CN105985932A - 制备含有干细胞的溶液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备含有干细胞的溶液的方法，包括：(1)将血液样本和二价阳离子螯合剂的混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使混合液分成两层或两层以上(即混合液形成两个或两个以上的分离层)，其中一个分离层内的液体含有血小板及干细胞；(2)收集或取得所述液体，并放入一容器中；(3)离心容器内的液体，直到悬浮于液体内的复数个颗粒沉积在容器的底部为止，所述颗粒包含前述的血小板和干细胞；以及(4)将所述颗粒重新悬浮于缓冲液或其它适当的液体中。

Description

制备含有干细胞的溶液的方法

技术领域

本发明涉及一种制备含有细胞的溶液的方法，特别涉及一种制备含有(体)干细胞的溶液的方法。

背景技术

干细胞具有自我更新(self-renewal)的能力，因此可以产生更多的干细胞并变成几乎任何一种的特化细胞(specialized cell)。干细胞研究被视为是生物医学未来最重要的领域之一，再加上近年来相关产业也加速成长，突显人们对于干细胞在医疗应用上的需求。

发明内容

本发明的主要目的，在于提供一种制备或制作含有干细胞的溶液的方法，该溶液可以用于植牙治疗或骨移植术(bone graft procedure)。

为达到上述的目的，本发明提供一种制备或制作含有干细胞的溶液的方法。这个方法包括以下步骤：(1)将血液样本与二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钾[K2EDTA]或乙二胺四乙酸三钾[K3EDTA])均匀混合后所形成的混合液放在温度为2至12摄氏度(较佳为2至7摄氏度或大约4摄氏度)的环境中静置3至72小时、3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时，使混合液分成两层或两层以上，即混合液形成两个或两个以上的分离层(例如包含上分离层和下分离层)，其中一个分离层(如上分离层或最上层的分离层)内的第一液体(如上清液)含有复数个血小板(尺寸可为小于6微米[μm])及复数个体干细胞，所述的体干细胞例如包括CD349(+)(多功能)体干细胞和Lgr5(+)(多功能)体干细胞；(2)从混合液中收集或取得第一液体；以及(3)在收集或取得第一液体之后，离心第一液体，使第一液体中有复数个颗粒聚集在一起，所述的颗粒包含前述的血小板和体干细胞。该方法可以进一步包括：在离心第一液体之后，移除部分的第一液体并留下聚集在一起的所述颗粒在剩余的第一液体中，然后将所述的颗粒重新悬浮于剩余的第一液体中，藉以制备或制作含有干细胞的溶液。或者，该方法可以进一步包括：在离心第一液体之后，移除实质上全部的或部分的第一液体并留下聚集在一起的所述颗粒，然后将所述的颗粒重新悬浮于第二液体中，藉以制备或制作含有干细胞的溶液。第二液体可以是或可以含有盐溶液，例如(杜氏)磷酸盐缓冲液[(Dulbecco’s)phosphate-bufferedsaline]。或者，第二液体可以是或可以含有无钙离子(Ca²⁺)的溶液，其还可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。无钙离子的溶液可以是生理食盐水(normal saline)，即0.9％盐溶液。或者，第二液体可以含有前述的盐溶液及一部分的第一溶液。在所述颗粒重新悬浮于第二液体之后，第二液体包含所述颗粒，并与所述颗粒混在一起。上述含有干细胞的溶液可以用于植牙治疗或骨移植术。

为达到上述的目的，本发明提供一种制备或制作含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)的方法，所述溶液可以用于植牙治疗或骨移植术。这个方法包括以下步骤：(1)将血液样本与二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸二钾[K2EDTA]或乙二胺四乙酸三钾[K3EDTA])在温度为2至12度摄氏(较佳为2至7摄氏度或大约4摄氏度)的环境中培养或培育一段时间(例如3至72小时，较佳为3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时)，使血液样本分成两层或两层以上，即血液样本形成两个或两个以上的分离层(例如包含上分离层和下分离层)；(2)收集或取得所述分离层其中之一(如上分离层)，并将该分离层放入一容器(如试管)中，其中该分离层含有复数个血小板(尺寸可为小于6μm)及复数个体干细胞(例如包括CD349(+)体干细胞和Lgr5(+)体干细胞)；(3)离心容器内的该分离层，直到悬浮于该分离层内的多种颗粒沉积在容器的底部为止，所述颗粒包含前述的体干细胞和血小板；以及(4)将沉积在容器底部的所述颗粒重新悬浮于一液体溶液中，藉以制备或制作所述含有干细胞的溶液。该液体溶液可以是或可以含有盐溶液，例如(杜氏)磷酸盐缓冲液。或者，该液体溶液可以是或可以含有无钙离子(Ca²⁺)的溶液，其也可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。无钙离子的溶液可以是生理食盐水，即0.9％盐溶液。或者，该液体溶液可以含有前述的盐溶液及一部分的分离层。或者，该液体溶液可以是一部分的分离层。在所述颗粒重新悬浮于该液体溶液之后，该液体溶液包含所述颗粒，并与所述颗粒混在一起。

在上述两种方法中，体干细胞的尺寸(如大小)可为1μm至6μm，较佳为大于1或2μm至小于6μm。体干细胞可以包含尺寸大于2μm至小于6μm的CD66e(+)体干细胞(也就是类卵裂球干细胞)。CD349(+)体干细胞亦为CD9(+)，而且尺寸可为大于2μm至小于6μm。Lgr5(+)体干细胞亦为Oct4(+)与Nanog(+)、以及CD133(-)、CD66e(-)、Sox2(-)、CD4(-)、CD8(-)、CD9(-)、CD10(-)、CD11(-)、CD16(-)、CD17(-)、CD18(-)、CD19(-)、CD20(-)、CD21(-)、CD31(-)、CD42(-)、CD63(-)、CD34(-)、Lin(-)、CD38(-)、CD90(-)、CD45(-)与CD349(-)。Lgr5(+)体干细胞的尺寸可为大于2μm至小于6μm。在含有干细胞的溶液中，Lgr5(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，CD349(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，白血球占尺寸大于2μm至小于20μm的细胞的百分比为小于2％(较佳为小于1％、0.5％或0.1％)，红血球占尺寸大于2μm至小于10μm的细胞的百分比为小于3％(较佳为小于2％、1％或0.5％)。另外，含有干细胞的溶液中少于1％细胞表现或表达CD133。上述血液样本可取自于一个体(如人或动物)的周边血液，并且含有复数个细胞。

为达到上述的目的，本发明提供一种含有干细胞的溶液，其可用于植牙治疗或骨移植术。所述含有干细胞的溶液含有尺寸大于2μm至小于6μm的CD349(+)体干细胞(SB-1细胞)、尺寸大于2μm至小于6μm的Lgr5(+)体干细胞(SB-2细胞)以及尺寸大于2μm至小于6μm的CD66e(+)体干细胞(类卵裂球干细胞)。所述含有干细胞的溶液也还可以含有一盐类(如氯化钠)或一盐溶液。盐溶液可以是(杜氏)磷酸盐缓冲液或无钙离子(Ca²⁺)的溶液。无钙离子的溶液也可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。无钙离子的溶液可以是生理食盐水，即0.9％盐溶液。在含有干细胞的溶液中，Lgr5(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，CD349(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，CD66e(+)体干细胞占尺寸大于2μm至小于6μm的细胞的百分比为小于6％(较佳为小于5％或4.5％)，白血球占尺寸大于2μm至小于20μm的细胞的百分比为小于2％(较佳为小于1％、0.5％或0.1％)，红血球占尺寸大于2μm至小于10μm的细胞的百分比为小于3％(较佳为小于2％、1％或0.5％)。

现将经由对说明性实施例、随附图式及申请专利范围的以下详细描述的评述，使本发明的此等以及其他组件、步骤、特征、效益及优势变得明朗。

附图说明

图1为本发明一实施例的制备或制作含有干细胞的溶液的流程图；

图2为本发明一实施例的制备或制作含有干细胞的溶液的流程图；

图3为褐藻补充品的内容/成分信息；

图4为六位人类受试者在口服褐藻补充品前后的干细胞数据；

图5A和图5B为一人类受试者在接受颗粒性白血球聚落刺激因子(granulocyte-colony stimulating factor，简称GCSF或G-CSF)注射疗程前后的流式细胞仪数据(flowcytometry data)；

图6A为前向散射系数(forward scattering coefficient，简称FSC)对侧向散射系数(side scattering coefficient，简称SSC)的流式细胞仪点状图(flow cytometrydot plot)；

图6B为使用流式细胞分析(flow cytometry analysis)获得的荧光直方图；

图6C为前向散射系数对侧向散射系数的流式细胞仪点状图；

图7A为前向散射系数对侧向散射系数的流式细胞仪点状图；

图7B至图7G为使用流式细胞分析获得的荧光直方图。

本代表图的符号简单说明：

S1 步骤

S2 步骤

S3 步骤

S4 步骤

S5 步骤

S6 步骤

S11、S12 步骤

2a 垂直线

虽然在图式中已描绘某些实施例，但本领域技术人员应了解，所描绘的实施例为说明性的，且可在本发明的范畴内构想并实施彼等所示实施例的变化以及本文所述的其他实施例。

具体实施方式

图式揭示本发明的说明性实施例。其并未阐述所有实施例。可另外或替代使用其它实施例。为节省空间或更有效地说明，可省略显而易见或不必要的细节。相反，可实施一些实施例而不揭示所有细节。当相同数字或标号出现在不同图式中时，其是指相同或类似组件或步骤。当以下描述连同随附图式一起阅读时，可更充分地理解本发明的实施方式，该等随附图式的性质应视为说明性而非限制性的。

以下先介绍本发明的各种定义与描述，然后再详细说明本发明的实施例。

细胞尺寸(Z)的定义:

在本发明中，后续段落提及的尺寸(Z)可用于描述细胞(例如(体)干细胞或生物细胞)的大小。尺寸(Z)可以(但不限定)被描述或定义为：(1)细胞生物学领域或干细胞领域对于细胞的大小或代表长度的传统定义、(2)细胞的直径(特别是当细胞的形状实质上为球体时)、(3)细胞的长轴长度(特别是当细胞的形状实质上为椭圆体时)、(4)细胞的宽度(当细胞的形状近似于正方体时)、(5)细胞的长度(当细胞的形状近似于长方体时)或是(6)细胞的最大横断面或横向尺寸。通过光学显微镜或电子显微镜(例如扫描式电子显微镜)获得的细胞影像或是通过流式细胞仪(flow cytometer)获得的数据(例如二维点、轮廓或密度图)可以用来判定或测量尺寸(Z)—不论是直径、长度、宽度或是最大横断面或横向尺寸。通过光学显微镜或电子显微镜获得的细胞影像可以是细胞的二维剖面图或立体结构。举例来说，经由光学显微镜或电子显微镜(例如扫描式电子显微镜)可获得一个二维剖面影像，然后通过测量二维剖面影像中细胞的最大横断面或横向尺寸就可以获得细胞的尺寸(Z)。

干细胞定义:

体干细胞(somatic stem cell)，亦称成体干细胞(adult stem cell)，可以在骨髓、脂肪或周边血液等器官或组织中发现，并且具有与所有干细胞相同的基本特征。体干细胞是未特化的细胞(unspecialized cell)或未分化的细胞(undifferentiated cell)，而且能够分化成特定的细胞种类。“体干细胞”术语在本发明不属于或不包含胚胎干细(embryonic stem cell)；换句话说，本发明中的体干细胞不是取自于或来自于胚胎或胚胎组织。

体干细胞有许多不同的种类，包括全能干细胞(totipotent stem cell)、多功能干细胞(pluripotent stem cell)、多潜能干细胞(multipotent stem cell)以及先驱干细胞(progenitor stem cell)。先驱干细胞也可以称为专一性干细胞或单能干细胞(unipotent stem cell)。类卵裂球干细胞(blastomere-like stem cell，简称BLSC)属于全能干细胞或多功能干细胞。极小类胚胎干细胞(very small embryonic-like stemcell，简称VSEL)属于多功能干细胞。SB-1细胞和SB-2细胞属于多功能干细胞或多潜能干细胞。间质干细胞(mesenchymal stem cell，简称MSC)、造血干细胞(hematopoietic stemcell，简称HSC)、多潜能成体先驱细胞(multipotent adult progenitor cell，简称MAPC)、骨髓多潜能干细胞(bone marrow derived multipotent stem cell，简称BMSC)以及多潜能成体干细胞(multipotent adult stem cell，简称MASC)属于多潜能干细胞。神经干细胞(neural stem cell)、视网膜干细胞(retina stem cell)、嗅球干细胞(olfactory bulbsstem cell)、上皮干细胞(epidermal stem cell)、肌肉干细胞(muscle stem cell)、肠道干细胞(intestine stem cell)、胰脏干细胞(pancreatic stem cell)、心脏干细胞(heartstem cell)、肝脏干细胞(liver stem cell)、肾脏干细胞(kidney stem cell)、内皮干细胞(endothelial stem cell)、脂肪干细胞(adipocyte or adipose-derived stem cell)、成体骨髓多元性诱导细胞(marrow-isolated adult multilineage inducible cell)、前间质干细胞(pre-mesenchymal stem cell，简称pre-MSC)、间质先驱细胞(mesenchymalprogenitor cell)、造血先驱细胞(hematopoietic progenitor cell，简称HPC)、多潜能先驱细胞(multipotent progenitor cells，简称MPP)、谱系限制先驱细胞(lineage-restricted progenitor cell，简称LRP)、共同髓原先驱细胞(common myeloidprogenitor cell，简称CMP)以及共同淋巴球先驱细胞(common lymphocyte progenitorcell，简称CLP)属于先驱干细胞。

在后续段落中，跟随在一细胞(表面)标记后面的符号“+”表示细胞(例如干细胞)可以表现或表达该细胞(表面)标记，也就是说流式细胞仪可以经由(特定标记用的)抗体侦测到存在于细胞表面的该细胞(表面)标记。跟随在一细胞(表面)标记后面的符号“-”表示细胞(例如干细胞)无法表现或表达该细胞(表面)标记，也就是说该细胞(表面)标记没有存在于细胞的表面，而且流式细胞仪也无法经由(特定标记用的)抗体侦测到该细胞(表面)标记。因此，正号“+”是指细胞(例如干细胞)可以表现或表达细胞(表面)标记，负号“-”则是指细胞(例如干细胞)无法表现或表达细胞(表面)标记。

SB-1细胞为含有细胞核的多功能或多潜能干细胞，并且是CD349(+)细胞。CD349(+)体干细胞(即SB-1细胞)也被发现为CD9(+)、Oct4(+)与Nanog(+)、以及CD133(-)、CD90(-)、CD34(-)与Sox2(-)。CD349(+)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米(micrometer，符号μm)、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，SB-1细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。SB-1细胞可以表现细胞(表面)标记CD349，因而能够以CD349(+)为特征。

SB-2细胞为含有细胞核的多功能或多潜能干细胞，并且是Lgr5(+)细胞。Lgr5(+)体干细胞(即SB-2细胞)也被发现为Oct4(+)与Nanog(+)、以及CD133(-)、CD66e(-)、CD4(-)、CD8(-)、CD9(-)、CD10(-)、CD11(-)、CD16(-)、CD17(-)、CD18(-)、CD19(-)、CD20(-)、CD21(-)、CD31(-)、CD42(-)、CD63(-)、CD34(-)、Lin(-)、CD38(-)、CD90(-)、CD45(-)、CD349(-)与Sox2(-)。Lgr5(+)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，SB-2细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。SB-2细胞可以表现细胞(表面)标记Lgr5，因而能够以Lgr5(+)为特征。在本发明中，SB细胞包含CD349(+)体干细胞(即SB-1细胞)和Lgr5(+)体干细胞(即SB-2细胞)。

类卵裂球干细胞(BLSC)为含有细胞核的全能或多功能干细胞，并且是CD66e(+)细胞。CD66e(+)体干细胞(即类卵裂球干细胞)的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，类卵裂球干细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。类卵裂球干细胞可以表现细胞(表面)标记CD66e，因而能够以CD66e(+)为特征。

极小类胚胎干细胞(VSEL)为含有细胞核的多功能干细胞，而且可以是CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞。属于极小类胚胎干细胞的CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞也被发现为CD45(-)与Lin(-)。CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)可以是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于2微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。较佳地，CD133(+)体干细胞与CD34(+)体干细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。就CD133(+),CD45(-),Lin(-)体干细胞而言，这种极小类胚胎干细胞可以表现细胞(表面)标记CD133，但是无法表现细胞(表面)标记CD45和Lin，因此这种极小类胚胎干细胞能够以CD133(+)、CD45(-)和Lin(-)为特征。就CD34(+),CD45(-),Lin(-)体干细胞而言，这种极小类胚胎干细胞可以表现细胞(表面)标记CD34，但是无法表现细胞(表面)标记CD45和Lin，因此这种极小类胚胎干细胞能够以CD34(+)、CD45(-)和Lin(-)为特征。

间质干细胞(MSC)为含有细胞核的多潜能干细胞，并且可以是CD13(+)体干细胞、CD29(+)体干细胞、CD44(+)体干细胞、CD73(+)体干细胞、CD90(+)体干细胞或CD105(+)体干细胞。间质干细胞可以表现下列一种或多种的细胞(表面)标记：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90和CD105。因此，间质干细胞可以具有下列一种或多种的特征：CD13(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD73(+)、C90(+)和CD105(+)。间质干细胞有各种非常不同的细胞群，因而具有各种的尺寸及形状。例如，某些类型的间质干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。其它类型的间质干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)则是大于6微米、7微米或10微米。

造血干细胞(HSC)为含有细胞核的多潜能干细胞。造血干细胞包括CD34(+),cKit(-),CD38(-),Lin(-)细胞与CD150(+),CD244(-),CD48(-)细胞。属于造血干细胞的CD34(+),cKit(-),CD38(-),Lin(-)体干细胞与CD150(+),CD244(-),CD48(-)体干细胞的尺寸(关于尺寸的描述可参阅上述尺寸(Z)的定义)可以是小于或等于4微米、5微米或6微米，例如是介于0.1微米至6微米之间、介于0.5微米至6微米之间、介于1微米至6微米之间、介于0.1微米至5微米之间、介于0.5微米至5微米之间、介于1微米至5微米之间、介于0.1微米至4微米之间、介于0.5微米至4微米之间或介于1微米至4微米之间。就CD34(+),cKit(-),CD38(-),Lin(-)体干细胞而言，这种造血干细胞可以表现细胞(表面)标记CD34，但是无法表现细胞(表面)标记cKit、CD38和Lin，因此这种造血干细胞能够以CD34(+)、cKit(-)、CD38(-)和Lin(-)为特征。就CD150(+),CD244(-),CD48(-)体干细胞而言，这种造血干细胞可以表现细胞(表面)标记CD150，但是无法表现细胞(表面)标记CD244和CD48，因此这种造血干细胞能够以CD150(+)、CD244(-)和CD48(-)为特征。

行为或方法(X)的描述：

以下列出行为或方法(X)的范例。这些行为或方法被认为可以有效增加一个体(例如人体或非人体)体内某一种或特定几种干细胞的数量，该非人体可以是动物。

行为或方法(X)包括：

1.服用药物，例如合成药物或含有天然萃取物的药物；

2.服用草药或中药，例如冬虫夏草、人参、枸杞、灵芝、牛樟芝以及/或是巴西蘑菇；

3.服用营养品或膳食补充品(dietary supplement)，例如营养片或营养粉，该营养品或膳食补充品可以含有下列一种或多种的物质或成分：维他命(如维他命A、维他命B、维他命B群、维他命B₁₂、维他命D、维他命D₃、维他命E等)、巨量及/或微量矿物质(如钙、钠、钾、氟、溴、铬、碘、硅、硒、铍、锂、钴、钒、镍等)、多醣(polysaccharide)、含岩藻糖的高分子活性醣蛋白(high molecular weight fucose-containing glycoprotein)、海藻(包括绿藻、蓝绿藻、褐藻等)、岩藻糖(fucose)、褐藻的主要成分—褐藻糖胶(fucoidan)、小分子褐藻糖胶(oligo fucoidan)、藻类、含有褐藻糖胶的褐藻(如生长或生产在日本冲绳县的褐藻)、日本的水云(mozuku)、绿藻、蓝绿藻(或称蓝藻)、褐藻(包括水云、昆布(kelp)、裙带菜(undaria pinnatifida)、羊栖菜(sargassum fusiforme)等)、植化素(phytochemical)(如异黄酮素(isoflavones)、植物雌激素(phytoestrogen)等)、茄红素(lycopene)、表没食子儿茶素没食子酸脂(epigallocatechin gallate，简称EGCG)、绿茶素(green teaessence)、醣质营养素(gluconutrients)(如半乳糖(Galactose)、木糖(Xylose)、葡萄糖(Glucose)、甘露糖(Mannose)、乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine)、乙酰半乳糖胺(N-acetyl galactosamine)、乙酰神经胺酸(N-acetyl neuraminic acid)等)、鱼油、香桩、取自植物、叶子、果实、蔬菜、鱼、海藻或藻类的营养素；

4.励行素食饮食；

5.食用健康食品或有机食品；

6.服用另类(非传统的)药物；

7.接受另类疗法或另类治疗，例如葛森疗法(Gerson therapy)或布鲁士癌症疗法(the Breuss cancer cure)；

8.接受针灸治疗；

9.接受按摩，例如足底按摩；

10.做运动，例如走路、慢跑、跳舞、体操、瑜珈、有氧运动以及/或是太极拳；

11.睡觉(其目的在于评估睡眠质量)；

12.冥想；

13.进行由个人、保健专家或医生设计的健康改善计划或疾病治疗计划；

14.服用某种可以改善体内器官健康状况的营养品，例如服用可以改善前列腺健康状况的茄红素；

15.进行复健计划，以治疗伤害、治疗由手术造成的创伤或是治疗疾病；

16.饮用药酒(药酒乃是将一种或数种药材浸泡在酒里存放一段时间而制成)，例如饮用人参药酒(人参药酒是将人参浸泡在高酒精浓度米酒里一个月的时间而制成)；

17.服用政府部门或机构(如美国食品药物管理局)核准用于治疗特定疾病(如癌症、皮肤病、肾脏病等)的一种或数种药物；

18.接受政府部门核准用于治疗特定疾病(如癌症、皮肤病、肾脏病等)的一种或数种治疗方法；

19.从事或参与宗教活动，例如祷告或拜神等；

20.接受阳光(或日光)直接照射或间接照射，接受照射的时间可以是:(1)日出前10分钟至日出后50分钟的早晨时段(此时含有大量的红外线)、(2)上午11点30分(11:30AM)至下午12点30分(12:30PM)的中午时段(此时含有大量的紫外线)、或是(3)日落前50分钟至日落后10分钟的下午时段(此时含有大量的红外线)；

21.照射日光灯或发光二极管(LED)发出的光源，日光灯或发光二极管发出的光源可包含可见光的整个光谱(spectrum)、红外线的整个光谱、红光的整个光谱、绿光的整个光谱、蓝光的整个光谱、紫外线的整个光谱或混合上述一种以上光线的整个光谱；

22.进行或接受改善身体自愈力的计划、治疗、方法、仪器以及/或是系统，例如病后、伤后或术后用于改善身体自愈力的方法或治疗(如高压氧治疗)；

23.饮用咖啡，例如黑咖啡；

24.喝茶，例如绿茶、红茶或茉莉花茶；

25.饮用红酒；

26.服用褪黑激素(melatonin)；

27.聆听音乐，例如莫扎特交响曲或贝多芬交响曲；

28.注射含有褐藻糖胶或小分子褐藻糖胶的物质，例如含有褐藻糖胶或小分子褐藻糖胶的营养品或补充品；

29.服用荷尔蒙补充品或是注射荷尔蒙；

30.注射颗粒性白血球聚落刺激因子(GCSF或G-CSF)，该因子为细胞激素(cytokine)或荷尔蒙(醣蛋白)，能够刺激骨髓产生颗粒性白血球(granulocyte)和干细胞，以释放它们到血流里；

31.接受颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程；以及

32.服用营养品、营养产品、营养液、营养饮料、营养补充剂或营养食品，其含有：(1)各种的胺基酸(例如精胺酸(Arginine)、组胺酸(Histidine)、离胺酸(Lysine)、天门冬胺酸(Aspartic acid)、麸胺酸(Glutamic acid)、丝胺酸(Serine)、羟丁胺酸(或称苏胺酸，Threonine)、天门冬酰胺酸(Asparagine)、麸酰胺酸(Glutamine)、半胱胺酸(Cysteine)、硒半胱胺酸(Selenocysteine)、甘胺酸(Glycine)、脯胺酸(Proline)、色胺酸(Tryptophan)、丙胺酸(Alanine)、缬胺酸(Valine)、异白胺酸(Isoleucine)、白胺酸(Leucine)、甲硫胺酸(Methionine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)、酪胺酸(Tyrosine)等)、(2)均衡胺基酸(balanced amino acid)、或是(3)九种人体必需胺基酸(也就是，组胺酸、异白胺酸、白胺酸、离胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、羟丁胺酸、色胺酸以及缬胺酸)。例如，(a)含红豆、绿豆或黑豆发酵物的产品、(b)含一种或数种水果(例如甜菜(sugar beet)、苹果、番石榴、奇异果、葡萄、菠萝、火龙果、青木瓜、西红柿、酪梨等)发酵物的液态物、饮料或饮品、(c)将一种或数种药材浸泡在酒里存放一段时间而制成的药酒，例如将人参浸泡在高酒精浓度的米酒里一个月时间而制成的人参药酒。

实施例：

图1揭示用于制备或制作含有干细胞的溶液的六个步骤S1、S2、S3、S4、S5和S6。依序进行或实施图1所示的步骤S1至S6可以制备、获得或制作一种含有干细胞的溶液。请参阅图1所示，在步骤S1中，从一受治疗者(即个体)的周边血液取出、采集、获得或提取一血液样本，并放入到一个或多个含有二价阳离子螯合剂的第一容器(例如一个储存袋、一个或多个注射器、或是一个或多个采血管)中，然后让血液样本与二价阳离子螯合剂均匀混合，以致第一容器里有血液样本和二价阳离子螯合剂的第一混合液。在本发明中，受治疗者的周边血液属于非胚胎组织。二价阳离子螯合剂为一抗凝剂(anticoagulant)。在本发明中，二价阳离子螯合剂可以是乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，简称EDTA)，例如乙二胺四乙酸二钾(K2EDTA)抗凝剂或乙二胺四乙酸三钾(K3EDTA)抗凝剂，或者是柠檬酸盐(citrate)。每一个第一容器里可以含有70毫克(milligram，简称mg)以上的二价阳离子螯合剂，譬如含有90～900毫克的二价阳离子螯合剂、含有120～450毫克的二价阳离子螯合剂或是含有150～400毫克的二价阳离子螯合剂。受治疗者可以是一人类(例如孩童、青少年、成年人或老年人)或是一动物(例如哺乳动物)。该动物可以是：灵长类动物(如猴子或大猩猩)、狗、啮齿动物(如老鼠或豚鼠)、猫、马、牛、羊、猪、鸡、鸭、鹅、鸟或大象。

血液样本含有许多细胞，包括尺寸小于或等于6微米的小细胞和尺寸大于6微米的大细胞。小细胞包含血小板(其尺寸为小于6微米)和小体干细胞(其尺寸为小于或等于6微米，较佳为大于1或2微米至小于或等于6微米)。小体干细胞例如包括一种或多种特定种类的体干细胞(例如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)以及极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)。大细胞包括尺寸大于6微米的大体干细胞以及红血球和白血球等谱系细胞(lineage cell)。血液样本的量(体积)可以大于或等于20、30或45毫升，例如20～250毫升、60～500毫升、80～250毫升或100～200毫升。为了获得或形成第一混合液，每毫升的血液样本可混合1.5毫克或以上(较佳为1.6～2.0毫克)的二价阳离子螯合剂(例如K2EDTA、K3EDTA或柠檬酸盐)。前述的一种或多种特定种类的体干细胞(以下称为“特定体干细胞”)可以是或是含有上述“干细胞定义”中的一种或多种干细胞。例如，特定体干细胞可以是或是含有尺寸等于或小于6μm(较佳则是介于1μm至6μm之间或是大于1或2μm至小于6μm)的体干细胞，如SB-1细胞、SB-2细胞、类卵裂球干细胞、极小类胚胎干细胞、间质干细胞以及/或是造血干细胞。或者，特定体干细胞可以是或是含有尺寸小于6μm(较佳则是大于2μm至小于6μm)的体干细胞，例如CD349(+)体干细胞(即SB-1细胞)以及/或是Lgr5(+)体干细胞(即SB-2细胞)以及/或是CD66(+)体干细胞(即类卵裂球干细胞)。

在步骤S2中，将第一混合液存放在温度为2至12摄氏度(较佳为2至7摄氏度或大约4摄氏度)的设备中静置一段(预定的)时间，例如3至72小时，较佳为3至6小时、6至72小时、6至48小时、16至72小时、16至48小时、36至60小时或48至72小时。前述的设备可以是冰箱或是可使物品保持低温的装置。在已存放前述的一段(预定的)时间的第一混合液中，特定体干细胞(例如SB细胞)通过二价阳离子螯合剂(如K2EDTA、K3EDTA或柠檬酸盐)而被活化；换言之，特定体干细胞的细胞周期从G₀期被活化到(或称进入到)G₁期。该活化作用与二价阳离子螯合剂抑制p53功能的能力(可能藉由螯合Zn²⁺)有关，藉由抑制p53的功能，可让特定体干细胞离开G₀静止期并进入细胞周期G₁。由于P53蛋白质需要Zn²⁺才能适当地折叠来形成功能性蛋白质，因此藉由二价阳离子螯合剂螯合Zn²⁺会是活化特定体干细胞的关键步骤。另外，二价阳离子螯合剂也有可能螯合其它的二价离子(如Ca²⁺)来活化处于G₀期的特定体干细胞。

在第一混合液处于上述的温度并经过上述的一段(预定的)时间之后，第一混合液会因重力的关系分成两层或以上，即第一混合液形成两个或两个以上的分离层(例如包含上分离层和下分离层)。所述分离层其中之一，例如上分离层或最上层的分离层，可以是上清液(supernatant liquid)，并可分为三个部分：血小板(尺寸可为小于6微米)、血清(serum)和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(例如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)以及极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)。上清液的量(体积)可以是6毫升至120毫升、20毫升至250毫升、40毫升至125毫升或是50毫升至100毫升。上述分离层中的上清液可含有二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)及/或生长因子。所述分离层的另一层，例如下分离层，包含了第一混合液中绝大多数的或非常高百分比的大细胞，其中所述大细胞包括红血球和白血球等谱系细胞以及大体干细胞。例如，所述另一分离层可以含有第一混合液中95％、98％、99％或以上的大细胞。因此，上清液大体上不含有大细胞(如红血球和白血球)或是含有第一混合液中不到0.5％、1％、2％或5％的大细胞。例如，上清液可以含有第一混合液中不到1％或2％的红血球以及第一混合液中不到1％或2％的白血球；第一混合液中至少98％或99％的红血球以及第一混合液中至少98％或99％的白血球聚集在上述的另一分离层(如下分离层)中。上清液的量(体积)除以血液样本的量(体积)所得到的比值可在1/3至1/2之间。上清液的量(体积)除以第一混合液的量(体积)所得到的比值可在1/3至1/2之间。综上所述，按照步骤S1和步骤S2，来自受治疗者的血液样本会与二价阳离子螯合剂在上述的温度中培养或培育上述的一段(预定的)时间，使血液样本分成两层或以上，即血液样本形成两个或两个以上的分离层(所述分离层包括上清液)。

在步骤S3中，绝大部分的或大体上所有的上清液被聚集或转移到一个第二容器(例如一储存袋、一玻璃瓶或一注射器)中。第二容器中的上清液(以下称为“细胞混合液”)含有小细胞，例如血小板和小体干细胞，其中小体干细胞包含特定体干细胞(如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)以及极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)。尺寸大于2微米至小于6微米的体干细胞在细胞混合液中的数量可大于或等于1000万颗或3000万颗，较佳为2500万～30000万颗、3000万～50000万颗或1000万～50000万颗。细胞混合液可以含有二价阳离子螯合剂(例如乙二胺四乙酸)及/或生长因子。在细胞混合液中，大细胞的数量占全部粒子或细胞的数量的百分比可小于5％、1％或0.5％(较佳为小于0.1％或0.01％)，小细胞的数量占全部粒子或细胞的数量的百分比可大于95％、99％或99.5％(较佳为大于99.9％或99.99％)。

根据图6A和图6B的数据，可以计算出每毫升细胞混合液中的红血球数量。图6A是以流式细胞仪分析10微升(microliter，简称μl)的细胞混合液后所得到的。红血球，即CD235a(+)细胞，是位在图6A的区域R3中；区域R3中的细胞总数为25000。图6B示出与区域R3中所有细胞有关的CD235a荧光强度的分布。在图6B中，荧光直方图被垂直线2a(即参考线)分为低荧光强度的区域V3-L和高荧光强度的区域V3-R。图6B的区域V3-R表示细胞对CD235a染色呈阳性，即红血球；图6B的区域V3-L表示细胞对CD235a染色呈阴性。图6B的结果显示区域R3中的红血球数占区域R3中的细胞总数的百分比为0.1％。将区域R3中的细胞总数(即25000)乘以区域R3中的红血球数占区域R3中的细胞总数的百分比(即0.1％)可计算出10微升细胞混合液中的红血球数(其为25)。然后，利用10微升细胞混合液中的红血球数计算出每毫升细胞混合液中的红血球数量，其计算出的数量为2500。由上述结果可知，每毫升细胞混合液中的红血球数量为小于10⁵或10⁴。较佳地，每毫升细胞混合液中的红血球数量为小于10³。另外，在细胞混合液中，红血球占尺寸大于2微米至小于10微米的细胞的百分比可为小于3％，较佳为小于2％、1％或0.5％。

根据图6C的流式细胞仪数据，可以计算出每毫升细胞混合液中的白血球数量。图6C的流式细胞仪资料是以流式细胞仪分析50微升的细胞混合液后所得到的。在图6C中，区域R1为分析白血球所作的设门(gating)。50微升细胞混合液中的白血球数可经由图6C的流式细胞仪数据来获得，其计算出的数量为30。然后，利用50微升细胞混合液中的白血球数计算出每毫升细胞混合液中的白血球数量，其计算出的数量为600。由上述结果可知，每毫升细胞混合液中的白血球数量为小于10⁴或10³。较佳地，每毫升细胞混合液中的白血球数量为小于10²。另外，在细胞混合液中，白血球占尺寸大于2微米至小于20微米的细胞的百分比可为小于2％，较佳为小于1％、0.5％或0.1％。

图7A示出前向散射系数(forward scattering coefficient，简称FSC)对侧向散射系数(side scattering coefficient，简称SSC)的流式细胞仪点状图(flow cytometrydot plot)。图7A的点状图是以流式细胞仪分析5.6微升的细胞混合液后所得到的。在图7A中，尺寸大于2微米至小于6微米的细胞位在区域R5。换句话说，区域R5中的所有细胞的尺寸是大于2微米至小于6微米。图7B示出与区域R5中所有细胞有关的CD61荧光强度的分布。在图7B中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V1-L和高荧光强度的区域V1-R。图7B的区域V1-R表示细胞对CD61染色呈阳性，即血小板；图7B的区域V1-L表示细胞对CD61染色呈阴性。图7B的结果显示区域R5中的血小板数占区域R5中的细胞总数的百分比为80.5％。因此，在细胞混合液中，血小板占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于75％或80％，较佳为介于75％至85％。

图7C示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD133荧光强度的分布。在图7C中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V3-L和高荧光强度的区域V3-R。图7C的区域V3-R表示细胞对CD133染色呈阳性，即极小类胚胎干细胞；图7C的区域V3-L表示细胞对CD133染色呈阴性。图7C的结果显示区域R5中的CD133(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为0.3％。由上述可知，细胞混合液中少于1％细胞表现或表达CD133。图7D示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD34荧光强度的分布。在图7D中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V1-L和高荧光强度的区域V1-R。图7D的区域V1-R表示细胞对CD34染色呈阳性，即极小类胚胎干细胞；图7D的区域V1-L表示细胞对CD34染色呈阴性。图7D的结果显示区域R5中的CD34(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为0.4％。因此，在细胞混合液中，CD133(+)细胞和CD34(+)细胞共占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于2％，较佳为小于1％或0.5％。

图7E示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD66e荧光强度的分布。在图7E中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V2-L和高荧光强度的区域V2-R。图7E的区域V2-R表示细胞对CD66e染色呈阳性，即类卵裂球干细胞；图7E的区域V2-L表示细胞对CD66e染色呈阴性。图7E的结果显示区域R5中的CD66e(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为4％。因此，在细胞混合液中，CD66e(+)细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于6％，较佳为小于5％或4.5％。

图7F示出与图7A区域R5中所有细胞有关的CD349荧光强度的分布。在图7F中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V3-L和高荧光强度的区域V3-R。图7F的区域V3-R表示细胞对CD349染色呈阳性，即SB-1细胞；图7F的区域V3-L表示细胞对CD349染色呈阴性。图7F的结果显示区域R5中的CD349(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为5.6％。因此，在细胞混合液中，CD349(+)细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％，较佳为介于4.5％至10％。

图7G示出与图7A区域R5中所有细胞有关的Lgr5荧光强度的分布。在图7G中，荧光直方图被一垂直线(即参考线)分为低荧光强度的区域V2-L和高荧光强度的区域V2-R。图7G的区域V2-R表示细胞对Lgr5染色呈阳性，即SB-2细胞；图7G的区域V2-L表示细胞对Lgr5染色呈阴性。图7G的结果显示区域R5中的Lgr5(+)细胞数占区域R5中的细胞总数的百分比为5.4％。因此，在细胞混合液中，Lgr5(+)细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％，较佳为介于4.5％至10％。

在步骤S4中，将细胞混合液(即第二容器中的上清液)以适当的转速(例如每分钟转速(rpm)从等于或大于1,200转到等于或小于3,000转，较佳则是从等于或大于1,400转到等于或小于2,000转)离心一段适当的时间(例如从等于或大于10分钟到等于或小于25分钟，较佳则是从等于或大于15分钟到等于或小于20分钟)，使悬浮于细胞混合液中的复数个颗粒沉积或聚集在第二容器的底部。换句话说，在经过离心之后，细胞混合液可以归纳成或分为两个主要部份：经过离心的液体(以下称为“离心液体”)和所述颗粒，其中离心液体位在第二容器里，所述颗粒聚集或沉积在第二容器的底部、离心液体中以及离心液体的底部。所述颗粒包含上述的小细胞，例如血小板及小体干细胞，其中小体干细胞可以包含特定体干细胞(例如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)以及极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)。

根据来自图6A至图6C和图7A至图7G的结果，可以估算出、假定出、推测出或得出以下数据。在所述颗粒中，SB-1细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，SB-2细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，类卵裂球干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于6％(较佳为小于5％或4.5％)，极小类胚胎干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于2％(较佳为小于1％或0.5％)，血小板占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于75％或80％(较佳为介于75％至85％)，白血球占尺寸大于2微米至小于20微米的细胞的百分比可为小于2％(较佳为小于1％、0.5％或0.1％)，红血球占尺寸大于2微米至小于10微米的细胞的百分比可为小于3％(较佳为小于2％、1％或0.5％)。另外，所述颗粒中少于1％细胞表现或表达CD133。

在步骤S5中，将几乎所有或顶部的离心液体从第二容器里移除，但聚集或沉积在第二容器底部、离心液体中及离心液体底部的所述颗粒仍留在第二容器中或是留在第二容器内剩余的离心液体的底部中。接着，在步骤S6中，将一缓冲液或液体适量地加入到第二容器中，然后让留在第二容器内的所述颗粒重新悬浮于一液体溶液(其可以是或可以含有所述缓冲液或液体)中，以致形成一含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)。该含有干细胞的溶液含有所述颗粒，例如血小板和小体干细胞，其中小体干细胞可以包含特定体干细胞(例如SB细胞)、类卵裂球干细胞(即CD66e(+)体干细胞)以及极小类胚胎干细胞(即CD133(+)体干细胞和CD34(+)体干细胞)。在某些情况(例如步骤S5是移除顶部的离心液体)下，前述的液体溶液可以还包含底部的离心液体(即第二容器内剩余的离心液体)。在将所述颗粒重新悬浮于该液体溶液的步骤之后，该液体溶液包含所述颗粒，并与所述颗粒混在一起。前述的缓冲液或液体可以是或可以含有磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline，简称PBS)，例如杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline)。或者，该缓冲液或液体可以是或可以含有无钙离子(Ca²⁺)的溶液或培养基。该无钙离子的溶液或培养基，例如含有氯化钠(NaCl)的溶液，还可以不含有任何其它的二价离子，例如镁离子(Mg²⁺)。该含有氯化钠的溶液可以是生理食盐水(normal saline)。生理食盐水通常是指重量/体积百分比为0.9％的氯化钠溶液，约300mOsm/L或每公升9.0克。磷酸盐缓冲液(PBS)例如含有氯化钠(sodium chloride)、磷酸钠(sodium phosphate)及磷酸钾(potassium phosphate)。在某些配方中，磷酸盐缓冲液(PBS)还包含氯化钾(potassium chloride)、镁(magnesium)和钙(calcium)。

在另一示例中，本发明可以让留在第二容器内的所述颗粒重新悬浮于底部的离心液体(即第二容器内剩余的离心液体)中，以致形成一含有干细胞的溶液(或称为干细胞混合液)，其含有所述颗粒。在这个例子中，步骤S6提及的将缓冲液或液体适量地加入到第二容器的步骤可以予以省略。

在本发明中，含有干细胞的溶液的浓度可以是每毫升含有10⁶至10⁷个SB细胞(即SB-1细胞和SB-2细胞)。另外，根据来自图6A至图6C和图7A至图7G的结果，可以估算出、假定出、推测出或得出以下数据。在含有干细胞的溶液中，SB-1细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，SB-2细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于4％或5％(较佳为介于4.5％至10％)，类卵裂球干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于6％(较佳为小于5％或4.5％)，极小类胚胎干细胞占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为小于2％(较佳为小于1％或0.5％)，血小板占尺寸大于2微米至小于6微米的细胞的百分比可为大于75％或80％(较佳为介于75％至85％)，白血球占尺寸大于2微米至小于20微米的细胞的百分比可为小于2％(较佳为小于1％、0.5％或0.1％)，红血球占尺寸大于2微米至小于10微米的细胞的百分比可为小于3％(较佳为小于2％、1％或0.5％)。另外，含有干细胞的溶液中少于1％细胞表现或表达CD133。含有干细胞的溶液中每毫升的白血球数可为小于10⁴或10³，较佳为小于10²。含有干细胞的溶液中每毫升的红血球数可为小于10⁵或10⁴，较佳为小于10³。在某些情况(例如步骤S5是移除顶部的离心液体)下，含有干细胞的溶液还含有二价阳离子螯合剂(如乙二胺四乙酸)以及/或是生长因子。

在另一个实施例中，请参阅图2所示，本发明可以在实施或进行步骤S1之前，先实施或进行步骤S11和步骤S12。在步骤S11中，受治疗者进行或接受一行为或方法，例如上述行为或方法(X)其中之一。例如，在步骤S11中，受治疗者可以服用或摄取一干细胞驱动剂，譬如含有褐藻糖胶的化合物。该含有褐藻糖胶的化合物可以是褐藻补充品。图3为褐藻补充品的内容/成分信息。在图3中，一颗褐藻补充品含有重量百分比为80％的水云粉(mozukupowder)、重量百分比为15％的结晶纤维素(crystalline cellulose)、重量百分比为3％的蔗糖脂肪酸酯(sucrose fatty acid esters)以及重量百分比为2％的精细二氧化硅。水云粉可以萃取自或提取自生长在日本冲绳县周围海域中的水云褐藻(其为一种海藻)。然后，将水云粉混合结晶纤维素、蔗糖脂肪酸酯以及精细二氧化硅，以形成这颗褐藻补充品(其含有0.1克的褐藻糖胶)。在步骤S11中，受治疗者可以是服用或摄取20颗或20颗以上(例如至少30颗)的褐藻补充品，也就是说受治疗者服用或摄取2克或2克以上(例如至少3克)的褐藻糖胶。或者，在步骤S11中，受治疗者也可以是注射颗粒性白血球聚落刺激因子(其为一种干细胞驱动剂)或是接受颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程。

在步骤S12中，受治疗者在进行或接受上述行为或方法(即进行步骤S11)后等待一段(预定的)时间，例如15分钟至60分钟、20分钟至100分钟、30分钟至4小时、60分钟至90分钟、0.5小时至3小时、1小时至6小时、1小时至12小时、12小时至36小时或是36小时至50小时。经由步骤S11和S12，前述的特定体干细胞(例如SB细胞)可以从受治疗者的骨髓流动到受治疗者的周边血液里，使受治疗者的周边血液变成富含特定体干细胞。在实施步骤S12之后，依序实施或进行图1所示的步骤S1至S6，藉以获得上述含有干细胞的溶液。

图4为一图表，示出一个实验中六位人类受试者C、L、M、W、Y和P的干细胞资料，而这些干细胞资料是由受试者C、L、M、W、Y和P的周边血液获得。在这个实验中，受试者C、L、M、W和Y每个人口服20颗图3所描述的褐藻补充品。换句话说，受试者C、L、M、W和Y每个人以口服的方式摄取至少2克的褐藻糖胶。受试者P在这个实验中是作为一对照者，因此没有服用前述的褐藻补充品。在图4中，0hr对于受试者C、L、M、W和Y而言是代表“服用褐藻糖胶前”，对于受试者P而言则是代表“在对照试验开始时”；1.5hr对于受试者C、L、M、W和Y而言是代表“在服用褐藻糖胶后的第1.5小时”，对于受试者P而言则是代表“在对照试验开始后的第1.5小时”；24hr对于受试者C、L、M、W和Y而言是代表“在服用褐藻糖胶后的第24小时”，对于受试者P而言则是代表“在对照试验开始后的第24小时”。如图4所示，CD349(+)细胞和Lgr5(+)细胞(即SB细胞)的数量在服用褐藻糖胶后的第1.5小时有显著的增加，然而CD349(+)细胞和Lgr5(+)细胞的数量在对照试验开始后的第1.5小时并没有显著的增加。因此，服用或摄取褐藻糖胶(如褐藻补充品)可以驱动SB细胞(如CD349(+)细胞和Lgr5(+)细胞)移动到周边血液或血流里，让周边血液或血流富含SB细胞。

图5A示出第一血液样本里有关Lgr5(+)细胞(即SB-2细胞)的流式细胞仪数据，其中第一血液样本来自于一人类受试者在进行颗粒性白血球聚落刺激因子(GCSF)注射疗程前的周边血液。图5B显示第二血液样本里有关Lgr5(+)细胞的流式细胞仪数据，其中第二血液样本来自于该人类受试者在进行颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程后的周边血液。前述的颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程为：连续五天注射每日每公斤体重5微克(即5micrograms/kg/day)剂量的颗粒性白血球聚落刺激因子。在这个实验中，人类受试者连续五天每天注射一次剂量为5micrograms/kg/day的颗粒性白血球聚落刺激因子。第二血液样本来自于受试者在注射最后一次颗粒性白血球聚落刺激因子后大约第3.5小时的周边血液。图5A和图5B是利用流式细胞仪获得的结果或数据。在图5A和图5B中，区域Q5-LR中的黑点代表Lgr5(+)细胞。有关第一血液样本获得的图5A，区域Q5-LR中的Lgr5(+)细胞数量占区域Q5-UL、Q5-UR、Q5LL和Q5LR中所有粒子或细胞数量的百分比为1.6％。有关第二血液样本获得的图5B，区域Q5-LR中的Lgr5(+)细胞数量占区域Q5-UL、Q5-UR、Q5LL和Q5LR中所有粒子或细胞数量的百分比为8％。因此，注射颗粒性白血球聚落刺激因子可以驱动SB细胞(特别是Lgr5(+)细胞)移动到周边血液或血流里，让周边血液或血流富含SB细胞。

从上述的结果或数据可知，步骤S11的行为或方法(例如食用褐藻补充品或接受颗粒性白血球聚落刺激因子注射疗程)可以驱动前述的特定体干细胞(例如SB细胞)到受治疗者的周边血液里，使受治疗者的周边血液可以在进行或接受上述行为或方法后的一时间点(例如第1.5小时或1～6小时内)增加特定体干细胞的数量。因此，经由步骤S11和步骤S12可以使受治疗者的周边血液富含特定体干细胞，例如SB-1细胞以及/或是SB-2细胞。

在一实施例中，以图1的步骤S1至S6或图2的步骤S11、S12及S1至S6所制备、获得或制作的含有干细胞的溶液可以用于骨移植术(bone graft procedure)。骨移植术可用于重建失去的组织(lost tissue)或是增加不足的组织(insufficient tissue)。在本实施例中，骨移植术包括：将(骨)移植材料和前述的含有干细胞的溶液混合，以致形成或做出(骨)移植材料和含有干细胞的溶液的第二混合液；以及将一有效量的第二混合液投予前述的受治疗者(以下称为“第一个体”)或另一受治疗者(以下称为“第二个体”)，例如投予第一或第二个体的齿槽骨(alveolar bone)。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种(如人类)或是与第一个体不相同生物分类的物种。例如，第一个体可以是一哺乳动物(如猪)，而第二个体是一人类。上述(骨)移植材料可以是人造骨材料(synthetic bone material)、经过处里的施体材料(processed donor material)或是第一个体本身的自体骨(autologousbone)。骨移植术也可以用在与骨或关节有关的治疗中，例如植牙治疗(dental implanttreatment)。当骨移植术用在植牙治疗时，骨移植术执行完后才会将牙科植体(dentalimplant)置放在第一或第二个体的齿槽骨中。位在第一或第二个体的齿槽骨里的第二混合液会刺激骨骼生长，进而为牙科植体创造出一个稠密、结实的地基。

在另一个实施例中，以图1的步骤S1至S6或图2的步骤S11、S12及S1至S6所制备、获得或制作的含有干细胞的溶液可以用于一植牙治疗。该植牙治疗包括下列步骤：(1)对牙科植体进行处理；以及(2)将经过处理的牙科植体通过螺纹旋入第一或第二个体的齿槽骨，其中牙科植体的外螺纹(或螺旋)上具有一多孔性氧化钛层(a porous titanium-oxidelayer)。对牙科植体进行处理的步骤包括使多孔性氧化钛层上具有前述的含有干细胞的溶液，其方法可以是将牙科植体浸在含有干细胞的溶液中或是将含有干细胞的溶液涂布或滴在多孔性氧化钛层上。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种(如人类)或是与第一个体不相同生物分类的物种。例如，第一个体可以是一哺乳动物(如猪)，而第二个体是一人类。多孔性氧化钛层具有复数个微米级的孔洞(micrometer pore)、复数个次微米级的孔洞(sub-micrometer pore)及复数个纳米级的孔洞(nanometer pore)在其中；多孔性氧化钛层的粗糙度可大于100纳米(nm)、200纳米或300纳米，例如介于200纳米至700纳米之间或介于300纳米至500纳米之间。当牙科植体通过螺纹旋入第一或第二个体的齿槽骨一段时间之后，含有干细胞的溶液可以增强具有纳米洞(nano-hole)和微米洞(micro hole)的多孔结构在多孔性氧化钛层和齿槽骨之间的形成。在本实施例中，多孔性氧化钛层例如是形成在牙科植体的外螺纹的钛金属表面上。

在另一个实施例中，以图1的步骤S1至S6或图2的步骤S11、S12及S1至S6所制备、获得或制作的含有干细胞的溶液可以用于一植牙治疗。该植牙治疗包括下列步骤：(1)对牙科植体进行处理；以及(2)将经过处理的牙科植体通过螺纹旋入第一或第二个体的齿槽骨。对牙科植体进行处理的步骤包括使牙科植体的外螺纹(或螺旋)的钛金属表面上具有前述的含有干细胞的溶液，其方法可以是将牙科植体浸在含有干细胞的溶液中或是将含有干细胞的溶液涂布或滴在牙科植体的外螺纹的钛金属表面上。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种(如人类)或是与第一个体不相同生物分类的物种。例如，第一个体可以是一哺乳动物(如猪)，而第二个体是一人类。钛金属表面的粗糙度可小于50纳米(nm)或100纳米，例如介于20纳米至80纳米之间或介于30纳米至45纳米之间。当牙科植体通过螺纹旋入第一或第二个体的齿槽骨一段时间之后，含有干细胞的溶液可使钛金属表面和齿槽骨之间形成具有纳米洞和微米洞的多孔结构。

在另一个实施例中，以图1的步骤S1至S6或图2的步骤S11、S12及S1至S6所制备、获得或制作的含有干细胞的溶液可以用于一植牙治疗。该植牙治疗包括以下步骤：将牙科植体通过螺纹旋入第一或第二个体的齿槽骨，其中牙科植体具有多孔性氧化钛层在其外螺纹(或螺旋)上，然后将含有干细胞的溶液涂布或滴在牙科植体的露出部分(即牙科植体的顶部)上，使含有干细胞的溶液沿着牙科植体的多孔性氧化钛层和第一或第二个体的齿槽骨之间的界面流动，以致牙科植体的多孔性氧化钛层和第一或第二个体的齿槽骨之间具有含有干细胞的溶液。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种(如人类)或是与第一个体不相同生物分类的物种。例如，第一个体可以是一哺乳动物(如猪)，而第二个体是一人类。多孔性氧化钛层具有复数个微米级的孔洞、复数个次微米级的孔洞及复数个纳米级的孔洞在其中；多孔性氧化钛层的粗糙度可大于100纳米(nm)、200纳米或300纳米，例如介于200纳米至700纳米之间或介于300纳米至500纳米之间。当含有干细胞的溶液位在多孔性氧化钛层和齿槽骨之间一段时间之后，含有干细胞的溶液可以增强具有纳米洞和微米洞的多孔结构在多孔性氧化钛层和齿槽骨之间的形成。在本实施例中，多孔性氧化钛层例如是形成在牙科植体的外螺纹的钛金属表面上。

在另一个实施例中，以图1的步骤S1至S6或图2的步骤S11、S12及S1至S6所制备、获得或制作的含有干细胞的溶液可以用于一植牙治疗。该植牙治疗包括以下步骤：将牙科植体通过螺纹旋入第一或第二个体的齿槽骨，其中牙科植体的外螺纹(或螺旋)的表面为钛金属表面，然后将含有干细胞的溶液涂布或滴在牙科植体的露出部分(即牙科植体的顶部)上，使含有干细胞的溶液沿着牙科植体的外螺纹的钛金属表面和第一或第二个体的齿槽骨之间的界面流动，以致钛金属表面和第一或第二个体的齿槽骨之间具有含有干细胞的溶液。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种(如人类)或是与第一个体不相同生物分类的物种。例如，第一个体可以是一哺乳动物(如猪)，而第二个体是一人类。钛金属表面的粗糙度可小于50纳米(nm)或100纳米，例如介于20纳米至80纳米之间或介于30纳米至45纳米之间。当含有干细胞的溶液位在钛金属表面和齿槽骨之间一段时间之后，含有干细胞的溶液可使钛金属表面和齿槽骨之间形成具有纳米洞和微米洞的多孔结构。

在另一个实施例中，以图1的步骤S1至S6或图2的步骤S11、S12及S1至S6所制备、获得或制作的含有干细胞的溶液可以用于治疗关节、肌腱、(膝)关节软骨、肩膀或脊椎。该治疗方法包括下列步骤：以图1所示的步骤S1至S6或是图2所示的步骤S11、S12及S1至S6制备、获得或制作含有干细胞的溶液，然后将一有效量的含有干细胞的溶液注入第一个体或第二个体，例如注入第一个体或第二个体的关节、肌腱、(膝)关节软骨、肩膀、脊椎或肌肉。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种(如人类)或是与第一个体不相同生物分类的物种。例如，第一个体可以是一哺乳动物(如猪)，而第二个体是一人类。

在另一个实施例中，以图1的步骤S1至S6或图2的步骤S11、S12及S1至S6所制备、获得或制作的含有干细胞的溶液可以用于治疗关节炎(例如骨关节炎[osteoarthritis]、干癣性关节炎[psoriatic arthritis]、类风湿性关节炎[rheumatoid arthritis]或僵直性脊椎炎[ankylosing spondylitis])、肌腱炎、肌腱损伤或自体免疫疾病(例如类风湿性关节炎、僵直性脊椎炎或全身性红斑性狼疮[systemic lupus erythematosus])。该治疗方法包括下列步骤：以图1所示的步骤S1至S6或是图2所示的步骤S11、S12及S1至S6制备、获得或制作含有干细胞的溶液，然后将一有效量的含有干细胞的溶液注入第一个体或第二个体，例如注入第一个体或第二个体的关节、肌腱、(膝)关节软骨、肩膀、脊椎或肌肉。第二个体可以是与第一个体相同生物分类的物种(如人类)或是与第一个体不相同生物分类的物种。例如，第一个体可以是一哺乳动物(如猪)，而第二个体是一人类。

以上所述是通过实施例说明本发明的特点，其目的在使熟习该技术者能暸解本发明的内容并据以实施，而非限定本发明的专利范围，故，凡其他未脱离本发明所揭示的精神所完成的等效修饰或修改，仍应包含在以下所述的申请专利范围中。

Claims (10)

1.一种制备一含有干细胞的溶液的方法，其特征在于，包括下列步骤：

将一血液样本和一二价阳离子螯合剂的一混合液放在温度为2至12摄氏度的环境中静置3至72小时，使所述的混合液形成复数个分离层，其中位于所述的分离层其中之一内的一液体含有复数个体干细胞及复数个血小板；

取得所述的液体；以及

在取得所述的液体之后，离心所述的液体，使复数个颗粒聚集在所述的液体中，所述的颗粒包括所述的体干细胞及所述的血小板。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括在离心所述的液体之后，移除全部或部分的所述的液体并留下聚集在一起的所述的颗粒，然后重新悬浮所述的颗粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的二价阳离子螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)或柠檬酸盐。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的体干细胞的尺寸介于1微米至6微米之间，并且包括CD349(+)干细胞和Lgr5(+)干细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的液体含有所述的二价阳离子螯合剂。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述的含有干细胞的溶液是用于植牙治疗或骨移植术。

7.一种溶液，其特征在于，含有尺寸大于2微米至小于6微米的Lgr5(+)体干细胞，其中所述的溶液是用于植牙治疗。

8.如权利要求7所述的溶液，其特征在于，含有尺寸大于2微米至小于6微米的CD349(+)体干细胞。

9.如权利要求7所述的溶液，其特征在于，其中白血球占尺寸大于2微米至小于20微米的细胞的百分比为小于2％。

10.如权利要求7所述的溶液，其特征在于，含有一盐类。