TW201625663A - 腫瘤抗原胜肽 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的在於提供一種腫瘤抗原胜肽，其特異性地被呈現在癌及癌幹細胞；及，提供一種含有此腫瘤抗原胜肽來作為有效成分之醫藥組成物等，其有益於癌的預防及/或治療。 為了達成上述目的，本發明是藉由提供下述來解決問題：一種部分胜肽，其源自屬於同型異構物A或C、或者是亞型5或6的BORIS(印記位點調節物兄弟)；一種聚核苷酸，其編碼出前述胜肽；一種醫藥組成物，其含有該等胜肽及/或聚核苷酸來作為有效成分；及，一種癌的預防及/或治療劑等，其特徵在於會誘導出細胞毒性T細胞。

Description

腫瘤抗原胜肽
本發明是關於一種源自BORIS的腫瘤抗原胜肽等，其作為癌的預防及/或治療劑是有益的。
至今所開發的抗癌劑的治療效果並不充分，僅藉由抗癌劑所實行的治療能夠根治癌症的機率極低。作為其原因，可舉出是以往的治療劑未能將形成癌組織的根源之細胞選擇性地標靶化的緣故。到了近年，作為該「形成癌組織的根源之細胞」，癌幹細胞的存在被報導出來。癌幹細胞，是在癌細胞之中以微乎其微的比例存在，具有高腫瘤形成能力、自我複製能力及分化能力的細胞，認為是涉及到癌的產生、復發及轉移的原因細胞。因此若能夠將癌幹細胞進行標靶化，期待有高的可能性能夠有效地抑制癌的增殖、復發及轉移。亦即，癌幹細胞的檢測技術和將癌幹細胞視為標靶之新穎治療劑的開發，對於癌症醫療成了重要的課題。
另一方面，在源自生物體的腫瘤細胞或病毒感染細胞等的排除方面，是細胞性免疫，尤其是細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte；稱為CTL)負責重 要的工作。在腫瘤細胞之排除時，CTL辨識出腫瘤細胞上的抗原胜肽(腫瘤抗原胜肽)和MHC(主要組織相容性複合體；Major Histocompatibility Complex)第I型抗原(在人類的的情況稱為HLA(人類白血球抗原，human leukocyte antigen)第I型抗原)之複合體，而攻擊、破壞腫瘤細胞。腫瘤抗原胜肽，是在腫瘤細胞中特異性地表現的蛋白質(腫瘤抗原蛋白質)，在細胞內被合成後，藉由透過蛋白分解酶在細胞內被分解而生成。所生成的腫瘤抗原胜肽，在內質網(endoplasmic reticulum)內與MHC第I型抗原(HLA第I型抗原)結合而形成複合體，並被運送到細胞表面上進行抗原呈現。如此一來，腫瘤特異性的CTL辨識出包含經抗原呈現的抗原胜肽之複合體，藉由細胞毒殺作用或淋巴素的產生等來攻擊腫瘤細胞而顯示出抗腫瘤效果。隨著如此一連串作用的闡明，藉由將腫瘤抗原蛋白質或腫瘤抗原胜肽作為所謂的癌免疫療法劑(癌疫苗)來運用，使癌症患者體內的癌特異性CTL增強的治療法正在持續開發。
BORIS(印記位點調節物兄弟；Brother of the Regulator of Imprinted Sites)基因，是CTCF基因的同種同源物，在編碼出N端胜肽區域和C端胜肽區域之2個胜肽之區域之間，具有11個鋅手指區域。BORIS，已知除了就像各式各樣的基因表現的抑制子及活化子般作為一般的轉錄因子而運作之外，也知道在各種的腫瘤細胞中，特別是在癌幹細胞中有表現。又，有報導 指出，BORIS的鋅手指區域，具有與CTCF基因的高相同性，BORIS中，存在著被分類成6群亞型的23個同型異構物，該等全部是轉錄後產生的剪接變異體(非專利文獻1)。又BORIS因為在睪丸以外的正常組織不會表現，作為癌診斷及治療的候選標的而受到注目，而有報導指出對於BORIS的各亞型之特異抗體或用來阻礙BORIS基因的表現之siRNA等(專利文獻1、2等)。並且亦有報導指出，分析BORIS蛋白質的序列，並從該序列預測出被限制於HLA-A0201之序列，其中的1個序列能夠誘導出CTL，該CTL會實際上特異性辨識出受到抗原呈現的細胞(非專利文獻2)。
[先前技術文獻] (專利文獻)
專利文獻1：國際公開第2008/028066號冊子
專利文獻2：美國專利申請案公開第2009/0169613號
(非專利文獻)
非專利文獻1：Pugacheva et al., PLoS ONE 5(11): e13872
非專利文獻2：Romagnoli et al., Rapporti ISTISAN. 2006;06(50), 36-40
本發明之目的在於提供一種源自BORIS之腫瘤抗原胜肽，特別是BORIS的同型異構物或亞型的特異性腫瘤抗原胜肽；及，提供一種含有此腫瘤抗原胜肽來作為有效成分之醫藥組成物等，其有益於癌的預防及/或治療，特別是特異性處置癌幹細胞之醫藥組成物等。
本案發明人，在研究作為用於癌疫苗治療之腫瘤抗原的BORIS中，發現BORIS即使是在子宮頸癌或卵巢癌之中顯示出幹細胞性質的細胞中，會特異性表現出特定的亞型的BORIS。基於該見解進一步反覆研究後，發現藉由誘導出細胞毒性T細胞(CTL)，其會辨識出表現特定的同型異構物或亞型的BORIS之細胞，而能處置許多的癌細胞及/或癌幹細胞，更加進展研究的結果而使本發明完成。
亦即本發明是關於下述所揭示者：
〔1〕一種誘導細胞毒性T細胞的方法，其細胞毒性T細胞會特異性辨識出表現BORIS基因之細胞，該BORIS基因屬於同型異構物A或C、或者是亞型5或6，該方法包含使以下之(a)或(b)中的任一種與週邊血液淋巴球(peripheral blood lymphocyte)接觸：(a)聚胜肽，其是前述BORIS蛋白質的部分胜肽，為8~20胺基酸長，並具有人類白血球抗原(HLA)結合能力； (b)聚核苷酸，其編碼出上述(a)記載的聚胜肽的至少一種。
〔2〕如〔1〕所述之誘導細胞毒性T細胞的方法，其中，在試管內(in vitro)進行。
〔3〕一種聚胜肽，其用於如〔1〕或〔2〕所述之方法中，是以序列編號1或序列編號2來表示的聚胜肽的部分胜肽，為8~20胺基酸長，並具有HLA結合能力。
〔4〕如〔3〕所述之聚胜肽，其為8~11胺基酸長。
〔5〕如〔3〕或〔4〕所述之聚胜肽，其是以序列編號1來表示的聚胜肽的部分胜肽。
〔6〕如〔5〕所述之聚胜肽，其是以序列編號3、序列編號4、序列編號5或序列編號72來表示。
〔7〕如〔3〕或〔4〕所述之聚胜肽，其是以序列編號2來表示的聚胜肽的部分胜肽。
〔8〕如〔7〕所述之聚胜肽，其是以序列編號10來表示。
〔9〕一種聚胜肽，其用於如〔1〕或〔2〕之方法中，並具有HLA-A11抗原結合能力。
〔10〕如〔9〕之聚胜肽，其是以序列編號65、序列編號66、序列編號67或序列編號72來表示。
〔11〕一種聚胜肽，其用於如〔1〕或〔2〕所述之方法中，並具有HLA-A2抗原結合能力，是以序列編號4、序列編號5、序列編號10、序列編號47或序列編號57來表示。
〔12〕一種聚胜肽，其用於如〔1〕或〔2〕所述之方法中，並具有HLA-A24抗原結合能力。
〔13〕如〔12〕之聚胜肽，其是以序列編號3或10來表示。
〔14〕一種聚胜肽，是在如〔3〕~〔13〕中任一項所述之聚胜肽中，被加成、缺失(deletion)、取代了1或複數個胺基酸。
〔15〕一種聚核苷酸，其用於如〔1〕或〔2〕所述之方法中，用以編碼出如〔3〕~〔14〕中任一項所述之聚胜肽。
〔16〕一種細胞毒性T細胞誘導劑，其包含如〔3〕~〔14〕中任一項所述之聚胜肽的至少一種來作為有效成分。
〔17〕一種醫藥組成物，其包含如〔16〕所述之細胞毒性T細胞誘導劑來作為有效成分。
〔18〕一種癌幹細胞處置用組成物，其包含如〔16〕所述之細胞毒性T細胞誘導劑來作為有效成分。
〔19〕一種癌的預防及/或治療用組成物，其包含如〔16〕所述之細胞毒性T細胞誘導劑來作為有效成分。
〔20〕一種癌的預防及/或治療用組成物，其包含利用如〔1〕或〔2〕所述之方法所誘導出來的細胞毒性T細胞來作為有效成分。
〔21〕如〔19〕或〔20〕所述之癌的預防及/或治療用組成物，其中，該癌是於女性特有的臓器中的癌或肺癌。
〔22〕一種表現載體，其含有如〔15〕所述之聚核苷酸。
〔23〕一種用於癌的治療或預防的醫藥組成物，其含有如〔15〕所述之聚核苷酸、或〔22〕所述之表現載體的任一種來作為有效成分。
〔24〕一種HLA-四聚體，其含有如〔3〕~〔14〕中任一項所述之聚胜肽和HLA。
〔25〕一種抗原呈現細胞的製造方法，其包含使下述(a)或(b)與具有抗原呈現能力的細胞在試管內接觸的步驟：(a)如〔3〕~〔14〕中任一項所述之聚胜肽(b)聚核苷酸，其編碼出上述(a)所述之聚胜肽的至少一種。
〔26〕一種抗體，其與以序列編號1或序列編號2來表示的聚胜肽的至少一部分進行特異性結合。
〔27〕一種BORIS蛋白質檢測用套組，其包含如〔26〕所述之抗體。
根據本發明，可提供：一種誘導細胞毒性T細胞(CTL)的方法，該CTL會辨識出特定的同型異構物或亞型之BORIS；一種腫瘤抗原胜肽，其作為用於該方法的CTL之誘導劑是有益的；及，一種含有此胜肽來作為有效成分之醫藥組成物等，其有益於癌的預防及/或治療。特別是在癌之中，由於在具有像幹細胞性質的細胞(亦即癌幹細胞)中，存在著會表現特定的亞型的BORIS，故藉由本發明之治療劑，對癌幹細胞選擇性地處置亦變得可能。
第1圖是根據球狀體形成分析法所形成的球狀體的相片。
第2圖是表示在子宮頸癌細胞株CaSki及TCS細胞株中的幹細胞性基因SOX2、NANOG、Oct3/4的相對表現量的圖表。
第3圖是表示在正常組織中的BORIS的表現的圖；(a)是表示RT-PCR的結果，(b)是表示相對表現量的圖表。
第4圖是表示在各種子宮頸癌細胞株的塊狀群細胞及球體群細胞中的BORIS相對表現量的圖表。
第5圖是表示各種癌細胞中的BORIS相對表現量的圖表。
第6圖是表示在子宮頸癌細胞株CaSki及MS751細胞株之中，塊狀群細胞和球體群細胞的各BORIS亞型的表現量的比較圖。
第7圖是表示在卵巢癌細胞株TOV21G及smov2細胞株之中，塊狀群細胞和球體群細胞的各BORIS亞型的表現量的比較圖。
第8-1圖是表示在子宮頸癌細胞株亦即TCS細胞株中，使各BORIS亞型大量表現時，球體形成分析的結果的相片。
第8-2圖是表示在子宮頸癌細胞株亦即TCS細胞株中，使各BORIS亞型大量表現時，球體形成分析的結果的圖表。
第9-1圖是表示在子宮頸癌細胞株亦即SKG-IIIb細胞株中，使各BORIS亞型大量表現時，球體形成分析的結果的相片。
第9-2圖是表示在子宮頸癌細胞株亦即SKG-IIIb細胞株中，使各BORIS亞型大量表現時，球體形成分析的結果的圖表。
第10圖是表示從BORIS sf6特異性序列中提取的候選HLA結合性胜肽之HLA-A02結合分析的結果的圖表。
第11圖是表示HLA-A＊24：02結合性BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽的折疊試驗的結果的圖表；該圖表是顯示由表示HLA-單體之峰值面積所推定出來的HLA-單體形成量。
第12-1圖是表示將採集自檢體編號A24-38的樣品，與RMM胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第12-2圖是表示將採集自檢體編號A24-38的樣品，與RMM胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階段解析中，由於在第2、4、8及9行中檢測到CTL，故於第二階段解析中，是針對這些行進行解析。
第13圖是表示使用RMM-Tet對RMM胜肽特異性CTL的機能進行機能解析的結果圖；在用RMM胜肽刺激時，得知IFNγ是RMM胜肽特異性地被生產出來。
第14-1圖是表示分別比較經siRNA轉染的CaSki細胞株之中的mRNA表現(a)及細胞增殖(b)的圖表。
第14-2圖是經siRNA轉染的CaSki細胞的顯微鏡影像。
第15圖是比較經siRNA轉染的CaSki細胞株之幹細胞性基因表現的圖表。
第16-1圖是比較經siRNA轉染的CaSki細胞株(a)、MS751細胞株(b)的球體形成能力的圖表。
第16-2圖是經siRNA轉染的各細胞株的顯微鏡影像。
第17圖是表示比較經siRNA轉染的細胞株之輻射耐受性的圖表。
第18圖是表示若BORIS表現量高則生存率會顯著降低的克普蘭-麥爾生存曲線(Kaplan-Meier survival curve)。
第19-1圖是表示在小細胞肺癌細胞株SBC1、SBC3、SBC5及Lc817細胞株之中，塊狀群細胞和球體群細胞之各BORIS亞型的表現量的比較圖。
第19-2圖是表示在非小細胞肺癌細胞株Lu99A及86-2細胞株之中，塊狀群細胞和球體群細胞之各BORIS亞型的表現量的比較圖。
第19-3圖是表示在肺鱗狀上皮癌細胞株LK2、EBC1及Sq1細胞株之中，塊狀群細胞和球體群細胞之各BORIS亞型的表現量的比較圖。
第19-4圖是表示在肺腺癌細胞株A549、LHK2、LHK2-SOX2及PC3細胞株之中，塊狀群細胞和球體群細胞之各BORIS亞型的表現量的比較圖。
第19-5圖是表示在肺腺癌初代培養細胞Primary3、Primary4、Primary5及Primary7細胞之中，塊狀群細胞和球體群細胞之各BORIS亞型的表現量的比較圖。
第20圖是表示將採集自檢體編號A2-34的樣品，與KLL胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段分析的結果圖。
第21圖是表示將採集自檢體編號A2-34的樣品，與KLL胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段分析的結果圖；由於在第一階段解析之中，於第5行及11中檢測出CTL，故在第二階段解析之中是針對這些行來進行解析。
第22圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與LLF胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第23-1圖及第23-2圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與LLF胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；由於在第一階段解析之中，於第1行、2、4、5、6、 7、8、9、10及11中檢測出CTL，故在第二階段解析之中是針對這些行來進行解析。
第24圖是表示將採集自檢體編號A2-S1的樣品，與LLF胜肽呈現細胞共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應的結果圖。
第25圖是表示由採集自檢體編號A2-S1、A2-S2、A2-S3的樣品，與LLF胜肽呈現細胞共培養，用ELISPOT來解析所誘導出來的CTL的IFNγ生產能力的結果圖。
第26圖是表示由採集自檢體編號A2-S1的樣品，與LLF胜肽呈現細胞共培養後，在將誘導出來的CTL進行單株化及增幅之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應的結果圖。
第27圖是表示由採集自檢體編號A2-S1的樣品，與LLF胜肽呈現細胞共培養後，在將誘導出來的CTL進行單株化及增幅之後，用ELISPOT來解析IFNγ的生產能力的結果圖。
第28圖是表示由採集自檢體編號A2-S1的樣品，與LLF胜肽呈現細胞共培養後，將誘導出來的CTL進行單株化及增幅之後，用LDH killing分析法來解析細胞毒殺性活性的結果圖。
第29圖是表示將採集自檢體編號A24-S4或檢體編號A2-S5的樣品，與RMM胜肽呈現細胞共培養之後，用 流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應的結果圖。
第30圖是表示由採集自檢體編號A24-S4或檢體編號A2-S5的樣品，與RMM胜肽呈現細胞共培養之後，用ELISPOT來解析所誘導出來的CTL的IFNγ生產能力的結果圖。
第31圖是表示由採集自檢體編號A24-S4的樣品，與RMM胜肽呈現細胞共培養之後，在將誘導出來的CTL進行單株化及增幅之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應的結果圖。
第32圖是表示由採集自檢體編號A2-S5的樣品，與RMM胜肽呈現細胞共培養之後，在將誘導出來的CTL進行單株化及增幅之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應的結果圖。
第33圖是表示HLA-A＊02：01限制性、BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽的折疊試驗的結果的圖表；該圖表是顯示由表示HLA-單體之峰值面積所推定出來的HLA-單體形成量。
第34圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與VLE胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第35圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與VLE胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階 段解析中，由於在第10行中檢測到CTL，故於第二階段解析中，是針對第10行進行解析。
第36圖是表示將採集自檢體編號A2-27的樣品，與VLE胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第37圖是表示將採集自檢體編號A2-27的樣品，與VLE胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階段解析中，由於在第3行中檢測到CTL，故於第二階段解析中，是針對第3行進行解析。
第38圖是表示將採集自檢體編號A2-34的樣品，與VLE胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第39圖是表示將採集自檢體編號A2-34的樣品，與VLE胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階段解析中，由於在第4行中檢測出CTL，故於第二階段解析中，是針對第4行進行解析。
第40圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與KLA胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第41圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與KLA胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於 第一階段解析中，由於在第2、5、11行中檢測到CTL，故於第二階段解析中，是針對第2、5、11行進行解析。
第42圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與VLT胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第43圖是表示將採集自檢體編號A2-29的樣品，與VLT胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階段解析中，由於在第7及9行中檢測到CTL，故於第二階段解析中，是針對第7及9行進行解析。
第44圖是表示使用KLA-Tet將KLA胜肽特異性CTL的機能進行機能解析的結果圖；在用KLA胜肽刺激時，可知KLA胜肽特異性地檢測出CD107a。
第45圖是表示使用VLT-Tet將VLT胜肽特異性CTL的機能進行機能解析的結果圖；在用VLT胜肽刺激時，可知VLT胜肽特異性地誘導出CD107a。
第46圖是表示HLA-A＊11：01限制性、BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽的折疊試驗的結果的圖表；該圖表是顯示出表示HLA單體之峰值面積。
第47圖是表示將採集自檢體編號＊11-13的樣品，與SVL胜肽、NTH胜肽、KQL胜肽、GLI胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第48圖是表示將採集自檢體編號＊11-13的樣品，與SVL胜肽、NTH胜肽、KQL胜肽、GLI胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階段解析中，由於在第1行中檢測到CTL，故於第二階段解析中，是針對第1行進行解析。
第49圖是將採集自檢體編號＊11-13的樣品，與SVL胜肽、NTH胜肽、KQL胜肽、GLI胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第三階段解析的結果圖；於第二階段解析中，由於在第1行的孔B中檢測到CTL，故於第三階段解析中，針對第1行的孔B進行解析。
第50圖是表示將採集自檢體編號＊11-13的樣品，與SLA胜肽、CSY胜肽、TVY胜肽、TVL胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第51圖是表示將採集自檢體編號＊11-13的樣品，與SLA胜肽、CSY胜肽、TVY胜肽、TVL胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階段解析中，由於在第12行中檢測出CTL，故於第二階段解析中，是針對第12行進行解析。
第52圖是表示將採集自檢體編號＊11-13的樣品，與SLA胜肽、CSY胜肽、TVY胜肽、TVL胜肽共培養之 後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第三階段解析的結果圖；於第二階段解析中，由於在第12行的孔E中檢測出CTL，故於第三階段解析中，是針對第12行的孔E進行解析。
第53圖是表示將採集自檢體編號＊11-16的樣品，與RMS胜肽、GTM胜肽、AAA胜肽、KLLF胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第一階段解析的結果圖。
第54圖是表示將採集自檢體編號＊11-16的樣品，與RMS胜肽、GTM胜肽、AAA胜肽、KLLF胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第二階段解析的結果圖；於第一階段解析中，由於在第7行和第11行中檢測出CTL，故於第二階段解析中，是針對第7和11行進行解析。
第55圖是表示將採集自檢體編號＊11-16的樣品，與RMS胜肽、GTM胜肽、AAA胜肽、KLLF胜肽共培養之後，用流式細胞分析儀來解析與HLA-四聚體試劑進行反應之第三階段解析的結果圖；於第二階段解析中，由於在第7行的孔E、第11行的孔H中檢測出CTL，故於第三階段解析中，是針對第7行的孔E、第11行的孔H進行解析。
第56圖是表示使用了293T細胞萃取液之西方點墨的結果，該細胞萃取液是使附加了Myc Tag的BORIS sf5及BORIS sf6各自短暫性地強制表現後之293T細胞萃 取液；不管使用哪一個特異抗體時，都和使用Myc Tag抗體時在相同的位置上能確認到條帶，故顯示出這些抗體的特異性。
第57圖是表示使用BORIS sf5的特異抗體，對肺癌組織切片進行免疫染色的結果；即使是相同的肺癌組織，也確認到BORIS sf5的表現為陽性者和陰性者；其中，(a)是表示陰性的，(b)是表示陽性的染色影像，且相對於在(b)到處可見被染色成褐色的細胞，在(a)幾乎看不到。
以下，針對本發明進行詳細地說明。
(1)本發明之聚胜肽
本發明中所謂的「抗原決定基胜肽」，是意味著與MHC(在人類中是HLA)結合，並在細胞表面上呈現抗原的聚胜肽。在抗原決定基胜肽中，包含了CTL抗原決定基胜肽，其與MHC第I型結合並受到抗原呈現，而被CD8陽性T細胞所辨識；及輔助細胞抗原決定基胜肽，其與MHC第II型結合並受到抗原呈現，而被CD4陽性T細胞所辨識。
抗原決定基胜肽之中，將腫瘤細胞中源自特異性或者過剩地表現的蛋白質之聚胜肽，特別稱為腫瘤抗原胜肽。所謂的抗原呈現，是存在於細胞內的聚胜肽與MHC結合，此MHC/抗原胜肽複合體在細胞表面上進行局部化的 現象稱之。如同上述，已知經呈現於細胞表面的抗原藉由T細胞等辨識後，會活化細胞性免疫或體液性免疫，由於受到MHC第I型所呈現的抗原，隨著活化細胞性免疫的同時，會被初始T細胞的T細胞受體所辨識，將初始T細胞，誘導至具有細胞毒殺活性的CTL，故作為用於免疫療法的腫瘤抗原胜肽，較佳為與MHC第I型結合，並受到抗原呈現的聚胜肽。
另一方面，被樹狀細胞等抗原呈現細胞攝取的抗原蛋白質，藉由與MHC第II型結合在抗原呈現細胞的表面上受到抗原呈現，而被CD4陽性T細胞所辨識，最後能夠誘導出會活化細胞性免疫或體液性免疫的輔助T細胞。由於輔助T細胞並不只是像CTL具有細胞毒殺活性，在CTL的活性維持、生存維持也擔任重要的角色，故作為用於免疫療法的腫瘤抗原胜肽，亦佳為與MHC第II型結合，並受到抗原呈現的聚胜肽。已知與MHC第I型結合的聚胜肽大約8~11個胺基酸長，與MHC第II型結合的聚胜肽大約12~20個胺基酸長。
本發明中，「腫瘤(tumor)」包含良性腫瘤及惡性腫瘤(癌、惡性贅生物(malignant neoplasm))。癌症(cancer)包含造血器官之腫瘤、上皮性之惡性腫瘤(癌，carcinoma)和非上皮性之惡性腫瘤(肉瘤，sarcoma)。
本發明中，單以「BORIS」稱呼的情況，是意味著印記位點調節物兄弟(Brother of the Regulator of Imprinted Sites)基因或其表現產物也就是mRNA或蛋白質的任一種。在BORIS基因的表現控制上，已知有3種啟動子(從上游的啟動子依序稱為啟動子A、啟動子B及啟動子C)參與其中，藉由透過任一個啟動子而轉錄是否受到控制來大致區分為3個同型異構物(對應各啟動子，分別稱為同型異構物A、同型異構物B及同型異構物C)。並且各個同型異構物因轉錄時所受到的剪接方式而進一步區別為複數的剪接變異體。藉此BORIS已知具有6個同型異構物A(A1~A6)、8個同型異構物B(B0~B7)、9個同型異構物C(C1~C9)之合計23個同型異構物。例如BORIS C1同型異構物，具有以序列編號76表示之序列。
如同上述，BORIS是亦被稱為11-鋅手指蛋白的CTCF的同種同源物，BORIS蛋白質，在11個鋅手指區域的N端側及C端側各自具有N端胜肽區域及C端胜肽區域的結構。N端胜肽區域，根據同型異構物存在著24個胺基酸長、53個胺基酸長及258個胺基酸長的產物，但相同長度者，其序列受到高度保留。C端胜肽區域，存在著各式各樣長度的產物，其序列也各自有所不同。BORIS，藉由該C端胜肽區域的序列分類成6個亞型(亞型1~6，於本說明書中有單以sf1~6來略稱的情況)。因此各亞型的C端序列，在各自的亞型中有特有的序列，屬於同一亞型的同型異構物間，受到高度保留。
本發明之聚胜肽，是表現特定的同型異構物或亞型之BORIS，具體而言，是表現出屬於同型異構物A或C、或者是亞型5或6的BORIS之細胞的細胞表面上，受到抗原呈現者。因此本發明之聚胜肽，是屬於同型異構物A或C、或者是亞型5或6的BORIS的部分胜肽，為8~20個胺基酸長，具有HLA結合能力的聚胜肽。在包含癌幹細胞的癌細胞中，表現這些BORIS的癌細胞為多數存在，因此本發明之聚胜肽，於癌的免疫療法中是有益的。
本發明之聚胜肽，於一態樣中，於BORIS sf6中特有的序列亦即以序列編號1或於BORIS sf5中特有的序列亦即以序列編號2表示之聚胜肽的部分胜肽，是包含MHC，特別是與HLA結合的胜肽，較佳為包含MHC，特別是藉由HLA受到抗原呈現的胜肽，更佳為包含MHC，特別是藉由HLA受到抗原呈現且能誘導CTL之胜肽的聚胜肽。HLA中雖然存在著數種型，但本發明之聚胜肽，較佳為能結合於HLA第I型，更佳為能結合於HLA-A24、HLA-A11或HLA-A02，再更佳為能結合於HLA-A02、HLA-A11及HLA-A24之中的2種以上HLA。於另一態樣中，能結合於HLA第II型的聚胜肽亦佳。
例如MHC是HLA第I型的情況，已知大部分藉著HLA第I型分子受到呈現的抗原，是被細胞質內的蛋白酶體分解後，往TAP(抗原加工相關性傳遞蛋白；transporter in antigen processing)移送，於粗 面內質網內和集合在TAP的HLA第I型分子與β 2-微球蛋白的複合體結合，經過高基氏體藉由胞吐作用往細胞表面搬運。因此，本發明之聚胜肽，亦可在結合於MHC之前經過加工等處理，生成像是該等處理的結果抗原決定基胜肽這樣的胜肽，亦包含在本發明之聚胜肽內。例如，藉著使在前述一連串的抗原呈現路徑上進行作用的伴護蛋白亦即HSP70和HSP90、或是gp96和視為目的之胜肽或蛋白質融合，由於能有效率地進行抗原呈現，故本發明之聚胜肽於其一態樣中，是與在抗原呈現路徑上進行作用的伴護蛋白融合。
又本發明之抗原決定基胜肽，亦可為經施以能易於導入至生物體內的各種修飾者。作為能易於導入至生物體內的各種修飾之例，可舉出HIV的PT(蛋白質轉導；Protein Transduction)結構域。HIV的PT結構域，是以Tat蛋白質的第49~57號胺基酸所構成的胜肽。藉由將這樣的修飾附加在視為目的之蛋白質或胜肽的N端及/或C端上，能夠易於將目的之蛋白質或胜肽導入到細胞內。
如同上述，由於本發明之聚胜肽亦可在結合於MHC之前經過加工等處理，故只要是包含抗原決定基胜肽之胺基酸序列的序列，胺基酸長度並沒有特別限定。然而，本發明之聚胜肽其本身較佳為抗原決定基胜肽，因此胺基酸長較佳為約8~20個胺基酸左右，更佳為約8~約11個胺基酸左右，再更佳為約8~10個胺基酸左右。
於一較佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號1表示之聚胜肽的部分胜肽，為8~11個胺基酸長，具有HLA結合能力的聚胜肽。
於另一較佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號2表示之聚胜肽的部分胜肽，為8~11個胺基酸長，具有HLA結合能力的聚胜肽。
聚胜肽是否有「具有HLA結合能力」，能夠使用於該技術領域中已知的方法簡單地調查。作為該方法，並不限定於此，例如可舉出就像於WO2010/50190號公報中記載，使用抗HLA的單株抗體，將表現在細胞表面上HLA的量(亦即與聚胜肽結合之HLA的量)作為螢光強度來進行觀察的HLA結合分析；於Kim et al.,Methods Mol Biol.2013；960：447-59等中記載的使用BIAcore surface plasmon resonance(SPR)的結合分析、於Shin et al.,PNAS,Nov 2007；104：19073-19078等中記載的利用iTopia(iTopia Epitope Discovery System Assay，Beckman coulter公司)的方法等，該方法是使用僅在固定於固相的HLA和聚胜肽結合時會特異性結合的HLA抗體來進行觀察。
探討了上述以序列編號1及序列編號2表示之聚胜肽的部分胜肽後的結果，作為抗原決定基候選胜肽，以序列編號3、序列編號4、序列編號5及序列編號72表示之聚胜肽，和以序列編號10表示之聚胜肽受到了鑑 定。因此於一更佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號3、序列編號4、序列編號5或序列編號72表示之聚胜肽。又，於另一更佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號10表示之聚胜肽。
於另一態樣中，本發明之聚胜肽，是屬於同型異構物A或C、或者是亞型5或6的BORIS的部分胜肽，其具有對HLA-A11抗原的結合能力。由於HLA-A11抗原是屬於HLA第I型的HLA，故本態樣之聚胜肽，較佳為具有約8~11個胺基酸長。
探討了上述具有抗HLA-A11抗原的結合能力之BORIS的部分胜肽後的結果，作為抗原決定基候選胜肽，以序列編號60~73表示之聚胜肽受到了鑑定。針對這些聚胜肽進一步反覆探討後的結果，於序列編號65、序列編號66、序列編號67及序列編號72之中，確認到高CTL誘導能力。因此於一更佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號65、序列編號66、序列編號67或序列編號72表示之聚胜肽。其中以序列編號72表示之聚胜肽，由於如同上述是BORIS sf6之特有序列(序列編號1)的部分聚胜肽，故又更佳。於另一又更佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號65、序列編號66或序列編號67表示之聚胜肽，這些是以序列編號76表示之聚胜肽的部分胜肽，尤其是也有存在於鋅手指區域的胜肽。以往BORIS的鋅手指區域，由於和已知在體細胞中廣泛表現的CTCF具有高度相同性，故一直認為難以得到BORIS 特異性腫瘤抗原胜肽。因此這次根據本案發明人等的研究，獲得了源自鋅手指區域之BORIS特異性腫瘤抗原胜肽是令人感到驚訝的。
於另一態樣中，本發明之聚胜肽，是屬於同型異構物A或C、或者是亞型5或6的BORIS的部分胜肽，其具有對HLA-A2抗原及/或HLA-A24抗原的結合能力。由於HLA-A2抗原及HLA-A24抗原是屬於HLA第I型的HLA，故本態樣之聚胜肽，較佳為具有約8~11個胺基酸長。
探討了上述具有對HLA-A2抗原及/或HLA-A24抗原的結合能力之BORIS的部分胜肽後的結果，作為抗原決定基候選胜肽，以序列編號3~16及47~57表示之聚胜肽受到了鑑定。針對這些聚胜肽進一步反覆探討後的結果，於序列編號3、序列編號4、序列編號5、序列編號10、序列編號47、序列編號48及序列編號57中，確認到顯示出適當的HLA結合能力。因此於一更佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號3、序列編號4、序列編號5、序列編號10、序列編號47、序列編號48及序列編號57表示之聚胜肽。其中以序列編號3、序列編號4及序列編號5表示之聚胜肽，由於如同上述是BORIS sf6之特有序列(序列編號1)的部分聚胜肽，故又更佳。又以序列編號10表示之聚胜肽，由於如同上述是BORIS sf5之特有序列(序列編號2)的部分聚胜肽，且具有與HLA-A2抗原及HLA-A24抗原兩者的結合 能力，故又更佳。於另一又更佳態樣中，本發明之聚胜肽，是以序列編號47、序列編號48及序列編號57表示之聚胜肽，這些也是以序列編號76表示之聚胜肽的部分胜肽。又，在這之中更佳為以序列編號47及序列編號57表示之聚胜肽。
其中，特佳的是，以序列編號4、序列編號5、序列編號10、序列編號47、序列編號48及序列編號57表示之聚胜肽。這些聚胜肽，根據本案發明人等的研究，確認到能夠誘導出特異性的細胞毒性T細胞(CTL)。
本態樣之聚胜肽之中，作為具有對HLA-A2抗原的結合能力之聚胜肽，雖然並不限定於此，但可舉出以序列編號4、序列編號5、序列編號10、序列編號47及序列編號57表示之聚胜肽等。
本態樣之聚胜肽之中，作為具有對HLA-A24抗原的結合能力之聚胜肽，雖然並不限定於此，但可舉出以序列編號3或序列編號10表示之聚胜肽等。
於另一態樣中，本發明之聚胜肽，是在上述聚胜肽中被加成、缺失、取代了1或複數個胺基酸的聚胜肽。理所當然，本態樣之聚胜肽，是被加成、缺失、取代了1或複數個胺基酸且具有HLA結合能力的聚胜肽。
HLA抗原，尤其是對HLA第I型抗原具有結合性的胜肽，已知在特定的位置上具有特定的胺基酸，該位置被稱為錨定模體(anchor motif)，即使將某錨定模體置換成別的錨定模體，認為並不會喪失HLA結合能力。因此 作為本發明之胜肽中的加成、缺失、取代，較佳是將錨定模體置換成別的錨定模體的加成、缺失、取代。例如在具有HLA-A11抗原結合性的聚胜肽中，已知多是自N端起第2個位置上配置Ile、Met、Ser、Thr或Val中的任一個，在第9個或者第10個位置上配置Lys或Arg中的任一個，作為上述較佳的加成、缺失、取代，例如可舉出將存在於自N端起第2個位置上的Ile取代為Met、Ser、Thr或Val。
亦即，作為本發明之較佳的加成、缺失、取代之例，可舉出：(a)HLA-A11抗原結合性胜肽中，將自N端起第2個位置的胜肽設為Ile、Met、Ser、Thr或Val者；(b)HLA-A11抗原結合性胜肽中，將自N端起第9個或者第10個的胜肽設為Lys或Arg者；(c)HLA-A24抗原結合性胜肽中，將自N端起第2個位置的胜肽設為Trp、Phe、Met或Tyr者；(d)HLA-A24抗原結合性胜肽中，將自N端起第9個或者第10個的胜肽設為Phe、Leu、Ile或Trp者；(e)HLA-A2抗原結合性胜肽中，將自N端起第2個位置的胜肽設為Ile、Val、Ala或Thr者；及/或(f)HLA-A2抗原結合性胜肽中，將自N端起第9個或者第10個的胜肽設為Val、Leu、Ile、Ala或Met者等。
關於本發明之聚胜肽的合成，能夠依照一般的胜肽化學中使用的習知之方法來進行。作為該習知之方 法，可舉出記載於文獻(Peptide Synthesis,Interscience,New York,1966；The Proteins,Vol 2,Academic Press Inc.,New York,1976；胜肽合成,丸善(股),1975；胜肽合成之基礎與實驗，丸善(股),1985；醫藥品之開發續第14卷‧胜肽合成,廣川書店,1991；這些文獻藉由引用而構成本申請案的一部分)等之方法。
本發明之聚胜肽，藉由提供給後述之CTL誘導方法或使用了人類模式動物的分析法(WO02/47474號公報，Int J.Cancer：100,565-570(2002))等，能夠確認在活體內(in vivo)的活性。
由於包含癌幹細胞的癌細胞，多數會表現同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS，故本發明之聚胜肽，如同本說明書所記載，能夠用在用來誘導出特異性辨識這些細胞的細胞毒性T細胞(CTL)。因此本發明之聚胜肽，有益於癌的預防及/或治療等，能夠作為醫藥組成物的有效成分。尤其是，因為由本案發明人等發現BORIS亞型之中sf5及/或sf6會在癌幹細胞中特異性表現，所以源自該亞型特有的胺基酸序列的本發明之聚胜肽，可特別適宜地用於用來處置癌幹細胞的醫藥組成物中。又，本發明之聚胜肽，亦可為用以癌的預防及/或治療者。並且，本發明亦關於在用以癌的預防及/或治療之醫藥的製造上本發明之聚胜肽的使用。
(2)本發明之聚核苷酸
本發明之聚核苷酸，是包含是編碼出前述本發明之聚胜肽的至少1種的聚核苷酸。本發明之聚核苷酸，可以是cDNA和mRNA、cRNA或合成DNA中的任一種。又可以是單股、雙股中的任一種形態。具體而言，例如可舉出能將由編碼出記載於序列編號3、序列編號4、序列編號5、序列編號10、序列編號47、序列編號48、序列編號57、序列編號65、序列編號66、序列編號67或序列編號72的胺基酸序列的核苷酸序列所構成的聚核苷酸，以各自表現的方式進行編碼的核苷酸序列所構成的聚核苷酸等。本發明之聚核苷酸，於一態樣中，是用在使用基因重組技術使本發明之聚胜肽用以在宿主內加以生產。這種情況，由於在宿主間胺基酸密碼的使用頻率不同，因此為了符合生產之宿主的使用頻率亦可變更胺基酸的密碼。
本發明之聚核苷酸，能取得單股及雙股的任一種形態。本發明之聚核苷酸為雙股的情況，藉由將前述本發明之聚核苷酸插入表現載體裡，能夠製作出用以表現本發明之聚胜肽的重組表現載體。亦即在本發明之聚核苷酸的範疇內，亦包含將本發明之雙股型聚核苷酸插入表現載體裡所製作成的重組表現載體。
本發明之聚核苷酸，如同本說明書中記載，有益於癌的預防及/或治療等，能夠作為醫藥組成物的有效成分。又，本發明之聚核苷酸，亦可為用於癌的預防及/或治療 者。並且，本發明亦關於在用以癌的預防及/或治療之醫藥的製造上本發明之聚核苷酸的使用。
在本發明所使用的表現載體，能夠取決於使用的宿主或目的等來使用各式各樣的載體，若是該發明所屬技術領域中具有通常知識者則能夠適當選擇。作為在本發明所能使用的表現載體，例如可舉出質體、噬菌體載體、病毒載體、黏質體載體、福斯質體(fosmid)載體、人造染色體載體(HAC、YAC、BAC、PAC)等。例如，宿主是大腸桿菌的情況，作為載體可舉出pUC118、pUC119、pBR322、pCR3、pGATA等質體載體；λ ZAPII、λ gt11等噬菌體載體。宿主是酵母的情況，作為載體，可舉出pYES2、pYEUra3、pYAC4等。在宿主是昆蟲細胞的情況中，可舉出pAcSGHisNT-A、pIEx、pBAC等。在宿主是動物細胞的情況中，可舉出pCEP4、pKCR、pCDM8、pGL2、pcDNA3.1、pRc/RSV、pRc/CMV等質體載體或反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、牛痘載體、仙台病毒載體、慢病毒載體等病毒載體等。
前述載體，亦可適當具有可誘導表現的啟動子、編碼出信號序列的基因、篩選用標記基因、終止子等因子。又，為了容易分離精製，作為與硫醇氧化還原蛋白、組胺酸標籤(His-tag)、或者GST(穀胱甘肽硫轉移酶)等融合的融合蛋白質亦可加成表現序列。這種情況，能夠使用具有在宿主細胞內運作之適當的啟動子(lac、tac、 trc、trp、CMV、SV40早期啟動子等)的GST融合蛋白質載體(pGEX4T等)，或具有Myc、His等標籤序列的載體(pcDNA3.1/Myc-His等)，還有表現與硫醇氧化還原蛋白及組胺酸標籤融合之融合蛋白質的載體(pET32a)等。
藉由利用於前述所製作而成的表現載體將宿主進行形質轉換，能夠製作出含有該表現載體的形質轉換細胞。作為在此使用的宿主，在不損及本發明之聚胜肽所具有之功能的範圍內可以使用任何的細胞，例如可舉出大腸桿菌、減毒化沙門氏桿菌等之細菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等。作為大腸桿菌，可舉出E.coli K-12系統之HB101株、C600株、JM109株、DH5α株、AD494(DE3)株、BL21株等。又作為酵母，可舉出Saccharomyces cerevisiae等。作為動物細胞，可舉出L929細胞、BALB/c3T3細胞、C127細胞、CHO細胞、COS細胞、Vero細胞、HeLa細胞、293-EBNA細胞等。作為昆蟲細胞可舉出sf9、Hi5、S2等。
作為導入表現載體給宿主細胞的方法，只要使用適合前述宿主細胞之一般導入方法即可。具體而言可舉出磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、電穿孔法、使用基因導入用脂質(Lipofectamine，Lipofectin；Gibco-BRL公司)之方法(脂質轉染法)等。導入後，藉由在包含篩選標記之一般培養基內培養，能夠篩選出前述表現載體被導入宿主細胞中的形質轉換細胞。
藉由在適當的條件下持續培養如以上所述進行而獲得之形質轉換細胞，能夠製作出本發明之聚胜肽。獲得之聚胜肽，可藉由一般生化學上的精製手段，進一步進行分離、精製。在此作為精製手段，可舉出鹽析、離子交換層析法、吸附層析法、親和性層析法、膠體過濾層析法等。又使本發明之聚胜肽，作為與前述之硫醇氧化還原蛋白或組胺酸標籤、GST等融合之融合蛋白質來表現時，可藉由利用這些融合蛋白質或標籤之性質的精製法來進行分離、精製。又，使用減毒化沙門氏桿菌等細菌作為宿主細胞的情況，是將該細菌當作基因傳遞載體來使用，亦即亦可將宿主細胞也就是細菌以直接送到對象的體內的方式來使用。
編碼出本發明之聚胜肽的聚核苷酸，可以是DNA的形態也可以是RNA的形態。這些本發明之聚核苷酸，根據本發明之聚胜肽的胺基酸序列資訊及藉此而被編碼出來的DNA序列資訊，能夠使用該技術領域中習知的通常方法而輕易製造出來。具體而言，能夠藉由一般的DNA合成或藉由PCR所實行的增幅等來製造。
編碼出本發明之聚胜肽的聚核苷酸，包含了編碼出前述抗原決定基胜肽的聚核苷酸。
(3)將本發明之聚胜肽作為有效成分之CTL誘導劑
本發明之聚胜肽如同上述，由於能夠用在誘導出抗癌細胞之CTL的方法中，故作為腫瘤抗原胜肽可成為CTL誘導劑。
亦即，藉由從人類血液試料分離出週邊血液淋巴球，在試管中(in vitro)添加本發明之聚胜肽進行刺激，能夠誘導出會特異性辨識經該胜肽沖擊(pulse)之HLA抗原陽性細胞的CTL(J.Immunol.,154,p2257,1995)。在此CTL之誘導的有無，能夠藉由下述方法來確認，例如，透過例如ELISA法等來測定CTL所生產的各種細胞介素(例如IFNγ)的量，該CTL是對抗原胜肽呈現細胞產生反應。又亦能夠藉由測定CTL對經使用51Cr來標記之抗原胜肽呈現細胞的毒殺性的方法(51Cr釋放分析法，Int.J.Cancer,58：p317,1994)來確認。
又，藉由Int.J.Cancer,39,390-396,1987,N.Eng.J.Med,333,1038-1044,1995等中記載之方法，也能夠建立CTL殖株。
藉由本發明之聚胜肽而被誘導出來的CTL，具有對將本發明之聚胜肽作為抗原來呈現之細胞的毒殺作用或淋巴素的生產能力。由於本發明之聚胜肽如同上述是腫瘤抗原胜肽，透過該等功能能夠發揮抗腫瘤作用，較佳為發揮抗癌作用。因此本發明之聚胜肽及藉此被誘導出來的CTL，能夠作為用以癌的預防及/或治療之醫藥或醫藥組成物的有效成分。
若將含有本發明之聚胜肽來作為有效成分之CTL誘導劑投予給癌症患者，在抗原呈現細胞的HLA抗原上呈現了本發明之聚胜肽，對HLA抗原和被呈現之胜肽的結合複合體具特異性的CTL進行增殖而能夠破壞癌細胞，其結果，能夠預防及/或治療癌症。因此，將本發明的聚胜肽作為有效成分之CTL誘導劑，較佳是能對HLA-A02抗原、HLA-A11抗原及/或HLA-A24抗原陽性之對象來使用。其中更佳是能對罹患了會表現同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS的癌的對象，再更佳是能對罹患了BORIS sf5及/或sf6陽性之癌的對象來使用。作為同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌，例如可舉出子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黑色素瘤等癌(腫瘤)等，本發明之CTL誘導劑，能夠為了這些癌的預防及/或治療而使用。能夠為了特別是子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌等在女性特有之臓器中的癌、及肺癌的預防及/或治療而較佳地使用。
在此癌的「預防」中，不只是預防患者罹患癌症，還包含已透過手術切除原發病灶之腫瘤的患者中藉由復發預防、手術、放射線療法或是藥物療法等之癌症治療來防止未完全去除之腫瘤的轉移等。又，在癌的「治療」中，不只是使癌縮小的癌之治癒、症狀改善，還包含抑制癌細胞之增殖、腫瘤的擴大或是源自原發病灶的癌細胞轉移的預防進展等。
將本發明的聚胜肽作為有效成分之CTL誘導劑，對於罹患了同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性，較佳為BORIS sf5及/或sf6陽性之癌的HLA-A02、HLA-A11或HLA-A24陽性的癌症患者特別有效。具體而言，能夠為了例如子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黑色素瘤等癌(腫瘤)的預防或治療而使用。能夠為了特別是子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌等在女性特有之臓器中的癌的預防及/或治療而較佳地使用。
作為將本發明的聚胜肽作為有效成分之CTL誘導劑的劑型，並沒有特別限定，但可舉出油乳化液(乳化製劑)、高分子奈米粒子、微脂粒製劑、結合於直徑為數μm之微珠的粒子狀製劑、使脂質結合的製劑、微球體製劑、微膠囊製劑等。
將本發明的聚胜肽作為有效成分之CTL誘導劑，為了使細胞性免疫有效地成立，能夠和作為醫藥可容許的攜帶體(carrier)，例如能夠和適當的佐劑混合來投予，或併用來投予。
作為佐劑，可應用該技術領域中習知的佐劑，具體而言，例如，作為凝膠式可舉出氫氧化鋁、磷酸鋁及磷酸鈣等；作為菌體式可舉出CpG、單磷醯脂質A(monophosphoryl lipid A；MPL)、霍亂毒素、大腸桿菌不耐熱腸毒素、百日咳毒素及胞壁醯二肽(Muramyl dipeptide；MDP)等；作為油乳化液式 (乳化製劑)可舉出弗氏不完全佐劑、MF59及SAF等；作為高分子奈米粒子式可舉出免疫刺激複合體(Immunostimulatory complex；ISCOMs)、微脂粒、生物分解性微球體(Biodegradable microsphere)及源自皂素的QS-21等；作為合成式可舉出非離子性嵌段共聚物、胞壁醯肽類似物(Muramyl peptide analogue)、聚磷腈及合成聚核苷酸等；作為細胞介素式，可舉出IFN-α、IFN-β、IFNγ、IL-2及IL-12等。
作為投予方法，可舉出皮內投予、皮下投予、肌肉內投予、靜脈內投予等習知的任意投予方法。製劑中的本發明之聚胜肽的投予量，可依照治療目的之疾病、患者的年齡、體重等來適當調整，但通常為0.0001mg~1000mg，較佳為0.001mg~1000mg，更佳為0.1mg~10mg，將此在數日至數月內投予1次為佳。
如同以上所述，藉由使用含有本發明的聚胜肽作為有效成分之CTL誘導劑，可有效地處置同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性的癌。因此，本發明於一態樣中，包含了含有該CTL誘導劑來作為有效成分之醫藥組成物，較佳為癌幹細胞處置用組成物，或者是癌的預防及/或治療用組成物。
(4)將本發明的聚核苷酸作為有效成分之CTL誘導劑
使本發明之聚核苷酸表現出來的細胞，由於變成了將本發明之聚胜肽作為抗原來呈現的細胞，故具有透過T細胞受體而被T細胞辨識出來這樣的特徵。因此，本發明之聚核苷酸亦可成為CTL的誘導劑。被誘導出來的CTL，和藉由本發明之聚胜肽而誘導出來的CTL相同，能透過細胞毒殺作用或淋巴素的產生來發揮抗腫瘤作用，較佳為抗癌作用。因此本發明之聚核苷酸，能夠作為用於癌的治療或預防的醫藥或醫藥組成物的有效成分。含有本發明之聚核苷酸作為有效成分的CTL誘導劑，例如，藉由將本發明之聚核苷酸投予至癌症患者使之表現，能治療及/或預防癌症。
例如若藉由以下的方法將被插入於表現載體中的本發明之聚核苷酸投予至癌症患者，在抗原呈現細胞內腫瘤抗原胜肽大量表現。之後，生成的腫瘤抗原胜肽和HLA-A02抗原、HLA-A11抗原或HLA-A24抗原等結合而形成複合體，藉由該複合體在抗原呈現細胞表面上受到高密度地呈現，癌特異性CTL在体內有效率地進行增殖，破壞癌細胞。如以上所述般進行，可達成癌的治療或預防。
將本發明之聚核苷酸作為有效成分的CTL誘導劑，較佳為能夠對HLA-A02抗原、HLA-A11抗原及/或HLA-A24抗原陽性之對象來使用。其中更佳為對罹患了表現出同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS的癌的對象，再更佳為對曾罹患BORIS sf5及/ 或sf6陽性的癌的對象來使用。作為同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性的癌，例如可舉出子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黑色素瘤等癌(腫瘤)等，本發明之CTL誘導劑，能夠為了這些癌的預防或治療而使用。能夠為了特別是子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌等在女性特有之臓器中的癌，及肺癌的預防及/或治療而較佳地使用。
作為藉由病毒載體而實施的方法，例如可舉出在反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、牛痘病毒、仙台病毒、慢病毒、痘病毒、小兒麻痺病毒、辛德畢斯病毒(sindbis virus)等DNA病毒或RNA病毒中插入本發明之DNA來導入的方法。在此之中，特佳為使用了反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、牛痘病毒等的方法。
作為其他的方法，可舉出將表現質體直接投予至肌肉內的方法(DNA疫苗法)、微脂粒法、陽離子脂質體(lipofectin)法、顯微注射法、磷酸鈣法、電穿孔法等，特佳為DNA疫苗法、微脂粒法。又，亦能夠使用細菌載體法，其是將表現質體導入到經減毒化的沙門氏桿菌等細菌中，投予該細菌使本發明之聚胜肽表現。
投予本發明之聚核苷酸時，可適當選擇依照治療目的之疾病、症狀等之適當的投予途徑及投予形態來進行投予。例如，能夠以可注射到靜脈、動脈、皮下、皮內、肌肉內等的形態來進行投予。進行投予時，例如，可取得液劑等之製劑形態，但一般而言可作為含有有效成分亦即 本發明之聚核苷酸的注射劑等，視其必要，亦可添加醫藥上可容許的攜帶體(載體)。又，在含有本發明之聚核苷酸的微脂粒或膜融合微脂粒(仙台病毒(HVJ)-微脂粒等)中，能夠作為懸浮劑、冷凍劑、離心分離濃縮冷凍劑等之微脂粒製劑的形態。
製劑中本發明之聚核苷酸的含量，能夠依照治療目的之疾病、患者的年齡、體重等來適當調整，但例如，作為聚核苷酸的含量是將0.0001mg~100mg，較佳為0.001mg~10mg的本發明之聚核苷酸，在數日至數月內投予1次。
只要是該發明所屬技術領域中具有通常知識者，就能適當選擇出合適的細胞、載體、投予方法、投予形態及投予量。
(5)本發明之抗原呈現細胞
前述的本發明之聚胜肽或聚核苷酸，於癌症患者的治療中，例如，能夠如以下所述在試管內(in vitro)使用。亦即藉由使本發明之聚胜肽或聚核苷酸中的任一者和具有抗原呈現能力之細胞進行接觸，就能夠製作出抗原呈現細胞。抗原呈現細胞的製作，雖然亦可在試管內(in vitro)進行亦可在活體內(in vivo)進行，但較佳為在試管內(in vitro)進行。具體而言，本發明是提供一種抗原呈現細胞及其製造方法，該抗原呈現細胞較佳是藉由使源自癌症患者經分離的具有抗原呈現能力之細胞，和本 發明之聚胜肽或聚核苷酸中的任一者，在試管內(in vitro)進行接觸，而在該細胞之細胞表面上，呈現出例如HLA-A02抗原或HLA-A11抗原、HLA-A24抗原等和本發明之聚胜肽的複合體。
在本發明之抗原呈現細胞中包含了，例如(1)在適當的培養液中，將抗原呈現細胞和CTL抗原決定基胜肽混合30分鐘到1小時而成的抗原決定基胜肽刺激抗原呈現細胞，(2)使用編碼出CTL抗原決定基胜肽的核酸，利用基因導入等在抗原呈現細胞上呈現出CTL抗原決定基胜肽的細胞，(3)人工製作而成的具有抗原呈現能力之人工抗原呈現細胞等。
在此所謂的「具有抗原呈現能力之細胞」，只要是將能呈現本發明之聚胜肽的MHC，較佳為HLA-A02抗原、HLA-A11抗原及/或HLA-A24抗原表現在細胞表面上的細胞則沒有特別限定，但此等之中，較佳為專職的抗原呈現細胞，特別是被視為抗原呈現能力高的樹狀細胞更佳。人工製作而成的具有抗原呈現能力之人工抗原呈現細胞，能藉由下述方法來製作，例如在脂質雙層或塑膠或者乳膠等珠粒上固定有HLA和CTL抗原決定基胜肽和β 2-微球蛋白之3者複合體，且固定了能刺激CTL的CD80、CD83和CD86等之共刺激分子，或者是固定了一種抗體等，其對和共刺激分子結合之T細胞方面的配位子亦即CD28起了競爭的作用。
又，作為用以由前述具有抗原呈現能力之細胞製備出本發明之抗原呈現細胞所添加的物質，本發明之聚胜肽或聚核苷酸中的任一者皆可。
本發明之抗原呈現細胞，例如，藉由從癌症患者分離出具有抗原呈現能力之細胞，將本發明之聚胜肽對該細胞在試管內(in vitro)進行刺激，使HLA-A02抗原、HLA-A11抗原及/或HLA-A24抗原和本發明之聚胜肽之複合體被呈現出來而得。使用樹狀細胞時，例如，藉由從癌症患者的週邊血液利用聚蔗糖(ficoll)法分離出淋巴球，之後除去非貼附型細胞，將貼附型細胞在GM-CSF及IL-4存在下進行培養來誘導樹狀細胞，將該樹狀細胞和本發明之聚胜肽一起培養來進行刺激等，而能夠製備出本發明之抗原呈現細胞。
又，藉由將本發明之聚核苷酸導入至前述具有抗原呈現能力之細胞裡，來製備本發明之抗原呈現細胞時，該聚核苷酸，可以是DNA的形態，也可以是RNA的形態。導入聚核苷酸來作成抗原呈現細胞的方法是在該技術領域中所知，該發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠適當選擇。
前述抗原呈現細胞能夠作為CTL誘導劑的有效成分。含有該抗原呈現細胞作為有效成分的CTL誘導劑，為了穩定地維持抗原呈現細胞，較佳為包含生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、培養基等。作為投予方法，可舉出靜脈內投予、皮下投予、皮內投予等。藉由 將含有這樣的抗原呈現細胞作為有效成分而成的CTL誘導劑回歸患者的體內，在罹患有同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌的患者的體內，對於將本發明之聚胜肽進行抗原呈現的癌細胞具特異性的CTL受到有效率地誘導，其結果是能夠治療將本發明之聚胜肽進行抗原呈現的同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌。
(6)本發明之細胞毒性T細胞(CTL)
本發明之聚胜肽及聚核苷酸，在癌症患者的治療中，能夠像以下所述來使用。亦即藉由使本發明之聚胜肽及聚核苷酸中的任一者與週邊血液淋巴球接觸，能夠誘導出CTL，特別是誘導出會特異性辨識表現出同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS基因的細胞的CTL。亦即本發明，是提供一種CTL及其誘導方法，該CTL是藉由使源自癌症患者的週邊血液淋巴球，和本發明之聚胜肽或聚核苷酸中的任一者進行接觸而誘導出來。該方法，可以在試管內(in vitro)進行亦可在活體內(in vivo)進行，但較佳為在試管內(in vitro)進行。
作為誘導本發明之CTL的方法，具體而言，例如可舉出下述之方法。首先利用本發明之聚胜肽直接刺激PBMC(週邊血液單核細胞；peripheral blood mononuclear cell)或者T細胞，或利用經該胜肽刺激過的抗原呈現細胞、經基因導入的抗原呈現細胞、或人工 製作而成之具有抗原呈現能力的人工抗原呈現細胞進行刺激。將藉由刺激而誘導出來的CTL在5%CO2恒溫槽內於37℃培養7~10日。將藉由CTL抗原決定基胜肽和IL-2，或藉由抗原呈現細胞和IL-2所實施的刺激透過一週重複1次來確保CTL的必要細胞數。
例如在黑色素瘤中，對於將患者本人的腫瘤內浸潤T細胞在體外進行大量培養，再將此細胞回歸患者的間接免疫治療法可看到治療效果。又在小鼠的黑色素瘤中，藉由將脾細胞在試管內(in vitro)透過腫瘤抗原胜肽TRP-2進行刺激，使對腫瘤抗原胜肽具特異性的CTL進行增殖，將該CTL投予至黑色素瘤移植小鼠，可看到轉移抑制。這是基於使會特異性辨識抗原呈現細胞之MHC和腫瘤抗原胜肽的複合體的CTL在試管內(in vitro)進行增殖的結果。因此，使用本發明之聚胜肽或聚核苷酸，在試管內(in vitro)刺激患者週邊血液淋巴球來增加腫瘤特異性CTL後，將此CTL回歸患者的治療法認為是有用的。
該CTL能夠作為癌的治療劑或預防劑的有效成分。該治療劑或預防劑，為了穩定地維持CTL，較佳為包含生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)、培養基等。作為投予方法，可舉出靜脈內投予、皮下投予、皮內投予等。藉由將含有這樣的CTL作為有效成分而成的癌的治療或預防劑回歸患者的體內，在罹患了本發明之同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌 的患者的體內藉由CTL所進行之癌細胞的毒殺作用受到促進，藉此破壞癌細胞，而能夠治療癌症。
(7)本發明之HLA-多聚體
所謂HLA-四聚體，是指藉由將HLA和β 2微球蛋白跟胜肽(抗原胜肽)集合而成的複合體(HLA-單體)進行生物素化，使之結合到卵白素上而成為四聚體化者(Science 279：2103-2106(1998)、Science 274：94-96(1996))，記載於例如美國專利第5,635,363號、法國專利申請案公開第FR9911133號、美國專利第5,723,584號、美國專利第5,874,239號、美國專利第5,932,433號、美國專利第6,265,552號、日本專利登記第4976294號等。而現在含有各種抗原胜肽的HLA-四聚體正被製作出來，含有本發明之聚胜肽和HLA-A02、HLA-A11或HLA-A24的HLA-四聚體能夠輕易地製作。又，HLA-二聚體及HLA-五聚體亦基於相同的原理，在這些多聚體中，前述HLA單體分別受到二聚體化及五聚體化。因此，含有本發明之聚胜肽，亦即具有同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS的HLA結合能力，尤其是具有HLA第I型結合能力的部分胜肽，和HLA-A02、HLA-A11或HLA-A24的HLA單體及HLA多聚體，特別是HLA-四聚體也是本發明之一態樣。
具體而言，例如可舉出含有本發明之聚胜肽和HLA-A02、HLA-A11或HLA-A24的HLA-四聚體。該HLA-四聚體，為了藉由流式細胞技術、螢光顯微鏡等習知的檢測手段而能夠輕易地選別或檢測出經結合之CTL較佳為接受螢光標記。具體而言，例如可舉出藉由藻紅素(PE)、螢光異硫氰酸鹽(FITC)、甲藻黃-素葉綠素-蛋白質(PerCP)等而被標記的HLA-四聚體。
作為HLA-四聚體的製法例，例如可舉出記載於美國專利編號5,635,363號、法國專利申請案編號FR9911133號、Science 279：2103-2106(1998)、Science 274：94-96(1996)等文獻者，只要是該發明所屬技術領域中具有通常知識者就能夠選出適切的方法。作為製作例，若簡單敘述就如同以下所述。
首先在可表現蛋白質的大腸桿菌或哺乳動物細胞中，導入HLA-A24、HLA-A11或HLA-A02的表現載體及β 2微球蛋白表現載體予以表現。在此，較佳為使用大腸桿菌(例如BL21)。將獲得之單體HLA-A24、HLA-A11或HLA-A02複合體和本發明之聚胜肽進行混合，形成了可溶性的HLA-胜肽複合體。其次藉由BirA酵素將HLA-胜肽複合體中的HLA-A02、HLA-A11或HLA-A24之C端部位的序列進行生物素化。藉由此經生物素化的HLA-胜肽複合體和經螢光標記的卵白素以4：1的莫耳比進行混合，能夠製備出HLA-四聚體。另外，在 前述各階段中，較佳為進行藉由膠體過濾等所實行的蛋白質精製。
藉由使用本發明之HLA-四聚體(或單體)，將可以檢測、精製本發明之腫瘤特異性CTL。作為生成CTL的方法，例如可舉出以下的方法。
(i)讓PBMC和適當濃度的本發明之HLA-四聚體進行反應。和本發明之HLA-四聚體結合的CTL因為藉由標記色素而被染色，使用細胞分選儀、顯微鏡等僅把被染色的CTL分離出來。經由這樣而被分離出來的CTL，經由抗CD3抗體、PHA、IL-2等之T細胞刺激藥劑，或X光照射或是絲裂黴素處理等且透過已損失了增殖能力的抗原呈現細胞進行刺激增殖，確保必要的細胞數。
(ii)將本發明之HLA-單體及/或四聚體進行固相化於無菌盤等，再將PBMC培養在固相化盤。為了分離出已結合到被固相化在盤上的本發明之HLA-單體及/或四聚體的CTL，在沖走未結合而浮游著的其他細胞後，將僅殘留在盤上的特異性CTL懸浮在新培養基中。經由這樣而被分離出來的CTL，經由抗CD3抗體、PHA、IL-2等之T細胞刺激藥劑，或X光照射或絲裂黴素處理等且透過已損失了增殖能力的抗原呈現細胞進行刺激增殖，確保必要的細胞數。
(iii)將本發明之HLA-單體及/或四聚體，和CD80、CD83、CD86等共刺激分子，或是和一種抗體等，其對和共刺激分子結合之T細胞方面的配位子亦即CD28起了 競爭的作用，進行固相化於無菌盤等，再將PBMC培養在固相化盤。2日後將IL-2添加到培養基裡，在5%CO2恒溫槽內於37℃培養7~10日。回收經培養的細胞繼續在新的固相化盤上培養。藉由重複此操作來確保CTL的必要細胞數。
又，藉由和抗細胞表面蛋白質之抗體(CD62L、CCR7或CD45RA等)組合來使用，能夠調查出CTL的分化階段(Seder RA,Ahmed R.,Nat Immunol.,2003；4：835-842)。或者，藉由和細胞內細胞介素染色法組合，也能用於CTL的機能性評估。因此只要鑑定CTL抗原決定基胜肽，並製作出HLA-四聚體，就能進行對於該抗原決定基胜肽而被誘導出來的CTL之定量和定性，且在獲得對於該抗原決定基胜肽的源頭蛋白質相關之疾病的診斷資訊上能成為巨大的貢獻。
(8)腫瘤的檢測方法(檢查方法、診斷方法)
本發明亦提供利用前述的本發明之HLA-四聚體的腫瘤的檢測方法(檢查方法、診斷方法)。
使用本發明之HLA-四聚體的本發明之檢測方法(診斷方法)，在典型上，是藉由採集受試者的血液，或是利用活體組織切片等來採集懷疑是腫瘤的受試組織的一部分，並透過本發明之HLA-四聚體來檢測、測定該檢體所含有之會辨識源自同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS的腫瘤抗原胜肽和HLA抗原的複合體的 CTL的量，來檢測、檢查或診斷出是否罹患子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌、乳癌、大腸癌、肺癌、黑色素瘤等同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌(腫瘤)或其程度。特別是能夠檢測、檢查或診斷出是否罹患子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌等在女性特有之臓器中的癌和肺癌或是其程度。
使用本發明之HLA-四聚體，能夠對CTL進行定量，該CTL是對由對象採集來的生物體試料中的BORIS，尤其是對同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS具特異性。定量，例如能夠如以下所述進行來實施。使由對象採集來的週邊血液或者PBMC，與適當濃度的HLA-四聚體進行反應。和HLA-四聚體結合的CTL由於藉由標記色素而被染色，故使用流式細胞分析儀、顯微鏡等進行計數。在和HLA-四聚體試劑進行反應時，藉由使用跟HLA-四聚體試劑不同之色素進行標記而成的抗CD3抗體、抗CD4抗體、抗CD8抗體等來進行反應，亦能夠同時判定BORIS特異性CTL的T細胞亞群。
本發明之檢測(檢查、診斷)方法，亦能夠檢測(檢查、診斷)例如在具有腫瘤的患者中，在用以改善該腫瘤而投予治療藥的情況中，該腫瘤是否有改善或其改善程度。並且本發明之檢測(檢查、診斷)方法，亦能夠利用在癌症患者的選拔，該癌症能夠有效地適用將本發明之聚胜肽或聚核苷酸作為有效成分的醫藥，或利用在藉由該醫藥而實施的治療效果之預測和判定等。
使用本發明之HLA-四聚體的本發明之檢測(檢查)方法的特定態樣，是包含下述(a)和(b)、及任意包含(c)的步驟：(a)讓由受試者獲得之生物體試料和本發明之HLA-四聚體進行接觸的步驟；(b)將上述HLA-四聚體所結合之細胞量作為指標來測定CTL量的步驟，該CTL會辨識源自該生物體試料中的BORIS sf5或sf6的腫瘤抗原胜肽和HLA抗原的複合體；(c)基於(b)的結果，判斷癌的罹患的步驟。
使用本發明之HLA-四聚體的本發明之診斷方法的特定態樣，包含上述(a)、(b)及(c)的步驟。
使用本發明之HLA-四聚體的本發明之檢測方法(檢查方法、診斷方法)的一態樣，是藉由檢測生物體試料中本發明之聚胜肽特異性CTL，且測定其量來實施。例如能夠藉由製作本發明之HLA-四聚體，並使用此HLA-四聚體，透過流式細胞分析儀將疑似罹癌之患者的週邊血液淋巴球中的抗原胜肽特異性CTL定量來進行。
腫瘤之有無的預測、判定、判斷或診斷，例如，能夠藉由測定受試者的血液或疑似腫瘤的受試組織中本發明之聚胜肽特異性CTL的量，或是測定呈現本發明之聚胜肽的細胞的量來進行。此時，能夠藉由根據情況將正常的對應組織中BORIS基因或者同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS的mRNA表現水準、本發明之 聚胜肽水準或CTL水準等作為基準值，將該基準值和由受試者獲得之試料中前述水準做比較，判定兩者的差異來進行。
在此受試者的受試組織和正常的對應組織之前述水準的比較，能夠藉由並行受試者的生物體試料和正常者的生物體試料作為對象之測定來進行而實施。在未進行並行的情況，能夠將使用複數(至少2個，較佳為3個以上，更佳為5個以上)的正常組織以相等的測定條件進行測定而獲得的本發明之聚胜肽特異性CTL量的平均值或統計中間值，作為正常者的值亦即基準值，而用來比較。
又，在被投予了本發明之聚胜肽或聚核苷酸的受試者中，藉由測定本發明之聚胜肽特異性CTL的量，也能判定實際上CTL是否有被誘導出來。例如，該受試者之組織中的本發明之聚胜肽特異性CTL的量，和正常者的該等水準做比較，例如將多2倍以上，較佳為多3倍以上的情況作為指標，能夠判定藉由本發明之聚胜肽或聚核苷酸所實施的治療是有效的。
(9)癌的預防及/或治療方法
本發明又關於一種預防及/或治療對象中的癌的方法，該方法包含將選自由本發明之聚胜肽、聚核苷酸、CTL、抗原呈現細胞所組成之群組的有效成分的有效量，投予到視該有效成分為必要之對象的步驟。
本發明中的「對象」，意味著任意的生物個體，較佳為動物，更佳為哺乳動物，再更佳為人類的個體。於本發明中，雖然對象可以是健康，也可以是罹患了某些疾病，但在謀求癌的預防及/或治療的情況中，典型上是意味著罹患了癌，或是有罹患的風險的對象。於本發明之一態樣中，對象是HLA-A02陽性、HLA-A11陽性及/或HLA-A24陽性。於本發明之一態樣中，對象是罹患了同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌，或是有罹患的風險。於本發明之一態樣中，對象是HLA-A02陽性、HLA-A11及/或HLA-A24陽性，且罹患了同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌，或是有罹患的風險。
作為用於本發明之預防/治療方法中的本發明之聚胜肽、聚核苷酸、CTL及抗原呈現細胞，可舉出本說明書所記載的任意者。所謂本發明中的有效量，是例如減輕癌的症狀、或者延遲或停止其惡化發展的量，較佳為抑制癌，或者治癒的量。又，較佳為不會產生不良影響的量，該不良影響會超過因投予所帶來之利益。該量能夠藉由使用了培養細胞等的試管內(in vitro)試驗，或小鼠、大鼠等模式動物中的試驗來適當決定，這樣的試驗法是該發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知。有效成分的具體用量，可考慮到關於視該有效成分為必要之對象的種種條件，例如症狀的嚴重度、對象的一般健康狀態、年齡、 體重、對象的性別、進食、投予的時機及頻率、併用的醫藥、對治療的反應性、劑型，及對治療的順從性等來決定。
作為具體用量，例如，在本發明之聚胜肽的情況，通常為0.0001mg~1000mg，較佳為0.001mg~1000mg，更佳為0.1mg~10mg，將此聚胜肽在數日到數月內投予1次為佳。又，在本發明之聚核苷酸的情況，通常為0.0001mg~100mg，較佳為0.001mg~10mg，將此聚核苷酸在數日到數月內投予1次為佳。又，作為投予方法，能夠使用皮內投予、皮下投予、肌肉內投予、靜脈內投予等習知之任意的適當投予方法。
本發明之預防/治療方法的一態樣，是在進行投予的步驟之前，進一步包含篩選出HLA-A02陽性、HLA-A11陽性及/或HLA-A24陽性的對象作為預防/治療的對象的步驟。本發明之此態樣，亦可在上述進行篩選的步驟之前，進一步包含決定對象之HLA型的步驟。對象之HLA型的決定，能藉由習知的任意手法來進行。又，本發明之預防/治療方法的一態樣，是在進行投予的步驟之前，進一步包含篩選出具有同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌的對象作為預防/治療的對象的步驟。本發明之此態樣，亦可在上述進行篩選的步驟之前，進一步包含檢測對象中的同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌的步驟。對象中的同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌的檢測，能夠使用上述(8)所記載之腫瘤的檢測 方法。本發明之預防/治療方法的一態樣，是在進行投予的步驟之前，進一步包含篩選出是HLA-A02陽性、HLA-A11陽性及/或HLA-A24陽性，且具有同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌的對象作為預防/治療的對象的步驟。本發明之此態樣，亦可在上述進行篩選的步驟之前，進一步包含決定對象之HLA型的步驟及檢測對象中的同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS陽性癌的步驟。
在本說明書中所提及的全部專利、申請案及其他出版物，是藉由參照其整體而援用於本說明書中。
(10)本發明之抗體
本發明又提供一種抗體，該抗體會特異性結合在同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS的至少一部分，較佳為以序列編號1、序列編號2或序列編號76表示之聚胜肽的至少一部分，更佳為以序列編號1或序列編號2表示之聚胜肽的至少一部分。因此本發明之抗體，較佳為能夠特異性辨識出屬於亞型5或6之BORIS。抗體，可以是多株抗體也可以是單株抗體，但較佳為單株抗體。
又，在本發明之抗體中亦包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、dsFv、Diabody及sc(Fv)2等抗體的機能性片段。又，這些機能性片段的多聚體(例如，二聚體、三聚體、四聚體、聚合體)，亦包含在本發明之抗體中。
關於本發明之抗體的製造，能夠依照該技術領域中習知的方法來進行。例如，能夠將以序列編號1或2表示之聚胜肽的全部或一部分作為免疫原對兔子等進行免疫，藉由從其血清進行精製來獲得抗體。
本發明之抗體，是能對同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS進行特異性結合的抗體，可以檢測會表現同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS的細胞，或檢測同型異構物A或C，或者是屬於亞型5或6之BORIS本身。因此在本發明之一態樣中，提供了包含本發明之抗體的BORIS蛋白質之檢測用套組及/或精製用套組。
本發明之套組，只要包含本發明之抗體則沒有特別限制，包含於該技術領域中已知的所有套組，雖然並不限定於此，但可舉出例如用於ELISA法、西方點墨法、色層分析法、免疫染色法等套組。
本發明之套組，除了本發明之抗體以外，亦可進一步包含1個或2個以上之適合於套組用途的任意構成零件，作為該構成零件，雖然並不限定於此，但可舉出例如亦可受到標記或未受到標記之二次抗體、發色試劑、溶劑、緩衝液、陽性控制、陰性控制、反應容器、前處理試劑、阻斷試劑、載玻片、蓋玻片、針對各用途的使用說明書等。
(10)其他
本發明，是基於在子宮頸癌或卵巢癌中具有幹細胞性之性質的細胞中，BORIS蛋白質，特別是BORIS sf5及/或sf6會高表現這樣的見解。因此，基於該見解各式各樣的技術被包含在本發明中。
本發明，於一態樣中，是關於會特異性辨識BORIS sf5或sf6的抗體。該抗體，為了辨識具有序列編號1或2所記載之胺基酸序列的聚胜肽或其一部分作為抗原決定基，能夠使用該技術領域中已知的方法來製作。藉由使用該抗體，能檢測例如特定之組織及/或細胞中的BORIS sf5及/或sf6的表現量，藉此，能判定組織或對象中的癌幹細胞或腫瘤是否存在。又，藉由使用該抗體來抑制影響癌幹細胞之幹細胞性的BORIS sf5及/或sf6的機能，能進行處置癌幹細胞、癌的預防及/或治療。
又，於本發明之另一態樣中，是關於具有和BORIS基因互補的序列的聚核苷酸。如同上述，認為BORIS基因，尤其是其特定的亞型於癌幹細胞中會特別強力表現，而影響幹細胞性。因此認為藉由妨礙BORIS基因的表現，能夠抑制癌幹細胞中的幹細胞性。因此於一較佳態樣中，本發明之聚核苷酸，能作為抑制性核酸，尤其是作為siRNA來使用。又，本發明之聚核苷酸，亦能夠作為用以檢測試料中BORIS sf5及/或sf6之DNA或mRNA的引子或探針來使用。
於本發明之又另一態樣中，是關於一種癌幹細胞之檢測方法，其包含檢測從對象獲得之試料中的BORIS sf5 及/或sf6的mRNA及/或聚胜肽的水準；及，將正常組織及/或細胞中的BORIS sf5及/或sf6的mRNA及/或聚胜肽的水準作為基準值，並將前述檢測出來之水準和前述基準做比較。作為檢測mRNA及/或聚胜肽的水準的方法，可使用該技術領域中已知的方法。作為檢測mRNA的水準的方法，例如可舉出RT-PCR、DNA微陣列、北方點墨等。在該檢測mRNA的水準的方法中，可使用上述BORIS sf5及/或sf6的引子及/或探針。作為檢測聚胜肽的水準的方法，例如可舉出免疫組織染色、西方點墨等。在該檢測聚胜肽的水準的方法中，可使用上述BORIS sf5及/或sf6的特異性抗體。
本發明，於另一態樣中，是關於一種對象中的腫瘤的檢測方法，其包含檢測從對象獲得之試料中的BORIS sf5及/或sf6的mRNA及/或聚胜肽的水準；及，將正常組織及/或細胞中的BORIS sf5及/或sf6的mRNA及/或聚胜肽的水準作為基準值，並將前述檢測出來之水準和前述基準做比較。作為檢測mRNA及/或聚胜肽的水準的方法，可使用該技術領域中已知的方法。作為檢測mRNA的水準的方法，例如可舉出RT-PCR、DNA微陣列、北方點墨等。在該檢測mRNA的水準的方法中，可使用上述BORIS sf5及/或sf6的引子及/或探針。作為檢測聚胜肽的水準的方法，例如可舉出免疫組織染色、西方點墨等。在該檢測聚胜肽的水準的方法中，可使用上述BORIS sf5及/或sf6的特異性抗體。在本發明中，本 態樣之腫瘤的檢測方法，能夠取代上述(8)之方法來進行。因此，亦可用於例如上述(9)中的癌的檢測步驟。
於本發明之又另一態樣中，是關於一種醫藥組成物，其用以處置癌幹細胞相關的癌，該癌是包含BORIS蛋白質或其同型異構物的部分胜肽，在女性特有之臓器中的癌。BORIS，在癌-睾丸抗原之中，特別是睪丸以外的組織中表現量少，另一方面，由本案發明人等所發現的見解，在子宮頸癌、卵巢癌、子宮癌等在女性特有之臓器中的癌，其中包含具有幹細胞性的細胞的癌中會強烈表現。因此，在女性特有之臓器中的癌的處置中，期待會發揮低副作用和高特異性等之特別優異的效果。
[實施例]
於以下表示實施例，來具體地說明本發明，但本發明並不限定於此等實施例。除非另有說明，否則實驗法是使用該技術領域中一般使用的方法，例如「免疫實驗操作法」(編輯：右田俊介、紺田進、本庶佑、濱岡利之)所記載之方法等。
又，以下之實施例中所使用的BORIS之同型異構物及亞型表示於以下之表中。除非有另外記載，否則記載著同型異構物名的情況是當作意味著特定的同型異構物，記載著亞型名的情況是當作意味著屬於亞型之同型異構物的任一種，單以「BORIS」記載的情況是當作意味著沒有特別指定同型異構物或亞型的一般BORIS基因的表現產物、或BORIS B0同型異構物。又，於以下之實施例 中，「胜肽名-Tet」是意味著和以胜肽名表示之胜肽結合成的HLA四聚體。
<實施例1>癌幹細胞之分離、鑑定 (1)球狀體形成細胞之分離
有報導指出，於子宮頸癌中，球體形成是作為癌幹細胞標記的指標之一。於是，進行了使用低附著性培養皿的球狀體形成分析法。使用具有超低附著性表面的多孔盤(Ultra Low Attachment 6-well plate，Corning公司製造)培養了各子宮頸癌細胞株(CaSki、TCS、MS751、SKG-IIIb、ME-180及SiHa)。細胞，是將經附著培養的細胞使用2mM之EDTA中添加0.25%之胰蛋白酶的溶液進行剝離，以在各孔中有103個/孔的方式進行播種。作為培養基，是使用在無血清DMEM/F-12培養基中添加20ng/ml之h-EGF(由R&D systems取得)、10ng/ml之b-FGF(由R&D systems取得)、1%之青黴素/鏈黴素(由GIBCO取得)、4μg/ml之肝素、及最終濃度1%之N2補充劑(N2 supplement)(由WAKO取得)者，以一般的培養條件培養7日或14日，在全部的細胞株中確認到100μm以上之球狀體的形成(第1圖)。在以下的試驗中，以「球體(sphere)」表示之細胞群，是意味著自藉由和本試驗相同的非附著培養所形成之球狀體分離出來的細胞群。又，以「塊狀(bulk)」表示之細胞群，是意味著藉由一般的附著培養而獲得之細胞群。
(2)球狀體形成細胞之性質
為了確認球狀體形成細胞是顯示出像幹細胞之性質的細胞，而進行輻射耐受性試驗、抗癌劑耐受性試驗、流式細胞技術分析，球體群跟塊狀群做比較後，更加確認是顯示出像幹細胞之性質的群。
(3)幹細胞性基因的表現解析
使用SOX2、NANOG及Oct3/4作為幹細胞性基因，針對CaSki和TCS細胞株的塊狀群及球體群中的前述各基因的表現量，利用定量性RT-PCR分別進行解析。PCR機器是使用STEPONE realtime PCR system(Applied Biosystems公司製造)，基因的表現是利用閥值循環數(threshold cycle number；Ct)來檢測，藉由ΔΔCt法將塊狀群中的幹細胞性基因的表現當作1時的相對表現量進行定量。SOX2、NANOG、Oct3/4的引子、探針混合物是使用了TaqMan gene expression(Applied Biosystems)。
結果顯示於第2圖。可知不管是在哪一個細胞株中，球體群的細胞中幹細胞性基因會高表現。這教示了，球體群裡顯示出像幹細胞之性質的癌細胞受到了濃縮。使用特別顯著地表現出幹細胞性基因的CaSki細胞株，進行下述cDNA微陣列解析。
(4)cDNA微陣列
為了針對與塊狀群相比在球體群中會高度表現的基因進行解析，而使用了cDNA微陣列。首先，使用市售的氨烯丙基(aminoallyl)RNA增幅套組ver2(高產率型)(Sigma Aldrich)，依照套組中附屬的說明書，由各細胞萃取出全RNA。將獲得之全RNA 3μg使用市售的寡聚dT T7啟動子引子及反轉錄酵素進行反轉錄，而合成了cDNA。其次使用T7RNA聚合酶來合成cRNA，同時引入了Cy3或Cy5標記三磷酸胞苷。藉由此程序，利用Cy5將球體群細胞的樣品進行標記。將塊狀群細胞的樣品作為控制細胞並利用Cy3進行標記。再次使用NanoDrop(Thermo Scientific公司)來確認cRNA的質。之後和Cy3標記cRNA及Cy5標記cRNA組合，在雜交混合物(hybridization cocktail)(Sigma Aldrich)中進行片段化。使經標記化的cRNA在60mer探針寡核苷酸微陣列(Panorama Human Micro Array，Sigma Aldrich)中進行雜交，於50℃培養20小時。使用Genepix 4000B Microarray Scanner(Axon Instruments公司)來決定螢光強度。利用相同之方法，利用Cy3將球體群細胞的樣品進行標記，利用Cy5將塊狀群細胞的樣品進行標記再次進行實驗(Dye Swap法)。
(5)癌幹細胞特異性抗原候選蛋白質之選定
在上述cDNA微陣列的結果中，將癌-睪丸抗原(CT抗原)作為對象，確認到球體群之中的表現。結果顯示於下表。
作為球體群中特異性表現的CT抗原，BORIS受到了鑑定。因此教示了BORIS是能成為對癌幹細胞有效的治療標的。
<實施例2>BORIS作為對癌幹細胞之治療標的之評估 (1)正常組織中的BORIS的表現解析
作為正常組織的cDNA基因庫，使用了Human Multiple Tissue cDNA Panels I and II(Clontech公司)。PCR是將包含0.1~0.5μl之cDNA、0.1μl之Taq DNA polymerase(Qiagen公司)及12pmol之引子的cDNA混合物，首先於94℃進行2分鐘的加溫後，接著進行30~40次循環，該循環是於94℃進行15秒的解離，於60℃進行30秒的黏合，於68℃進行30秒的延長的循環。引子是使用序列編號35及36。
結果顯示於第3圖。可知BORIS在正常組織中，除了在睪丸以外幾乎沒有表現。
(2)各子宮頸癌細胞株中的BORIS的表現解析
使用MS751、TCS、CaSki、SKG-IIIb、ME-180及SiHa作為子宮頸癌細胞株，使用和上述實施例1(4)同樣的方法由各細胞株的塊狀群及球體群採集cDNA，將各細胞株中的BORIS的表現量，利用與實施例1(3)同樣的方法，定量出將TCS細胞株的塊狀群中的表現當作1時的相對表現量。BORIS的引子、探針混合物是使用了 TaqMan gene expression(Applied Biosystems)。
結果顯示於第4圖。在半數以上的細胞株中，與塊狀群相比在球體群BORIS的表現量大幅增大。
(3)其他癌細胞株中的BORIS的表現解析
將作為子宮體癌細胞株之RL95-2及HEC-1-A，和作為卵巢癌細胞株之TOV-21G、ES-2、MCAS、Ovcar-3、SMOV-2及SKOV-3的塊狀群細胞中的BORIS的表現量，作為與(2)同樣地將TCS的塊狀群細胞中的表現量當作1的相對表現量來進行定量。
結果顯示於第5圖。BORIS不只在子宮頸癌，連在子宮體癌和卵巢癌中也顯示出高表現量。
(4)子宮頸癌細胞株中的BORIS之各亞型的同型異構物的表現解析
將子宮頸癌細胞株中的BORIS之各亞型的同型異構物的表現量，與(1)同樣地用RT-PCR進行了解析。使用下表的引子作為各亞型中特異性引子。
[表3]
結果顯示於第6圖。相對於在CaSki細胞株的塊狀群細胞中，在亞型(sf)1~4可見到顯著的表現，在球體群細胞中，塊狀群細胞中幾乎沒看到表現的sf6強烈地表現著。又，即使在MS751細胞株中，發現sf1及sf6在塊狀群細胞中沒觀察到但在球體群細胞中有觀察到表現。
(5)卵巢癌細胞株中的BORIS之各亞型變異體的表現解析
使用卵巢癌細胞株TOV21G及SMOV-2來取代子宮頸癌細胞株CaSki及MS751，進行與上述(4)同樣的實驗。結果顯示於第7圖。
和上述子宮頸癌細胞株的結果相同，即使在卵巢癌細胞株中，球體群細胞中觀察到BORIS sf6的特異性表現。又，在卵巢癌細胞株中，不論是哪個細胞株不僅是sf6連sf5的表現也相較於塊狀群細胞有顯著地上昇。
(6)肺癌細胞株及由肺癌患者手術切除片所建立之初代培養細胞中的BORIS之各亞型變異體的表現解析
使用來自小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺鱗狀上皮癌、肺腺癌的細胞株，及由肺癌患者手術切除片所建立之初代培養細胞，進行與上述(5)同樣的實驗。球狀體形成細胞，除了使用未添加N2補充劑及肝素的培養基以外，是使用與上述實施例1(1)相同的順序製備而成。結果顯示於第19-1圖、第19-2圖、第19-3圖、第19-4圖及第19-5圖。
<實施例3>針對BORIS sf6之探討 (1)BORIS同型異構物的過剩表現株之製作
使用pMXpuro載體及包含Plat-A細胞的Platinum反轉錄病毒表現系統，製作編碼出BORIS之sf1同型異構物也就是B0同型異構物、sf4同型異構物也就是B3同型異構物、sf6同型異構物也就是B6同型異構物及C7同型異構物的反轉錄病毒載體，並導入至TCS細胞株中製作成各別的BORIS同型異構物的過剩表現株。利用定量性PCR來確認BORIS同型異構物的表現量 時，和分別導入mock載體者做比較，確認到約1萬倍的表現。藉由同樣的方法，也製作出導入至SKG-IIIb細胞株中的過剩表現株。
(2)球體形成分析
利用與上述實施例1(1)相同的方法，播種1000個/孔之過剩表現TCS細胞株及過剩表現SKG-IIIb細胞株，藉由2週的培養進行球體形成分析。
結果顯示於第8圖及第9圖。不論在哪一個細胞株中，都在BORIS sf6，特別是BORIS B6同型異構物的大量表現株中確認到有意義的球體形成。
(3)候選BORIS sf6特異性HLA結合性抗原決定基之提取
和HLA第I型分子結合而受到抗原呈現的抗原決定基胜肽，是由8~10個的胺基酸所構成，從N端側起第2個，和第9或10個胺基酸是對於和HLA第I型分子結合最重要的胺基酸，稱為錨定模體。有報導指出，此錨定模體，會依各個HLA第I型分子的種類而有所不同。例如，世界上研究最先進之結合於HLA-A2分子的抗原決定基胜肽，最為知名的是由9~10個的胺基酸所構成的胜肽，其在自N端起第2個位置上具有白胺酸，在第9或10個位置上具有白胺酸或纈草胺酸。又，作為結合於HLA-A24分子的胜肽，最為知名的是由9~10個的胺基酸所構成的胜 肽，其自N端起第2個位置上具有酪胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸或色胺酸中的任一種，第9或10個位置上具有白胺酸、異白胺酸、色胺酸或苯丙胺酸中的任一種。
從BORIS sf6特異性的C端序列(序列編號1)，提取出具有上述HLA結合錨定模體結構的胜肽。提取出作為候選HLA-A2結合性胜肽的KLLFIGTIKV(KLL胜肽：序列編號4)及LLFIGTIKV(LLF胜肽：序列編號5)，和作為候選HLA-A24結合性胜肽的SFKKLLFIGTI(序列編號3)，藉由常法來合成。
(4)HLA-A2結合分析
將T2細胞於26℃培養一晚。之後用PBS將細胞洗淨，加入在(3)合成的KLL胜肽及LLF胜肽作為候選HLA-A2結合性胜肽、源自巨細胞病毒之胜肽也就是CMV胜肽(序列編號37)及源自流行性感冒病毒之胜肽也就是Influenza(序列編號38)作為正控制、和HLA-A24結合性胜肽也就是GK-12胜肽(序列編號39)作為負控制，於26℃進行3小時的共培養。將溫度設在37℃再進行3小時的共培養後，進行離心分離除去上清液，分離出細胞。對分離出來的細胞添加HLA-A2抗體，於4℃靜置1小時，之後用PBS洗淨。添加螢光標記抗小鼠IgG+IgM抗體作為2次抗體，於4℃靜置30分鐘後，加入1%甲醛將細胞固定住。將固定後的細胞，於流式細胞 分析儀(BECTON DIKINSON公司或Beckman Coulter公司)，測定FITC螢光強度。
結果顯示於第10圖。和KLL胜肽及LLF胜肽一起培養的T2細胞，不論何者都顯示出和CMV胜肽及Influenza胜肽相同程度的螢光強度，可知是使HLA-A2分子以相同程度局域於細胞表面上。此結果教示了任一個胜肽都和HLA-A2結合並於細胞表面受到抗原呈現。
(5)藉由聚胜肽刺激所實行的BORIS sf6特異性CTL之誘導
從已知保持著HLA-A＊02：01之健康的2名成人採集週邊血液，以3,000rpm進行5~10分鐘離心處理並回收上清液的血漿部分。從血漿部分以外，利用密度梯度離心法分離出PBMC。在96孔U底細胞培養用微量試驗盤(BECTON DIKINSON公司)的各孔中，加入10mL的培養基及約3×107個/盤在上述分離出來的PBMC，並使之懸浮進行培養，該培養基是在Hepes改變RPMI1640培養基(Sigma公司)中添加了2-巰基乙醇(最終濃度55μM)、L-麩胺酸(最終濃度2mM)、作為抗生素的鏈黴素(最終濃度100μg/mL)和青黴素G(最終濃度100U/mL)及5%的血漿成分。在此之中，以10μg/mL的濃度添加序列編號4或序列編號5的BORIS sf6特異性CTL抗原決定基候選胜肽。培養2日後，以50U/mL的最終濃度添加IL-2，再培養2週。
對於適量的上述培養細胞，添加10μL之PE標記HLA-四聚體試劑和20μL之CD8-FITC抗體，平穩地進行混合，於4℃靜置30分鐘。加入1.5mL之PBS並攪拌後，以3,000rpm離心分離5分鐘，吸取上清液並廢棄後，將細胞再次懸浮於400μL之PBS中，在24小時以內使用流式細胞分析儀進行分析。
解析是以2階段來進行。首先第1階段，是將96孔U底細胞培養用微量試驗盤之縱列的8孔分的細胞作為1個樣品而回收，確認此樣品中的BORIS特異性CTL之誘導的有無。針對在此階段確認到CTL誘導的樣品，進行第2階段的解析。第2階段，是從作為1個樣品的8孔個別地回收細胞，確認BORIS特異性CTL之誘導的有無。
利用流式細胞分析儀之分析結果的圖，是藉由點狀展開圖來表示，該點狀展開圖是以對數標度(log scale)顯示出X軸上對CD8、Y軸上對HLA-四聚體試劑的螢光強度。點狀展開圖中的數字，是在將展開圖四分割而成的區域表記為UL(左上)、UR(右上)、LL(左下)、LR(右下)時，表示(UR+LR)分之中UR的百分率，亦即CD8陽性的細胞之中，HLA-四聚體試劑陽性之細胞的比例。
第20圖是表示樣品的第一階段的分析結果，該樣品是採集自利用BORIS sf6特異性CTL抗原決定基候選胜肽之序列編號4將檢體編號A2-34之PBMC培養13日而成者。利用KLL-Tet確認序列編號4特異性CTL之誘導後，檢測出在檢體編號A2-34中顯著的CD8陽性KLL-Tet陽性的細胞集團是於第5行(lane)、第11行的UR中。這件事表示，序列編號4之胜肽是BORIS sf6特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A2-34的生物體內存在有BORIS特異性CTL。
第21圖是表示，在上述第一階段的分析中確認到CTL之誘導的第5行、第11行之第2階段的結果。在第5行的孔C、第11行的孔F，檢測出KLL胜肽(序列編號4)特異性CTL。這件事證明了，KLL胜肽是顯示出HLA-A＊02：01限制性的BORIS sf6特異性CTL抗原決定基胜肽。由於在96孔中的2孔檢測出KLL胜肽特異性CTL，故KLL胜肽特異性CTL在週邊血液PBMC中的存在比例是藉由以下的公式算出。
KLL胜肽特異性CTL之頻率=(HLA-四聚體試劑陽性孔數)/(實驗中使用的PBMC數×誘導前之CD8陽性率)=2/(3×107×0.16)=4.17×10-7
第22圖是表示樣品的第一階段的分析結果，該樣品是採集自利用BORIS sf6特異性CTL抗原決定基 候選胜肽之序列編號5將檢體編號A2-29之PBMC進行培養13日而成者。利用LLF-Tet確認序列編號5之特異性CTL之誘導後，檢測出在檢體編號A2-29中顯著的CD8陽性LLF-Tet陽性的細胞集團是於第1行、第2行、第4行、第5行、第6行、第7行、第8行、第9行、第10行及第11行的UR中。這件事表示，序列編號5之胜肽是BORIS sf6特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A2-29的生物體內存在有BOIRS sf6特異性CTL。
第23-1和-2圖是表示，在上述第一階段確認到CTL之誘導的第1行、第2行、第4行、第5行、第6行、第7行、第8行、第9行、第10行及第11行的第二階段的結果。在第1行的孔B、第2行的孔B和D和G和H、第4行的孔C和F和G、第5行的孔B和F和G、第6行的孔E和F、第7行的孔F、第8行的孔C和G、第9行的孔C、第10行的孔A、第11行的孔E，檢測出LLF胜肽(序列編號5)特異性CTL。這證明了，LLF胜肽是顯示出HLA-A＊02：01限制性的BORIS sf6特異性CTL抗原決定基胜肽。由於在96孔中的19孔檢測出LLF胜肽特異性CTL，故LLF胜肽特異性CTL在週邊血液PBMC中的存在比例是藉由以下的公式算出。
LLF胜肽特異性CTL之頻率=(HLA-四聚體試劑陽性孔數)/(實驗中使用的PBMC數×誘導前之CD8陽性率) =19/(3×107×0.17)=3.73×10-6
(6)藉由PHA母細胞刺激而實行的BORIS sf6特異性CTL之誘導
從已知保持著HLA-A＊02：01之健康的3名成人採集週邊血液50mL，進行離心處理並回收上清液的血漿部分。使用Lymphoprep(Axis-Shield PoC As公司)，從去除血漿後的血球部分分離出PBMC。分離出來的PBMC，懸浮於10mL之AIM-V培養基中，播種在細胞培養用培養皿，在37℃的CO2培養器之中，培養4小時。AIM-V培養基是意味著在Life Technologies公司的AIM-V裡，添加了最終濃度10mM之HEPES(Life Technologies公司)、最終濃度50μM之2-巰基乙醇(Life Technologies公司)的培養基。之後，僅回收懸浮細胞，使用MACS磁珠(Miltenyi Biotec公司)，使用磁性細胞分離法將CD8陽性細胞和陰性細胞分離出來。
CD8陰性細胞，懸浮於AIM-V培養基後，分注約4×105個/孔到48孔盤(Corning公司)裡，進行了培養。
於開始上述培養的同日裡，在一部分CD8陰性細胞的孔裡添加了最終濃度1μg/mL之PHA(植物血凝素；phytohemagglutinin，Wako公司)、最終濃度 100U/mL之IL-2(Life Technologies公司)。從培養開始第4日，於培養試管(BD公司)回收細胞，懸浮於10mL之AIM-V培養基，放入75cm2培養燒瓶(Nunc公司)裡。並且，添加了最終濃度100U/mL之IL-2(鹽野義公司)。從培養開始第8日，將細胞回收至培養試管(BD公司)裡，懸浮於1mL之AIM-V(Life Technologies公司)，添加了序列編號5的胜肽(最終濃度20μg/mL)。之後，於室溫放置1小時，進行100Gy的放射線照射處置，製備成PHA母細胞。
CD8陽性細胞的培養，是懸浮於在AIM-V培養基中添加了最終濃度10%之人類AB血清(LONZA Japan公司)的培養基裡後，分注約2×106個/孔到48孔盤(Corning公司)裡來進行。
從培養開始第8日，在各孔添加裡10ng之IL-7(R&D Systems公司)。並且，CD8陽性細胞和PHA母細胞是以5比1的方式混合，開始進行共培養。從培養開始第9日、第16日裡，再度開始PHA母細胞的製備，PHA母細胞的製備結束的第16日、第23日裡CD8陽性細胞和PHA母細胞以5比1的方式再度混合，合計進行3次藉由PHA母細胞而實行的刺激。培養開始第16日添加10U/mL之IL-2(鹽野義公司)，階段性地提高濃度，最終提高濃度到50U/mL為止，至第28日繼續進行培養。
將在這28日內培養的細胞集團，使用與上述(5)相同的方法利用PE標記HLA-四聚體試劑及 CD8-FITC抗體進行染色，確認樣品中的BORIS sf6特異性CTL之誘導的有無。
第24圖是表示分取自細胞集團的樣品的分析結果，該細胞集團是利用BORIS sf6特異性CTL抗原決定基候選胜肽之序列編號5將檢體編號A2-S1之PBMC進行培養28日而成。利用LLF-Tet確認序列編號5特異性CTL之誘導後，檢測出在檢體編號A2-S1中顯著的CD8陽性LLF-Tet陽性的細胞集團。這表示，LLF胜肽(序列編號5)之胜肽是顯示出HLA-A＊02：01限制性的BORIS sf6特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A2-S1的生物體內存在有BOIRS特異性CTL。
(7)LLF胜肽特異性CTL的機能解析
BOIRS特異性CTL的機能解析是使用ELISPOT Set(BD公司)套組來進行。首先，採集一部分將BORIS sf6特異性CTL誘導出來的細胞集團，製備成5×105個/mL。將此樣品以100μL/孔散布在抗IFNγ抗體被固相化之ELISPOST分析用盤裡，於37℃的CO2培養器之中，靜置30分鐘。在該盤裡，將T2細胞中經序列編號5之胜肽沖擊之細胞以成為5×104個/孔的方式添加，於37℃的CO2培養器之中，靜置一晚。洗淨後，添加生物素標記抗IFNγ抗體，於室溫反應2小時。清洗反應液，添加HRP標記鏈黴親和素進行反應。洗淨後，藉由添加 100μL/孔之發色劑，進行反應15~30分鐘，將CTL所分泌的IFNγ進行光點化來測定。
結果顯示於第25圖。和添加了負控制之源自HIV的胜肽(SLY胜肽)時，或未添加胜肽時(PBS)做比較，利用LLF胜肽(序列編號5)刺激時，明顯地檢測出較多IFNγ的光點。因此確認到，在添加LLF胜肽進行培養的PBMC中，藉由再刺激，生產出IFNγ之LLF胜肽(序列編號5)特異性CTL被誘導出來。
(8)CTL殖株之選別及培養
將在上述(7)確認到IFN γ的生產能力的BORIS sf6特異性CTL，和HLA-四聚體試劑利用抗CD8-FITC(MBL公司)抗體進行雙重染色，將與HLA-四聚體試劑及抗CD8-FITC抗體進行反應過的細胞利用流式細胞分析儀1次1個細胞播種到96孔盤(Corning公司)裡。培養此細胞的培養基，是使用在AIM-V培養基裡添加了最終濃度10%之人類AB血清(LONZA Japan公司)、最終濃度1%之青黴素/鏈黴素(Life Technologies公司)、最終濃度1%之GlutaMAX(Life Technologies公司)、最終濃度100U/mL之IL-2(鹽野義公司)、最終濃度5μg/mL之PHA(Wako公司)的培養基。在各孔裡添加了50000個從健康的供血者3人進行採血並分取而得之PBMC，該PBMC是經過100Gy之放射線照射處理的細胞。
又，利用流式細胞分析儀分離出來的細胞，觀察培養基的顏色並隨時進行一半量之培養基交換。並且，在細胞增加的階段，移置到48孔盤裡。
將經培養之CTL，使用與上述(5)相同的方法利用LLF-Tet及CD8-FITC抗體進行染色，並將確認到CTL之增幅的結果顯示於第26圖。其結果，檢測出顯著的CD8陽性LLF-Tet陽性之細胞集團。這表示，源自BORIS之LLF胜肽特異性的CTL的單株化及增幅已經成功了。
將經培養之CTL，以與上述(7)相同的順序進行處理，並將進行CTL的機能解析的結果顯示於第27圖。結果，和未添加胜肽時(-)做比較，在利用LLF胜肽刺激時，檢測出較多IFNγ的光點。故確認到，經培養之CTL，就是藉由LLF胜肽的再刺激的會生產IFNγ之LLF胜肽(序列編號5)特異性的CTL。
(9)LLF胜肽特異性CTL的機能解析
利用LDH killing分析法(TaKaRa Bio公司)來解析在(8)培養結束的LLF胜肽特異性CTL是否會攻擊呈現LLF胜肽之細胞。首先，製備出成為LLF胜肽特異性CTL的攻撃對象的標的細胞(Target)。準備了下述3種類的細胞：T2細胞中經序列編號5之LLF胜肽沖擊之細胞；作為其負控制，T2細胞中經源自HIV胜肽(SLY胜肽)沖擊之細胞；僅為T2細胞。標的細胞，是以每1×104個/ 孔散布在96孔V底盤(Corning公司)裡。LLF特異性CTL(Effector)，是製備成9×105個/mL、3×105個/mL、1×105個/mL之濃度的細胞懸浮液，以每1孔散布100μL，和散布於96孔盤的標的細胞混合。之後，將96孔盤以1800rpm離心10分鐘後，於37℃的CO2培養器之中靜置4小時到12小時。將96孔盤進行離心，使細胞沈澱後，將上清液100μL移到平底96孔盤。在各自的孔裡，添加100μL之包含黃遞酶(diaphorase)的反應液並於室溫靜置30分鐘，其後測定490nm的吸光度。藉由此操作，一般存在於細胞膜內的LDH，由於細胞在遭受傷害時因細胞膜的損傷而釋放到細胞外，故藉由測定培養液中的LDH量可評定細胞毒殺性。使用此方法，來探討LLF胜肽特異性CTL是否會辨識並攻擊呈現LLF胜肽之標的細胞。
其結果顯示於第28圖。在X軸是以E/T率來表示Effector和Target細胞的比例，Y軸是表示細胞毒殺性活性(%)。細胞毒殺活性，能夠依照其次表示的公式來算出。表示為：〔試料實測值(490nm中的吸光度：A490)-低控制(A490)〕/〔高控制(A490)-低控制(A490)〕×100。高控制(A490)是表示在Target細胞懸浮液中添加了2%之Triton X-100的測定值，低控制(A490)是表示僅有Target細胞的懸浮液的測定值。細胞毒殺性活性(%)值是以3試料的平均值來表示。
LLF胜肽特異性CTL，與將經負控制之源自HIV的胜肽(SLY胜肽)沖擊之T2細胞作為標的細胞時，或與將未添加胜肽之T2細胞作為標的細胞時做比較，在將經LLF胜肽沖擊之T2細胞作為標的細胞時顯示出高比例的細胞毒殺性活性。亦即會特異性辨識出呈現LLF胜肽(序列編號5)的癌細胞並發揮細胞毒殺性活性的情事變得明朗。
<實施例4>針對BORIS sf5之探討 (1)候選BORIS特異性HLA結合性抗原決定基之提取
與上述實施例3(3)同樣地，提取出BORIS特異性的候選HLA結合性抗原決定基。作為分析對象的BORIS，是使用BORIS B1同型異構物(亞型5)，其具有最長的胺基酸序列，且也是癌幹細胞中會特異性地表現的BORIS的候選者，提取出對於日本人中約60%所保持的HLA-A＊24：02具有結合性的抗原決定基的候選者，進行合成。合成的胜肽如以下所示。
[表4]
於表5中顯示合成的BORIS之HLA-A＊24：02結合性胜肽的特徵。是用從合成之胜肽的N端起3個或4個胺基酸序列作為胜肽名的簡碼來表示。從左開始，是表示胜肽名、胺基酸序列、BORIS同型異構物B1胺基酸序列上的位置、胺基酸數、以用於解析之BIMAS(BioInformatics & Molecular Analysis Section,http：//thr.cit.nih.gov/index.shtml)的HLA Peptide Binding Predictions(http：//thr.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/)所算出的得分。此得分是預測HLA-A＊24：02和胜肽的親和性的數值，分數越高，就意味著HLA和胜肽越有可能形成穩定的複合體。
[表5]
(2)BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽之折疊試驗
HLA-四聚體試劑製造的最初階段，是從將原料也就是HLA和β 2-微球蛋白和胜肽在試驗管內之適當的溶液中進行混合的折疊開始。在折疊溶液中，藉由此3種類的 原料的締合反應而形成3者複合體(HLA-單體)。此時，若HLA和胜肽的結合力越高，此締合反應會順利地進行，藉由利用膠體過濾管柱進行分析，能檢測3種類之原料的複合體(HLA-單體)。另一方面，HLA沒有和胜肽的結合力時，幾乎檢測不到HLA-單體。因此，藉由歷時地分析折疊溶液，或者藉由進行熱處理等，可驗證HLA和胜肽的結合性與穩定性。在本說明書中，將此試驗稱為「折疊試驗」。
使用上述合成的11種類的胜肽來實施折疊試驗。簡潔來說，將利用大腸桿菌表現系統而進行表現精製的HLA-A＊24：02(60mg/L)、β 2-微球蛋白(20mg/L)及BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽(30μM)添加到折疊溶液(1M之Tris-HCl、0.5M之EDTA、2M之精胺酸、5mM之GSH、0.5mM之GSSG及蛋白分解酶抑制劑)中(括弧內的濃度都是最終濃度)並混合後，歷時地分取折疊溶液，用膠體過濾管柱進行分析。使用了由9個胺基酸所構成的陽性控制胜肽(序列編號40)和由10個胺基酸所構成的陽性控制胜肽(序列編號41)、及各自的陰性控制(序列編號42及43)作為比較對象。
結果顯示於第11圖。在膠體過濾管柱分析的結果，HLA分子和β 2-微球蛋白，在利用大腸桿菌表現系統進行表現精製時，雖然用8M尿素可被溶化，但難溶性的HLA分子，未達HLA-單體形成者是作為凝集體在7~8分鐘被檢測出，其次HLA-單體的峰值在10分鐘前後 被檢測出，β 2-微球蛋白在14分鐘附近被檢測出。在15分鐘以後折疊溶液的成分或胜肽被檢測出。因此結果是將數值以柱狀圖來表示，該數值是將顯示形成HLA-單體的10分鐘前後之峰值的峰值面積換算成推定HLA-單體形成量(mg)的值。
(3)BORIS特異性HLA-四聚體試劑之製造
根據上述(2)之折疊試驗的結果，使用序列編號11以外之10種BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽和HLA-A＊24：02製造出PE標記HLA-四聚體試劑。於本說明書，雖然製造出來的HLA-四聚體試劑是以例如KYA-Tet等簡碼來表示，但這是表示使用HLA-A＊24：02和胜肽KYA(KYASVEASKL)和β 2-微球蛋白的3者複合體而製造出來者。簡潔來說，與上述(2)同樣地，將HLA-A＊24：02和β 2-微球蛋白及BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽添加到折疊溶液裡進行混合，使HLA-單體得以形成。在此，以在重組HLA-A＊24：02分子的C端側上加成生物素結合部位的方式設計出表現蛋白質，HLA-單體形成後，在該部位上加成了生物素。將經色素標記之鏈黴親和素及上述生物素化HLA-單體以莫耳比1：4進行混合，獲得HLA-四聚體試劑。
(4)BORIS特異性CTL之誘導
從已知保持著HLA-A＊24：02之健康的7名成人採集週邊血液，以3,000rpm進行5~10分鐘離心處理並回收上清液的血漿部分。從血漿部分以外，利用密度梯度離心法分離出PBMC。在96孔U底細胞培養用微量試驗盤(BECTON DIKINSON公司)的各孔中，加入10mL的培養基及約3×105個/孔在上述分離出來的PBMC，並使之懸浮進行培養，該培養基是在Hepes改變RPMI1640培養基(Sigma公司)中添加了2-巰基乙醇(最終濃度55μM)、L-麩胺酸(最終濃度2mM)、作為抗生素的鏈黴素(最終濃度100μg/mL)和青黴素G(最終濃度100U/mL)及5%的血漿成分。在此之中，以10μg/mL的濃度添加序列編號11以外之上述BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽。培養2日後，以50U/mL的最終濃度添加IL-2，再培養2週。
對於適量的上述培養細胞，添加10μL之PE標記HLA-四聚體試劑和20μL之CD8-FITC抗體，平穩地進行混合，於4℃靜置30分鐘。加入1.5mL之PBS並攪拌後，以3,000rpm離心分離5分鐘，吸取上清液並廢棄後，將細胞再次懸浮於400μL之PBS中，在24小時以內使用流式細胞分析儀進行解析。
解析是以2階段來進行。首先第1階段，是將96孔U底細胞培養用微量試驗盤之縱列的8孔分的細胞作為1個樣品而回收，確認此樣品中的BORIS特異性CTL之誘導的有無。針對在此階段確認到CTL誘導的樣品，進行第2 階段的解析。第2階段，是從作為1個樣品的8孔個別地回收細胞，確認BORIS特異性CTL之誘導的有無。
第12-1圖是表示樣品的第一階段的分析結果，該樣品是採集自利用BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽之序列編號10將檢體編號A24-38之PBMC培養13日而成者。圖是藉由點狀展開圖來表示，該點狀展開圖是以對數標度顯示出X軸上對CD8、Y軸上對HLA-四聚體試劑的螢光強度，點狀展開圖中的數字，是在將展開圖四分割而成的區域表記為UL(左上)、UR(右上)、LL(左下)、LR(右下)時，表示(UR+LR)分中UR的百分率，亦即CD8陽性的細胞之中，HLA-四聚體陽性之細胞的比例。利用RMM-Tet確認序列編號10的特異性CTL之誘導後，檢測出在檢體編號A24-38中顯著的CD8陽性RMM-Tet陽性的細胞集團是於第2行、第4行、第8行、第9行的UR中。這件事表示，序列編號10之胜肽是BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A24-38的生物體內存在有BORIS特異性CTL。
第12-2圖是表示第二階段的結果，該第二階段的結果是針對在第一階段確認到CTL之誘導的第2行、第4行、第8行、第9行的進一步解析結果。在第2行的H、第4行的G和H、第8行的F、第9行的A孔，檢測出RMM胜肽(序列編號10)特異性CTL。這件事證明了，RMM胜肽是顯示出HLA-A＊24：02限制性的BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽。由於在96孔中的5孔檢測出 RMM胜肽特異性CTL，故RMM胜肽特異性CTL在週邊血液PBMC中的存在比例是藉由以下的公式算出。
RMM胜肽特異性CTL之頻率=(HLA-四聚體試劑陽性孔數)/(實驗中使用的PBMC數×誘導前之CD8陽性率)=5/(3×107×0.18)=9.26×10-7
(5)抗原呈現細胞之製備
遵照Kuzushima et al.,Clin Exp Immunol.1996；103：192-198所記載之方法，建立了EBV(人類疱疹病毒第四型；Epstein-Barr virus)感染B細胞株(以下稱為EBV感染LCL(淋巴母細胞株；lymphoblastoid cell line))。簡潔來說，將EBV生產細胞株也就是B95-8細胞(由JCRB Cell Bank取得)的培養上清液(包含活EBV病毒)和PBMC進行混合培養而獲得EBV感染LCL。
(6)RMM胜肽特異性CTL的機能解析
將在(4)誘導出來的PBMC的1/2量移到96孔U底細胞培養用微量試驗盤，以最終濃度成為100ng/mL的方式添加RMM胜肽。再以最終濃度成為1μg/mL的方式添加布雷非德菌素A(Brefeldin A；BFA)，在5%CO2恒溫槽於37℃培養5~16小時。培養後，洗淨細胞，添 加PE(藻紅素)標記HLA-四聚體試劑和PC5(藻紅素-Cy5)標記CD8抗體(Beckman Coulter公司)，於室溫放置15~30分鐘。洗淨後，用4%甲醛，於4℃固定15分鐘後，用過量的洗淨液清洗。用0.1%皂素進行膜滲透處理後，添加FITC標記抗IFNγ抗體(MBL公司製造)，於室溫反應15~30分鐘。洗淨後，使用流式細胞分析儀，將T細胞中的IFNγ陽性細胞率或者HLA-四聚體試劑陽性細胞中的IFNγ陽性細胞率進行定量。
結果顯示於第13圖。只有在用RMM胜肽刺激時，於UR出現了IFNγ陽性HLA-四聚體試劑陽性細胞，而在未添加RMM胜肽時幾乎沒出現。由此可知，在用RMM胜肽刺激時，對RMM-Tet有特異性反應的CTL被誘導出來。根據此結果，以下的內容變得明朗，在添加RMM胜肽進行培養的PBMC中，藉由再刺激，會生產出IFNγ之具有細胞毒殺性活性的RMM胜肽特異性CTL被誘導出來，此細胞因為藉由HLA-四聚體試劑而被染色，所以就是對源自HLA-A＊24：02限制性BORIS之胜肽也就是RMM胜肽(序列編號10)特異性的CTL。
(7)BORIS sf5特異性CTL之誘導
除了在製備PHA母細胞時使用序列編號10之胜肽(RMM胜肽)以外，使用和實施例3(6)同樣的順序，從已知保持著HLA-A＊24：02或HLA-A＊02：01之健康的成人進行了BORIS sf5特異性的CTL之誘導。
將誘導出來的CTL，藉由和實施例3(5)相同的方法進行染色，確認樣品中的BORIS sf5特異性CTL之誘導的有無。
第29圖是將保持著HLA-A＊24：02的檢體編號A24-S4或保持著HLA-A＊02：01的檢體編號A2-S5之PBMC和RMM胜肽(序列編號10)呈現細胞進行共培養28日的細胞集團的分析結果。檢體編號A24-S4和A2-S5中的RMM胜肽特異性CTL誘導之有無的確認，是使用RMM胜肽，並使用對應各自的檢體所保有的HLA的型而製造出來的HLA四聚體試劑來進行解析。其結果，檢體編號A24-S4和A2-S5都有檢測出顯著的CD8陽性RMM-Tet陽性的細胞集團。這件事表示，序列編號10之胜肽是BORIS sf5特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A24-S4和A2-S5的生物體內存在有BOIRS特異性CTL。且知道了序列編號10之胜肽具有和HLA-A＊24：02及HLA-A＊02：01雙方之HLA型的結合性。
BOIRS特異性CTL的機能解析，是使用ELISPOT Set(BD公司)套組，以和實施例3(7)同樣的順序進行，將RMM胜肽特異性CTL所分泌之IFNγ進行光點化來測定。
第30圖是表示將光點數藉由柱狀圖來表示的結果。和添加了負控制之源自HIV的胜肽(在檢體A24-S4中是RYL胜肽，在檢體A2-S5中是SLY胜肽) 時，或和未添加胜肽時(PBS)做比較，在利用RMM胜肽刺激時，明顯地檢測出較多光點數。
(8)RMM胜肽之解析
RMM胜肽，是BORIS B1同型異構物之第670~678個的胺基酸。在此，由於已知BORIS B1是屬於BORIS之亞型5的由700個胺基酸所構成的同型異構物，BORIS sf5在C端側的132個胺基酸，尤其是C端側38個胺基酸(序列編號2)上具有亞型特異性序列，故RMM胜肽是對BORIS sf5特異性的序列，是能誘導出CTL的抗原決定基胜肽，該CTL亦能夠將根據本發明發現會特異性表現BORIS sf5之源自卵巢癌的癌幹細胞當作標的。
<實施例5>針對BORIS C1同型異構物之探討 (1)候選BORIS特異性HLA結合性抗原決定基之提取
作為分析對象的BORIS，是使用BORIS C1同型異構物(亞型1，序列編號76)，除了使用HLA-A＊02：01作為HLA型以外和實施例3(3)同樣地進行，提取出BORIS特異性的HLA結合性抗原決定基候選者。合成的胜肽如以下所示。
[表6]
表7顯示出合成的BORIS之HLA-A＊02：01結合性胜肽的特徵。是用從合成之胜肽的N端側起3到4個胺基酸序列作為胜肽名的簡碼來表示。從左開始，是表示胜肽名、胺基酸序列、BORIS C1同型異構物胺基酸序列上的位置、胺基酸數、以用於解析之SYFPEITHI(http：//www.syfpeithi.de/0-Home.htm)的EPITOPE PREDICTION(http：//www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)所算出的得分。此得分，是用HLA-A＊02：01分子和胜肽的結構模體來預測HLA和胜肽的親和性的數值，得分越高，就意味著HLA和胜肽越有可能形成穩定的複合體。
(2)BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽之折疊試驗
使用按照表7所合成的11種類的胜肽來實施折疊試驗。折疊試驗，除了使用HLA-A＊02：01作為HLA，使用上述表7所記載胜肽作為抗原決定基候選胜肽，對陽性控制胜肽是使用序列編號58之胜肽及對陰性控制是使用序列編號59之胜肽作為比較對象以外，使用和實施例4(2)相同的方法進行。
其結果顯示於第33圖。結果和實施例4(2)同樣地，是表示換算成推定HLA-單體形成量(mg)的值。其結果，序列編號55除外，從序列編號47到序列編號57之10種類的BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽中，和陰性控制相比可看到充分的HLA-單體形成。亦即，表示除了MAA胜肽以外，表7所登載的BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽，會和HLA-A＊02：01結合。
(3)BORIS特異性HLA-四聚體試劑之製造
根據(2)之折疊試驗的結果，序列編號55除外，除了使用從序列編號47到序列編號57之10種類的BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽和HLA-A＊02：01以外，和實施例4(3)以同樣的順序製造出PE標記HLA-四聚體試劑。
(4)BORIS特異性CTL之誘導
將已知保持著HLA-A＊02：01之健康的4名成人作為對象，序列編號55除外，除了使用從序列編號47到序列編號57之BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽以外，藉由和實施例3(5)相同的方法來進行CTL之誘導。
經CTL之誘導的細胞集團，藉由和實施例3(5)相同的方法來確認CTL之誘導的有無。CTL的染色，是使用HLA-四聚體試劑來進行，該HLA-四聚體試 劑是對應到在誘導時所使用的BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽。在以下表示，確認到CTL之誘導的代表性結果。
第34圖是表示檢體編號A2-29、第36圖是表示檢體編號A2-27、第38圖是表示檢體編號A2-34之樣品的第一階段的分析結果，該樣品是將採集自上述檢體的PBMC和BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽之序列編號47培養13日而成者。利用VLE-Tet確認序列編號47的特異性CTL之誘導後，檢測出顯著的CD8陽性VLE-Tet陽性的細胞集團在檢體編號A2-29是於第10行、在檢體編號A2-27是於第3行、在檢體編號A2-34是於第4行的UR中。這件事表示，序列編號47之胜肽是BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A2-29、檢體編號A2-27、檢體編號A2-34的生物體內存在有BOIRS特異性CTL。
第35圖、第37圖、第39圖是表示，在第一階段確認到CTL之誘導的行的第二階段的結果。於第35圖，是在第10行的孔H，於第37圖，是在第3行的孔E，於第39圖，是在第4行的孔C檢測出VLE胜肽(序列編號47)特異性CTL。這件事證明了，VLE胜肽是顯示出HLA-A＊02：01限制性的BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽。不論在哪一個檢體中，由於在96孔中的1孔檢測出VLE胜肽特異性CTL，故VLE胜肽特異性CTL在週邊血液PBMC中的存在比例是藉由以下的公式算出。
VLE胜肽特異性CTL之頻率=(HLA-四聚體試劑陽性孔數)/(實驗中使用的PBMC數×誘導前之CD8陽性率)=1/(3×107×0.18)=1.85×10-7
第40圖是表示樣品的第一階段的分析結果，該樣品是採集自將PBMC和BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽之序列編號48培養13日而成者，該PBMC則是採集自檢體編號A2-29。利用KLA-Tet確認序列編號48之特異性CTL之誘導後，檢測出顯著的CD8陽性KLA-Tet陽性的細胞集團是在檢體編號A2-29中的第2行、第5行、第11行的UR中。這件事表示，序列編號48之胜肽是BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A2-29的生物體內存在有BOIRS特異性CTL。
第41圖是表示，在第一階段確認到CTL之誘導的行的第二階段的結果。於第41圖，是在第2行的孔H、第5行的孔D、第11行的孔F檢測出KLA胜肽(序列編號48)特異性CTL。這證明了，KLA胜肽是顯示出HLA-A＊02：01限制性的BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽。由於在96孔中的3孔檢測出KLA胜肽特異性CTL，故KLA胜肽特異性CTL在週邊血液PBMC中的存在比例是藉由以下的公式算出。
KLA胜肽特異性CTL之頻率=(HLA-四聚體試劑陽性孔數)/(實驗中使用的PBMC 數×誘導前之CD8陽性率)=3/(3×107×0.19)=5.26×10-7
第42圖是表示樣品的第一階段的分析結果，該樣品是採集自將PBMC和BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽之序列編號57培養13日而成者，該PBMC則是採集自檢體編號A2-29。利用VLT-Tet確認序列編號57之特異性CTL之誘導後，檢測出顯著的CD8陽性VLT-Tet陽性的細胞集團是在檢體編號A2-29中的第7行、第9行的UR中。這件事表示，序列編號57之胜肽是BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽，在檢體編號A2-29的生物體內存在有BOIRS特異性CTL。
第43圖是表示，在第一階段確認到CTL之誘導的行的第二階段的結果。於第43圖，是在第7行的孔A、第9行的孔G檢測出VLT胜肽(序列編號57)特異性CTL。這證明了，VLT胜肽是顯示出HLA-A＊02：01限制性的BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽。由於在96孔中的2孔檢測出VLT胜肽特異性CTL，故VLT胜肽特異性CTL在週邊血液PBMC中的存在比例是藉由以下的公式算出。
VLT胜肽特異性CTL之頻率=(HLA-四聚體試劑陽性孔數)/(實驗中使用的PBMC數×誘導前之CD8陽性率) =2/(3×107×0.19)=3.51×10-7
(5)胜肽特異性CTL的機能解析
將包含由檢體A2-29所誘導出來的KLA胜肽特異性CTL的PBMC，或包含由檢體A2-29所誘導出來的VLT胜肽特異性CTL的PBMC，在96孔U底細胞培養用微量試驗盤裡，以成為約3×106個的方式各分移成2孔。在包含KLA胜肽特異性CTL的PBMC中是添加KLA胜肽，在包含VLE胜肽特異性CTL的PBMC中是添加VLE胜肽，以成為最終濃度100ng/mL的方式添加到2孔之中的1孔，另1孔準備作為未處理之孔。並且，將抗CD107a-FITC標記抗體和孟寧素(monensin)一起添加到胜肽添加孔、未處理孔，在37℃的CO2培養器之中，培養4小時。培養後，將細胞洗淨，添加對應到各自的胜肽的PE標記HLA-四聚體試劑和PC5(藻紅素-Cy5)標記抗CD8抗體(Beckman Coulter公司)，於室溫放置15~30分鐘。以過量的洗淨液清洗，使用流式細胞分析儀，檢測CTL的去顆粒標記也就是CD107a來算出陽性細胞率。已知CTL在釋放穿孔素(perforin)、顆粒酶(granzyme)等細胞毒殺性因子時，會將存在於細胞內顆粒內膜的CD107a表現在細胞膜上，藉由檢測CD107a分子，能夠間接地調查出細胞毒殺因子的釋放。
結果顯示於第44圖、第45圖。於第44圖，只有在用KLA胜肽刺激時，於UR出現了CD107a陽性HLA-四聚體試劑陽性細胞，而在未添加KLA胜肽時幾乎沒出現。由此可知，在用KLA胜肽刺激時，對KLA-Tet有特異性反應的CTL被誘導出來。又，於第45圖，只有在用VLT胜肽刺激時，於UR出現了CD107a陽性HLA-四聚體試劑陽性細胞，而在未添加VLT胜肽時幾乎沒出現。由此可知，在用VLT胜肽刺激時，對VLT-Tet有特異性反應的CTL被誘導出來。根據此結果，可知在添加KLA胜肽進行培養的PBMC中，或在添加VLT胜肽進行培養的PBMC中，藉由再刺激而生產出顆粒酶或穿孔素之具有細胞毒殺性活性的CTL被誘導出來。又，此CTL因為藉由HLA-四聚體試劑而被染色，所以證明了就是對源自HLA-A＊02：01結合性BORIS C1之胜肽也就是KLA胜肽(序列編號48)或VLT胜肽(序列編號57)特異性的CTL。
HLA-A＊02：01限制性BORIS特異性CTL之誘導的探討結果，整理顯示於表8。
[表8]
(6)候選BORIS特異性HLA-A＊11：01結合性抗原決定基之提取
和上述實施例3(3)同樣地，提取出候選BORIS特異性的HLA結合性抗原決定基。惟，只有在一點上不同，提取出的候選抗原決定基是對包含日本人在內的東南亞顯示出第3名之保有率的HLA-A＊11：01具有結合性。將提取出的候選抗原決定基之胜肽序列進行合成，其序列顯示於表9-1，控制胜肽顯示於表9-2。
表9-1表示合成之候選BORIS特異性HLA-A＊11：01結合性抗原決定基的特徵。結合於HLA-A11的胜肽，已知自N端起第2個位置上大多配置了Ile、Met、Ser、Thr或Val的任一種，在第9個或者第10個位置上大多配置了Lys或Arg的任一種。又，該胜肽的長度，充分瞭解是由9到10個胺基酸所構成(參照Rapin N et al.,Curr Protoc Immunol.2010；Chapter 18：Unit 18.17)。是用從合成之胜肽的N端側起3到4個胺基酸序列作為胜肽名的簡碼來表示。從左開始，是表示胜肽名、胺基酸序列、屬於sf5之BORIS B1同型異構物及/或屬於sf6之C7/C9同型異構物之胺基酸序列上的位置、胺基酸數、以用於解析之NetMHC3.4(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)的HLA Peptide Binding Predictions所算出的得分(Nielsen et al.,Protein Sci.2003；12：1007-1017，Lundegaard et al.,Nucleic Acids Res.2008；36(Web Server issue)：W509-512，Lundegaard et al.,Bioinformatics.2008；24：1397-1398參照)。此得分，是預測HLA-A＊11：01和胜肽的親和性的數值，得分越高，就意味著HLA和胜肽越有可能形成穩定的複合體。另外於表9-1、9-2所示之NetMHC 3.4的得分， 是表示作為在用於分析之11種類的分析軟體所獲得之代表例。
(7)BORIS特異性HLA-A＊11：01限制性CTL抗原決定基候選胜肽之折疊試驗
使用按照表9-1所合成的13種類的胜肽來實施折疊試驗。折疊試驗，除了使用HLA-A＊11：01作為HLA、使用表9-1所記載胜肽作為抗原決定基胜肽，對陽性控制胜肽是使用序列編號73之胜肽及對陰性控制是使用序列編號40之胜肽作為比較對象以外，使用和實施例4(2)相同的方法進行。
對15種類之胜肽所實施的折疊試驗之1、3、7日後的分析結果顯示於第46圖。作為陽性控制胜肽，是使用源自CMV之pp65蛋白質的HLA-A＊11：01限制性胜肽(ATV胜肽，序列編號73)，作為陰性控制，是使用源自survivin-2B的HLA-A＊24：02限制性胜肽(AYA胜肽，序列編號40)作為比較對象。將表示HLA-單體形成之峰值的面積以柱狀圖來表示。其結果，BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽(從序列編號60到序列編號72)，和陰性控制做比較，可看到充分的HLA-單體形成。亦即，表示表9-1所登載之BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽，會和HLA-A＊11：01結合。
(8)BORIS特異性HLA-A＊11：01限制性HLA-四聚體試劑之製造
根據(7)之折疊試驗的結果，用和實施例4(3)相同的順序製造出PE標記HLA-四聚體試劑。惟，是使用從序列編號60到序列編號72之13種類的BORIS特異性CTL抗原決定基候選胜肽作為抗原決定基胜肽，使用HLA-A＊11：01作為HLA。其結果，在序列編號68未能製造出HLA-四聚體試劑。因此除去序列編號68，製造出了具有從序列編號60到序列編號72之CTL抗原決定基候選胜肽和HLA-A＊11：01的12種類的HLA-四聚體試劑。
(9)BORIS特異性CTL之誘導
將已知保持著HLA-A＊11：01之健康的2名成人作為對象，藉由和實施例3(5)相同的順序來進行CTL之誘導。惟，作為抗原決定基胜肽，是使用了將每4種類之候選HLA-A＊11：01限制性CTL抗原決定基混合而成的4種類混合胜肽1(序列編號60、序列編號63、序列編號66及序列編號70)，或是4種類混合胜肽2(序列編號61、序列編號64、序列編號67及序列編號71)，或是4種類混合胜肽3(序列編號62、序列編號65、序列編號69及序列編號72)。
經測試CTL之誘導的細胞集團的解析是以3階段來進行。首先第1階段，是將96孔U底細胞培養用微 量試驗盤之縱列的8孔分的細胞當作1樣品來回收。利用對應到在誘導此樣品時所使用的4種類混合胜肽的HLA-四聚體混合試劑1(SVL-Tet、NTH-Tet、KQL-Tet及GLI-Tet)，或是HLA-四聚體混合試劑2(SLA-Tet、CSY-Tet、TVY-Tet及TVL-Tet)，或是HLA-四聚體混合試劑3(RMS-Tet、GTM-Tet、AAA-Tet及KLLF-Tet)，藉由和實施例3(5)相同的順序進行染色，確認BORIS特異性CTL之誘導的有無。針對在此階段確認到CTL之誘導的樣品，進行第2階段的解析。第2階段，是從當作1樣品的8孔個別地回收細胞，將此樣品利用HLA-四聚體混合試劑1、2或3進行染色，確認BORIS特異性CTL之誘導的有無。第3階段，是在第2階段確認到CTL之誘導的孔的細胞，到底是和HLA-四聚體混合試劑中的哪一個HLA-四聚體試劑進行反應，分別使用HLA-四聚體試劑實施CTL的檢測。使用此方法，確認到在96孔U底細胞培養用微量試驗盤之何處的孔裡，對哪個胜肽具有特異性的CTL被誘導出來。
第47圖，是第1階段的解析結果。表示樣品之第一階段的分析結果，該樣品是採集自將檢體編號＊11-13之PBMC和4種類混合胜肽1培養14日而成者。利用HLA-四聚體混合試劑1並藉由和實施例3(5)相同的順序進行染色後，檢測出顯著的CD8陽性HLA-四聚體混合試劑1陽性之細胞集團是於第1行的UR中。此結果表示，在用於探討的候選BORIS特異性CTL抗原決定基之 中，至少存在著1種類的CTL抗原決定基，又，在檢體編號A＊11-13的生物體內存在著BORIS特異性CTL。
第48圖，是表示在第一階段的解析確認到CTL之誘導的第1行的第二階段解析結果。在第1行的孔B(1-B)，確認到對HLA-A＊11：01結合性BORIS特異性CTL抗原決定基有特異性的CTL之誘導。
第49圖，是表示在第二階段的解析確認到CTL之誘導的第1行的孔B的第三階段解析結果。結果，僅在用KQL-Tet進行染色的情況下確認到CTL。這證明了，KQL胜肽(序列編號66)是HLA-A＊11：01限制性BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽。
第50圖，是第1階段的解析結果。表示樣品之第一階段的分析結果，該樣品是採集自將檢體編號＊11-13之PBMC和4種類混合胜肽2培養14日而成者。利用HLA-四聚體混合試劑2並藉由和實施例3(5)相同的順序進行染色後，檢測出顯著的CD8陽性HLA-四聚體混合試劑2陽性之細胞集團是於第12行的UR中。此結果表示，在用於探討的候選BORIS特異性CTL抗原決定基之中，至少存在著1種類的CTL抗原決定基，又，在檢體編號A＊11-13的生物體內存在著BORIS特異性CTL。
第51圖，是表示在第一階段的解析確認到CTL之誘導的第12行的第二階段解析結果。在第12行的孔E(12-E)，確認到對HLA-A＊11：01結合性BORIS特異性CTL抗原決定基有特異性的CTL之誘導。
第52圖，是表示在第二階段的解析確認到CTL之誘導的第12行的孔E的第三階段解析結果。僅在用TVY-Tet進行染色的情況下確認到CTL。這證明了，TVY胜肽(序列編號67)是HLA-A＊11：01限制性BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽。
第53圖，是第1階段的解析結果。表示樣品之第一階段的分析結果，該樣品是採集自將檢體編號＊11-16之PBMC和4種類混合胜肽3培養14日而成者。利用HLA-四聚體混合試劑3並藉由和實施例3(5)相同的順序進行染色後，檢測出顯著的CD8陽性HLA-四聚體混合試劑3陽性之細胞集團是於第7行和第11行的UR中。此結果表示，在用於探討的候選BORIS特異性CTL抗原決定基之中，至少存在著1種類的CTL抗原決定基，又，在檢體編號A＊11-16的生物體內存在著BORIS特異性CTL。
第54圖，是表示在第一階段的解析確認到CTL之誘導的第7行和第11行的第二階段解析結果。在第7行的孔E(7-E)、第11行的孔H(11-H)，確認到對HLA-A＊11：01限制性BORIS特異性CTL抗原決定基有特異性的CTL之誘導。
第55圖，是表示在第二階段的解析確認到CTL之誘導的第7行的孔E、第11行的孔H的第三階段解析結果。第7行的孔E是僅在用GTM-Tet進行染色的情況下，第11行的孔H是僅在用KLLF-Tet進行染色的情況 下確認到CTL。這證明了，GTM胜肽(序列編號65)及KLLF胜肽(序列編號72)是HLA-A＊11：01限制性BORIS特異性CTL抗原決定基胜肽。
<實施例6>BORIS sf5及sf6之特異抗體的製備
藉由取得BORIS sf5及BORIS sf6特異抗體之目的，由序列編號1及序列編號2分別合成以8~20個胺基酸所構成的胜肽序列，在此胜肽的C端或N端上加成半胱胺酸殘基，依照通用方法使KHL(鎖孔貝血藍素；Keyhole limpet hemocyanin)結合並用於免疫原。對兔子及天竺鼠，以隔週或是每週進行了4~6次免疫。免疫結束後，從各個個體進行採血，將此血液藉由利用了用於免疫原的胜肽所製作成的親和性管柱進行精製而獲得特異抗體。
特異性的驗證，是使用293T細胞的細胞萃取液來實施，該293T細胞的細胞萃取液有分別使BORIS sf5及BORIS sf6短暫性表現的培養細胞293T之細胞萃取液和無處理的293T細胞之細胞萃取液。在短暫性表現的BORIS sf5及BORIS sf6之基因裡，加成了Myc Tag序列，對此使用特異性Myc Tag抗體作為陽性控制。
如第56圖所示，在西方點墨的驗證結果，獲得之BORIS sf5及BORIS sf6特異抗體，在使用各別的BORIS表現293T細胞之萃取液時，兩者都在和顯示與在陽性控制所檢測出的條帶相同分子尺寸的位置上檢測 出條帶，相對於此，在無處理之293T細胞萃取物兩者都沒檢測出條帶。由此認為，能夠取得分別對BORIS sf5及BORIS sf6特異性結合的抗體。另外，由肺癌患者所切除的癌患部組織切片，利用BORIS sf5特異抗體進行染色後的情況，明白有判定為陰性的情況和判定為陽性的情況(參照第57圖)。藉由使用獲得之特異抗體，可確認BORIS sf5及BORIS sf6各自的表現的有無，顯示出能成為判斷胜肽疫苗療法等可否適應的有力工具，該胜肽疫苗療法使用了在本發明經鑑定之CTL抗原決定基胜肽。
<實施例7>針對BORIS sf6之siRNA之製備 (1)siRNA的設計
將以具有如下表所示之序列的方式而設計出來的針對BORIS之siRNA，依照使用Lipofectamine RNAiMAX之製造商的使用說明書所記載之實驗規範，分別轉染至MS751及CaSki。將細胞在轉染後48小時進行解析。作為陰性對照是使用了Trilencer-27 Universal Scrambled Negative Control siRNA(SR30004，Origene)。
[表10]
進行基因敲低(knockdown)的結果，顯示於第14及15圖。第14-1圖(a)是表示透過3種siRNA，BORIS(B0)的表現水準顯著受到抑制(定量RT-PCR)。又，從第14-1圖(b)及第14-2圖，在siRNA1及siRNA2，觀察到若干的細胞增殖抑制。認為或許抑制住的BORIS亞型的數量越多，增殖抑制效果會越高。惟，在siRNA1及siRNA2，幹細胞性基因的抑制完全沒有發生(第15圖)。
又，如第16-1圖及16-2所示，針對CasKi及MS751中各自的球體形成能力，在siRNA2有顯著地受到抑制(和細胞增殖抑制的結果並不一定會一致)。
並且，siRNA1~3的基因敲低與輻射耐受性無關(第17圖)。
從第18圖，可知BORIS表現若高則生存率會顯著降低。因此，BORIS被認定為有意義的預後不良因子(poor prognostic factor)。
[產業利用性]
根據本發明，能夠提供對各式各樣的癌有效的治療劑。特別是藉由本發明之抗原決定基胜肽所誘導出來CTL，是可誘導出能夠特異性攻撃各種癌細胞，尤其是被視為惡性腫瘤之原因的癌幹細胞的CTL，作為副作用少且效果高的抗癌劑非常有用。
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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Claims (27)

  1. 一種誘導細胞毒性T細胞的方法，該細胞毒性T細胞會特異性辨識出表現BORIS基因之細胞，該BORIS基因屬於同型異構物A或C、或者是亞型5或6，該方法包含使下述(a)或(b)的任一種與週邊血液淋巴球接觸：(a)聚胜肽，其是前述BORIS蛋白質的部分胜肽，為8~20胺基酸長，並具有HLA結合能力；(b)聚核苷酸，其編碼出上述(a)記載的聚胜肽的至少一種。
  2. 如請求項1所述之誘導細胞毒性T細胞的方法，其中，在試管內進行。
  3. 一種聚胜肽，其用於如請求項1或2所述之方法中，是以序列編號1或序列編號2來表示的聚胜肽的部分胜肽，為8~20胺基酸長，並具有HLA結合能力。
  4. 如請求項3所述之聚胜肽，其為8~11胺基酸長。
  5. 如請求項3或4所述之聚胜肽，其是以序列編號1來表示的聚胜肽的部分胜肽。
  6. 如請求項5所述之聚胜肽，其是以序列編號3、序列編號4、序列編號5或序列編號72來表示。
  7. 如請求項3或4所述之聚胜肽，其是以序列編號2來表示的聚胜肽的部分胜肽。
  8. 如請求項7所述之聚胜肽，其是以序列編號10來表示。
  9. 一種聚胜肽，其用於如請求項1或2所述之方法中，並具有HLA-A11抗原結合能力。
  10. 如請求項9所述之聚胜肽，其是以序列編號65、序列編號66、序列編號67或序列編號72來表示。
  11. 一種聚胜肽，其用於如請求項1或2所述之方法中，並具有HLA-A2抗原結合能力，是以序列編號4、序列編號5、序列編號10、序列編號47或序列編號57來表示。
  12. 一種聚胜肽，其用於如請求項1或2所述之方法中，並具有HLA-A24抗原結合能力。
  13. 如請求項12所述之聚胜肽，其是以序列編號3或10來表示。
  14. 一種聚胜肽，是在如請求項3~13中任一項所述之聚胜肽中，被加成、缺失、取代了1或複數個胺基酸而成。
  15. 一種聚核苷酸，其用於如請求項1或2所述之方法中，用以編碼出如請求項3~14中任一項所述 之聚胜肽。
  16. 一種細胞毒性T細胞誘導劑，其包含如請求項3~14中任一項所述之聚胜肽的至少1種來作為有效成分。
  17. 一種醫藥組成物，其包含如請求項16所述之細胞毒性T細胞誘導劑來作為有效成分。
  18. 一種癌幹細胞處置用組成物，其包含如請求項16所述之細胞毒性T細胞誘導劑來作為有效成分。
  19. 一種癌的預防及/或治療用組成物，其包含如請求項16所述之細胞毒性T細胞誘導劑來作為有效成分。
  20. 一種癌的預防及/或治療用組成物，其包含利用如請求項1或2所述之方法所誘導出來的細胞毒性T細胞來作為有效成分。
  21. 如請求項19或20所述之癌的預防及/或治療用組成物，其中，該癌是於女性特有的臓器中的癌或肺癌。
  22. 一種表現載體，其含有如請求項15所述之聚核苷酸。
  23. 一種用於癌的治療或預防的醫藥組成物，其含有如請求項15所述之聚核苷酸、或如請求項22所述之表現載體的任一種來作為有效成分。
  24. 一種HLA-四聚體，其含有如請求項3~14中任一項所述之聚胜肽和HLA。
  25. 一種抗原呈現細胞的製造方法，其包含使下述(a)或(b)與具有抗原呈現能力的細胞在試管內接觸的步驟：(a)如請求項3~14中任一項所述之聚胜肽；(b)聚核苷酸，其編碼出上述(a)所述之聚胜肽的至少一種。
  26. 一種抗體，其與以序列編號1或序列編號2來表示的聚胜肽的至少一部分進行特異性結合。
  27. 一種BORIS蛋白質檢測用套組，其包含如請求項26所述之抗體。
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