TW201805421A

TW201805421A - 洋菜酶、含其之組合物、及其應用

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Publication number: TW201805421A
Application number: TW105125723A
Authority: TW
Inventors: 林俊宏; 王志鵬; 陳正文; 林慧傑; 張淑微; 黃文正; 賴建逢; 宣詩玲
Original assignee: 財團法人農業科技研究院
Priority date: 2016-08-12
Filing date: 2016-08-12
Publication date: 2018-02-16
Also published as: JP2018023359A; TWI597362B; US10822602B2; US20180044654A1; JP6472473B2

Abstract

本發明提供一種β-洋菜酶、含其之組合物、及其應用。本發明之β-洋菜酶提供領域中另一新穎之選擇，且有助於瓊脂醣水解產物於產業中之利用。此外，本發明的洋菜酶係經改良而特別適合透過原核細胞表現系統異源性地生產，而有利於商業上的使用。

Description

洋菜酶、含其之組合物、及其應用

本發明關於一種洋菜酶；尤指一種透過原核細胞表現系統生產的洋菜酶。

洋菜(agar)是一種由石花菜(Gelidium spp.)、龍鬚菜(Gracilaria spp.)及紫菜(Porphyra spp.)等紅藻之細胞壁所萃取之親水性多醣類，主要成分為瓊脂醣(agarose)與瓊脂膠(agaropectin)。瓊脂醣為可形成凝膠之中性多醣，分子量在100kDa以上，係由重複之D-半乳糖與3,6-無水-α-L-半乳糖(3,6-anhydro-α-L-galactopyranose)以α-1,3與β-1,4醣苷鍵連接所組成。瓊脂膠為不可形成凝膠之酸性多醣，分子量在20kDa以下，其組成與瓊脂醣相同，但某些3,6-無水-α-L-半乳糖之羥基會被置換成甲氧基(methoxy)、硫醯基(sulfoxy)及丙酮酸(pyruvate)。

可分解洋菜之水解酵素稱之為洋菜酶(agarase)；根據洋菜酶作用位置之不同，可將洋菜酶分為α-洋菜酶(EC 3.2.1.158)與β-洋菜酶(EC 3.2.1.81)。α-洋菜酶作用於瓊脂醣與瓊脂膠之α-1,3醣苷鍵，產生還原端具有3,6-無水-α-L-半乳糖基團之洋菜寡醣(agaro-oligosaccharides)。β-洋菜酶則作用於瓊脂醣與瓊脂膠之β-1,4醣苷鍵，產生還原端具有D-半乳糖基團之新洋菜寡醣(neoagaro-oligosaccharides)。

洋菜酶具有多種用途，例如可應用於分子生物學實驗，進行瓊脂醣膠體中DNA之回收；可應用於軟骨組織工程，處理支撐軟骨細胞之洋菜基材，促進軟骨細胞增殖與增加膠原蛋白含量，提高軟骨組織培養的效果；可應用於洋菜寡醣與新洋菜寡醣之製備；可應用於藻類原生質體(protoplast)之製作，進行DNA轉形或細胞融合；可應用於海藻多醣之水解，再藉由水解產物之組成，推測海藻多醣之結構；可應用於海藻單細胞之製備，作為海洋養殖動物之餌料。

此外，目前研究顯示，利用洋菜酶水解洋菜或海藻多醣粗萃物所得之寡醣具有多項生理與生物活性，例如抗氧化、免疫調節、抑菌、抑制酪胺酸酶(tyrosinase)、保濕、作為益生質(prebiotic)及降低血清總膽固醇等功效，可作為新一代之高價值功能性寡醣，應用於化妝品、保健食品及醫藥產業。目前雖已發現多種微生物可產生洋菜酶，但天然微生物所生產之洋菜酶於產業應用中實遭遇多種困難，例如，產量不足、產量不穩定、菌種安全性顧慮等，且有生產成本過高而不利於大量生產的缺點。

有鑑於此，領域中亦有考慮以酸水解洋菜或海藻多醣粗萃物來取得所需的寡醣，但酸水解法僅能獲得洋菜寡醣，且無法獲得聚合度均一之產物。相較於利用酸水解洋菜產生寡醣之方法，利用酵素水解法具有多項優勢，包括酵素可選擇性剪切特定醣苷鍵，獲得特定聚合度之寡醣；降解條件容易控制；酵素作用溫度較酸水解溫度為低，可降低能源消耗；操作流程較酸水解法簡單，不需進行酸鹼中和與脫鹽等過程；不需使用化學藥劑，較安全且減少污染環境之可能性；利用酵素水解法可生產洋菜寡醣或新洋菜寡醣等，仍較酸水解法來得理想。

綜上所述，為有利洋菜酶水解洋菜或海藻多醣粗萃物所得之寡醣於產業中利用，領域中需要一種新穎的洋菜酶，以提供產業中更多的選擇。此外，領域中也需要一種低成本之洋菜酶生產方法，以降低前述寡醣的生產成本，更有利於商業化。

爰是，本發明的一個目的為提供一種新穎的洋菜酶，讓產業有更多種不同的選擇。

本發明的另一個目的為提供一種利用洋菜酶生產新洋菜寡醣的方法，其採用原核細胞表現系統進行重組洋菜酶的大量生產，並將所取得的重組洋菜酶運用於洋菜、瓊脂醣或海藻多醣粗萃物之水解，而得以降低新洋菜寡醣的生產成本。

為了達到上述目的，本發明提供一種β-洋菜酶，其至少包含SEQ ID NO 06所示胺基酸序列。

較佳地，前述β-洋菜酶具有SEQ ID NO 01所示胺基酸序列。

較佳地，前述β-洋菜酶具有SEQ ID NO 02所示胺基酸序列。

較佳地，前述β-洋菜酶具有SEQ ID NO 03所示胺基酸序列。

較佳地，前述β-洋菜酶具有SEQ ID NO 04所示胺基酸序列。

較佳地，前述β-洋菜酶具有SEQ ID NO 05所示胺基酸序列。

較佳地，前述β-洋菜酶具有SEQ ID NO 06所示胺基酸序列。

本發明又提供一種用於分解瓊脂醣的組合物，其包含：0.1至10U/mL之前述洋菜酶；及50至200mM之緩衝液；其中前述緩衝液為檸檬酸緩衝液或磷酸緩衝溶液；U/mL及mM之濃度單位係以前述組合物的總體積為基礎。

較佳地，前述組合物進一步包含1至2mM之鹽類，其係以前述組合物的總體積為基礎。

較佳地，前述鹽類為KCl、ZnSO₄、FeSO₄、BaCl₂、NaCl、SrCl₂、CoCl₂、MgSO₄、MnCl₂、CaCl₂、AlCl₃、或其組合。

本發明更提供一種生產新洋菜寡醣的方法，其包含以下步驟：(A)提供一樣本，其包含一瓊脂醣；及(B)使前述樣本與一前述組合物接觸。

較佳地，前述方法之產物包含至少40重量百分濃度之新洋菜四糖，其係以前述產物的總重量為基礎。

較佳地，前述方法之產物實質上不包含新洋菜二糖。

較佳地，前述步驟(B)係於40℃至60℃下進行。

較佳地，前述步驟(B)係於pH 5至7下進行。

較佳地，前述樣本係為：瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻多醣粗萃物、或其組合。

本發明又提供一種β-洋菜酶表現載體，其包含：一核苷酸序列，其包含選自由SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、及SEQ ID NO 13所組成之群組的序列；及一大腸桿菌表現系統之調控元件，其包含一啟動子與核糖體結合部位。

較佳地，前述表現載體具有選自由SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、及SEQ ID NO 20所組成之群組的序列。

綜上所述，本發明提供一種新穎的洋菜酶，並教示使用該洋菜酶分解瓊脂醣的方法。值得注意的是，本發明的研究顯示經C端刪減突變後的洋菜酶不僅可維持相當的活性，更可顯著提高於大腸桿菌表現系統中的表現量。據此本發明較佳實施態樣之洋菜酶特別適合透過原核細胞表現系統進行異源性生產，而特別有利於商業上的使用。

第一圖係一示意圖。該示意圖顯示本發明之pET-AgaB-2-775、pET-AgaB-2-875、pET-AgaB-2-975、pET-AgaB-2-1096、pET-AgaB-2-1275、pET-AgaB-2-1380、及pET-AgaB-2-1811表現載體中洋菜酶基因及其轉譯產物於天然洋菜酶中之相對位置。

第二圖係本發明實驗二中以平板培養基測定轉形株表現重組洋菜酶的結果。(1)BL21(DE3)(pET-29a)，作為負向控制組。(2)BL21(DE3)(pET-AgaB-2-775)。(3)BL21(DE3)(pET-AgaB-2-875)。(4)BL21(DE3) (pET-AgaB-2-975)。(5)BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1096)。(6)BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1275)。(7)BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1380)。(8)BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1811)。

第三圖係本發明實驗二中以蛋白質電泳測定轉形株表現重組洋菜酶的結果。第M欄：PageRuler^TM Prestained Protein Ladder。第1欄：BL21(DE3)(pET-29a)。第2欄：BL21(DE3)(pET-AgaB-2-775)。第3欄：BL21(DE3)(pET-AgaB-2-875)。第4欄：BL21(DE3)(pET-AgaB-2-975)。第5欄：BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1096)。第6欄：BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1275)。第7欄：BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1380)。第8欄：BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1811)。

第四圖係本發明實驗二中洋菜酶活性測試的結果。775：本發明表現載體pET-AgaB-2-775表現所得之洋菜酶。875：本發明表現載體pET-AgaB-2-875表現所得之洋菜酶。975：本發明表現載體pET-AgaB-2-975表現所得之洋菜酶。1096：本發明表現載體pET-AgaB-2-1096表現所得之洋菜酶。1275：本發明表現載體pET-AgaB-2-1275表現所得之洋菜酶。1380：本發明表現載體pET-AgaB-2-1380表現所得之洋菜酶。1811：本發明表現載體pET-AgaB-2-1811表現所得之洋菜酶。

第五圖係本發明實驗三中較佳催化溫度之試驗的結果。(A)AgaB-2-875。(B)AgaB-2-975。(C)AgaB-2-1096。(D)AgaB-2-1275。(E)AgaB-2-1380。(F)AgaB-2-1811。

第六圖係本發明實驗三中較佳催化酸鹼值之試驗的結果。(A)AgaB-2-875。(B)AgaB-2-975。(C)AgaB-2-1096。(D)AgaB-2-1275。(E)AgaB-2-1380。(F)AgaB-2-1811。●代表檸檬酸緩衝溶液(pH 3~6)。□代表磷酸緩衝溶液(pH 6~8)。▲代表甘胺酸-氫氧化鈉(Glycine-NaOH)緩衝溶液(pH 9~10)。

第七圖係本發明實驗三中受質特性分析的結果。

第八圖係本發明實驗三中產物分析的結果。

如前所述，雖然領域中已知可利用微生物異源性生產洋菜酶，但這樣的生產方式仍有諸多瓶頸。再者，雖然領域中已知可利用原核細胞表現系統來表現標的蛋白質，但並非所有蛋白質皆可藉由原核細胞表現系統進行大量表現。影響原核細胞表現系統生產標的蛋白質之因素包括基因密碼子之分佈、mRNA之穩定性、標的蛋白質之穩定性、表現系統之選用、及表現系統之生產參數等。若標的蛋白質之基因本身就不適合以異源性方式進行表現，利用原核細胞表現系統大量生產該標的蛋白質自無成功的可能性。透過基因工程或發酵工程針對標的基因與培養技術進行改良，將有助於標的蛋白質產量之提升，可使標的蛋白質於商業化的生產更具優勢。

Paenibacillus agarexedens為科學家Miehlmann於西元1972年自濕草原土(meadow soil)中所分離之細菌。在本發明之前，從未有任何關於該菌種之洋菜酶基因的報導。本發明自該細菌中分離出特定的核苷酸片段，並從而取得一新穎的洋菜酶，可提供領域中另一個洋菜酶的選擇。

本發明的一個面向中提供一種衍生自Paenibacillus agarexedens的β-洋菜酶，其包含如SEQ ID NO 01所示之序列。前述SEQ ID NO 01所示者為本發明之洋菜酶的胺基酸序列，其共具有1811個胺基酸。值得注意的是，前述SEQ ID NO 01所示之序列僅為Paenibacillus agarexedens基因體中的一段核苷酸序列，並非一基因序列。依據胺基酸與密碼子的對應關係，所屬領域具有通常知識者自可推估出可轉譯出前述SEQ ID NO 01所示序列的核苷酸序列。於一較佳實施態樣中，前述β-洋菜酶係由如SEQ ID NO 08所示之序列所轉譯而得。

在本發明的前揭面向中，在不破壞前述洋菜酶正常活性的前提下，為了提升以原核細胞表現系統異源性生產前述洋菜酶的產量，本發明採用基因工程技術嘗試刪減具SEQ ID NO 01之序列的前述洋菜酶的C端的胺基酸。

在一可行實施態樣中，本發明以基因工程所生產的重組β-洋菜酶至少包含SEQ ID NO 06所示胺基酸序列。在另一可行實施態樣中，本發明以基因工程所生產的重組β-洋菜酶至少依序包含SEQ ID NO 01所示胺基酸序列之第1至第875個胺基酸。前述「依序包含」係指前述β-洋菜酶包含該些所指胺基酸，且該些胺基酸係依據於SEQ ID NO 01中所示的順序而排列；惟限制條件是，前述β-洋菜酶不包含SEQ ID NO 01所示胺基酸序列之全長。前述「全長」係指前述SEQ ID NO 01所示之所有胺基酸及其次序。前述「第1至第875個胺基酸」係指自N端起算的第1個胺基酸至第875個胺基酸。

在本發明的前揭面向中，具體實施態樣01提供一β-洋菜酶，其依序包含前述SEQ ID NO 01所示之序列。前述SEQ ID NO 01所示之序列可由SEQ ID NO 08轉譯而得。

在本發明的前揭面向中，具體實施態樣02提供一β-洋菜酶，其僅依序包含前述SEQ ID NO 01所示之序列的第1至1380個胺基酸，即SEQ ID NO 02所示之序列。前述SEQ ID NO 02所示之序列可由SEQ ID NO 09轉譯而得。

在本發明的前揭面向中，具體實施態樣03提供一β-洋菜酶，其僅依序包含前述SEQ ID NO 01所示之序列的第1至1275個胺基酸，即SEQ ID NO 03所示之序列。前述SEQ ID NO 03所示之序列可由SEQ ID NO 10轉譯而得。

在本發明的前揭面向中，具體實施態樣04提供一β-洋菜酶，其僅依序包含前述SEQ ID NO 01所示之序列的第1至1096個胺基酸，即SEQ ID NO 04所示之序列。前述SEQ ID NO 04所示之序列可由SEQ ID NO 11轉譯而得。

在本發明的前揭面向中，具體實施態樣05提供一β-洋菜酶，其僅依序包含前述SEQ ID NO 01所示之序列的第1至975個胺基酸，即SEQ ID NO 05所示之序列。前述SEQ ID NO 05所示之序列可由SEQ ID NO 12轉譯而得。

在本發明的前揭面向中，具體實施態樣06提供一β-洋菜酶，其僅依序包含前述SEQ ID NO 01所示之序列的第1至875個胺基酸，即SEQ ID NO 06所示之序列。前述SEQ ID NO 06所示之序列可由SEQ ID NO 13轉譯而得。

本發明的另一個面向中提供一種用於分解瓊脂醣之組合物。前述組合物可應用於產業中以供取得瓊脂醣的水解產物，如新洋菜四糖。在一可行實施態樣中，前述組合物包含一洋菜酶，其至少依序包含SEQ ID NO 01所示胺基酸序列之第1至第875個胺基酸。在一較佳實施態樣中，前述洋菜酶於前述組合物中的濃度為0.1至10U/mL，其中前述U/mL之濃度單位係以前述組合物的總體積為基礎。

在另一可行實施態樣中，前述組合物包含一洋菜酶，其具有選自由SEQ ID NO 01、SEQ ID NO 02、SEQ ID NO 03、SEQ ID NO 04、SEQ ID NO 05、及SEQ ID NO 06所組成之群組的胺基酸序列。

在一較佳實施態樣中，前述組合物進一步包含1至2mM之鹽類、50至200mM之緩衝液、或其組合；其中前述mM之濃度單位係以前述組合物的總體積為基礎。經本發明研究，前述鹽類有助於穩定並提升前述洋菜酶的活性。可行地，前述鹽類包括但不限於：KCl、ZnSO₄、FeSO₄、BaCl₂、NaCl、SrCl₂、CoCl₂、MgSO₄、MnCl₂、CaCl₂、AlCl₃、或其組合。所屬領域具有通常知識者當可理解，前述鹽類於本發明之組合物中可能經解離而以金屬離子與非金屬離子之狀態存在、或同時存在解離及未解離的狀態。前述緩衝液亦有助於穩定前述洋菜酶的活性。可行地，前述緩衝液包括但不限於：檸檬酸緩衝液或磷酸緩衝溶液。較佳地，前述檸檬酸緩衝液的pH值為5至6。較佳地，前述磷酸緩衝溶液的pH值為6至7。

本發明的又一個面向中提供一種生產新洋菜寡醣的方法。本發明方法包含以下步驟：(A)提供一樣本，其包含一瓊脂醣；及(B)使前述樣本與本發明之組合物接觸。前述樣本可為：瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻多醣粗萃物、或其組合。前述「接觸」可透過使前述樣本及前述組合物混合於同一溶液中而達成。

在一可行實施態樣中，前述方法所得之前述產物中包含40重量百分濃度以上的新洋菜四糖，其中前述重量百分比係以前述產物的總重量為基礎。在一較佳實施態樣中，前述方法所得之前述產物中包含40重量百分濃度以上的新洋菜四糖，其中前述重量百分比係以前述產物的總重量為基礎。在又一較佳實施態樣中，前述產物實質上不包含新洋菜二糖。

在一較佳實施態樣中，前述步驟(B)之「接觸」可透過使前述樣本及前述組合物混合於同一溶液中而達成。較佳地，前述接觸係於40℃至60℃的溫度下進行。較佳地，前述接觸係於pH值5至7下進行。在一較佳實施態樣中，前述接觸係進行1至24小時。

在本發明的更一個面向中，本發明提供一種β-洋菜酶表現載體。前述表現載體包含一核苷酸序列，其包含選自由SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、及SEQ ID NO 13所組成之群組的序列。前述表現載體係用於在一原核細胞表現系統中異源性地表現本發明之β-洋菜酶。因此，較佳地，前述表現載體將進一步包含一調控元件；其中前述調控元件可為被選定之原核細胞表現系統所辨識。在一可行實施態樣中，前述調控元件至少包含一啟動子與核糖體結合部位；較佳地，前述調控元件可額外包含：操縱子(operator)、轉錄/轉譯的加強子序列(enhancer sequences)、或其組合。

在一較佳實施態樣中，前述表現載體具有選自由SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、及SEQ ID NO 20所組成之群組的序列。

本發明所述之「異源性地表現」或其他類似之詞彙係指前述β-洋菜酶係於一非其原始來源之微生物中表現。舉例來說，前述β-洋菜酶的原始來源之微生物係P.agarexedens，若於一大腸桿菌表現系統中表現前述β-洋菜酶即屬本發明所述之「異源性地表現」。如前所述，表現系統的各項生產參數影響標的蛋白質之產量，並影響生產成本。若能取得關鍵性生產參數的數值，將可有效率的於一表現系統中大量生產標的蛋白質。在本發明的一個較佳實施態樣中，本發明經大量試驗後獲致於一大腸桿菌表現系統中異源性地表現本發明之β-洋菜酶的較佳溫度條件為15至37℃。β-洋菜酶於前述溫度範圍中之可溶性表現量較佳，而有助於大規模商業化生產作業。

實驗一：選殖本發明之洋菜酶基因與建構本發明之表現載體。

本實施例自P.agarexedens的全基因體中挑選出一序列(其胺基酸序列如SEQ ID NO 01，共1811個胺基酸；其核苷酸序列如SEQ ID NO 08，共5433個核苷酸，其不包含起始碼)，經蛋白質比對分析後認為可能轉譯出具有分解瓊脂醣能力的蛋白質(即一洋菜酶)。在本發明之前，從未有任何研究揭露該序列與其轉譯產物可能的生理活性。此外，該序列與本發明申請時領域中所習知的洋菜酶基因亦不具明顯的相似度。本發明進一步透過基因工程將該序列建構於一表現載體中，以期在一原核細胞表現系統中大量且穩定的表現所需的洋菜酶。

菌種與培養基

以購自食品工業研究所之P.agarexedens BCRC 17346作為洋菜酶基因研究對象。以大腸桿菌(Escherichia coli)ECOS 9-5(Yeastern,Taiwan)作為DNA選殖用之宿主細胞。

利用含有0.1%尿素(urea)之營養培養基(nutrient broth)培養基(BD Difco,USA)進行P.agarexedens之培養，視需要添加1.5%(w/v)洋菜(agar)(BD Difco,USA)製備固體培養基。利用Lurai-Bertani(LB)培養基(BD Difco,USA)進行大腸桿菌之培養，視需要添加適量抗生素或1.5%洋菜。

基因體DNA(genomic DNA)之抽取

挑取單一BCRC 17346菌落接種於含有0.1%尿素之營養培養基中。於30℃下以180rpm之轉速進行振盪培養24小時後，利用DNA純化套組(Tissue & Cell Genomic DNA Purification kit；GMbiolab,Taiwan)進行菌株基因體DNA之抽取。首先取4mL之培養菌液至離心管中，經離心(5,870×g，5分鐘)後，倒除上清液，收集菌體部分。加入200μL之溶液A[10mM Tris-HCl,pH 8.0；10mM EDTA；50mM；NaCl；20%(w/v)sucrose；10mg/mL lysozyme]重新懸浮菌體，並於37℃下作用1小時。此步驟之目的在於分解菌體之細胞壁。接著加入20μL的蛋白酶K(proteinase K；10mg/mL)及200μL的萃取試劑，於56℃下作用3小時。在此過程中，每5分鐘便輕緩地上下搖晃以使菌體與試劑充分混合。之後，加入200μL的結合試劑(binding solution)並於70℃下作用10分鐘。接著加入200μL的無水酒精至微量離心管中並均勻混合，再吸取所有溶液(包括沉澱物)至一離心分離小管(spin column)。將該離心分離小管放置於收集小管(collection tube)中，經離心(17,970×g，2分鐘)後，倒除流出液。再加入300μL的結合試劑至離心分離小管，經離心(17,970×g，2分鐘)後，倒除流出液。之後，再加入700μL的清洗試劑(wash solution)至離心分離小管，經離心(17,970×g，2分鐘)後，倒除流出液，並重複上述步驟一次。最後以17,970×g之條件離心5分鐘，去除殘留酒精。將離心分離小管放入一滅菌微量離心管中，加入適量無菌去離子水引流基因體DNA。

本發明洋菜酶DNA片段之選殖

以P.agarexdens基因體DNA為模板，利用聚合酶連鎖反應增幅本發明之洋菜酶DNA片段。於該聚合酶連鎖反應使用下列引子對。

在50μL PCR反應混合物中包含1倍HiFi緩衝液，200μM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP及dCTP)，1μM擴增引子，100ng P.agarexdens基因體DNA及1U VELOCITY^TM DNA聚合酶(BIOLINE,USA)。PCR反應條件為98℃反應5分鐘(1個循環)；98℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應3分鐘(35個循環)；72℃反應7分鐘(1個循環)。

PCR反應結束後，利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。使用PCR-M^TM Clean Up system kit(GeneMark,Taiwan)並依據產品使用說明進行PCR產物之回收。接著使用CloneJET PCR Cloning Kit(Thermo Scientific,USA)來進行洋菜酶DNA片段之選殖。選殖之實驗步驟係參考廠商提供之操作手冊進行。將黏合混合物(ligation mixture)轉形入大腸桿菌ECOS^TM 9-5中。轉形的詳細步驟可參酌產品使用說明，或由領域中的標準實驗步驟加以修飾調整。

將轉形後之菌體培養於含安比西林(ampicillin,100μg/mL)之LB固態培養基上。待長成菌落後，以菌落聚合酶連鎖反應(colony PCR)篩選轉形株。首先，先配置100μL PCR反應液，其中包括1倍Taq反應緩衝液，200μM dNTP(dATP、dTTP、dGTP及dCTP)，1μM擴增引子及2.5U DreamTaq DNA聚合酶(Thermo,USA)。將PCR反應液分裝於PCR小管(10μL/管)中。以牙籤將菌落點至PCR小管後，即可進行PCR反應。PCR反應條件為：95℃反應5分鐘(1個步驟)；95℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應6分鐘(25個循環)；72℃反應7分鐘(1個步驟)。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。抽取經確認帶有外插DNA(insert DNA)之轉形株中的質體，並進行DNA定序(源資國際生物科技股份有限公司)。將經定序確認帶有洋菜酶DNA片段的質體命名為pJET-PBAGA-2-DS-DS；該洋菜酶DNA片段僅為Paenibacillus agarexedens基因體中的一段特定之核苷酸序列，並非一基因序列。

建構本發明之表現載體

本實驗係建構用於表現本發明之洋菜酶的表現載體。此外，本發明係嘗試以前述pJET-PBAGA-2-DS-DS所帶有的洋菜酶DNA片段為基礎，透過基因工程的方式建構出不同DNA片段的洋菜酶基因。以測試刪除特定長度的C端胺基酸(C端刪減突變)是否影響洋菜酶的活性與其於大腸桿菌表現系統中異源性生產的產量。本實驗共建構7個表現載體，分別為：pET-AgaB-2-775、pET-AgaB-2-875、pET-AgaB-2-975、pET-AgaB-2-1096、pET-AgaB-2-1275、pET-AgaB-2-1380、及pET-AgaB-2-1811，將於後續段落中說明。

(1)引子對：針對洋菜酶N端第1至第775個胺基酸的DNA序列設計特異性引子：

針對洋菜酶N端第1至第875個胺基酸的DNA序列設計特異性引子：

針對洋菜酶N端第1至第975個胺基酸的DNA序列設計特異性引子：

針對洋菜酶N端第1至第1096個胺基酸的DNA序列設計特異性引子：

針對洋菜酶N端第1至第1275個胺基酸的DNA序列設計特異性引子：

針對洋菜酶N端第1至第1380個胺基酸的DNA序列設計特異性引子：

針對洋菜酶N端第1至第1811個胺基酸的DNA序列設計特異性引子：

(2)PCR反應混合物(50μL)：本實驗共準備兩種PCR反應混合物分別供前述7個表現載體之建構。

PCR反應混合物1含有下列成分：1倍GDP-HiFi PCR緩衝液B，200μM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP及dCTP)，1μM擴增引子，100ng pJET-PBAGA-2-DS及1U GDP-HiFi DNA聚合酶。

PCR反應混合物2含有下列成分：1倍Hi-Fi緩衝液，200μM的dNTP(dATP、dTTP、dGTP及dCTP)，1μM擴增引子，100ng pJET-PBAGA-2-DS及1U VELOCITY^TM DNA聚合酶。

(3)PCR反應條件：本實驗共準備兩種PCR反應條件分別供前述7個表現載體之建構。

PCR反應條件1為：96℃反應2分鐘(1個循環)；94℃反應30秒、60℃反應30秒、68℃反應1分鐘30秒(35個循環)；68℃反應5分鐘(1個循環)。

PCR反應條件2為：98℃反應5分鐘(1個循環)；98℃反應30秒、55℃反應30秒、72℃反應3分鐘(35個循環)；72℃反應7分鐘(1個循環)。

(4)表現載體之建構：前述pET-AgaB-2-775、pET-AgaB-2-875、pET-AgaB-2-975、pET-AgaB-2-1096、pET-AgaB-2-1275、pET-AgaB-2-1380、及pET-AgaB-2-1811表現載體中之不同DNA片段的洋菜酶基因係分別透過使用前揭引子對、PCR反應混合物、及PCR反應條件進行PCR反應所得。有關PCR反應之實驗設計於下表一所示。

PCR反應完成之後，利用DNA電泳確認PCR產物中是否含有預估大小的DNA片段。接著，利用PCR-M^TM Clean Up kit進行PCR產物之回收。以NdeI與XhoI剪切PCR產物後，利用T4 DNA接合酶將DNA片段接入以相同限制酶剪切之pET-29a(+)(以下簡稱pET-29a)(Merck Millipore,USA)中。將黏合產物轉形進入大腸桿菌ECOS 9-5中。以菌落聚合酶連鎖反應挑選轉形株。利用DNA電泳確認有無預估大小之DNA片段。抽取經確認帶有外插DNA(insert DNA)之轉形株中的質體，並進行DNA定序。將經定序確認帶有洋菜酶基因的質體分別命名為pET-AgaB-2-775(SEQ ID NO 21)、pET-AgaB-2-875(SEQ ID NO 20)、pET-AgaB-2-975(SEQ ID NO 19)、pET-AgaB-2-1096(SEQ ID NO 18)、pET-AgaB-2-1275(SEQ ID NO 17)、pET-AgaB-2-1380(SEQ ID NO 16)、及pET-AgaB-2-1811(SEQ ID NO 15)。前述表現載體所含之序列的相對位置請參第一圖中所述。

實驗二：本發明之重組洋菜酶的誘導表現與偵測。 利用平板培養基測定轉形株表現重組洋菜酶之情形

將本發明表現載體轉形入E.coli BL21(DE3)。利用滅菌牙籤將單一轉形株接種於含有康那黴素(kanamycin)(最終濃度為30μg/mL)與異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG)(最終濃度為1mM)的LB固體培養基中，於30℃下培養48小時。加入10mL碘溶液(18g/L iodine,36g/L potassium iodine)至固體培養基上。搖晃10分鐘後，將碘溶液倒除，再加入10mL 1M NaCl進行褪染。若菌落周圍具有透明環，則代表該轉形株可表現洋菜酶。

實驗結果如第二圖中所示。除了pET-AgaB-2-775表現載體實驗組外，其他本發明之表現載體實驗組所表現的洋菜酶皆具活性，且其活性沒有明顯的區別。pET-AgaB-2-775表現載體實驗組不具透明環可能是因為該轉形株未能表現洋菜酶，或是其所表現的洋菜酶不具活性。

利用蛋白質電泳測定轉形株表現重組洋菜酶之情形

挑選單一菌落接種於含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)的5mL LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行隔夜培養。取100μL的培養菌液加入含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)的10mL LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養至OD₆₀₀達約為0.4至0.6左右時，加入0.1mM IPTG並於特定溫度下進行重組蛋白質之誘導表現。分別於誘導4與24小時後，取2mL菌液進行離心(20,630×g，5分鐘，4℃)，收集菌體部分，進行可溶性蛋白質與不可溶性蛋白質之劃分(即，可溶性與否)。利用蛋白質電泳觀察重組洋菜酶之可溶性表現情形。

實驗結果如第三圖中所示。圖中數據顯示，利用前揭本發明的表現載體皆可表現出可溶性的洋菜酶。綜合第二圖中所示數據，意味著pET-AgaB-2-775表現載體實驗組無法利用平板培養基活性測定法觀察到透明環的原因應該是因為利用該表現載體所表現的洋菜酶不具活性所致。

洋菜酶活性測試

挑選單一菌落接種於含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)的5mL LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行隔夜培養。取100μL之培養菌液加入含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)的10mL LB培養基中，於37℃與180rpm之條件下進行振盪培養至OD₆₀₀達約0.4至0.6左右時，加入0.1mM IPTG並於37℃下誘導4小時後，取1mL之OD₆₀₀調整至2.0的菌液進行離心(20,630×g，5分鐘，4℃)，收集菌體部分。將菌體懸浮於Lysis緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，pH 7.4)中，並進行破菌處理。離心(20,630×g，5分鐘，4℃)後，取破菌上清液(意即可溶性蛋白質部分)進行酵素活性測定。

酵素活性測定方法如下所述。將850μL 0.24%(w/v)之低熔點瓊脂醣(洋菜酶受質)溶液與100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻後，加熱至完全溶解並於40℃下放置10分鐘。加入50μL之破菌上清液至酵素反應受質中，於40℃下反應10分鐘。反應完畢後，立即加入1mL DNS溶液(1% 3,5-dinitrosalicylic acid,30% potassium sodium tartrate tetrahydrate,1.6% NaOH)，並於100℃下加熱5分鐘。待反應液冷卻後，加入1mL去離子水進行混合，並取出100μL反應液至96孔盤中，再以ELISA reader於540nm之波長下測定吸光值。利用不同濃度之半乳糖(D-galactose)溶液進行DNS呈色反應，建立還原糖之標準曲線。利用該標準曲線，以前揭於540nm之波長下測得的吸光值為基礎，計算出本發明洋菜酶於酵素反應所釋出的還原糖量。一個活性單位(activity unit,U)定義為每分鐘產生相當於1μmole半乳糖所需之酵素量。

每毫升培養液之酵素活性(U/mL)係如第四圖中所示。實驗結果證實本發明之pET-AgaB-2-775表現載體實驗組所表現的洋菜酶確實不具活性。這樣的結果說明本發明選殖之P.agarexdens洋菜酶N端的前875個胺基酸應為維持其活性所必須者。

實驗三：本發明之重組洋菜酶的純化與特性分析。 重組洋菜酶之誘導表現與純化

挑選轉形株之單一菌落，並將其接種於含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)的12mL LB培養基中，於37℃、180rpm之條件下培養隔夜。取10mL之培養菌液加入含有康那黴素(最終濃度為30μg/mL)之1L LB培養基中，振盪培養(37℃，180rpm)至OD₆₀₀約為0.4至0.6左右。接著加入0.1mM IPTG並於特定溫度(18℃,25℃,30℃,37℃)下進行重組蛋白質之誘導表現。誘導24小時後，離心(10,000×g，10分鐘，4℃)收集菌體部份。再將菌體懸浮於10mL Lysis緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，pH 7.4)中，並利用超音波破碎儀將菌體破碎後，進行離心(8,000×g，15分鐘)以收集上清液部分。最後再以0.22μm過濾膜過濾所收集到的上清液。

然後，利用重組蛋白質C端之His tag能與鎳或鈷離子形成配位共價鍵之特性，採用固定化金屬離子親和層析法(immobilized-metal ion affinity chromatography)進行蛋白質純化。重組洋菜酶之純化之方式係利用蛋白質液相層析系統ÄKTA prime plus(GE Healthcare,Sweden)搭配5mL HiTrap^TM Ni excel管柱(GE Healthcare,Sweden)進行。首先，以25mL Lysis緩衝液平衡管柱後，將前述上清液注入HiTrap^TM Ni excel管柱。待樣品注入完成後，以100mL之清洗緩衝液[20mM磷酸鈉，500mM NaCl，30mM咪唑(imidazole)，pH 7.4]洗除非特異性結合之蛋白質。最後以150mL之溶離緩衝液(20mM磷酸鈉，500mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.4)沖提樹脂上的洋菜酶。此原理係藉助高濃度的咪唑與重組洋菜酶競爭樹脂結合部位，致使重組洋菜酶自樹脂上被沖提下來。將純化之洋菜酶溶液放入Amicon ultra-15 ultracel-30K離心管(Merck Millipore,USA)中，於4℃下以2,600×g離心至適當體積後，貯存於4℃中備用。

於不同溫度下表現本發明之表現載體所得的洋菜酶產量如下表二中所示。E.coli BL21(DE3)(pET-AgaB-2-875)於18℃下誘導24小時可得最大量之可溶性洋菜酶。E.coli BL21(DE3)(pET-AgaB-2-975)於18℃下誘導24小時可得最大量之可溶性洋菜酶；E.coli BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1096)於18℃下誘導24小時可得最大量之可溶性洋菜酶； E.coli BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1275)於18℃下誘導24小時可得最大量之可溶性洋菜酶；E.coli BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1380)於18℃下誘導24小時可得最大量之可溶性洋菜酶；E.coli BL21(DE3)(pET-AgaB-2-1811)於25℃下誘導24小時可得最大量之可溶性洋菜酶。上述之結果顯示，降低誘導溫度或延長誘導時間有助於提升本發明之洋菜酶刪減突變體之可溶性表現量。此外，由結果中亦可觀察到C端之刪減突變可提升重組蛋白質之產量。

本發明之重組洋菜酶的特性探討

(1)較佳催化溫度：將850μL 0.24%(w/v)低熔點瓊脂醣溶液與100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻後，加熱至完全溶解，並於不同溫度(30至80℃)下放置10分鐘。之後，於各試管中加入50μL洋菜酶溶液(0.1U)，於不同溫度(20至80℃)下反應10分鐘。後續之DNS呈色與酵素活性單位計算方法係如前揭實驗中所述。將反應測得之最高酵素活性定義為100%，此即為最適作用溫度下之酵素活性，並計算其他溫度下之相對酵素活性。從實驗結果來看(第五圖)，本發明之各洋菜酶的較佳催化溫度約在40至50℃；其中AgaB-2-875、AgaB-2-975、AgaB-2-1096、AgaB-2-1275、AgaB-2-1380及AgaB-2-1811之較佳催化溫度分別為40℃、45℃、45℃、50℃、50℃及45℃。

(2)較佳催化酸鹼值：將850μL 0.24%(w/v)低熔點瓊脂醣溶液分別與100μL 0.5M檸檬酸緩衝溶液(pH 3~6)、磷酸緩衝溶液(pH 6~8)及甘胺酸-氫氧化鈉(Glycine-NaOH)緩衝溶液(pH 9~10)混合均勻後，加熱至完全溶解，製備成不同pH值的反應受質。取950μL反應受質於酵素的前揭較佳催化溫度下放置10分鐘後，加入50μL洋菜酶溶液(0.1U)，於酵素之最適作用溫度下反應10分鐘。後續之DNS呈色與酵素活性單位計算方法係如前揭實驗中所述。將反應測得之最高酵素活性定義為100%，此即為較佳催化酸鹼值下的酵素活性，並計算其他酸鹼值下之相對酵素活性。實驗結果顯示本發明之各洋菜酶的較佳催化酸鹼值皆約為6。

(3)酵素動力學分析：將850μL不同濃度(0.24~3.53%,w/v)之低熔點瓊脂醣溶液與100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻後，加熱至完全溶解並於酵素之前揭較佳催化溫度下放置10分鐘。之後，於各試管中加入50μL洋菜酶溶液(0.1U)，於酵素之較佳催化溫度下反應10分鐘。後續之DNS呈色與酵素活性單位計算方法係如前揭實驗中所述。以受質濃度對酵素反應速率作圖，可得受質飽和曲線圖。利用Lineweaver-Burk plot雙倒數法求得受質飽合濃度(米氏常數，Michaelis constant，Km)值與最大反應速率Vmax值。再進一步利用Vmax計算轉變數(turnover number,Kcat)與催化效率(catalytic efficiency,Kcat/Km)值。

實驗結果如下表三中所示。本發明前述段落中所述實驗中已證實C端刪減突變有助於提升產量。而此實驗進一步說明特定C端刪減突變可能會降低催化效率(Kcat/Km)。惟縱使如此，本發明之重組洋菜酶已具備足以供應商業利用的催化效率，其中又以AgaB-2-1275及AgaB-2-1811的催化效率尤佳。

(4)金屬離子對本發明之洋菜酶的活性影響：將100μL 20mM之金屬鹽類溶液、750μL 0.27%(w/v)之瓊脂醣及100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻後，加熱至完全溶解並於酵素之較佳催化溫度下放置10分鐘。加入50μL洋菜酶溶液(0.1U)至酵素反應受質中，於酵素之較佳催化溫度下反應10分鐘。後續之DNS呈色與酵素活性單位計算方法係如前揭實驗中所述。利用相對活性比較不同金屬鹽類對於本發明之重組洋菜酶水解能力的影響。實驗結果如下表四中所示。金屬鹽類(金屬離子)確實有助於提升本發明洋菜酶(AgaB-2-1275及AgaB-2-1811)的活性；其中MnCl₂更可提升本發明洋菜酶之活性達2倍以上。

(5)本發明洋菜酶之受質特性分析：本實驗係探討可被本發明洋菜酶水解的物質。將850μL 0.24%(w/v)之瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻酸鈉(sodium alginate)、鹿角菜膠(carrageenan)、可溶性澱粉及羧甲基纖維素鈉(sodium carboxymethylcellulose)溶液分別與100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻後，加熱至完全溶解並於酵素之較佳催化溫度下放置10分鐘。接著加入50μL洋菜酶溶液(0.1U)至酵素反應受質中，於酵素之較佳催化溫度下反應10分鐘。後續之DNS呈色與酵素活性單位計算方法係如前揭實驗中所述。實驗結果顯示(第七圖)，本發明之重組洋菜酶對低熔點瓊脂醣之水解能力最佳；亦可水解瓊脂醣與洋菜；但無法水解海藻酸鈉、鹿角菜膠、可溶性澱粉及羧甲基纖維素鈉。

(6)本發明洋菜酶之產物分析：本實驗採用薄層層析法(Thin layer chromatography,TLC)分析洋菜酶水解瓊脂醣之產物。將850μL 1.18%(w/v)低熔點瓊脂醣溶液與100μL 0.5M磷酸緩衝溶液(pH 6)混合均勻為一混合物後，加熱至完全溶解，並在40℃下放置10分鐘。然後加入50μL之洋菜酶溶液(2U/mL)至前述混合物中，於40℃下反應24小時。接著離心該反應液(15,000rpm，4℃，10分鐘)，再以0.22μm過濾膜進行過濾除菌，並儲存於-20℃下備用。將8μL洋菜酶水解產物、2μL新洋菜二糖溶液(10μg/μL)、2μL新洋菜四糖溶液(10μg/μL)及2μL新洋菜六糖溶液(10μg/μL)點樣於矽膠60 TLC片(Merck Millipore,USA)上。待樣品風乾後，將膠片傾斜放入含有展開液(50%正丁醇，25%醋酸，25%去離子水)之展開槽中。待展開完成後，將TLC片取出風乾，再將0.1M鄰苯二甲酸苯胺溶液(aniline phthalate solution)(Sigma-Aldrich,USA)噴灑至膠片上。經風乾後，利用加熱方式進行呈色，並計算樣品與標準品訊號之Rf值(retention factor value)。由Rf值判斷洋菜酶水解產物之種類。實驗結果顯示，本發明之洋菜酶水解瓊脂糖的主要產物為新洋菜四糖，其含量約為產物的40重量百分濃度以上，另含有新洋菜六糖與六糖以上之寡醣。值得注意的是，產物中幾乎不含有新洋菜二糖。

<110> 財團法人農業科技研究院

<120> 洋菜酶、含其之組合物、及其應用

<130>

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1811

<212> PRT

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 1

<210> 2

<211> 1380

<212> PRT

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 2

<210> 3

<211> 1275

<212> PRT

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 3

<210> 4

<211> 1096

<212> PRT

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 4

<210> 5

<211> 975

<212> PRT

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 5

<210> 6

<211> 875

<212> PRT

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 6

<210> 7

<211> 775

<212> PRT

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 7

<210> 8

<211> 5436

<212> DNA

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 8

<210> 9

<211> 4140

<212> DNA

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 9

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<211> 3825

<212> DNA

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 10

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<211> 3288

<212> DNA

<213> Paenibacillus agarexedens

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<211> 2925

<212> DNA

<213> Paenibacillus agarexedens

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<212> DNA

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 13

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<212> DNA

<213> Paenibacillus agarexedens

<400> 14

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vector

<400> 15

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<211> 9402

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> vector

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<211> 9087

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> vector

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<211> 8550

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> vector

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> vector

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> vector

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> vector

<400> 21

<210> 22

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<223> primer

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<210> 24

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<400> 25

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

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<212> DNA

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<400> 29

<210> 30

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> primer

<400> 30

Claims

一種β-洋菜酶，其至少包含SEQ ID NO 06所示胺基酸序列。
如請求項1所述之β-洋菜酶，其具有SEQ ID NO 01所示胺基酸序列。
如請求項1所述之β-洋菜酶，其具有SEQ ID NO 02所示胺基酸序列。
如請求項1所述之β-洋菜酶，其具有SEQ ID NO 03所示胺基酸序列。
如請求項1所述之β-洋菜酶，其具有SEQ ID NO 04所示胺基酸序列。
如請求項1所述之β-洋菜酶，其具有SEQ ID NO 05所示胺基酸序列。
如請求項1所述之β-洋菜酶，其具有SEQ ID NO 06所示胺基酸序列。
一種用於分解瓊脂醣的組合物，其包含：0.1至10U/mL之如前述請求項1-7中任一項所述之洋菜酶；及50至200mM之緩衝液；其中前述U/mL及前述mM係以前述組合物的總體積為基礎。
如請求項8所述之組合物，其進一步包含1至2mM之鹽類，其係以前述組合物的總體積為基礎。
如請求項9所述之組合物，其中前述鹽類為KCl、ZnSO₄、FeSO₄、BaCl₂、NaCl、SrCl₂、CoCl₂、MgSO₄、MnCl₂、CaCl₂、AlCl₃、或其組合。
一種生產新洋菜寡醣的方法，其包含以下步驟：(A)提供一樣本，其包含一瓊脂醣；及(B)使前述樣本與一如請求項8所述之組合物接觸。
如請求項11所述之方法，其中前述組合物進一步包含1至2mM之鹽類，其係以前述組合物的總體積為基礎。
如請求項11所述之方法，其中前述方法之產物包含至少40重量百分濃度之新洋菜四糖，其係以前述產物的總重量為基礎。
如請求項11所述之方法，其中前述方法之產物實質上不包含新洋菜二糖。
如請求項11所述之方法，其中前述步驟(B)係於40℃至60℃下進行。
如請求項11所述之方法，其中前述步驟(B)係於pH 5至7下進行。
如請求項11所述之方法，其中前述樣本係為：瓊脂醣、低熔點瓊脂醣、洋菜、海藻多醣粗萃物、或其組合。
一種β-洋菜酶表現載體，其包含：一核苷酸序列，其包含選自由SEQ ID NO 8、SEQ ID NO 9、SEQ ID NO 10、SEQ ID NO 11、SEQ ID NO 12、及SEQ ID NO 13所組成之群組的序列；及一大腸桿菌表現系統之調控元件，其包含一啟動子與核糖體結合部位。
如請求項18所述之表現載體，其具有選自由SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、及SEQ ID NO 20所組成之群組的序列。