TW201623622A

TW201623622A - 製備具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液之方法

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Publication number: TW201623622A
Application number: TW103146621A
Authority: TW
Inventors: 王淑珍; 杜平悳; 常振鎧; 陳榮才
Original assignee: 嘉藥學校財團法人嘉南藥理大學
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2016-07-01
Also published as: TWI521061B

Abstract

本發明係有關於一種利用粕類發酵製備具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液之方法，係包含將一素材烘乾磨成粉末並與水混合成一混合液；加入0.1%澱粉酶(α-amylase)於95℃水解1小時；加入0.1%葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)於65℃水解4小時；將一乳酸菌加入含有混合液之培養基內培養24小時進行發酵；離心培養基，取上清液並煮沸20分鐘；以及過濾上清液，以獲一發酵粗萃液係具有抑制血管收縮素轉換酶活性。

Description

利用粕類發酵製備具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液之方法

本發明係有關於一種利用粕類發酵製備具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液之方法，尤其係指一種加入粕類素材於培養基提供乳酸菌進行發酵以製得發酵粗萃液之方法，以此方法獲得的發酵粗萃液具有抑制血管收縮素轉換酶的能力。

近幾年，高血壓已成為國人常見的慢性疾病之一，由於高血壓亦可能引起中風和心臟病等重大疾病，因此高血壓患者需妥善服藥以控制血壓。引起高血壓的原因有許多，其中「血管收縮素轉換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)」在血壓調節上扮演重要的角色之一，可促使血壓升高，是以若能抑制血管收縮素轉換酶的活性，便能降低血壓。目前臨床上大多係藉由化學合成藥物抑制ACE活性以控制血壓，但這些化學合成藥物具有許多副作用，例如長期服用悅您定(Renitec^®)、心達舒(Tritace^®)或脈樂甫利錠(Monopril^®)容易產生頭暈、嘔吐、容易疲倦、乾咳、鉀離子過高、腎衰竭等現象。因此，若能研發出更佳的調控血壓方法，將能大幅提升高血壓患者的福祉。

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)係指能夠代謝糖類、產生乳酸之細菌，具有這些功能的細菌包括乳酸桿菌(Lactobacillus)、鍵球菌(Streptococcus)、念球菌(Leuconostoc)等；乳酸菌亦是「益生菌」中最重要的一群，可增加人體內益菌含量。目前已有研究發現利用乳酸菌發酵後的發酵乳、酸奶、起司等食品中具有抑制ACE活性的能力而使血壓降低。為了增加乳酸菌發酵後發酵液內可抑制ACE的活性成分，許多研究嘗試在培養基內添加天然物質提供乳酸菌進行發酵；例如前案「乳酸菌發酵牡蠣風味乳製品產製技術與其生理活性功能之探討」(國立臺灣海洋大學，張源義，2004)利用生鮮牡蠣經熱水萃取後所餘牡蠣肉渣與1%葡萄糖之15%脫脂奶粉復原乳於37℃下進行乳酸菌發酵，並取其發酵乳進行抑制ACE能力之試驗，結果發現其具有較佳抑制ACE的效果；前案「中草藥萃取液以乳酸菌發酵後對血管收縮素轉換酶抑制活性影響之研究」(南台科技大學，楊哲政，2009)利用乳酸菌與利用不同萃取比例、溫度、時間進行萃取的天麻、黃芩、仙草萃取液一起進行發酵，期待經由乳酸菌的發酵後，其原本降血壓的效果能有效的增加；以及前案「清酒酒粕乳酸菌發酵液抑制血管收縮素轉換酶活性之研究」(大同大學，鄭淑文，2011)將由泡菜醱酵產物所篩選出來具乳酸菌株對清酒酒粕進行小量發酵培養，培養12小時之後測試酒粕發酵液抑制ACE的活性，結果均具有抑制ACE活性的能力。

然，目前添加於培養基的素材仍然有限，如何研發出更多種類素材以增加發酵液中抑制ACE活性的有效成分，開發出更佳的保健產品或醫藥組成物以控制血壓，乃為本發明人思及之方向。

本發明主要目的為提供一種生產發酵粗萃液之方法，其係指加入粕類素材於培養基內提供乳酸菌進行發酵以製得發酵粗萃液之方法，且此發酵粗萃液具有抑制血管收縮素轉換酶的能力。

為了達到上述實施目的，本發明一種利用粕類發酵製備具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液之方法，其包括步驟一：將一素材烘乾磨成粉末並與水以1：11混合成一混合液；步驟二：加入0.1%澱粉酶(α-amylase)於混合液中，並於95℃水解1小時；步驟三：加入0.1%葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)於混合液中，並於65℃水解4小時；步驟四：將一乳酸菌以1%(W/W)加入含有混合液之培養基內培養24小時進行發酵；步驟五：離心培養基，取上清液並煮沸20分鐘；以及步驟六：過濾上清液，以獲一發酵粗萃液係具有抑制血管收縮素轉換酶活性。

於本發明之一實施例中，素材係選自於由葵花籽、小麥、紅藜、花生粕、亞麻仁粕、紅蘿蔔、芝麻粕、紅豆、綠豆、小米、黑豆以及紫心地瓜所構成之群組；較佳係選自於紅蘿蔔、芝麻粕、亞麻仁粕或小米。

於本發明之一實施例中，步驟三係先調整混合液之pH值為4.5；步驟四之乳酸菌係已先培養24小時，且步驟四之乳酸菌係於35-37℃，轉速70-80rpm培養24小時。

於本發明之一實施例中，步驟四之培養基係利用下述步驟製得：(a)準備一無糖豆乳，並以121℃殺菌15分鐘；(b)將無糖豆乳以水稀釋至蛋白質含量為16mg/mL；以及(c)依照稀釋完成之體積添加2%之葡萄糖，並以121℃殺菌5分鐘，冷卻備用。

於本發明之一實施例中，步驟五係以8,000-10,000rpm離心培養基10-15分鐘。

於本發明之一實施例中，步驟六係以0.45μm過濾器過濾上清液。

藉此，本發明獲得之發酵粗萃液具有抑制血管收縮素轉換酶活性，因此可進一步運用於作為調整血壓之醫藥或保健組成物。

(S1)‧‧‧步驟一

(S2)‧‧‧步驟二

(S3)‧‧‧步驟三

(S4)‧‧‧步驟四

(S5)‧‧‧步驟五

(S6)‧‧‧步驟六

第一圖：本發明較佳實施例之步驟流程圖。

第二圖：分析乳酸菌發酵產生之發酵粗萃液對於ACE之影響。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示之結構，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

請參閱第一圖，本發明一種利用粕類發酵製備具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液之方法，其包括下列步驟：步驟一(S1)：將一素材烘乾磨成粉末並與水以1：11混合成一混合液，其中素材係選自於由葵花籽、小麥、紅藜、花生粕、亞麻仁粕、紅蘿蔔、芝麻粕、紅豆、綠豆、小米、黑豆以及紫心地瓜所構成之群組；較佳係選自於紅蘿蔔、芝麻粕、亞麻仁粕或小米；步驟二(S2)：加入0.1%澱粉酶(α-amylase)於混合液中，並於95℃水解1小時；步驟三(S3)：可先調整混合液之pH值為4.5，再加入0.1%葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)於混合液中，並於65℃水解4小時；步驟四(S4)：將一乳酸菌(較佳係已先培養24小時)以1%(W/W)加入含有混合液之培養基內培養24小時進行發酵(較佳於35-37℃，轉速70-80rpm進行發酵)；其中，培養基係利用下述步驟製得：(a)準備一無糖豆乳，並以121℃殺菌15分鐘；(b)將無糖豆乳以水稀釋至蛋白質含量為16mg/mL；以及(c)依照稀釋完成之體積添加2%之葡萄糖，並以121℃殺菌5分鐘，冷卻備用；步驟五(S5)：離心培養基(可例如以8,000-10,000rpm離心培養基10-15分鐘)，取上清液並煮沸20分鐘；以及步驟六(S6)：過濾上清液(可例如以0.45μm過濾器過濾)，以獲一發酵粗萃液係具有抑制血管收縮素轉換酶活性，可進一步用以調整血壓。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

<製備素材>

將葵花籽(sunflower seed)、小麥(wheat)、紅藜(red quinoa)、花生粕(peanut residue)、亞麻仁粕(linseed residue)、紅蘿蔔(carrot)以及芝麻粕(sesame residue)等素材烘乾磨成粉末，以粉末：水=1：11混合；再以0.1%澱粉酶(α-amylase)於95℃水解1小時，調整pH4.5，再以0.1%葡萄糖澱粉酶(glucoamylase)於65℃作用4小時，形成一混合液。

<乳酸菌豆乳培養基>

豆乳培養基係使用義美市售無糖豆乳(無糖豆奶)，先以121℃、15分鐘殺菌處理，將豆乳以RO水稀釋至蛋白質含量16mg/mL，再依照最後配置完成之體積，添加2%之葡萄糖，以121℃、5分鐘殺菌處理，冷卻備用。

<乳酸菌來源>

乳酸菌分離株(isolates of LABs)B0014、B0015、B0059、B0060、B0096、B0137相關資訊如表一。

<發酵條件及製備>

取1mL活化完成的菌液(含已培養24小時之乳酸菌)至上述豆乳培養基中，並分別將不同素材製成的混合液加入豆乳培養基內，於35℃震盪培養(80rpm/min)培養24小時；將培養後乳酸菌發酵液取至無菌離心管中，以8,000rpm離心15分鐘，將上清液於沸水煮20分鐘，最後以0.45μm過濾器(filters)過濾，進行血管收縮素轉換酶(ACE)抑制能力測定。

<ACE抑制能力測定>

(1)藥品配製

製備Hippuryl-histidyl-leucine(HHL)：以含有0.3M氯化鈉(NaCl)之磷酸鉀緩衝液(0.2M,pH8.2)溶解HHL(Sigma；MO，美國)，其濃度為5mM；製備血管收縮素轉換酶(angiotensin I-converting enzyme,ACE)：以含有50%甘油的磷酸鉀緩衝液(0.2M,pH8.2)溶解ACE(Sigma；MO，美國)，其濃度為143mU/mL。

(2)Pyridine-Benzene sulfonyl chloride(BSC)化學呈色法

取9μL的0.2M磷酸鉀緩衝液(pH8.2)(含0.3M氯化鈉，加上15μL的基質HHL，以及6μL的樣品，最後加入30μL的ACE，總體積共60μL；於37℃水浴1小時後，加入50μL氯化氫溶液(1N)中止反應；之後加入100μL的呈色劑比啶(pyridine)和50μL的BSC，震盪均勻，置於冰上冷卻至室溫，取200μL至96孔盤，以分光光度計測定410nm吸光值。ACE抑制率百分比公式計算如下：[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100%；其中A為不含樣品之吸光值；B為不含樣品並以緩衝液取代ACE之吸光值；C為加入樣品之吸光值；D為加入樣品並以緩衝液取代ACE之吸光值。

(3)逆向高效液相色譜法(Reverse phase-high performance liquid chromatography,RP-HPLC)

取9μL的0.2M磷酸鉀緩衝液(pH8.2)(含0.3M氯化鈉，加上15μL的基質HHL，以及6μL的樣品，最後加入30μL的ACE，總體積共60μL；於37℃水浴1小時後，加入50μL氯化氫溶液(1N)中止反應；之後取10μL注入C18管柱測定酵素反應產物馬尿酸(Hippuric acid,HA)，沖提液為50%甲醇(Methanol)含0.01%三氯醋酸(TCA)，以UV 228nm偵測。標準品以不同濃度之馬尿酸與其吸光值作圖，求得回歸方程式，計算出的馬尿酸含量再以下列公式計算出抑制率。抑制率百分比公式計算如下：[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100%；其中A為不加入樣品之馬尿酸含量；B為不加入樣品並以緩衝液取代ACE之馬尿酸含量；C為加入樣品之馬尿酸含量；D為加入樣品並以緩衝液取代ACE之馬尿酸含量。

分析乳酸菌於豆乳發酵後所得發酵粗萃液的ACE抑制能力，並比較逆向高效液相色譜法(RP-HPLC)與化學呈色法之ACE抑制能力測定，其中控制組為未加入乳酸菌株之豆乳，正控制組為可爾必思。結果請參閱第二圖，乳酸菌發酵後得到的發酵粗萃液皆具有ACE抑制能力，且兩種方法測定結果相同，故後續係採用呈色法進行ACE抑制能力測定。

實施例一：分析不同素材進行發酵產生之發酵粗萃液對於ACE之影響

分別將不同濃度(20%及40%)之葵花籽、小麥、紅藜、花生粕、亞麻仁粕、紅蘿蔔及芝麻粕素材加入豆乳培養基進行乳酸菌發酵，再分析不同發酵粗萃液對於ACE之抑制能力為何。其中控制組為未加入乳酸菌株之素材，N.D.代表未檢出。結果請參閱表二，相較於控制組，20%及40%的素材皆具有較佳的ACE抑制能力，且其中以20%紅藜、20%亞麻仁粕、20%芝麻粕與40%紅蘿蔔具有較高ACE抑制率。

實施例二：分析不同素材進行不同乳酸菌發酵產生之發酵粗萃液對於ACE之影響

選擇實例一中具有較高ACE抑制能力的素材(20%紅藜、20%亞麻仁粕、20%芝麻粕與40%紅蘿蔔)測試不同乳酸菌株(B0014、B0015、B0059、B0060、B0096與B0137)發酵產生的發酵粗萃液對於ACE之影響。結果如表三~表六，選出的四種素材分別加入豆乳培養基，並利用不同乳酸菌株發酵得到的發酵粗萃液，皆具有抑制ACE活性的效果，且抑制率皆達七成以上。

表六

綜上所述，利用如葵花籽、小麥、紅藜、花生粕、亞麻仁粕、紅蘿蔔、芝麻粕、紅豆、綠豆、小米、黑豆以及紫心地瓜等粕類發酵確實可得到具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液，且不同的素材亦可進一步混合加入培養基內，達到更佳的ACE抑制效果；目前發明人在自發性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rat,SHR)動物實驗測試結果，亦發現這些發酵粗萃液可制抑動物體內的ACE活性，並具有降血壓效果。

由上述之實施說明可知，本發明與現有技術相較之下，本發明具有以下優點：

1.本發明利用天然素材加入培養基內提供乳酸菌進行發酵，獲得具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液，將可進一步運用於作為調控血壓之保健產品或醫藥品，避免化學合成藥物造成的副作用。

2.本發明利用多種粕類進行發酵測試，並發現許多素材皆具有極佳的血管收縮素轉換酶抑制能力，可提供業者依需求選取所需的素材混合使用，以期達到更佳的血管收縮素轉換酶抑制效果。

綜上所述，本發明之利用粕類發酵製備具有抑制血管收縮素轉換酶活性之發酵粗萃液之方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便。

惟，上述所揭之圖示及說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。