TW201632456A

TW201632456A - 光聲成像用奈米粒子

Info

Publication number: TW201632456A
Application number: TW105102762A
Authority: TW
Inventors: Eiichi Ozeki; Isao Hara
Original assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2015-03-06
Filing date: 2016-01-29
Publication date: 2016-09-16
Also published as: TWI561463B; WO2016143017A1

Abstract

本發明的奈米粒子包含含有兩親媒性嵌段聚合物的分子集合體。兩親媒性聚合物包含具有20個以上肌胺酸單元的親水性嵌段鏈與具有10個以上乳酸單元的疏水性嵌段鏈。分子集合體含有包含近紅外線吸收官能基的近紅外線吸收有機分子，其濃度為5 μmol/g以上。近紅外線吸收有機分子較佳為於包含10個以上乳酸單元的聚合物鏈上鍵結有所述近紅外線吸收官能基的疏水性聚合物。本發明的奈米粒子可作為光聲成像的對比劑而使用。

Description

光聲成像用奈米粒子

本發明是有關於一種於光聲成像中使用的奈米粒子。

近年來，對奈米技術的關心不斷提高，開發出充分利用奈米尺寸物質特有的性質的新穎的功能性材料。在專利文獻1中記載了包含含有肌胺酸單元的親水性嵌段鏈與含有乳酸單元的疏水性嵌段鏈的兩親媒性嵌段聚合物可有效用作正電子發射斷層攝影法（Positron Emission Tomography，PET）或螢光成像用探測劑（Fluorescence Imaging，FI）。

正電子發射斷層攝影法（PET）、螢光成像（FI）、核磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）、超音波成像（Ultrasound Imaging，USI）等生物體成像法作為並不解剖生物體而把握生物體內的狀況的方法而於近年受到關注。

作為生物體成像法之一種的光聲成像（Photoacoustic Imaging，PAI）是檢測由於光聲效應而產生的聲波（一般是超音波）的產生位置及強度，獲得測定對象的影像的方法。所謂光聲效應是吸收光能的分子放出熱，且因該熱引起的體積膨脹而產生聲波的現象。光聲成像是可使用空間解析度高的雷射光作為激發手段而檢測組織內的衰減小的超音波的手法，因此作為空間解析度及深達度此兩者均優異的生物體成像手法而受到關注。於光聲成像中，一般使用生物體透過性高的近紅外線（波長為700 nm～900 nm）的奈米脈衝雷射。

於光聲成像中，存在由於生物體內的血色素（hemoglobin）或黑色素（melanin）的近紅外線吸收而引起的難以觀察到目標部位的情況。因此，為了使來自測定對象部位的聲波有效地增幅而可進行更詳細的檢測或測定，使用金奈米粒子或單層碳奈米管等具有近紅外線吸收性的對比劑。然而，包含無機材料的對比劑具有毒性，因此限制將其投予至生物體中。

另一方面，作為對生物體的毒性小的對比劑，已知有靛氰綠（indocyanine green，ICG）等有機分子。然而，ICG等近紅外線吸收有機分子由於分子尺寸小，因此於測定對象部位的集聚性低。因此，提出了使ICG等近紅外線吸收有機分子內包於奈米粒子內，作為光聲成像的對比劑而使用的方法。

例如，在專利文獻2中揭示了於核糖體（ribosome）中內包有ICG的聚集體的粒子可作為光聲成像的對比劑而使用。而且，在專利文獻2中揭示了如下方法：藉由將特別地鍵結於腫瘤等標的部位的物質（抗體等）固定化於粒子上，可特別地標識標的部位。 [現有技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：WO2009/148121號說明書專利文獻2：WO2013/125237號說明書

[發明所欲解決之課題]

然而，於所述專利文獻2中，僅僅表示了內包近紅外線吸收色素的核糖體在血清中的保持率高，並未表示在生物體中的應用例。而且，亦未表示光聲成像的測定例，難以說顯示了其有用性。

鑒於所述，本發明的目的在於提供如下光聲成像用奈米粒子，其使用對生物體的毒性少的有機分子，且於生物體內的集聚性優異。 [解決課題之手段]

本發明者等人研究的結果發現含有紅外線吸收有機分子的兩親媒性聚合物的分子集合體的奈米粒子可達成所述目的，從而完成本發明。本發明是有關於作為光聲成像的對比劑而使用的光聲成像用奈米粒子。

本發明的奈米粒子包含含有兩親媒性嵌段聚合物的分子集合體，所述兩親媒性嵌段聚合物包含具有20個以上肌胺酸單元的親水性嵌段鏈與具有10個以上乳酸單元的疏水性嵌段鏈。分子集合體以5 μmol/g以上的濃度含有包含近紅外線吸收官能基的近紅外線吸收有機分子。較佳為分子集合體的粒徑為20 nm～200 nm。

於較佳的形態中，近紅外線吸收有機分子是於包含10個以上乳酸單元的聚合物鏈上鍵結有所述近紅外線吸收官能基的疏水性聚合物。

近紅外線吸收官能基例如是下述式（1）所表示的官能基。

[化1]

於所述式中，R₁ 是亦可經取代的烷基，R₂ 是亦可經取代的伸烷基。R₃ 及R₃ '是氫原子、或相互連結而形成環狀結構的基。X是氫或鹵素。環B及環D是分別相同或亦可不同的含氮縮合芳香族雜環。A^- 是陰離子，m是0或1。

於一實施形態中，近紅外線吸收官能基是源自靛氰綠的基。 [發明的效果]

本發明的奈米粒子是有機分子且生物降解性優異，因此於投予至生物體的情況下的毒性小。而且，本發明的奈米粒子具有特別地集聚於血管病變或癌症部位的特性。因此，將本發明的奈米粒子作為對比劑而投予至生物體，進行利用近紅外激發光的光聲成像，藉此使血管病變或癌症部位的位置可視化，從而可正確地確定。

本發明的奈米粒子可藉由投予至生物體等中，作為光聲成像的對比劑而使用。奈米粒子包含含有兩親媒性嵌段聚合物的分子集合體，於分子集合體中含有近紅外線吸收有機分子。於分子集合體中含有近紅外線吸收有機分子的形態包括：兩親媒性嵌段聚合物與近紅外線吸收聚合物一同形成分子集合體的形態；鍵結有近紅外線吸收基的兩親媒性嵌段聚合物形成分子集合體的形態；於兩親媒性嵌段聚合物的分子集合體內內包近紅外線吸收劑的形態；及於兩親媒性嵌段聚合物與疏水性聚合物的分子集合體中內包近紅外線吸收劑的形態。

[兩親媒性嵌段聚合物] 於本發明的奈米粒子中，兩親媒性嵌段聚合物的凝聚力成為驅動力（driving force）而形成分子集合體。亦即，兩親媒性嵌段聚合物是分子集合體的基本要素。兩親媒性嵌段聚合物包含親水性嵌段鏈與疏水性嵌段鏈。

親水性嵌段鏈所具有的所謂「親水性」是表示相對於疏水性嵌段鏈而言，親水性相對性強。具體而言，表示該親水性嵌段鏈與疏水性嵌段鏈形成嵌段共聚物，藉此可作為共聚物分子整體而實現兩親媒性之程度的親水性。同樣地，疏水性嵌段鏈所具有的所謂「疏水性」是表示相對於親水性嵌段鏈而言，疏水性相對性強。具體而言，表示該疏水性嵌段鏈與親水性嵌段鏈形成嵌段共聚物，藉此可作為共聚物分子整體而實現兩親媒性之程度的疏水性。

（親水性嵌段鏈）親水性嵌段鏈是具有20個以上源自肌胺酸（N-甲基甘胺酸）的單元（肌胺酸單元）的親水性分子鏈。肌胺酸的水溶性高。而且，聚肌胺酸具有N取代醯胺，因此可順-反異構化，且α碳周圍的立體阻礙少，因此具有高的柔軟性。因此，藉由使用聚肌胺酸鏈作為構成單元，可形成兼具高的親水性與柔軟性的親水性嵌段鏈。

親水性嵌段鏈的肌胺酸單元若為20個以上，則鄰接存在的嵌段聚合物的親水性嵌段彼此容易凝聚，自身凝聚性得到提高，因此變得容易形成分子集合體。親水性嵌段鏈中的肌胺酸單元數的上限並無特別限制，自使分子集合體的結構穩定化的觀點考慮，較佳為500個以下。若肌胺酸單元數過大，則存在分子集合體欠缺穩定性的傾向。親水性嵌段鏈的肌胺酸單元數更佳為30個～300個，進一步更佳為50個～200個。

親水性嵌段鏈的所有的肌胺酸單元可連續，只要不損及所述聚肌胺酸的特性，肌胺酸單元亦可不連續。在親水性嵌段鏈具有肌胺酸以外的單體單元的情況下，肌胺酸以外的單體單元並無特別限定，例如可列舉親水性胺基酸或胺基酸衍生物。胺基酸包括α-胺基酸、β-胺基酸、γ-胺基酸，較佳為α-胺基酸。親水性α-胺基酸可列舉絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、天冬胺酸、麩胺酸等。而且，親水性嵌段亦可具有糖鏈或聚醚等。親水性嵌段較佳為於末端（和與疏水性嵌段的連接子部為相反側的末端）具有羥基等親水性基。

親水性嵌段鏈可為直鏈狀，亦可具有分支結構。於親水性嵌段鏈具有分支結構的情況下，較佳為於各分支鏈含有兩個以上肌胺酸單元。

（疏水性嵌段鏈）疏水性嵌段鏈具有10個以上乳酸單元（在本說明書中，有時將以乳酸單元為基本單元的該疏水性嵌段鏈簡單記載為聚乳酸）。聚乳酸具有優異的生物體適合性及穩定性。因此，由以聚乳酸為構成嵌段的兩親媒性聚合物所得的分子集合體在生物體、特別是人體中的應用中有用。而且，聚乳酸具有優異的生物降解性，因此代謝快，於生物體內對病變部位以外的組織的集聚性低。因此，由以聚乳酸為構成嵌段的兩親媒性物質所得的分子集合體於對血管病變的特別的集聚性的方面非常有用。而且，聚乳酸在低沸點溶媒中的溶解性高，因此在用以製造分子集合體的溶液中可使用低沸點的有機溶媒。因此，可容易地減低分子集合體的製造中所使用的溶劑的殘存量，對生物體的安全性優異，且提高分子集合體的製造效率。

疏水性嵌段鏈若具有10個以上乳酸單元，則容易形成疏水芯，自身凝聚性得到提高，因此變得容易形成分子集合體。疏水性嵌段鏈中的乳酸單元數的上限並無特別限制，自使分子集合體的結構穩定化的觀點考慮，較佳為100個以下。疏水性嵌段中的乳酸單元數更佳為20個～80個，進一步更佳為30個～50個。

在作為由以聚乳酸為構成嵌段的兩親媒性物質所得的分子集合體的形狀控制及大小控制的一因素而作出貢獻的方面而言，亦較佳為調整聚乳酸的鏈長。疏水性嵌段鏈的所有的乳酸單元可連續，也可以不連續。

構成疏水性嵌段鏈的乳酸單元可為L-乳酸亦可為D-乳酸。而且，亦可為L-乳酸與D-乳酸混合存在。疏水性嵌段鏈的所有的乳酸單元可連續，乳酸單元也可以不連續。疏水性嵌段鏈中所含的乳酸以外的單體單元並無特別限定，例如可列舉乙醇酸、羥基異丁酸等羥基酸，或甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、酪胺酸、色胺酸、麩胺酸甲酯、麩胺酸苄酯、天冬胺酸甲酯、天冬胺酸乙酯、天冬胺酸苄酯等疏水性胺基酸或胺基酸衍生物。

疏水性嵌段鏈可為直鏈狀，亦可具有分支結構。疏水性嵌段鏈並不分支者在形成分子集合體時，存在容易形成緊湊的疏水芯，親水性嵌段鏈的稠密度增大的傾向。因此，為了形成粒徑小、結構穩定性高的芯/殼型分子集合體，較佳為疏水性嵌段鏈為直鏈狀。

（兩親媒性嵌段聚合物的結構及合成方法）兩親媒性聚合物是鍵結有親水性嵌段鏈與疏水性嵌段鏈者。親水性嵌段鏈與疏水性嵌段鏈亦可經由連接子而鍵結。連接子可較佳地使用具有可與作為疏水性嵌段鏈的構成單元的乳酸單體（乳酸或乳酸交酯）或聚乳酸鏈鍵結的官能基（例如羥基、胺基等）、可與作為親水性嵌段的構成單元的肌胺酸單體（例如肌胺酸或N-羧基肌胺酸酐）或聚肌胺酸鍵結的官能基（例如胺基）的連接子。藉由適宜選擇連接子，可控制親水性嵌段鏈或疏水性嵌段鏈的分支結構。

兩親媒性嵌段聚合物的合成法並無特別限定，可使用公知的肽合成法、聚酯合成法、酯肽合成法等。詳細而言可參照WO2009/148121號（所述專利文獻1）等而合成兩親媒性嵌段聚合物。

[近紅外線吸收有機分子] 近紅外線吸收有機分子含有吸收近紅外線（波長為700 nm～1300 nm）的官能基。具有氫鍵的化合物的取代基在近紅外區域具有吸收，但其吸收比較小，近紅外線容易透過生物體組織。因此，若將含有吸收近紅外線而放出熱能的近紅外線吸收有機分子的對比劑投予至生物體而進行光聲成像，則變得可正確地獲得集聚有對比劑的部位的資訊。亦即，藉由在奈米粒子中含有近紅外線吸收有機分子，變得可使用近紅外的激發光而進行生物體的光聲成像。

近紅外線吸收有機分子可列舉具有在聚合物上鍵結有近紅外線吸收基的狀態的化合物（近紅外線吸收聚合物）及近紅外線吸收有機分子其自身（近紅外線吸收劑）。

＜近紅外線吸收聚合物＞近紅外線吸收聚合物是在聚合物鏈上鍵結有近紅外線吸收基者。可將在所述兩親媒性聚合物上鍵結有近紅外線吸收基者作為近紅外線吸收聚合物，亦可將在可藉由自身集合與兩親媒性聚合物一起形成分子集合體的聚合物上鍵結有近紅外線吸收基者用作近紅外線吸收聚合物。自於分子集合體的疏水芯存在多個近紅外線吸收有機分子，且提高光聲訊號的強度的觀點考慮，可較佳地使用在疏水性聚合物上鍵結有近紅外線吸收基者。

（近紅外線吸收基）作為近紅外線吸收基，使用經由共軛系而鍵結多個芳香環，由此而構成長且大的共軛π電子系的基。具體而言可列舉源自花青（Cyanine）系色素、酞菁（phthalocyanine）系色素、萘醌（naphthoquinone）系色素、二亞銨（diimmonium）系色素、偶氮系色素等色素的官能基。其中，自近紅外的吸光係數高、光聲訊號強度容易提高考慮，較佳為花青系。源自花青系色素的基的一例以如下的通式（I）而表示。

[化2]

所述式（I）中、R₁ 是亦可經取代的烷基，R₂ 是亦可經取代的伸烷基。R₃ 及R₃ '是氫原子、或相互連結而形成環狀結構的基。X是氫或鹵素。環B及環D是分別相同或亦可不同的含氮縮合芳香族雜環。A^- 是陰離子，m是0或1。

R₁ （烷基）及R₂ （伸烷基）的碳數為1～20，較佳為碳數為2～5。在R₁ 及R₂ 具有取代基的情況下，該取代基亦可為陰離子性。取代基可列舉羧基、羧酸鹽基、金屬羧酸鹽基、磺醯基、磺酸鹽基、金屬磺酸鹽基、羥基等。所述金屬可以是鹼金屬或鹼土金屬。

在X為鹵素的情況下，鹵素可以是Cl、Br及I。在m為0的情況下，R₁ 及R₂ 的任意一者為陰離子性基，分子整體採用甜菜鹼結構。在m為1的情況下，A^- 可以是Cl^- 、Br^- 、I^- 等鹵離子，ClO₄ ^- 、BF₄ ^- 、PF₆ ^- 、SbF₆ ^- 、SCN^- 等。

環A及環B可以分別獨立為含氮二環式或三環式芳香族雜環。較佳為環B與環D相同。環B的較佳的態樣可列舉以下所示的結構。

[化3]

環D的較佳的態樣可列舉以下所示的結構。 [化4]

於所述式中，R₄ 及R₅ 均可以是氫。或者R₄ 及R₅ 亦可相互連結而形成芳基環。所述芳基環可以是亦可經取代的苯環。

較佳的近紅外線吸收基是以下述結構式（II）所表示的源自靛氰化合物的基。 [化5]

較佳的近紅外線吸收基的具體例可列舉環B及環D均為含氮三環式芳香族雜環的ICG基（下述式III）、IC7-1基（下述式IV）及IR820基（下述式V）；環B及環D均為含氮二環式芳香族雜環的IR783基（下述式VI）及IR806基（下述式VII）；以及環B為含氮三環式芳香族雜環、環C為含氮二環式芳香族雜環的IC7-2基（下述式VIII）。

[化6]

（聚合物鏈）近紅外線吸收聚合物的聚合物鏈部分的結構並無特別限定。聚合物鏈較佳為疏水性。近紅外線吸收聚合物若為疏水性，則容易凝聚於分子集合體的疏水芯，而獲得利用近紅外的激發光的光聲訊號強度高的奈米粒子。

疏水性聚合物鏈較佳為具有多個乳酸單元。例如，可為以乳酸單元為主要構成成分者（亦即聚乳酸鏈），亦可為除了多個乳酸單元的疏水性嵌段之外亦具有親水性嵌段者（亦即兩親媒性嵌段聚合物鏈）。近紅外線吸收聚合物的疏水性聚合物鏈較佳為具有5個以上乳酸單元。疏水性聚合物鏈的乳酸單元數更佳為5～50，進一步更佳為15～35。乳酸單元的所有可連續，亦可不連續。

在分子集合體含有兩親媒性聚合物與近紅外線吸收聚合物的情況下，近紅外線吸收聚合物的疏水性聚合物鏈的構成單元或鏈長基本上可根據與所述兩親媒性嵌段聚合物的疏水性嵌段鏈的分子設計同樣的觀點而決定。若如此，則近紅外線吸收聚合物與兩親媒性嵌段聚合物的疏水性嵌段鏈的親和性高，因此變得容易獲得於疏水芯部分含有近紅外線吸收聚合物的分子集合體。

較佳為近紅外線吸收聚合物的聚合物鏈不超過兩親媒性嵌段聚合物的長度。而且，較佳為近紅外線吸收聚合物的聚合物鏈不超過兩親媒性嵌段聚合物中的疏水性嵌段的2倍的長度。較佳為所述近紅外線吸收基鍵結於聚合物鏈的末端構成單元上。

作為於疏水性聚合物鏈上鍵結有源自靛氰綠的ICG基而作為近紅外線吸收基的近紅外線吸收聚合物的具體例，可列舉下述式的聚合物。於下述式中，n是整數，較佳為5～50。

[化7]

＜近紅外線吸收劑＞近紅外線吸收劑可藉由內包於以所述兩親媒性嵌段聚合物為基本要素的分子集合體而形成分子集合體的一部分。近紅外線吸收劑可列舉花青系色素、酞菁系色素、萘醌系色素、二亞銨系色素、偶氮系色素等。其中，自近紅外的吸光係數高、容易提高光聲訊號強度考慮，較佳為花青系。花青系色素的一例是以下的通式（I'）而表示。

[化8]

於所述式（I'）中，R₂ '是於所述式（I）中的R₂ 上加成有氫原子、烷基、其他取代基者。所述式（I'）除了將R₂ 置換為R₂ '以外，其他與所述式（I）相同。

所述式（I'）所表示的近紅外線吸收劑的具體例可列舉環B及環D均為含氮三環式芳香族雜環的ICG（下述式III'）、IC7-1（下述式IV'）及IR820（下述式V'）；環B及環D均為含氮二環式芳香族雜環的IR783（下述式VI'）及IR806（下述式VII'）；以及環B為含氮三環式芳香族雜環、環C為含氮二環式芳香族雜環的IC7-2（下述式VIII'）。

[化9]

[奈米粒子的形成] 本發明的奈米粒子包含以含有所述近紅外線吸收有機分子的方式而形成的所述兩親媒性聚合物的分子集合體。另外，在使用鍵結有近紅外線吸收基的兩親媒性嵌段聚合物的情況下，可藉由形成兩親媒性嵌段聚合物的分子集合體而獲得含有近紅外線吸收有機分子的奈米粒子。奈米粒子的製作法並無特別限定，可根據奈米粒子的大小、特性、承載的近紅外線吸收有機分子的種類、性質、含量等而適宜選擇。形成有奈米粒子的情況可藉由電子顯微鏡觀察而確認。

作為奈米粒子的形成方法的具體例，可列舉使含有兩親媒性聚合物與近紅外線吸收有機分子的溶液乾燥而所得的薄膜與水系液體接觸，而獲得於水系液體中分散有奈米粒子的分散液的方法（薄膜法），使該溶液與水系液體接觸而獲得分散液的方法（注入法）等。

於薄膜法及注入法的任意方法中，均是使用包含兩親媒性嵌段聚合物或近紅外線吸收有機分子等分子集合體的構成成分及溶媒的溶液。溶媒若為可溶解分子集合體的構成成分者，則並無特別限定。於薄膜法中較佳地使用低沸點溶媒。所謂低沸點溶媒是指1大氣壓下的沸點為100℃以下、較佳為90℃以下的溶媒。具體而言可列舉氯仿、二乙醚、乙腈、乙醇、三氟乙醇、異丙醇、六氟異丙醇、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃、己烷等。於注入法中，除了所述低沸點溶媒以外，亦可並無限制地使用二甲基亞碸、二甲基甲醯胺等高沸點溶媒。

奈米粒子的形成中所使用的溶液亦可含有兩親媒性嵌段聚合物、近紅外線吸收有機分子、及溶媒以外的成分。例如亦可含有兩親媒性嵌段聚合物或近紅外線吸收聚合物以外的聚合物作為分子集合體的構成成分。兩親媒性嵌段聚合物或近紅外線吸收聚合物以外的聚合物可列舉疏水性聚合物。藉由加入疏水性聚合物，可促進分子集合體的疏水芯的形成或控制疏水芯的體積等。疏水性聚合物可使用與所述近紅外線吸收聚合物的聚合物鏈（不含近紅外線吸收基者）同等者。另外，為了提高近紅外線吸收有機分子的濃度，且獲得光聲成像用奈米粒子，較佳為不使用近紅外線吸收聚合物以外的疏水性聚合物（亦即不含近紅外線吸收基的疏水性聚合物），或者極力減少使用量。具體而言，不含近紅外線吸收基的疏水性聚合物的量較佳為相對於100莫耳份近紅外線吸收聚合物而言為30莫耳份以下，更佳為20莫耳份以下，進一步更佳為10莫耳份以下。

（薄膜法）薄膜法是在核糖體的製備中所使用的方法。所述兩親媒性嵌段聚合物由於疏水性嵌段鏈具有乳酸單元，且具有在低沸點溶媒中的溶解性，因此可使用該方法而製備奈米粒子。薄膜法包含：在玻璃容器等容器中準備所述溶液的步驟；自溶液中除去有機溶媒，於容器的內壁獲得含有聚合物與近紅外線吸收有機分子的薄膜的步驟；及於容器中加入水系液體，將薄膜狀物質轉換為內包近紅外線吸收有機分子的分子集合體而獲得奈米粒子的分散液的步驟。

藉由自容器內的溶液除去溶媒，而於容器內壁形成含有構成分子集合體的聚合物與近紅外線吸收有機分子的薄膜。溶媒的除去方法並無特別限定，可根據所使用的溶媒的沸點等而適宜決定。例如可進行減壓下的溶媒除去，亦可進行利用自然乾燥的溶媒除去。

於貼附有該薄膜的容器中加入水系液體，於薄膜自容器內壁剝落的過程中形成分子集合體。水系液體是水或水溶液，若為生物化學、藥學所許可的液體即可，例如可列舉注射用蒸餾水、生理鹽水、緩衝液等。為了使薄膜自容器內壁剝離，而促進奈米粒子的形成，亦可於容器內加入水系液體後進行加溫處理或超音波處理。加溫處理例如可在70℃～100℃、5分鐘～60分鐘的條件下進行。

另外，亦可在薄膜或玻璃板等基材上形成薄膜而代替在容器的內壁形成薄膜，藉由使基材上的薄膜與水系液體接觸而形成奈米粒子。基材上的薄膜與水系液體的接觸例如可藉由將形成有薄膜的基材浸漬於水系液體中而進行。

（注入法）注入法是在其他眾多奈米粒子的製備中所使用的方法。於該方法中，使所述溶液分散於水系液體中，進行純化處理，例如凝膠過濾層析法、過濾、超離心等處理後，將有機溶媒除去，藉此可製備奈米粒子。較佳為於注入法中，在使用對生物體有害的有機溶媒作為溶液的溶媒的情況下，嚴格地進行有機溶媒的除去。

（奈米粒子的冷凍乾燥處理）藉由薄膜法或注入法而所得的奈米粒子的分散液可直接作為光聲成像用對比劑而投予至生物體。而且，亦可對所得的分散液進行冷凍乾燥處理。冷凍乾燥處理的方法可採用公知的方法。例如，藉由液氮等使奈米粒子的分散液冷凍，於減壓下使其昇華，藉此而獲得奈米粒子的冷凍乾燥處理物。藉此可使奈米粒子作為冷凍乾燥處理物而進行保存。視需要於該冷凍乾燥物中加入水系液體，獲得奈米粒子的分散液，藉此可將奈米粒子供至使用。

於冷凍乾燥處理前的分散液中，對奈米粒子的形成並未作出貢獻的聚合物或近紅外線吸收有機分子有時分別以其自身的形式而殘存。若將此種分散液供至冷凍乾燥處理，則在溶媒被濃縮的過程中，可由並未形成奈米粒子而殘存的聚合物與近紅外線吸收有機分子而進一步形成奈米粒子。因此，變得可有效率地進行本發明的奈米粒子的製備。

（近紅外線吸收有機分子的濃度）光聲成像用奈米粒子中的近紅外線吸收有機分子的濃度為5 μmol/g以上。藉由提高近紅外線吸收有機分子的濃度，可提高將奈米粒子投予至生物體的情況下的光聲訊號的強度。在近紅外線吸收有機分子的濃度不足5 μmol/g的情況下，即使增大奈米粒子於生物體中的投予量，亦難以獲得可進行生物體成像之程度的光聲訊號。為了可實現精度更高的光聲成像，奈米粒子中的近紅外線吸收有機分子的濃度較佳為10 μmol/g以上，更佳為15 μmol/g以上，進一步更佳為20 μmol/g以上。奈米粒子中的近紅外線吸收有機分子的濃度的上限並無特別限制，但存在濃度越高越提高光聲訊號強度的傾向。然而，若近紅外線吸收有機分子的濃度過高，則存在分子集合體的結構變得不穩定的傾向。因此，奈米粒子中的近紅外線吸收有機分子的濃度較佳為100 μmol/g以下，更佳為70 μmol/g以下，進一步更佳為50 μmol/g以下。

ICG等近紅外線吸收基亦是螢光色素，藉由照射近紅外線而發出螢光，因此亦可作為螢光對比劑而使用。於螢光成像中，若螢光色素的濃度變高，則產生由於濃度淬滅而造成的訊號降低。特別是在分子集合體內內包近紅外螢光色素的情況下，若於一個分子集合體的疏水芯內存在多個螢光色素分子，則螢光色素分子彼此近接而存在，因此容易產生濃度淬滅。例如在分子集合體的奈米粒子中內包ICG的情況下，若其濃度成為5 μmol/g以上，則變得幾乎觀測不到來自ICG的螢光。因此，於螢光成像用奈米粒子中，除了藉由螢光色素所標識的疏水性聚合物以外，亦使用未藉由螢光色素所標識的疏水性聚合物，需要限制摻入至疏水芯的螢光色素數。另一方面，於光聲成像中，於一個分子集合體內存在多個紅外線吸收基，使其成為藉由螢光而產生濃度淬滅之程度的高濃度，由此而獲得可進行生物體成像之程度的光聲訊號。

藉由調整兩親媒性聚合物與近紅外線吸收有機分子的使用比率，可提高奈米粒子中的近紅外線吸收有機分子的濃度。在使用於疏水性聚合物鏈上鍵結有近紅外線吸收基的疏水性近紅外線吸收聚合物作為近紅外線吸收有機分子的情況下，近紅外線吸收聚合物的量較佳為相對於100莫耳份兩親媒性聚合物而言為5莫耳份～200莫耳份，更佳為10莫耳份～100莫耳份，進一步更佳為15莫耳份～70莫耳份。

（奈米粒子的大小）本發明的光聲成像用奈米粒子的大小較佳為20 nm～200 nm。所謂「粒徑」是指在粒子分佈中出現頻率最高的粒徑，亦即中心粒徑。粒徑小於20 nm的奈米粒子難以在分子集合體內高濃度地內包近紅外線吸收有機分子，粒徑大於200 nm的奈米粒子在特別是藉由注射而投予至生物體內的情況下，存在作為注射劑而言欠佳的情況。奈米粒子的大小可藉由利用穿透式電子顯微鏡（Transmission Electron Microscope；TEM）的觀察法、或動態光散射（Dynamic Light Scattering；DLS）法而測定。

作為控制奈米粒子的大小的方法，可列舉調整兩親媒性嵌段聚合物或疏水性聚合物的鏈長的方法，或調整疏水性聚合物的調配量的方法。隨著疏水性聚合物的調配量的增大，分子集合體的疏水芯的體積增大，因此存在奈米粒子變大的傾向。

[奈米粒子於光聲成像中的應用] 本發明的光聲成像用奈米粒子是以包含具有肌胺酸單元的親水性嵌段鏈與具有乳酸單元的疏水性嵌段鏈的兩親媒性嵌段聚合物為基本要素的分子集合體（所謂的乳糖體（Lactosome））。乳糖體具有如下特長：具有高的血中滯留性，且與其他分子集合體相比而言，在肝臟中的集聚量明顯較低。

迄今為止，已知可將近紅外線吸收劑等色素用於光聲成像中，但靛氰綠等色素於肝臟中的集聚性高，難以在病變部位集聚於血管等的病變部位。相對於此，若使用本發明的奈米粒子，則藉由利用滯留於血中的奈米粒子容易聚集於腫瘤部位、炎症部位、動脈硬化部位、血管新生部位等血管病變部位的性質（高透過性和滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應），變得可進行以癌症部位等為標的之光聲成像。

（於生物體中投予奈米粒子）奈米粒子的投予對象的生物體並無特別限定，可以是人類或非人類動物。作為非人類動物，可列舉人類以外的哺乳類，更具體而言可列舉靈長類、齧齒類（小白鼠、大白鼠等）、兔、狗、貓、豬、牛、羊、馬等。於生物體內的投予方法並無特別限定，可為全身投予及局部投予的任意者。亦即，奈米粒子的投予可藉由注射、內服、外用的任意方法而進行。投予液中的奈米粒子的濃度為0.5 mg/mL～100 mg/mL左右，較佳為0.8 mg/mL～50 mg/mL，更佳為1 mg/mL～20 mg/mL。

自投予奈米粒子直至開始檢測為止的時間可根據奈米粒子所具有的近紅外線吸收有機分子的種類或投予標靶的種類等而適宜決定。例如可設為投予後3小時～48小時、或1小時～24小時。若低於所述範圍，則奈米粒子於癌症部位等標的之滯留不充分，訊號過強，因此存在無法明確地區分投予標靶與其他部位（背景）的情況。如超過所述範圍，則存在自投予標靶排泄奈米粒子的情況。

（光聲成像裝置）光聲成像是利用如下現象者，即吸收光能的分子放出熱，且因該熱引起的體積膨脹而產生聲波的現象（光聲效應）。光聲成像裝置可根據成像部位等而使用適宜的裝置。光聲成像裝置包含光激發部、聲波檢測部、成像部。

光激發部照射近紅外線，對投予至生物體的奈米粒子中所含的近紅外線吸收有機分子進行激發。光激發部較佳為近紅外的相干光源，其中較佳地使用OPD雷射。OPD雷射是利用光參數振盪（Optical Parametric Oscillation；OPD）的相干光源，作為在自可見區域至紅外區域的較廣的波長區域中連續波長可變的光源而得到實用化。

聲波檢測部檢測因熱引起的體積膨脹而產生的聲波（具體而言為超音波），所述熱是自被來自光激發部的照射光所激發的分子放出的熱。聲波檢測部可使用可檢測超音波的聲響感測器。

成像部若為基於聲波檢測部的位置及所檢測的聲波的波形，而使存在奈米粒子的組織的位置或大小可視化者即可。根據所得的光聲影像，可獲知生物體內的奈米粒子的滯留狀況，可基此診斷血管病變的有無或位置等。 [實施例]

以下表示使用本發明的奈米粒子的光聲成像的實施例，但本發明並不限定於以下的實施例。

[分子集合體的製作] 如下所述，製作包含近紅外線吸收聚合物（ICG-PLLA₃₀ ）與兩親媒性嵌段聚合物（PSar₇₀ -PLLA₃₀ ）的分子集合體的奈米粒子。

＜ICG修飾聚L-乳酸（ICG-PLLA₃₀ ）的合成＞（胺基化聚L-乳酸的合成）使用L-乳酸交酯與N-苄氧羰基-1,2-二胺基乙烷鹽酸鹽，依照下述的流程1，合成胺基化聚L-乳酸（a-PLA）。

[化10]

將使辛酸錫（6.91 mg）擴散於甲苯（1.0 mL）中而成者加入至作為聚合起始劑的N-苄氧羰基-1,2-二胺基乙烷鹽酸鹽（310 mg，1.60 mmol）中。將甲苯減壓蒸餾除去後，加入L-乳酸交酯（3.45 g，24 mmol），在Ar環境下、120℃下進行12小時的聚合反應後，將反應容器空氣冷卻至室溫。使所得的黃白色固體溶解於約10 mL的氯仿中，滴加至冷甲醇（100 mL）中而獲得白色沈澱。藉由離心分離回收所得的白色沈澱，進行減壓乾燥。

於所得的白色沈澱（500 mg）的二氯甲烷（1 mL）溶液中加入25 v/v%溴化氫/乙酸（2.0 mL），於遮光、乾燥空氣下進行2小時攪拌。於反應結束後，將反應溶液滴加至冷甲醇（100 mL）中，藉由離心分離回收所析出的沈澱。將所得的白色沈澱溶解於氯仿中之後，藉由飽和NaHCO₃ 水溶液進行清洗，藉由無水MgSO₄ 進行脫水操作。藉由矽藻土過濾而將MgSO₄ 除去後，進行真空乾燥，獲得a-PLA的白色的非晶狀粉末（440 mg）。

（近紅外線吸收基的修飾）於含有1.9 mg胺基化聚L-乳酸（a-PLA）的DMF溶液中，加入含有1 mg（相對於a-PLA而言為1.3當量）靛氰綠衍生物（ICG-sulfo-OSu）的DMF溶液，於室溫下進行約20小時的攪拌。其後，將溶媒減壓蒸餾除去，藉由LH-20管柱進行純化，獲得經由胺基而在聚L-乳酸上鍵結有源自靛氰綠的近紅外線吸收官能基的聚合物（ICG-PLLA₃₀ ）（下述流程2）。

[化11]

＜兩親媒性嵌段聚合物（PSar₇₀ -PLLA₃₀ ）的合成＞於胺基化聚L-乳酸（a-PLA）（383 mg，0.17 mmol）與肌胺酸-N-羧酸酐（Sar-NCA）（3.21 g，27.9 mmol）中，在Ar環境下加入二甲基甲醯胺（DMF）（140 mL），於室溫下進行12小時的攪拌。將反應溶液冷卻至0℃後，加入乙醇酸（72 mg，0.95 mmol）、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽（HATU）（357 mg，0.94 mmol）、及N,N-二異丙基乙基胺（DIEA）（245 μL，1.4 mmol），於室溫下進行18小時的反應（下述流程3）。

[化12]

藉由旋轉蒸發器將DMF減壓蒸餾除去後，藉由LH20管柱進行純化，回收於270 nm檢測出峰值的餾份而進行濃縮。將所得的濃縮溶液在0℃下滴加至二乙醚中，進行再沈澱，藉此獲得1.7 g聚乳酸-聚肌胺酸兩親媒性嵌段聚合物（PSar₇₀ -PLLA₃₀ ）。

＜奈米粒子的製作＞製備聚乳酸-聚肌胺酸兩親媒性嵌段聚合物（PSar₇₀ -PLLA₃₀ ·26H₂ O，Mw=7767）及ICG修飾聚L-乳酸（ICG-PLLA₃₀ ，Mw=2998）各自的氯仿溶液（0.2 mM），以ICG修飾聚L-乳酸的莫耳濃度成為20 mol%的方式在玻璃容器內製備兩種溶液的混合液。將溶媒自混合液中減壓蒸餾除去，於玻璃容器的壁面形成混合聚合物的薄膜。於玻璃容器內加入水，於溫度為82℃下進行20分鐘熱水燙後，在室溫下放置30分鐘。藉由0.2 mm的過濾器進行過濾而將浮動異物除去，然後進行冷凍乾燥，獲得分子集合體（靛氰綠乳糖體）的奈米粒子。奈米粒子中的ICG修飾聚L-乳酸的含量是27 μmol/g。使用馬爾文（Malvern）公司製造的Zetasizer Nano S，藉由動態光散射（DLS）法而測定的奈米粒子的粒徑為60 nm。

將所得的奈米粒子的水分散液的吸收光譜表示於圖2（A）中。而且，將靛氰綠（濃度為2 μM）的吸收光譜表示於圖2（B）中。於ICG單質的吸收光譜中，極大吸收波長為779 nm，相對於此，靛氰綠乳糖體的極大吸收波長為796 nm，可知由於分子集合體的形成而向長波長側移動。而且，與ICG單質相比而言，靛氰綠乳糖體的吸收峰值寬度變小，莫耳吸光係數增大約10%。

光聲訊號與吸光係數成正比。因此，可知藉由使用本發明的奈米粒子，可進行與單獨使用色素的情況相比而言訊號強度高的光成像。近紅外吸收峰值的極大及形狀變化的理由尚不明確，但在本發明的奈米粒子中，在一個分子集合體內，多個ICG基近接而剛性固定，因此產生ICG基彼此的分子間相互作用，共軛π電子系受到擾動。

[光聲成像] 圖1是本實施例中所使用的光聲成像測定系統的構成概要圖。光聲用激發光源1使用30 Hz的光參數振盪器（脈衝寬度為6奈秒）。激發光源調整為與靛氰綠乳糖體的吸收峰值對應的796 nm。輸出光脈衝藉由分光鏡5而分割為4根光束，各個光束經由透鏡7而導入至光纖11。將來自各光纖的照射脈衝光的能量調整為小於20 μJ，組織表面的強度為約13 mJ/cm² 。

4根光纖11的前端安裝於光聲感測器頭15上。光聲感測器頭15的成像探針包含傾斜配置的4根激發用光纖11、及具有聲透鏡的聲波檢測用50 MHz超音波感測器。該探針的深度解析度為39 μm、XY面解析度為56 μm。

光聲感測器頭15連結於可動台13上，藉由電腦50而控制其位置。於本實施例中，藉由150 μm的間隔對4 mm見方的區域進行掃描。藉由場效電晶體放大器25對藉由4根激發用光纖11的光脈衝而誘發的光聲波（超音波）進行増幅。光電管23檢測來自光聲用激發光源1的雷射振盪，將其作為觸發器（trigger），藉由數位示波器21而檢測、記錄藉由放大器25而進行増幅的聲波，進行平均化。光聲波的時間波形可基於組織內的音速（1540 m/sec）而轉換為深度分佈，藉由可視化軟體（Kitware VolView 3.4）而重組為三維光聲影像。

[對小白鼠模型中投予靛氰綠乳糖體] 培養人類頭頸部扁平上皮癌細胞（FaDu），將其移植至雌性小白鼠（8週齡）的左大腿部（4×10⁶ 個/40 μL），使用腫瘤體積為100 mm³ 左右者。將1.5 wt%的靛氰綠乳糖體生理鹽水分散液藉由尾靜脈注射投予至該皮下腫瘤小白鼠模型（150 mg/kg體重）。將投予前、投予30分鐘後及投予18小時後所進行的光聲成像影像表示於圖3（A）～圖3（C）中。

[光動力治療] 在投予18小時後，使用808 nm的光纖耦合CW雷射二極體，實施光動力治療（photodynamic therapy，PDT）。以覆蓋腫瘤區域整體的方式，在光點大小為10 mm、功率密度為600 mW/cm² 下進行10分鐘的（360 J/cm² ）雷射照射。將PDT後所測定的光聲成像影像表示於圖3（D）中。

[血管的光聲成像] 在投予靛氰綠乳糖體前及PDT後進行血管的光聲成像測定。在血管的光聲成像中，使用100 Hz的光參數振盪器（脈衝寬度為9奈秒），將激發波長調整為氧化血色素（HbO₂ ）與脫氧化血色素（HHb）的等吸收點532 nm。將投予前及PDT後的光聲成像影像表示於圖3（E）、圖3（F）中。

於投予靛氰綠乳糖體前，雖然藉由532 nm的激發光確認表示血管結構的光聲訊號（圖3（E）），但796 nm的激發光的光聲訊號低（圖3（A））。於投予30分鐘後，確認796 nm的激發光的光聲訊號增大（圖3（B））。認為該現象是由於靛氰綠乳糖體在血管內循環而引起的。在投予18小時後，796 nm的激發光的光聲訊號明顯增大（圖3（C）），表示靛氰綠乳糖體有效率地蓄積於腫瘤內。

於實施光動力治療（PDT）後，796 nm的激發光的光聲訊號急速減少（圖3（D）），表示由於光動力反應而產生ICG的光褪色。而且，在PDT後，532 nm的激發光的光聲訊號亦基本消失，剩餘的訊號亦振幅減少約35%（圖3（F））。該現象暗示由於PDT而產生血管的停工。

以上結果表示藉由使用近紅外線的光聲成像而可觀測到本發明的奈米粒子特別地集聚於病變部位的血管內且濃度藉由PDT而急速地減少。根據該些結果可知本發明的奈米粒子於血管病變的診斷中有用。

1‧‧‧激發光源
5‧‧‧分光鏡
7‧‧‧透鏡
11‧‧‧光纖
13‧‧‧可動台
15‧‧‧光聲感測器頭
21‧‧‧數位示波器
23‧‧‧光電管
25‧‧‧放大器
50‧‧‧電腦

圖1是實施例中所使用的光聲成像裝置的構成圖。圖2（A）是實施例的奈米粒子（靛氰綠乳糖體（ICG Lactosome））的吸收光譜，圖2（B）是ICG的吸收光譜。圖3（A）～圖3（F）是光聲成像的測定結果，圖3（A）～圖3（D）是對796 nm的激發光的光聲訊號進行可視化者，圖3（E）及圖3（F）是對532 nm的激發光的光聲訊號進行可視化者。

Claims

一種光聲成像用奈米粒子，其是用作光聲成像的對比劑的光聲成像用奈米粒子，其包含含有兩親媒性嵌段聚合物的分子集合體，所述兩親媒性嵌段聚合物包含具有20個以上肌胺酸單元的親水性嵌段鏈與具有10個以上乳酸單元的疏水性嵌段鏈，於所述分子集合體中，以5 μmol/g以上的濃度含有包含近紅外線吸收官能基的近紅外線吸收有機分子。
如申請專利範圍第1項所述的光聲成像用奈米粒子，其中，所述近紅外線吸收有機分子是於包含10個以上乳酸單元的聚合物鏈上鍵結有所述近紅外線吸收官能基的疏水性聚合物。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的光聲成像用奈米粒子，其中，所述近紅外線吸收官能基是下述式（I）所表示的官能基：式中，R₁ 是亦可經取代的烷基；R₂ 是亦可經取代的伸烷基；R₃ 及R₃ '是氫原子、或相互連結而形成環狀結構的基；X是氫或鹵素；環B及環D是分別相同或亦可不同的含氮縮合芳香族雜環；A^- 是陰離子，m是0或1。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的光聲成像用奈米粒子，其中，所述近紅外線吸收官能基是源自靛氰綠的基。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的光聲成像用奈米粒子，其中，所述分子集合體的粒徑為20 nm～200 nm。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的光聲成像用奈米粒子，其於血管病變的診斷中使用。
如申請專利範圍第1項或第2項所述的光聲成像用奈米粒子，其於癌症部位的檢測中使用。