸鹽的製備
將50mg式(I)化合物、1ml甲基叔丁基醚加入5ml離心管，室溫攪拌至固體完全溶清，加入21.5mg檸檬酸，室溫攪拌3h，抽濾，固體室溫真空乾燥3h，得26mg固體。
實施例7：式(I)化合物己二酸鹽C晶型的製備
將0.7g己二酸和19ml異丙醇加入100ml單口瓶中，升溫至60℃，固體溶清。將2.36g式(I)化合物和19ml異丙醇加入100ml單口瓶中，室溫攪拌溶清後滴入己二酸異丙醇溶液，室溫攪拌過夜，析晶，抽濾，室溫真空乾燥3h，得1.66g固體。所得固體經X-射線粉末衍射譜（X-ray Powder Diffraction, XRPD）確認為晶體形態（C晶型），C晶型的XRPD圖譜見圖2，其DSC圖譜見圖3，TGA圖譜見圖4，其DSC吸熱峰峰值在149.89 oC附近，其XRPD衍射峰位置如下表1所示。 表1
峰序號 2 θ值[ o或度] d[Å] 相對強度（%）
1 4.458 19.80532 62.02%
2 6.300 14.01734 100.00%
3 7.025 12.57291 11.55%
4 8.899 9.92934 21.43%
5 10.647 8.30269 6.37%
6 11.947 7.40198 4.27%
7 12.551 7.04674 3.82%
8 12.961 6.82520 3.07%
9 13.342 6.63099 4.26%
10 14.200 6.23215 3.74%
11 15.204 5.82268 1.97%
12 16.023 5.52687 9.86%
13 16.451 5.38418 12.52%
14 17.777 4.98527 12.54%
15 18.325 4.83751 3.54%
16 19.098 4.64343 21.85%
17 19.766 4.48806 8.68%
18 20.123 4.40924 7.01%
19 21.030 4.22097 11.66%
20 21.620 4.10711 4.33%
21 22.443 3.95833 7.66%
22 22.524 3.94430 7.75%
23 22.542 3.94124 7.45%
24 23.352 3.80631 2.95%
25 23.977 3.70841 1.84%
26 24.300 3.65994 5.85%
27 24.860 3.57867 5.44%
28 25.374 3.50730 4.11%
29 25.973 3.42779 5.47%
30 27.393 3.25328 6.39%
31 27.976 3.18672 3.71%
32 28.807 3.09673 1.87%
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.60 (s, 1H), 7.85 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.39 (t, J = 9.5 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.11 – 6.86 (m, 4H), 5.99 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.91 (s, 1H), 4.53 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.85 (d, J = 3.2 Hz, 1H), 3.55 (dq, J = 20.2, 10.0 Hz, 1H), 3.35 – 3.25 (m, 1H), 3.01 (dq, J = 19.3, 9.6 Hz, 1H), 2.81 (dd, J = 9.2, 7.0 Hz, 1H), 2.71 – 2.52 (m, 3H), 2.49 – 2.41 (m, 3H), 2.34 (dd, J = 9.3, 4.5 Hz, 1H), 2.25 – 2.13 (m, 5H), 1.87 – 1.72 (m, 2H), 1.61 – 1.52 (m, 1H), 1.52 – 1.41 (m, 4H), 1.13 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
實施例8：式(I)化合物苯甲酸鹽B晶型的製備
將3.0g式(I)化合物、100ml異丙醚加入250ml單口瓶中，室溫攪拌至固體完全溶清，加入0.75g苯甲酸，室溫攪拌過夜，抽濾，將濾餅及30ml異丙醚加100ml單口瓶中室溫攪拌1h，析晶，抽濾，室溫真空乾燥所得濾餅3h，得3.11g固體。所得固體經X-射線粉末衍射譜確認為晶體形態（B晶型），該結晶固體的XRPD圖譜見圖5，其DSC圖譜見圖6，TGA圖譜見圖7，其DSC吸熱峰峰值在150.08 oC附近，其XRPD衍射峰位置如下表2所示。 表2
峰序號 2 θ值[ o或度] d[Å] 相對強度（%）
1 4.692 18.81760 38.49%
2 4.905 18.00028 15.27%
3 6.343 13.92354 32.41%
4 7.193 12.27979 84.17%
5 9.370 9.43108 9.39%
6 9.827 8.99308 20.60%
7 10.007 8.83218 53.01%
8 10.319 8.56606 9.43%
9 11.111 7.95703 21.44%
10 11.388 7.76420 51.80%
11 12.064 7.33060 6.73%
12 12.688 6.97112 12.47%
13 13.516 6.54578 3.97%
14 14.067 6.29085 16.11%
15 14.359 6.16354 15.27%
16 14.781 5.98852 27.88%
17 17.303 5.12098 9.90%
18 18.780 4.72137 100.00%
19 19.007 4.66536 61.65%
20 19.249 4.60735 46.38%
21 19.659 4.51223 62.54%
22 19.912 4.45531 59.93%
23 20.091 4.41613 85.94%
24 20.796 4.26793 31.48%
25 21.146 4.19817 18.68%
26 21.657 4.10014 31.29%
27 22.350 3.97456 9.67%
28 23.573 3.77102 16.86%
29 23.702 3.75082 19.76%
30 24.634 3.61104 9.39%
31 25.681 3.46609 6.73%
32 27.048 3.29390 7.99%
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.60 (s, 1H), 7.98 – 7.91 (m, 2H), 7.85 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.62 (t, J = 7.4 Hz, 1H), 7.50 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.09 – 6.99 (m, 2H), 6.97 – 6.89 (m, 2H), 6.00 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 4.90 (s, 1H), 4.54 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.85 (s, 2H), 3.01 (dt, J = 25.3, 9.6 Hz, 2H), 2.82 (dd, J = 9.2, 6.9 Hz, 1H), 2.71 – 2.54 (m, 3H), 2.45 (dd, J = 11.9, 7.3 Hz, 3H), 2.35 (dd, J = 9.4, 4.5 Hz, 1H), 2.19 (dt, J = 13.4, 7.8 Hz, 1H), 1.91 – 1.73 (m, 2H), 1.55 (dt, J = 12.7, 6.3 Hz, 1H), 1.13 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
實施例9：式(I)化合物琥珀酸鹽的製備
將5.0g式(I)化合物、100ml異丙醚裝入250ml單口瓶中，室溫攪拌至固體完全溶清。加入1.21g琥珀酸，室溫攪拌過夜，抽濾，室溫真空乾燥3h，得5.4g的式(I)化合物琥珀酸鹽。
實施例10：式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的製備
實施例10-1：將實施例9得到的琥珀酸鹽加入甲醇溶清，減壓濃縮得泡沫狀固體。稱取泡沫狀固體500mg，將乙醇（4.5ml）、水（0.5ml）加入10ml單口瓶中，室溫攪拌，固體溶清，保溫攪拌2h析出固體，抽濾，室溫真空乾燥所得固體3h，得0.22g的式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型。所得固體經X-射線粉末衍射譜確認，該結晶固體的XRPD圖譜見圖8，其DSC圖譜見圖9，TGA圖譜見圖10，其DSC吸熱峰峰值在186.82 oC附近，其XRPD衍射峰位置如下表3所示。 表3
峰序號 2 θ值[ o或度] d[Å] 相對強度（%）
1 5.009 17.62809 2.60%
2 7.126 12.39530 28.15%
3 9.303 9.49916 18.36%
4 10.094 8.75593 6.21%
5 11.288 7.83226 46.04%
6 11.734 7.53556 4.28%
7 13.752 6.43413 5.95%
8 14.295 6.19071 6.23%
9 15.181 5.83144 5.59%
10 15.508 5.70918 16.05%
11 15.995 5.53652 8.84%
12 17.100 5.18115 12.94%
13 18.253 4.85637 4.70%
14 18.689 4.74414 4.38%
15 19.894 4.45944 100.00%
16 20.258 4.37996 13.01%
17 20.908 4.24534 14.71%
18 21.123 4.20252 7.07%
19 21.514 4.12706 10.75%
20 22.688 3.91620 11.49%
21 23.050 3.85536 5.98%
22 23.579 3.77018 10.22%
23 24.581 3.61866 3.74%
24 25.417 3.50146 14.28%
25 26.662 3.34073 5.88%
26 27.235 3.27173 6.09%
27 28.650 3.11327 1.93%
28 29.472 3.02833 4.89%
29 30.895 2.89201 3.40%
30 32.307 2.76879 3.35%
31 34.449 2.60131 1.59%
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 10.59 (s, 1H), 7.86 (d, J = 2.6 Hz, 1H), 7.40 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.02 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.98 – 6.91 (m, 2H), 6.01 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 4.91 (s, 1H), 4.54 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.89 (s, 1H), 3.54 (dq, J = 20.1, 10.0 Hz, 1H), 3.31 (dq, J = 13.3, 6.5 Hz, 1H), 3.02 (dq, J = 19.3, 9.6 Hz, 1H), 2.89 (dd, J = 9.4, 6.9 Hz, 1H), 2.67 (dt, J = 8.8, 6.4 Hz, 2H), 2.59 – 2.52 (m, 4H), 2.43 (dd, J = 9.2, 4.1 Hz, 1H), 2.40 (s, 4H), 2.21 (td, J = 13.7, 7.8 Hz, 1H), 1.90 – 1.75 (m, 2H), 1.59 (td, J = 12.6, 7.0 Hz, 1H), 1.14 (d, J = 6.7 Hz, 3H).
式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型還可通過以下實施例製備得到：在5ml離心管中加入100mg上述泡沫狀固體與500μL溶劑（見表4），室溫攪拌1-24小時，抽濾出固體，並將其於室溫真空乾燥。詳細見表4。 表4
 實施例 溶劑 晶型
10-2 異丙醚 A晶型
10-3 甲基叔丁基醚 A晶型
實施例 11 ：式 (I) 化合物琥珀酸鹽單晶研究
可通過如下方法製備式(I)化合物琥珀酸鹽的單晶：取約10mg的上述式(I)化合物琥珀酸鹽（由實施例9製備得到）置於3mL樣品瓶中，加入1500µL異丙醚與900µL四氫呋喃，超聲溶解後，用封口膜將瓶口密封並用針頭在封口膜上紮一個小孔，室溫靜置3天，析出晶體，制得，所得單晶樣品經X-粉末衍射檢測為A晶型。
對所得單晶進行單晶X-射線衍射資料收集並解析其單晶結構。其單晶結構資料如表5所示。
根據單晶衍射結果分析，單晶屬四方晶系，空間群I 4。晶胞參數：a= 24.6731(4) Å，b= 24.6731(4) Å，c= 10.2575(3)Å，α=90°，β= 90°，γ=90°, 晶胞體積V= 6244.4(3) Å 3。可靠因數R1= 0.0891，wR2=0.2852，S=0.992。化學計量式為C 30H 37F 4N 5O 4，計算不對稱單元分子量為607.64，單個晶胞中含有8個不對稱單元，每個不對稱單元含有1個游離鹼分子與1個琥珀酸分子，如圖11和圖12所示。
確認式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的絕對構型為： 表5：單晶X-射線衍射資料
化學式 C 30H 37F 4N 5O 4
化學式量 607.64
晶系 四方
空間群 I 4
a，Å a= 24.6731(4)
b，Å b= 24.6731(4)
c，Å c= 10.2575(3)
α，deg 90°
β，deg 90°
γ，deg 90°
體積，Å 3 6244.4(3)
Z 8
D calc, g cm -3 1.293
溫度，K 190.0
輻射（波長） Ga Kα（1.34139）
儀器 BRUKER D8 VENTURE
h，k，l範圍 -32＜=h＜=29, -31＜=k＜=32, -11＜=l＜=13
θ範圍 2.203-60.581
程式 SHELXL-2014
採集的資料 8778
獨特性資料（Unique data） 7042
R（Ｆ o） 0.0891
R W（Ｆ o 2） 0.2852
擬合優度 0.992
絕對構型測定 Flack參數-0.09(10)
生物學活性及相關性質的測試
測試例1、式(I)化合物及其可藥用鹽飽和溶解度試驗
實驗儀器：迴旋式水浴恆溫振盪器（太倉文爾惠金，型號DSHZ-300A）；高效液相色譜儀（安捷倫1260）。
實驗方法：精密稱取供試樣品約10mg，置10ml離心管中，加水1ml，至水浴恆溫振盪器中振搖（37℃，150rpm），若樣品完全溶解，則繼續加入樣品10mg，振搖約24小時，取上清液，用乙腈進行適當稀釋後進行HPLC檢測，按外標法測定其濃度。
實驗結果：待測化合物的飽和溶解度如表6所示，可見式(I)化合物琥珀酸鹽、苯甲酸鹽和己二酸鹽的24h飽和溶解度顯著優於游離鹼。 表6：飽和溶解度試驗結果
化合物樣品 溶劑 24h時溶解度（mg/ml）
式(I)化合物琥珀酸鹽 (實施例10-1) 水 3.27
式(I)化合物苯甲酸鹽 (實施例8) 0.70
式(I)化合物己二酸鹽 (實施例7) 2.48
式(I)化合物 (實施例1) 0.05
測試例2、式(I)化合物及其可藥用鹽的異構體雜質考察試驗
試驗方法：將式(I)化合物琥珀酸鹽（實施例10-1，A晶型）、式(I)化合物己二酸鹽(實施例7，C晶型)、式(I)化合物（實施例1）均採用兩層聚乙烯、一層藥用複合膜包裝，重點考察在高溫、光照、高濕、加速等條件下式(I)化合物的異構體雜質的含量變化，結果如表7所示。異構體雜質分別為異構體1和異構體2，結構如下所示。N.D表示未檢測到該雜質。
試驗結果：式(I)化合物琥珀酸鹽和式(I)化合物己二酸鹽在高溫、光照、加速和高濕條件下，其異構體雜質均未明顯增長，游離狀態的式(I)化合物在5天的高溫條件下，其異構體1雜質的含量出現較明顯的增長。另外游離狀態的式(I)化合物在高溫、光照、加速和高濕條件下檢測到新的異構體2雜質。該試驗證明化合物的上述鹽型熱穩定性更優，且相較於游離鹼能更有效地抑制異構體雜質的產生。 表7：異構體雜質考察試驗結果
測試樣品 放樣條件 異構體1含量% 異構體2含量%
式(I)化合物琥珀酸鹽 0時 0.20 N.D
式(I)化合物己二酸鹽 0.17 N.D
式(I)化合物 0.03 N.D
式(I)化合物琥珀酸鹽 60℃，8天 0.23 N.D
40℃/75%RH，8天 0.26 N.D
92.5%RH，8天 0.25 N.D
4500lux，8天 0.23 N.D
式(I)化合物己二酸鹽 60℃，8天 0.16 N.D
40℃/75%RH，8天 0.23 N.D
92.5%RH，8天 0.25 N.D
4500lux，8天 0.21 N.D
式(I)化合物 60℃，5天 0.12 0.48
40℃/75%RH，5天 0.04 0.10
92.5%RH，5天 0.04 0.05
4500lux，5天 0.04 0.34
測試例3、式(I)化合物可藥用鹽穩定性考察試驗
試驗方法：將式(I)化合物琥珀酸鹽（實施例10-1，A晶型）、式(I)化合物苯甲酸鹽（實施例8，B晶型）、式(I)化合物己二酸鹽（實施例7，C晶型）均採用兩層聚乙烯、一層藥用複合膜包裝，考察在高溫、光照、加速和高濕等條件下的雜質數量和雜質總量的變化，結果如表8所示。
試驗結果：式(I)化合物琥珀酸鹽、式(I)化合物苯甲酸鹽和式(I)化合物己二酸鹽均能較好地控制總雜含量，特別是式(I)化合物琥珀酸鹽和式(I)化合物己二酸鹽在高溫、光照、加速和高濕等條件下，其總雜含量和雜質增長率這兩方面均表現出色。 表8：穩定性考察試驗結果
測試樣品 放樣條件 雜質個數及總雜含量
式(I)化合物琥珀酸鹽 0時 3 / 1.1%
60℃，5天 6 / 1.5%
40℃/75%RH，5天 3 / 1.2%
92.5%RH，5天 3 / 1.3%
4500lux，5天 8 / 1.6%
式(I)化合物苯甲酸鹽 0時 6 / 2.6%
60℃，4天 7 / 3.6%
40℃/75%RH，4天 8 / 2.9%
92.5%RH，4天 7 / 2.8%
4500lux，4天 7 / 2.9%
式(I)化合物己二酸鹽 0時 1 / 0.69%
60℃，5天 4 / 1.2%
40℃/75%RH，5天 3 / 0.87%
92.5%RH，5天 2 / 0.82%
4500lux，5天 3 / 1.0%
測試例 4 ：式 (I) 化合物及其可藥用鹽的大鼠藥代動力學評價
實驗材料： SD雌性大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。 MC（甲基纖維素）購自Sigma。 乙腈購自Merck（USA）。
實驗方法：
雌性SD大鼠12只(200-300g，6-8周），隨機分成4組，每組3只。分別口服給予式(I)化合物、式(I)化合物苯甲酸鹽、式(I)化合物琥珀酸鹽和式(I)化合物己二酸鹽，劑量24mg/kg，溶媒0.5%甲基纖維素水溶液。動物實驗前正常喂水，禁食過夜，在給藥後4h恢復食物供給。每組大鼠於給藥前及給藥後0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h和48h進行頸靜脈采血。收集的全血樣品置於K 2EDTA抗凝管中，離心5 min後（12000 rpm，4ºC）取血漿待測。
取大鼠血漿樣品10 μL ，加入150 μL乙腈溶劑（其中含內標化合物）沉澱蛋白，渦旋5 min後，離心（14000 rpm）5 min，上清液用含0.1%(v/v)FA的水稀釋2倍，於LC-MS/MS系統（AB Sciex Triple Quad 6500+）進行定量檢測。在測定樣品濃度時隨行SD大鼠血漿標準曲線和質控樣品。對10x稀釋樣品，取2μL樣品加入18μL的空白血漿，渦旋0.5 min後，加入300 μL乙腈溶劑（其中含內標化合物）沉澱蛋白，其餘處理步驟同不稀釋樣品。
實驗結果：
相對於游離鹼，式(I)化合物苯甲酸鹽、式(I)化合物琥珀酸鹽和式(I)化合物己二酸鹽均取得了更為優異的PK特性，具有良好的口服生物利用度。 表9 式(I)化合物及其可藥用鹽的大鼠PK測試結果
PK參數 式(I)化合物
游離鹼 苯甲酸鹽 琥珀酸鹽 己二酸鹽
T max(h) 5.50 5.00 5.50 5.50
C max(ng/mL) 692 825 961 961
AUC last(h*ng/mL) 19188 23834 25893 22760
F% - 124 135 119
測試例5 式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型對乳腺癌細胞的體外增殖抑制研究
實驗材料：MCF-7, CAMA-1, HCC1500, T47D, 及SK-BR-3細胞均購自ATCC，EFM-19 及MCF-7 ESR1 Y537S突變株購自科佰生物。細胞培養條件參照ATCC或科佰產品說明書，培養基購自Invitrogen，血清購自Gibico。MCF-7 培養基為 DMEM+ 10% FBS+0.01 mg/ml 人胰島素 (翌聖)+1% 非必需胺基酸。CAMA-1培養基為EMEM+10%FBS. HCC1500及EFM-19 培養基為RPMI-1640+10% FBS。T47D培養基為 RPMI-1640+10% HI-FBS+2 unit/mL牛胰島素(Solarbio)。MCF-7 ESR1 Y537S培養基為MEM+10% FBS+1 mM丙酮酸鈉+1%非必需胺基酸。SK-BR-3培養基為McCoy’s 5A+10% FBS。氟維司群購自MCE。式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型根據實施例10-1方法製備得到。
實驗方法：培養細胞融合率達到70%以上時，消化細胞，MCF-7,T47D, MCF ESR1 Y537S細胞密度調整為500/20 μL/孔，HCC1500細胞密度調整為2000/20 μL/孔，CAMA-1, EFM-19以及SK-BR-3細胞密度調整為1000/20 μL/孔種在384孔細胞培養板中（Corning）培養過夜。使用Echo650（Beckman）轉移120 nL 3倍稀釋化合物至細胞板中, 補加40 μL相應培養基，化合物處理7天后，加入CellTiter-Glo (Promega)檢測細胞活力，細胞孔作為0%抑制對照，0.1 μM氟維司群處理孔作為100%抑制對照（其中MCF-7 ESR1 Y537S使用2 μM氟維司群處理孔作為100%抑制對照，SK-BR-3使用培養基孔作為100%抑制對照）。使用IDBS XLfit 進行4參數擬合計算IC 50及最大抑制率資料。
實驗結果：式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型對不同ER陽性乳腺癌細胞株均表現出較強的增殖抑制作用，IC 50＜1 nM，對ESR1 Y537S突變株增殖抑制IC 50為27.6 nM，對ER陰性細胞SK-BR-3最高2 μM濃度下無增殖抑制作用。 表10 式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型對乳腺癌細胞增殖抑制作用
細胞株 IC 50_nM 最大抑制率%
MCF7 0.78 99.59
MCF-7 ESR1 Y537S 27.60 100.96
HCC1500 0.94 90.32
 CAMA-1 0.38 97.66
EFM-19 0.40 110.99
T47D 0.55 94.29
SK-BR-3 (ER -) ＞2000 -2.5
測試例6 式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型對MCF-7及MCF-7 ESR1 Y537S突變株ER蛋白降解作用
實驗材料：MCF-7購自ATCC，MCF-7 ESR1 Y537S突變株購自科佰生物。細胞培養條件參照ATCC或科佰產品說明書，培養基購自Invitrogen，血清購自Gibico。MCF-7 培養基為 DMEM+ 10% FBS+0.01 mg/ml 人胰島素 (翌聖)+1% 非必需胺基酸。CAMA-1培養基為EMEM+10%FBS。MCF-7 ESR1 Y537S培養基為MEM+10% FBS+1 mM丙酮酸鈉+1%非必需胺基酸。氟維司群購自MCE。式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型根據實施例10-1方法製備得到。
實驗方法：培養細胞融合率達到70%以上時，消化細胞，調整細胞密度為5000/20 μL/孔，種在384孔細胞培養板中（Greiner）培養過夜。使用Echo650（Beckman）轉移100 nL 3倍稀釋化合物至細胞板中，24小時後加入20 μL 8% 甲醛（滬試）室溫固定20分鐘，加入50 μL冰甲醇（Millipore）透膜處理10分鐘，加入50 μL Licor blocking buffer室溫封閉1小時，加入20 μL ER抗體（CST）及GAPDH抗體（Abcam）4度孵育過夜。洗掉一抗，加入IRDye 800 羊抗兔IgG抗體及IRDye 680羊抗鼠IgG抗體 (LI-COR) 避光孵育45分鐘，洗掉二抗，倒置1200轉每分離心1分鐘去除殘餘液體，使用Sapphire RGBNIR（Azure）檢測800 nM及680 nM信號。使用AzureSpot進行螢光定量分析，計算Chanel 800（ER）/ Chanel 680 (GAPDH） 數值，細胞孔作為0%抑制對照，MCF-7 使用0.1 μM氟維司群處理孔作為100%抑制對照，MCF-7 ESR1 Y537S使用2 μM氟維司群處理孔作為100%降解。使用IDBS XLfit 進行4參數擬合計算DC 50及最大降解率資料。
實驗結果：式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型對MCF-7及ESR1 Y537S突變株均表現出較高的ER降解作用。 表11式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型對MCF-7及ESR1 Y537S突變株ER降解作用
細胞株 DC 50_nM 最大降解率%
MCF7 0.73 105.09
MCF-7 ESR Y537S 47.32 99.57
測試例7 式(I)化合物琥珀酸鹽的人ER陽性乳腺癌MCF-7異種皮下移植瘤小鼠模型藥效學研究
實驗材料： 人乳腺癌MCF-7細胞：ECACC，86012803 17β-雌二醇片：Innovative Research of America, Cat No.: SE-121, 60-day release, 0.18 mg/pellet EMEM培養液：ATCC, Cat No.: 30-2003 胎牛血清：ExCell; Cat No.: FND500 雙抗：Gibco, Cat No.: 15240-062 0.25%胰酶-EDTA：Gibco, Cat No.: 25200-072 DPBS：Corning, Cat. No.: 21-031-CVR 基質膠: Corning, Cat. No.: 354234 氟維司群注射液（Fulvestrant）：阿斯利康（AstraZeneca），250 mg/5 mL/支
實驗方法：
動物資訊：Balb/c nude小鼠，雌性，6-8周，體重約18-22克，動物購自上海靈暢生物科技有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食和自由飲水。
細胞培養：人乳腺癌MCF-7細胞株體外培養，培養條件為EMEM（細胞培養液）中加入10%胎牛血清，1% 雙抗，37℃，5%CO 2孵箱。一周兩次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞匯合度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將0.2 ml/（含1×10 7個）MCF-7細胞懸液（DPBS：基質膠，體積比為1:1）皮下接種於每只小鼠的右後背，並於細胞接種前兩天皮下接種17β-雌二醇片。在接種細胞後第6天，腫瘤平均體積達到173.65 mm 3時開始分組給藥，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組給藥當天為第0天(Day 0)。
給藥：式(I)化合物琥珀酸鹽(實施例10-1，A晶型)的給藥劑量為0.3，1，3或10 mg/kg（以游離鹼計），口服給藥（PO），每天一次給藥（QD）x21次。氟維司群（Fulvestrant）的給藥劑量為250 mg/kg，皮下注射（SC），每週一次給藥（QW）x4次。每組8只小鼠。
腫瘤測量和實驗指標：
每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a x b 2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。每週兩次測量小鼠體重。
化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI（%）來評價。TGI（%）= [(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積)/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)]x100%。
實驗結果：
見表12，圖13和圖14。雖然有個別小鼠出現了超過10%的體重下降，但是與供試品式(I)化合物琥珀酸鹽的劑量無關，而且受試藥組的小鼠體重和溶媒對照組相比並無特別顯著的降低，考慮到該模型受到雌激素貼片的影響可能會影響小鼠狀態和體重，所以這些個別小鼠的體重下降與供試品式(I)化合物琥珀酸鹽無關。實驗各組均無小鼠死亡。
試驗結果表明，開始給藥後第20天（Day 20），一週一次皮下注射給予人乳腺癌MCF-7荷瘤小鼠250 mg/kg對照品Fulvestrant，對MCF-7異種移植腫瘤模型的腫瘤生長有較弱的抑制效果（P＜0.05）。一天一次口服給予荷瘤小鼠0.3 mg/kg的供試品式(I)化合物琥珀酸鹽，和溶媒對照組相比，顯示出一定的抑制腫瘤生長的作用（P＜0.0001），一天一次口服給予荷瘤小鼠1 mg/kg, 3 mg/kg或10 mg/kg的供試品式(I)化合物琥珀酸鹽，和溶媒對照組相比，顯示出顯著的抑制腫瘤生長的作用（P＜0.0001），並呈現較好的劑量依賴性，在1 mg/kg及以上的劑量下，腫瘤開始消退。在人乳腺癌MCF-7皮下瘤模型上，式(I)化合物琥珀酸鹽在1 mg/kg及以上的劑量下（PO，QD），顯示出了顯著優於對照品Fulvestrant（250 mg/kg，SC，QW）的抗腫瘤活性（P＜0.0001）。 表 12  MCF-7 皮下瘤模型腫瘤體積
受試化合物 劑量 mg/kg 給藥方式 給藥頻率 平均腫瘤體積（ mm 3 ） TGI （ % ）
0 天 2 天 6 天 9 天 13 天 16 天 20 天
溶劑對照 / PO QD 174 222 290 368 507 679 780 /
Fulvestrant 250 SC QW 174 213 267 305 367 483 605 28.84
式(I)化合物琥珀酸鹽 0.3 PO QD 174 199 236 278 340 396 506 45.22
式(I)化合物琥珀酸鹽 1 PO QD 174 192 129 112 92 83 75 116.33
式(I)化合物琥珀酸鹽 3 PO QD 174 180 96 76 55 38 33 123.26
式(I)化合物琥珀酸鹽 10 PO QD 174 188 72 57 56 37 29 123.80
測試例 8 式 (I) 化合物琥珀酸鹽的人 ER 陽性乳腺癌 T47D 異種皮下移植瘤小鼠模型藥效學研究
實驗材料：人乳腺癌xxT47D細胞，為T47D (ATCC, HTB-133)經過兩次體內傳代的細胞 17β-雌二醇片：Innovative Research of America, Cat No.: SE-121, 60-day release, 0.18 mg/pellet RPMI-1640培養液：Gibco, Cat No.: C22400500BT 胎牛血清：HyClone; Cat No.: SV30087.03 牛胰島素：源葉，Cat. No.: 11070-73-8 雙抗：Gibco, Cat No.: 15240-062 0.25%胰酶-EDTA：Gibco, Cat No.: 25200072 DPBS：Corning, Cat. No.: 21-031-CVR 基質膠: Corning, Cat. No.: 354234 氟維司群注射液（Fulvestrant）：阿斯利康（AstraZeneca），250 mg/5 mL/支
實驗方法：
動物資訊：Balb/c nude小鼠，雌性，6-8周，體重約18-22克，動物購自上海靈暢生物科技有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食和自由飲水。
細胞培養：人乳腺癌xxT47D細胞體外培養，培養條件為RPMI-1640培養基中加10%胎牛血清，0.2 Units/mL 牛胰島素，1%雙抗，37ºC 5%CO 2孵箱培養。一周兩次用胰酶-EDTA進行常規消化處理傳代。當細胞匯合度為80%~90%，數量到達要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將 0.2 mL（含1×10 7個）xxT47D細胞懸液（DPBS：基質膠，體積比為1:1）皮下接種於每只小鼠的右後背，並於細胞接種前兩天皮下接種17β-雌二醇片。在接種細胞後第6天，腫瘤平均體積達到137.09 mm 3時開始分組給藥，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組給藥當天為第0天(Day 0)。
給藥：式(I)化合物琥珀酸鹽(實施例10-1，A晶型)的給藥劑量為0.3，1或3 mg/kg，口服給藥（PO），每天一次給藥（QD）x28次。氟維司群（Fulvestrant）的給藥劑量為250 mg/kg，皮下注射（SC），每週一次給藥（QW）x4次。每組8只小鼠。
腫瘤測量和實驗指標：
每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a x b 2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。每週兩次測量小鼠體重。
化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI（%）來評價。TGI（%）= [(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積)/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)]x100%。
實驗結果：
見表13，圖15和圖16。
試驗結果表明，在開始給藥後第28天（Day 28），一週一次皮下注射給予人乳腺癌T47D荷瘤小鼠250 mg/kg對照品Fulvestrant，和溶媒對照組相比，顯示出一定的抗腫瘤生長的作用（P＜0.0001）。一天一次口服給予荷瘤小鼠0.3 mg/kg，1 mg/kg或3 mg/kg的供試品式(I)化合物琥珀酸鹽，和溶媒對照組相比有一定或顯著的抑制腫瘤生長的作用（P＜0.0001），並呈現較好的劑量依賴性。在人乳腺癌T47D皮下瘤模型上，式(I)化合物琥珀酸鹽在1 mg/kg及以上的劑量下（PO，QD），顯示出了顯著優於對照品Fulvestrant（250 mg/kg，SC，QW）的抗腫瘤活性（P＜0.0001）。 表 13  T47D 皮下瘤模型腫瘤體積
受試化合物 劑量 mg/kg 給藥方式 給藥頻率 平均腫瘤體積（mm 3） TGI（%）
0天 4天 7天 11天 14天 18天 21天 25天 28天
溶劑對照 / PO QD 137 245 355 473 580 700 796 931 1078 /
Fulvestrant 250 SC QW 137 220 317 372 424 474 466 557 627 48.35
式(I)化合物琥珀酸鹽 0.3 PO QD 137 217 318 412 505 544 501 596 703 39.87
式(I)化合物琥珀酸鹽 1 PO QD 137 228 261 271 245 271 220 289 349 77.47
式(I)化合物琥珀酸鹽 3 PO QD 137 207 208 196 185 197 176 225 277 85.04
測試例 9 式 (I) 化合物琥珀酸鹽的人 ER 陽性乳腺癌 MCF-7 異種腦原位移植瘤小鼠模型藥效學研究
實驗材料人乳腺癌MCF-7細胞：ATCC，HTB-22 17β-雌二醇片：Innovative Research of America, SE-121, 60-day release, 0.72 mg/pellet EMEM培養液：ATCC, Cat No.: 30-2003 胎牛血清：Gibco, Cat No.: 10099-141C 重組人胰島素：上海翊聖生物科技有限公司，Cat No.: 40112ES60 青鏈黴素（P/S）：Gibco, Cat No.: 15140-122 0.25%胰酶-EDTA：Gibco, Cat No.: 25200-072 DPBS：Hyclone, Cat. No.: SH30256.01 氟維司群注射液（Fulvestrant）：阿斯利康（AstraZeneca），250 mg/5 mL/支
實驗方法
動物資訊：NPG小鼠，雌性，6-7周，體重約17-23克，動物購自北京維通達生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食和自由飲水。
細胞培養：人乳腺癌MCF-7細胞株體外培養，培養條件為EMEM（細胞培養液）中加入10%胎牛血清，10 μg/ml重組人胰島素和1% P/S，37℃，5%CO 2孵箱。一週一到兩次用0.25%胰酶-EDTA進行常規消化處理傳代。數量到達要求以及細胞在對數生長期時，收取細胞，計數。
細胞接種：將0.015 ml/（含2×10 6個）MCF-7細胞懸液腦原位接種於每只小鼠的大腦（前囟前1 mm, 中縫右側2 mm, 顱骨硬腦膜平面下3 mm），並於細胞接種前三天皮下接種17β-雌二醇片。在接種細胞後第8天，開始分組給藥，依據動物體重隨機分組給藥，分組當天為Day 0。
給藥：式(I)化合物琥珀酸鹽(實施例10-1，A晶型)的給藥劑量為3，10或30 mg/kg，口服給藥（PO），每天一次給藥（QD），持續給藥到Day 60。氟維司群（Fulvestrant）的給藥劑量為250 mg/kg，皮下注射（SC），每週一次給藥（QW），持續給藥到Day 60。每組8只小鼠。
體重測量和實驗指標： 每週兩次稱量小鼠體重。 化合物的抑瘤療效用中位生存期來評價。
實驗結果：
見表14和圖17。與溶劑對照組相比，一週一次皮下注射給予MCF-7腦原位腫瘤模型動物250 mg/kg Fulvestrant對動物的生存率沒有顯著提高，而一天一次口服給予MCF-7腦原位腫瘤模型動物10或30 mg/kg式(I)化合物琥珀酸鹽可以顯著提高小鼠生存率（P＜0.001），改善動物狀態，藥效明顯強於Fulvestrant（P＜0.001）。 表 14  MCF-7 腦原位模型各治療組對小鼠生存率的影響
受試化合物 劑量 mg/kg 給藥方式 給藥頻率 中位生存期（天） 第 60 天 (Day 60) 存活小鼠比例
溶劑對照 / PO QD 26.5 1/8
Fulvestrant 250 SC QW 27 1/8
式(I)化合物琥珀酸鹽 3 PO QD 31 3/8
式(I)化合物琥珀酸鹽 10 PO QD - 8/8
式(I)化合物琥珀酸鹽 30 PO QD - 8/8
測試例 10 ：式 (I) 化合物對 MCF7 細胞內雌激素受體降解效果研究試驗1.       實驗目的 本實驗的目的是測定式(I)化合物對MCF7細胞內內源表達的雌激素受體的降解活性，根據DC 50及最大降解效率評價化合物的活性。 2.       實驗方法 MCF7細胞（ATCC, HTB-22）用含10%胎牛血清的DMEM(Gibco，11995-065)完全培養基進行培養。實驗第一天，使用完全培養基將MCF7細胞以3000個/孔的密度種於384孔板，37ºC，5%CO 2細胞培養箱培養。待測化合物溶解於DMSO，儲存濃度為10 mM，用Echo 550 （Labcyte Inc.）稀釋並加入細胞培養板內，待測化合物處理的起始濃度為100 nM，3倍梯度稀釋，9個濃度點，設置含0.5%DMSO的空白對照，各濃度點設雙複孔對照。37ºC，5%CO 2細胞培養箱培養24小時。各細胞培養孔內加入多聚甲醛至細胞培養液內，多聚甲醛終濃度約3.7 %以固定細胞，作用30分鐘後，棄上清，加入50 μL PBS每孔洗滌一次；加入PBS 含0.5% v/v Tween-20 處理細胞30 分鐘，PBS洗滌一次；加入封閉液（PBS內含5% BSA，0.05% Tween-20）室溫孵育1小時；去封閉液加入一抗混合液（抗-ER 單抗，Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAb, GST, # 8644S, 1：1000稀釋；抗-GAPDH 單抗，GAPDH(D4C6R) Mouse mAb, GST, #97166S， 1：2000稀釋）室溫孵育3小時；用PBST（PBS內含0.05% Tween-20）洗滌3次；加入檢測二抗（800CW-羊抗兔IgG， LI-COR，P/N: 926-32211, 1:1000稀釋；680RD-羊抗鼠 IgG，LI-COR，#925-68070，1：1000稀釋），室溫，避光孵育45分鐘；PBST洗滌3次，使用Odyssey CLx讀取各孔螢光信號，計算Chanel 800（ER）/ Chanel 680 (GAPDH）數值。以0.1 μM fulvestrant處理孔作為100%降解對照，計算各濃度點的降解率，使用XlLfit分析處理資料，計算化合物的降解活性DC 50及最大降解率Imax。資料分析見表15。 表 15 式 (I) 化合物對 MCF7 細胞內雌激素受體降解活性
化合物編號 ER level DC 50(nM) 最大降解率
式(I)化合物 0.15 104%
測試例 11 ：式 (I) 化合物對 MCF7 細胞增殖的抑制效果研究試驗1.       實驗目的 本實驗的目的是測定式(I)化合物對MCF7細胞體外增殖的抑制影響，根據IC 50評價化合物的活性。 2.       實驗方法 MCF7細胞（ATCC, HTB-22）用含10%胎牛血清的DMEM(Gibco，11995-065)完全培養基進行培養。實驗第一天，使用完全培養基將MCF7細胞以500個/孔的密度種於384孔板，37ºC，5%CO 2細胞培養箱過夜培養。第二天，加入待測化合物進行藥物處理，採用Echo550 （Labcyte Inc.）將儲存濃度為10 mM的化合物溶液進行稀釋及轉移至各細胞培養孔內，待測化合物在細胞內的處理起始濃度為100 nM，3倍梯度稀釋，9個濃度點，設置含0.3%DMSO的空白對照，各濃度點設雙複孔對照。37ºC，5%CO 2細胞培養箱培養7天，第八天，取出細胞培養板。加入CellTiter-Glo ®Luminescent Cell Viability Assay （Promega, G7573）， 室溫放置10分鐘後，使用多標記酶標儀EnVision（ PerkinElmer）讀取發光信號值，用XLfit根據化合物的濃度和發光信號值計算各化合物的抑制活性IC 50。 3.           資料分析見表16 表16 式(I)化合物對MCF7細胞增殖的抑制活性
化合物編號 MCF-7細胞增殖抑制IC 50(nM)
式(I)化合物 0.27
測試例 12 ：式 (I) 化合物在 pH 值為 7.4 的磷酸鹽緩衝液中的表觀溶解度
為了使口服化合物到達作用部位，並且為了腸道的有效吸收，該化合物需處於溶液狀態，因此具有高固有溶解度的化合物可能更適合於藥物用途。
一、材料和試劑
待測化合物按記載方法製備。對照藥孕酮從Sigma購買。pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液由本實驗室配製。乙腈和甲醇從Fisher購買。其他試劑從市場購買。
1.5毫升平底玻璃小瓶（BioTech Solutions）； 聚四氟乙烯/矽有機樹脂瓶塞（BioTech Solutions）；聚四氟乙烯包被攪拌棒； MultiScreenHTS HV (0.45 µm) 96 well plate過濾板（Millipore, MSHVN4510 or MSHVN4550）； Eppendorf Thermomixer Comfort；Vacuum Manifold ORVMN96 (Orochem)。
二、實驗步驟
儲備液的配製
用DMSO配製待測物和對照藥孕酮的10 mM儲備液。
表觀溶解度測定步驟
取30 µL 10 mM待測物儲備液，以指定順序加到對應96孔板的對應位置。在樣品板的對應小瓶加入970 µL的pH值7.4的磷酸鹽緩衝液。實驗為雙平行。在每個小瓶中加一根攪拌棒，並蓋上聚四氟乙烯/矽有機樹脂瓶塞。隨後將樣品盤放進Eppendorf Thermomixer Comfort，以1100轉的轉速在25度條件下震盪2個小時。2小時後，去除瓶塞，用一塊大磁鐵吸走攪拌棒，然後從樣品板轉移樣品至過濾板。用真空泵產生負壓，過濾樣品。轉移5 µL濾液到新的樣品板，然後加入5 µL DMSO和490 µL 50% ACN(IS).H 2O (內標乙腈：水=1:1)。根據峰形情況，可能用一定比例的50% ACN(IS).H 2O來稀釋樣品稀釋液以獲得更好的峰形。稀釋倍數可能因待測物溶解性的大小或其液質回應信號強弱而調整。
樣品分析步驟
將進樣板放進自動進樣器的進樣盤中，通過液質分析評估樣品。
三、實驗步驟
通過Microsoft Excel 進行所有的計算。樣品濾液的分析和定量，是通過使用液質對已知濃度的標準品峰的定性和定量完成的。計算得到的式(I)化合物在PH值為7.4的磷酸鹽緩衝液中的表觀溶解度值。 表17 式(I)化合物在pH值為7.4的磷酸鹽緩衝液中的表觀溶解度值
化合物編號 pH = 7.4表觀溶解度 （µM）
式(I)化合物 92
測試例 13 ：式 (I) 化合物在大鼠中血腦屏障（ BBB ）透過能力
藥物能透過動物的血腦屏障在腦中有足夠的暴露量是藥物對腦轉移病灶有效的關鍵，因此通過測量動物給藥後血漿和腦組織中的藥物濃度，可以評估藥物在腦中的分佈情況，進而判斷藥物能否在腦原位模型中起到抑制腫瘤生長的效果。
實驗材料
SD雌性大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。MC(甲基纖維素)購自Sigma；乙腈購自Merck（USA）。PBS（磷酸鹽緩衝鹽）購自生工生物。
實驗方法
雌性SD大鼠6只(200-300g，6-8周），隨機分成2組，每組3只。分別給予式(I)化合物，溶媒0.5%甲基纖維素水溶液 。動物實驗前正常喂水，禁食過夜，給藥後四小時恢復給食。每組大鼠於給藥後2h收集血漿和腦組織。收集的全血樣品置於K 2EDTA抗凝管中，離心5 min後（12,000 rpm，4ºC）取血漿待測；組織採集後用濾紙吸乾，樣品保存在-80度冰箱待測。
取大鼠血漿樣品10 μL，加入150 μL乙腈溶劑（其中含內標化合物）沉澱蛋白，渦旋5 min後，離心（14,000 rpm）5 min，上清液用含0.1%(v/v)FA的水稀釋2倍，於LC-MS/MS系統（AB Sciex Triple Quad 6500+）進行定量檢測。對10x稀釋樣品，取2μL樣品加入18μL的空白血漿，渦旋0.5 min後，加入300 μL乙腈溶劑（其中含內標化合物）沉澱蛋白，其餘處理步驟同不稀釋樣品。在測定血漿樣品濃度時隨行SD大鼠血漿標準曲線和血漿質控樣品。
大鼠腦組織樣品先用4倍品質體積的PBS勻漿液進行勻漿。取腦組織勻漿液樣品20 μL，加入20 μL空白小鼠血漿進行稀釋混勻再加入600 μL乙腈溶劑（其中含內標化合物）沉澱蛋白，渦旋5 min後，離心（14,000 rpm）5 min，上清液用含0.1%(v/v)FA的水稀釋2倍，於LC-MS/MS系統（AB Sciex Triple Quad 6500+）進行定量檢測。式(I)化合物表現出優秀的血腦屏障透過能力，在大鼠的腦組織中藥物暴露量較高。
BBB測試結果如下所示： 表18 式(I)化合物大鼠血腦屏障透過實驗
化合物編號 給藥劑量 mg/kg 血漿藥物濃度 ng/ml 腦部藥物濃度 ng/g B/P 比值
式(I)化合物 100 QD 2617 10560 4.2
測試例 14 ：式 (I) 化合物對 MCF-7 小鼠皮下腫瘤模型的生長抑制實驗
實驗試劑 人乳腺癌MCF-7細胞：ATCC, HTB-22 17β-雌二醇片：Innovative Research of America, Cat No.: SE-121, 60-day release, 0.72 mg/pellet EMEM培養液：ATCC, Cat No.: 30-2003 胎牛血清：Gbico; Cat No.: 1099-141C 青鏈黴素(Pen Strep)：Gibco, Cat No.: 15240-122 重組人胰島素：上海翊聖，Cat. No.：40112ES60 0.25%胰酶-EDTA：Gibco, Cat No.: 25200-072 D-PBS(無鈣鎂離子磷酸鹽緩衝液)：Hyclone, Cat. No.: SH30256.01 Matrigel: Corning, Cat. No.: 356237
實驗方法
動物資訊：NPG小鼠，雌性，6-7周，體重約19-28克，動物購自北京維通達生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食和自由飲水。
細胞培養：人乳腺癌MCF-7細胞株體外培養，培養條件為EMEM（細胞培養液）中加入10%胎牛血清，1% Pen Strep，10 μg/ml 重組人胰島素，37℃、5%CO 2孵箱。一週一次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將0.1ml/（含1×10 7）MCF-7細胞懸液（D-PBS：Matrigel，體積比為1:1）皮下接種於每只小鼠的右後背，並於細胞接種前四天皮下接種17β-雌二醇片。在接種細胞後第24天，依據腫瘤體積隨機分組給藥，分組當天為第0天(Day 0)。
給藥：式(I)化合物的給藥劑量為1，3或10 mg/kg，口服給藥（PO），每天一次給藥（QD）x3周。溶媒組8只小鼠，給藥組6只小鼠。
腫瘤測量和實驗指標：
每週兩次用遊標卡尺測量腫瘤直徑。腫瘤體積的計算公式為：V = 0.5a x b 2，a和b分別表示腫瘤的長徑和短徑。每週兩次測量小鼠體重。
化合物的抑瘤療效用腫瘤生長抑制率TGI（%）來評價。TGI（%）= [(1-(某處理組給藥結束時平均瘤體積-該處理組開始給藥時平均瘤體積)/(溶劑對照組治療結束時平均瘤體積-溶劑對照組開始治療時平均瘤體積)]x100%。
實驗結果：
見表19。在小鼠皮下移植瘤MCF-7模型中，式(I)化合物在1 mg/kg, 3 mg/kg, 或10 mg/kg一天一次口服給藥對腫瘤生長具有顯著抑制作用（P＜0.01），且具有較好的劑量反應關係，在3 mg/kg和10 mg/kg劑量下具有縮小腫瘤的效果。式(I)化合物在10 mg/kg一天一次口服給藥對腫瘤生長具有顯著抑制作用（P＜0.01），且具有縮小腫瘤的效果。式(I)化合物在所嘗試劑量下未顯著影響小鼠體重。 表19  MCF-7皮下瘤模型腫瘤體積
受試化合物 劑量 mg/kg 給藥方式 給藥頻率 平均腫瘤體積（mm 3） TGI（%）
0天 21天
溶劑對照 / PO QD 179 403 /
式(I)化合物 1 PO QD 183 207 89.08
式(I)化合物 3 PO QD 169 136 114.71
式(I)化合物 10 PO QD 177 91 138.17
測試例 15 ：式 (I) 化合物對小鼠 MCF-7 腦原位腫瘤模型生長的抑制實驗
實驗試劑/儀器： 人乳腺癌MCF-7細胞：ATCC, HTB-22 17β-雌二醇片：Innovative Research of America, Cat No.: SE-121, 60-day release, 0.72 mg/pellet EMEM培養液：ATCC, Cat No.: 30-2003 胎牛血清：Gibco，Cat. No.: 1099-141C 青鏈黴素(Pen Strep)：Gibco, Cat No.: 15240-122 重組人胰島素：上海翊聖，Cat. No.：40112ES60 0.25%胰酶-EDTA：Gibco, Cat No.: 25200-072 腦立體定位儀：瑞沃德，Cat No.:標準型/數顯/單臂/小鼠/68055 微量注射泵：KDS，Cat No.: Legato130 微型手持顱鑽：瑞沃德，Cat No.: 78001
實驗方法：
動物資訊：NPG小鼠，雌性，6-8周，體重約17-29克，動物購自北京維通達生物技術有限公司，將小鼠飼養在SPF級的環境中，每個籠位單獨送排風，所有動物都可以自由獲取標準認證的商業實驗室飲食和自由飲水。
細胞培養：人乳腺癌MCF-7細胞株體外培養，培養條件為EMEM（細胞培養液）中加入10%胎牛血清，1% Pen Strep，10 μg/ml 重組人胰島素，37℃、5%CO 2孵箱。一周兩次用0.25%胰酶-EDTA消化液進行常規消化處理傳代。當細胞飽和度為80%-90%，數量達到要求時，收取細胞，計數。
細胞接種：將15 μl/（含2×10 6）MCF-7細胞懸液利用腦定位儀，微量注射泵和微型手持顱鑽，接種於小鼠顱內，並於細胞接種前三天皮下接種17β-雌二醇片。在接種細胞後第8天，依據小鼠體重隨機分組給藥，分組當天為第0天(Day 0)。
給藥：Fulvestrant（氟維司群，阿斯利康）給藥劑量為250 mg/kg，皮下注射（SC），每週一次給藥（QW），式(I)化合物的給藥劑量為30 mg/kg，口服給藥（PO），每天一次給藥（QD）。溶媒組11只小鼠，給藥組8只小鼠。所有組持續給藥直到小鼠死亡，因狀態差安樂死或者實驗結束。
實驗觀察和結束：
每週兩次測量小鼠體重，並觀察小鼠生存狀態。
第48天(Day 48)結束實驗，安樂死所有小鼠。
實驗結果：
見圖18和圖19。在小鼠腦原位MCF-7模型中，Fulvestrant組小鼠（250 mg/kg一週一次皮下注射給藥）體重持續下降，小鼠的生存狀況和溶劑對照組無明顯差別（中位生存期，溶媒對照組29天，Fulvestrant組29.5天）。式(I)化合物組小鼠（30 mg/kg一天一次口服給藥）體重平穩，狀態無異常，直到實驗終點，式(I)化合物組小鼠均未出現死亡，相對於溶劑對照或者Fulvestrant，化合物對MCF-7腦原位腫瘤模型小鼠具有顯著的抑制作用，小鼠的生存期顯著的延長（P＜0.01）。
[相關申請的交叉引用] 本申請要求於2021年11月12日向中國國家智慧財產權局提交的第202111339152.0號中國專利申請的優先權和權益，所述申請公開的內容通過援引整體併入本文中。
以上概述了數個實施例的部件、使得在本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以更理解本發明實施例的概念。在本發明所屬技術領域中具有通常知識者應該理解、可以使用本發明實施例作為基礎、來設計或修改其他製程和結構、以實現與在此所介紹的實施例相同的目的及/或達到相同的好處。在本發明所屬技術領域中具有通常知識者也應該理解、這些等效的結構並不背離本發明的精神和範圍、並且在不背離本發明的精神和範圍的情況下、在此可以做出各種改變、取代和其他選擇。因此、本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定為準。
在以下附圖以及說明中闡述了本說明書中所描述之主題之一或多個實施例的細節。從說明、附圖和申請專利範圍，本說明書之主題的其他特徵、態樣與優點將顯得明瞭，其中： 圖1為式(I)化合物NOESY圖譜。 圖2為式(I)化合物的己二酸鹽C晶型的XRPD圖譜。 圖3為式(I)化合物的己二酸鹽C晶型的DSC圖譜。 圖4為式(I)化合物的己二酸鹽C晶型的TGA圖譜。 圖5為式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型的XRPD圖譜。 圖6為式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型的DSC圖譜。 圖7為式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型的TGA圖譜。 圖8為式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的XRPD圖譜。 圖9為式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的DSC圖譜。 圖10為式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的TGA圖譜。 圖11為式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的立體結構橢球圖。 圖12為式(I)化合物琥珀酸鹽A晶型的晶胞結構堆積圖。 圖13 式(I)化合物琥珀酸鹽在MCF-7異種皮下移植瘤小鼠模型上的抗腫瘤生長效果圖。 圖14 式(I)化合物琥珀酸鹽對MCF-7異種皮下移植瘤小鼠體重變化圖。 圖15式(I)化合物琥珀酸鹽在T47D異種皮下移植瘤小鼠模型上的抗腫瘤生長的效果圖。 圖16 式(I)化合物琥珀酸鹽對T47D異種皮下移植瘤小鼠體重變化圖。 圖17 式(I)化合物琥珀酸鹽對MCF-7異種腦原位荷瘤小鼠生存曲線圖。 圖18為式(I)化合物對MCF-7異種腦原位荷瘤小鼠生存曲線圖。 圖19為式(I)化合物對MCF-7異種腦原位荷瘤小鼠體重變化圖。

Claims (26)

  1. 一種式(I)化合物的可藥用鹽， 其中，所述可藥用鹽選自硫酸鹽、磷酸鹽、苯甲酸鹽、琥珀酸鹽、己二酸鹽、富馬酸鹽、L-蘋果酸鹽和檸檬酸鹽。
  2. 根據請求項1所述的式(I)化合物的可藥用鹽，所述式(I)化合物的可藥用鹽選自其苯甲酸鹽、琥珀酸鹽和己二酸鹽。
  3. 根據請求項1所述的式(I)化合物的可藥用鹽，所述式(I)化合物的琥珀酸鹽如式(II)所示，其中，x選自0.5~2， 。
  4. 根據請求項1所述的式(I)化合物的可藥用鹽，所述式(I)化合物的苯甲酸鹽如式(III)所示，其中，y選自0.5~2， 。
  5. 根據請求項1所述的式(I)化合物的可藥用鹽，所述式(I)化合物的己二酸鹽如式(IV)所示，其中，z選自0.5~2， 。
  6. 根據請求項3所述的式(I)化合物的可藥用鹽，其中x選自0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0；優選地，x選自0.8、0.9、1.0、1.1和1.2。
  7. 根據請求項4所述的式(I)化合物的可藥用鹽，其中y選自0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0；優選地，y選自0.8、0.9、1.0、1.1和1.2。
  8. 根據請求項5所述的式(I)化合物的可藥用鹽，其中z選自0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9和2.0；優選地，z選自0.8、0.9、1.0、1.1和1.2。
  9. 一種式(I)化合物的己二酸鹽C晶型， 所述C晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、8.90±0.2º、19.10±0.2º處有衍射峰。
  10. 根據請求項9所述C晶型，其中： 所述C晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、7.03±0.2º、8.90±0.2º、16.45±0.2º、17.78±0.2º、19.10±0.2º、21.03±0.2º處有衍射峰；或者 所述C晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.46±0.2º、6.30±0.2º、7.03±0.2º、8.90±0.2º、10.65±0.2º、11.95±0.2º、12.55±0.2º、13.34±0.2º、14.20±0.2º、16.02±0.2º、16.45±0.2º、17.78±0.2º、18.33±0.2º、19.10±0.2º、19.77±0.2º、20.12±0.2º、21.03±0.2º、21.62±0.2º、24.30±0.2º、25.97±0.2º、27.39±0.2º和27.98±0.2º處有衍射峰；或者 所述C晶型的X-射線粉末衍射圖譜與圖2基本上一致。
  11. 根據請求項9或10所述C晶型，所述C晶型的DSC譜圖在149.89±5℃處具有吸熱峰。
  12. 一種式(I)化合物的苯甲酸鹽B晶型， 所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.39±0.2º、18.78±0.2º處有衍射峰。
  13. 根據請求項12所述B晶型，其中： 所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.19±0.2º、10.01±0.2º、11.39±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º、20.09±0.2º處有衍射峰；或者 所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.69±0.2º、6.34±0.2º、7.19±0.2º、9.83±0.2º、10.01±0.2º、11.11±0.2º、11.39±0.2º、14.78±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.25±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º、20.09±0.2º、20.80±0.2º、21.66±0.2º處有衍射峰；或者 所述B晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在4.69±0.2º、4.91±0.2º、6.34±0.2º、7.19±0.2º、9.37±0.2º、9.83±0.2º、10.01±0.2º、10.32±0.2º、11.11±0.2º、11.39±0.2º、12.06±0.2º、12.69±0.2º、13.52±0.2º、14.07±0.2º、14.36±0.2º、14.78±0.2º、17.30±0.2º、18.78±0.2º、19.01±0.2º、19.25±0.2º、19.66±0.2º、19.91±0.2º、20.09±0.2º、20.80±0.2º、21.15±0.2º、21.66±0.2º、22.35±0.2º、23.57±0.2º、23.70±0.2º、24.63±0.2º、25.68±0.2º、27.05±0.2º處有衍射峰；或者 所述B晶型的X-射線粉末衍射圖譜與圖5基本上一致。
  14. 根據請求項12或13所述B晶型，所述B晶型的DSC譜圖在150.08±5℃處具有吸熱峰。
  15. 一種式(I)化合物的琥珀酸鹽A晶型， 所述A晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.13±0.2º、9.30±0.2º、11.29±0.2º、15.51±0.2º、19.89±0.2º處有衍射峰。
  16. 根據請求項15所述A晶型，其中： 所述A晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在7.13±0.2º、9.30±0.2º、11.29±0.2º、15.51±0.2º、17.10±0.2º、19.89±0.2º、20.26±0.2º、20.91±0.2º、21.51±0.2º、22.69±0.2º、23.58±0.2º、25.42±0.2º處有衍射峰；或者 所述A晶型以衍射角2 θ表示的X-射線粉末衍射圖譜中，在5.01±0.2º、7.13±0.2º、9.30±0.2º、10.09±0.2º、11.29±0.2º、11.73±0.2º、13.75±0.2º、14.30±0.2º、15.18±0.2º、15.51±0.2º、16.00±0.2º、17.10±0.2º、18.25±0.2º、18.69±0.2º、19.89±0.2º、20.26±0.2º、20.91±0.2º、21.12±0.2º、21.51±0.2º、22.69±0.2º、23.05±0.2º、23.58±0.2º、24.58±0.2º、25.42±0.2º、26.66±0.2º、27.24±0.2º和29.47±0.2º 處有衍射峰；或者 所述A晶型的X-射線粉末衍射圖譜與圖8基本上一致。
  17. 根據請求項15或16所述A晶型，所述A晶型的DSC譜圖在186.82±5℃處具有吸熱峰。
  18. 根據請求項15~17中任一項所述A晶型，所述A晶型的晶胞參數為a= 24.6731(4) Å，b= 24.6731(4) Å，c= 10.2575(3)Å，α=90°，β= 90°，γ=90°。
  19. 一種製備請求項1~8中任一項式(I)化合物的可藥用鹽的方法，所述製備方法包含了式(I)所示化合物與相應酸成鹽反應的步驟。
  20. 根據請求項19所述製備方法，所述成鹽反應的溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種。
  21. 根據請求項19或20所述製備方法，所述製備方法還包括攪拌析晶，過濾和乾燥中的一種或其組合的步驟。
  22. 一種製備請求項9~11中任一項所述的C晶型的方法，包含以下步驟： （1-a）將己二酸和溶劑混合； （2-a）將式(I)化合物和溶劑混合； （3-a）混合步驟（1-a）的混合物與步驟（2-a）的混合物； （4-a）將混合了所述已二酸和所述式(I)化合物的所得混合物攪拌，析晶； （5-a）過濾出結晶，收集濾餅，乾燥； 優選地，步驟（1-a）和步驟（2-a）中的溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種，更優選異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，最優選異丙醇； 優選地，所述式(I)化合物與己二酸的莫耳比為1:2~2:1，更優選莫耳比為1: 1； 優選地，所述步驟（1-a）在加熱條件下進行，更優選加熱溫度約為40-80℃； 優選地，所述步驟（4-a）在15-30℃條件下進行。
  23. 一種製備請求項12~14中任一項所述的B晶型的方法，包含以下步驟： （1-b）將式(I)化合物和溶劑混合； （2-b）向步驟（1-b）的混合物中加入苯甲酸； （3-b）將混合了所述式(I)化合物和所述苯甲酸的所得混合物攪拌，析晶； （4-b）過濾出並收集固體； 優選地，步驟（1-b）中的溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種，更優選異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，最優選異丙醚； 優選地，所述式(I)化合物與苯甲酸的莫耳比為1:2~2:1，更優選莫耳比為1: 1； 優選地，所述步驟（1-b）在15-30℃條件下進行； 優選地，所述步驟（3-b）的攪拌在加熱條件下進行，更優選加熱溫度約為40-68℃，最優選60-68℃； 任選地，所述B晶型的製備方法還包括以下步驟： （5-b）將步驟（4-b）收集的固體和溶劑混合； （6-b）將所得混合物攪拌； （7-b）過濾出並收集固體，乾燥； 優選地，步驟（5-b）中的溶劑選自異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，優選異丙醚； 優選地，步驟（6-b）在15-30℃條件下進行。
  24. 一種製備請求項15~18中任一項所述的A晶型的方法，包含以下步驟： （1-c）將式(I)化合物和溶劑混合； （2-c）向步驟（1-c）的混合物中加入琥珀酸； （3-c）將混合了所述式(I)化合物和所述琥珀酸的所得混合物攪拌，析出固體； （4-c）過濾出並收集固體； 優選地，步驟（1-c）中的溶劑選自環己烷、正庚烷、甲苯、氯仿、乙醚、異丙醚、甲基叔丁基醚、四氫呋喃、乙二醇二甲醚、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸異丙酯、乙酸丁酯、甲醇、乙醇、異丙醇、正丁醇和乙腈中的至少一種，更優選異丙醚、甲基叔丁基醚、甲醇、異丙醇和四氫呋喃中的至少一種，最優選異丙醚； 優選地，所述式(I)化合物與琥珀酸的莫耳比為1:2~2:1，更優選莫耳比為1: 1； 優選地，所述步驟（3-c）在15-30℃條件下進行； 優選地，所述步驟（3-c）的反應時間為1-48小時，更優選3-24小時； 任選地，所述A晶型的製備方法還包括以下步驟： （5-c）將步驟（4-c）收集的固體和溶劑混合； （6-c）將所得混合物攪拌析晶； （7-c）過濾出並收集固體，乾燥； 優選地，步驟（5-c）中的溶劑選自甲醇、乙醇、異丙醇、四氫呋喃和水中的至少一種，更優選乙醇/水的混合溶劑； 優選地，所述乙醇/水的體積比約為1:1~50:1，更優選2:1~20:1，最優選10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1或4:1； 優選地，所述步驟（6-c）在15-30℃條件下進行； 優選地，所述步驟（6-c）的反應時間為0.5-48小時。
  25. 一種藥物組合物，其包含請求項1~8任一項所述式(I)化合物的可藥用鹽或請求項9~18任一項所述晶型，以及藥學上可接受的輔料。
  26. 請求項1~8任一項所述式(I)化合物的可藥用鹽、請求項9~18任一項所述晶型或請求項25所述的藥物組合物在製備用於預防或者治療雌激素受體相關疾病的藥物中的用途； 優選地，所述雌激素受體相關疾病為腫瘤； 更優選地，所述腫瘤為乳腺癌； 更優選地，所述腫瘤為ER陽性乳腺癌； 更優選地，所述腫瘤為ER陽性乳腺癌腦轉移。
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