TW201634690A - 製備含有幹細胞之溶液的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種製備含有幹細胞之溶液的方法，其係包括：(1)將血液樣本和二價陽離子螯合劑的混合液放在溫度為攝氏2至12度的環境中靜置3至72小時，使混合液分成兩層或兩層以上(即混合液形成兩個或兩個以上的分離層)，其中一個分離層內的液體含有血小板及幹細胞；(2)收集或取得該液體，並放入一容器中；(3)離心容器內的液體，直到懸浮於液體內的複數個顆粒沉積在容器的底部為止，該些顆粒包含前述的血小板和幹細胞；以及(4)將該些顆粒重新懸浮於緩衝液或其它適當的液體中。

Description

製備含有幹細胞之溶液的方法
本發明係有關一種製備含有細胞之溶液的方法，尤指一種製備含有(體)幹細胞之溶液的方法。
幹細胞具有自我更新(self-renewal)的能力，因此可以產生更多的幹細胞並變成幾乎任何一種的特化細胞(specialized cell)。幹細胞研究被視為是生物醫學未來最重要的領域之一，再加上近年來相關產業也加速成長，突顯人們對於幹細胞在醫療應用上的需求。
本發明之主要目的，在於提供一種製備或製作含有幹細胞之溶液的方法，該溶液可以用於植牙治療或骨移植術(bone graft procedure)。
為達到上述之目的，本發明提供一種製備或製作含有幹細胞之溶液的方法。這個方法包括以下步驟：(1)將血液樣本與二價陽離子螯合劑(例如乙二胺四乙酸二鉀[K2 EDTA]或乙二胺四乙酸三鉀[K3 EDTA])均勻混合後所形成的混合液放在溫度為攝氏2至12度(較佳為攝氏2至7度或大約攝氏4度)的環境中靜置3至72小時、3至6小時、6至72小時、6至48小時、16至72小時、16至48小時、36至60小時或48至72小時，使混合液分成兩層或兩層以上，即混合液形成兩個或兩個以上的分離層(例如包含上分離層和下分離層)，其中一個分離層(如上分離層或最上層的分離層)內的第一液體(如上清液)含有複數個血小板(尺寸可為小於6微米[µm])及複數個體幹細胞，該些體幹細胞例如包括CD349(+)(多功能)體幹細胞和Lgr5(+)(多功能)體幹細胞；(2)從混合液中收集或取得第一液體；以及(3)在收集或取得第一液體之後，離心第一液體，使第一液體中有複數個顆粒聚集在一起，該些顆粒包含前述的血小板和體幹細胞。該方法可以進一步包括：在離心第一液體之後，移除部分的第一液體並留下聚集在一起的該些顆粒在剩餘的第一液體中，然後將該些顆粒重新懸浮於剩餘的第一液體中，藉以製備或製作含有幹細胞的溶液。或者，該方法可以進一步包括：在離心第一液體之後，移除實質上全部的或部分的第一液體並留下聚集在一起的該些顆粒，然後將該些顆粒重新懸浮於第二液體中，藉以製備或製作含有幹細胞的溶液。第二液體可以是或可以含有鹽溶液，例如(杜氏)磷酸鹽緩衝液[(Dulbecco’s) phosphate-buffered saline]。或者，第二液體可以是或可以含有無鈣離子(Ca2+ )的溶液，其還可以不含有任何其它的二價離子，例如鎂離子(Mg2+ )。無鈣離子的溶液可以是生理食鹽水(normal saline)，即0.9%鹽溶液。或者，第二液體可以含有前述的鹽溶液及一部分的第一溶液。在該些顆粒重新懸浮於第二液體之後，第二液體包含該些顆粒，並與該些顆粒混在一起。上述含有幹細胞的溶液可以用於植牙治療或骨移植術。
為達到上述之目的，本發明提供一種製備或製作含有幹細胞之溶液(或稱為幹細胞混合液)的方法，該溶液可以用於植牙治療或骨移植術。這個方法包括以下步驟：(1)將血液樣本與二價陽離子螯合劑(例如乙二胺四乙酸二鉀[K2 EDTA]或乙二胺四乙酸三鉀[K3 EDTA])在溫度為攝氏2至12度(較佳為攝氏2至7度或大約攝氏4度)的環境中培養或培育一段時間(例如3至72小時，較佳為3至6小時、6至72小時、6至48小時、16至72小時、16至48小時、36至60小時或48至72小時)，使血液樣本分成兩層或兩層以上，即血液樣本形成兩個或兩個以上的分離層(例如包含上分離層和下分離層)；(2)收集或取得該些分離層其中之一(如上分離層)，並將該分離層放入一容器(如試管)中，其中該分離層含有複數個血小板(尺寸可為小於6µm)及複數個體幹細胞(例如包括CD349(+)體幹細胞和Lgr5(+)體幹細胞)；(3)離心容器內的該分離層，直到懸浮於該分離層內的多種顆粒沉積在容器的底部為止，該些顆粒包含前述的體幹細胞和血小板；以及(4)將沉積在容器底部的該些顆粒重新懸浮於一液體溶液中，藉以製備或製作所述含有幹細胞的溶液。該液體溶液可以是或可以含有鹽溶液，例如(杜氏)磷酸鹽緩衝液。或者，該液體溶液可以是或可以含有無鈣離子(Ca2+ )的溶液，其也可以不含有任何其它的二價離子，例如鎂離子(Mg2+ )。無鈣離子的溶液可以是生理食鹽水，即0.9%鹽溶液。或者，該液體溶液可以含有前述的鹽溶液及一部分的該分離層。或者，該液體溶液可以是一部分的該分離層。在該些顆粒重新懸浮於該液體溶液之後，該液體溶液包含該些顆粒，並與該些顆粒混在一起。
在上述兩種方法中，體幹細胞的尺寸(如大小)可為1µm至6µm，較佳為大於1或2µm至小於6µm。體幹細胞可以包含尺寸大於2µm至小於6µm的CD66e(+)體幹細胞(也就是類卵裂球幹細胞)。CD349(+)體幹細胞亦為CD9(+)，而且尺寸可為大於2µm至小於6µm。Lgr5(+)體幹細胞亦為Oct4(+)與Nanog(+)、以及CD133(−)、CD66e(−)、Sox2(−)、CD4(−)、CD8(−)、CD9(−)、CD10(−)、CD11(−)、CD16(−)、CD17(−)、CD18(−)、CD19(−)、CD20(−)、CD21(−)、CD31(−)、CD42(−)、CD63(−)、CD34(−)、Lin(−)、CD38(−)、CD90(−)、CD45(−)與CD349(−)。Lgr5(+)體幹細胞的尺寸可為大於2µm至小於6µm。在含有幹細胞的溶液中，Lgr5(+)體幹細胞占尺寸大於2µm至小於6µm的細胞的百分比為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，CD349(+)體幹細胞占尺寸大於2µm至小於6µm的細胞的百分比為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，白血球占尺寸大於2µm至小於20µm的細胞的百分比為小於2%(較佳為小於1%、0.5%或0.1%)，紅血球占尺寸大於2µm至小於10µm的細胞的百分比為小於3%(較佳為小於2%、1%或0.5%)。另外，含有幹細胞的溶液中少於1%細胞表現或表達CD133。上述血液樣本可取自於一個體(如人或動物)的周邊血液，並且含有複數個細胞。
為達到上述之目的，本發明提供一種含有幹細胞的溶液，其可用於植牙治療或骨移植術。該含有幹細胞的溶液含有尺寸大於2µm至小於6µm的CD349(+)體幹細胞(SB-1細胞)、尺寸大於2µm至小於6µm的Lgr5(+)體幹細胞(SB-2細胞)以及尺寸大於2µm至小於6µm的CD66e(+)體幹細胞(類卵裂球幹細胞)。該含有幹細胞的溶液也還可以含有一鹽類(如氯化鈉)或一鹽溶液。鹽溶液可以是(杜氏)磷酸鹽緩衝液或無鈣離子(Ca2+ )的溶液。無鈣離子的溶液也可以不含有任何其它的二價離子，例如鎂離子(Mg2+ )。無鈣離子的溶液可以是生理食鹽水，即0.9%鹽溶液。在含有幹細胞的溶液中，Lgr5(+)體幹細胞占尺寸大於2µm至小於6µm的細胞的百分比為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，CD349(+)體幹細胞占尺寸大於2µm至小於6µm的細胞的百分比為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，CD66e(+)體幹細胞占尺寸大於2µm至小於6µm的細胞的百分比為小於6%(較佳為小於5%或4.5%)，白血球占尺寸大於2µm至小於20µm的細胞的百分比為小於2%(較佳為小於1%、0.5%或0.1%)，紅血球占尺寸大於2µm至小於10µm的細胞的百分比為小於3%(較佳為小於2%、1%或0.5%)。
現將經由對說明性實施例、隨附圖式及申請專利範圍之以下詳細描述的評述，使本發明之此等以及其他組件、步驟、特徵、效益及優勢變得明朗。
圖式揭示本發明之說明性實施例。其並未闡述所有實施例。可另外或替代使用其它實施例。為節省空間或更有效地說明，可省略顯而易見或不必要之細節。相反，可實施一些實施例而不揭示所有細節。當相同數字或標號出現在不同圖式中時，其係指相同或類似組件或步驟。當以下描述連同隨附圖式一起閱讀時，可更充分地理解本發明之態樣，該等隨附圖式之性質應視為說明性而非限制性的。
以下先介紹本發明的各種定義與描述，然後再詳細說明本發明的實施例。
細胞尺寸(Z)的定義:
在本發明中，後續段落提及的尺寸(Z)可用於描述細胞(例如(體)幹細胞或生物細胞)的大小。尺寸(Z)可以(但不限定)被描述或定義為：(1)細胞生物學領域或幹細胞領域對於細胞的大小或代表長度的傳統定義、(2)細胞的直徑(特別是當細胞的形狀實質上為球體時)、(3)細胞的長軸長度(特別是當細胞的形狀實質上為橢圓體時)、(4)細胞的寬度(當細胞的形狀近似於正方體時)、(5)細胞的長度(當細胞的形狀近似於長方體時)或是(6)細胞的最大橫斷面或橫向尺寸。透過光學顯微鏡或電子顯微鏡(例如掃描式電子顯微鏡)獲得的細胞影像或是透過流式細胞儀(flow cytometer)獲得的資料(例如二維點、輪廓或密度圖)可以用來判定或測量尺寸(Z)—不論是直徑、長度、寬度或是最大橫斷面或橫向尺寸。透過光學顯微鏡或電子顯微鏡獲得的細胞影像可以是細胞的二維剖面圖或立體結構。舉例來說，經由光學顯微鏡或電子顯微鏡(例如掃描式電子顯微鏡)可獲得一個二維剖面影像，然後通過測量二維剖面影像中細胞的最大橫斷面或橫向尺寸就可以獲得細胞的尺寸(Z)。
幹細胞定義:
體幹細胞(somatic stem cell)，亦稱成體幹細胞(adult stem cell)，可以在骨髓、脂肪或周邊血液等器官或組織中發現，並且具有與所有幹細胞相同的基本特徵。體幹細胞是未特化的細胞(unspecialized cell)或未分化的細胞(undifferentiated cell)，而且能夠分化成特定的細胞種類。“體幹細胞”術語在本發明不屬於或不包含胚胎幹細(embryonic stem cell)；換句話說，本發明中的體幹細胞不是取自於或來自於胚胎或胚胎組織。
體幹細胞有許多不同的種類，包括全能幹細胞(totipotent stem cell)、多功能幹細胞(pluripotent stem cell)、多潛能幹細胞(multipotent stem cell)以及先驅幹細胞(progenitor stem cell)。先驅幹細胞也可以稱為專一性幹細胞或單能幹細胞(unipotent stem cell)。類卵裂球幹細胞(blastomere-like stem cell，簡稱BLSC)屬於全能幹細胞或多功能幹細胞。極小類胚胎幹細胞(very small embryonic-like stem cell，簡稱VSEL)屬於多功能幹細胞。SB-1細胞和SB-2細胞屬於多功能幹細胞或多潛能幹細胞。間質幹細胞(mesenchymal stem cell，簡稱MSC)、造血幹細胞(hematopoietic stem cell，簡稱HSC)、多潛能成體先驅細胞(multipotent adult progenitor cell，簡稱MAPC)、骨髓多潛能幹細胞(bone marrow derived multipotent stem cell，簡稱BMSC)以及多潛能成體幹細胞(multipotent adult stem cell，簡稱MASC)屬於多潛能幹細胞。神經幹細胞(neural stem cell)、視網膜幹細胞 (retina stem cell)、嗅球幹細胞 (olfactory bulbs stem cell)、上皮幹細胞 (epidermal stem cell)、肌肉幹細胞 (muscle stem cell)、腸道幹細胞 (intestine stem cell)、胰臟幹細胞 (pancreatic stem cell)、心臟幹細胞 (heart stem cell)、肝臟幹細胞 (liver stem cell)、腎臟幹細胞 (kidney stem cell)、內皮幹細胞(endothelial stem cell)、脂肪幹細胞(adipocyte or adipose-derived stem cell)、成體骨髓多元性誘導細胞(marrow-isolated adult multilineage inducible cell)、前間質幹細胞(pre-mesenchymal stem cell，簡稱pre-MSC)、間質先驅細胞(mesenchymal progenitor cell)、造血先驅細胞(hematopoietic progenitor cell，簡稱HPC)、多潛能先驅細胞(multipotent progenitor cells，簡稱MPP)、譜系限制先驅細胞(lineage-restricted progenitor cell，簡稱LRP)、共同髓原先驅細胞(common myeloid progenitor cell，簡稱CMP)以及共同淋巴球先驅細胞(common lymphocyte progenitor cell，簡稱CLP)屬於先驅幹細胞。
在後續段落中，跟隨在一細胞(表面)標記後面的符號“+”表示細胞(例如幹細胞)可以表現或表達該細胞(表面)標記，也就是說流式細胞儀可以經由(特定標記用的)抗體偵測到存在於細胞表面的該細胞(表面)標記。跟隨在一細胞(表面)標記後面的符號“−”表示細胞(例如幹細胞)無法表現或表達該細胞(表面)標記，也就是說該細胞(表面)標記沒有存在於細胞的表面，而且流式細胞儀也無法經由(特定標記用的)抗體偵測到該細胞(表面)標記。因此，正號“+”是指細胞(例如幹細胞)可以表現或表達細胞(表面)標記，負號“−”則是指細胞(例如幹細胞)無法表現或表達細胞(表面)標記。
SB-1細胞為含有細胞核的多功能或多潛能幹細胞，並且是CD349(+)細胞。CD349(+)體幹細胞(即SB-1細胞)也被發現為CD9(+)、Oct4(+)與Nanog(+)、以及CD133(−)、CD90(−)、CD34(−)與Sox2(−)。CD349(+)體幹細胞的尺寸(關於尺寸的描述可參閱上述尺寸(Z)的定義)是小於或等於4微米(micrometer，符號µm)、5微米或6微米，例如是介於0.1微米至6微米之間、介於0.5微米至6微米之間、介於1微米至6微米之間、介於2微米至6微米之間、介於0.1微米至5微米之間、介於0.5微米至5微米之間、介於1微米至5微米之間、介於0.1微米至4微米之間、介於0.5微米至4微米之間或介於1微米至4微米之間。較佳地，SB-1細胞的尺寸是大於2微米至小於6微米。SB-1細胞可以表現細胞(表面)標記CD349，因而能夠以CD349(+)為特徵。
SB-2細胞為含有細胞核的多功能或多潛能幹細胞，並且是Lgr5(+)細胞。Lgr5(+)體幹細胞(即SB-2細胞)也被發現為Oct4(+)與Nanog(+)、以及CD133(−)、CD66e(−)、CD4(−)、CD8(−)、CD9(−)、CD10(−)、CD11(−)、CD16(−)、CD17(−)、CD18(−)、CD19(−)、CD20(−)、CD21(−)、CD31(−)、CD42(−)、CD63(−)、CD34(−)、Lin(−)、CD38(−)、CD90(−)、CD45(−)、CD349(−)與Sox2(−)。Lgr5(+)體幹細胞的尺寸(關於尺寸的描述可參閱上述尺寸(Z)的定義)是小於或等於4微米、5微米或6微米，例如是介於0.1微米至6微米之間、介於0.5微米至6微米之間、介於1微米至6微米之間、介於2微米至6微米之間、介於0.1微米至5微米之間、介於0.5微米至5微米之間、介於1微米至5微米之間、介於0.1微米至4微米之間、介於0.5微米至4微米之間或介於1微米至4微米之間。較佳地，SB-2細胞的尺寸是大於2微米至小於6微米。SB-2細胞可以表現細胞(表面)標記Lgr5，因而能夠以Lgr5(+)為特徵。在本發明中，SB細胞包含CD349(+)體幹細胞(即SB-1細胞)和Lgr5(+)體幹細胞(即SB-2細胞)。
類卵裂球幹細胞(BLSC)為含有細胞核的全能或多功能幹細胞，並且是CD66e(+)細胞。CD66e(+)體幹細胞(即類卵裂球幹細胞)的尺寸(關於尺寸的描述可參閱上述尺寸(Z)的定義)是小於或等於4微米、5微米或6微米，例如是介於0.1微米至6微米之間、介於0.5微米至6微米之間、介於1微米至6微米之間、介於2微米至6微米之間、介於0.1微米至5微米之間、介於0.5微米至5微米之間、介於1微米至5微米之間、介於0.1微米至4微米之間、介於0.5微米至4微米之間或介於1微米至4微米之間。較佳地，類卵裂球幹細胞的尺寸是大於2微米至小於6微米。類卵裂球幹細胞可以表現細胞(表面)標記CD66e，因而能夠以CD66e(+)為特徵。
極小類胚胎幹細胞(VSEL)為含有細胞核的多功能幹細胞，而且可以是CD133(+)體幹細胞與CD34(+)體幹細胞。屬於極小類胚胎幹細胞的CD133(+)體幹細胞與CD34(+)體幹細胞也被發現為CD45(−)與Lin(−)。CD133(+)體幹細胞與CD34(+)體幹細胞的尺寸(關於尺寸的描述可參閱上述尺寸(Z)的定義)可以是小於或等於4微米、5微米或6微米，例如是介於0.1微米至6微米之間、介於0.5微米至6微米之間、介於1微米至6微米之間、介於2微米至6微米之間、介於0.1微米至5微米之間、介於0.5微米至5微米之間、介於1微米至5微米之間、介於0.1微米至4微米之間、介於0.5微米至4微米之間或介於1微米至4微米之間。較佳地，CD133(+)體幹細胞與CD34(+)體幹細胞的尺寸是大於2微米至小於6微米。就CD133(+), CD45(−), Lin(−)體幹細胞而言，這種極小類胚胎幹細胞可以表現細胞(表面)標記CD133，但是無法表現細胞(表面)標記CD45和Lin，因此這種極小類胚胎幹細胞能夠以CD133(+)、CD45(−)和Lin(−)為特徵。就CD34(+), CD45(−), Lin(−)體幹細胞而言，這種極小類胚胎幹細胞可以表現細胞(表面)標記CD34，但是無法表現細胞(表面)標記CD45和Lin，因此這種極小類胚胎幹細胞能夠以CD34(+)、CD45(−)和Lin(−)為特徵。
間質幹細胞(MSC)為含有細胞核的多潛能幹細胞，並且可以是CD13(+)體幹細胞、CD29(+)體幹細胞、CD44(+)體幹細胞、CD73(+)體幹細胞、CD90(+)體幹細胞或CD105(+)體幹細胞。間質幹細胞可以表現下列一種或多種的細胞(表面)標記：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105。因此，間質幹細胞可以具有下列一種或多種的特徵：CD13(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD73(+)、C90(+)和CD105(+)。間質幹細胞有各種非常不同的細胞群，因而具有各種的尺寸及形狀。例如，某些類型的間質幹細胞的尺寸(關於尺寸的描述可參閱上述尺寸(Z)的定義)是小於或等於4微米、5微米或6微米，例如是介於0.1微米至6微米之間、介於0.5微米至6微米之間、介於1微米至6微米之間、介於0.1微米至5微米之間、介於0.5微米至5微米之間、介於1微米至5微米之間、介於0.1微米至4微米之間、介於0.5微米至4微米之間或介於1微米至4微米之間。其它類型的間質幹細胞的尺寸(關於尺寸的描述可參閱上述尺寸(Z)的定義)則是大於6微米、7微米或10微米。
造血幹細胞(HSC)為含有細胞核的多潛能幹細胞。造血幹細胞包括CD34(+), cKit(−), CD38(−), Lin(−)細胞與CD150(+), CD244(−), CD48(−)細胞。屬於造血幹細胞的CD34(+), cKit(−), CD38(−), Lin(−)體幹細胞與CD150(+), CD244(−), CD48(−)體幹細胞的尺寸(關於尺寸的描述可參閱上述尺寸(Z)的定義)可以是小於或等於4微米、5微米或6微米，例如是介於0.1微米至6微米之間、介於0.5微米至6微米之間、介於1微米至6微米之間、介於0.1微米至5微米之間、介於0.5微米至5微米之間、介於1微米至5微米之間、介於0.1微米至4微米之間、介於0.5微米至4微米之間或介於1微米至4微米之間。就CD34(+), cKit(−), CD38(−), Lin(−)體幹細胞而言，這種造血幹細胞可以表現細胞(表面)標記CD34，但是無法表現細胞(表面)標記cKit、CD38和Lin，因此這種造血幹細胞能夠以CD34(+)、cKit(−)、CD38(−)和Lin(−)為特徵。就CD150(+), CD244(−), CD48(−)體幹細胞而言，這種造血幹細胞可以表現細胞(表面)標記CD150，但是無法表現細胞(表面)標記CD244和CD48，因此這種造血幹細胞能夠以CD150(+)、CD244(−)和CD48(−)為特徵。
行為或方法(X)的描述：
以下列出行為或方法(X)的範例。這些行為或方法被認為可以有效增加一個體(例如人體或非人體)體內某一種或特定幾種幹細胞的數量。該非人體可以是動物。
行為或方法(X)包括：
1. 服用藥物，例如合成藥物或含有天然萃取物的藥物；
2. 服用草藥或中藥，例如冬蟲夏草、人參、枸杞、靈芝、牛樟芝以及/或是巴西蘑菇；
3. 服用營養品或膳食補充品(dietary supplement)，例如營養片或營養粉，該營養品或膳食補充品可以含有下列一種或多種的物質或成分：維他命(如維他命A、維他命B、維他命B群、維他命B12 、維他命D、維他命D3 、維他命E等)、巨量及/或微量礦物質(如鈣、鈉、鉀、氟、溴、鉻、碘、矽、硒、鈹、鋰、鈷、釩、鎳等)、多醣(polysaccharide)、含岩藻糖之高分子活性醣蛋白(high molecular weight fucose-containing glycoprotein)、海藻(包括綠藻、藍綠藻、褐藻等)、岩藻糖(fucose)、褐藻的主要成分—褐藻糖膠(fucoidan)、小分子褐藻糖膠(oligo fucoidan)、藻類、含有褐藻糖膠的褐藻(如生長或生產在日本沖繩縣的褐藻)、日本的水雲(mozuku)、綠藻、藍綠藻(或稱藍藻)、褐藻(包括水雲、昆布(kelp)、裙帶菜(undaria pinnatifida)、羊栖菜(sargassum fusiforme)等)、植化素(phytochemical)(如異黃酮素(isoflavones)、植物雌激素(phytoestrogen)等)、茄紅素(lycopene)、表沒食子兒茶素沒食子酸脂(epigallocatechin gallate，簡稱EGCG)、綠茶素(green tea essence)、醣質營養素(gluconutrients)(如半乳糖(Galactose)、木糖(Xylose)、葡萄糖(Glucose)、甘露糖(Mannose)、乙醯葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)、乙醯半乳糖胺(N-acetyl galactosamine)、乙醯神經胺酸(N-acetyl neuraminic acid)等)、魚油、香樁、取自植物、葉子、果實、蔬菜、魚、海藻或藻類的營養素；
4. 勵行素食飲食；
5. 食用健康食品或有機食品；
6. 服用另類(非傳統的)藥物；
7. 接受另類療法或另類治療，例如葛森療法(Gerson therapy)或布魯士癌症療法(the Breuss cancer cure)；
8. 接受針灸治療；
9. 接受按摩，例如足底按摩；
10. 做運動，例如走路、慢跑、跳舞、體操、瑜珈、有氧運動以及/或是太極拳；
11. 睡覺(其目的在於評估睡眠品質)；
12. 冥想；
13. 進行由個人、保健專家或醫生設計的健康改善計畫或疾病治療計畫；
14. 服用某種可以改善體內器官健康狀況的營養品，例如服用可以改善前列腺健康狀況的茄紅素；
15. 進行復健計畫，以治療傷害、治療由手術造成的創傷或是治療疾病；
16. 飲用藥酒(藥酒乃是將一種或數種藥材浸泡在酒裡存放一段時間而製成)，例如飲用人參藥酒(人參藥酒是將人參浸泡在高酒精濃度米酒裡一個月的時間而製成)；
17. 服用政府部門或機構(如美國食品藥物管理局)核准用於治療特定疾病(如癌症、皮膚病、腎臟病等)的一種或數種藥物；
18. 接受政府部門核准用於治療特定疾病(如癌症、皮膚病、腎臟病等)的一種或數種治療方法；
19. 從事或參與宗教活動，例如禱告或拜神等；
20. 接受陽光(或日光)直接照射或間接照射，接受照射的時間可以是: (1)日出前10分鐘至日出後50分鐘的早晨時段(此時含有大量的紅外線)、(2)上午11點30分(11:30AM)至下午12點30分(12:30PM)的中午時段(此時含有大量的紫外線)、或是(3)日落前50分鐘至日落後10分鐘的下午時段(此時含有大量的紅外線)；
21. 照射日光燈或發光二極體(LED)發出的光源，日光燈或發光二極體發出的光源可包含可見光的整個光譜(spectrum)、紅外線的整個光譜、紅光的整個光譜、綠光的整個光譜、藍光的整個光譜、紫外線的整個光譜或混合上述一種以上光線的整個光譜；
22. 進行或接受改善身體自癒力的計畫、治療、方法、儀器以及/或是系統，例如病後、傷後或術後用於改善身體自癒力的方法或治療(如高壓氧治療)；
23. 飲用咖啡，例如黑咖啡；
24. 喝茶，例如綠茶、紅茶或茉莉花茶；
25. 飲用紅酒；
26. 服用褪黑激素(melatonin)；
27. 聆聽音樂，例如莫札特交響曲或貝多芬交響曲；
28. 注射含有褐藻糖膠或小分子褐藻糖膠的物質，例如含有褐藻糖膠或小分子褐藻糖膠的營養品或補充品；
29. 服用荷爾蒙補充品或是注射荷爾蒙；
30. 注射顆粒性白血球聚落刺激因子(GCSF或G-CSF)，該因子為細胞激素(cytokine)或荷爾蒙(醣蛋白)，能夠刺激骨髓產生顆粒性白血球(granulocyte)和幹細胞，以釋放它們到血流裡；
31. 接受顆粒性白血球聚落刺激因子注射療程；以及
32. 服用營養品、營養產品、營養液、營養飲料、營養補充劑或營養食品，其係含有：(1)各種的胺基酸(例如精胺酸(Arginine)、組胺酸(Histidine)、離胺酸(Lysine)、天門冬胺酸(Aspartic acid)、麩胺酸(Glutamic acid)、絲胺酸(Serine)、羥丁胺酸(或稱蘇胺酸，Threonine)、天門冬醯胺酸(Asparagine)、麩醯胺酸(Glutamine)、半胱胺酸(Cysteine)、硒半胱胺酸(Selenocysteine)、甘胺酸(Glycine)、脯胺酸(Proline)、色胺酸(Tryptophan)、丙胺酸(Alanine)、纈胺酸(Valine)、異白胺酸(Isoleucine)、白胺酸(Leucine)、甲硫胺酸(Methionine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)、酪胺酸(Tyrosine)等)、(2)均衡胺基酸(balanced amino acid)、或是(3)九種人體必需胺基酸(也就是，組胺酸、異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、羥丁胺酸、色胺酸以及纈胺酸)。例如，(a)含紅豆、綠豆或黑豆發酵物的產品、(b)含一種或數種水果(例如甜菜(sugar beet)、蘋果、番石榴、奇異果、葡萄、鳳梨、火龍果、青木瓜、番茄、酪梨等)發酵物的液態物、飲料或飲品、(c)將一種或數種藥材浸泡在酒裡存放一段時間而製成的藥酒，例如將人參浸泡在高酒精濃度的米酒裡一個月時間而製成的人參藥酒。
實施例：
圖1揭示用於製備或製作含有幹細胞之溶液的六個步驟S1、S2、S3、S4、S5和S6。依序進行或實施圖1所示的步驟S1至S6可以製備、獲得或製作一種含有幹細胞的溶液。請參閱圖1所示，在步驟S1中，從一受治療者(即個體)的周邊血液取出、採集、獲得或提取一血液樣本，並放入到一個或多個含有二價陽離子螯合劑的第一容器(例如一個儲存袋、一個或多個注射器、或是一個或多個採血管)中，然後讓血液樣本與二價陽離子螯合劑均勻混合，以致第一容器裡有血液樣本和二價陽離子螯合劑的第一混合液。在本發明中，受治療者的周邊血液屬於非胚胎組織。二價陽離子螯合劑為一抗凝劑(anticoagulant)。在本發明中，二價陽離子螯合劑可以是乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，簡稱EDTA)，例如乙二胺四乙酸二鉀(K2 EDTA)抗凝劑或乙二胺四乙酸三鉀(K3 EDTA)抗凝劑，或者是檸檬酸鹽(citrate)。每一個第一容器裡可以含有70毫克(milligram，簡稱mg)以上的二價陽離子螯合劑，譬如含有90~900毫克的二價陽離子螯合劑、含有120~450毫克的二價陽離子螯合劑或是含有150~400毫克的二價陽離子螯合劑。受治療者可以是一人類(例如孩童、青少年、成年人或老年人)或是一動物(例如哺乳動物)。該動物可以是：靈長類動物(如猴子或大猩猩)、狗、齧齒動物(如老鼠或豚鼠)、貓、馬、牛、羊、豬、雞、鴨、鵝、鳥或大象。
血液樣本含有許多細胞，包括尺寸小於或等於6微米的小細胞和尺寸大於6微米的大細胞。小細胞包含血小板(其尺寸為小於6微米)和小體幹細胞(其尺寸為小於或等於6微米，較佳為大於1或2微米至小於或等於6微米)。小體幹細胞例如包括一種或多種特定種類的體幹細胞(例如SB細胞)、類卵裂球幹細胞(即CD66e(+)體幹細胞)以及極小類胚胎幹細胞(即CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。大細胞包括尺寸大於6微米的大體幹細胞以及紅血球和白血球等譜系細胞(lineage cell)。血液樣本的量(體積)可以大於或等於20、30或45毫升，例如20~250毫升、60~500毫升、80~250毫升或100~200毫升。為了獲得或形成第一混合液，每毫升的血液樣本可混合1.5毫克或以上(較佳為1.6~2.0毫克)的二價陽離子螯合劑(例如K2 EDTA、K3 EDTA或檸檬酸鹽)。前述的一種或多種特定種類的體幹細胞(以下稱為“特定體幹細胞”)可以是或是含有上述“幹細胞定義”中的一種或多種幹細胞。例如，特定體幹細胞可以是或是含有尺寸等於或小於6µm(較佳則是介於1µm至6µm之間或是大於1或2µm至小於6µm)的體幹細胞，如SB-1細胞、SB-2細胞、類卵裂球幹細胞、極小類胚胎幹細胞、間質幹細胞以及/或是造血幹細胞。或者，特定體幹細胞可以是或是含有尺寸小於6µm(較佳則是大於2µm至小於6µm)的體幹細胞，例如CD349(+)體幹細胞(即SB-1細胞)以及/或是Lgr5(+)體幹細胞(即SB-2細胞)以及/或是CD66(+)體幹細胞(即類卵裂球幹細胞)。
在步驟S2中，將第一混合液存放在溫度為攝氏2至12度(較佳為攝氏2至7度或大約攝氏4度)的設備中靜置一段(預定的)時間，例如3至72小時，較佳為3至6小時、6至72小時、6至48小時、16至72小時、16至48小時、36至60小時或48至72小時。前述的設備可以是冰箱或是可使物品保持低溫的裝置。在已存放前述的一段(預定的)時間的第一混合液中，特定體幹細胞(例如SB細胞)通過二價陽離子螯合劑(如K2 EDTA、K3 EDTA或檸檬酸鹽)而被活化；換言之，特定體幹細胞的細胞週期從G0 期被活化到(或稱進入到)G1 期。該活化作用與二價陽離子螯合劑抑制p53功能的能力(可能藉由螯合Zn2+ )有關，藉由抑制p53的功能，可讓特定體幹細胞離開G0 靜止期並進入細胞週期G1 。由於P53蛋白質需要Zn2+ 才能適當地折疊來形成功能性蛋白質，因此藉由二價陽離子螯合劑螯合Zn2+ 會是活化特定體幹細胞的關鍵步驟。另外，二價陽離子螯合劑也有可能螯合其它的二價離子(如Ca2+ )來活化處於G0 期的特定體幹細胞。
在第一混合液處於上述的溫度並經過上述的一段(預定的)時間之後，第一混合液會因重力的關係分成兩層或以上，即第一混合液形成兩個或兩個以上的分離層(例如包含上分離層和下分離層)。該些分離層其中之一，例如上分離層或最上層的分離層，可以是上清液(supernatant liquid)，並可分為三個部分：血小板(尺寸可為小於6微米)、血清(serum)和小體幹細胞，其中小體幹細胞包含特定體幹細胞(例如SB細胞)、類卵裂球幹細胞(即CD66e(+)體幹細胞)以及極小類胚胎幹細胞(即CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。上清液的量(體積)可以是6毫升至120毫升、20毫升至250毫升、40毫升至125毫升或是50毫升至100毫升。上述分離層中的上清液可含有二價陽離子螯合劑(例如乙二胺四乙酸)及/或生長因子。該些分離層的另一層，例如下分離層，包含了第一混合液中絕大多數的或非常高百分比的大細胞，其中該些大細胞包括紅血球和白血球等譜系細胞以及大體幹細胞。例如，該另一分離層可以含有第一混合液中95%、98%、99%或以上的大細胞。因此，上清液大體上不含有大細胞(如紅血球和白血球)或是含有第一混合液中不到0.5%、1%、2%或5%的大細胞。例如，上清液可以含有第一混合液中不到1%或2%的紅血球以及第一混合液中不到1%或2%的白血球；第一混合液中至少98%或99%的紅血球以及第一混合液中至少98%或99%的白血球係聚集在上述的另一分離層(如下分離層)中。上清液的量(體積)除以血液樣本的量(體積)所得到的比值可在1/3至1/2之間。上清液的量(體積)除以第一混合液的量(體積)所得到的比值可在1/3至1/2之間。綜上所述，按照步驟S1和步驟S2，來自受治療者的血液樣本會與二價陽離子螯合劑在上述的溫度中培養或培育上述的一段(預定的)時間，使血液樣本分成兩層或以上，即血液樣本形成兩個或兩個以上的分離層(該些分離層包括上清液)。
在步驟S3中，絕大部分的或大體上所有的上清液被聚集或轉移到一個第二容器(例如一儲存袋、一玻璃瓶或一注射器)中。第二容器中的上清液(以下稱為“細胞混合液”)含有小細胞，例如血小板和小體幹細胞，其中小體幹細胞包含特定體幹細胞(如SB細胞)、類卵裂球幹細胞(即CD66e(+)體幹細胞)以及極小類胚胎幹細胞(即CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。尺寸大於2微米至小於6微米的體幹細胞在細胞混合液中的數量可大於或等於1000萬顆或3000萬顆，較佳為2500萬~30000萬顆、3000萬~50000萬顆或1000萬~50000萬顆。細胞混合液可以含有二價陽離子螯合劑(例如乙二胺四乙酸)及/或生長因子。在細胞混合液中，大細胞的數量占全部粒子或細胞的數量的百分比可小於5%、1%或0.5%(較佳為小於0.1%或0.01%)，小細胞的數量占全部粒子或細胞的數量的百分比可大於95%、99%或99.5%(較佳為大於99.9%或99.99%)。
根據圖6A和圖6B的資料，可以計算出每毫升細胞混合液中的紅血球數量。圖6A是以流式細胞儀分析10微升(microliter，簡稱µl)的細胞混合液後所得到的。紅血球，即CD235a(+)細胞，是位在圖6A的區域R3中；區域R3中的細胞總數為25000。圖6B示出與區域R3中所有細胞有關的CD235a螢光強度的分布。在圖6B中，螢光直方圖被垂直線2a(即參考線)分為低螢光強度的區域V3-L和高螢光強度的區域V3-R。圖6B的區域V3-R表示細胞對CD235a染色呈陽性，即紅血球；圖6B的區域V3-L表示細胞對CD235a染色呈陰性。圖6B的結果顯示區域R3中的紅血球數佔區域R3中的細胞總數的百分比為0.1%。將區域R3中的細胞總數(即25000)乘以區域R3中的紅血球數佔區域R3中的細胞總數的百分比(即0.1%)可計算出10微升細胞混合液中的紅血球數(其係為25)。然後，利用10微升細胞混合液中的紅血球數計算出每毫升細胞混合液中的紅血球數量，其計算出的數量為2500。由上述結果可知，每毫升細胞混合液中的紅血球數量為小於105 或104 。較佳地，每毫升細胞混合液中的紅血球數量為小於103 。另外，在細胞混合液中，紅血球占尺寸大於2微米至小於10微米的細胞的百分比可為小於3%，較佳為小於2%、1%或0.5%。
根據圖6C的流式細胞儀資料，可以計算出每毫升細胞混合液中的白血球數量。圖6C的流式細胞儀資料是以流式細胞儀分析50微升的細胞混合液後所得到的。在圖6C中，區域R1為分析白血球所作的設門(gating)。50微升細胞混合液中的白血球數可經由圖6C的流式細胞儀資料來獲得，其計算出的數量為30。然後，利用50微升細胞混合液中的白血球數計算出每毫升細胞混合液中的白血球數量，其計算出的數量為600。由上述結果可知，每毫升細胞混合液中的白血球數量為小於104 或103 。較佳地，每毫升細胞混合液中的白血球數量為小於102 。另外，在細胞混合液中，白血球占尺寸大於2微米至小於20微米的細胞的百分比可為小於2%，較佳為小於1%、0.5%或0.1%。
圖7A示出前向散射係數(forward scattering coefficient，簡稱FSC)對側向散射係數(side scattering coefficient，簡稱SSC)的流式細胞儀點狀圖(flow cytometry dot plot)。圖7A的點狀圖是以流式細胞儀分析5.6微升的細胞混合液後所得到的。在圖7A中，尺寸大於2微米至小於6微米的細胞位在區域R5。換句話說，區域R5中的所有細胞的尺寸是大於2微米至小於6微米。圖7B示出與區域R5中所有細胞有關的CD61螢光強度的分布。在圖7B中，螢光直方圖被一垂直線(即參考線)分為低螢光強度的區域V1-L和高螢光強度的區域V1-R。圖7B的區域V1-R表示細胞對CD61染色呈陽性，即血小板；圖7B的區域V1-L表示細胞對CD61染色呈陰性。圖7B的結果顯示區域R5中的血小板數佔區域R5中的細胞總數的百分比為80.5%。因此，在細胞混合液中，血小板佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於75%或80%，較佳為介於75%至85%。
圖7C示出與圖7A區域R5中所有細胞有關的CD133螢光強度的分布。在圖7C中，螢光直方圖被一垂直線(即參考線)分為低螢光強度的區域V3-L和高螢光強度的區域V3-R。圖7C的區域V3-R表示細胞對CD133染色呈陽性，即極小類胚胎幹細胞；圖7C的區域V3-L表示細胞對CD133染色呈陰性。圖7C的結果顯示區域R5中的CD133(+)細胞數佔區域R5中的細胞總數的百分比為0.3%。由上述可知，細胞混合液中少於1%細胞表現或表達CD133。圖7D示出與圖7A區域R5中所有細胞有關的CD34螢光強度的分布。在圖7D中，螢光直方圖被一垂直線(即參考線)分為低螢光強度的區域V1-L和高螢光強度的區域V1-R。圖7D的區域V1-R表示細胞對CD34染色呈陽性，即極小類胚胎幹細胞；圖7D的區域V1-L表示細胞對CD34染色呈陰性。圖7D的結果顯示區域R5中的CD34(+)細胞數佔區域R5中的細胞總數的百分比為0.4%。因此，在細胞混合液中，CD133(+)細胞和CD34(+)細胞共佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為小於2%，較佳為小於1%或0.5%。
圖7E示出與圖7A區域R5中所有細胞有關的CD66e螢光強度的分布。在圖7E中，螢光直方圖被一垂直線(即參考線)分為低螢光強度的區域V2-L和高螢光強度的區域V2-R。圖7E的區域V2-R表示細胞對CD66e染色呈陽性，即類卵裂球幹細胞；圖7E的區域V2-L表示細胞對CD66e染色呈陰性。圖7E的結果顯示區域R5中的CD66e(+)細胞數佔區域R5中的細胞總數的百分比為4%。因此，在細胞混合液中，CD66e(+)細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為小於6%，較佳為小於5%或4.5%。
圖7F示出與圖7A區域R5中所有細胞有關的CD349螢光強度的分布。在圖7F中，螢光直方圖被一垂直線(即參考線)分為低螢光強度的區域V3-L和高螢光強度的區域V3-R。圖7F的區域V3-R表示細胞對CD349染色呈陽性，即SB-1細胞；圖7F的區域V3-L表示細胞對CD349染色呈陰性。圖7F的結果顯示區域R5中的CD349(+)細胞數佔區域R5中的細胞總數的百分比為5.6%。因此，在細胞混合液中，CD349(+)細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於4%或5%，較佳為介於4.5%至10%。
圖7G示出與圖7A區域R5中所有細胞有關的Lgr5螢光強度的分布。在圖7G中，螢光直方圖被一垂直線(即參考線)分為低螢光強度的區域V2-L和高螢光強度的區域V2-R。圖7G的區域V2-R表示細胞對Lgr5染色呈陽性，即SB-2細胞；圖7G的區域V2-L表示細胞對Lgr5染色呈陰性。圖7G的結果顯示區域R5中的Lgr5(+)細胞數佔區域R5中的細胞總數的百分比為5.4%。因此，在細胞混合液中，Lgr5(+)細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於4%或5%，較佳為介於4.5%至10%。
在步驟S4中，將細胞混合液(即第二容器中的上清液)以適當的轉速(例如每分鐘轉速(rpm)從等於或大於1,200轉到等於或小於3,000轉，較佳則是從等於或大於1,400轉到等於或小於2,000轉)離心一段適當的時間(例如從等於或大於10分鐘到等於或小於25分鐘，較佳則是從等於或大於15分鐘到等於或小於20分鐘)，使懸浮於細胞混合液中的複數個顆粒沉積或聚集在第二容器的底部。換句話說，在經過離心之後，細胞混合液可以歸納成或分為兩個主要部份：經過離心的液體(以下稱為“離心液體”)和該些顆粒，其中離心液體位在第二容器裡，該些顆粒聚集或沉積在第二容器的底部、離心液體中以及離心液體的底部。該些顆粒包含上述的小細胞，例如血小板及小體幹細胞，其中小體幹細胞可以包含特定體幹細胞(例如SB細胞)、類卵裂球幹細胞(即CD66e(+)體幹細胞)以及極小類胚胎幹細胞(即CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。
根據來自圖6A至圖6C和圖7A至圖7G的結果，可以估算出、假定出、推測出或得出以下數據。在該些顆粒中，SB-1細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，SB-2細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，類卵裂球幹細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為小於6%(較佳為小於5%或4.5%)，極小類胚胎幹細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為小於2%(較佳為小於1%或0.5%)，血小板佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於75%或80%(較佳為介於75%至85%)，白血球占尺寸大於2微米至小於20微米的細胞的百分比可為小於2%(較佳為小於1%、0.5%或0.1%)，紅血球占尺寸大於2微米至小於10微米的細胞的百分比可為小於3%(較佳為小於2%、1%或0.5%)。另外，該些顆粒中少於1%細胞表現或表達CD133。
在步驟S5中，將幾乎所有或頂部的離心液體從第二容器裡移除，但聚集或沉積在第二容器底部、離心液體中及離心液體底部的該些顆粒仍留在第二容器中或是留在第二容器內剩餘的離心液體的底部中。接著，在步驟S6中，將一緩衝液或液體適量地加入到第二容器中，然後讓留在第二容器內的該些顆粒重新懸浮於一液體溶液(其係可以是或可以含有該緩衝液或液體)中，以致形成一含有幹細胞的溶液(或稱為幹細胞混合液)。該含有幹細胞的溶液含有該些顆粒，例如血小板和小體幹細胞，其中小體幹細胞可以包含特定體幹細胞(例如SB細胞)、類卵裂球幹細胞(即CD66e(+)體幹細胞)以及極小類胚胎幹細胞(即CD133(+)體幹細胞和CD34(+)體幹細胞)。在某些情況(例如步驟S5是移除頂部的離心液體)下，前述的液體溶液可以還包含底部的離心液體(即第二容器內剩餘的離心液體)。在將該些顆粒重新懸浮於該液體溶液的步驟之後，該液體溶液包含該些顆粒，並與該些顆粒混在一起。前述的緩衝液或液體可以是或可以含有磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，簡稱PBS)，例如杜氏磷酸鹽緩衝液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)。或者，該緩衝液或液體可以是或可以含有無鈣離子(Ca2+ )的溶液或培養基。該無鈣離子的溶液或培養基，例如含有氯化鈉(NaCl)的溶液，還可以不含有任何其它的二價離子，例如鎂離子(Mg2+ )。該含有氯化鈉的溶液可以是生理食鹽水(normal saline)。生理食鹽水通常是指重量/體積百分比為0.9%的氯化鈉溶液，約300 mOsm/L或每公升9.0克。磷酸鹽緩衝液(PBS)例如含有氯化鈉(sodium chloride)、磷酸鈉(sodium phosphate)及磷酸鉀(potassium phosphate)。在某些配方中，磷酸鹽緩衝液(PBS)還包含氯化鉀(potassium chloride)、鎂(magnesium)和鈣(calcium)。
在另一示例中，本發明可以讓留在第二容器內的該些顆粒重新懸浮於底部的離心液體(即第二容器內剩餘的離心液體)中，以致形成一含有幹細胞的溶液(或稱為幹細胞混合液)，其係含有該些顆粒。在這個例子中，步驟S6提及之將緩衝液或液體適量地加入到第二容器的步驟可以予以省略。
在本發明中，含有幹細胞的溶液的濃度可以是每毫升含有106 至107 個SB細胞(即SB-1細胞和SB-2細胞)。另外，根據來自圖6A至圖6C和圖7A至圖7G的結果，可以估算出、假定出、推測出或得出以下數據。在含有幹細胞的溶液中，SB-1細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，SB-2細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於4%或5%(較佳為介於4.5%至10%)，類卵裂球幹細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為小於6%(較佳為小於5%或4.5%)，極小類胚胎幹細胞佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為小於2%(較佳為小於1%或0.5%)，血小板佔尺寸大於2微米至小於6微米的細胞的百分比可為大於75%或80%(較佳為介於75%至85%)，白血球占尺寸大於2微米至小於20微米的細胞的百分比可為小於2%(較佳為小於1%、0.5%或0.1%)，紅血球占尺寸大於2微米至小於10微米的細胞的百分比可為小於3%(較佳為小於2%、1%或0.5%)。另外，含有幹細胞的溶液中少於1%細胞表現或表達CD133。含有幹細胞的溶液中每毫升的白血球數可為小於104 或103 ，較佳為小於102 。含有幹細胞的溶液中每毫升的紅血球數可為小於105 或104 ，較佳為小於103 。在某些情況(例如步驟S5是移除頂部的離心液體)下，含有幹細胞的溶液還含有二價陽離子螯合劑(如乙二胺四乙酸)以及/或是生長因子。
在另一個實施例中，請參閱圖2所示，本發明可以在實施或進行步驟S1之前，先實施或進行步驟S11和步驟S12。在步驟S11中，受治療者進行或接受一行為或方法，例如上述行為或方法(X)其中之一。例如，在步驟S11中，受治療者可以服用或攝取一幹細胞驅動劑，譬如含有褐藻糖膠的化合物。該含有褐藻糖膠的化合物可以是褐藻補充品。圖3為褐藻補充品的內容/成分資訊。在圖3中，一顆褐藻補充品含有重量百分比為80%的水雲粉(mozuku powder)、重量百分比為15%的結晶纖維素(crystalline cellulose)、重量百分比為3%的蔗糖脂肪酸酯(sucrose fatty acid esters)以及重量百分比為2%的精細二氧化矽。水雲粉可以萃取自或提取自生長在日本沖繩縣周圍海域中的水雲褐藻(其係為一種海藻)。然後，將水雲粉混合結晶纖維素、蔗糖脂肪酸酯以及精細二氧化矽，以形成這顆褐藻補充品(其係含有0.1克的褐藻糖膠)。在步驟S11中，受治療者可以是服用或攝取20顆或20顆以上(例如至少30顆)的褐藻補充品，也就是說受治療者服用或攝取2克或2克以上(例如至少3克)的褐藻糖膠。或者，在步驟S11中，受治療者也可以是注射顆粒性白血球聚落刺激因子(其係為一種幹細胞驅動劑)或是接受顆粒性白血球聚落刺激因子注射療程。
在步驟S12中，受治療者在進行或接受上述行為或方法(即進行步驟S11)後等待一段(預定的)時間，例如15分鐘至60分鐘、20分鐘至100分鐘、30分鐘至4小時、60分鐘至90分鐘、0.5小時至3小時、1小時至6小時、1小時至12小時、12小時至36小時或是36小時至50小時。經由步驟S11和S12，前述的特定體幹細胞(例如SB細胞)可以從受治療者的骨髓流動到受治療者的周邊血液裡，使受治療者的周邊血液變成富含特定體幹細胞。在實施步驟S12之後，依序實施或進行圖1所示的步驟S1至S6，藉以獲得上述含有幹細胞的溶液。
圖4為一圖表，示出一個實驗中六位人類受試者C、L、M、W、Y和P的幹細胞資料，而這些幹細胞資料是由受試者C、L、M、W、Y和P的周邊血液獲得。在這個實驗中，受試者C、L、M、W和Y每個人口服20顆圖3所描述的褐藻補充品。換句話說，受試者C、L、M、W和Y每個人以口服的方式攝取至少2克的褐藻糖膠。受試者P在這個實驗中是作為一對照者，因此沒有服用前述的褐藻補充品。在圖4中，0hr對於受試者C、L、M、W和Y而言是代表“服用褐藻糖膠前”，對於受試者P而言則是代表“在對照試驗開始時”；1.5hr對於受試者C、L、M、W和Y而言是代表“在服用褐藻糖膠後的第1.5小時”，對於受試者P而言則是代表“在對照試驗開始後的第1.5小時”；24hr對於受試者C、L、M、W和Y而言是代表“在服用褐藻糖膠後的第24小時”，對於受試者P而言則是代表“在對照試驗開始後的第24小時”。如圖4所示，CD349(+)細胞和Lgr5(+)細胞(即SB細胞)的數量在服用褐藻糖膠後的第1.5小時有顯著的增加，然而CD349(+)細胞和Lgr5(+)細胞的數量在對照試驗開始後的第1.5小時並沒有顯著的增加。因此，服用或攝取褐藻糖膠(如褐藻補充品)可以驅動SB細胞(如CD349(+)細胞和Lgr5(+)細胞)移動到周邊血液或血流裡，讓周邊血液或血流富含SB細胞。
圖5A示出第一血液樣本裡有關Lgr5(+)細胞(即SB-2細胞)的流式細胞儀數據，其中第一血液樣本來自於一人類受試者在進行顆粒性白血球聚落刺激因子(GCSF)注射療程前的周邊血液。圖5B顯示第二血液樣本裡有關Lgr5(+)細胞的流式細胞儀數據，其中第二血液樣本來自於該人類受試者在進行顆粒性白血球聚落刺激因子注射療程後的周邊血液。前述的顆粒性白血球聚落刺激因子注射療程為：連續五天注射每日每公斤體重5微克(即5 micrograms/kg/day)劑量的顆粒性白血球聚落刺激因子。在這個實驗中，人類受試者連續五天每天注射一次劑量為5 micrograms/kg/day的顆粒性白血球聚落刺激因子。第二血液樣本來自於受試者在注射最後一次顆粒性白血球聚落刺激因子後大約第3.5小時的周邊血液。圖5A和圖5B是利用流式細胞儀獲得的結果或數據。在圖5A和圖5B中，區域Q5-LR中的黑點代表Lgr5(+)細胞。有關第一血液樣本獲得的圖5A，區域Q5-LR中的Lgr5(+)細胞數量占區域Q5-UL、Q5-UR、Q5LL和Q5LR中所有粒子或細胞數量的百分比為1.6%。有關第二血液樣本獲得的圖5B，區域Q5-LR中的Lgr5(+)細胞數量占區域Q5-UL、Q5-UR、Q5LL和Q5LR中所有粒子或細胞數量的百分比為8%。因此，注射顆粒性白血球聚落刺激因子可以驅動SB細胞(特別是Lgr5(+)細胞)移動到周邊血液或血流裡，讓周邊血液或血流富含SB細胞。
從上述的結果或數據可知，步驟S11的行為或方法(例如食用褐藻補充品或接受顆粒性白血球聚落刺激因子注射療程)可以驅動前述的特定體幹細胞(例如SB細胞)到受治療者的周邊血液裡，使受治療者的周邊血液可以在進行或接受上述行為或方法後的一時間點(例如第1.5小時或1~6小時內)增加特定體幹細胞的數量。因此，經由步驟S11和步驟S12可以使受治療者的周邊血液富含特定體幹細胞，例如SB-1細胞以及/或是SB-2細胞。
在一實施例中，以圖1的步驟S1至S6或圖2的步驟S11、S12及S1至S6所製備、獲得或製作的含有幹細胞的溶液可以用於骨移植術(bone graft procedure)。骨移植術可用於重建失去的組織(lost tissue)或是增加不足的組織(insufficient tissue)。在本實施例中，骨移植術包括：將(骨)移植材料和前述的含有幹細胞的溶液混合，以致形成或做出(骨)移植材料和含有幹細胞的溶液的第二混合液；以及將一有效量的第二混合液投予前述的受治療者(以下稱為“第一個體”)或另一受治療者(以下稱為“第二個體”)，例如投予第一或第二個體的齒槽骨(alveolar bone)。第二個體可以是與第一個體相同生物分類的物種(如人類)或是與第一個體不相同生物分類的物種。例如，第一個體可以是一哺乳動物(如豬)，而第二個體是一人類。上述(骨)移植材料可以是人造骨材料(synthetic bone material)、經過處裡的施體材料(processed donor material)或是第一個體本身的自體骨(autologous bone)。骨移植術也可以用在與骨或關節有關的治療中，例如植牙治療(dental implant treatment)。當骨移植術用在植牙治療時，骨移植術執行完後才會將牙科植體(dental implant)置放在第一或第二個體的齒槽骨中。位在第一或第二個體的齒槽骨裡的第二混合液會刺激骨骼生長，進而為牙科植體創造出一個稠密、結實的地基。
在另一個實施例中，以圖1的步驟S1至S6或圖2的步驟S11、S12及S1至S6所製備、獲得或製作的含有幹細胞的溶液可以用於一植牙治療。該植牙治療包括下列步驟：(1)對牙科植體進行處理；以及(2)將經過處理的牙科植體透過螺紋旋入第一或第二個體的齒槽骨，其中牙科植體的外螺紋(或螺旋)上具有一多孔性氧化鈦層(a porous titanium-oxide layer)。對牙科植體進行處理的步驟包括使多孔性氧化鈦層上具有前述的含有幹細胞的溶液，其方法可以是將牙科植體浸在含有幹細胞的溶液中或是將含有幹細胞的溶液塗佈或滴在多孔性氧化鈦層上。第二個體可以是與第一個體相同生物分類的物種(如人類)或是與第一個體不相同生物分類的物種。例如，第一個體可以是一哺乳動物(如豬)，而第二個體是一人類。多孔性氧化鈦層具有複數個微米級的孔洞(micrometer pore)、複數個次微米級的孔洞(sub-micrometer pore)及複數個奈米級的孔洞(nanometer pore)在其中；多孔性氧化鈦層的粗糙度可大於100奈米(nm)、200奈米或300奈米，例如介於200奈米至700奈米之間或介於300奈米至500奈米之間。當牙科植體透過螺紋旋入第一或第二個體的齒槽骨一段時間之後，含有幹細胞的溶液可以增強具有納米洞(nano-hole)和微米洞(micro hole)的多孔結構在多孔性氧化鈦層和齒槽骨之間的形成。在本實施例中，多孔性氧化鈦層例如是形成在牙科植體的外螺紋的鈦金屬表面上。
在另一個實施例中，以圖1的步驟S1至S6或圖2的步驟S11、S12及S1至S6所製備、獲得或製作的含有幹細胞的溶液可以用於一植牙治療。該植牙治療包括下列步驟：(1)對牙科植體進行處理；以及(2)將經過處理的牙科植體透過螺紋旋入第一或第二個體的齒槽骨。對牙科植體進行處理的步驟包括使牙科植體的外螺紋(或螺旋)的鈦金屬表面上具有前述的含有幹細胞的溶液，其方法可以是將牙科植體浸在含有幹細胞的溶液中或是將含有幹細胞的溶液塗佈或滴在牙科植體的外螺紋的鈦金屬表面上。第二個體可以是與第一個體相同生物分類的物種(如人類)或是與第一個體不相同生物分類的物種。例如，第一個體可以是一哺乳動物(如豬)，而第二個體是一人類。鈦金屬表面的粗糙度可小於50奈米(nm)或100奈米，例如介於20奈米至80奈米之間或介於30奈米至45奈米之間。當牙科植體透過螺紋旋入第一或第二個體的齒槽骨一段時間之後，含有幹細胞的溶液可使鈦金屬表面和齒槽骨之間形成具有納米洞和微米洞的多孔結構。
在另一個實施例中，以圖1的步驟S1至S6或圖2的步驟S11、S12及S1至S6所製備、獲得或製作的含有幹細胞的溶液可以用於一植牙治療。該植牙治療包括以下步驟：將牙科植體透過螺紋旋入第一或第二個體的齒槽骨，其中牙科植體具有多孔性氧化鈦層在其外螺紋(或螺旋)上，然後將含有幹細胞的溶液塗佈或滴在牙科植體的露出部分(即牙科植體的頂部)上，使含有幹細胞的溶液沿著牙科植體的多孔性氧化鈦層和第一或第二個體的齒槽骨之間的界面流動，以致牙科植體的多孔性氧化鈦層和第一或第二個體的齒槽骨之間具有含有幹細胞的溶液。第二個體可以是與第一個體相同生物分類的物種(如人類)或是與第一個體不相同生物分類的物種。例如，第一個體可以是一哺乳動物(如豬)，而第二個體是一人類。多孔性氧化鈦層具有複數個微米級的孔洞、複數個次微米級的孔洞及複數個奈米級的孔洞在其中；多孔性氧化鈦層的粗糙度可大於100奈米(nm)、200奈米或300奈米，例如介於200奈米至700奈米之間或介於300奈米至500奈米之間。當含有幹細胞的溶液位在多孔性氧化鈦層和齒槽骨之間一段時間之後，含有幹細胞的溶液可以增強具有納米洞和微米洞的多孔結構在多孔性氧化鈦層和齒槽骨之間的形成。在本實施例中，多孔性氧化鈦層例如是形成在牙科植體的外螺紋的鈦金屬表面上。
在另一個實施例中，以圖1的步驟S1至S6或圖2的步驟S11、S12及S1至S6所製備、獲得或製作的含有幹細胞的溶液可以用於一植牙治療。該植牙治療包括以下步驟：將牙科植體透過螺紋旋入第一或第二個體的齒槽骨，其中牙科植體的外螺紋(或螺旋)的表面為鈦金屬表面，然後將含有幹細胞的溶液塗佈或滴在牙科植體的露出部分(即牙科植體的頂部)上，使含有幹細胞的溶液沿著牙科植體的外螺紋的鈦金屬表面和第一或第二個體的齒槽骨之間的界面流動，以致鈦金屬表面和第一或第二個體的齒槽骨之間具有含有幹細胞的溶液。第二個體可以是與第一個體相同生物分類的物種(如人類)或是與第一個體不相同生物分類的物種。例如，第一個體可以是一哺乳動物(如豬)，而第二個體是一人類。鈦金屬表面的粗糙度可小於50奈米(nm)或100奈米，例如介於20奈米至80奈米之間或介於30奈米至45奈米之間。當含有幹細胞的溶液位在鈦金屬表面和齒槽骨之間一段時間之後，含有幹細胞的溶液可使鈦金屬表面和齒槽骨之間形成具有納米洞和微米洞的多孔結構。
在另一個實施例中，以圖1的步驟S1至S6或圖2的步驟S11、S12及S1至S6所製備、獲得或製作的含有幹細胞的溶液可以用於治療關節、肌腱、(膝)關節軟骨、肩膀或脊椎。該治療方法包括下列步驟：以圖1所示的步驟S1至S6或是圖2所示的步驟S11、S12及S1至S6製備、獲得或製作含有幹細胞的溶液，然後將一有效量的含有幹細胞的溶液注入第一個體或第二個體，例如注入第一個體或第二個體的關節、肌腱、(膝)關節軟骨、肩膀、脊椎或肌肉。第二個體可以是與第一個體相同生物分類的物種(如人類)或是與第一個體不相同生物分類的物種。例如，第一個體可以是一哺乳動物(如豬)，而第二個體是一人類。
在另一個實施例中，以圖1的步驟S1至S6或圖2的步驟S11、S12及S1至S6所製備、獲得或製作的含有幹細胞的溶液可以用於治療關節炎(例如骨關節炎[osteoarthritis]、乾癬性關節炎[psoriatic arthritis]、類風濕性關節炎[rheumatoid arthritis]或僵直性脊椎炎[ankylosing spondylitis])、肌腱炎、肌腱損傷或自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎、僵直性脊椎炎或全身性紅斑性狼瘡[systemic lupus erythematosus])。該治療方法包括下列步驟：以圖1所示的步驟S1至S6或是圖2所示的步驟S11、S12及S1至S6製備、獲得或製作含有幹細胞的溶液，然後將一有效量的含有幹細胞的溶液注入第一個體或第二個體，例如注入第一個體或第二個體的關節、肌腱、(膝)關節軟骨、肩膀、脊椎或肌肉。第二個體可以是與第一個體相同生物分類的物種(如人類)或是與第一個體不相同生物分類的物種。例如，第一個體可以是一哺乳動物(如豬)，而第二個體是一人類。
以上所述係藉由實施例說明本發明之特點，其目的在使熟習該技術者能暸解本發明之內容並據以實施，而非限定本發明之專利範圍，故，凡其他未脫離本發明所揭示之精神所完成之等效修飾或修改，仍應包含在以下所述之申請專利範圍中。
S1-S6‧‧‧步驟
S11、S12‧‧‧步驟
2a‧‧‧垂直線
圖1為本發明一實施例之製備或製作含有幹細胞之溶液的流程圖。 圖2為本發明一實施例之製備或製作含有幹細胞之溶液的流程圖。 圖3為褐藻補充品的內容/成分資訊。 圖4為六位人類受試者在口服褐藻補充品前後的幹細胞數據。 圖5A和圖5B為一人類受試者在接受顆粒性白血球聚落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，簡稱GCSF或G-CSF)注射療程前後的流式細胞儀數據(flow cytometry data)。 圖6A為前向散射係數(forward scattering coefficient，簡稱FSC)對側向散射係數(side scattering coefficient，簡稱SSC)的流式細胞儀點狀圖(flow cytometry dot plot)。 圖6B為使用流式細胞分析(flow cytometry analysis)獲得的螢光直方圖。 圖6C為前向散射係數對側向散射係數的流式細胞儀點狀圖。 圖7A為前向散射係數對側向散射係數的流式細胞儀點狀圖。 圖7B至圖7G為使用流式細胞分析獲得的螢光直方圖。
雖然在圖式中已描繪某些實施例，但熟習此項技術者應瞭解，所描繪之實施例為說明性的，且可在本發明之範疇內構想並實施彼等所示實施例之變化以及本文所述之其他實施例。
S1‧‧‧步驟
S2‧‧‧步驟
S3‧‧‧步驟
S4‧‧‧步驟
S5‧‧‧步驟
S6‧‧‧步驟

Claims (10)

  1. 一種製備一含有幹細胞之溶液的方法，其係包括下列步驟：                       將一血液樣本和一二價陽離子螯合劑的一混合液放在溫度為攝氏2至12度的環境中靜置3至72小時，使該混合液形成複數分離層，其中位在該些分離層其中之一內的一液體含有複數個體幹細胞及複數個血小板；                     取得該液體；以及                       在取得該液體之後，離心該液體，使複數個顆粒聚集在該液體中，該些顆粒包括該些體幹細胞及該些血小板。
  2. 如請求項1所述之方法，還包括在離心該液體之後，移除全部或部分的該液體並留下聚集在一起的該些顆粒，然後重新懸浮該些顆粒。
  3. 如請求項1所述之方法，其中該二價陽離子螯合劑為乙二胺四乙酸(EDTA)。
  4. 如請求項1所述之方法，其中該些體幹細胞的尺寸係介於1微米至6微米之間，並且包括CD349(+)幹細胞和Lgr5(+)幹細胞。
  5. 如請求項1所述之方法，其中該液體含有該二價陽離子螯合劑。
  6. 如請求項1所述之方法，其中該含有幹細胞的溶液係用於植牙治療或骨移植術。
  7. 一種溶液，其係含有尺寸大於2微米至小於6微米的Lgr5(+)體幹細胞，其中該溶液係用於植牙治療。
  8. 如請求項7所述之溶液，其係含有尺寸大於2微米至小於6微米的CD349(+)體幹細胞。
  9. 如請求項7所述之溶液，其中白血球占尺寸大於2微米至小於20微米之細胞的百分比為小於2%。
  10. 如請求項7所述之溶液，其係含有一鹽類。
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