TW201722897A - 有效於治療肝毒性及脂肪肝疾病的化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及有效於治療肝毒性及脂肪肝疾病的化合物及其用途。

Description

有效於治療肝毒性及脂肪肝疾病的化合物及其用途
本發明涉及有效治療肝毒性和脂肪肝疾病的化合物及其用途。
器官中的損傷可能由有毒試劑所引起，例如當施用過量的治療藥物時，通常會導致器官特別是肝臟或腎臟的損傷。對乙醯胺基酚(亦為已知的Panadol)也被稱為對乙醯胺基酚或N-乙醯基-對-胺基苯酚(N-acetyl-para-aminophenol，APAP)，是市場上使用最廣泛的緩解疼痛和減少發燒症狀的藥物。每年都有許多因為不當使用APAP而造成藥物中毒或自殺的案例，而且由APAP引起的肝損傷是嚴重疾病和死亡的主要原因。醇類或有機溶劑如四氯化碳(CCl4 )也可能引起肝毒性。許多臨床研究已證實，由APAP誘導的肝毒性是可預防的，而且早期診斷以及使用解毒劑N-乙醯半胱胺酸(N-acetylcysteine，NAC)可防止肝毒性的發生。
過量使用對乙醯胺基酚的早期檢測是必要的，因為如果在中毒後8小時內投與解毒劑，可達到最佳預後效果。藥物中毒的早期症狀包括不適、噁心和嘔吐。然而，有些患者即使其血液中的對乙醯胺基酚的濃度達到中毒的程度而且其異常肝功能呈現明顯異常，他們在早期(階段1)可能沒有顯現出中毒的跡象。肝毒性的跡象，例如腹痛、持續性嘔吐、黃疸、右上腹疼痛，通常在攝入大量的對乙醯胺基酚後24-48小時(階段2)變得明顯。血清轉胺酶通常在給藥後16小時開始提升，並伴隨出現臨床症狀。階段3通常在施用後3-4天發生，而且此時很容易預測肝損傷程度以及預後程度。肝毒性的徵兆從肝功能指數升高(AST＞1,000IU/L)的輕微症狀，到伴隨代謝性酸中毒、黃疸、高血糖、AST＞1,000IU/L、異常凝血和肝/腦病變的嚴重急性暴發性肝炎。在嚴重的情況下，階段4將會引起少尿腎衰竭或死亡。
有些對乙醯胺基酚中毒的患者僅顯示出輕度肝損傷，但具有嚴重的腎毒性，這主要是因為在腎小管的P-450s (細胞色素P450s，CYPs)中的APAP的直接代謝所引起。然而，急性腎衰竭也可能由急性肝衰竭所引起的肝腎綜合徵而引起，且鈉(FeNa)的排泄分率(fraction excretion)可用於區別原發性腎損傷(FeNa＞1)與肝腎綜合徵(FeNa＞1)。FeNa的計算式為(尿中的鈉濃度 ÷ 尿中的肌酐濃度) ÷ (血漿中的鈉濃度 ÷ 血漿中的肌酸酐濃度) × 100。
口服給藥後1-2小時達到血液中對乙醯胺基酚濃度的高峰，而且肝臟會消除掉大量的對乙醯胺基酚，超過90%的對乙醯胺基酚與葡萄糖苷酸和硫酸鹽結合，形成無毒代謝物，只有小於5%的對乙醯胺基酚被不同的CYPs消除，包括CYP2E1、CYP1A2和CYP3A4，其中CYP2E1和CYP1A2是代謝的主要酵素。這些酵素產生的代謝物N-乙醯基對苯醌亞胺(N-acetyl-p-benzoquinoneimine，NAPQI)是一種非常活躍的親電體。在正常條件下，NAPQI將立即與細胞中的穀胱甘肽反應並形成無毒的硫醇鹽。過量的對乙醯胺基酚使穀胱甘肽的消耗速率大於其合成速率，且當細胞中的穀胱甘肽含量低於正常範圍的30%時，NAPQI將結合大分子或含有半胱胺酸的核酸而導致肝損傷。由組織化學染色結果顯示，NAPQI將結合到半胱胺酸的巰基，並在肝細胞壞死發生前在中心小葉區域形成共價鍵。
患有肝病、酒精成癮或正在服用可能誘導P450活性的藥物，如卡巴馬平、乙醇、異煙酸酊、乙苯基丙二醯脲(可能是其他巴比妥類藥物)、二苯乙內醯脲、苯磺唑酮、磺醯脲類、立汎黴素和普瑞米頓(Primidone)，的患者是發展出由APAP造成的嚴重肝毒性的好發族群，而且若該患者同時產生併發症，例如成人呼吸窘迫綜合徵、腦水腫、無法控制的出血、感染或多器官功能障礙綜合徵(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)，則可能很容易死亡。以乙醇為例，乙醇主要由肝臟的CYP2E1消除，其APAP中毒的機制分為三個階段：第一階段，乙醇在肝臟中與APAP競爭CYP2E1的受體，且該階段中NAPQI的濃度降低，在第二階段，乙醇將CYP2E1的半衰期從7小時延長至37小時，這增加了肝臟中CYP2E1的含量，而且在此階段NAPQ1的濃度將緩慢增加，而在第三階段，在酒精戒斷期間，肝臟中會出現更多的CYP2E1以消除對乙醯胺基酚，因此對乙醯胺基酚的毒性代謝物顯著增加並導致肝臟損傷。最近的研究表明，二烯丙基硫醚可有效預防小鼠中由對乙醯胺基酚所引起的肝毒性，進一步證明二烯丙基硫醚可抑制CYP2E1的活性。據推測，二烯丙基硫醚對乙醯胺基酚誘導的肝毒性的保護機制是通過抑制對乙醯胺基酚產生中間體NAPQI來達成的。以前的研究顯示，通過抑制作用，可以減少肝細胞中還原型穀胱甘肽的消耗、氧化活化、線粒體功能障礙，以及由NAPQI引起的DNA損傷，進而將由對乙醯胺基酚誘導的肝損傷降到最低。例如，人蔘屬植物三七(Panax notoginseng )、腺苷及其衍生物單磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷可以通過這種保護機制預防由對乙醯胺基酚誘導的肝損傷。
脂肪肝被認為是導致肝損傷的另一個因素。在正常情況下，脂肪佔肝臟重量的3%。臨床上，「脂肪肝疾病(fatty liver disease，FLD)」是指肝臟中的脂肪超過肝臟重量的5%，或超過10%的肝臟細胞在肝臟組織切片中顯現出囊泡脂肪變化。根據疾病的原因，脂肪肝可分為酒精性脂肪肝疾病(alcoholic fatty liver diseases，AFLD)、非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD)或由其他因素，如藥物，引起的其他脂肪肝疾病。脂肪肝疾病的病理特徵在於出現脂肪變態或脂肪變性、脂肪性肝炎或其類似物。通過脂肪變性的肝細胞的百分比，脂肪肝被分類為輕度(＜33%)、中度(33-66%)和重度(＞ 66%)。以前，脂肪肝被認為是良性的而且是可逆的情況，因此較少被認真看待，但最近的研究發現它會導致嚴重的肝纖維化和肝硬化，甚至是肝癌。隨著肥胖人群的增加，FLD的罹患率也在增加。
歐洲和美洲國家發生肝病的主要原因是慢性過度飲酒，因此，絕大多數肝病是由酒精損傷所引起的。但在過去的15-20年，NAFLD已成為歐洲和美洲國家的肝臟功能障礙的首要疾病。Thaler曾在1962年描述過NAFLD。而在1980年，Ludwig提出了來自伴隨的NAFLD之「非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)」，他在一群患有糖尿病和高脂血症的肥胖女性患者中發現該病症。此後，在1986年，Schaffner再次強調，NASH在發生NAFLD過程中誘導纖維化的機制內發揮重要作用。直到1998年，Day發現15-50%的NASH患者具有不同程度的纖維化，因此臨床醫師們開始注意到NAFLD。到了今日，除了AFLD，NASH不僅只是臨床上NAFLD自然進展的一個階段。由於NASH的存在，NAFLD不再被認為是良性肝病。
關於NAFLD的機制，Day和James在英國提出了基於大量臨床研究和動物實驗的二次發作假設。脂肪肝在第一次發作時發生，並且在第二次發作時發生脂肪性肝炎。第一次發作是由肝臟中因為肥胖、高脂血症等造成的過度積累的脂肪所引起的。第二次發作是由於氧化壓力和活性氧(reactive oxygen species，ROS)在線粒體中的作用，導致肝細胞膜上的脂質過氧化、原始炎症細胞激素和自由基的釋放，以及由星狀細胞活化引起的纖維化，並導致肝細胞壞死。NASH的機制涉及三酸甘油酯的過氧化、氧化壓力、ROS反應、肝細胞中脂質過氧化的增加，或細胞激素和肝酵素的增加，導致一系列自體免疫相互作用。
脂肪肝發生的原因主要是與長期過度攝入動物脂肪、蛋白質、碳水化合物有關，過量卡路里轉化為脂肪積累在體內，導致肥胖和脂肪肝。脂肪肝患者的血液可能具有正常的GOT/GPT值。因此，脂肪肝的正確診斷必須使用腹部超音波，目前腹部超音波可提供超過97%的準確度。
目前，尚無理想藥物可提供針對FLD的特異性治療效果，其治療基準目標為通過使用藥物來改善潛在的危險因素或控制慢性疾病的發展。一般建議根據造成脂肪肝的原因對症治療。例如，那些因為超重引起的脂肪肝的患者應該適度地減肥。任何帶有酒精性脂肪肝的患者都需要戒酒，並採取均衡的飲食來改善狀況。會損傷肝臟且由於長期接觸而導致脂肪肝疾病的化學物或藥物應立即停止使用。由於疾病，例如C型肝炎、高血脂等，引起的脂肪肝應通過治療原發疾病，例如治療C型肝炎或控制血脂，來治療。然而，如果過多的三酸甘油酯是由於個人體質的因素所造成，則很難通過減肥來改善脂肪肝疾病。
然而，目前臨床上常用於降低血清三酸甘油酯和膽固醇的現有藥物通常伴隨著副作用，例如肝毒性、肌病如肌痛、肌炎、橫紋肌溶解症及其類似物。關於降脂藥物，肌肉毒性是最顯著的副作用。特別是，他汀類藥物顯現出最高的肌肉毒性發生率，並且伴隨產生纖維酸。此外，降脂藥具有「脂肪驅動」效應，其將血脂「驅動」到肝臟，而肝臟中早已蓄積脂肪，且脂質的流入難以進行，導致肝臟中累積過多的脂肪，而使脂肪肝的情況更糟。可以看出，降脂藥物並不適合治療FLD。
於一方面，本發明提供一種新的化合物，其結構由式(I)表示如下式(I)， 其中 L為飽和或不飽和脂肪族基團； R係選自於下列所組成之群組：氫、多元醇基團和(G)­p 的糖基團，其中G為單醣殘基，且p為1至100的整數，其中(G)p 中的至少一個羥基被鹵素原子取代；以及 Q為2至4的整數，且每個R為相同或不同， 或其醫藥上可接受之鹽類。
於某些具體實施例中，本發明之化合物由式(II)表示如下： R1 -O-X-(CH2 )m -X-O-R2 式(II)， 其中 X為C=O； R1 和R2 為相同或不同，係選自於下列所組成之群組：氫、多元醇基團和(G)p 的糖基團，其中G為單醣殘基且p為1至100的整數，其中在(G)p 中的至少一個羥基被鹵素原子取代，其中當R1 為氫時，則R2 不為氫；以及 m為1至40的整數。
於另一方面，本發明提供了一種醫藥組合物，其包含至少一種如本文所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽類以及一醫藥上可接受之載體。
於另一方面，本發明提供了一種治療方法，其通過向有需要的個體施用一有效量的至少一種如本文所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
於某些具體實施例中，提供本發明之方法以預防或治療特徵在於在有需要的個體體內增加細胞色素P450的活性或增加自由基含量的疾病或病症。
於某些具體實施例中，提供本發明之方法以預防或治療在有需要的個體中的器官損傷。
於某些具體實施例中，提供本發明的方法以預防或治療在需要的個體中的肝毒性。
於某些具體實施例中，提供本發明的方法以預防或治療脂肪肝、保護肝功能或改善由脂肪肝或其它相關病症引起的肝臟疾病。
於另一方面，本發明提供如本文所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽類用於製備藥物之用途。具體而言，該藥物可用於預防或治療(i)特徵在於增加細胞色素P450的活性或增加自由基含量的疾病或病症，(ii)器官損傷，及/或(iii)肝毒性，及/或(iv)預防或治療脂肪肝、保護肝功能或改善由脂肪肝或其它相關疾病引起的肝臟疾病。
在下面的描述中闡述了本發明一個或多具體個實施例的細節。 從以下幾個具體實施例的詳細描述以及從所附之申請專利範圍中，本發明的其它特徵或優點將會顯而易見。
除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域之技術人員通常理解的相同含義。
如本文所用，冠詞「一」和「一個」是指該冠詞的語法對象的一個或多於一個(即，至少一個)。舉例而言，「一個元件」是指一個元件或多於一個元件。
I. 化合物
於一方面，本發明提供新的化合物，其結構由如下之式(I)所表示式(I)， 其中 L為飽和或不飽和脂肪族基團； R係選自於下列所組成之群組：氫、多元醇基團和(G)­p 的糖基團，其中G為單醣殘基，且p為1至100的整數，其中(G)p 中的至少一個羥基被鹵素原子取代；以及 Q為2至4的整數，且每個R為相同或不同， 或其醫藥上可接受之鹽類。
如本文所用，「脂肪族的」或「脂肪族基團」等詞表示為一種可為直鏈(即，無支鏈)、支鏈或環狀(包括融合的、橋接的和螺合的多環)的烴部分體，且可為完全飽和的或可含有一個或多個不飽和單元，但並非芳香族的。通常，脂肪族基團含有1-40個碳原子。於某些具體實施例中，脂肪族基團含有1-20個碳原子，或1-12個碳原子、1-8個碳原子或1-4個碳原子。於某些具體實施例中，脂肪族基團含有3-20個碳原子，或3-12個碳原子、3-8個碳原子或3-4個碳原子。合適的脂肪族基團包括，但不限於，直鏈或支鏈的烷基、烯基和炔基及其雜合物，例如(環烷基)烷基、(環烯基)烷基或(環烷基)烯基。
在某些具體實施例中，式(I)中的L基團係選自(a)直鏈烷基，(b)支鏈烷基，(c)由苯環取代的直鏈烷基，(d)由苯環取代的支鏈烷基，(e)苯基，其中該苯環含有直鏈脂肪族基團，以及(f)苯基，其中該苯環含有脂肪族支鏈。
如本文所用，「多元醇基團」乙詞表示每分子含有多個羥基(兩個或更多個羥基)的醇類。具體而言，該多元醇基團可為直鏈或環狀的，經取代的或未經取代的，或其混合物，只要所得之複合物為水溶性的且為醫藥上可接受的。
於某些具體實施例中，該多元醇基團為C3-24多元醇，特別是C3-20多元醇，更特別是C3-12多元醇或C3-12多元醇。
在更具體的具體實施例中，該多元醇基團由-CH-(CHOH)n CH2 OH表示，其中n為1-22、1-18、1-10，或1-6。在一個特定的實例中，n為4。
較佳的多元醇為糖醇。多元醇的實例包括，但不限於，3-碳多元醇(例如甘油、赤蘚糖醇和蘇糖醇)；5碳多元醇(例如阿糖醇、木糖醇和核糖醇)；6碳多元醇(例如甘露醇、山梨醇、半乳糖醇、岩藻糖醇、艾杜糖醇和肌醇)；12-碳多元醇(例如，油醇、異麥芽酮糖醇、麥芽糖醇和乳糖醇)；18-碳多元醇(例如麥芽三糖醇)；和24-碳多元醇(麥芽四糖醇)。
在式(I)中，G表示單醣殘基。本文所用之單醣較佳為具有化學式C6 H12 O6 (即，己糖)的6-碳單醣。該己糖可為D構型、L構型或其組合。己糖通常根據官能團分類。舉例而言，醛己糖在位置1具有醛，例如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔羅糖；而酮己糖則在位置2具有酮，例如阿洛酮糖、果糖、山梨糖和塔格糖。己糖還含有6個羥基，己糖中的醛或酮官能基可與相鄰的羥基官能基反應，分別形成分子內的半縮醛或半縮酮。若所得之環狀糖為5元環，則其為呋喃糖。若所得之環狀糖為6元環，則其為吡喃糖。環自發地打開和關閉，允許羰基和相鄰碳原子之間的鍵發生旋轉，產生二種不同的構型(α和β)。己糖可為S構型或R構型。
根據本發明，式(I)中的一個或多個單醣殘基中的至少一個羥基被鹵素原子取代。該鹵素原子的實例包括氯、溴和碘。特定來說，該鹵素原子為氯。
如本文所用的，「S 」或「R 」等詞係通過其構型而不涉及參考分子的命名光學異構體的方式，其被稱為R/S 系統。根據普利洛優先法則(Cahn Ingold Prelog priority rules)，基於原子序數，根據其配體各自被指定優先級的系統標記每個手性中心R 或S 。該系統標記分子中的每個手性中心(還具有不涉及手性中心的手性分子的延伸)。若化合物具有兩個手性中心，則可將其標記為例如(S, S )異構體對(S, R )異構體。
如本文所用，「醫藥上可接受之鹽類」乙詞包括酸加成鹽類。「醫藥上可接受之酸加成鹽類」係指保留生物學有效性和游離鹼性質的那些鹽類，游離鹼係與無機酸如，鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似物，以及有機酸如乙酸、丙酸、丙酮酸、馬來酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、水楊酸、三氟乙酸及其類似物形成。
於某些具體實施例中，在式(I)中，q為2、3或4，R基團中的至少一個不同於R中的另一個。
在某些具體實施例中，在式(I)中，q為2。
在這些具體實施例中，本發明之化合物可由式(II)表示如下： R1 -O-X-(CH2 )m -X-O-R2 式(II)， 其中 X為C=O； R1 和R2 為相同或不同，係選自於下列所組成之群組：氫、多元醇基團和(G)p 的糖基團，其中G為單醣殘基且p為1至100的整數，其中在(G)p 中的至少一個羥基被鹵素原子取代，其中當R1 為氫時，則R2 不為氫；以及 m為1至40的整數， 或其醫藥上可接受之鹽類。
在某些具體實施例中，在式(II)中，R1 為多元醇基團，R2 為(G)­p 的糖基團。在這種情況下，式(II)的化合物被認為是透過酯鍵藉由連接子將多元醇部分體與該糖部分體連接的綴合物。具體而言，該連接子由-O-X-(CH2 )m -X-O- (式(L))表示，其中X為C=O，m為1-40、1-20、1-12、1-8或1-4，更具體而言，m為3-20、3-12、3-8或3-4。在一個特定實例中，m為4。
於一些具體實施例中，p為2。該糖基團由-G1 -O-G2 表示，其中G1 和G2 相同或不同，係選自於由己醛糖和酮己糖所組成之群組，且在G1 中的至少一個羥基或在G2 中的至少一個羥基被鹵素原子取代。
於一些具體實施例中，G1 為葡萄糖，其中一個羥基被氯取代；以及G2 為果糖，其中二個羥基被氯取代。
在某些具體實施例中，糖基團由式(Ia)表示，式(Ia)。
本發明化合物的某些實例如下： 式1的((2R,3R,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5-雙(氯甲基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)氧基)-3-氯-4,5-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基((2R,3R,4R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)己二酸酯式1，以及 式2的C6-甘露醇式2。
於另一方面，本發明提供如下式C的中間體：其中Ph為苯基且Bn為芐基。
式(I)的化合物可以化學合成，例如通過如圖6的一般方案中所示的方法進行。
具體而言，本發明提供了可以提供一個或多個-COOH基團以與醇類進行酯化作用的連接劑。在步驟1中，該提供第一-COOH基團(若其他的可得的話，則會被保護)的連接劑與具有第一游離羥基(若其他的可得的話，則會被保護)的R反應以進行第一酯化作用，產生式(I)的化合物，其中q為1。在步驟2中，提供第二-COOH基團(若其他的可得的話，則會被保護)的連接劑與具有第二游離羥基(若其他的可得的話，則會被保護)的R反應以進行第二酯化作用，產生式(I)的化合物，其中q為2。在步驟3中，提供第三-COOH基團(若其他的可得的話，則會被保護)的連接劑與具有第三游離羥基(若其他的可得的話，則會被保護)的R反應以進行第三酯化作用，產生式(I)的化合物，其中q為3。在步驟4中，提供第四-COOH基團(若其他的可得的話，則會被保護)的連接劑與具有第四游離羥基(若其他的可得的話，則會被保護)的R反應以進行第四酯化作用，產生式(I)的化合物，其中q為4。
於一些具體實施例中，進行酯化作用的連接劑由式(La)表示， P1 -O-X-(CH2 )m -X-O-P2 式(La) 其中X與m如上所定義，且P1 和P2 相同或不同，為保護基或H。
於一些具體實施例中，進行酯化作用的連接劑由式(Lb)表示式(Lb)。
如本文所用，「保護基」為連接到官能部分體(例如羥基中的氧或胺基中的氮，代替氫)以保護官能基免於以不期望的方式進行反應的化學基團。保護基包括，例如，叔丁基、環烷基(例如，環己基)、芳基(例如2,4-二硝基苯基)、芳烷基(例如芐基、2,6-二氯芐基、3-溴芐基、2-硝基芐基、4-二甲基胺基甲醯基芐基和三苯基甲基)、四氫吡喃基、醯基、烷氧基羰基(例如叔丁氧基羰基)、芳烷氧基羰基(例如苄氧羰基、2-溴苄氧羰基)、二烷基硫代膦醯基(例如二甲基硫代膦醯基)和二芳基硫代膦醯基(例如二苯基硫代膦醯基)。較佳的保護基包括醯基及其類似物。
在一個特定實例中，在實施例1中提供了方案1，顯示本發明之化合物的具體合成方法。
II. 本發明之化合物的用途
本發明之化合物可作為用於治療方法的藥物。通常，式(I)的化合物作為前藥，在給藥後可變為代謝物，提供如本文所述之需要的治療效果。在一個實例中，式(I)的化合物為化合物F，其在施用後可變為甘露醇、三氯蔗糖和C6-甘露醇，這些都可作為P450抑製劑，並提供例如抗肝毒性的作用。參見以下實例。
本發明提供一種治療方法，其通過向有需要的個體施用一有效量的至少一種如本文所述之化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
本發明之化合物被發現作為例如P450抑製劑是有效的。
於一些具體實施例中，提供本發明之方法以預防或治療特徵在於在有需要的個體體內增加細胞色素P450的活性的疾病或病症。
這些疾病或病症的實例係列於表A中。 表A
於一些具體實施例中，提供本發明之方法以預防或治療特徵在於在有需要的個體體內增加自由基含量的疾病或病症。
於一些具體實施例中，提供本發明之方法以預防或治療在有需要的個體中的器官損傷。
在具體的實施例中，該器官損傷在肝臟或腎臟中。
在具體的實施例中，器官損傷或肝毒性係由治療藥物、CCl4 或脂質累積所引起。
在具體的實施例中，該治療藥物是對乙醯胺基酚。
於一些具體實施例中，提供本發明之方法以預防或治療在有需要的個體中的肝毒性。
於一些具體實施例中，提供本發明之方法以預防或治療脂肪肝，保護肝功能或改善由脂肪肝或其它相關病症引起的肝臟疾病。
如本文所用，「肝臟脂肪含量」乙詞係指在個體的肝臟中積累之脂肪的含量，並且包括廣義的脂質，例如三酸甘油酯(triglyceride，TG)和膽固醇。如本文所用，「降低肝臟脂肪含量」乙詞通常指減少個體中異常肝臟脂肪含量，即降低異常肝臟脂肪含量，更具體而言，降低異常肝臟脂肪含量至正常程度。例如，在正常情況下，脂肪佔肝臟重量的3%。若肝臟中的脂肪超過肝臟重量的5%，則判斷為異常脂肪蓄積(上述肝臟脂肪含量是示例的相對百分比，並且可能由於種族和其他因素而有變化)。於一特定方面，本文所用之「降低肝臟脂肪含量」乙詞可表示個體中異常肝臟脂肪的含量，例如從肝臟重量的5%或更高降低至肝臟重量的3%。可以通過標準分析方法評估肝脂肪含量，包括但不限於超音波分析、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、核磁共振光譜法(magnetic resonance spectroscopy，MRS)、電腦斷層掃描(computed tomography， CT)和肝臟活體組織切片檢驗。
如本文所用，「肝功能」乙詞係指由肝臟執行的一個或多個生理功能。肝功能可以通過許多常規測定方法，如丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase，ALT)分析或天冬胺酸轉胺酶(aspartate transaminase，AST)分析來進行分析。根據本發明，本文所述之化合物可用於維持肝功能，包括改善肝功能和防止肝損傷。
如本文所用，「肝臟疾病」乙詞係指肝細胞損傷或由某些因素引起之損傷，然後潛在地導致肝功能障礙。根據本發明，於一些具體實施例中，本文提出之化合物可用於改善由脂肪肝所引起的肝臟疾病。更具體而言，本文所用之「肝損傷」係指與正常肝臟相比，具有組織學或生化功能障礙的肝臟。於一特定具體實施例中，「肝損傷」係指由酒精或非酒精因素，例如高脂肪飲食或肥胖，或治療藥物或有機溶劑引起之肝臟損傷。在一特定具體實施例中，「肝損傷」可為具有選自脂肪變性、小葉炎症、肝細胞氣脹和肝細胞產生的囊泡脂肪滴之一種或多種特徵的肝組織損傷。於一特定具體實施例中，「肝損傷」可為肝臟的生化功能障礙，其可由丙胺酸轉胺酶(ALT)或天冬胺酸轉胺酶(AST)的活性來確定。較高活性的ALT或AST表示肝臟的生化功能具有嚴重的功能障礙。
如本文所用，「肝抗氧化活性」乙詞係指針對氧化壓力的活性或能力。通過根據本發明之化合物改善個體的肝抗氧化活性是指包括，但不限於，降低氧化壓力或增強抗氧化系統成員之酵素活性或含量。抗氧化系統成員可為穀胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)、穀胱甘肽(glutathione， GSH)、穀胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GRd)及/或超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)。
根據本發明，本文所述之化合物包括常見的賦形劑和生物類黃酮，其可用於減少肝脂肪含量和改善相關病症。本文所述之「相關病症」乙詞包括由肝臟脂肪異常積累引起的病症，包括，但不限於，脂肪肝疾病、急性和慢性酒精性脂肪肝疾病、急性和慢性非酒精性脂肪肝疾病、急性和慢性酒精性肝炎、急性和慢性非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝硬化和酒精性肝硬化(ICD-9-CM診斷碼：571.8、571.0、571.1、571.2、571.3、571.4、571.5、571.9)。
如本文所用，「預防」乙詞係指針對疾病或疾病的症狀或狀況的預防措施。預防措施包括，但不限於，對尚未診斷為患有該疾病或該疾病之症狀或狀況但可能易感染或傾向於感染該疾病之個體，施用或投予一種或多種活性劑。預防措施的目的在於避免、預防或推遲疾病或疾病的症狀或病症之發生。
如本文所用，「治療」乙詞係指對疾病或疾病的症狀或狀況的治療措施。治療措施包括，但不限於，對患有疾病或疾病的症狀或病症或疾病惡化之個體施用或投予一種或多種活性劑。治療措施之目的在於治療、治愈、減輕、緩解、改變、補救、改進、改善或影響該疾病、疾病的症狀或病症、由疾病引起的殘疾或疾病的加重。
如本文所用，「CYP2E1抑製劑」為可以抑制CYP2E1活性的任何化合物、物質或材料。許多測定可用於分析CYP2E1活性，例如人或大鼠肝臟微粒體之分析。
如本文所用，根據本發明之有治療需要的個體包括人類和非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括，但不限於，伴侶動物例如貓、狗及其類似物，以及農場動物例如牛、馬、綿羊、山羊、豬及其類似物。
「有效量」乙詞或類似用語係指足以在個體中實現期望的治療、預防及/或生物效應的活性劑的量，例如減少藥物誘導的副作用，或者禁止、改善、減輕、減少或預防疾病的一種或多種疾病之症狀或病症或進展。實際有效量可以根據各種原因如施用途徑和頻率、接受該藥物的個體的體重和物種，以及施用目的而改變。本領域技術人員可以基於本文的公開內容，確定的方法，以及他們自己的經驗來確定每種情況下的劑量。
如本文所用之「標準劑量」乙詞係指治療劑的有效劑量，其由醫藥社群，包括食品及藥物管理局，中的權威來源推薦並常用於常規實踐中。如本文所用之「減少的劑量」乙詞係指低於標準劑量但仍保持與相同治療劑基本相同的治療效果的劑量。具體而言，根據本發明，治療藥物的減少劑量為治療藥物的標準治療劑量的約90%或更少、80%或更少、70%或更少、60%或更少、50%或更少。
於一些具體實施例中，本文所用之有效量的活性成分可以與醫藥上可接受的載體一起配製為用於遞送和吸收的適當形式的醫藥組合物。
如本文所用，「醫藥上可接受的」係指載體與組合物中的活性成分相容，並且較佳地可穩定該活性成分，並對於接受治療的個體是安全的。該載體可為活性成分的稀釋劑、載體、賦形劑或基質。組合物可另外包含潤滑劑、潤濕劑、乳化劑和懸浮劑、防腐劑、甜味劑，和調味劑。本發明之組合物可在投予患者後提供活性成分的快速、持續或延遲釋放的效果。
根據本發明，該組合物的形式可為片劑、丸劑、粉劑、錠劑、包裝、錠劑、酏劑、懸浮液、洗劑、溶液、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、滅菌注射液，和包裝粉末。
本發明之組合物可以通過任何生理學上可接受的途徑，例如口服、腸胃外(例如肌肉內、靜脈內、皮下和腹膜內)、經皮輸送、栓劑和鼻內途徑遞送。關於胃腸外給藥，較佳為以無菌水溶液的形式使用，其可以包含其它物質，例如足以使溶液與血液等滲透壓的鹽類或葡萄糖。可使用本領域技術人員熟知的標準藥理學技術完成在無菌條件下製備適當的腸胃外組合物，並且不需要額外的創造性勞力。
在某些具體實施例中，本發明之式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽類可用於預防或治療器官中的損傷，例如，在肝臟或腎臟中，其可由過量的治療藥物(例如對乙醯胺基酚)或暴露於醇類、化學劑、生物分子或可在這些器官中引起毒性作用的任何物質所引起。
特定而言，肝臟中的損傷可以包括肝細胞或組織的損傷、損害或喪失，導致肝功能異常或肝臟蛋白質含量的異常。於一些具體實施例中，如本文所述之肝損傷為急性肝損傷，其係指相對快速發作的肝損傷，例如，從症狀發作起少於12週，具體而言是少於6週的期間。於一些具體實施例中，患有急性肝損傷的患者沒有得過慢性肝病。
特定而言，腎臟中的損傷可以包括腎細胞或組織的損傷、損害或喪失，導致腎功能異常。這樣的腎損傷可以例如通過腎小球濾過率的降低、尿量輸出的減少、血清肌酐的增加、血清半胱胺酸蛋白酶抑製劑C的增加等來確定。於一些具體實施例中，本文所述之腎損傷係急性腎損傷，其可表示腎臟過濾功能的突然或快速下降，例如在14天內，較佳在7天內，更佳在72小時內，還更佳的在48小時內。
在一個具體實施例中，本發明的式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽類能夠預防或治療由NAPQI (N-乙醯基-對-苯醌亞胺，N-acetyl-p-benzoquinone imine)引起之不希望得到的病症。
因此，本發明提供了本發明之式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽類在製備用於預防或治療在一個體中由NAPQI (N-乙醯基-對-苯醌亞胺)引起之不希望得到的病症的藥物之用途。本發明還提供了在有需要的個體中預防或治療由NAPQI (N-乙醯基-對-苯醌亞胺)引起之不希望得到的病症之方法，包含施予個體本發明之式(I)的化合物或其醫藥上可接受之鹽類，其量有效預防或治療該不希望得到的病症。
III. 本發明之化合物與其它活性劑的組合使用
本發明之化合物及/或其代謝物可以與一種或多種額外的活性劑組合施用，該活性劑具體而言是作為P450抑製劑及/或提供抗肝毒性活性的活性劑及/或具有抗脂肪肝活性的活性劑，從而例如提供協同效應。
作為P450抑製劑(命名為「第一活性劑」)的一些活性劑被描述於PCT/CN2013/087049 (USSN 14/441,317，其內容通過引用方式整體併入本文)中。這種P450抑製劑的具體實例包括，但不限於，聚乙二醇脫水山梨糖醇單月桂酸酯(Tween 20)、微晶纖維素、磷酸二鈣二水合物、Brij 35、糖精、甘露醇、Cremophor RH40、三氯蔗糖、交聯聚維酮、澱粉羥乙酸鈉、Eudragit S100、交聯羧甲基纖維素鈉、Pluronic F68、薄荷醇、低取代羥丙基纖維素、預膠化澱粉、Dextrates NF水合物、檸檬酸、Cremophor EL、Aerosil 200、Myrj 52、山梨酸、檸檬油、羥丙基纖維素、山梨醇、乙醯磺胺酸鉀、羥丙基甲基纖維素、乳糖單水合物、麥芽糖糊精、Brij 58、Brij 76、Tween 80、Tween 40、PEG 400、PEG 4000、PEG 8000、Span 60、苯甲酸鈉、羥乙基甲基纖維素、甲基纖維素、Span 80、環己烷胺基磺酸鈉、山嵛酸甘油酯、氧化紅、甘油單硬脂酸酯、共聚維酮K28、乙酸澱粉、硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉、聚維酮K30、PEG2000，以及N-乙醯半胱胺酸(NAC)及其任何組合。
在某些具體實施例中，與本發明之式(I)的化合物組合使用的一種或多種第一活性劑係選自於下列所組成之群組：脫水磷酸二鈣、薄荷醇、甘露醇、三氯蔗糖、N-乙醯半胱胺酸(NAC)及其任何組合。
在PCT/CN2016/078039中描述了一些具有抗脂肪肝活性的活性劑(命名為「第二活性劑」)，該PCT申請案的內容係通過引用方式整體併入本文。具有抗脂肪肝活性的活性劑的具體實例包括，但不限於，(ii) 選自以下所組成群組的第二活性劑：十二烷基硫酸鈉、薄荷醇、三氯蔗糖、甘露醇、山梨醇、糖精、甘油、苯甲酸鈉、氧化紅、預膠化澱粉、環己烷胺基磺酸鈉、山梨酸、檸檬油、檸檬酸、丁基化羥基茴香醚、枸杞子、異牡荊素、聖草酚、麥角固醇、β-月桂烯、高膽固醇、(+)-兒茶素、高良薑精、桑色素、金松雙黄酮、香蜂草苷、棉纖維素、木犀草素-7-葡萄糖苷、(+)-紫杉葉素、反式肉桂酸、月見草內含物(Diosmin)、蒙花苷、木糖醇、木犀草素、獐牙菜苦苷、葛根素、根皮苷、甜橙黃酮、(-)-表沒食子兒茶素、山奈酚、熊果酸、水飛薊素、(+)-苧烯、橙皮苷、(-)-表兒茶素-3-沒食子酸酯、水飛薊賓、芒柄花素、肉荳蔻酸乙酯、二十碳五烯酸(EPA)、漢黃芩素、聚維酮K-30、原兒茶酸、繖形酮、橙皮素、去甲二氫癒創木酸、新橙皮苷、柚皮苷、(-)-表兒茶素、甘草甜素、黃芩苷、槲皮苷、黃芩素，以及其任何組合。
在某些具體實施例中，與本發明之式(I)的化合物組合使用的一種或多種第二活性劑係選自於下列所組成之群組：十二烷基硫酸鈉、薄荷醇、三氯蔗糖、甘露醇、山梨醇、糖精、甘油、苯甲酸鈉、氧化紅、預膠化澱粉、環己烷胺基磺酸鈉、山梨酸、檸檬油、檸檬酸、丁基化羥基茴香醚、枸杞子、異牡荊素、聖草酚、麥角固醇、β-月桂烯、高膽固醇、(+)-兒茶素、高良薑精、桑色素、金松雙黄酮、香蜂草苷、棉纖維素、木犀草素-7-葡萄糖苷、(+)-紫杉葉素、反式肉桂酸、月見草內含物(Diosmin)、蒙花苷、木糖醇、木犀草素、獐牙菜苦苷，以及其任何組合。
在某些具體實施例中，與本發明之式(I)的化合物組合使用的一種或多種第二活性劑係選自於下列所組成之群組：葛根素、根皮苷、甜橙黃酮、(-)-表沒食子兒茶素、山奈酚、熊果酸、水飛薊素、(+)-苧烯、橙皮苷、(-)-表兒茶素-3-沒食子酸酯、水飛薊賓、芒柄花素、肉荳蔻酸乙酯、二十碳五烯酸(EPA)、漢黃芩素、聚維酮K-30、原兒茶酸、繖形酮、橙皮素、去甲二氫癒創木酸、新橙皮苷、柚皮苷、(-)-表兒茶素、甘草甜素、黃芩苷、槲皮苷、黃芩素，以及其任何組合。
在某些具體實施例中，與本發明之式(I)的化合物組合使用的一種或多種第二活性劑係選自於下列所組成之群組：聖草酚、甘露醇、薄荷醇、三氯蔗糖、糖精，以及其任何組合。
在某些具體實施例中，與本發明之式(I)的化合物組合使用的一種或多種第二活性劑係選自於下列所組成之群組：(1) 糖精和甘露醇的組合、(2) 薄荷醇和甘露醇的組合、(3) 三氯蔗糖和甘露醇的組合、(4) 聖草酚和甘露糖醇的組合、(5) 聖草酚和三氯蔗糖的組合、(6) 薄荷醇、甘露醇和羥基硬脂醇的組合，以及(7) 三氯蔗糖、甘露醇和羥基乙醇的組合。
特定而言，式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽類和一種或多種額外的試劑可以同時或依序施用。
在本發明中，還提供本發明之式(I)的化合物或其醫藥上可接受之鹽類能夠預防或治療由NAPQI (N-乙醯基-對-苯醌亞胺)所引起的不希望得到的病症。
作為具體實施例，本發明提供式(I)化合物及/或其代謝物與N-乙醯半胱胺酸(NAC)的組合。本發明還提供了用於在需要的個體中施用N-乙醯半胱胺酸(NAC)的方法，包含對該個體投予NAC與式(I)的化合物及/或其代謝物的組合。在一個具體實施例中，本發明之組合或方法在預防或治療NAC有效的疾病或病症中是有效的。於一些具體實施例中，由NAC治療或預防的疾病或病症係選自於下列所組成之群組：肌陣攣性癲癇、急性呼吸窘迫綜合徵、重金屬中毒、流感病毒感染、心臟病、口腔乾燥風濕性關節炎症候群、慢性支氣管炎、癲癇(Unverricht- Lundborg型)和HIV感染。
通過以下實施例進一步說明本發明，該實施例是為了說明而不是限制之目的而提供的。
實施例
實施例 1 ：本發明之式 1 的化合物 ( 化合物 F) 之合成
((2R,3R,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5- 雙 ( 氯甲基 )-3,4- 二羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 )-3- 氯 -4,5- 二羥基四氫 -2H- 吡喃 -2- 基 ) 甲基 ((2R,3R,4R)-2,3,4,5,6- 五羥基己基 ) 己二酸酯 ( 式 1)( 化合物 F) 的合成
用於式1(化合物F)之合成的合成策略示於方案1中。
方案1HMDS =六甲基二矽氮烷 TMSOTf =三氟甲磺酸三甲基甲矽烷 TBAF =氟化四丁銨 THF =四氫呋喃 TMS =三甲基甲矽烷基 DCC =二環己基碳二亞胺 DMAP = 4-二甲基胺基吡啶 DCM =二氯甲烷 DMF = N,N’-二甲基甲醯胺 DIBAL =二異丁基鋁 Bn =芐基醚
一般方法
除非另有說明，所有化學品均來自商業來源並直接使用。
在以下之條件下評價產物的色層分析純度： 流動相組成A：甲醇:H2 O = 5/95 (v/v)，含有0.05%NH4 OH B：甲醇:H2 O = 95/5 (v/v)，含有0.05%NH4 OH 色層分析系統： 管柱類型 Waters® Acquity UPLC HSST3 , 1.8 μm, 100 × 2.1mm 自動進樣器溫度 4°C 管柱箱溫度 45°C 流速 0.35 mL/分鐘 分析時間 10分鐘 注射體積 5 μL 保留時間 4.8分鐘
MS分析在以下條件下進行： 質譜儀設置： 質譜儀 三重四極桿質譜(API Qtrap5500) 應用生物系統公司 檢測 MRM陰性模式 前藥： m/z 688.9 → m/z 180.9
使用Bruker標準脈衝程序，在MeOH-d4 (δH 3.30, δC 49.0)或CDCl3 (δH 7.24, δC 77.0)中的Bruker AMX-500 NMR光譜；在HMQC和HMBC實驗中，Δ= 1 s 且J 分別為140, 8Hz，相關圖分別由每個光譜的512 × 1K個數據點組成，每個光譜由16到64個瞬間組成。
1.1 甘露醇 ( 化合物 (i)) 至化合物 (B)
1.1.1 甘露醇 ( 化合物 (i)) 至化合物 (i)-1 甘露醇，化合物(i) 化合物(i)-1
於室溫、一大氣壓下，在D-甘露醇(25g，0.137 mol)的DMF(250mL)溶液中加入苯甲醛(30mL，0.345 mmol)。在0°C下向混合物中滴加濃硫酸(10mL)。在逐漸升溫至室溫後，將混合物攪拌3天。然後在劇烈攪拌下將混合物倒入冰水(250mL)和正己烷(200mL)中。將混合物溫熱至室溫後，過濾沉澱物並用正己烷洗滌。將沉澱物懸浮在氯仿中並在劇烈攪拌下加熱回流15分鐘。當混合物達到室溫時，收集未溶解的沉澱物並從乙醇中重結晶，得到所需產物，為白色固體(9.86g，20%)。Rf = 0.45 (EA/Hex = 1/1)。
1.1.2 化合物 (i)-1 至化合物 (i)-2 化合物(i)-1 化合物(i)-2
於室溫、一大氣壓下，在1,3,4,6-二亞芐基(10g，27.9 mmol)的DMF(100mL)溶液中加入芐基溴(7.96mL，66.96 mmol)。將混合物冷卻至0°C，然後在幾分鐘內加入60% NaH (2.68g，66.96mmol)。在使其逐漸升溫至室溫後，將混合物攪拌整夜。然後將反應以水淬滅(滴加)，以NaHCO3 ( 水溶液 ) 和二氯甲烷萃取。將有機層以MgSO4 乾燥，真空濃縮。將殘餘物通過矽膠管柱色層分析純化，得到所需產物 。(10.39g，69%)。R f = 0.2 (EA/Hex = 1/6)。
1.1.3 化合物 (i)-2 至化合物 (B) 化合物(i)-2 化合物(B)
將2,5-二芐基-1,3,4,6-二亞芐基 (1.5g，2.78mmol)在甲苯(12.5 mL)中的溶液冷卻至-18°C (冰鹽浴)。滴加1.2M DIBAL (18.5 mL，22.3 mmol)，升溫至室溫。1.5小時後，將反應冷卻至0°C，然後通過MeOH和15% KOH( 水溶液 ) 淬滅。將混合物以DCM萃取，將有機層以MgSO4 乾燥並真空濃縮。將殘餘物通過矽膠管柱色層分析純化，得到所需產物。(709 mg，47%)。R f = 0.1(EA/HEX = 1/5)。
1.2 三氯蔗糖 ( 化合物 (ii)) 至化合物 (D)
1.2.1 化合物 (ii) 至化合物 (ii)-1 三氯蔗糖，化合物(ii) 化合物(ii)-1
對三氯蔗糖(1g，2.5 mmol)在DCM(10mL)中的溶液中加入HMDS (2.6mL，12.57 mmol)和TMSOTf (45μL，0.25 mmol)。將反應物在室溫下攪拌整夜。將反應物在真空中濃縮並通過棉花，以己烷洗滌。將濾液再次真空濃縮，得到產物，定量。(1.9 g，定量)。R f = 0.9(EA/HEX = 1/8)。
1.2.2 化合物 (ii)-1 至化合物 (D) 化合物(ii)-1 化合物(D)
對五-TMS三氯蔗糖 (5g，6.6 mmol)在吡啶(150 mL)中的溶液中加入0.1 M 吡啶-TcCl溶液 (6.6 mL)，並於開口燒瓶中攪拌3天。將反應溶液以真空濃縮，通過矽膠管柱色層分析純化，得到所需產物 。(1.4g，30%)。R f = 0.5 (EA/HEX = 1/8)。
1.3 6- 氧代 -6-((2R,3R,4R)-2,3,4- 參 ( 芐氧基 )-4-(2- 苯基 -1,3- 二氧戊環 -4- 基 ) 丁氧基 ) 己酸 ( 化合物 (C)) 的合成 在0°C下，在火焰乾燥的R.B.燒瓶中，將化合物A (165 mg，1當量)溶於DCM (5 mL)中，然後向其中加入吡啶(0.2 mL)和DMAP(50 mg)。然後將反應混合物攪拌10分鐘，加入化合物B (59 mg，1.5當量)。然後將反應混合物在室溫下攪拌5小時。TLC證實反應完成。將反應混合物在減壓下在旋轉蒸發儀上蒸發至乾燥。將粗化合物通過管柱色層分析進一步純化，得到所需化合物，為無色油狀物(136 mg，67%)。
1.4 ((2R,3S,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5-雙(氯甲基)-3,4-雙((三甲基甲矽烷基)氧基)四氫呋喃-2-基)氧基)-3-氯-4,5-雙((三甲基甲矽烷基)氧基)四氫-2H-吡喃-2-基)甲基((2R,3R,4R)-2,3,4-參(芐氧基)-4-(2-苯基-1,3-二氧戊環-4-基)丁基)己二酸酯的合成
對化合物C (100 mg，1.0當量)在DCM中的冰冷溶液中加入DCC (35 mg，1.15當量)並攪拌10分鐘。然後向該化合物D (112 mg，1.2當量)中加入DMAP (5mg，0.25當量，催化的)。將反應混合物溫熱至室溫並攪拌4小時。TLC證實反應完成。將反應混合物在減壓下在旋轉蒸發儀上蒸發至乾燥。然後通過使用中性矽膠和5至15%乙酸乙酯的己烷溶液，以1%三乙胺作為洗脫劑的管柱色層分析法純化粗化合物，得到呈無色油狀的所需化合物E (84mg，42%)。
1.5 ((2R,3R,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5- 雙 ( 氯甲基 )-3,4- 二羥基四氫呋喃 -2- 基 ) 氧基 )-3- 氯 -4,5- 二羥基四氫 -2H- 吡喃 -2- 基 ) 甲基 ((2R,3R,4R)-2,3,4,5,6- 五羥基己基 ) 己二酸酯 ( 化合物 F) 的合成
在火焰乾燥的單頸R.B.燒瓶中，將化合物E (500 mg，1當量)溶解於無水MeOH (20 mL)中，然後將溶液通過氮氣脫氣(氮氣注射器在溶液內部深處，氮氣吹掃15分鐘)。然後小心地向反應混合物中加入10% Pd-C (200 mg，33% w/w)。最後，將反應混合物在氫氣球壓力下攪拌6小時。TLC證實反應完成。然後將反應混合物通過矽藻土床過濾，並以無水甲醇洗滌該矽藻土床。將濾液在減壓下在旋轉蒸發儀上蒸發至乾燥。然後將最終化合物保持在高真空下，得到所需的最終化合物F ，為無色半固體或白色固體(190 mg，73%)。通過高分辨率質譜分光光度法和13 C NMR鑑定化合物F的結構。
實施例 2 ：作為前藥的化合物 F ，當與血液 ( 體外 ) 溫育時產生代謝物
2.1 材料和方法
將新鮮的人類全血用於藥物水解作用之研究。將藥物(10 mg，化合物F)溶於1 mL溶液(20%甲醇)中。在含有1.0 mg藥物的20 mL新鮮全血等分試樣在50mL燒瓶中，在37°C下在搖動水浴中恆溫進行藥物水解(n = 3)。在時間為0時，加入藥物，並在不同時間的溫育後，在0.25、0.5、0.33、0.75、1、2、4、6、12和24小時收集血液樣品。血液樣品使用1 mL乙腈以淬滅藥物的酶水解作用，因而獲得樣品。通過裝備有離子噴霧(ion-spray，ESI)源的API QTrap5500三重四極桿質譜儀測定血液中的前藥及其相關代謝物，例如C6-甘露醇、甘露醇和三氯蔗糖。ESI介面用於負離子模式。
2.2 結果
在m/z 688.9→180.9的轉變處監測前藥。在m/z 395→359的轉變處監測三氯半乳蔗糖；在m/z 452.3→273.3的轉變處監測甘露醇；在m/z 309→101.1的轉變處監測C6-甘露醇。所有化合物通過高解析度質譜分光光度計和13 C NMR鑑定。C6-甘露醇(式(2))的結構如下：(2)
以前藥在血液中溫育後剩餘之前藥的百分比，以及三氯蔗糖、甘露醇和C6-甘露醇增加之百分比相對於時間來繪圖，以表示血液中前藥的水解作用(圖1)。結果顯示，以化合物F作為前藥，在體外與血液溫育後變成其代謝物，包括三氯蔗糖、甘露醇和C6-甘露醇。
實施例 3 ： SD (Sprague Dawley)- 大鼠 ( 體內 ) 的藥物動力學研究
3.1 材料和方法
以3.67 mg/kg體重的劑量口服給予SD-大鼠前藥。將血液樣品以0、0.5、1、2、4、6、8、12和24小時的間隔收集到肝素化微量離心管中。通過以8,000 rpm離心血液樣品10分鍾後立即得到血漿樣品。然後將血漿樣品儲存在-80°C備用。通過配備有離子噴霧(ESI)來源的API QTrap5500三重四極桿質譜儀以分析血漿樣品中的前藥及其相關代謝物，如甘露醇和三氯蔗糖。ESI介面用於負離子模式。
3.2 結果
在m/z 688.9→180.9的轉變處監測前藥。在m/z 395→359的轉變處監測三氯半乳蔗糖；在m/z 452.3→273.3的轉變處監測甘露醇；在m/z 309→101.1的轉變處監測C6-甘露醇。
圖2及圖3分別顯示在口服給予3.67 mg/kg單一劑量前藥的SD大鼠中，前藥和其相關代謝物，例如三氯蔗糖和甘露醇，的血漿濃度時間曲線。結果顯示，化合物F作為前藥，給藥後在動物體內轉化成其代謝物，包括三氯蔗糖、甘露醇和C6-甘露醇。
實施例 4 ： CYP2E1 抑制活性分析
4.1 材料和方法
本實施例係從人類肝臟中製備微粒體，以用於體外篩選CYP450同工酶抑製劑。基於從不同來源的肝臟製備的微粒體CYP450同工酶與其特異性基質氯唑沙宗(Chlorzoxazone，CZX)的反應，以測試有效的人類肝臟CYP450同工酶抑製劑，並測試CYP450同工酶抑製劑的原理。在添加測試樣品後，通過使用對照組的6-OH-CZX的量作為基線，將CYP450同工酶代謝物標準品6-OH-CZX (6-羥基-氯唑酮)的量特定用於計算測試樣品的CYP450同工酶(CYP2E1)抑制率。
所有樣品的測試皆進行三重複。為了測定抑制百分比，將每種試驗化合物溶解至1、2、4 μg/mL三種不同濃度。將在試驗化合物存在下的CYP2E1活性量與對照組的溫育物進行比較。將含有0.5 mg微粒體蛋白質的500-μL反應混合物與320 μM CZX，在含有5 mM MgCl2 和1 mM NADPH且pH 7.4的50 mM磷酸鹽緩衝液中，於37°C下溫育30分鐘。以冰冷的乙腈終止反應，然後加入4-羥基甲苯磺醯胺作為內部標準品。在液相色層分析-串聯質譜儀(LC-MS/MS)分析之前，將有機相蒸發至乾燥並重構到流動相(甲醇：水= 1:1)中。使用裝備有離子噴霧(ESI)源的API 3000三重四極桿質譜儀來測定人類肝臟微粒體中的6-OH-CZX。ESI介面係用於正離子模式。在m/z 284.5→185.9的轉變處監測6-OH-CZX。
結果分析：使用對照組作為基線，將從LC/MS/MS獲得的檢測信號值轉換為CYP450同工酶代謝物標準品6-羥基-氯唑烷酮的量(pmol)，即對照組的CYP450同工酶抑制率為0%。在試驗化合物存在下，比較CYP450同功酶活性量與對照組溫育物。
4.2 結果
二乙基二硫代胺基甲酸(Diethyldithiocarbamic acid，DDTC)是已知的CYP2E1抑製劑。在100 μM的濃度下，處理DDTC導致人類肝臟微粒體中CYP2E1的90.9%抑制率(使用CZX作為CYP2E1的基質來測量)。基於觀察到的DDTC的抑制活性，我們測試了在濃度為4、2和1 μg/mL時CYP2E1抑制的新化合物(前藥)及其相關代謝物。結果總結在表1中。表 1. 從人類肝臟微粒體的體外篩選而來之 CYP2E1 抑製劑的抑制率
在人類肝臟微粒體中檢測的試驗化合物的CYP 2E1抑制率如表1所示。從該結果得知，試驗化合物，包括前藥(化合物F)及其代謝物，即甘露醇、三氯半乳蔗糖與具有保護基的C6-甘露糖醇(式C)已經證實作為P450 2E1抑製劑是有效的，其中4 μg/mL前藥的中間代謝物(即具有保護基的C6-甘露醇，式C)顯示出最好的抑制效果(70.3 ± 2.8%)。
實施例 5 ：分析以對乙醯胺基酚 (APAP) 和 CCl4 誘導的肝損傷
5.1 材料和方法
5.1.1 試劑
所有有機溶劑均為HPLC等級，購自Tedia公司(Fairfield，俄亥俄州，美國)。APAP購自Sigma公司(St.Louis，密蘇里州，美國)，半乳糖可注射溶液由Southern Photochemical Co.公司製造，係通過將400 g的半乳糖(Sigma公司)溶解於1 L含有注射用的等張鹽類的緩衝溶液中製備。
5.1.2 動物
體重為175-280 g的雄性SD (Sprague-Dawley)大鼠係購自台灣國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center，NLAC)。該研究係根據國家衛生研究院的進行動物研究指南所進行，且所有的大鼠被放置在空氣/濕度控制的環境中，在12小時日間/12小時夜間的循環以及無限制供應水及食物的環境下。在研究過程中，在正常供水下連續監測大鼠的體重。
5.1.3 處理
5.1.3.1 由 APAP 誘導的肝損傷
基於由APAP誘導的肝損傷，使用甘露醇和三氯蔗糖進行動物試驗(大鼠)。
在正常對照組(第1組)中，動物沒有被餵食APAP。在APAP誘導肝損傷的對照組(第2組)中，動物被餵食單劑量的APAP，其施用量為每公斤體重2,000 mg，以誘導肝毒性。在以NAC治療的陽性對照組(第3組)中，動物被餵食單劑量的APAP，其施用量為每公斤體重2000 mg，以誘導肝毒性，4小時後，開始通過試管餵養的24小時治療期，包括首先施用140 mg的NAC (每公斤體重)，隨後每4小時施用70 mg的NAC (每公斤體重)五次。在實驗組(第4組)中，動物被餵食單劑量的APAP，其施用量為每公斤體重2,000 mg，以誘導肝毒性，4小時後，開始通過試管餵養的24小時治療期，包括每4小時投與本發明之成分共6次，各小組如下所示： (a) (第4.1組)：以小於或等於100 mg每人每4小時的劑量施用甘露醇，持續24小時， (b) (第4.2組)：每4小時施用為第4.1組的2倍劑量之甘露醇，持續24小時， (c) (第4.3組)：以小於或等於100 mg每人每4小時的劑量施用三氯蔗糖，持續24小時， (d) (第4.4組)：每4小時施用為第4.3組的2倍劑量之三氯蔗糖，持續24小時， (e) (第4.5組)：每4小時施用為第4.1組的0.5倍劑量之甘露糖醇以及為第4.3組的0.5倍劑量之三氯蔗糖的組合，持續24小時， (f) (第4.6組)：每4小時施用為第4.1組的劑量之甘露糖醇以及為第4.3組的劑量之三氯蔗糖的組合，持續24小時， (g) (第4.7組)：每4小時施用為第4.1組的1.5倍劑量之甘露糖醇以及為第4.3組的1.5倍劑量之三氯蔗糖的組合，持續24小時， (h) (第4.8組)：每4小時施用為第4.1組的2倍劑量之甘露糖醇以及為第4.3組的2倍劑量之三氯蔗糖的組合，持續24小時，以及 (i) (第4.9組)：首先施用140 mg的NAC每公斤體重，隨後施用70 mg的NAC加上為第4.1組的2倍劑量之甘露糖醇以及為第4.3組的2倍劑量之三氯蔗糖的組合，每4小時一次，共五次。
在24小時治療期後，從大鼠的尾動脈收集血液，以用於AST/SLT測定。隨後，對大鼠進行GSP測試。最後，犧牲大鼠並進行組織學分析。
5.1.3.2 由 CCl4 誘導的肝損傷
基於由CCl4 誘導的肝損傷，以選自本文所述之活性成分的甘露醇和三氯蔗糖進行動物試驗(小鼠)。
在正常對照組中，通過腹腔注射給予動物生理鹽水。在CCl4 誘導之肝損傷的對照組中，以腹腔注射給予動物10 ml/kg CCl4 (40%在玉米油中)以誘導肝毒性。在實驗組中，以腹腔注射給予動物10 ml/kg CCl4 (40%在玉米油中)以誘導肝毒性，4小時後，通過試管餵食給予本發明的不同成分。在給予本發明之成分之前或在給予本發明之成分24小時後，自小鼠體內收集血液以進行AST/ALT分析。最後，在第2天犧牲動物，收集血液以進行AST/ALT分析，並進行組織學分析。
另一方面，對其他實驗組的小鼠餵食本發明之成分12週，並對小鼠進行GSP測試。
5.1.4 血液樣品
處理完成後，在乙醚麻醉下犧牲大鼠，從大鼠的尾動脈收集血液，並置於含有EDTA的試管中。將血漿於4°C下以13,000 rpm離心15分鐘，將分離的血漿等分轉移到離心小管中，並儲存於-80°C。
5.1.5 生物化學分析
通過測量血漿AST和ALT活性來定量肝損傷。AST和ALT是肝毒性的常見指標，並使用Synchron LXi 725系統(Beckman Instruments公司，美國)進行測量。
5.1.6 光學顯微鏡
將大鼠犧牲後，進行組織學分析。肝臟樣品以含有10%甲醛之磷酸鹽緩衝溶液進行固定、脫水、包埋在石蠟中，製備5 μm厚度的切片，然後以蘇木精和曙紅染色，並進行高碘酸希夫染色(Periodic acid Schiff stain，PAS)。在光學顯微鏡下觀察染色切片。
5.1.7 肝功能的定量測試
在研究完成後，對所有大鼠進行GSP測試。以靜脈注射在30秒內對大鼠注射0.4 g/ml體重的半乳糖溶液0.5 g/kg，並於注射後5、10、15、30、45和60分鐘時，從大鼠的尾動脈各收集一份血液樣品。比色半乳糖脫氫酶用於定量半乳糖的濃度，且該試驗濃度範圍為50至1,000 μg/ml。使用標準偏差和變異係數(CV)計算每個濃度的日內變化，且最大允許變異係數為10% CV，並且通過比較校準曲線的斜率和截距來檢查每日之間的變化。GSP為停止該30秒注射後在60秒時獲得的血液半乳糖濃度。
5.1.8 統計分析
所有數據以平均值±標準偏差(standard deviation，SD)表示，並且使用ANOVA計算結果以確定顯著性。以社會科學統計套裝軟體(版本13，SPSS Inc.公司)進行計算，接著以事後測試來檢查多重比較的最小顯著差異，以便確認各組之間的顯著差異，而且當p ＜0.05時，各組之間的平均差異是顯著的。
5.2 結果
5.2.1 甘露醇和三氯蔗糖和其它成分能有效治療由 APAP 誘導的肝損傷
結果如表2所示。
表2 * p ＜0.05，** p ＜0.01，*** p ＜0.005：各實驗組與APAP對照組的比較
結果顯示，APAP肝毒性組發生肝損傷。相較之下，這種肝損傷和存活率可以通過使用甘露醇及/或三氯蔗糖，以劑量依賴的方式提高。特別是，甘露醇和三氯蔗糖的組合實現協同效應；結果與正常對照組相似，甚至優於以NAC標準治療的陽性對照組。此外，包括Aerosil 200、羥基乙酸澱粉鈉、交聚維酮、微晶纖維素和聚維酮K-30的其它成分也被發現對治療肝損傷有效，也比使用NAC標準治療的陽性對照組更好。
改善的結果也反映在相應的肝組織中。
圖4所示為組織學分析的結果。來自APAP肝毒性組的大鼠的肝組織切片顯示，圍繞中心靜脈的肝細胞被破壞，帶有可見的空泡化現象以及細胞核數目的減少，一些肝細胞甚至顯示出壞死的跡象，而且與來自正常對照組大鼠的肝細胞(圖4B)相比，肝損傷更為嚴重。相反地，對照組大鼠的肝臟結構正常，肝細胞完整，按順序排列，沒有空泡化現象(圖4A)。而以甘露醇及/或三氯蔗糖處理的實驗組的肝切片，肝細胞相對完整，具有可見的核及較少的空泡化現象(圖4D、E、F、G、H)。尤其是，甘露醇和三氯蔗糖的組合實現最佳保護效果(圖4G)；其結果甚至優於以NAC標準治療的陽性對照組(圖4C)。
5.2.2 甘露醇可有效治療由 CCl4 誘導的肝損傷
結果如表3所示。
表3
結果顯示，CCl4 對照組發生肝損傷。相反的，這種肝損傷可以通過使用甘露醇來改善。
實施例 6 ：脂肪肝的測定
6.1 材料和方法
6.1.1 細胞株和細胞培養基
通過使用人類肝癌細胞株Hep G2分析本文所述之各種成分(包括甘露醇和三氯蔗糖以及其它成份)對於減少脂肪含量的活性。
使用Dulbecco改良的Eagle培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)製備表4中列出的用於進行後續實驗的DMEM培養基編號A-F。
表4：DMEM培養基編號A-F的製備
將DMEM培養基編號A-F置於2-8°C下保存，並在實驗前於37°C水浴中溫熱。
6.1.2 細胞計數和存活性試驗
死細胞會吸收0.4%台盼藍並顯色；而活細胞由於其細胞膜完整而排除某些染料並且呈現透明。將100 μl細胞懸浮液和等體積的0.4%台盼藍均勻混合以形成混合物。將一些混合物(約20 μl)加到血球細胞計數器上的凹槽中，然後覆蓋蓋玻片以在光學顯微鏡下觀察。活細胞沒有被染色，死細胞呈現藍色。
6.1.3 自 HepG2 細胞株的細胞以油酸誘導形成脂肪肝細胞
將HepG2細胞株(15×106 個細胞)在DMEM培養基編號B中培養，在37°C、含5% CO2 的培養箱中孵育24小時後，於DMEM培養基編號C (無血清培養基)中培養24小時，最後在DMEM培養基編號D (含有油酸鹽/白蛋白複合物)中再培養48小時以誘導HepG2細胞株形成脂肪肝細胞。
6.1.4 每組脂肪肝細胞的處理
將HepG2細胞株分為六組，包括：(1)空白組：無處理；(2) DMSO組：來自空白組的細胞以二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理；(3)對照組：以油酸誘導形成脂肪肝細胞；(4)載體組：以油酸誘導形成的脂肪肝細胞再以DMSO處理；(5)陽性對照組：以水飛薊素處理脂肪肝細胞；和(6)測試組：以本發明之各種化合物處理脂肪肝細胞。
6.1.5 細胞中三酸甘油酯 (TG) 的測定
孵育72小時後，將來自每組處理過後的細胞在PBS中連續洗滌二次，然後與0.5 ml胰蛋白酶/EDTA溫育3分鐘。之後以2 ml PBS刮擦細胞，然後轉移到離心管中以超音波破碎。取20 μl體積的細胞萃取物以測量蛋白質含量。使用市售的試劑組合(Randox)進行TG測定。將上述獲得的TG含量除以蛋白質含量，得到之比值表示細胞中TG的相對含量。
6.1.6 實驗動物
選擇台灣衛生福利部所公佈之規範「評價保健食品的肝保護和保健功效之方法」中推薦的B6小鼠用於動物試驗。在前測的每一組中使用四隻以上的小鼠，而在確認試驗的每一組中使用十二隻以上的小鼠。在23 ± 2°C、具有55 ± 15%相對濕度的動物房中，於正常光/暗循環(上午7:00至下午7:00亮燈/下午7:00至上午7: 00關燈)的環境下繁殖的雄性小鼠，重量為18-23g，購自BioLASCO公司(台北)，並置於國防醫學中心的實驗動物中心。根據國家衛生研究院的動物實驗指南進行動物試驗。小鼠以3-5 g/天餵食正常飼料，無限量供應飲水1-2週，並研究健康狀況，小鼠的體重每週記錄一次。
6.1.7 動物分組
將測試的動物隨機分組為空白組、高脂肪飲食對照組(High Fat Diet，HFD)、陽性對照組(Positive Control，PS)和試驗組。對空白組的動物餵食正常飼料。對HFD組的動物餵食高脂肪飼料。對PS組的動物餵食高脂肪飼料，另外並以試管餵食水飛薊素(5 mg/kg/天)。對試驗組的動物餵食高脂肪飼料，另外並以試管餵食試驗化合物。
6.1.8 試驗方法
以正常飼料隨意餵食空白組動物12週，而以高脂肪飼料隨意餵食HFD組、PS組和試驗組的動物12週。餵養8週後，以試管對空白組和HFD組的動物每天加入一次去離子水；每天以試管對PS組動物餵食水飛薊素一次；而且每天以試管對試驗組動物餵食試驗化合物一次，持續4或8週的期間。
在測試之前以及在測試後的第八、第十二和第十六週，從臉頰或心臟收集血液。在試驗結束時，對所有的小鼠稱重，然後犧牲小鼠，並同時從臉頰或心臟收集血液。小鼠的血液樣品在室溫下靜置1小時以使其凝結，然後以冷凍離心機中在15,700×g、4°C下離心5分鐘以分離血清。隨後，以自動血液生化分析儀檢測肝功能的生物化學指標，包括天冬胺酸轉胺酶(AST)、丙胺酸轉胺酶(ALT)、三酸甘油酯(TG)、總膽固醇(TCHO/TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。
此外，從犧牲的小鼠腹部取出腹部脂肪和肝臟樣品，並稱重以比較脂肪和肝臟的重量，並獲得肝臟重量與體重的比率。從最大的右肝葉切下體積為約1cm3 的二個組織塊，固定在10%中性甲醛溶液中，然後以石蠟包埋並進行切片。對切割下的切片進行H＆E染色以用於組織病理學觀察。此外，將其餘肝臟冷凍以保存並檢測肝臟中三酸甘油酯和總膽固醇的含量。另外，通過半乳糖單點法分析每組動物的肝功能，該方法被認可並被美國食品藥物管理局(FDA)以及台灣衛生福利部推薦於臨床使用上進行剩餘肝功能的定量。在試驗結束時，以靜脈注射給予每隻動物0.5 g半乳糖(G.S.P.® 0.4 g/mL) /kg動物。給藥1小時後，以濾紙取約0.5 ml全血，分析小鼠的肝功能。GSP值越高，剩餘的肝功能越差。(FDA：「產業指南：受損患者的藥物動力學，肝功能研究設計，數據分析及對劑量和標記的影響，2003年」。)
6.1.9 組織病理學組織切片：
在試驗結束時，犧牲所有小鼠。從最大的右肝葉切下體積約1cm3 的一個組織塊，固定在10%中性甲醛中，然後在各種濃度的乙醇(30、50、70、95、99.5%)及二甲苯中脫水和透明化。然後，以熱石蠟溶液替換二甲苯。最後，以石蠟溶液包埋組織。以切片機將成品石蠟樣品切成5 μm厚的石蠟切片。將切片貼在乾淨的載玻片上，於37°C下乾燥，然後以H&E染色法進行染色。
6.1.10 蘇木精和伊紅染色 (H ＆ E)
將肝組織切片在二甲苯中脫蠟30分鐘，然後在99.5%、95%、70%、50%和30%含水乙醇中分別連續再水合30分鐘。在蒸餾水中浸泡10分鐘後，可對切片進行染色。首先將切片浸入蘇木精中30秒以對細胞核進行染色，然後以蒸餾水洗滌數分鐘後，再以曙紅染色2-5分鐘，再以蒸餾水再次洗滌數分鐘。染色結束後，切片分別在50%、70%、95%和100%乙醇水溶液中脫水兩次，每次30秒，在二甲苯中透明化兩次，最後密封並用封固劑保存。
6.1.11 組織病理學觀察
當存在持續的肝損傷時，為了觀察肝細胞中損傷、脂肪蓄積、壞死或纖維化的變化，對肝臟組織進行H&E染色以評估肝臟脂肪蓄積的程度。所有組織病理切片從肝臟最大右葉上的相同位置切除，以消除主觀觀察中的偏差，然後進行病理染色。針對病理學中的半定量分析評估，必須由醫師或獸醫病理學家確認，其進行雙盲分析以評分(NAS評分)，而且在不知道試驗設計的情況下比較所有的切片。最後，以統計學方法進行每組的差異分析。
6.1.12 肝抗氧化能力的分析
從犧牲的動物中取約0.1 g肝臟組織，並以生物均質機離心10分鐘使其均質化。將9倍重量(w/w)的緩衝液(pH 7.4，50 mmol/L Tris-HCl，180 mmol/L KCl)加入該均質化的組織中，然後以震盪混合器充分混合以備用。使用所得到的肝組織勻質化溶液樣品以分析肝臟抗氧化系統中的各種成員，包括穀胱甘肽過氧化物酶(GPx)、穀胱甘肽(GSH)、穀胱甘肽還原酶(Grd)和超氧化物歧化酶(SOD)。相關分析的方法可以在已知文獻中找到，例如，台灣衛生福利部所公佈的「評價保健食品的肝保護和保健功效之方法」的草案。
6.1.13 統計分析
所有數據以平均值±標準偏差(standard deviation，SD)表示。以社會科學統計套裝軟體，版本13，SPSS Inc.公司，計算單因子變異數分析(one-way ANOVA)以決定試驗結果的統計學顯著性差異。之後，以事後測試中的最小顯著差異方法進行多重比較，以確認各組之間的顯著差異。當p ＜ 0.05時，判斷組間的平均差異為顯著。
6.2 結果
6.2.1 細胞實驗
在細胞實驗中，在陽性對照組(水飛薊)中測量HepG2細胞中TG含量降低的結果如表5所示。
表5：水飛薊素對於在陽性對照組的HepG2脂肪細胞中TG含量降低的功效
以濃度恆定的試驗化合物測量HepG2脂肪細胞中TG含量降低的結果如表6所示。如結果所示，相對於對照組，在濃度恆定的試驗條件下，試驗化合物在由被誘導的HepG2細胞形成的脂肪肝細胞中表現出不同程度的降低TG含量的效果。計算TG的減少率(%)的方程式如下：[1-(試驗組的TG含量 - 空白組的TG含量)/(油酸誘導組的TG含量 - 空白組的TG含量)]×100%。
表6：以試驗化合物減少的脂肪肝細胞中的TG含量
表6-1：來自表6之部分試驗化合物，其可降低脂肪肝細胞中的TG含量
表6-2：來自表6的部分試驗化合物(類黃酮)，其降低脂肪肝細胞中的TG含量
表6-3：來自表6的部分試驗化合物(賦形劑)，其降低脂肪肝細胞中的TG含量
6.2.2 動物實驗
在動物實驗中，除了用正常飼料餵養的空白組動物之外，所有的動物皆經處理以誘導產生脂肪肝。八週後，除了原始飼料之外，給予每組動物不同的治療四週或八週。對空白組和HFD組的動物餵食去離子水；對PS組的動物餵食水飛薊素；並且以不同的試驗化合物，包括葛根素、根皮苷、聖草酚、三氯蔗糖、甘露醇、糖精、橙皮素、薄荷醇及其組合餵食測試組的動物。
6.2.2.1 對動物的體重、肝臟重量和體脂肪重量的影響以及試驗化合物的安全性評估
來自動物實驗的結果，每組動物的肝臟重量、體脂肪重量和體重增加如表7-1和表7-2所列。
表7-1：因試驗化合物所造成之肝臟重量和體脂肪重量的分析結果
表7-2：因試驗化合物所造成之體重增加的分析結果
該結果顯示，以脂肪肝誘導的動物的腹部脂肪重量增加。在各別施用的試驗化合物之中，甘露醇、薄荷醇和三氯蔗糖可顯著降低動物腹部脂肪的重量。
此外，在給予試驗化合物後，在測試組的動物中未觀察到異常狀況。在測試期間沒有動物死亡。在測試後對犧牲動物的屍體進行解剖檢驗，沒有觀察到由試驗化合物引起的疾病或臨床症狀的出現。因此，試驗化合物是安全的。
6.2.2.2 試驗化合物有效降低肝臟中的脂質
圖5所示為被誘導表現出脂肪肝的小鼠，其肝門區附近(包括膽管、門靜脈、肝動脈)的肝細胞覆蓋有許多大囊泡脂肪滴，並出現肝細胞腫脹，表示以誘導方式成功建立了脂肪肝的動物模型。
動物實驗的結果顯示，在施用4週或8週時間後，多種試驗化合物顯現出減少動物肝臟中脂質的效果。結果如表8-1和表8-2所示。
表8-1：試驗化合物可以減少動物的肝脂質(給藥期為4週)
表8-2：試驗化合物可以減少動物的肝脂質(給藥期為8週)
該結果顯示，脂肪肝誘導的小鼠的肝臟中三酸甘油酯(TG)和總膽固醇(TC)升高。在各別施用的試驗化合物中，橙皮苷、葛根素、紫草醇、根皮苷、甘露醇、薄荷醇和三氯蔗糖可顯著降低肝臟中的三酸甘油酯(TG)。特別是，以聖草酚治療4週後，達到肝臟中三酸甘油酯(TG)含量降低約67% (p ＜0.005)的優異效果。此外，橙皮素、聖草酚、根皮苷、甘露醇、薄荷醇、三氯蔗糖和糖精可以顯著減少肝臟中的總膽固醇(TC)。特定而言，在以糖精治療4週後，達到肝臟中的總膽固醇(TC)含量降低約56% (p ＜0.005)的優異效果。
當施用二種試驗化合物的組合時，糖精和甘露醇的組合、薄荷醇和甘露醇的組合、三氯蔗糖和甘露醇的組合、聖草酚和甘露醇的組合，或者聖草酚和三氯半乳蔗糖的組合可以顯著地減少肝臟中的三酸甘油酯(TG)。特別是，以薄荷醇和甘露醇的組合治療4週後，可以達到肝臟中的三酸甘油酯(TG)含量降低約77% (p ＜0.005)的優異效果；且以聖草酚和三氯蔗糖的組合進行處理8週後，可以達到肝臟中的三酸甘油酯(TG)含量降低約78% (p ＜0.005)的優異效果。此外，三氯蔗糖和甘露醇的組合，聖草酚和甘露醇的組合，或者聖草酚和三氯蔗糖的組合可以顯著降低肝臟中的總膽固醇(TC)含量，其中以聖草酚和三氯蔗糖的組合治療8週後可以達到肝臟中的總膽固醇(TC)含量降低約77% (p ＜0.005)的優異效果。
當施用三種試驗化合物的組合時，薄荷醇、甘露醇和聖草酚的組合或是三氯蔗糖、甘露醇和聖草酚的組合可以顯著降低肝臟中的三酸甘油酯(TG)。特別是，以三氯蔗糖、甘露醇和聖草酚的組合治療8週後，可以達到肝臟中的三酸甘油酯(TG)含量降低約79% (p ＜0.005)的優異效果。此外，三氯蔗糖、甘露醇和聖草酚的組合可以顯著減少肝臟中的總膽固醇(TC)。
6.2.2.3 試驗化合物有效減少肝損傷
6.2.2.3.1 減少肝臟組織中肝臟脂肪和肝損傷之效果
動物實驗的結果顯示，多個試驗化合物在4週的試驗期間顯現出減少肝臟脂肪和肝組織損傷的功效。圖5顯示出具有脂肪肝的動物的肝組織損傷。肝組織損傷包括覆蓋肝門區(包括膽管、門靜脈、肝動脈)附近肝細胞和肝細胞腫脹的許多大囊泡脂肪滴。相較之下，以水飛薊素、薄荷醇、聖草酚或甘露醇處理4週後，肝組織切片中肝細胞內的大囊泡脂肪滴顯著減少。以水飛薊素處理的小鼠中仍觀察到一部分小的破碎的脂肪滴，但以薄荷醇、聖草酚或甘露醇處理的小鼠的肝組織類型接近空白組中的動物的肝組織類型，這代表輕度脂肪肝疾病。此外，NAS評分的結果如表9所示。
表9：試驗化合物可以降低動物的肝損傷狀況
NAS (非酒精性脂肪肝活性評分)表示為非酒精性脂肪肝病的活性評分[Hepatology期刊，2005年6月；第41卷第6期：第1313-21頁]，以及綜合評價脂肪變性程度、小葉炎症和肝細胞腫脹。評分表如表10所示。高分表示為嚴重的肝損傷。
該結果顯示，肝組織損傷發生在脂肪肝誘導的小鼠(NAS評分增加)。在各別施用的試驗化合物中，聖草酚和甘露醇可以顯著降低肝損傷。值得注意的是，當施用二種化合物的組合時，薄荷醇和甘露醇的組合達到了優異的效果。幾乎沒有任何肝臟損傷出現。其NAS評分與空白組的一樣。
6.2.2.3.2 減少肝功能障礙之效果
動物實驗的結果顯示，在4週或8週的給藥期間，多種試驗化合物顯現出減輕動物肝臟功能障礙的效果。結果如表11-1和表11-2所示。
表11-1：試驗化合物可以減少動物的肝功能障礙(給藥期為4週)
表11-2：試驗化合物可以降低動物的肝功能障礙(給藥期為8週)
丙胺酸胺基轉移酶(ALT)和天冬胺酸轉胺酶(AST)最常作為酶指示劑以反映出肝臟的生化功能障礙。在正常情況下，這些酶存在於肝細胞中。然而，當肝細胞損傷時，它們會外洩。血清中的ALT和AST值升高通常代表肝臟發炎和肝功能障礙。
該結果顯示，以脂肪肝(ALT和AST值增加)誘導的動物患有肝功能障礙。在各別施用的試驗化合物中，橙皮素、葛根素、聖草酚、根皮苷、甘露醇、薄荷醇、三氯蔗糖和糖精都可以顯著降低ALT和AST值。特別是，以甘露醇處理4週後，可以達到ALT值降低約64% (p ＜0.005)且AST值降低約60% (p ＜0.005)的優異效果。
當施用二種試驗化合物的組合時，薄荷醇和甘露醇的組合以及聖草酚和三氯蔗糖的組合可以顯著降低ALT值。此外，薄荷醇和甘露醇的組合、三氯蔗糖和甘露醇的組合，或糖精和甘露醇的組合可以顯著降低AST值。特別是，以薄荷醇和甘露醇的組合治療4週後，可以達到ALT值降低約76% (p ＜0.005)以及AST值降低約62% (p ＜0.005)的優異效果。
當施用三種試驗化合物的組合時，三氯蔗糖、甘露醇和聖草酚的組合可以顯著降低ALT值(p ＜0.005)。
6.2.2.4 試驗化合物可以改善肝臟的抗氧化活性
動物實驗的結果顯示，在4週的試驗期間，多種試驗化合物顯現出改善動物肝臟的抗氧化活性之效果。結果如表12-1和表12-2所示。
表12-1：試驗化合物可以改善動物肝臟的抗氧化活性(Gpx和GSH)
表12-2：試驗化合物可以改善動物肝臟的抗氧化活性(Grd和SOD)
Gpx、GSH、Grd和SOD是肝臟抗氧化系統中常見的成員，這些成員可以減少肝臟中的氧化壓力，防止肝臟因為氧化壓力而造成損傷。 Gpx、GSH、Grd和SOD值的增加表示肝臟保持較佳的抗氧化活性。
該結果顯示，脂肪肝誘導的小鼠的抗氧化活性降低。在各別施用的試驗化合物中，橙皮素、葛根素、聖草酚、根皮苷、甘露醇和三氯蔗糖皆可顯著改善抗氧化活性。特別是，以甘露醇治療4週後達到Gpx、GSH、Grd和SOD含量顯著增加(p ＜0.005)的優異效果。
總之，試驗化合物(包括甘露醇和三氯蔗糖等)可以減少肝臟中的脂肪含量、減少肝臟損傷和改善肝臟的抗氧化活性。這些化合物已經通過動物實驗被證實是安全的，並且發現有可能發展為保健食品或藥物，用以減少肝臟脂肪和改善相關疾病，例如脂肪肝疾病、急性和慢性酒精性脂肪肝疾病、急性和慢性非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic fatty liver diseases, NAFLD)，急性和慢性酒精性肝炎、急性和慢性非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性肝硬化和酒精性肝硬化(ICD-9-CM診斷代碼：571.8, 571.0, 571.1, 571.2, 571.3, 571.4, 571.5, 571.9)。
無
當結合附圖閱讀時，將更好地理解前述發明內容以及本發明以下之詳細描述。為了說明本發明之目的，在圖式中展示出目前較佳之具體實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於所展示之精確排列及手段。
在圖式中：
圖1所示為在血液中(體外)前藥殘留或其相關代謝物形成的百分比。
圖2所示為在SD大鼠中口服施用前藥之後，血漿中前藥和三氯蔗糖的濃度對時間的曲線圖。
圖3所示為在SD大鼠中口服施用前藥之後，血漿中甘露醇的濃度對時間的曲線圖。
圖4所示為動物肝組織的H&E染色結果。(A)正常對照組，(B) APAP誘導的肝損傷之對照組，(C)以NAC治療的陽性對照組，(D)以甘露醇(1.67 mg/kg)治療的實驗組，(E)以三氯蔗糖(1.67 mg/kg)治療的實驗組，(F)以甘露醇(2.51 mg/kg)加三氯蔗糖(2.51 mg/kg)治療的實驗組，(G)以甘露醇(3.34 mg/kg)加三氯蔗糖(3.34 mg/kg)治療的實驗組，以及(H)以NAC和甘露醇(3.34 mg/kg)和三氯蔗糖(3.34 mg/kg)的組合治療的實驗組。
圖5所示為取自小鼠的肝組織切片，該小鼠係被誘導產生脂肪肝，然後以不同的試驗化合物分組治療四週。
圖6所示為本發明之化合物的合成方法的一般方式。
無

Claims (42)

  1. 一種由式(I)表示的化合物，式(I)， 其中 L為飽和或不飽和脂肪族基團； R係選自於下列所組成之群組：氫、多元醇基團和(G)p 的糖基團，其中G為單醣殘基，且p為1至100的整數，其中(G)p 中的至少一個羥基被鹵素原子取代；以及 q為2至4的整數，且每個R為相同或不同， 或其醫藥上可接受之鹽類。
  2. 如請求項1之化合物，其中該L為具有1至40個碳原子的烷基。
  3. 如請求項1之化合物，其中該L係選自於下列所組成之群組：支鏈烷基、以苯環取代的直鏈烷基、以苯環取代的支鏈烷基、以直鏈脂肪族基團取代的苯基，以及以支鏈脂肪族基團取代的苯基。
  4. 如請求項1之化合物，其中該多元醇基團是直鏈或環狀的，經取代或未經取代的。
  5. 如請求項1之化合物，其中該單醣殘基為己糖。
  6. 一種由式(II)表示的化合物， R1 -O-X-(CH2 )m -X-O-R2 式(II)， 其中 X為C=O； R1 和R2 為相同或不同，係選自於下列所組成之群組：氫、多元醇基團和(G)p 的糖基團，其中G為單醣殘基且p為1至100的整數，其中在(G)p 中的至少一個羥基被鹵素原子取代，其中當R1 為氫時，則R2 不為氫；以及 m為1至40的整數， 或其醫藥上可接受之鹽類。
  7. 如請求項6之化合物，其中該多元醇基團為-CH(CHOH)n CH2 OH，其中n為1至18的整數。
  8. 如請求項6之化合物，其中在(G)p 中的二個或更多個羥基被鹵素原子取代。
  9. 如請求項6之化合物，其中該單醣殘基為己糖。
  10. 如請求項9之化合物，其中該己糖係選自於由己醛糖和酮己糖所組成之群組。
  11. 如請求項6之化合物，其中該糖基R1 或R2 係由-G1 -O-G2 表示，其中G1 和G2 為相同或不同，係選自於由己醛糖和酮己糖所組成之群組，且在G1 中的至少一個羥基或在G2 中的至少一個羥基被鹵素原子取代。
  12. 如請求項11之化合物，其中該鹵素原子係選自於由氯、溴和碘所組成之群組。
  13. 如請求項12之化合物，其中該鹵素原子為氯。
  14. 如請求項11之化合物，其中G1 為葡萄糖，其中一個羥基被氯取代；以及G2 為果糖，其中二個羥基被氯取代。
  15. 如請求項11之化合物，其中R1 或R2 係由式(Ia)表示式(Ia)。
  16. 如請求項7之化合物，其中m和n為4。
  17. 如請求項1之化合物，其係選自於下列所組成之群組：式1的((2R,3R,4R,5R,6R)-6-(((2R,5R)-2,5-雙(氯甲基)-3,4-二羥基四氫呋喃-2-基)氧基)-3-氯-4,5-二羥基四氫-2H-吡喃-2-基)甲基((2R,3R,4R)-2,3,4,5,6-五羥基己基)己二酸酯式1。
  18. 如請求項1之化合物，其係式2的C6-甘露醇式2。
  19. 一種由式C表示的化合物，式C 其中Ph為苯基且Bn為芐基。
  20. 一種醫藥組合物，包含如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類以及一醫藥上可接受之載體。
  21. 一種用於在有需要的個體中預防或治療疾病或病症的方法，包含向該個體施用有一效量的如申請專利範圍第1項之化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
  22. 如請求項21之方法，其中該如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類與選自於下列所組成之群組的一個或多個額外的試劑結合施用： (i) 一第一活性劑，係選自於下列所組成之群組：聚乙二醇脫水山梨糖醇單月桂酸酯(Tween 20)、微晶纖維素、磷酸二鈣二水合物、Brij 35、糖精、甘露醇，Cremophor RH40、三氯蔗糖、交聯聚維酮、澱粉羥乙酸鈉、Eudragit S100、交聯羧甲基纖維素鈉、Pluronic F68、薄荷醇、低取代羥丙基纖維素、預膠化澱粉、Dextrates NF水合物、檸檬酸、Cremophor EL、Aerosil 200、Myrj 52、山梨酸、檸檬油、羥丙基纖維素、山梨醇、乙醯磺胺酸鉀、羥丙基甲基纖維素、乳糖單水合物、麥芽糖糊精、Brij 58、Brij 76、Tween 80、Tween 40、PEG 400、PEG 4000、PEG 8000、Span 60、苯甲酸鈉、羥乙基甲基纖維素、甲基纖維素、Span 80、環己烷胺基磺酸鈉、山嵛酸甘油酯、氧化紅、甘油單硬脂酸酯、共聚維酮K28、乙酸澱粉、硬脂酸鎂、月桂基硫酸鈉、聚維酮K30、PEG2000，以及N-乙醯半胱胺酸(NAC)及其任何組合； (ii) 一第二活性劑，係選自於下列所組成之群組：十二烷基硫酸鈉、薄荷醇、三氯蔗糖、甘露醇、山梨醇、糖精、甘油、苯甲酸鈉、氧化紅、預膠化澱粉、環己烷胺基磺酸鈉、山梨酸、檸檬油、檸檬酸、丁基化羥基茴香醚、枸杞子、異牡荊素、聖草酚、麥角固醇、β-月桂烯、高膽固醇、(+)-兒茶素、高良薑精、桑色素、金松雙黄酮、香蜂草苷、棉纖維素、木犀草素-7-葡萄糖苷、(+)-紫杉葉素、反式肉桂酸、月見草內含物(Diosmin)、蒙花苷、木糖醇、木犀草素、獐牙菜苦苷、葛根素、根皮苷、甜橙黃酮、(-)-表沒食子兒茶素、山奈酚、熊果酸、水飛薊素、(+)-苧烯、橙皮苷、(-)-表兒茶素-3-沒食子酸酯、水飛薊賓、芒柄花素、肉荳蔻酸乙酯、二十碳五烯酸(EPA)、漢黃芩素、聚維酮K-30、原兒茶酸、繖形酮、橙皮素、去甲二氫癒創木酸、新橙皮苷、柚皮苷、(-)-表兒茶素、甘草甜素、黃芩苷、槲皮苷、黃芩素，以及其任何組合；以及 (i)和(ii)的任何組合。
  23. 如請求項22之方法，其中該一個或多個額外的試劑係選自於下列所組成之群組：脫水磷酸二鈣、薄荷醇、甘露醇、三氯蔗糖、N-乙醯半胱胺酸(NAC)及其任何組合。
  24. 如請求項22之方法，其中該一個或多個額外的試劑係選自於下列所組成之群組：(1) 糖精和甘露醇的組合、(2) 薄荷醇和甘露醇的組合、(3) 三氯蔗糖和甘露醇的組合、(4) 聖草酚和甘露糖醇的組合、(5) 聖草酚和三氯蔗糖的組合、(6) 薄荷醇、甘露醇和羥基硬脂醇的組合，以及(7) 三氯蔗糖、甘露醇和羥基乙醇的組合。
  25. 如請求項22之方法，其中該如申請專利範圍第1項之化合物或其醫藥上可接受之鹽類與該一個或多個額外的試劑係同時或依序施用。
  26. 一種用於預防或治療特徵在於在有需要的個體體內增加細胞色素P450的活性或增加自由基含量的疾病或病症之方法，包含向該個體施用一有效量的如申請專利範圍第1項之化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
  27. 如請求項26之方法，其中該如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類係與一個或多個如請求項20所定義之額外的試劑聯合施用。
  28. 一種用於預防或治療在有需要的個體中器官損傷之方法，包含向該個體施用一有效量的如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
  29. 如請求項28之方法，其中該器官損傷係在肝臟或腎臟。
  30. 如請求項28之方法，其中該器官損傷係由治療藥物、CCl4 或脂質所引起。
  31. 如請求項30之方法，其中該治療藥物為對乙醯胺基酚。
  32. 如請求項28之方法，其中該如申請專利範圍第1項之化合物或其醫藥上可接受之鹽類係與一個或多個如申請專利範圍第20項所定義之額外的試劑聯合施用。
  33. 一種用於預防或治療在有需要的個體中的肝毒性之方法，包含向該個體施用一有效量的如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
  34. 如請求項33之方法，其中該肝毒性係由治療藥物、CCl4 或脂質所引起。
  35. 如請求項33之方法，其中該治療藥物為對乙醯胺基酚。
  36. 如請求項33之方法，其中該如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類係與一個或多個如請求項20所定義之額外的試劑聯合施用。
  37. 一種用於預防或治療脂肪肝、保護肝功能或改善由脂肪肝或其它相關疾病引起的肝臟疾病之方法，包含向該個體施用一有效量的如申請專利範圍第1項之化合物或其醫藥上可接受之鹽類。
  38. 如請求項37之方法，其中該如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類係與一個或多個如請求項20所定義之額外的試劑聯合施用。
  39. 一種如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類之用途，其係用於製備預防或治療特徵在於增加細胞色素P450的活性或增加自由基含量的疾病或病症之藥物。
  40. 一種如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類之用途，其係用於製備預防或治療器官損傷之藥物。
  41. 一種如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類之用途，其係用於製備預防或治療肝毒性之藥物。
  42. 一種如請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽類之用途，其係用於製備預防或治療脂肪肝、保護肝功能或改善由脂肪肝或其它相關疾病引起的肝臟疾病之藥物。
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