TW201708239A

TW201708239A - 經取代的氨基酸硫酯類化合物、其組合物及應用

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Publication number: TW201708239A
Application number: TW104128088A
Authority: TW
Inventors: yong-gang Wei; Yan Yu; Guan-Peng Qiu; Bo-Lin Lei; Guo-Zhi Zhu; yong-hua Lu
Original assignee: Sichuan Haisco Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2015-08-27
Publication date: 2017-03-01
Also published as: TWI616453B

Abstract

本發明關於一種通式(A)所示的取代的氨基酸硫酯類化合物、其組合物及應用，通式(A)中的各取代基的定義與說明書中的定義相同。 □

Description

經取代的氨基酸硫酯類化合物、其組合物及應用

本發明關於一種取代的氨基酸硫酯類化合物、其組合物及應用，具體的說，本發明關於一種通式(I)所示的取代的氨基酸硫酯類化合物、其立體異構體或藥學上可以接受的鹽以及含有它們的藥物組合物以及在製備治療病毒感染性疾病中的藥物中的用途。

乙肝是世界性的疾病之一，它由乙肝病毒引起。世界上有三分之一的人口均在某種程度上感染了乙肝病毒，其中包括3億5千萬慢性攜帶者。在一些亞洲和非洲國家，乙肝已經變成流行性疾病，尤其是在中國。乙肝病毒能引起急性和慢性感染，急性感染通常伴隨著肝臟發炎，嘔吐，黃疸，極個別的還會引起死亡，而慢性感染有可能誘發肝硬化及肝癌。目前雖然可以通過疫苗預防乙肝病毒感染，但仍無有效的方法治療慢性乙肝疾病。

乙肝病毒是一種嗜肝性的脫氧核糖核酸(DNA)病毒，具有環狀的部分雙鏈DNA基因組。較短的一條鏈有1700到2800個核苷酸，較長的一條鏈有3020到3320個核苷酸，而這條長鏈則編碼病毒的DNA聚合酶。乙肝病毒的基因組編碼了四個已知基因--C、X、P和S。基因C編碼核蛋白(HBcAg)，基因S編碼表面抗原(HBsAg)，基因P則編碼DNA聚合酶，而基因X 編碼的蛋白功能尚不清楚，但是它被認為與肝癌的發生有關，因為它活化了誘導細胞增值的基因，並且讓生長調節因子去活化。

乙肝病毒的生命週期複雜，是通過未知受體和內吞作用進入細胞，其基因組被宿主蛋白chaperones轉移到細胞核。在細胞核裡，乙肝病毒通過宿主細胞的DNA聚合酶將部分雙鏈DNA轉化為完整的雙鏈DNA，並且將形態改變為通過共價鍵結合的環狀DNA(cccDNA)。cccDNA作為模板，轉錄四個病毒mRNA。這四個轉錄子作為模板，被轉運進細胞質，被翻譯成病毒的膜蛋白，核蛋白及DNA聚合酶。最長的mRNA(3.5kb，長於病毒基因組)作為模板複製新的基因組拷貝，轉錄核衣殼蛋白及病毒DNA聚合酶。同時，這個3.5kb長的RNA將逆轉錄出乙肝病毒DNA的反義鏈，隨後完成病毒正義鏈。雙鏈DNA會作為新的子病毒輸出或者重新回到細胞核形成新的cccDNA。

乙肝病毒RNA和DNA的合成依賴於乙肝病毒DNA聚合酶，乙肝病毒DNA聚合酶對於病毒的複製是必須的。該聚合酶有四個結構域：對於乙肝病毒複製的開始及核衣殼的裝配很重要的末端蛋白、間隔蛋白、逆轉錄酶及用於降解前基因組RNA模板的RNaseH結構域。儘管如此，缺乏校對功能導致了乙肝病毒DNA聚合酶的高突變率。

利用DNA聚合酶抑制劑來做為抗乙肝病毒藥物已經稱為一個頗具吸引力的選擇。特殊的病毒聚合酶抑制劑屬核苷類似物家族。對於慢性乙肝病人的治療由於口服抗乙肝病毒核苷類似物藥物而得到了改善。在血清中，核苷類似物能迅速將乙肝病毒DNA降至不可測的水平，並且起效機製明確：核苷類似物競爭性抑制了病毒DNA聚合酶的活性。同時，與干擾素IFN-α相比，核苷類似物表現出良好的耐受性及更小的不良反應。到目前為止，有五種核苷類似物乙肝病毒DNA聚合酶抑制劑作為治療慢性乙肝的藥物，在美國及歐洲上市，包括：拉米夫定(lamivudine)、替諾福韋酯(adefovir dipivoxil)、恩替卡韋(entecavir)、替比夫定(telbivudine)和替諾福韋酯富馬酸鹽(tenofovir disoproxil fumarate)，還有其他幾個藥物處於研發階段。同時，因為病毒在肝臟中殘留以及病毒聚合酶引起的突變(包括病毒聚合酶氨基酸的替換突變)，長期抗病毒治療可能會引起病毒的抗藥性和選擇性。這對於開發新型抗病毒藥物提出了要求。

替諾福韋(tenofovir)，化學名稱為[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基磷酸(PMPA)，是一種核苷酸類逆轉錄酶抑制劑，具有抗HBV和HIV；但是由於其含有磷酸基團，具有較大極性，生物膜穿透能力差，在生物體內生物利用度差等缺點。為了克服這一缺點，可製成膦酸酯或者膦醯胺前藥形式。2002年由吉利德公司研發上市的藥物Viread(富馬酸替諾福韋二吡呋酯)為PMPA的一種前藥方式，製備成膦酸酯的前藥形式大大提高了生物利用度。Viread在治療HIV和HBV方面發揮了重要的作用。關於替諾福韋前藥形式的改造成為了研究的熱點。

歐洲專利EP206459描述了包含替諾福韋結構的9-(磷酸甲氧基烷基)腺嘌呤衍生物，及其用於抗病毒藥的用途，其中R¹選擇氫、甲基、羥甲基，R²選自取代或未取代的亞乙基、亞甲基、亞丙基等。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構式如下：

EP481214描述了包含阿德福韋酯的新的口服磷酸酯核苷類似物前藥，及其抗病毒的醫藥用途，特別是抗RNA、DNA病毒，也可以用於治療腫瘤等，其中B選自嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、鳥嘧啶等，R³選自取代或未取代的C₁-C₂₀烷基，R¹、R²獨立的選自取代或未取代的氨基、OR⁴，R⁴選自CH₂C(O)N(R⁵)₂,CH₂C(O)OR⁵、CH2 OC(O)R⁵、CH(R⁵)OC(O)R⁵、CH₂C(R⁵)₂CH₂OH或CH₂OR⁵，R⁵選自未取代或被羥基、氧、硝基、鹵素取代的C₄-C₂₀烷基、芳基或芳基-烷基，R1、R2可以成環。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構如下：

WO0208241描述了包含替諾福韋酯結構的腺嘌呤衍生物，其中R¹選擇氫、甲基。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構式如下：

WO02057288描述了取代的氨基酸硫酯類化合物及其用於抗病毒藥的用途，其中Q選自嘌呤或嘧啶，R⁴、R⁵獨立的選自氫、烷基、芳基等，R¹、R²、R³、R⁷、R⁸獨立的選自羥基、鹵素、氫、氨基、烷基、烷氧基、烷基氨基等。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構式如下：

CN200410024276.X描述了9-((磷酸酯)甲氧基烷基)腺嘌呤衍生物及其用於抗病毒藥的用途，其中R¹、R²獨立的選自氫或取代的聯苯甲基。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構式如下：

CN200710041280.0描述了取代的氨基酸硫酯類化合物及其用於抗病毒藥的用途，其中R¹選自氫、鹵素、氨基、環丙基氨基、甲氧基、乙氧基等，R²選自氫或氨基，R⁵選自甲基或氫，R³、R⁴獨立的選自(取代的氨基羰基氧基)烷基。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構式如下：

CN200410088840.4描述了取代的氨基酸硫酯類化合物及其用於抗病毒藥的用途，其中R為氫或甲基，R²選自氫或樟腦醯基，R¹選自含3-8個碳的環烷基、3-8個碳的非飽和鏈烴基、3-8個碳的非飽和環烷基或6-10個碳的芳烴。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構式如下：

WO2011069322描述了取代的氨基酸硫酯類化合物及其用於治療和預防與病毒感染相關疾病的醫藥用途，其中R¹選自氫或甲基，R²選自-R³或-OR³，R³選自C_1-8烷基、C_3-8環烷基。不認為此專利中具體描述是本發明的一部分，其結構式如下：

本發明是在替諾福韋酯基礎上設計具有通式(I)所示的化合物，以提供一種結構新穎、藥效更好、更安全、毒副作用小、溶解性好或生物利用度高的取代的氨基酸硫酯類化合物、其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，可用於治療病毒感染性疾病，其中病毒感染性疾病包括乙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。

本發明提供一種通式(A)所示化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中：

A選自6至10員芳環或6至10員雜芳環，所述的雜芳基含有1至4個選自N、O、S的雜原子，所述的芳環或雜芳環任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基、三氟甲基、C_1-4烷氧基或-C(=O)OC_1-4烷基的取代基所取代；B為；E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-或-CH₂CH₂OCH₂-；R^N選自H或C_1-4烷基； R¹和R²各自獨立的選自H、C_1-6烷基或一種天然或可藥用氨基酸的側鏈，如果側鏈含有羧基，該羧基可以選擇被烷基或芳基酯化；作為選擇，R¹、R²可以與其所連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基；R³選自H、C_1-6烷基、6至10員芳環或6至10員雜芳環，所述的雜芳基含有1至4個選自N、O、S的雜原子，所述的烷基、芳環或雜芳環任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基的取代基所取代。

本發明較佳方案，一種通式(A)所示氨基酸硫酯類化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中該化合物選自通式(I)所示的化合物，其中：

A選自苯基或萘基，所述的苯基或萘基任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基的取代基所取代；B為；E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-或-CH₂CH₂OCH₂-；R^N選自H或C_1-4烷基；R²是一種天然或可藥用氨基酸的側鏈，如果側鏈含有羧基，該羧基可以選擇被烷基或芳基酯化；R³為C_1-6烷基。

本發明較佳方案，一種通式(I)所示氨基酸硫酯類化合物、其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中A選自苯基或萘基，較佳為苯基；所述的苯基或萘基任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、甲基、乙基、甲氧基或乙氧基的取代基所取代，進一步較佳被0至5個選自H、F、Cl、Br、CN、氨基或甲氧基的取代基所取代。

本發明較佳方案，一種通式(I)所示氨基酸硫酯類化合物、其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中R²是一種天然或可藥用氨基酸的側鏈，其中的氨基酸較佳為甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、結氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、絲氨酸、穀氨醯胺、蘇氨酸、半胱氨酸、組氨酸、天冬醯胺、酪氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、萘胺酸或精氨酸，進一步較佳為甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬醯胺或精氨酸，更佳為甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸。

本發明較佳方案，一種通式(I)所示氨基酸硫酯類化合物、其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中R³為C_1-6烷基，較佳為C_1-4烷基，進一步較佳為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基。

本發明較佳方案，一種通式(I)所示氨基酸硫酯類化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中該化合物選自通式(II)所示的化合物，其中：

R²選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬醯胺或精氨酸的側鏈，較佳為甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸的側鏈。

E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-； R³為C_1-4烷基。

本發明較佳方案，一種通式(I)所示氨基酸硫酯類化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中該化合物選自通式(III)所示的化合物，其中：

R³選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基。

本發明較佳方案，一種通式(III)所示氨基酸硫酯類化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中R²選自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、天冬醯胺或精氨酸的側鏈，較佳為甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸的側鏈，進一步較佳為丙氨酸的側鏈；R³為C_1-4烷基，較佳為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基。

本發明較佳方案，一種通式(A)所示氨基酸硫酯類化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中該化合物選自通式(IV)所示的化合物其中：

A選自6至10員芳環或6至10員雜芳環，所述的雜芳基含有1至4個選自N、O、S的雜原子，所述的芳環或雜芳環任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基、三氟甲基、C_1-4烷氧基或-C(=O)OC_1-4烷基的取代基所取代； B為；E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-或-CH₂CH₂OCH₂-；R¹和R²各自獨立的選自C_1-6烷基，作為選擇，R¹、R²與其所連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基；R³選自H、C_1-6烷基、6至10員芳環或6至10員雜芳環，所述的雜芳基含有1至4個選自N、O、S的雜原子，所述的芳環或雜芳環任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基的取代基所取代。

本發明較佳方案，一種通式(I)所述的化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中：A選自取代或未取代的苯基、吡啶基或萘基，當被取代時，任選進一步被1至3個選自H、F、Cl、Br、I、CN、甲氧基、甲基、三氟甲基或乙氧基羰基的取代基所取代；B為；E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-；R¹和R²各自獨立的選自甲基、乙基，作為選擇，R¹、R²與其所連接的碳原子一起形成環丙基；R³選自甲基、乙基、異丙基、一氟甲基或者二氟甲基。

本發明較佳方案，一種通式(A)所述的化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中：A選自苯基；R^N選自H；R¹和R²各自獨立的選自甲基或乙基； R³選自甲基、乙基或異丙基。

本發明較佳方案，一種通式(I)所示的氨基酸硫酯類化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，其中該化合物為：

根據本發明一些較佳實施方案，所述化合物為化合物1經離析(resolution)得到的化合物：

其中分離條件為：儀器，MG Ⅱ preparative SFC；柱，ChiralPak AS-H,250×30mmI.D.；流動相，A為CO₂以及B為Methanol；梯度，B 40%；流量，40mL/min；背壓，100bar；柱溫38℃；波長， 220nm；週期，5.5min；在上述分離條件下得到保留時間短和保留時間長的兩個化合物；其中保留時間短的化合物為化合物1-1保留時間為2.21±0.5min；其中保留時間長的化合物為化合物1-2保留時間為3.82±0.5min。

根據本發明另一些較佳實施方案，所述化合物為化合物2經離析得到的化合物：

其中分離條件為：儀器：Thar 200 prepararive SFC，柱：ChiralPak AS-10u,300×50mmI.D.，流動相：A為CO₂以及B為乙醇，梯度：B 45%，流量：200mL/min，背壓：100bar，柱溫：38℃，波長：220nm，週期：~15min；在上述分離條件下得到保留時間短和保留時間長的兩個化合物；其中保留時間短的化合物為化合物2-1保留時間為2.32±0.5min；其中保留時間長的化合物為化合物2-2保留時間為3.98±0.5min。

根據本發明另一些較佳實施方案，所述化合物為化合物5經離析得到的化合物：

其中分離條件為：儀器：Thar 200 prepararive SFC，柱：ChiralCel OD-10u,300×50mmI.D，流動相：A為CO₂以及B為乙醇，梯度：B 25%，流量：200mL/min，背壓100bar，柱溫：38℃，波長：220nm，週期：~5min；在上述分離條件下得到保留時間短和保留時間長的兩個化合物；其中保留時間短的化合物為化合物5-1保留時間為3.38±0.5min；其中保留時間長的化合物為化合物5-2保留時間為3.77±0.5min。

根據本發明另一些較佳實施方案，所述化合物為化合物6經離析得到的化合物：

其中分離條件為：儀器：MGII preparative SFC-1，柱：ChiralCel OD-5u,250×30mmI.D.流動相：A為CO2以及B為異丙醇，梯度：30%，流量：60mL/min，背壓：100bar，柱溫：38℃，波長：220nm，週期：~4min；在上述分離條件下得到保留時間短和保留時間長的兩個化合物；其中保留時間短的化合物為化合物6-1保留時間為 1.93±0.5min；其中保留時間長的化合物為化合物6-2保留時間為2.87±0.5min。

根據本發明另一些較佳實施方案，所述化合物為化合物7經離析得到的化合物：

其中分離條件為：儀器：waters SFC，柱：Chiralpak AS-3(4.6×100mm)，流動相：A為甲醇以及B為CO₂，梯度：B 10-40%，流量：2mL/min，背壓：2000psi，柱溫：35℃，波長：260nm；週期：~6min；在上述分離條件下得到保留時間短和保留時間長的兩個化合物；其中保留時間短的化合物為化合物7-1保留時間為1.62±0.5min；其中保留時間長的化合物為化合物7-2保留時間為2.52±0.5min。

本發明還提供通式(A)所示化合物，其立體異構體或其藥學上可以接受的鹽，其中所述的鹽為富馬酸鹽。

本發明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有治療有效劑量的本發明所述的化合物，及其立體異構體或藥學上可以接受的鹽，以及藥學上可接受的載體或者賦形劑。

進一步，本發明還提供了本發明的化合物，其立體異構體或其藥學上可以接受的鹽在製備治療病毒感染性疾病的藥物中的應用。

本發明的較佳方案，其中所述病毒感染性疾病包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。

進一步，本發明還提供了一種治療病毒感染性疾病的方法，其中所述方法包括給藥本發明所述的化合物、其立體異構體或其藥學上可以接受的鹽或共晶或所述的藥物組合物。

除非有相反的陳述，在說明書和權利要求書中使用的術語具有下述含義。

本發明關於到被多個取代基取代時，各取代基可以相同或不相同。

本發明關於到含有多個雜原子時，各雜原子可以相同或不相同。

本發明所述基團和化合物中所關於的元素碳、氫、氧、硫、氮或鹵素均包括它們的同位素情況，及本發明所述基團和化合物中所關於的元素碳、氫、氧、硫或氮任選進一步被一個或多個它們對應的同位素所替代，其中碳的同位素包括¹²C、¹³C和¹⁴C，氫的同位素包括氕(H)、氘(D，又叫重氫)、氚(T，又叫超重氫)，氧的同位素包括¹⁶O、¹⁷O和¹⁸O，硫的同位素包括³²S、³³S、³⁴S和³⁶S，氮的同位素包括¹⁴N和¹⁵N，氟的同位素¹⁹F，氯的同位素包括³⁵Cl和³⁷Cl，溴的同位素包括⁷⁹Br和⁸¹Br。

術語“烷基”是指飽和的脂肪族烴基團，包括1至20個碳原子的直鏈和支鏈基團。較佳含有1至10個碳原子的烷基，非限制性實施例包括，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、正戊基、正壬基，及其各種支鏈異構體等；更佳的是含有1至4個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基或第三丁基等。烷基可以是取代的或未取代的，當被取代時，取代基較佳為1至5個，獨立地選自H、F、Cl、Br、I、=O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、巰基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基醯基氨基、環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯或雜環烷巰基。

“氨基”是指-NH₂，可以是取代的或未取代的，當被取代時，取代基較佳為1至3個，獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、羥基、氨基、烷基氨基、烷基醯基氨基、雜環烷基、環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、羥基烷基、羧酸或羧酸酯。

“芳基”是指取代的或未取代的6至14員全碳單環或稠和多環基團，具有共軛的π電子體系的多環基團，較佳為6至10員芳香環，其非限定性實例包括苯基或萘基；所述芳基可以稠和與雜芳基、雜環基或環烷基，且與母體結構連接的部分為芳基，其非限定性實例包括苯並呋喃、苯並環戊烷基或苯並噻唑等。當被取代時，取代基較佳為1至5個，取代基獨立地選自H、F、Cl、Br、I、=O、烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、基、羥基、硝基、氰基、氨基、烷基醯基氨基、環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷基巰基、羥基烷基、羧酸、羧酸酯或雜環烷基巰基。

“天然或可藥用氨基酸”：蛋白質分子的基本骨架是氨基酸序列，組成蛋白質的基本氨基酸有20種，這20種基本氨基酸是生物進行蛋白後期修飾的基礎，此外，在這些基本氨基酸的基礎上，生物還會合成羥脯氨酸、羥賴氨酸等衍生出來的氨基酸類型，這些由生物合成的氨基酸統稱為“天然氨基酸”；用人工方法合成的就是“非天然氨基酸”。“可藥用氨基酸”是指在藥學上可接受的天然或非天然氨基酸。

“藥學上可接受的鹽”是指藥學上可接受的無毒酸或鹼的鹽，包括無機酸和鹼、有機酸和鹼的鹽。

“共晶”是指活性藥物成分(active pharmaceutical ingredient，API)和共晶形成物(cocrystal former，CCF)在氫鍵或其他非共價鍵的作用下結合而成的晶體，其中API和CCF的純態在室溫下均為固體，並且各組分間存在固定的化學計量比。共晶是一種多組分晶體，既包含兩種中性固體之間形成的二員共晶，也包含中性固體與鹽或溶劑化物形成的多員共晶。所述“共晶形成物”包括但不限於各種藥學上可接受的酸、鹼、非離子化合物。

“立體異構體”是指由分子中原子在空間上排列方式不同所產生的異構體，包括順反異構體、對映異構體和構形異構體。

“藥物組合物”表示一種或多種文本所述化合物或其生理學/藥學上可接受的鹽或前體藥物與其它化學組分的混合物，其它組分例如生理學/藥學上可接受的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進化合物對生物體的給藥。

“前藥”是指可以在生理條件下或者通過溶劑解轉化為具有生物活性的本發明化合物。本發明的前藥通過修飾在該化合物中的功能基團來製備，該修飾可以按常規的操作或者在體內被除去，而得到母體化合物。前藥包括本發明化合物中的一個羥基、氨基或者巰基連接到任何基團上所形成的化合物，當本發明化合物的前藥被施予哺乳動物個體時，前藥被裂解而分別形成游離的羥基、游離的氨基或者游離的疏基。前藥的例子包括但不限於，本發明化合物中的羥基或氨基功能基團與甲酸、乙酸或苯甲酸所形成的化合物。

"任選"、"任選的"或"任選地"意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“芳基任選被烷基取代”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括芳基被烷基取代的情形和芳基不被烷基取代的情形。

“取代或未取代的”是指基團可以被取代或不被取代的情形，若在本發明中沒有指出基團可以被取代，則表示該基團為未取代的情形。

“作為選擇”是指“作為選擇”之後的方案與“作為選擇”之前的方案為並列關係，而不是在前方案中的進一步選擇情形。

“取代”是指基團中一個或多個氫原子被其它基團取代的情形，如果所述的基團被氫原子取代，形成的基團與被氫原子取代的基團相同。基團被取代的情形，例如氨基、C_1-4烷基、C_1-4烷氧基、C_3-6碳環、3至6員雜環任選進一步被0至4個選自H、F、Cl、Br、I、羥基、氰基、氨基、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基的取代基所取代，形成的基團包括但不限於甲基、氯甲基、三氯甲基、羥基甲基、-CH₂OCH₃、-CH₂SH、-CH₂CH₂CN、-CH₂NH₂、-NHOH、-NHCH₃、-OCH₂Cl、-OCH₂OCH₂CH₃、-OCH₂CH₂NH₂、-OCH₂CH₂SH、-OCH₂CH₂OH、1-羥基環丙基、2-羥基環丙基、2-氨基環丙基、4-甲基呋喃基、2-羥基苯基、4-氨基苯基或苯基。

本發明具體合成方法

方法一：

化合物(A-1)與硫醇在酯縮合劑下反應得到化合物(A-2)，所述縮合劑包括但不限於二環己基碳二亞胺、N,N-羰基二咪唑、N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯、1-對甲基苯磺醯咪唑、4,5-二氰基咪唑，較佳為N,N-羰基二咪唑；化合物(A-2)脫去氨基保護基得到化合物(A-3)；所述脫保護是使用常規氨基保護基脫保護方法，包括但不限於在酸性條件下脫保護基，如使用三氟乙酸；化合物(A-3)和化合物(A-4)在鹼性條件下反應得到化合物(A)；化合物(A-1)可購買或參考CN201080036406.5文獻製備；化合物(A-4)參考EP0206459B1、CN01813161.1或WO2013052094文獻製備；其中：R^a選自氨基保護基，其中所述氨基保護基包括但不限於第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧基羰基、三氯乙氧基羰基、三甲基矽基乙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、2-聯苯基-2-丙氧羰基、第三丁氧基、鄰苯二甲醯基、對甲苯磺醯基、鄰硝基苯磺醯基、對硝基苯磺醯基、三甲基乙醯基、甲醯基、三氟乙醯基、苯甲醯基、苄基、三苯甲基、對甲氧基苄基或2,4-二甲氧基苄基，較佳第三丁氧基羰基；A、B、E、R^N、R²和R³的定義與通式(A)所述定義一致。

方法二：

化合物(I-A)與硫醇在酯縮合劑下反應得到化合物(I-B)，所述縮合劑包括但不限於二環己基碳二亞胺、N,N-羰基二咪唑、N,N'-二琥珀醯亞胺基碳酸酯、1-對甲基苯磺醯咪唑、4,5-二氰基咪唑，較佳為：N,N-羰基二咪唑；化合物(I-B)脫去氨基保護基得到化合物(I-C)；所述脫保護是使用常規氨基保護基脫保護方法，包括但不限於在酸性條件下脫保護基，如使用三氟乙酸；化合物(I-C)和化合物(A-4)在鹼性條件下反應得到化合物(I)；化合物(I-A)可購買或參考CN201080036406.5文獻製備；化合物(A-4)參考EP0206459B1、CN01813161.1或WO2013052094文獻製備；其中：R^a選自氨基保護基，其中所述氨基保護基包括但不限於第三丁氧基羰基、苄氧基羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧基羰基、三氯乙氧基羰基、三甲基矽基乙氧羰基、甲氧羰基、乙氧羰基、2-聯苯基-2-丙氧羰基、第三丁氧基、鄰苯二甲醯基、對甲苯磺醯基、鄰硝基苯磺醯基、對硝基苯磺醯基、三甲基乙醯基、甲醯基、三氟乙醯基、苯甲醯基、苄基、三苯甲基、對甲氧基苄基或2,4-二甲氧基苄基，較佳為第三丁氧基羰基；A、B、E、R^N、R²和R³的定義與通式(I)所述定義一致。

方法三：

化合物(A-4)可以購買或者參考WO2014088923或WO2012154698等方法製備化合物(IV-B)可以購買或者參考WO2012075456、WO2011014973或WO2012084794等方法製備；化合物(IV-C)可以參考本發明實施例、WO0208241或WO2013052094等方法製備；化合物(IV)通過化合物(IV-C)與硫醇發生酯交換反應得到；R⁴選擇H或C_1-6烷基； A、B、E、R¹、R²和R³的定義與通式(IV)中的定義一致。

以下結合附圖及實施例詳細說明本發明的技術方案，但本發明的保護範圍包括但是不限於此。

化合物的結構是通過核磁共振(NMR)或(和)質譜(MS)來確定的。NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用(Bruker Avance III 400和Bruker Avance 300)核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d₆)，氘代氯仿(CDCl₃)，氘代甲醇(CD₃OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)。

MS的測定用(Agilent 6120B(ESI)和Agilent 6120B(APCI))。

HPLC的測定使用安捷倫1260DAD高壓液相色譜儀(Zorbax SB-C18 100×4.6mm)。

薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.20mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm。

柱層析一般使用煙臺黃海矽膠200~300目矽膠為載體。

本發明的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買於泰坦科技、安耐吉化學、上海德默、成都科龍化工、韶遠化學科技、百靈威科技等公司。

氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

氫化反應通常抽真空，充入氫氣，反復操作3次。

實施例中無特殊說明，反應在氮氣氛下進行。

實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。

實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫。

室溫為最適宜的反應溫度，為20℃~30℃。

實施例1

(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氨基丙酸硫代異丙酯(化合物1)

S-isopropyl(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]propanethioate

第一步：(S)-2-(第三丁氧基羰基)氨基丙酸硫代異丙酯(1B)

(S)-S-isopropyl 2-((tert-butoxycarbonyl)amino)propanethioate

將N-第三丁氧基羰基-L-丙氨酸(1A)(5g,26.4mmol)溶解於四氫呋喃(40mL)中，加入N,N'-羰基二咪唑(CDI)(4.7g，29.1mmol)，室溫攪拌2小時。加入硫代異丙醇(6.2g,79.3mmol)，室溫反應過夜。加入4mol/L的氫氧化鈉溶液(30mL)，用二氯甲烷(50mL×4)萃取，合併有機層，無水硫酸鈉乾燥，濃縮，殘留物用矽膠柱分離純化(石油醚：乙酸乙酯(v/v)=1：0~9：1)，得標題化合物(S)-2-(第三丁氧基羰基)氨基丙酸硫代異丙酯(1B)，淺黃色液體(4g，產率61%)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 3.61(m,1H),2.37-2.16(m,1H),1.46(s,9H),1.36(d,3H),1.30(d,6H)。

第二步：(S)-2-氨基丙酸硫代異丙酯三氟乙酸鹽(1C)

(S)-S-isopropyl 2-aminopropanethioate triflouroacetate

將(S)-2-(第三丁氧基羰基)氨基丙酸硫代異丙酯(1B)(4g,16.2mmol)溶於二氯甲烷(10mL)中，加入三氟乙酸(10mL)，室溫攪拌4小時。減壓濃縮至乾得粗產物(S)-2-氨基丙酸硫代異丙酯三氟乙酸鹽(1C)(4g)，直接用於下一步。

第三步：[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基次磷酸(1E)

[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphinic acid

氮氣保護下將[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]磷酸(即PMPA)(1D)(5g,17.4mmol)加到三頸瓶中，加入乙腈(40mL)，三乙胺(3.5g,34.8mmol),4-二甲氨基吡啶(即DMAP)(2.1g，17.4mmol)和亞磷酸三苯酯(8.1g，26.1mmol)加完後，加熱至內溫80℃反應兩天。將反應液減壓濃縮除去乙腈，向殘留物中加入乙酸乙酯(10mL)和水(15mL)，分液，水層用乙酸乙酯(10mL×2)萃取，合併水層，水層用濃鹽酸調節pH至3，室溫攪拌10分鐘，用濃鹽酸調節pH至2，冰水冷卻至10℃攪拌兩小時後靜置過夜，過濾，濾餅用水(10mL)洗滌，收集濾餅，烘乾標題化合物[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基次磷酸(1E)，(3.5g，產率56%)。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 8.16(s,1H),8.14(s,1H),7.55(s,2H),7.32-7.25(m,2H),7.09(m,3H),4.30(dd,1H),4.19(dd,1H),3.97(m,1H),3.87-3.69(m,2H),1.05(d,3H)。

³¹P NMR(400MHz,DMSO)δ 16.66。

第四步：[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氯(1F)

9-[(2R)-2-[[chloro(phenoxy)phosphoryl]methoxy]propyl]purin-6-amine

將[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基次磷酸(1E)(2g，5.5mmol)懸浮於乙腈(20mL)中，加入氯化亞碸(2.6g，22.0mmol)加熱至內溫85℃反應4小時，將反應液減壓濃縮，得粗產物直接用於下一步。

第五步：(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氨基丙酸硫代異丙酯(化合物1)

將(S)-2-氨基丙酸硫代異丙酯三氟乙酸鹽(1C)(4g,16.2mmol)溶於乾燥的二氯甲烷(20mL)中，氮氣保護下，以乾冰-乙醇冷卻至-50℃，滴加三乙胺(5mL，35.8mmol)攪拌10分鐘，滴加[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氯(1F)(2.1g，5.5mmol)的二氯甲烷(20mL)懸濁液，完成後，自然升溫至室溫反應1小時。向反應液中加入水(20mL)，分液，有機層用水(10mL)洗滌一次，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，將殘留物溶於乙酸乙酯(50mL)中，冰浴冷卻下用4mol/L的鹽酸調節pH至2，分液，水層用乙酸乙酯(20mL)萃取，取水層，加入二氯甲烷(50mL)，冰浴冷卻下滴加飽和碳酸氫鈉水溶液調節pH至8，分液，水層用二氯甲烷(20mL)萃取，合併有機層，飽和氯化鈉(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氨基丙酸硫代異丙酯(化合物1)(300mg，產率11%)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.33(d,1H),7.98(s,1H),7.32(t, 1H),7.23(t,1H),7.14(m,,2H),7.00(d,1H),5.82(d,2H),4.41(ddd,1H),4.22-3.90(m,5H),3.73-3.36(m,3H),1.32-1.17(m,12H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 23.21,22.00。

LC-MS M/Z(ESI)：493.3[M+1]。

化合物1的離析

分離分析方法：儀器，Thar analytical SFC；柱，ChiralPak AS-H,250×4.6mm；流動相，A為CO₂以及B為Methanol(0.05%DEA)；梯度，B 40%；流量，2.4mL/min；背壓，100bar；柱溫，35℃；波長，220nm。

製備分離方法：儀器，MG Ⅱ preparative SFC；柱，ChiralPak AS-H,250×30mmI.D.；流動相，A為CO₂以及B為Methanol；梯度，B 40%；流量，40mL/min；背壓，100bar；柱溫38℃；波長，220nm；週期，5.5min。

樣品製備：(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氨基丙酸硫代異丙酯(化合物1)(300mg)溶解於甲醇中，製得樣品濃度10mg/mL的溶液，進樣3mL/每針，分離後得到兩個光學異構體化合物1-1(保留時間：2.21min，106mg，白色固體，ee%=100%)，化合物1-2(保留時間：3.82min，109mg，白色固體，ee%=100%)。

化合物1-1

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.31(s,1H),8.01(s,1H),7.32(t,2H),7.21-7.11(m,3H),6.04(s,2H),4.47(dd,1H),4.21-4.13(m,1H),4.13-4.06(m,1H),4.06-3.96(m,2H),3.69(dd,1H),3.54-3.39(m,2H),1.28-1.17(m,12H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 23.15。

LC-MS M/Z(ESI)：493.1[M+1]。

化合物1-2

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.35(s,1H),7.97(s,1H),7.25-7.17(m,2H),7.13-7.05(m,1H),7.03-6.95(m,2H),5.90(s,2H),4.34(dd,1H),4.16-4.03(m,2H),3.99-3.89(m,2H),3.84(t,1H),3.76-3.52(m,2H),1.33-1.20(m,12H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 22.12。

LC-MS M/Z(ESI)：493.1[M+1]。

實施例2

(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氨基丙酸硫代乙酯(化合物2)

S-ethyl(2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]propanethioate

第一步：(S)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙酸硫代乙酯(2B)

S-ethyl(S)-2-(tert-butoxycarbonylamino)propanethioate

將N-第三丁氧基羰基-L-丙氨酸(2A)(50,264mmol)溶解在四氫呋喃(400mL)中，加入N,N'-羰基二咪唑(CDI)(47g，291mmol)，室溫攪拌1小時，加入乙硫醇(18g，291mmol)，室溫反應過夜。向反應液中加入水(100mL)，分液，水層用乙酸乙酯(100mL×4)萃取，合併有機層，用飽和氯化鈉水溶液(50mL×2)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，殘留物用矽膠柱分離純化(石油醚：乙酸乙酯=1：0~9：1)得標題化合物(S)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙酸硫代乙酯(2B)，白色固體(46g，產率74.6%)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 4.97(s,1H),4.37(d,1H),2.88(m,2H),1.45(s,9H),1.37(d,3H),1.25(t,3H)。

第二步(2S)-2-氨基丙酸硫代乙酯三氟乙酸鹽(2C)

S-isopropyl(2S)-2-aminopropanethioate triflouroacetate

將(S)-2-(第三丁氧基羰基氨基)丙酸硫代乙酯(1B)(23g，98.57mmol)溶解在二氯甲烷(20mL)中，加入三氟乙酸(20mL)，室溫攪拌反應2小時，減壓濃縮至乾得粗產物(2S)-2-氨基丙酸硫代乙酯(2C)(25g)直接用於下一步。

第三步(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氨基丙酸硫代乙酯(化合物2)

S-ethyl (2S)-2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]propanethioate

將(2S)-2-氨基丙酸硫代乙酯(2C)(25g,98.57mmol)溶解在乾燥二氯甲烷(150mL)中，氮氣保護下，以乾冰-乙醇冷卻至-50℃，滴加三乙胺(36.6g,361.6mmol)，加入[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氯(1F)(23g，60.24mmol)，自然升溫至室溫反應1小時。反應完成後，加入水(50mL)，分液，水層用二氯甲烷萃取(100mL)，合併有機層，用10%的磷酸二氫鈉水溶液(50ml×4)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，殘留物用矽膠柱層析純化(二氯甲烷，甲醇/二氯甲烷=1%，甲醇/二氯甲烷=2.5%)得標題化合物(2S)-2-[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基乙氧基]甲基]苯氧基磷醯氨基丙酸硫代乙酯(化合物2)(8g，產率27.7%)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.33(d,1H),7.97(d,1H),7.35-7.27(m,1H),7.24-7.06(m,3H),7.00(d,1H),6.15(d,2H),4.50-4.29(m,1H),4.22-4.05(m,2H),4.05-3.89(m,2H),3.75-3.61(m,1H),2.84(m,1H),2.80-2.64(m,1H),1.29-1.13(m,9H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 23.38,22.22。

LC-MS M/Z(ESI)：479.3[M+1]。

化合物2的離析

分離分析方法：儀器：Thar analytical SFC，柱：ChiralPak AS-H,250×4.6mm，流動相：A為CO₂以及B為甲醇(0.05%DEA)，梯度：B 40%，流量：2.4mL/min，背壓：100bar，柱溫：35℃，波長：220nm，製備分離方法：儀器：Thar 200 prepararive SFC，柱：ChiralPak AS-10u,300×50mmI.D.，流動相：A為CO₂以及B為乙醇，梯度：B 45%，流量：200mL/min，背壓：100bar，柱溫：38℃，波長：220nm，週期：~15min，樣品製備：化合物2溶解於乙醇中，製得樣品濃度60mg/ml的溶液，進樣：16ml每針，分離後得到兩個光學異構體化合物2-1(保留時間：2.32min，2.38g，白色固體，ee%=100%)，化合物2-2(保留時間：3.98min，2.24g，白色固體，ee%=100%)。

化合物2-1

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.30(s,1H),7.97(s,1H),7.34-7.28(m,2H),7.19-7.13(m,3H),6.08(s,2H),4.46(dd,1H),4.21-3.95(m,5H),3.74-3.60(m,2H),2.84-2.65(m,2H),1.25(d,3H),1.20(d,3H),1.16(t,3H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 23.37。

LC-MS M/Z(ESI)：479.0[M+1]。

化合物2-2

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.35(s,1H),7.97(s,1H),7.20(m,2H),7.09(m,1H),7.03-6.96(m,2H),6.10(s,2H),4.37-4.23(m,2H),4.11(m,2H),4.01-3.87(m,2H),3.66(dd,1H),2.84(m,2H), 1.31-1.19(m,9H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 22.20。

LC-MS M/Z(ESI)：479.0[M+1]。

實施例3 化合物1-1的富馬酸鹽

將化合物1-1(2g，4.06mmol)溶解在乙酸乙酯(26mL)中，加入富馬酸(0.471g，4.06mmol)及無水甲醇(4mL)，加熱至50℃攪拌至溶液完全澄清後，再降溫至室溫攪拌析晶3小時，過濾，濾餅依次用乙酸乙酯(20mL)洗滌和二氯甲烷(20mL)洗滌，收集濾餅減壓乾燥得化合物1-1的富馬酸鹽(1.9g，產率84.4%)。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 13.11(s,2H),8.13(d,2H),7.34(t,2H),7.19-7.11(m,5H),6.63(s,2H),5.77(dd,1H),4.26(ddd,2H),4.16-3.76(m,4H),3.36(m 1H),1.26-1.14(m,6H),1.07(dd,6H)。

³¹P NMR(162MHz,DMSO)δ 24.25。

LC-MS M/Z(ESI)：493.1[M+1]。

實施例4 化合物1-2的富馬酸鹽

將化合物1-2(2g，4.06mmol)溶解在乙酸乙酯(18mL)中，加入富馬酸(0.471g，4.06mmol)及無水甲醇(2mL)，加熱至50℃攪拌至溶液完全澄清後，再降溫至室溫攪拌析晶3小時，過濾，濾餅依次用乙酸乙酯(20mL)和二氯甲烷(20mL)洗滌，收集濾餅減壓乾燥得化合物1-2的富馬酸鹽(1.5g，產率66.7%)。

¹H NMR(400MHz,DMSO)δ 13.11(s,2H),8.15(s,1H),8.10(s,1H),7.29(t,2H),7.21(s,2H),7.14(t,1H),7.05(d,2H),6.64(s,2H),5.94(t,1H),4.28(dd,1H),4.14(dd,1H),3.99-3.83(m,3H),3.76(dd,1H),3.37(m,1H),1.20(dd,6H),1.12(d,3H),1.08(d,3H)。

³¹P NMR(162MHz,DMSO)δ 23.84。

LC-MS M/Z(ESI)：493.1[M+1]。

實施例5

2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基丙酸硫代異丙酯(化合物5)

S-isopropyl 2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]-2-methyl-propanethioate

第一步：2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基-丙酸乙酯(5B)

ethyl 2-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]-2-methyl-propanoate

2-氨基-2-甲基丙酸乙酯(18g,0.138mol)溶於的二氯甲烷(200mL)中，在氮氣保護下加入二異丙胺(11.49g,0.114mol)，並在冰浴下加入9-[(2R)-2-[[氯(苯氧基)磷醯基]甲氧基]丙基]嘌呤-6-氨(16g,41.99mmol)，加完室溫反應2個小時，將反應液用20mL水洗滌，再用飽和硫酸二氫鈉洗滌(20mL×2)，無水硫酸鈉乾燥有機相，濃縮，殘留物用矽膠柱色譜分離提純(二氯甲烷；甲醇(v/v)=50：1)得到標題化合物2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基-丙酸乙酯(5B)，紅色固體(5g，產率25.0%)。

LCMS m/z=477.1[M+1]。

第二步：2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基丙酸硫代異丙酯(化合物5)

將三甲基鋁(2mol/L)(25.2mL,50mmol,2mol/L)溶於的二氯甲烷(50mL)中，在冰浴氮氣保護下，加入二異丙硫醇(3.8g,50mmol)，冰浴下攪拌30分鐘，加入2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基-丙酸乙酯(5B)(3g,6.3mmol)，室溫反應4天，向反應液中加入氯化銨飽和溶液(50mL)，過濾，分液，水相用二氯甲烷(50mL×3)萃取，合併有機相，有機相用水洗滌(50mL×2)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮，得到標題化合物2-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基丙酸硫代異丙酯(化合物5)，紅色固體3.1g，產率100%)。

LCMS m/z=507.0[M+1]。

化合物5的離析

分離分析方法：儀器：Agilent analytical SFC，柱：ChiralCel OD-3,150×4.6mm，流動相：A為CO₂以及B為乙醇(0.05%DEA)，梯度：B 5-40%，流量：2.4mL/min，背壓：100bar，柱溫：35℃，波長：220nm，製備分離方法：儀器：Thar 200 prepararive SFC，柱：ChiralCel OD-10u,300×50mmI.D，流動相：A為CO₂以及B為乙醇，梯度：B 25%，流量：200mL/min，背壓100bar，柱溫：38℃，波長：220nm，週期：~5min，樣品製備：化合物5溶解於乙醇和二氯甲烷中，製得樣品濃度40mg/ml的溶液，進樣：3ml每針，分離後得到兩個光學異構體化合物5-1(保留時間：3.38min，0.88g，白色固體，ee%=100%)，化合物5-2(保留時間：3.77min，1.36g，白色固體，ee%=100%)。

化合物5-1

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.34(s,1H),7.95(s,1H),7.24-7.22(m,2H),7.13-7.08(m,1H),7.01-6.98(m,2H),5.69(s,2H),4.36(dd,1H),4.19-4.13(m,1H),4.04-3.85(m,3H),3.73-3.52(m,2H),1.54(s,3H),1.49(s,3H),1.31(d,3H),1.29(d,3H),1.26(d,3H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 22.56。

LCMS m/z=507.0[M+1]；

化合物5-2

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.34(s,1H),7.98(s,1H),7.33-7.31(m,2H),7.19-7.13(m,3H),5.74(s,2H),4.41(dd,1H),4.19-4.14(m,1H),4.07-3.85(m,2H),3.82-3.65(m,2H),3.57-3.46(m,1H),1.47(s,3H),1.40(s,3H),1.28(d,3H),1.26(d,3H),1.22(d,3H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 22.36。

LCMS m/z=507.0[M+1]。

實施例6

2-[[[(1R)-2-(6-氨基-7H-嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基丙酸硫代乙酯(化合物6)

S-ethyl 2-[[[(1R)-2-(6-amino-7H-purin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]-2-methyl-propanethioate

將三甲基鋁(67ml,134.4mmol,2mol/L)溶於二氯甲烷(100mL)中，0℃加入乙硫醇(8.33g，10mmol)，反應15分鐘，加入2-[[[(1R)-2-(6-氨基-7H-嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基-丙酸乙酯(5B)(8.0g，16.8mmol)，室溫反應過夜。於0℃加入飽和氯化銨溶液淬滅，過濾，濾液用二氯甲烷(100mL×2)萃取，無水硫酸鈉乾燥，減壓濃縮，得到標題化合物2-[[[(1R)-2-(6-氨基-7H-嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-2-甲基丙酸硫代乙酯(化合物6)，黃色油狀物(4.47g，產率54.4%)。

LCMS m/z=493.1[M+1]。

化合物6的離析

分離分析方法：儀器：Thar analytical SFC，柱：ChiralCel OD-H,250×4.6mm,5um，流動相：A為CO₂以及B為異丙醇(0.05%DEA)，梯度：B 5~40%，流量：2.4mL/min，背壓：100bar，柱溫：35℃，波長：220nm，製備分離方法：儀器：MGII preparative SFC-1，柱：ChiralCel OD-5u,250×30mmI.D.流動相：A為CO2以及B為異丙醇，梯度：30%，流量：60mL/min，背壓：100bar，柱溫：38℃，波長：220nm，週期：~4min，樣品製備：化合物6溶解於甲醇中，進樣：2.1ml每針，分離後得到兩個光學異構體化合物6-1(保留時間：1.93min，1.45g，白色固體，ee%=100%)，化合物6-2(保留時間：2.87min，3.04g，白色固體，ee%=100%)。

化合物6-1：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.33(s,1H),7.97(s,1H),7.26-7.22(m,2H),7.12-7.11(m,1H),7.00-6.98(m,2H),5.83(s,2H),4.36(dd,1H),4.16(dd,1H),3.97-3.92(m,2H),3.85(d,1H),3.70-3.65(m,1H),2.80(q,2H),1.54(s,3H),1.50(s,3H), 1.27-1.22(m,6H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 22.63。

LCMS m/z=493.0[M+1]；

化合物6-2：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.33(s,1H),7.96(s,1H),7.35-7.28(m,2H),7.21-7.09(m,3H),6.09(s,2H),4.41(dd,1H),4.16(dd,1H),4.04-3.89(m,2H),3.74-3.63(m,2H),2.80-2.77(m,2H),1.47(s,3H),1.40(s,3H),1.23-1.18(m,6H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 22.46。

LCMS m/z=493.0[M+1]。

實施例7

1-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-環丙基甲酸硫代異丙酯(化合物7)

S-isopropyl 1-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]-cyclopropanecarbothioate

第一步：1-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌呤-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-環丙基甲酸乙酯(7B)

ethyl 1-[[[(1R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-1-methyl-ethoxy]methyl-phenoxy-phosphoryl]amino]-cyclopropanecarboxylate

將1-氨基環丙基甲酸乙酯(5.0g,43.9mmol)溶於200mL的二氯甲烷中，在氮氣保護下加入二異丙胺(3.5g,35.56mmol)，並再冰浴下加入1F(5.0g,13.1mmol)，升溫到室溫反應2個小時，將反應液用20mL水淬滅，分液，有機相用飽和硫酸二氫鈉洗滌(20mL×2)，無水硫酸鈉乾燥有機相，濃縮，殘留物用矽膠柱色譜分離提純(DCM：甲醇(v/v)=50：1)得到標題化合物7B，紅色固體(2g，產率32.25%)。

LCMS m/z=475.1[M+1]。

第二步：1-[[[(1R)-2-(6-氨基嘌吟-9-基)-1-甲基-乙氧基]甲基-苯氧基-磷醯基]氨基]-環丙基甲酸硫代異丙酯(化合物7)

將三甲基鋁(2mol/L)(33.7ml,67.5mmol)溶於50mL的二氯甲烷中，在冰浴氮氣保護下加入二異丙硫醇(5.13g,67.5mmol)，並再冰浴下攪拌30分鐘，再加入7B(4.0g,8.4mmol)，升溫到室溫反應4天，加入50mL的飽和氯化氨飽和溶液淬滅反應，分液，水相並用二氯甲烷萃取(50mL×3)，合併有機相，有機相用水洗滌(50mL×2)，無水硫酸鈉乾燥，濃縮，得到標題化合物7，紅色固體4.2g，產率100%)。

化合物7的離析

製備分離方法：儀器：waters SFC，柱：Chiralpak AS-3(4.6×100mm)，流動相：A為甲醇以及B為CO₂，梯度：B 10-40%，流量：2mL/min，背壓：2000psi，柱溫：35℃，波長：260nm；週期：~6min；樣品製備：化合物7溶解於甲醇中，進樣：2ml每針，分離後得到兩個光學異構體化合物7-1(保留時間：1.62min，30mg，白色固體，ee%=100%)，化合物7-2(保留時間：2.52min，60mg，白色固體，ee%=100%)。

化合物7-1：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.32(s,1H),7.96(s,1H),7.31-7.29(m,2H),7.18-7.13(m,3H),5.94(s,2H),4.44(dd,1H),4.19(dd,1H),4.13-3.94(m,3H),3.84-3.78(m,1H),3.46-3.39(m,1H),1.56-1.47(m,1H),1.40-1.35(m,1H),1.26(d,3H),1.23-1.20(m,6H),1.14-1.06(m,1H),1.03-0.94(m,1H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 23.42。

LCMS m/z=505.0[M+1]；

化合物7-2：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.34(s,1H),7.92(s,1H),7.30-7.22(m,2H),7.15-7.12(m,1H),7.01-6.99(m,2H),5.70(s,2H),4.41(dd,1H),4.27-4.08(m,3H),4.05-3.96(m,1H),3.77(dd,1H),3.53-3.46(m,1H),1.55-1.44(m,2H),1.30-1.22(m,9H),1.17-1.08(m,2H)。

³¹P NMR(162MHz,CDCl₃)δ 22.53。

LCMS m/z=505.0[M+1]。

測試例測試例1、抗乙型肝炎病毒活性篩選

用HepG2.2.15細胞測定化合物的抗乙肝病毒活性。使用的材料與儀器如下：HepG2.2.15細胞，RPMI 1640培養液，胎牛血清，96孔板，DMSO，QIAamp 96 DNA Blood Kit，Cell-titer blue，酶標儀，Applied Biosystems 7900 real-time PCR system。

用DMSO將各化合物溶解至20mM，-20℃貯存，將各化合物的20mM貯存液用DMSO 3倍梯度稀釋，共9個濃度。再用含2.0% FBS的RPMI 1640培養液稀釋200倍。化合物的最高測試終濃度為100M。實驗步驟參照QIAamp 96 DNA Blood Kit(QIAGEN 51161)說明書，qPCR法測定化合物抗乙肝病毒活性並計算EC₅₀(半數有效抑制濃度)。分析數據和計算抑制百分比：應用如下公式計算抑制百分比：抑制率(%)=(DMSO對照組的HBV總量-受試樣品組的HBV總量)/DMSO對照組的HBV總量×100。最後使用GraphPad Prism軟件計算化合物的EC₅₀值。

Cell-titer blue法測定化合物的細胞毒性並計算CC₅₀(致50%細胞毒性濃度)。分析數據和計算相對細胞活力：應用如下公式計算細胞活性百分比：細胞生存率(%)=(受試樣品的螢光數值-背景螢光數值)/(DMSO對照組的螢光數值-背景螢光數值)×100。最後使用GraphPad Prism軟件計算化合物的CC₅₀值。結果如下表所示：

結論：測試化合物均表現出良好的抗乙肝病毒活性，與對照相比具有相當的抗乙肝病毒活性，且在測試的濃度範圍內没有細胞毒性。

測試例2 大鼠組織分布

雄性SD大鼠(購自維通利華，許可證號為SCXK(京)2012-0001)，體重200-220g。實驗前一天動物禁食不禁水。實驗當天，36只大鼠分別灌胃給予3個受試化合物，，劑量為15mg/kg(按原藥PMPA計)。分別於給藥後0.5h，2h，6h和24h收集血液及組織樣品。眼眶取血(肝素抗凝)，3000g，4℃離心10min，收集血漿。同時收集肝臟及腎臟，稱總重，之後各組織各取50mg，存於-80℃。

配製測試化合物的標準品溶液，加入至空白血漿，肝臟和腎臟勻漿液中。標準曲線濃度分別為10000ng/ml，5000ng/ml，2500ng/ml，1000ng/ml，250ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，2ng/ml。取30μl各濃度溶液，加入含內標的乙腈200μl，2500rpm震盪2min，之後13000rpm，4℃離心10min，取上清，繪製測試化合物在空白血漿，肝臟和腎臟勻漿液中的標準曲線。

取血漿樣品30μl，加入含內標的乙腈200μl，2500rpm震盪 2min，之後13000rpm，4℃離心10min，取上清，HPLC-MS/MS檢測受試化合物組樣品中PMPA和測試化合物濃度(ng/ml)，組織樣品按每50mg加入0.5ml生理鹽水，勻漿。勻漿後，取30μl勻漿液，加入含內標的乙腈200μl，2500rpm震盪2min，之後13000rpm，4℃離心10min，取上清，HPLC-MS/MS檢測受試化合物組樣品中PMPA濃度(ng/ml，ng/g)。試驗結果如表2，表3。

結論：本發明化合物與對照相比，PMPA具有更高的肝臟暴露量，肝臟與腎臟濃度比更高，提示肝靶向性更好，腎臟代謝濃度相對較低，可減少腎毒性。

測試3 全血穩定性

本實驗利用的ICR小鼠、SD大鼠、Beagle犬、食蟹猴及健康人的全血均為實驗前新鮮採集(雌雄各半)。受試化合物將與各種屬全血進行共孵育，孵育體系為400μL，孵育終濃度為1μM。在不同的時間點(0、5、15、30、60min)，取出40μL孵育全血樣品，加入到200μL含有內標的乙腈中。蛋白沉澱後，離心取上清，上清液中的受試化合物由LC-MS/MS方法分析，樣品平行2份。

分析物/內標峰面積之比(Aanalyte/AIS)將由儀器得出，剩餘百分比(%Control)由非零時間點樣品與零時刻樣品中Aanalyte/AIS之比計算出。將Ln(%Control)對孵育時間作圖並進行線性擬合。結果如表4所示。

結論：在人全血中，本發明化合物1-1,1-2的Average T_1/2值是對照化合物的30餘倍，其穩定性明顯優於對照化合物，故PMPA在人血漿中的暴露量更低，明顯降低了本發明化合物因在血漿中代謝生成PMPA而產生的毒副作用。

Claims

一種通式(A)所示化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中： A選自6至10員芳環或6至10員雜芳環，所述的雜芳基含有1至4個選自N、O、S的雜原子，所述的芳環或雜芳環任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基、三氟甲基、C_1-4烷氧基或-C(=O)OC_1-4烷基的取代基所取代；B為；E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-或-CH₂CH₂OCH₂-；R^N選自H或C_1-4烷基；R¹和R²各自獨立的選自H、C_1-6烷基或一種天然或可藥用氨基酸的側鏈，如果側鏈含有羧基，該羧基可以選擇被烷基或芳基酯化；作為選擇，R¹、R²可以與其所連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基；R³選自H、C_1-6烷基、6至10員芳環或6至10員雜芳環，所述的雜芳基含有1至4個選自N、O、S的雜原子，所述的烷基、芳環或雜芳環任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基的取代基所取代。
根據申請專利範圍第1項所述的化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中，該化合物選自通式(I)所示化合物： A選自苯基或萘基，所述的苯基或萘基任選進一步被0至5個選自H、F、Cl、Br、I、CN、氨基、羥基、羧基、C_1-4烷基或C_1-4烷氧基的取代基所取代；R²是一種天然或可藥用氨基酸的側鏈，如果側鏈含有羧基，該羧基可以選擇被烷基或芳基酯化；R³為C_1-6烷基。
根據申請專利範圍第2項所述的化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中該化合物選自通式(II)所示的化合物，其中 E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-；R²選自甘氨酸、丙氨酸或苯丙氨酸的側鏈；R³為C_1-4烷基。
根據申請專利範圍第3項所述的化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中該化合物選自通式(III)所示的化合物，其中： R³選自甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基或異丁基。
根據申請專利範圍第1項所述的化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，該化合物選自通式(IV)所示的化合物，其中： R¹和R²各自獨立的選自C_1-6烷基，或者R¹、R²與其所連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基。
根據申請專利範圍第5項所述的化合物、其立體異構體、藥學上可以接受的鹽或共晶，其中：A選自取代或未取代的苯基、吡啶基或萘基，當被取代時，任選進一步被1至3個選自H、F、Cl、Br、I、CN、甲氧基、甲基、三氟甲基或乙氧基羰基的取代基所取代；E選自-CH₂CH(CH₃)OCH₂-；R¹和R²各自獨立的選自甲基或乙基，或者R¹、R²與其所連接的碳原子一起形成環丙基；R³選自甲基、乙基、異丙基、一氟甲基或者二氟甲基。
根據申請專利範圍第1項所述的化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽或共晶，其中該化合物為：
根據申請專利範圍第1~7項中任一項所述的化合物，其立體異構體或藥學上可以接受的鹽或共晶，其中所述的鹽為富馬酸鹽。
一種藥物组合物，所述藥物组合物含有治療有效劑量的申請專利範圍第1~8項中任一項所述的化合物及其立體異構體或藥學上可以接受的鹽或共晶，以及藥學上可接受的載體或者賦形劑。
申請專利範圍第1~8項中任一項所述的化合物、其立體異構體或其藥學上可以接受的鹽或共晶，在製備治療病毒感染性疾病的藥物中的應用。
根據申請專利範圍第10項所述的應用，其中所述病毒感染性疾病包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。
一種治療病毒感染性疾病的方法，其中所述方法包括給藥申請專利範圍第1~8項中任一項所述的化合物、其立體異構體或其藥學上可以接受的鹽或共晶或申請專利範圍第9項所述的藥物組合物。
根據申請專利範圍第12項所述的方法，其中所述病毒感染性疾病包括乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。