CN110538187A

CN110538187A - Cpt1激活剂

Info

Publication number: CN110538187A
Application number: CN201810520576.9A
Authority: CN
Inventors: 王初; 戴建业; 刘源
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2018-05-28
Filing date: 2018-05-28
Publication date: 2019-12-06

Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体而言，涉及肉碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)激活剂、鉴定CPT1激活剂的方法，以及CPT1激活剂的医药用途。

Description

CPT1激活剂

发明领域

发明背景

在现代社会中，全世界约三分之一的成年人都超重，这些人群因此具有发展出肥胖相关的代谢性疾病的高风险因素，这些疾病包括非酒精性脂肪性肝病、2型糖尿病和心血管疾病。虽然肥胖的病因和发病机制复杂且涉及多因素，但是不均衡饮食被认为是干扰常规能量代谢并诱导多器官脂质积聚过多的罪魁祸首。因此，减少脂质积聚可能是改善肥胖症和相关代谢紊乱的有效解决方案。目前的方法包括进食更健康的饮食，物理和治疗性地抑制食物摄入，通过手术去除过多的脂肪并抑制脂质生物合成。由于脂质积聚是脂质代谢失衡的结果，因此可以通过增加脂质消耗来改善疾病。

脂质消耗的主要途径是通过线粒体脂肪酸β-氧化(FAO)，这是游离脂肪酸与辅酶A(CoA)酯化，转运到线粒体基质并氧化生成乙酰-CoA的基本过程。长链酰基辅酶A酯转运到线粒体基质中是由肉碱棕榈酰转移酶(CPT)系统介导，该系统由三种蛋白CPT1、酰基肉碱移位酶和CPT2组成。CPT1锚定在线粒体外膜上，负责将酰基辅酶A转化为酰基肉碱，酰基肉碱通过移位酶穿过线粒体膜，并通过线粒体内的CPT2转化回酰基辅酶A，然后进入β-氧化。CPT1被认为是FAO的限速酶，且脂肪生成中间体丙二酰辅酶 A对其的抑制是维持脂肪酸代谢平衡的关键调节机制。已证明乙酰辅酶A羧化酶的遗传学抑制减少丙二酰辅酶A产生，从而逆转饮食诱导的肝脂肪变性和胰岛素抵抗，并且过表达有活性的但对丙二酰辅酶A不敏感的CPT1突变体能够改善超重和小鼠胰岛素抵抗，这两者都支持激活肝脏FAO以治疗肥胖相关的代谢紊乱的机制。

据报道，一种合成的脂肪酸合成酶抑制剂C75可以在饮食诱导的肥胖模型中激活CPT1以增加外周能量利用和脂肪酸氧化，但其激活机制仍有争论，因为后来发现 C75-CoA加合物在体外和体内都作为CPT1的高效抑制剂起作用。因此，寻找可激活 CPT1并促进FAO以减轻脂质积聚和代谢紊乱的新化合物具有重大意义。本领域仍需要鉴定CPT1激活剂，用于预防和/或治疗脂肪代谢相关疾病。

附图说明

图1.黄芩苷减少细胞脂质积聚。(A)示出黄芩苷的结构。(B)使用油红O(ORO) 染色和MTT测定(n＝6)评估黄芩苷在HeLa细胞中的剂量依赖性抗脂肪变性作用和细胞毒性。(C)从用DMSO(“CTR”)、高浓度脂肪酸(“HFA”)单独以及高浓度脂肪酸与黄芩苷共同处理后的染色的HeLa细胞中提取的ORO染料的图像(顶部)和定量(底部)(n＝6)。(D)用DMSO(“CTR”)、高浓度脂肪酸(“HFA”)单独以及高浓度脂肪酸与黄芩苷共同处理后的HeLa细胞的ORO染色的图像(顶部)和定量(底部)(n＝3)。(E)用 DMSO(“CTR”)、高浓度脂肪酸(“HFA”)单独以及高浓度脂肪酸与黄芩苷共同处理后的HeLa细胞的受激拉曼散射显微镜(SRS)分析的图像(顶部)和定量(底部)(n＝3)。

图2.从小鼠肝脏分离的原代肝细胞中黄芩苷减少细胞脂质积累并直接激活CPT1A。 (A)从用DMSO(“CTR”)、仅高浓度脂肪酸(“HFA”)以及高浓度脂肪酸组合黄芩苷和 /或丙二酰辅酶A处理的染色的原代肝细胞中提取的ORO染料的图像(左)和定量(右)。(B) 用100μM黄芩苷处理活肝细胞导致CPT1A活性增加(左)；在用或不用黄芩苷处理的肝细胞中CPT1A的免疫印迹和蛋白质丰度定量(中)；用100μM黄芩苷处理肝细胞裂解物导致CPT1A活性增加(右)。100μM黄芩苷处理24h后检测细胞，n＝6。*p<0.05；**p<0.01； ***p<0.001。

图3.定量化学蛋白质组分析鉴定CPT1A为黄芩苷的靶。(A)具有(BP)或不具有(CP)二苯甲酮光交联基团(红色)的黄芩苷探针的结构。炔烃报告基团为蓝色。(B)评价黄芩苷BP探针降低HeLa细胞中的脂质积聚的能力。(C)用于鉴定蛋白质组中黄芩苷靶标的 SILAC-ABPP实验的总体方案。包括“BP对照”、“UV对照”、“CP对照”和“竞争” 在内的四组实验。(D)Venn图，显示在每组SILAC-ABPP实验中鉴定的平均比值≥4.0 的蛋白的数目(括号中显示)，显示从所有四组SILAC-ABPP实验共同鉴定出总共142种蛋白。(E)通过SILAC-ABPP鉴定的142种蛋白靶标的基因本体论分析揭示了它们与脂肪酸降解和代谢的关联。显示了具体归为“脂肪酸降解”通路的七种蛋白的名称。(F)通过siRNA敲低七种酶中的每一种均不同程度的消除了黄芩苷在HeLa细胞中的抗脂肪变性作用。黑星号：与用DMSO和空载体(CTR)处理的脂肪变性细胞相比。“空白(Mock)” 表示用黄芩苷和空载体处理的脂肪细胞。(G)丙二酰辅酶A(一种已知的CPT1A抑制剂) 的共同处理消除了黄芩苷在减少HeLa细胞中脂质积聚中的作用。对于所有数据，*p <0.05；**p<0.01；***p<0.001，n＝6。

图4.黄芩苷光亲和探针的合成路线和凝胶内荧光分析。(A)合成路线。试剂和条件：a)NaN₃(1.5当量)，NH₄Cl(1.0当量)，DMF，120℃过夜，98％；b)(4-羟基苯基)硼酸(2.0当量)，Cu₂O(0.05当量)，DMSO，100℃过夜，42％；c)3-溴丙-1-炔(1.2当量)， NaH(1.2当量)，DMF，0至25℃过夜，86％；d)LiOH·H₂O(5.0当量)，THF，MeOH， 65℃，2小时；e)4-(氨基甲基)苯基)(苯基)甲酮(1.1当量)，EDCI(1.1当量)，HOAT(1.1 当量)，EA，25℃，4小时，55％(2个步骤)；f)黄芩苷(1.0当量)，EtOH，H₂O，DMSO， 302nm UV，25℃，3h，55％(HPLC分离)。(B)用200μM黄芩苷探针标记HeLa细胞蛋白质组并观察UV依赖性标记信号。在存在2倍过量的黄芩苷的情况下，标记信号被有效地竞争。

图5.在HeLa细胞中RNAi敲低七个靶标蛋白。qRT-PCR分析显示在RNAi敲低后，被鉴定为黄芩苷结合靶标并且功能性分配到“脂肪酸降解”通路中七个靶标蛋白的mRNA水平降低。n＝3。

图6.如通过使用RNA-seq的转录组分析所揭示的，黄芩苷不影响HeLa细胞中脂质代谢相关的蛋白的转录。(A)被鉴定为黄芩苷结合靶标并被功能性分配至的“脂肪酸降解”途径的七个靶标蛋白的mRNA的FPKM值。n＝3。(B)黄芩苷处理后mRNA水平有显著变化的基因的基因本体论分析(p<0.05)表明黄芩苷处理在转录水平上不影响与脂质代谢有关的途径。

图7.黄芩苷直接激活CPT1A的酶促活性。(A)用100μM黄芩苷处理活HeLa细胞导致CPT1A活性增加>3倍。(B)CPT1A的免疫印迹(上)以及在用或不用黄芩苷处理的 HeLa细胞中定量其蛋白质丰度(下)。(C)用100μM黄芩苷处理HeLa细胞粗裂解物导致 CPT1A活性增加>7倍。(D)用100μM黄芩苷处理分离的线粒体提取物导致CPT1A活性(“mitoCPT1A”)增加>5倍。(E)用100μM黄芩苷处理来自过表达野生型CPT1A的大肠杆菌的粗裂解物导致重组CPT1A(“reCPT1A”)活性增加>3倍。来自过表达空载体的大肠杆菌的裂解物或CPT1A的催化性失活突变体H473A显示最小背景CPT1A活性。(F)用100μM黄芩苷处理来自过表达小鼠CPT1A(“mCPT1A”)的大肠杆菌粗裂解物增加CPT1A活性。(G)用100μM黄芩苷处理过表达线虫CPT1(“ceCPT”)的大肠杆菌粗裂解物提高CPT1活性。(H)黄芩苷不激活同种型重组CPT1B。(I)黄芩苷不激活同种型重组CPT1C。对于所有数据，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，n＝3。

图8.黄芩苷在大肠杆菌裂解液中对重组CPT1A表现出剂量依赖性激活。包括过表达空载体(“背景”)的大肠杆菌裂解物或CPT1A的催化失效突变体H473A(“CPT1A_Mut”) 的CPT1A活性作为对照。假设激活效应在800μM黄芩苷处达到最大值，估计的EC50 值可以拟合为247.50μM。n＝3。

图9.CPT1A-黄芩苷相互作用的结构建模和生理学验证。(A)通过温度依赖性细胞热漂移测定法测量(n＝3)，黄芩苷处理增加CPT1A在细胞裂解物中的热稳定性。(B)如通过在52℃下的浓度依赖性细胞热漂移测定(n＝3)所测量的，黄芩苷处理增加CPT1A在细胞裂解物中的热稳定性。(C)通过竞争性ABPP-还原二甲基化(ABPP-RD)实验鉴定的具有对逐渐增加的黄芩苷竞争敏感(品红)或不敏感(紫色)的比率CPT1A肽。(D)基于来自竞争性ABPP-RD实验的信息预测的CPT1A-黄芩苷复合物模型的结构概览。蛋白质以卡通表示，呈灰色，黄芩苷以棒表示，以黄色显示。活性位点残基(H473、Y589和 T602)以青色显示在棒图中。具有对黄芩苷的结合敏感和不敏感的ABPP-RD比率的肽分别以品红色和紫色着色。预测的结合口袋周围的残基用绿色着色。预测的CPT1A-黄芩苷界面放大视图如右图所示。CPT1A中的关键界面残基(L286、I291、E309和H327)显示在棒图中，并标有残基名称和位置。(E)预测的关键界面残基的破坏性突变消除了黄芩苷光亲和探针的CPT1A标记(n＝2)。基于CPT1A-黄芩苷复合物的对接模型预测了四种破坏性突变。有或没有黄芩苷竞争下用黄芩苷探针标记过表达这些突变体的大肠杆菌裂解物，并且用链霉亲和素富集。对富集前的输入裂解物(“输入”)、富集后的样品(“下拉(pulldown)”)和富集后用黄芩苷竞争的样品(“竞争”)进行CPT1A的免疫印迹分析。通过ImageJ定量免疫印迹信号的强度，并通过从“下拉”泳道减去“竞争”泳道的强度，然后除以“输入”泳道的强度来计算探针标记的数量比率。*p<0.05；**p<0.01； ***p<0.001，与野生型相比。(F)在HeLa细胞中黄芩苷处理后的CPT1A总体活性，所述细胞通过siRNA敲低内源性CPT1A之后过表达野生型CPT1A或每种破坏性突变体。激活倍数显示在条生物上方(n＝3)。(G)在siRNA敲低内源性CPT1A的HeLa细胞中，野生型CPT1A的过表达可拯救对黄芩苷的抗脂肪变性作用的响应反应，但任何破坏性突变体都不能拯救(n＝3)。(H)siRNA敲低内源性CPT1A之后过表达野生型CPT1A 或每种破坏性突变体的HeLa细胞中黄芩苷激活后的总体CPT1A活性。激活倍数显示在条上方(n＝3)。黑色星号表示与DMSO相比差异的显著性，*p<0.05；**p<0.01；***p <0.001。

图10.通过竞争性ABPP-RD实验鉴定对黄芩苷结合敏感的CPT1A肽。(A)竞争性ABPP-RD实验的总体方案。首先将过表达CPT1A的大肠杆菌的裂解物与DMSO或黄芩苷分别温育，然后通过UV光交联由黄芩苷探针进行标记。用胰蛋白酶消化探针标记的裂解物，并通过还原二甲基化进行同位素标记，然后混合在一起用于LC-MS/MS分析。由于黄芩苷可以与探针标记竞争，并产生黄芩苷结合位点周围的更多的未修饰 CPT1A肽，具有更高定量比的肽(黄芩苷比DMSO)表明它们与黄芩苷的结合位点接近，而表面上的肽具有不变的比率表示它们远离结合位点。(B)CPT1A的氨基酸序列，其中具有较高比例的肽为品红色，和具有不变比例的肽着色紫色。

图11.评价具有破坏性突变的CPT1A突变体上的黄芩苷探针的标记。(A)四种“破坏性”突变体的Rosetta能量分数列表显示预测它们维持CPT1A稳定性(负“稳定”能量分数)并破坏与黄芩苷的结合(正“结合”能量分数)。(B)预测的关键界面残基的破坏性突变消除黄芩苷光亲和探针的CPT1A标记(n＝2)。基于CPT1A-黄芩苷复合物的对接模型预测了四种破坏性突变。有或没有黄芩苷竞争下用黄芩苷探针标记过表达这些突变体的大肠杆菌裂解物，并且用链霉亲和素富集。对富集前的输入裂解物(“输入”)，富集后的样品(“下拉”)和黄芩苷竞争下富集后的样品(“竞争”)进行CPT1A的免疫印迹分析。通过ImageJ定量免疫印迹信号的强度，并通过从“下拉”泳道减去“竞争”泳道的强度，然后除以“输入”泳道的强度来计算探针标记的定量比率。

图12.在“拯救”实验中内源性敲低和外源性过表达后，CPT1A的丰度。(A)在 RNAi敲低内源性CPT1A后然后瞬时过表达野生型人CPT1A或黄芩苷不敏感突变体的 HeLa细胞的CPT1A免疫印迹。100μM黄芩苷处理24h，n＝3。(B)在shRNA敲低肝脏 CPT1A后通过AAV介导过表达野生型小鼠CPT1A或对黄芩苷不敏感的H327E突变体的小鼠肝脏中CPT1A免疫印迹。CTR：对照组；SI：敲低内源性CPT1A。OE：野生型 CPT1A或其黄芩不敏感突变体的过表达。n＝4。

图13.黄芩苷改善小鼠饮食诱导的肥胖症和相关的代谢紊乱。(A)黄芩苷处理减少DIO小鼠的体重，但是在正常饮食的小鼠(“CHOW”)中没有减少。(B)黄芩苷处理降低DIO小鼠体内脂肪的百分比。(C)黄芩苷处理不影响CHOW或DIO小鼠的食物摄取。(D)黄芩苷处理增加DIO小鼠的能量消耗。(E)黄芩苷处理使DIO小鼠的呼吸交换率 (RER)趋于0.7，表明更多的脂肪被用作能量来源。(F)和(G)黄芩苷处理减少DIO小鼠的肝脏大小和重量。(H)和(I)来自有或没有黄芩苷处理的CHOW或DIO小鼠的肝组织切片的苏木精和曙红(HE)染色和油红O(ORO)染色的图像。(J)黄芩苷处理降低DIO小鼠中肝脏甘油三酯(TG)和胆固醇(CHOL)的水平。(K)黄芩苷处理增加CHOW和DIO小鼠肝脏中CPT1A的活性。(L)黄芩苷处理降低血浆中非酯化脂肪酸(NEFA)的水平并提高总酮体(TKB)的水平。对于所有数据，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，每组n＝5。

图14.黄芩苷治疗改善胰岛素敏感性、高脂血症和高血糖症以及肝功能。(A)CHOW小鼠和DIO小鼠中的胰岛素耐受试验(“ITT”)。(B)小鼠血液中主要生物标志物的生化分析。小鼠具有正常或高脂肪饮食，并用或不用黄芩苷处理。通过相应试剂盒分析的标志物包括天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、载脂蛋白E(APOE)、胆固醇 (CHOL)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌钙蛋白I和肌钙蛋白T(TNTs)。黄芩苷逆转几乎所有NAFLD相关生化指标紊乱，所有数据均在生理盐水或400mg/kg黄芩苷处理12周后测量，*p<0.05；**p<0.01；***p <0.001，n＝5。

图15.在体重出现差异之前，黄芩苷处理改变DIO小鼠中的呼吸交换率(RER)。(A)该黄芩苷处理不降低DIO小鼠或CHOW小鼠的体重。(B)黄芩苷处理使DIO小鼠的呼吸交换率(RER)更接近0.7，这表明更多的脂肪被用作能量来源。(C)黄芩苷处理增加了 DIO小鼠的能量消耗并减少了CHOW小鼠的能量消耗。(D)在内源性肝脏CPT1A敲除后，在小鼠肝脏中过表达野生型CPT1A(SI&OE_WT)或破坏性突变体H327E(SI& OE_MUT)的DIO小鼠中黄芩苷处理没有降低体重。(E)黄芩苷处理使呼吸交换比率 (RER)在SI和OE_WT小鼠中为0.7，表明更多脂肪被用作能量来源。(F)黄芩苷处理第三周在SI&OE_WT或SI&OE_MUT小鼠中对能量消耗没有显著影响。所有数据均在生理盐水或400mg/kg黄芩苷每日处理3周后测量，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001， n＝5。

图16.黄芩苷处理不改变小鼠肝脏中CPT1A的表达和丙二酰辅酶A的水平。(A)在用或不用黄芩苷处理的正常和高脂饮食的小鼠的肝脏中的CPT1A和肌动蛋白的免疫印迹，以及蛋白质表达水平的定量。(B)在用黄芩苷处理后，小鼠肝脏(正常或高脂肪饮食) 中丙二酰辅酶A水平没有显著降低。所有数据在盐水或400mg/kg黄芩苷每日处理12 周后测量，**p<0.01；N＝5。

图17.小鼠CPT1A中黄芩苷不敏感突变体的选择。人CPT1A、CPT1B、CPT1C和小鼠CPT1A在黄芩苷预测结合位点区域的序列比对。基于对接模型预测的四种破坏性突变的残基位置以红色突出显示。L286和I291在人和小鼠CPT1A直向同源物之间不是保守的。人和小鼠直系同源物之间保守但在人类CPT1A同种型之间不保守的区域以青色突出显示，这可能是黄芩苷对人类CPT1A的同种型具有选择性的原因。

图18.肝脏CPT1A的敲低消除DIO小鼠中黄芩苷的抗脂肪变性作用。(A)通过shRNA干扰(siCPT1A)在组织特异性敲低后，肝脏CPT1A的免疫印迹(上)和定量(下)。 (B)肝脏CPT1A的敲低导致CPT1A在小鼠肝脏中的酶活性降低。(C)肝脏CPT1A的敲低不影响DIO小鼠的食物摄取。(D)肝脏CPT1A的敲低消除DIO小鼠中由黄芩苷诱导的体重减轻。(E)肝脏CPT1A的敲低消除了DIO小鼠中由黄芩苷诱导的体脂肪百分比降低。(F)和(G)肝脏CPT1A的敲低消除DIO小鼠中黄芩苷诱导的能量消耗和呼吸交换比率(RER)的增加。(H)肝脏CPT1A的敲低消除DIO小鼠中由黄芩苷诱导的减轻的肝脏重量。(I)通过HE和ORO染色测量，肝脏CPT1A的敲低消除DIO小鼠中由黄芩苷诱导的肝脏尺寸减少和肝脂肪变性减少。(J)和(K)肝脏CPT1A的敲低消除DIO小鼠中黄芩苷诱导的肝脏甘油三酯(TG)和胆固醇(CHOL)水平的降低。所有数据在盐水或 400mg/kg黄芩苷每日处理12周后测量，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，n＝5。

图19.黄芩苷的抗肥胖和抗脂肪变性作用取决于它与CPT1A的相互作用。(A)小鼠CPT1A的H327E突变体保留其对黄芩苷激活的抗性。在每个条上方显示黄芩苷对小鼠CPT1A活性的激活倍数(n＝3)。(B)和(C)通过温度依赖性细胞热漂移测定(n＝3)测量，黄芩苷处理提高重组小鼠野生型CPT1A(左)在大肠杆菌裂解物中的热稳定性，但是不提高黄芩苷抗性H327E突变体的稳定性(右)。黑色星号表示与DMSO相比差异的显著性， *p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。敲除内源性肝脏CPT1A后，小鼠肝脏中野生型 CPT1A而不是破坏性突变体H327E的过表达可挽救DIO小鼠中对黄芩苷的抗脂肪变性响应，包括体重减轻(D)；体脂百分比降低(E)；通过HE和ORO染色测量的肝脏尺寸减小和肝脂肪变性(F)；肝脏重量减少(G)；肝甘油三酯(TG)和胆固醇(CHOL)水平降低(H)；血浆中非酯化脂肪酸(NEFA)的水平降低和总酮体(TKB)水平升高(I)；增加能量消耗(J)；改变的呼吸交换率(RER)为0.7(K)。(L)在敲低内源性肝脏CPT1A后，在小鼠肝脏中过表达野生型CPT1A或破坏性突变体H327E的DIO小鼠中肝脏总体CPT1A活性。对于 D-L，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，每组n＝5。

图20.黄芩苷对胰岛素抵抗和其他代谢参数的系统性改善取决于其与CPT1A的相互作用。(A)过表达野生型CPT1A和H327E突变体的DIO小鼠中的胰岛素耐受试验 (“ITT”)。(B)正常或高脂肪饮食小鼠血液中主要生物标志物的生化分析：天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、载脂蛋白E(APOE)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌钙蛋白I和肌钙蛋白 T(TNTs)。黄芩苷能逆转几乎所有NAFLD相关生化指标紊乱，所有数据均在生理盐水或400mg/kg黄芩苷每日处理12周后测量，*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，n＝5。

图21.CPT1A在其他组织如脂肪、肠和肾中的丰度和活性。(A)所有这些组织中的CPT1A可以被黄芩苷激活，肝脏CPT1A的整体活性被测量为最高。所有数据在盐水或 400mg/kg黄芩苷每日处理12周后测量，n＝4。(B)来自对照小鼠、CPT1A敲低的小鼠以及具有CPT1A恢复的小鼠的其它三种组织(包括脂肪、小肠和肾脏)中CPT1A的 Western印迹。n＝4。

图22.黄芩苷衍生物在活化CPT1A和降低脂质积累中的作用。(A)黄芩苷、黄芩素和Ac-黄芩苷的结构。(B)使用油红O(ORO)染色评价黄芩苷、黄芩素和Ac-黄芩苷在 HeLa细胞中的降脂作用(100μM黄芩苷衍生物处理24小时，n＝3)。(C)使用来自过表达野生型CPT1A的大肠杆菌粗裂解物比较黄芩苷、黄芩素和Ac-黄芩苷的CPT1A激活能力。(D)使用MTT测定评估黄芩苷、黄芩素和Ac-黄芩苷在HeLa细胞中的细胞毒性作用(100μM黄芩苷衍生物24小时，n＝3)。(E)通过化学蛋白组学分析实验(顶部：原始色谱图；底部：平均竞争比率)显示黄芩素和Ac-黄芩苷竞争CPT1A上黄芩苷-光交联探针的标记。(F)通过免疫印迹证明黄芩素和Ac-黄芩苷竞争CPT1A上黄芩苷-光交联探针的标记。

发明详述

本发明人通过定量化学蛋白质组的方法，发现黄芩苷能够直接与CPT1相互作用，并且显著增强CPT1的体外或体内活性。这是目前发现的第一种与CPT1直接相互作用的CPT1激活剂。

因此，在一方面，本发明提供黄芩苷或其衍生物或其盐作为CPT1激活剂的用途。黄芩苷结构如下式I所示。

如本发明所用，“CPT1”是指肉碱棕榈酰基转移酶1，其是脂肪酸β-氧化过程中的限速酶。在一些实施方案中，所述CPT1是人CPT1。在一些实施方案中，所述CPT1 是小鼠CPT1。在一些优选实施方案中，所述CPT1是CPT1A。在一些优选实施方案中，所述CPT1是人CPT1A。

如本文所用，“激活”是指酶促活性的增强。如本文所用，“CPT1激活剂”是指与不存在所述激活剂相比，所述激活剂的存在能够增强CPT1的酶促活性。例如，在所述激活剂存在下的CPT1的酶促活性是所述激活剂不存在下的CPT1的酶促活性的大约1.2 倍、大约1.5倍、大约2倍、大约3倍、大约4倍、大约5倍、大约6倍、大约7倍、大约8倍、大约9倍、大约10倍、大约15倍、大约20倍、大约25倍、大约50倍或更高。在一些实施方案中，本发明所述CPT1激活剂与CPT1直接相互作用。

此外，通过分析黄芩苷与CPT1相互作用的空间结构以及突变体实验，本发明人鉴定出CPT1中对于黄芩苷介导的酶促活性增强的关键氨基酸位点。这些关键位点可以用于设计或筛选新的CPT1激活剂。

因此，在另一方面，本发明提供一种筛选CPT1激活剂的方法，所述方法包括：

(a)获得候选化合物的空间结构和CPT1的空间结构模型；

(b)使候选化合物的空间结构与CPT1的空间结构模型对接；

(c)鉴定能够与CPT1中第286位、第291位、第309位和第327位氨基酸中的一或多个相互作用的候选化合物，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1；和

(d)进一步验证步骤(c)中鉴定的候选化合物对CPT1的激活作用。

SEQ ID NO:1(人CPT1A氨基酸序列): MAEAHQAVAFQFTVTPDGIDLRLSHEALRQIYLSGLHSWKKKFIRFKNGIITGVYPASPSSWLIVVVGVMTTMYAKIDPSLGIIAKINRTLET ANCMSSQTKNVVSGVLFGTGLWVALIVTMRYSLKVLLSYHGWMFTEHGKMSRATKIWMGMVKIFSGRKPMLYSFQTSLPRLPVPAVKDTVNRYLQSVRPLMKEEDFKRMTALAQDFAVGLGPRLQWYLKLKSWWATNYVSDWWEEYIYLRGRGPLMVNSNYYAMDLLYILPTHIQAA RAGNAIHAILLYRRKLDREEIKPIRLLGSTIPLCSAQWERMFNTSRIPGEETDTIQHMRDSKHIVVYHRGRYFKVWLYHDGRLLKPREMEQ QMQRILDNTSEPQPGEARLAALTAGDRVPWARCRQAYFGRGKNKQSLDAVEKAAFFVTLDETEEGYRSEDPDTSMDSYAKSLLHGRC YDRWFDKSFTFVVFKNGKMGLNAEHSWADAPIVAHLWEYVMSIDSLQLGYAEDGHCKGDINPNIPYPTRLQWDIPGECQEVIETSLNTA NLLANDVDFHSFPFVAFGKGIIKKCRTSPDAFVQLALQLAHYKDMGKFCLTYEASMTRLFREGRTETVRSCTTESCDFVRAMVDPAQTVEQRLKLFKLASEKHQHMYRLAMTGSGIDRHLFCLYVVSKYLAVESPFLKEVLSEPWRLSTSQTPQQQVELFDLENNPEYVSSGGGFGPVA DDGYGVSYILVGENLINFHISSKFSCPETDSHRFGRHLKEAMTDIITLFGLSSNSKK。

在一些实施方案中，在步骤(a)中通过同源建模获得CPT1的空间结构模型。在一些实施方案中，在步骤(c)中鉴定能够与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327中的一个或多个相互作用的候选化合物。在一些优选实施方案中，在步骤(c)中鉴定能够与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327相互作用的候选化合物。同源建模或结构模型对接的概念和方法是本领域已知的，并且可以通过多种计算机程序(例如Rosetta 软件套件)实现。

因此，在另一方面，本发明提供一种CPT1的激活剂，所述激活剂能够与CPT1中第286位、第291位、第309位和第327位氨基酸中的一或多个相互作用，由此增加 CPT1的活性，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，所述CPT1激活剂与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327中的一个或多个相互作用。在一些优选实施方案中，所述CPT1激活剂与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327 相互作用。在一些实施方案中，所述激活剂通过本发明上述的方法筛选获得。

在一些实施方案中，所述候选化合物或所述CPT1激活剂可以包括小分子化合物(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)、适体、抗体等，其能够与CPT1直接相互作用以增加CPT1的活性。

在另一方面，本发明提供本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)在制备用于增强CPT1的活性，例如用于增强对象体内的CPT1活性的组合物中的用途。

在另一方面，本发明提供一种包含本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)作为活性成分的组合物，其用于增强CPT1的活性，例如用于增强对象体内的CPT1活性。

在另一方面，本发明提供一种增强CPT1的活性的方法，所述方法包括使CPT1与本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物相接触。

在另一方面，本发明提供一种增强样品中CPT1的活性的方法，所述方法包括使所述样品与本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物相接触。在一些实施方案中，所述样品是包含CPT1的细胞裂解物。在一些实施方案中，所述样品是表达CPT1的细胞或细胞培养物。所述细胞可以是真核细胞(细胞系，或原代细胞如肝细胞)或原核细胞(如大肠杆菌细胞)。

在另一方面，本发明提供一种增强对象体内的CPT1的活性的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物。

在另一方面，本发明提供一种通过增强对象体内CPT1的活性来增加对象中脂肪消耗的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物。

在另一方面，本发明提供一种通过增强对象体内CPT1的活性来减少对象体重的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物。

如本文所用，“对象”包括哺乳动物例如小鼠或人，优选是人。在一些实施方案中，所述对象是具有高脂饮食的对象。

在一些实施方案中，所述对象是需要全胃肠外营养的对象，例如胃肠道功能障碍或衰竭患者，大面积烧伤、严重复合伤、严重感染患者、炎性肠病患者、肠外瘘患者等。在一些实施方案中，本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物与胃肠外营养物共同施用。通过施用本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物，可以促进全胃肠外营养治疗中的脂质利用和/或避免全胃肠外营养治疗中常见的脂质代谢相关紊乱。

在另一方面，本发明提供一种在对象中通过增强CPT1的活性而预防和/或治疗脂肪代谢相关疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物。

在另一方面，本发明提供本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物在制备用于在对象中通过增强CPT1的活性而预防和/或治疗脂肪代谢相关疾病的药物中的用途。

如本文所用，“脂肪代谢相关疾病”包括但不限于肝脂肪变性(例如非酒精性脂肪肝)、 2型糖尿病、肥胖症(例如饮食诱导的肥胖症)、高血糖症、高血脂症、冠心病、高胰岛素血症、高尿酸血症、高血压、胰岛素抵抗等。

在一些优选实施方案中，所述对象具有高脂饮食。本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物特别适合给习惯于高脂饮食的对象施用以预防脂肪代谢相关疾病，而无需改变其生活习惯。

在另一方面，本发明提供一种在对象中治疗CPT1A缺陷症的方法，所述方法包括给所述对象施用本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物。

在另一方面，本发明提供本发明的CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或本发明的组合物在制备用于在对象中治疗CPT1A缺陷症的药物中的用途。

如本文所用，“CPT1A缺陷症”是指对象体内CPT1A酶活性缺乏导致的遗传性疾病。例如，所述对象体内一个或两个拷贝的CPT1A编码基因发生突变，导致CPT1A酶活性不足。

本发明的组合物包含溶于或分散于药学可接受的载体中的有效量的一种或多种CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)。短语“药学可接受的”是指当按照需要施用于对象(例如人)时不会产生不良的、变应性的或其它不利的反应的分子实体和组合物。对包含至少一种CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)的组合物的制备是本领域技术人员根据本公开内容已知的，并示例于“Remington：The Science and Practice ofPharmacy，”第21版，2005，其通过参考并入本文中。另外，对于人类施用来说，应当理解，制备还应满足药物审批机构所要求的对无菌性、热原性、整体安全性以及纯度的标准。

本文使用的“药学可接受的载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、抗氧化剂、盐、包衣、表面活性剂、防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸、抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、溶液阻滞剂(例如石蜡)、吸附剂(例如，高岭土、膨润土)、药物稳定剂(例如，十二烷基硫酸钠)、凝胶、粘合剂(例如，糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、藻酸盐)、赋形剂(例如，乳糖、聚乙二醇)、崩解剂(例如琼脂、淀粉、乳糖、磷酸钙、碳酸钙、海藻酸、山梨醇、甘氨酸)、润湿剂(例如，十六烷醇、单硬脂酸甘油酯)、润滑剂、吸收促进剂(例如，季铵盐)、可食用油(例如，杏仁油、椰油、油性酯或丙二醇)、甜味剂、调味剂、着色剂、填充剂(例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、硅酸)、压片润滑剂(例如，硬脂酸镁、淀粉、葡萄糖、乳糖、白垩)、吸入用载体(例如，烃抛射剂)、缓冲剂或诸如此类的物质及其组合，这是本领域普通技术人员所了解的(参见例如，“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，”第21版，2005)。将任何除了与所述活性成分不相容的常规载体以外的常规载体用于所述组合物也在考虑范围内。

在任何情形中，所述组合物可包含多种抗氧化剂以阻滞一种或多种组分的氧化。抗氧化剂的实例包括抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟甲苯、丁羟茴醚、卵磷脂、没食子酸丙酯和生育酚。另外，防止微生物作用可通过使用防腐剂来实现，所述防腐剂例如多种抗菌剂和抗真菌剂，其包括但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其组合。

可药用的盐包括酸加成盐，例如与蛋白质组分的游离氨基形成的盐或者与无机酸(例如，盐酸、氢溴酸或磷酸)或有机酸(例如，乙酸、草酸、酒石酸、苯甲酸、乳酸、膦酸、柠檬酸、马来酸、富马酸、琥珀酸、萘磺酸、克拉维酸、硬脂酸或杏仁酸)形成的盐。与游离羧基形成的盐还可衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化镁或氢氧化铁)或者有机碱(例如，异丙胺、三甲胺、组氨酸或普鲁卡因)。

在所述组合物为液体形式的一些实施方案中，载体可以是溶剂或分散介质，其包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、液体(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)及其组合。可维持适当的流动性，例如通过使用包衣(如卵磷脂)来实现；通过分散于载体(例如，液体多元醇或脂类)中而维持所需粒径来实现；通过使用表面活性剂(例如，羟丙基纤维素)来实现；或者这些方法的组合。在许多情形中，优选包含等渗剂(例如，糖、氯化钠或其组合)。

本发明的激活剂或组合物可通过本领域普通技术人员已知的任何适当方法进行施用(参见例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，”第21版，2005)。本发明的激活剂或组合物可通过静脉内、肌肉内、腹腔内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜腔内、鞘内、口服、局部或吸入途径施用。优选地，本发明的激活剂或组合物通过口服施用。

当口服施用时，所述CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)可采用以下形式：片剂、胶囊、小袋、小瓶、粉剂、颗粒剂、锭剂、可重构的粉剂或液体制备物。根据需要，通过将所需量的所述活性化合物掺入含有多种上述其它成分的合适溶剂中来制备无菌注射用溶液，然后进行过滤除菌。通常，通过将多种无菌活性成分掺入含有基本分散介质和/或所述其它成分的无菌载体中来制备分散体系。在用于制备无菌注射用溶液、混悬液或乳剂的无菌粉剂的情形中，优选的制备方法为真空干燥或冷冻干燥技术，所述技术从先前过滤除菌的液体介质中产生活性成分加任何其它所需成分的粉末。必要时，所述液体介质应进行适当缓冲，并且在注射前用足够的盐水或葡萄糖首先使液体稀释剂等渗。制备用于直接注射的高度浓缩组合物也在考虑范围内，其中可以想到使用DMSO 作为溶剂会导致极其快速的渗透、将高浓度的活性药剂递送至小的区域。在一些具体的实施方案中，可通过在所述组合物中使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝、明胶或其组合)来实现注射用组合物的延长吸收。

如本文所用，“有效量”或“有效剂量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或包含化合物的组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。

对患者施用本发明组合物的实际剂量可根据以下身体和生理因素来确定：体重、性别、症状严重程度、所治疗疾病的类型、先前或当前的治疗干预、患者的未知病因疾病、施用时间、具体化合物的排泄率以及施用途径。在任何情况下，将由负责施用的医务人员确定组合物中活性成分的浓度以及用于个体对象的合适剂量。在一些具体实施方案中，所述CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)以1-1000mg/kg体重，例如 100-900mg/kg体重、200-800mg/kg体重、300-700mg/kg体重、400-600mg/kg体重、 500mg/kg体重的剂量施用。在一些具体实施方案中，所述CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或所述组合物每天施用一次、每天施用两次、每天施用三次，或每两天、每三天、每四天、每五天、每六天或每七天施用一次。在一些实施方案中，所述 CPT1激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或所述组合物持续施用1周、2周、3周、4 周、5周、6周、7周、8周、9周、10周或更长时间段。在一些实施方案中，所述CPT1 激活剂(例如黄芩苷或其衍生物或其盐)或所述组合物每天施用一次，其施用至少两周。

在本发明的另一方面，还提供了一种鉴定生物学样品中与黄芩苷相互作用的蛋白质的方法，所述方法包括使用下式II所示的黄芩苷探针捕获所述生物学样品中与黄芩苷相互作用的蛋白质。在一些实施方案中，通过定量化学蛋白质组学分析所捕获的蛋白质，鉴定与黄芩苷相互作用的蛋白质。

实施例

材料和方法

细胞培养、建模和处理

Hela细胞(来自北京大学Chengqi Yi实验室并由中国典型培养物保藏中心(中国武汉) 认证为无支原体污染)37℃，5％CO₂在Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM，ThermoFisher Scientific)中培养，其中补充有10％胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)和1％青霉素-链霉素(Thermo Fisher Scientific)。将每孔2×10⁴个细胞铺在96孔板中，血清饥饿24 小时并用1mM游离脂肪酸(油酸：棕榈酸，2:1，摩尔比，Sigma-Aldrich)处理24小时以诱导脂滴积累(建模)。然后用100μM黄芩苷(四川维克奇生物技术有限公司)或黄芩苷BP 探针在高脂培养基中处理细胞24小时。对于丙二酰-CoA处理，将细胞与100μM丙二酰辅酶A(Sigma-Aldrich)和100μM黄芩苷一起共处理。

RNA干扰

下面列出的siRNA构建体由GenePharma(中国上海)设计和合成。在黄芩苷处理前的建模阶段，基于(Thermo Fisher Scientific)的方案进行干扰。

ALDH3A2_Primer F:CUUUAUGUAUUUUCGCAUAtt

ALDH3A2_Primer R:UAUGCGAAAAUACAUAAAGag

ACSL1_Primer F:GAAGGAUUCUGGUCUGAAAtt

ACSL 1_Primer R:UUUCAGACCAGAAUCCUUCcc

ACSL 3_Primer F:GGAACUAACUGAACUAGCUtt

ACSL 3_Primer R:AGCUAGUUCAGUUAGUUCCtt

ACSL 4_Primer F:GCAAUAAUCCUGCUAUGGAtt

ACSL 4_Primer R:UCCAUAGCAGGAUUAUUGCag

CPT1A_Primer F:GGAUGGGUAUGGUCAAGAUtt

CPT1A_Primer R:AUCUUGACCAUACCCAUCCag

ACADVL_Primer F:GAUUGUCAAUGAACAGUUUtt

ACADVL_Primer R:AAACUGUUCAUUGACAAUCcc

HADHA_Primer F:CCGUCCUUAUCUCAUCAAAtt

HADHA_Primer R:UUUGAUGAGAUAAGGACGGca

CPT1A在Hela细胞中过表达

过表达构建体列于“克隆CPT1表达质粒”如下。在黄芩苷处理之前的建模阶段，基于(Thermo Fisher Scientific)的方案进行过表达。

qRT-PCR

按照Eastep Super Total RNA Extraction(LS1040，Promega)的说明提取总RNA。逆转录根据RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(#cat：K1622，Thermo FisherScientific) 的方案进行。用TSINGKE(北京，中国)设计和合成的引物，按照UltraSYBRMixture(含 ROX I)(#cat:CW2601,cwbiotech)的方案制备qRT-PCR样品。在AppliedBiosystems ViiA 7系统(Thermo Fisher Scientific)上进行qRT-PCR分析。

通过RNA-seq进行转录组分析

按照RNeasy Micro Kit(#cat：74004，QIAGEN)的说明提取总RNA。mRNA分离和cDNA合成根据用于Illumina的NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒(E7530，New EnglandBiolabs)中的方案进行。使用每个样品的50ng cDNA作为文库制备的起始量。按照用于Illumina的NEBNext Ultra DNA文库制备试剂盒(E7370，New England BiolabsA) 的说明构建具有～300bp插入片段大小的双末端测序文库。使用Illumina HiSeq 2500系统进行测序。每种mRNA的每百万读段定位至外显子模型每千碱基的片段(FKPM)被用于进一步分析。

MTT测定

将10⁴个细胞铺在96孔板中，每孔加入100μL预热培养基。贴壁后，将细胞在无血清培养基中饥饿24小时，然后转换为含有100μM黄芩苷或黄芩苷BP探针的正常培养基再24小时。处理后，将细胞与100μL含有50μgMTT(Sigma-Aldrich)的常规培养基一起孵育4小时。最后，紫色沉淀物溶解于200μL的DMSO(Sigma-Aldrich)中，通过酶标仪(Bio-Rad)测量490nm处的吸光度。

油红O(ORO)染色和定量分析

细胞用PBS缓冲液洗涤3次，并在冰冷的10％福尔马林中固定30分钟。将固定的细胞在异丙醇/水溶液(3:2，v/v，Sigma-Aldrich)中的100μL 0.5％油红O染色20分钟，在75％乙醇中区分2分钟，最后成像前用100μL蒸馏水漂洗3次。用ImageJ分析每个图像的强度，并通过细胞计数归一化。为了定量细胞脂质，加入50μL的 DMSO(Sigma-Aldrich)以溶解从染色的细胞中提取的ORO染料，并将通过酶标仪 (Bio-Rad)测得的在490nm处的吸光度通过MTT测量值归一化以产生最终的定量读数。

受激拉曼散射(SRS)显微镜

用于确定脂质含量的SRS显微镜在先前报道的内建系统上进行。在35mm玻璃底培养皿中，用1mM游离脂肪酸处理细胞24小时，然后与100μM黄芩苷共同处理再24 小时，并用SRS系统进行扫描。为了检测脂质含量，将泵和探针频率差调谐至2850cm-1，其与活细胞中的CH2对称振动模式共振。选择三个随机视野进行成像。在每个视野中获得三维图像以获得完全的脂质分布。每个皿成像10-15分钟。用ImageJ分析每个图像的强度并通过细胞计数归一化。

黄芩苷探针的合成

图4显示了合成黄芩苷探针的途径。

向1(1.0g，6.22mmol)的DMF(12mL)溶液中加入NaN₃(606mg，9.33mmol)和 NH₄Cl(333mg，6.22mmol)。将反应混合物加热至120℃并搅拌过夜。然后将反应混合物用Na₂CO₃骤冷并用2M HCl酸化得到沉淀，通过过滤收集沉淀，得到产物2(1.3g，98％产率)。向2(304mg，1.49mmol)的DMSO(12mL)溶液中加入(4-羟基苯基)硼酸(411mg， 2.98mmol)和Cu₂O(11mg，0.075mmol)。将反应混合物加热至100℃并搅拌过夜。反应混合物用EA萃取并用2MHCl和饱和NaCl溶液洗涤。将有机溶液真空蒸发。通过硅胶快速色谱法纯化残余物，得到化合物3(188mg，42％收率)。

在氮气下，在0℃向3(180mg，0.61mmol)的无水DMF溶液(6mL)中加入NaH(18mg，0.73mmol)和3-溴丙-1-炔(81μL，0.730mmol)。将反应温度逐渐升至室温后，将溶液搅拌过夜。反应混合物用饱和氯化铵猝灭，用EA萃取并用硫酸钠干燥。然后真空除去有机溶剂，残余物通过硅胶快速柱色谱纯化，使用PE/EA作为洗脱剂，得到产物4(175mg， 86％收率)。

将化合物4(149mg，0.45mmol)溶于THF/MeOH/H₂O(8/2.5/2.5mL)的混合溶液中。然后加入LiOH(94mg，2.23mmol)。反应混合物在65℃回流2小时。反应混合物用2M HCl 酸化得到沉淀，通过过滤收集沉淀，得到酸产物。向之前步骤获得的产物的EA溶液(18mL)加入(4-(氨基甲基)苯基)(苯基)甲酮(5,122mg，0.49mmol)、EDCI(94mg，0.49mmol) 和HOAt(67mg，0.49mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时，然后用饱和NaHCO₃和盐水洗涤。真空除去有机溶剂，残余物通过硅胶快速柱层析纯化，使用PE/EA作为洗脱剂，得到产物6(126mg，两步收率为55％)。

在石英试管中的黄芩苷(22mg，0.049mmol)和6(25mg，0.049mmol)的溶液 (DMSO/EtOH/H₂O溶剂)在搅拌下用手持式302nm紫外灯照射3小时。减压蒸发有机溶剂。产物7通过HPLC-MS纯化(25.2mg，55％收率)。1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.07 (m,2H),7.94-7.89(m,3H),7.83-7.81(d,J＝7.82,1H),7.74-7.72(d,J＝7.73,4H),7.64-7.42 (m,10H),7.09-6.75(m,4H),4.72-4.61(m,4H),4.07-3.88(m,2H),3.66-3.58(m,2H), 3.44-3.40(t,J＝3.42,1H),2.92-2.91(m,1H)；13C NMR(500MHz,MeOD)δ196.83,183.17, 167.74,167.25,166.04,165.22,158.13,150.98,149.83,147.09,143.91,137.49,136.28, 134.78,134.57,134.09,132.36,131.83,131.44,130.00,129.55,129.16,129.01,128.75, 128.10,127.58,127.31,127.27,127.13,127.08,126.77,126.40,115.36,114.81,106.82,104.78,101.54,95.54,77.78,75.96,75.55,75.20,72.89,72.47,71.04,55.44,42.95,39.03； HRMS-EI(m/z)calc.for C52H42N3O14[M+]:932.2715；Found:932.2713。

凝胶内荧光分析

将Hela细胞血清饥饿24小时并用1mM游离脂肪酸处理24小时以诱导脂滴积聚。收获细胞并在-80℃下保存用于进一步实验。

将冷冻的细胞沉淀物重新悬浮在冰上的含有0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的 PBS中，超声处理并通过以20000g超速离心30分钟而分离成可溶和不溶部分。使用 BCA蛋白质测定法(Pierce TM BCA蛋白质测定试剂盒，Thermo Fisher Scientific)在酶标仪(Bio-Rad)上测定可溶性裂解物的浓度并将其调节至2mg/mL。用黄芩苷探针(200μM) 标记裂解物(每等份200μL)，与天然化合物(400μM)竞争或不竞争。用氯仿-甲醇沉淀探针标记的裂解物，用200μL 1.2％SDS/PBS重悬，并与300μM罗丹明-叠氮化物、1mM Tris(2-羧乙基)膦(TCEP，Sigma-Aldrich)混合，在室温下加入100μM Tris((1-苄基-1H-1,2,3- 三唑-4-基)甲基)胺(TBTA)(Sigma-Aldrich)和1mM CuSO₄(Sigma-Aldrich)。1小时后，将样品与SDS样品上样缓冲液混合并通过10％SDS-PAGE分离。罗丹明荧光的图像是在 BioradChemiDoc成像系统上获得的，如图4所示。

CPT1活性测定

根据先前报道的方案(Wanders RJ,et al.,(2010)Journal of inheritedmetabolic disease 33(5):479-494.)修改进行CPT1活性测定，其基本上测量氘标记的肉碱([D9]-肉碱，剑桥同位素实验室)到氘标记的棕榈酰肉碱([D9]-棕榈酰肉碱)的转换。反应缓冲液由150mM KCl(Sigma-Aldrich)，2mM EDTA(Sigma-Aldrich)，4.5mM谷胱甘肽(Sigma-Aldrich)， 1mg/mL BSA，0.1mM棕榈酰-CoA(Sigma-Aldrich)和在PBS中的0.1mM[D9]-肉碱组成。按所示浓度加入黄芩苷。使用纯化的但无活性的重组CPT1A来建立蛋白质浓度标准曲线，并使用蛋白质印迹来估计当进行CPT1A酶促测定时各种细胞、组织和大肠杆菌裂解物中CPT1A的量。然后将这些数字用于将CPT1A活性标准化至绝对标度(每gCPT1A 每分钟转化的纳摩尔棕榈酰-肉毒碱)。

为了测试细胞CPT1A活性，将HeLa细胞在含有0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich) 的PBS中在冰上裂解，并将裂解物调整至2mg/mL。通过向100μL反应缓冲液中加入20μL裂解物开始酶促反应，并在37℃孵育10分钟。在反应结束时，加入0.3nmol[D3]- 棕榈酰肉毒碱(Cambridge Isotope Laboratory)作为内标，加入600μL预冷的甲醇以在冰上提取小分子代谢物。反应混合物在4℃以20,000g离心5分钟。然后取出400μL上清液与600μL蒸馏水混合，制成1mL最终样品体积，用于通过LC-MS测量[D9]-棕榈酰-肉毒碱。LC-MS系统由带有安捷伦色谱柱的AB SCIEX 5500三重四极杆质谱仪和 SHIMADZU DGU-20A液相色谱仪组成。缓冲液梯度为100％-0％缓冲液A(100％水， 0.1％甲酸)和0％-100％缓冲液B(100％乙腈，0.1％甲酸)，10分钟。通过比较[D9]-棕榈酰-肉毒碱和[D3]-棕榈酰-肉碱的峰面积来计算[D9]-棕榈酰-肉毒碱的绝对浓度。在有或没有100μM丙二酰辅酶A处理的同时制备两个反应，并且将CPT1A的活性计算为有和无丙二酰辅酶A处理之间[D9]-棕榈酰-肉碱的差异。

为了测试原代肝细胞中的CPT1A活性，将肝细胞在含有0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的PBS中在冰上裂解，并将裂解物调整至2mg/mL。通过向100μL 反应缓冲液中加入10μL裂解物开始酶促反应，并在37℃温育10分钟。

为了从线粒体测试CPT1A活性，线粒体通过用于培养细胞的线粒体分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)分离。然后将线粒体在含有0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich) 的PBS中在冰上裂解，然后将裂解物调整至0.2mg/mL。如上所述，使用10μL线粒体裂解物来测定CPT1A活性。

为了测试来自小鼠肝脏的CPT1A活性，将组织用0.1％的Triton X-100均质化以获得2mg/mL的裂解物。如上所述，使用10μL肝裂解物来测定CPT1A活性。

为了测试来自大肠杆菌的重组CPT1活性，如上所述使用10μL(通过含有0.1％triton-100的50mL PBS溶解的1L大肠杆菌培养物)过表达每种CPT1构建体的大肠杆菌裂解物来测定CPT1活性，作为计算CPT1活性的对照，进行[D9]-棕榈酰-肉毒碱的测量而没有丙二酰辅酶A处理。

SILAC-ABPP

SILAC ABPP实验是根据先前报道(Martin BR et al.,(2011)Nature methods 9(1):84-89；Weerapana E et al.,(2007)Nature protocols 2(6):1414-1425)的方案改编进行的。 Hela细胞在含有10％SILAC FBS(赛默飞世尔科技)、1％青霉素-链霉素(赛默飞世尔科技) 和100μg/mL[13C6,15N4]L-精氨酸-HCl和[13C6,15N2]L-赖氨酸-HCl(CambridgeIsotope Laboratory)或L-精氨酸-HCl和L-赖氨酸-HCl(Sigma-Aldrich)的SILAC DMEM(Thermo Fisher Scientific)中传代。在ABPP实验前，将细胞血清饥饿24小时并用 1mM游离脂肪酸处理24小时以诱导脂滴积聚。收获细胞并在-80℃下保存用于进一步实验。

将冷冻的细胞沉淀重悬于含有0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的PBS中，超声处理并通过以100,000g超速离心45分钟而分离成可溶和不溶部分。使用BCA蛋白质测定法(Pierce TM BCA蛋白质测定试剂盒，Thermo Fisher Scientific)在酶标仪(Bio-Rad)上测定可溶性蛋白质浓度。将裂解物调整至2mg/mL并用2mM黄芩苷(10μL在DMSO中的200mM储备液)或DMSO处理，用200μM黄芩苷探针(10μL在DMSO中的20mM储备液)或DMSO标记，并且然后在365nm的紫外辐射下放置在冰上1小时。轻和重探针标记的蛋白质组以1:1的比例均匀混合并立即用氯仿-甲醇沉淀。然后将沉淀用1.2％ SDS/PBS再悬浮并与300μM生物素-叠氮化物、100μM TBTA、1mM TCEP和1mM CuSO₄合并1小时。此反应后，再次用氯仿-甲醇萃取蛋白质组以除去多余的试剂。将蛋白质中间相用冷甲醇洗涤，用1.2％SDS/PBS溶解并用PBS稀释5倍。将溶解的蛋白质与链霉抗生物素蛋白珠(100μL，赛默飞世尔科技)在室温下旋转孵育3小时。然后将珠用5mL PBS洗涤三次，再用5mL水洗涤三次，然后转移到螺旋式Eppendorf管中。将富集的蛋白质在6M尿素/PBS中变性，用10mM二硫苏糖醇(DTT，J&KScientific)在65℃下还原15分钟，并在35℃在黑暗中用20mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)封闭30分钟搅动。反应物用950μL的PBS稀释并在1400g下离心3分钟。除去上清液。然后向珠中加入200μL 的2M尿素/PBS，2μL的100mM氯化钙水溶液和4μL的胰蛋白酶(在40μL的胰蛋白酶 (Promega)缓冲液中重构的20μg)的预混合溶液，并在37℃搅拌过夜。第二天，将混合物转移至Bio-spin过滤器(Bio-Rad)中，并通过离心(1000g)将消化的溶液洗脱至低粘附性管中。洗脱液用5％甲酸酸化。

如图3C所示，进行了一系列使用黄芩苷探针的SILAC-ABPP实验，其中有或没有天然黄芩苷化合物的竞争。简言之，总是用DMSO处理光蛋白质组，并用黄芩苷BP探针通过UV诱导的光交联进行标记，然后与如下所述处理的重蛋白质组混合。在“BP 对照”实验中，用DMSO处理重蛋白质组并用UV辐射的空白DMSO溶液标记。在“UV 对照”实验中，重组蛋白质组用DMSO处理并用黄芩苷BP探针标记，但没有UV辐射。在“CP对照”实验中，用DMSO处理重质蛋白质组，并用紫外线辐射用黄芩苷CP探针标记(即不含二苯甲酮部分)。在“竞争”实验中，重度蛋白质组与黄芩苷竞争，并用黄芩苷BP探针用紫外线辐射进行标记。三个对照实验被设计为消除来自间接和/或非特异性结合探针的假阳性靶标。对每个对照和竞争实验进行三次重复。

竞争性ABPP-RD

将100μL含重组CPT1A的大肠杆菌裂解物(3mg/mL，在100mM TEAB缓冲液中) 分别与黄芩苷或DMSO温育，并用200μM黄芩苷BP探针进行光标记。标记的蛋白质组用氯仿-甲醇提取，用冷甲醇洗涤，然后用100μL 1.2％SDS/TEAB溶解。将10μL探针标记的裂解物与30μL8μM尿素/TEAB混合，在10分钟时由10mM DTT(J&K Scientific)还原15分钟并用20mM碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)在35℃在黑暗中封闭30分钟。将反应混合物稀释至2M尿素/TEAB并在37℃搅拌下用0.4μg胰蛋白酶消化过夜。消化的样品用C18离心柱(Thermo FisherScientific)脱盐并通过真空离心(1500rpm，室温)干燥。将干燥的样品重新溶解于100μL的100mM TEAB中，并如先前报道的那样进行还原性二甲基化(Boersema PJ et al.,(2009)Nature protocols 4(4):484-494.)。简言之，将8μL的4％ (v/v)CH₂O或13CD₂O(Sigma-Aldrich)分别加入DMSO处理和黄芩苷处理的样品中，并且在室温下用8μL的0.6MNaBH₃CN还原1小时。反应用32μL1％(v/v)氨溶液和16μL 甲酸淬灭。将这对轻重样品合并，脱盐并通过真空离心干燥。最后，将干燥的样品重新溶解在20μL缓冲液A(95％水，5％乙腈，0.1％甲酸)中进行LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS分析

LC-MS/MS分析是在偶联Ultimate 3000LC系统的Q-Exactive Orbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上使用已发布的方案(5)进行的。简言之，通过柱的流速设定为 0.3μL/min，并且施加的远端喷雾电压设定为2.8kV。使用一次全扫描(350-1,800MW)，随后通过启用动态排除对20个丰度最高的离子的数据依赖性MS2扫描，进行MS2数据收集。

MS数据分析

使用ProLuCID用甲硫氨酸的可变修饰(15.9949Da)，半胱氨酸的静态修饰(57.0215Da)和完整的胰蛋白酶特异性进行肽搜索。数据通过DTASelect 2.0.47进一步过滤，错误发现率为1％。

如前所述(Benjamin DI et al.,(2012)Cell metabolism 16(5):565-577.)，使用内部软件 CIMAGE对SILAC-ABPP比率进行量化，稍作修改。仅在轻样品而不是重样品中检测到色谱峰的肽被指定阈值比率15以反映特异性富集。仅选择在全部三个重复中平均SILAC比率(轻/重)大于4.0的定量的蛋白质用于进一步的GO分析。

对于竞争性ABPP-RD，同位素二甲基化(对于轻和重标记分别为28.0313和34.0631Da)被设定为肽和赖氨酸的N-末端上的可变修饰。定量由CIMAGE完成。

CPT1表达质粒的克隆

人CPT1A有两种同种型，残基1至773的同种型1和残基1至756的同种型2。同种型1和同种型2之间的差异从残基746开始至C末端。为了克隆较长的同种型1，我们首先从其cDNA中克隆同种型2的序列，并通过使用桥式PCR将其与同种型1的合成核苷酸序列2236-2319组合。然后，我们将同种型1的完整序列克隆到pQLinkMx 载体中EcoRI和NotI位点之间以获得表达质粒。

将人CPT1B(hCPT1B)、人CPT1C(hCPT1C)或线虫CPT1(ceCPT1)的全长DNA序列克隆到pQLinkMx载体中的SacI和NotI位点之间。小鼠CPT1A(mCPT1A)的全长DNA 序列克隆在EcoR I和Not I位点之间。

根据Zheng L et al.,(2004)Nucleic acids research 32(14):e115，通过PCR产生人CPT1 突变体和小鼠CPT1突变体。通过DNA测序检查所有构建体。

还制备hCPT1A构建体用于在Hela细胞中过表达。将野生型hCPT1A的序列克隆到pCLHCY载体中。以与上述相同的方式产生每个破坏性突变，包括L286W、I291F、 E309Y和H327E。所有构建体均通过测序验证。

CPT1在大肠杆菌中的重组表达

表达质粒首先转化到大肠杆菌BL21中。在37℃下使细胞生长(3L瓶中的1L培养基)至600nm处的吸光度0.8-1.0，并通过0.5mM IPTG诱导20小时。通过在含有0.1％ TritonX-100(Sigma-Aldrich)和1mM PSMF(AMRESCO)的PBS缓冲液中在800巴高压均化3分钟使细胞裂解。将该混合物在21,500rpm下离心1小时。通过10％SDS-PAGE分析沉淀和上清液中CPT1的丰度。

动物实验

所有的动物手术均按照中国北京大学动物研究委员会批准的方案进行，符合“实验动物护理和使用指南”(NIH出版物第86-23号，1985年修订)。所有的小鼠(C57BL/6j，Charles River，中国北京)都在北京大学实验动物中心(AAALAC认可的实验动物设施) 在温度控制的屏障设施中12小时光照/黑暗循环保持，并且自由获得食物和水。本研究仅使用雄性动物。研究根据体重分层随机分组。选择每组五只小鼠以达到统计学显著性。该研究采用了随机、对比和单盲测试。对于野生型同窝出生者，在6周龄时开始进行高脂肪饮食(60％的卡路里来自脂肪，Research Diets Inc.)或chow饮食(10％卡路里来自脂肪，Research Diets Inc.)的饮食干预，并保持24周。在12周的饮食干预后开始每日灌胃400mg/kg黄芩苷(40mg/mL生理盐水)并且维持另外12周，然后分析这些小鼠的代谢变化和脂肪变性相关症状。

CPT1A的肝脏特异性敲低

使用BLOCK-iT^TMRNAi Designer(http://rnaidesigner.invitrogen.Com/rnaiexpress/)筛选靶向CPT1A全基因组的shRNA。根据起始位置和分级，选择靶序列(GGAGACAGACACCATCCAACA)构建慢病毒shRNA，并使用U6启动子后的XhoI和 HpaI限制性位点将shRNA插入到第三代lenti骨架pLL3.7(#cat：Addgene)。用包装质粒(pMDLg/pRRE，CMV-VSVG和RSV-Rev)将正向纯化的慢病毒shRNA表达质粒或空质粒(作为阴性对照)分别转染到HEK 293T细胞中以产生慢病毒。转染48小时后，收获病毒上清液，超速离心，重悬于PBS中并储存于-80℃直至使用。通过连续稀释浓缩的慢病毒感染HEK293T细胞确定的病毒滴度大约为6×10⁸IFU/mL。每四周一次，通过尾静脉将病毒注射到动物体内。

肝脏特异性过表达CPT1A

Adeno相关病毒(AAV)递送系统用于在小鼠肝脏中过表达Cpt1a(AAV2/8-Tbg-Cpt1a) 和Cpt1a H327E(AAV2/8-Tbg-Cpt1a H327E)，AAV2/8-Tbg-GFP用作对照。将Cpt1a和Cpt1a H327E的靶序列分别在Tbg启动子后的NotI和BamHI限制性位点之间插入AAV 主链。通过在HEK 293T细胞中转染三种质粒(含有Cpt1a或Cpt1a H327E的pAAV， pAAV2/8-反式质粒和辅助质粒)产生AAV2/8载体。用载体特异性引物通过qPCR测量载体基因组的滴度。通过尾静脉向小鼠注射100μL含有10¹¹AAV2/8载体基因组的病毒。

原代肝细胞分离和培养。

使用胶原酶灌注法从6-8周龄雄性小鼠的肝脏分离原代肝细胞。简言之，在通过灌注胶原酶IV型溶液(#cat：17104019，Invitrogen)消化组织后，解剖肝脏，切碎并通过 70μm细胞过滤器(#cat：352350，Falcon)过滤。将混合物在50g下离心以收集肝细胞(沉淀)。将重悬的肝细胞接种在含有10％FBS和1％青霉素-链霉素(PS)的DMEM平板上。

组织学分析

将从每只动物的相同叶切取的肝样品在室温下在4％多聚甲醛中固定过夜，通过乙醇梯度脱水，渗入二甲苯并包埋在石蜡中。用石蜡包埋的组织制备5μm厚的连续切片用于苏木精和曙红(H&E)染色。取自每只动物同一叶的另一组肝脏样品在液氮中快速冷冻并储存于-80℃。将冷冻样品包埋于并进行冷冻切片(10μm厚)以进行油红O染色。

生化指标和代谢率测量

用全自动生化分析仪(Roche，Cobas 4000)测定血清AST、ALT、TG、CHOL、LDL、 HDL、APOE、TNT和GLU。对于肝甘油三酯和胆固醇的测量，组通过将0.2g生肝组织在氯仿：甲醇(2:1，v/v)中匀浆制备织提取物。

对于GTTs，将小鼠禁食过夜16小时，然后腹膜内(i.p.)用D-葡萄糖(2g/kg体重)注射。对于ITTs，小鼠喂食并腹腔注射牛胰岛素(0.75U/kg体重，Sigma-Aldrich)。在注射之前和之后从尾静脉收集血液样品。用AccuCheck血糖仪(Roche)测量葡萄糖浓度。

为了测量食物摄入量、走动活动和其他代谢参数，小鼠分别在12小时光照/黑暗周期下饲养。使用全面的动物代谢监测系统(CLAMS；Columbus Instruments)来连续评估氧气消耗(VO₂)和二氧化碳产生(VCO₂)。能量消耗使用以下公式计算：能量消耗＝(3.815+1.232VO₂/VCO₂)/VO₂；呼吸交换率(RER)＝VCO₂/VO₂。

计算机建模

CPT1A的同源性模型(不包括N-末端跨膜结构域中的残基1-149)在Robetta结构预测服务器上自动建立。使用fpocket程序预测蛋白质内潜在的结合口袋。使用从竞争性ABPP-RD实验获得的信息作为约束条件，使用Autodock Vina程序将黄芩苷预先对接到CPT1A中的结合口袋中。为了引入骨架灵活性，使用Rosetta配体对接方案进一步优化了对接模型。为了验证该模型，根据以下两个标准，通过在Rosetta中使用单点饱和诱变扫描方案获得四个“破坏性”突变：每个突变体应该1)保持与野生型相似的结构稳定性(能量差<3.0Rosetta能量单位(REU))和2)使CPT1A和黄芩苷之间的相互作用不稳定(能量增加>3.0REU)。这四种突变体的Rosetta能量分数可以在图11找到。

蛋白质印迹

CPT1A抗体购自Abcam(#cat：ab128568)，β-肌动蛋白购自TransGen Biotech(#cat： HC201-02)。将组织或细胞在含有0.1％Triton X-100的PBS缓冲液中在冰上裂解30分钟。多次短脉冲超声后，将裂解物离心并调整至1mg/mL。通过10％SDS-PAGE凝胶分离15μg裂解物，并对CPT1A进行免疫印迹。

热漂移测定

如先前所述(Savitski MM,et al.(2014)Science 346(6205):1255784；MartinezMolina D, et al.(2013)Science 341(6141):84-87)所述进行热漂移测定。对于温度依赖性热漂移测定，将来自脂肪变性HeLa细胞或过表达CPT1A的大肠杆菌的50μL裂解物(3mg/mL)与 100μM黄芩苷在36至76℃的每个温度点温育4分钟。将样品在4℃以20,000g离心10分钟以分离上清液和沉淀。将12μL上清液与3μL 5x上样缓冲液混合，然后在10％ SDS-PAGE上分离以进行CPT1A的免疫印迹分析。

对于剂量依赖性热漂移测定，将50μL裂解物(3mg/mL)与各种浓度的黄芩苷(0至1000μM)在52℃下温育4分钟。如上所述通过离心分离上清液并进行CPT1A的免疫印迹分析。

统计

使用SPSS(IBM)分别通过Kolmogorov-Smirnov检验和Levene检验测试数据的正态性和方差齐性。当比较三个或更多的均值的统计学显著性，进行单因素或双向ANOVA，处理或表型作为独立因素。当检测两组测量值的统计学显著性时，进行双侧Student's t- 检验。P值<0.05被认为是统计学显著的。除非另有说明，否则所有数据均以均值±标准差表示。

实施例1、黄芩苷可以降低高脂处理细胞中的脂质积累。

本实施例评估了黄芩苷降低哺乳动物细胞系中脂质积累的能力。

HeLa细胞用1mM的油酸和棕榈酸(2:1摩尔比)处理以诱导脂滴的沉积。然后在存在过量的游离脂肪酸的情况下用一系列浓度的黄芩苷处理这些“脂肪变性”细胞24小时。通过油红O(ORO)对细胞进行染色，并且通过DMSO提取的ORO染料的强度来定量脂质积聚的程度。在浓度低至12.5μM时，黄芩苷能够显著降低脂滴的细胞积累，并且在高达400μM的浓度下保持其强抗脂肪变性作用，此时约80％的细胞仍然存活(图 1B)。100μM的黄芩苷处理已经可以将细胞脂质的量减少约50％(图1C)。ORO染色的细胞直接成像和定量都获得了类似的结果(图1D)。此外，通过受激拉曼散射(SRS)显微镜观察了这些细胞中的脂质含量。黄芩苷处理细胞中SRS信号的显著降低证实了黄芩苷的抗脂肪变性活性(图1E)。

此外，从小鼠肝脏中分离肝细胞，并用ORO染色证实黄芩苷在原代细胞中也具有降低脂质积累的类似活性(图2A)。

实施例2、通过SILAC-ABPP进行黄芩苷的靶分析

本实施例采用基于活性的蛋白质分析(Activity-Based Protein Profiling,ABPP)来鉴定蛋白质组中与黄芩苷直接相互作用的蛋白质靶标。

基于ABPP的化学蛋白质组学策略能够发现功能未注释的酶和生物活性小分子的蛋白靶标。特别是，该策略与细胞培养中氨基酸稳定同位素标记(Stable IsotopeLabeling by Amino acids in Cell culture,SILAC)的结合(SILAC-ABPP)使得可以直接在天然生物系统中直接鉴定被特定修饰的蛋白质靶标。

鉴于黄芩苷不含任何可以共价修饰蛋白质的明显反应性部分，发明人设计并合成了含有二苯甲酮光交联基团和炔基报道基团的光亲和性黄芩苷探针(图3A，图4A)。两个官能团都使用最近开发的“光点击”反应在羧酸基团上引入。

尽管有相当多的结构改变，本发明的黄芩苷探针能够像天然化合物一样有效地保留降低脂质积累的能力(图3B)。当使用探针(200μM)在凝胶内荧光测定中标记蛋白质组时，黄芩苷(400μM)的共处理能够与探针标记(图4B)竞争，证明探针与黄芩苷结合类似的靶蛋白。

为了鉴定这些靶蛋白，使用黄芩苷探针进行了一系列有或没有天然黄芩苷化合物竞争的SILAC-ABPP实验(图3C)。简而言之，首先从“轻”和“重”脂肪变性HeLa细胞裂解的蛋白质组分别与DMSO或黄芩苷(1mM)孵育15分钟，然后通过UV诱导的光交联用黄芩苷探针(200μM)标记。将探针标记的“轻”和“重”蛋白质组混合，与叠氮化物-生物素缀合，在链霉抗生物素蛋白珠上富集，最后进行胰蛋白酶消化。通过LC-MS/MS 分析消化的肽以鉴定被黄芩苷探针捕获的蛋白质。每种蛋白质的定量SILAC比率(轻或重)反映了天然黄芩苷化合物的竞争程度，较大的比例对应于更大的竞争。除了“竞争” 实验外，还进行了三组对照实验(“BP对照”，“CP对照”和“UV对照”)，以消除间接和/或非特异性结合探针(图3C)。对每个对照和竞争实验进行三次重复。

在所有对照和竞争实验中对平均SILAC比率应用4.0的截断值后，总共鉴定出142种蛋白质作为特异性结合黄芩苷的潜在靶标(图3D)。

实施例3、黄芩苷靶向脂肪酸氧化中的关键酶

对这142种蛋白质相关途径的基因本体论分析揭示排名最高的功能簇为“脂肪酸降解”，其包括七种酶(图3E)。使用RNA干扰(RNAi)瞬时敲低这些酶中的每一种(图5)，观察到敲低直接参与脂肪酸β氧化的限速酶肉碱棕榈酰转移酶1的肝脏同种型(CPT1A) 完全消除了黄芩苷的抗脂肪变性作用(图3F)。一致地，与内源性CPT1A抑制剂丙二酰辅酶A共同处理也显著损害黄芩苷的抗脂肪变性作用(图3G)。这些结果共同表明，由 CPT1A控制的FAO负责黄芩苷的抗脂肪变性作用。由于脂肪变性是由于脂质代谢失衡- 脂质生物合成过量和/或脂肪消耗不足造成的，还进行了黄芩苷处理细胞的转录组分析，发现在与各种脂质代谢途径相关的酶的转录水平上没有显著变化，包括CPT1A(图6)。因此，在FAO中，黄芩苷可能通过直接激活CPT1A来加速脂类消耗，从而发挥其抗脂肪变性作用。

实施例4、黄芩苷直接激活CPT1A

为了测试黄芩苷是否能够直接激活CPT1A，首先建立了定量酶测定来测量CPT1A活性，其使用[D9]-肉碱和棕榈酰辅酶A作为底物并检测[D9]-棕榈酰肉碱的产生。在该测定中，与来自DMSO处理的细胞(图7A)相比，来自黄芩苷处理(100μM，24小时)的 HeLa细胞的裂解物显示出CPT1A活性增加3倍。免疫印迹分析证实，与未处理的细胞相比，黄芩苷处理不干扰CPT1A的蛋白质水平(图7B)。向细胞裂解物中直接加入黄芩苷(100μM)导致CPT1A活性增加大约7倍(图7C)。此外，用100μM黄芩苷处理分离的线粒体提取物导致CPT1A活性的类似刺激(图7D)，这与CPT1A的线粒体定位一致。类似的CPT1A激活作用也可以在原代肝细胞中观察到(图2B)。在大肠杆菌中重组过表达 CPT1A，观察到用100μM黄芩苷处理的大肠杆菌裂解物的CPT1A活性增加>3倍，而背景CPT1A活性可忽略不计(图7E)。黄芩苷对CPT1A的激活是剂量依赖性的，因为当裂解物用高达800μM的黄芩苷处理时，观察到活性增加>60倍(图8)。还重组过表达了小鼠的CPT1A和秀丽隐杆线虫的CPT1，并证明黄芩苷能够激活这些直系同源物，尽管程度较低(图7F和7G)。有趣的是，黄芩苷不能激活CPT1B和CPT1C，另外两种人CPT1 的同种型(图7H和7I)。这些数据共同表明黄芩苷以特定的同种型选择性直接激活CPT1A。

实施例5、黄芩苷激活CPT1A的结构模型

本实施例提供了CPT1A和黄芩苷之间相互作用的生物物理分析。由于无法获得具有酶活性的纯化CPT1A，采取了其他替代方法直接在细胞裂解物中分析蛋白质-黄芩苷相互作用。

温度和剂量依赖性细胞热漂移测定均表明，黄芩苷影响CPT1A的热稳定性(图9A和9B)，表明CPT1A和黄芩苷之间存在直接相互作用。接下来使用黄芩苷探针通过竞争性ABPP-还原二甲基化(ABPP-RD)实验(图10A)定位其在CPT1A上的潜在结合位点。基于其探针标记是否对黄芩苷处理敏感的CPT1A肽(图9C和10B)，使用Rosetta软件套件通过同源建模和配体对接构建CPT1A-黄芩苷复合物模型(图9D)。在对接模型的指导下，在复合物界面设计了CPT1A中的四个突变(L286W、I291F、E309Y和H327E)，这些突变被预测为保持CPT1A的结构完整性但破坏黄芩苷的结合(图11A)。确认黄芩苷探针对所有四种破坏性突变体的标记都大大降低(图9E和图11B)。测试了它们在体外在黄芩苷处理后的酶活性，发现它们都显著丧失了由黄芩苷的激活能力(图9F)。

为了进一步验证CPT1在介导黄芩苷抗脂肪变性活性中的作用，在通过RNAi敲低内源性CPT1A表达后的HeLa细胞中过表达野生型CPT1A或四种突变体中的每一种(图 12A)，并评估黄芩苷对它们的抗脂肪变性活性。只有过表达野生型CPT1A才能拯救黄芩苷在细胞中造成的脂质积聚减少的表型(图9G)，并且黄芩苷处理后抗脂肪变性响应与总体CPT1A酶活性密切相关(图9H)。

实施例6、黄芩苷改善小鼠中饮食诱导的肥胖症和相关的代谢紊乱

本实施例调查了黄芩苷在饮食诱导的肥胖症(DIO)动物模型中的作用。

给小鼠喂高脂肪饮食12周诱发肥胖和肝脂肪变性，然后用黄芩苷(400mg/kg，每天) 再灌胃12周，高脂饮食不变。根据先前的药代动力学研究选择剂量，该研究在摄入后6小时内测量黄芩苷的最终血浆浓度为0.8μg/ml(Cai Y,et al.(2016)J.Chromatogr.BAnalyt.Technol.Biomed.Life.Sci.1026:124-133)。DIO小鼠在12周后的体重(42±4.7g)显著高于正常食物(30±1.7g)(图13A)。随后的黄芩苷处理导致全身重量显著降低(图13A)，降低的体脂百分比(图13B)，改善的胰岛素敏感性以及改善的高脂血症和高血糖 (图14)。在不影响食物摄入量的情况下(图13C)，黄芩苷治疗增加了DIO小鼠的能量消耗(图13D)，而改变的呼吸交换比率(RER)表明这些小鼠使用更多的脂肪作为能量来源 (图13E)。

对肝组织的分析表明，黄芩苷处理有效地减少了DIO小鼠中肝脏的尺寸和重量(图13F和13G)以及肝脂质积聚(图13H和13I)。此外，组织匀浆和血液样品的定量分析表明，黄芩苷可以显著降低DIO小鼠肝脏甘油三酯和胆固醇水平(图13J)并改善肝功能(图 14B)。值得注意的是，虽然黄芩苷可改善DIO小鼠的肝脂肪变性，但对瘦小鼠没有明显的不良影响，如体重减轻、食欲不振和肝毒性(图13A，13C和14B)，表明其可以安全地用于治疗肝脂肪变性和肥胖症。

测量了匀浆的肝裂解物中的CPT1A活性，发现黄芩苷处理导致CPT1A活性增加>2倍(图13K)，而蛋白质丰度或丙二酰辅酶A水平几乎没有变化(图16)。与激活的FAO一致，非酯化脂肪酸(NEFA)的血浆水平下降，总酮体(TKB)的血浆水平升高(图13L)。

实施例7、CPT1A的激活对黄芩苷的抗肥胖症作用至关重要

为了证实CPT1A激活在介导黄芩苷抗肥胖作用中的作用，在DIO小鼠模型中测试黄芩苷不敏感突变体。

首先在小鼠酶中检测了四种黄芩苷不敏感突变，因为它们是基于来自人类直系同源物的对接模型而设计的。体外CPT1A测定显示H327E保持其对黄芩苷激活的抗性(图19A)。与之一致，人和小鼠CPT1A的序列比对显示在四个突变位点中H327是保守的(图 17)。热漂移测定也证实小鼠CPT1A的H327E突变体不再被黄芩苷结合(图19B和19C)。

使用shRNA干扰敲除DIO小鼠肝脏CPT1A的表达，然后通过腺伴随病毒介导的转染用野生型CPT1A或H327E突变体的过表达进行拯救。与在细胞模型中的观察一致，只有野生型CPT1A而不是黄芩苷不敏感突变体H327E能够改善DIO小鼠中与肥胖相关的代谢症状，包括体重(图19D)和体脂百分比(图19E)减少，肝脏尺寸、体重和脂质沉积减少(图19F和19G)，肝脏中TG和CHOL水平降低(图19H)，血浆中NEFA降低和 TKB水平增加(图19I)以及改变的代谢速率(图19J和19K)。此外，黄芩苷改善胰岛素敏感性、高脂血症和高血糖症，其依赖于野生型CPT1A而不是黄芩苷不敏感性突变体 H327E(图20)。进一步实验证实，“拯救”效应不是由于野生型和突变体CPT1A的不同表达水平(图12B)，而是与CPT1A在黄芩苷处理后的总体酶活性相关(图19L)。这些数据共同支持CPT1与黄芩苷之间的直接相互作用负责介导黄芩苷的抗肥胖和抗脂肪变性活性。

讨论

本发明令人惊奇地发现，黄芩苷能够与FAO中的限速酶CPT1A直接相互作用而激活CPT1A，从而产生显著的抗脂肪变性作用。本发明还令人惊奇地发现，黄芩苷能够选择性作用于CPT1A而不是另外两种同种型CPT1B和CPT1C，因此可以用于特异性促进肝脏中的FAO。

本发明发现，高剂量(400mg/kg)黄芩苷的长期治疗(小鼠中每日施用长达12周以上) 不仅通过激活CPT1而改善了饮食诱导的肥胖症和肝脂肪变性，改善了DIO小鼠中的相关代谢综合征，包括胰岛素抵抗、高血糖症、高脂血症和受损肝功能等，而且没有观察到明显的副作用。黄芩苷可能成为预防和治疗饮食诱发的肥胖症和相关代谢紊乱的理想候选药物。

Claims

1.黄芩苷或其衍生物或其盐作为肉碱棕榈酰基转移酶1(CPT1)激活剂的用途。

2.一种筛选CPT1激活剂的方法，所述方法包括：

(a)获得候选化合物的空间结构和CPT1的空间结构模型；

(b)使候选化合物的空间结构与CPT1的空间结构模型对接；

(d)进一步验证步骤(c)中鉴定的候选化合物对CPT1的激活作用。

3.权利要求2的方法，在步骤(a)中通过同源建模获得CPT1的空间结构模型。

4.权利要求2的方法，在步骤(c)中鉴定能够与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327中的一个或多个相互作用的候选化合物。

5.权利要求2的方法，在步骤(c)中鉴定能够与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327相互作用的候选化合物。

6.一种CPT1激活剂，所述激活剂能够与CPT1中第286位、第291位、第309位和第327位氨基酸中的一或多个相互作用，由此增加CPT1的活性，所述氨基酸位置参考SEQ ID NO:1。

7.权利要求6的CPT1激活剂，所述CPT1激活剂与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327中的一个或多个相互作用。

8.权利要求6的CPT1激活剂，所述CPT1激活剂与人CPT1A的氨基酸L286、I291、E309和H327相互作用。

9.权利要求6的CPT1激活剂，所述激活剂通过权利要求2-5中任一项的方法筛选获得。

10.黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂在制备用于增强CPT1的活性，例如用于增强对象体内的CPT1活性的组合物中的用途。

11.一种包含黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂作为活性成分的组合物，其用于增强CPT1的活性，例如用于增强对象体内的CPT1活性。

12.一种增强CPT1的活性的方法，所述方法包括使CPT1与黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂或权利要求11的组合物相接触。

13.一种增强样品中CPT1的活性的方法，所述方法包括使所述样品与黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂或权利要求11的组合物相接触。

14.权利要求13的方法，所述样品是包含CPT1的细胞裂解物，或者，所述样品是表达CPT1的细胞或细胞培养物。

15.一种增强对象体内的CPT1的活性的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂或权利要求11的组合物。

16.一种通过增强对象体内CPT1的活性来增加对象中脂肪消耗的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂或权利要求11的组合物。

17.一种通过增强对象体内CPT1的活性来减少对象体重的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂或权利要求11的组合物。

18.一种在对象中通过增强CPT1的活性而预防和/或治疗脂肪代谢相关疾病的方法，所述方法包括给所述对象施用有效量的黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂或权利要求11的组合物。

19.黄芩苷或其衍生物或其盐，或权利要求6-9中任一项的CPT1激活剂或权利要求11的组合物在制备用于在对象中通过增强CPT1的活性而预防和/或治疗脂肪代谢相关疾病的药物中的用途。

20.权利要求18的方法或权利要求19的用途，所述脂肪代谢相关疾病选自肝脂肪变性(例如非酒精性脂肪肝)、2型糖尿病、肥胖症(例如饮食诱导的肥胖症)、高血糖症、高血脂症、冠心病、高胰岛素血症、高尿酸血症、高血压、胰岛素抵抗。

21.前述权利要求中任一项的用途、组合物或方法，其中所述对象包括哺乳动物例如小鼠或人，优选是人，优选地所述对象具有高脂饮食。

22.一种鉴定生物学样品中与黄芩苷相互作用的蛋白质的方法，所述方法包括使用下式II所示的黄芩苷探针捕获所述生物学样品中与黄芩苷相互作用的蛋白质

23.权利要求22的方法，其中通过定量化学蛋白质组学分析所捕获的蛋白质，鉴定与黄芩苷相互作用的蛋白质。