TW201608240A - 鑑定蛋白質抗原決定位之方法 - Google Patents

鑑定蛋白質抗原決定位之方法 Download PDF

Info

Publication number
TW201608240A
TW201608240A TW104122486A TW104122486A TW201608240A TW 201608240 A TW201608240 A TW 201608240A TW 104122486 A TW104122486 A TW 104122486A TW 104122486 A TW104122486 A TW 104122486A TW 201608240 A TW201608240 A TW 201608240A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
cells
cell
protein
prt
peptide
Prior art date
Application number
TW104122486A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI719939B (zh
Inventor
Tomoaki Inoue
Shunsuke Ito
Nobuo Sekiguchi
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of TW201608240A publication Critical patent/TW201608240A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI719939B publication Critical patent/TWI719939B/zh

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

本發明提供用以鑑定蛋白質之抗原決定位之經改良之方法等。 於一態樣，係用以鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，包括以下的步驟：(A)使目標蛋白質接觸由幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化之表現主要組織相容複合物(MHC分子)之細胞；(B)從前述表現MHC分子之細胞將前述目標蛋白質所含之胜肽與MHC分子之複合體予以單離；及(C)從前述複合體將前述胜肽溶離並鑑定。

Description

鑑定蛋白質抗原決定位之方法
本發明於一態樣係關於用以鑑定具有免疫原性之蛋白質之方法等，例如也係關於鑑定有可能成為誘導免疫原性之原因的抗原決定位之方法。
近年來已有許多生物醫藥品(抗體醫藥、生物製劑、荷爾蒙、蛋白質等)貢獻於醫療之革新。但是考量例如有效性與安全性之觀點，該等生物醫藥品具有之免疫原性會成為問題。一般，抗原誘導抗體產生、細胞性免疫之性質稱為免疫原性。生物醫藥品藉由作為抗原作用，能於患者體內誘導抗體產生。於此情形，有時因為對抗生物醫藥品而產生中和抗體而有治療效率降低之情形。或，可能引發過敏反應、浸透反應、輸注反應等。或可能產生對抗生物醫藥品之因內在性之自體蛋白質之中和導致自體免疫疾病等之抗體。
抗體產生之處理中，使抗原在抗原呈現細胞(APC)之細胞表面存在之主要組織相容複合物(也稱為MHC分子)上呈現(稱為「抗原呈現」)係為重要。涉及抗原呈現之MHC分子已知有MHCI分子(第I類)與MHCII分子(第II類)。例如：MHCI分子作用於殺手T細胞(CD8陽性T細胞)，MHCII分子作用於協助者T細胞(CD4陽性T細胞)。MHCI分子對於 自體細胞內之內因性抗原作用，而MHCII分子對於外來性的抗原作用。因此例如對於在癌細胞內產生之癌抗原，可能由於介由MHCI分子之抗原呈現而引起抗原抗體反應等。另一方面，對於如生物醫藥品之外來性抗原、毒物，可能由於介由MHCII分子之抗原呈現而引起抗原抗體反應等。
更具體而言，當介由MHCI分子時，自體細胞內之內因性蛋白質會被蛋白酶體分解為小胜肽。其次，胜肽和於內質網合成之MHCI分子結合而形成複合體。之後，該複合體被運到細胞表面，而於MHCI分子上呈現該胜肽作為抗原決定位。
另一方面，當介由MHCII分子，首先，外來性蛋白質以內吞作用被帶入抗原呈現細胞中。其次，被帶入的蛋白質由溶酶體分解為小胜肽後，和MHCII分子結合而形成複合體。之後，該複合體被運送到細胞表面，在MHCII分子上呈現該胜肽作為抗原決定位。然後，協助者T細胞之T細胞受體能介由該胜肽而和抗原呈現細胞結合。
但是該等路徑並非確定，即使是外來性抗原也可能以利用MHCI分子之抗原呈現路徑處理(此現象稱為「交叉致敏(cross priming)」。)。
為了避免抗體醫藥等的免疫原性，已有人進行鑑定MHC分子上呈現之胜肽序列之研究。藉此，能預測想對於活體投予之蛋白質、胜肽之免疫原性。再者，例如為了依據抗原決定位序列之資訊來製作非免疫原性蛋白質，可利用部位專一性突變來修飾抗原決定位。胜肽序列之鑑定方法已知有：利 用電腦模擬(in silico))之預測演算法的方法、T細胞增殖分析法(例如：藉由帶入氚標定之胸腺嘧啶而測定協助者T細胞之增殖能力等)。但是例如：只由抗原決定位之候選胜肽與MHC分子之間之結合親和性來預測抗原決定位之序列有困難。因此，希望能藉由直接鑑定在MHC分子上呈現之胜肽序列，而更確定地預測有可能成為免疫原性誘導之原因之抗原決定位。
已有人開發出使蛋白質接觸如樹狀細胞(DC)之抗原呈現細胞而誘導抗原呈現，使來自該蛋白質之胜肽呈現於該細胞上之MHC分子上後，將該MHC分子與胜肽之複合體分離‧精製後使胜肽溶離，並使用液體層析質量分析(LC/MS)等以直接鑑定胜肽序列之方法(專利文獻1、專利文獻2、非專利文獻1)。該方法稱作為MAPPs(MHC-associated peptide proteomics)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]歐洲專利申請案公開第1715343號說明書
[專利文獻2]歐洲專利申請案公開第1826217號說明書
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Kropshofer, H, et al., J. Immunotoxicol., 3, 131, 2006
於一態樣，專利文獻1之方法係就抗原呈現細胞 而言，將由人採血並分離而得之人末梢血單核細胞(PBMC)作為初代細胞，並利用由此進一步分離而得之單核球(細胞)(monocyte)進行分化誘導而得到的樹狀細胞。但是單核球在PBMC中只存在約10%，分裂次數也有限，故能取得之細胞數有限。再者，若供體(donor)不同，MHC分子之同種異型(allotype)也可能變化，故並非能穩定地獲得所望之MHC分子之同種異型，依MAPPs鑑定之胜肽也可能變化。又，取決於患者狀態其血中之各成分會變動，所以並非能穩定地以同一條件將PBMC予以單離。因此尋求能夠安定地確保多數的有多樣MHC分子之同種異型之抗原呈現細胞。
又，於另一態樣，常會為了從單核球誘導樹狀細胞分化而添加血清，故有可能會檢測到來自血清中之蛋白質的胜肽序列。
又，於另一態樣，現狀為能取得之PBMC之量有限，故時常會集合多數供體來源的PBMC一起使用，不容易決定所鑑定的胜肽中的哪種胜肽是涉及哪位患者之免疫原性之誘導。
本案發明人努力研究，結果藉由將表現從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化之抗原呈現細胞(具體而言，是表現主要組織相容複合物(MHC分子)之細胞)適用於MAPPs，而意外地解決上述課題之一部分或全部而完成了本發明。
亦即，就例示而言本發明提供以下的態樣：
[1]一種鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，包含以下步驟： (A)使目標蛋白質接觸從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化之表現主要組織相容複合物(MHC分子)之細胞；(B)從該表現MHC分子之細胞將該目標蛋白質所含之胜肽與MHC分子之複合體予以單離；及(C)從該複合體將該胜肽溶離並鑑定。
[2]如[1]之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，更包含以下步驟：(D)驗證已鑑定之胜肽是否為誘導免疫原性之抗原決定位。
[3]如[1]或[2]之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該幹細胞係選自於由人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞)、核移植ES細胞(ntES細胞)、胚胎生殖幹細胞(EG細胞)及成體幹細胞構成之群。
[4]如[1]至[3]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該MHC分子為MHCII分子。
[5]如[4]之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，該MHCII分子為HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP。
[6]如[1]至[5]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中該表現MHC分子之細胞更表現CD80、CD86、CD206及CD209中之至少一者。
[7]如[6]之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該表現MHC分子之細胞表現CD80、CD86、CD206及CD209全部。
[8]如[1]至[7]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該表現MHC分子之細胞為樹狀細胞。
[9]如[1]至[8]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法， 其中，該表現MHC分子之細胞表現欲投予該目標蛋白質之對象之MHC分子之1或多數同種異型。
[10]如[1]至[9]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該步驟(A)於無血清下進行。
[11]如[1]至[10]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該樹狀細胞係以包含以下步驟之方法製作且該步驟(a)~(c)中至少該步驟(c)使用無血清培養基：(a)使幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化而獲得中胚層前驅細胞；(b)使該中胚層前驅細胞分化而獲得單核球細胞；及(c)使該單核球細胞分化而獲得未成熟樹狀細胞，並視情形進一步刺激該未成熟樹狀細胞而獲得成熟樹狀細胞。
[12]如[11]之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該步驟(b)包括使該中胚層前驅細胞在含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之無血清培養基中分化而獲得單核球細胞之步驟。
[13]如[11]或[12]之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該步驟(c)包括步驟(c1)：(c1)使該單核球細胞在含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及介白素4(IL-4)之無血清培養基中分化而獲得未成熟樹狀細胞，及視情形包括步驟(c2)：(c2)使該未成熟樹狀細胞和免疫原接觸並視情形和發炎性細胞激素接觸以誘導為成熟樹狀細胞。
[14]如[8]至[13]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該樹狀細胞為未成熟樹狀細胞，該未成熟樹狀細胞藉由和具有免疫原性之目標蛋白質接觸而誘導為成熟樹狀細胞。
[15]如[1]至[14]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，其中，該目標蛋白質選自於由細胞激素、趨化介素、成長因子、抗體、酵素、結構性蛋白、荷爾蒙、及該等之任一斷片構成之群中之1種或1種以上。
[16]一種免疫原性減少或消失之蛋白質之製造方法，包含以下步驟：(1)依如[1]至[15]中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法鑑定蛋白質之抗原決定位；(2)修飾該抗原決定位以使對於MHC分子之結合減少或消失；及(3)製造具有經修飾之抗原決定位之蛋白質。
[17]一種蛋白質，係依如[16]之免疫原性減少或消失之蛋白質之製造方法獲得。
[18]一種預測蛋白質在對象是否有免疫原性之方法，包含以下步驟：(I)提供表現欲投予目標蛋白質之對象之MHC分子之1或多數同種異型之細胞，該細胞係從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化；(II)使目標蛋白質接觸該「表現MHC分子之1或多數同種異型之細胞」；(III)從該「表現MHC分子之1或多數同種異型之細胞」將該目 標蛋白質所含之胜肽與MHC分子之複合體予以單離；(IV)從該複合體將該胜肽溶離並鑑定；及(V)視情形，驗證鑑定之胜肽是否為誘導免疫原性之抗原決定位；該鑑定之胜肽為誘導免疫原性之抗原決定位時，則指示該目標蛋白質在該對象具有免疫原性。
[19]如[18]之預測蛋白質在對象是否有免疫原性之方法，其中，提供1或多數表現該對象之MHC分子之1或多數同種異型之細胞以包含該對象擁有之MHC分子之同種異型之全部集合。
[20]如[18]或[19]之預測蛋白質在對象是否有免疫原性之方法，其中，該幹細胞係來自該對象之人工多能性幹細胞(iPS細胞)。
[21]一種組成物，係對象之和該蛋白質相關連之疾病之治療及/或預防用組成物，含有蛋白質作為有效成分；其特徵為：該對象係從依如[18]至[20]中任一項之預測蛋白質在對象是否有免疫原性之方法預測對於該蛋白質不具免疫原性之對象選擇。
[22]一種幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞、或從其分化之表現MHC分子之細胞之用途，係使用於如[1]至[16]及[18]至[20]中任一項之方法。
[23]一種從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞製造樹狀細胞之方法，包含以下步驟：(a’)使幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化而獲得中胚層前驅細胞； (b’)使該中胚層前驅細胞於含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之無血清培養基分化而獲得單核球細胞；及(c’)於無血清培養基使該單核球細胞分化而獲得未成熟樹狀細胞，並視情形進一步刺激該未成熟樹狀細胞而獲得成熟樹狀細胞。
[24]如[23]之從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞製造樹狀細胞之方法，其中，該步驟(c’)包含步驟(c1’)：(c1’)使該單核球細胞於含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及介白素4(IL-4)之無血清培養基分化而獲得未成熟樹狀細胞；及視情形包含(c2’)：(c2’)使該未成熟樹狀細胞和免疫原接觸並視情形和發炎性細胞激素接觸而誘導為成熟樹狀細胞。
[25]一種樹狀細胞，係利用如[23]或[24]之從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞製造樹狀細胞之方法獲得。
[26]如[25]之樹狀細胞，其中，除了表現MHCII分子更表現CD80、CD86、CD206及CD209中之至少一者。
[27]如[26]之樹狀細胞，表現CD80、CD86、CD206及CD209全部。
[28]一種細胞組成物，包含如[25]至[27]中任一項之樹狀細胞。
[29]又，該技術領域中具有通常知識者當然能理解：將上述記載之1或多數態樣予以任意組合而得者，只要基於該技術領域中 具有通常知識者之技術常識於技術上無矛盾，則包括在本發明。
於一態樣，例如藉由準備多數不同之表現MHC分子之同種異型之幹細胞，能安定地確保有多樣MHC分子之同種異型之抗原呈現細胞，而提供以往不容易獲得之表現患者擁有之MHC分子之同種異型之1或多數，較佳為全部之1或多數抗原呈現細胞，並實施預測所望之蛋白質在患者是否有免疫原性之複合性解析。
在另一態樣，將MAPPs用抗原呈現細胞之出發材料和將PBMC作為出發材料之系統比較，啟示使用幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞作為出發材料的本發明有更高感度。
於另一態樣，幹細胞的細胞分裂次數無限制能增殖‧維持之方法已確立，所以能夠大量且安定地製造、供給表現必要之MHC分子之同種異型之抗原呈現細胞，在製造成本、簡便性之觀點亦為優良。
於另一態樣，藉由於幹細胞分化為抗原呈現細胞之過程使用無血清培養基，能避免檢測到來自血清中之蛋白質之胜肽序列的可能性。
第1圖顯示MAPPs(MHC-associated peptide proteomics)技術之中使用MHCII分子的情形之技術概要之一例。圖中，DC代表樹狀細胞。
第2圖顯示使人iPS細胞分化而得到樹狀細胞樣細胞之方案之一例。
第3A圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之Tic品系製作之單核球樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第3B圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之Tic品系製作之單核球樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第4A圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之201B7品系製作之單核球樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第4B圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之201B7品系製作之單核球樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第5A圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之Tic品系製作之樹狀細胞樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第5B圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之Tic品系製作之樹狀細胞樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第6A圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之201B7品系製作之樹狀細胞樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第6B圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在從獲得之201B7品系製作之樹狀細胞樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第7圖顯示使用來自人iPS細胞(Tic品系)之樹狀細胞樣細胞之MAPPs中，於暴露於Bet v1a時檢測到的胜肽之胺基酸序列之解析結果(第7圖(a))，及於Bet v1a無處置條件檢測到之在暴露於Bet v1a時也檢測到的胜肽之胺基酸序列之解析結果(第7圖(b))。將Bet v1a之胺基酸序列也一併顯示。Bet v1a之胺基酸序列中，大致區分4處在所對應之地方檢測到胜肽。
第8圖顯示使用來自人iPS細胞(201B7品系)之樹狀細胞樣細胞之MAPPs中，暴露於Bet v1a時檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果(第8圖(a))，及於Bet v1a無處置條件檢測到的在暴露於Bet v1a時也檢測到的胜肽之胺基酸序列之解析結果(第8圖(b))。Bet v1a之胺基酸序列也一併顯示。Bet v1a之胺基酸序列中，大致區分在3處所對應的地方檢測到胜肽。
第9A圖顯示使用來自人iPS細胞(Tic品系)之樹狀細胞樣細胞之MAPPs中，暴露於Infliximab時檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果(a)。Infliximab之H鏈及L鏈之胺基酸序列分別一併顯示。
第9B圖顯示使用來自人iPS細胞(Tic品系)之樹狀細胞樣細胞之MAPPs時，於Infliximab無處置條件檢測到之暴露於Infliximab時也檢測到的胜肽之胺基酸序列之解析結果(b)。Infliximab之H鏈及L鏈之胺基酸序列各一併顯示。
第10A圖顯示使用來自人iPS細胞(Tic品系)之樹狀細胞樣細胞之MAPPs中，暴露於重組人類第VIII因子時檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第10B圖接續第10A圖。
第10C圖接續第10B圖。
第10D圖接續第10C圖。
第10E圖接續第10D圖。
第10F圖接續第10E圖。
第10G圖接續第10F圖。
第10H圖接續第10G圖。
第11圖顯示使用來自人iPS細胞(Tic品系)之樹狀細胞樣細胞之MAPPs中，暴露於Phl p1時檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第12圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在獲得之單核球細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第13A圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在獲得之樹狀細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第13B圖顯示利用流式細胞儀解析檢查在獲得之樹狀細胞之細胞表面表現之分子之結果。
第14圖顯示使用來自人供體之PBMC之樹狀細胞之MAPPs時，於Bet v1a添加條件及非添加條件(對照)檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第15圖顯示使用使用來自人供體之PBMC之樹狀細胞之MAPPs中，Bet v1a添加條件及非添加條件(對照)檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第16圖顯示使用來自人供體之PBMC之樹狀細胞之MAPPs中，Bet v1a添加條件及非添加條件(對照)檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第17圖顯示使用來自人供體之PBMC之樹狀細胞之MAPPs中，Bet v1a添加條件及非添加條件(對照)檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第18圖顯示使用來自人供體之PBMC之樹狀細胞之MAPPs中，Bet v1a添加條件及非添加條件(對照)檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第19圖顯示使用來自人供體之PBMC之樹狀細胞之MAPPs中，Bet v1a添加條件及非添加條件(對照)檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第20圖顯示使用來自人供體之PBMC之樹狀細胞之MAPPs中，Bet v1a添加條件及非添加條件(對照)檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。
第21A圖顯示比較使用來自人iPS細胞之樹狀細胞樣細胞時和使用來自PBMC之樹狀細胞時，針對於Bet v1a添加條件檢測到之胜肽之胺基酸序列。
第21B圖接續第21A圖。
以下說明本發明之理想實施形態。
本說明書中，蛋白質可為例如天然蛋白質、重組蛋白質或使胺基酸彼此以人工方式鍵結而製備之合成胜肽。蛋白質可理解為1種蛋白質、或多數不同蛋白質之混合物。蛋白質也可含有非天然胺基酸。又，例如於活體內產生時可以被糖化。蛋白質宜為和動物(較佳為人)之治療或預防相關連之蛋白質(例如：抗體、荷爾蒙等)較佳。於一實施態樣，蛋白質可以從由細胞激素、趨化介素、成長因子、抗體、酵素、結構性蛋白、荷爾蒙、及該等之任一斷片構成之群組中之1種以上，較佳為從1種當中選擇。
蛋白質只要是被帶入細胞並分解後，或被帶入細胞而未分解，或在細胞內生成後分解後，和MHC分子形成複合體而進行抗原呈現者即可，該蛋白質之胺基酸序列之長度不 是特別成為問題。該蛋白質也可為和MHC分子形成複合體而進行抗原呈現之胜肽本身。
本說明書中，抗原決定位是指抗體所認識並結合之抗原之特定結構單位。抗原決定位是表現抗原性之最小單位，也稱為抗原決定基(antigenic determinant)。
本說明書中，分化可指原本為單一或同一之各個細胞或細胞集團等在結構及/或機能方面變化，而變得複雜化、異質化之狀態或態樣等。例如：分化可和分化誘導互換地使用，包括分化誘導已開始之狀態、分化誘導繼續之狀態、分化誘導已結束之狀態等，再者，應理解當然也包括分化誘導已結束之細胞或細胞集團增殖之狀態等。又，誘導也可指促進某細胞或細胞集團等在結構及/或機能方面分化為其他細胞或細胞集團等，只要能達成分化即可，並無特殊限定。
本說明書中，幹細胞係指多能性幹細胞，只要有分化多能性及自我複製能力之細胞即可，並無特殊限定。幹細胞，例如：人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞)、核移植ES細胞(ntES細胞)、胚胎生殖幹細胞(EG細胞)、成體幹細胞(WO2012/115276)。該等幹細胞宜為來自哺乳動物者，來自人特別理想。
ES細胞係來自受精卵之8細胞期、桑椹胚後之胚胎即囊胚之內部細胞塊等之胚胎來源的幹細胞。ES細胞可藉由從對象動物之受精卵之囊胚將內部細胞塊取出並將內部細胞塊於纖維母細胞之食槽(feeder)上培養以建立，其建立及維持方法為公知(例如：US Patent No.5,843,780等)。ES細胞之選 擇例如可將鹼性磷酸酶、OCT-3/4、NANOG等基因標記之表現作為指標以Real-Time PCR法進行。尤其，人ES細胞之選擇可以將OCT-3/4、NANOG、FBX15、FGF4、REX1、ECAD等基因標記之表現作為指標(E.Kroon et al.(2008),Nat.Biotechnol.,26：443-452)。
於一態樣，由於對於可能成為人之受精卵、胚胎破壞會產生倫理的問題，故製作人ES細胞時使用之胚胎，例如可使用利用體外受精進行不孕治療時未回到母體之冷凍保存的胚胎當中決定廢棄之多餘胚胎，或在體外受精處理獲得之發育過程停止的胚胎，或為自體且無成長為人之內在能力之細胞分裂與成長係基於單性生殖之未授精卵。或只使用囊胚胎期以前之卵裂期之胚胎之單裂球，而以無損胚胎發育能力、未破壞受精卵地製作ES細胞(Chung Y,Klimanskaya I,Becker S,Marh J,Lu SJ,Johnson J,Meisner L,Lanza R.(2006).Nature 439：216-219.；Klimanskaya I,Chung Y,Becker S,Lu SJ,Lanza R.(2006).Nature 444：481-485.；Chung Y,Klimanskaya I,Becker S,Li T,Maserati M,Lu SJ,Zdravkovic T,Ilic D,Genbacev O,Fisher S,Krtolica A,Lanza R.(2008).Cell Stem Cell 2：113-117.)。或，也可從停止發育的人胚胎製作ES細胞(Zhang X,Stojkovic P,Przyborski S,Cooke M,Armstrong L,Lako M,Stojkovic M.(2006).Stem Cells 24：2669-2676.)。
iPS細胞為可藉由將特定之初始化因子以DNA或蛋白質的形態導入到體細胞以製作之和ES細胞有大致同等特性，例如具分化多能性及自我複製能力之來自體細胞之人工幹 細胞(K.Takahashi and S.Yamanaka(2006)Cell,126：663-676；K.Takahashi et al.(2007),Cell,131：861-872；J.Yu et al.(2007),Science,318：1917-1920；Nakagawa,M.et al.,Nat.Biotechnol.26：101-106(2008)；WO2007/069666)。(在此，體細胞也可指生殖系列細胞、多能性幹細胞除外的所有動物細胞(較佳為包括人之哺乳動物細胞)。)
初始化因子可為於ES細胞專一性表現之基因、其基因產物或非編碼(non-coding)RNA、或對於ES細胞之未分化維持發揮重要作用的基因、其基因產物或非編碼(non-coding)RNA、或低分子化合物。初始化因子可列舉例如：OCT3/4、SOX2、SOX1、SOX3、SOX15、SOX17、KLF4、KLF2、c-MYC、N-MYC、L-MYC、NANOG、LIN28、FBX15、ERAS、ECAT15-2、TCLL、beta-catenin、LIN28B、SALL1、SALL4、ESRRB、NR5A2、TBX3。該等初始化因子可單獨使用或組合使用。初始化因子之組合，例如以下之組合。(i)OCT基因、KLF基因、SOX基因、MYC基因；(ii)OCT基因、SOX基因、NANOG基因、LIN28基因；(iii)OCT基因、KLF基因、SOX基因、MYC基因、hTERT基因、SV40 large T基因；(iv)OCT基因、KLF基因、SOX基因
或初始化因子之組合，可使用例如：WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、 WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO2010/111409、WO2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、WO2012/115276記載之組合。初始化因子或促進初始化之因子，例如：該技術領域中具有通常知識者公知之抑制劑、MEK抑制劑、DNA甲基轉移酶抑制劑、組蛋白去乙醯酶(HDAC)抑制劑、組蛋白甲基轉移酶抑制劑、p53抑制劑。初始化因子視情形可以使用載體(例如：病毒載體、質體載體、人工染色體載體)等，依例如：磷酸鈣法、脂轉染法、微注射法等該技術領域中具有通常知識者公知之方法導入到體細胞內。用以進行iPS細胞誘導之培養基，可使用例如含10~15%FBS之DMEM、DMEM/F12或DME培養基(此等之中可更適當含有白血病抑制因子(LIF)、盤尼西林/鏈黴素、嘌呤黴素、L-麩醯胺酸、非必須胺基酸類、β-巰基乙醇等。)、或適當使用該技術領域中具有通常知識者公知之市售培養基。
iPS細胞之培養可因應培養基之組成等適當設定。例如：於37℃、5%CO2存在下，使用含10%FBS之DMEM或DMEM/F12培養基，使體細胞和初始化因子接觸並培養約4~7日，之後將細胞重新灑在餵養細胞(feeder cell)(例如：絲裂 黴素C處理STO細胞、SNL細胞)上，於體細胞和初始化因子接觸後約10日後，以含有鹼性纖維母細胞成長因子(bFGF)之Primate ES細胞培養用培養基進行培養，並於該接觸起算約30~約45日或之後使iPS樣群落產生亦可。或於37℃、5%CO2存在下，於餵養細胞(例如：絲裂黴素C處理STO細胞、SNL細胞)上以含10%FBS之DMEM培養基(此等中也可更適當含有LIF、盤尼西林/鏈黴素、嘌呤黴素、L-麩醯胺酸、非必須胺基酸類、β-巰基乙醇等。)進行培養，於約25~約30日或之後使iPS樣群落產生亦可。也可將餵養細胞改為使用已初始化之體細胞本身、或使用細胞外基質、Matrigel(BD公司)。又，也可使用無血清培養基進行培養(Sun N,et al.(2009),Proc Natl Acad Sci U S A.106：15720-15725)。
iPS細胞之選擇也可利用形成之群落之形狀(例如：是否可獲得接近球狀之形狀之細胞塊)進行選擇。或於體細胞已初始化時，將會和表現之基因(例如：鹼性磷酸酶、OCT3/4、NANOG)連動表現之藥劑耐性基因導入作為標記基因時的情形，可藉由以含有對應之藥劑之培養基進行培養，而選擇已建立之iPS細胞。標記基因為螢光蛋白質基因時，也可藉由以螢光顯微鏡觀察來選擇iPS細胞。或也可利用公知之分化方法將細胞於活體外(in vitro)培養，以能分化為所望細胞作為指標來判定iPS細胞。或也可將細胞移植到免疫不全小鼠之皮下，解析於經過預定期間後形成之腫瘤組織，確認形成各種組織混雜之其畸胎瘤(tetratomer)而判定iPS細胞。或也可確認表現了於ES細胞專一性表現之標記基因而判定iPS細胞。或，也可以 微陣列等檢測全基因體的基因表現樣式，並將和ES細胞之表現樣式的相關性高的細胞判定為iPS細胞。
或也可接收已建立之iPS細胞之分讓並使用。
ntES細胞係從以核移植技術製作之選殖體胚胎而來之ES細胞，和來自受精卵之ES細胞有大致相同特性(T.Wakayama et al.(2001),Science,292：740-743；S.Wakayama et al.(2005),Biol.Reprod.,72：932-936；J.Byrne et al.(2007),Nature,450：497-502)。亦即，ntES細胞係由將未受精卵之核取代成體細胞之核而得之來自選殖體胚胎之囊胚胎之內部細胞塊建立之ES細胞。為了製作ntES細胞，可組合公知之核移植技術(例如：J.B.Cibelli et al.(1998),Nature Biotechnol.,16：642-646)和公知之ES細胞製作技術(若山清香等人(2008)，實驗醫學，26卷，5號(增刊),47~52頁)。核移植時，可對於哺乳動物之已去除核之未受精卵注入體細胞之核並培養數小時以進行初始化。
EG細胞，係從胚胎期之原始生殖細胞建立之和ES細胞帶有同樣之多能性之細胞(Y.Matsui et al.(1992),Cell,70：841-847)。可於LIF、bFGF、幹細胞因子(Stem Cell Factor，STF)等存在下培養原始生殖細胞以建立(Y.Matsui et al.(1992),Cell,70：841-847)。
成體幹細胞係於活體內可見到之未最終分化之細胞，其存在作為向最終分化細胞之前驅細胞之供給源。成體幹細胞存在於活體內之各組織，且通常能分化之細胞之種類受限。本發明中，成體幹細胞，尤其據認為可分化為例如單核球、 巨噬細胞、樹狀細胞等之造血幹細胞尤佳。又，造血前驅細胞係指從造血幹細胞分化之細胞。
本說明書中，來自幹細胞之前驅細胞，也可包括使幹細胞而獲得抗原呈現細胞(具體而言，表現MHC分子之細胞)之過程觀察到的各種細胞(例如：中胚層前驅細胞、造血前驅細胞、顆粒球‧巨噬細胞群落形成細胞、淋巴母細胞、單核母細胞、前單核球或單核球)。在此，幾乎所有的有核細胞均有MHCI分子(Peter Parham(2007)，基礎免疫學；The Human Protein Atlas,http：//www.proteinatlas.org/)，且自體細胞內之內因性蛋白質係介由MHCI分子而可對於殺手T細胞進行抗原呈現。另一方面，特定細胞除了MHCI分子以外尚有MHCII分子，介由MHCII分子可將外來性抗原對於協助者T細胞呈現(也稱為專家(professional)抗原呈現細胞)。
本說明書中，抗原呈現細胞可包括此等兩者的細胞類型。抗原呈現細胞為後者的類型時，例如：樹狀細胞、巨噬細胞、單核球、B細胞較佳。再者，若介由干擾素等細胞激素活化而誘導出MHCII分子，則甲狀腺濾胞細胞、纖維母細胞、血管內皮細胞等也可作為抗原呈現細胞，所以該等細胞也可作為後者之類型之例。是否有作為抗原呈現細胞(具體而言，係表現MHC分子之細胞，例如：樹狀細胞、巨噬細胞、單核球、B細胞。)之特性之判定基準，例如可將表現MHCI分子及/或MHCII分子之細胞作為指標，又，將表現CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD15、CD40、CD80、CD83、CD86、CD123、CD205、CD206、CD209、CCR7中之至少1者以上之細胞作為 指標更理想。
又，尤其，樹狀細胞的抗原呈現能力強，協助者T細胞之活化能力強，作為抗原呈現細胞為有利。又，抗原呈現細胞尤其未成熟樹狀細胞最理想。樹狀細胞係具有細胞突起且呈樹狀或樹枝狀之形態之細胞。是否具有作為樹狀細胞之特性之判定基準，例如可將除了MHCII分子是否更表現CD11b、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86、CD123、CD205、CD206、CD209、CCR7中之至少一者作為指標，更佳為將是否表現MHCII分子、CD80、CD86、CD206、CD209的全部作為指標。表現MHCII分子、CD80、CD86、CD206、CD209之全部且為CD14陰性之樹狀細胞又更佳。是否具有作為巨噬細胞細胞之特性之判定基準，例如可將除了MHCII分子是否更表現CD11b作為指標。又，CD80及CD86係指會對於協助者T細胞傳遞信號而使該細胞活化。本實施例獲得之樹狀細胞樣細胞由於在細胞形狀、細胞表面分子之表現、協助者T細胞刺激能力之方面和來自單核球之樹狀細胞有類似性質，所以也可包括在本說明書之樹狀細胞。同樣，本實施例獲得之單核球樣細胞也可包括在本說明書之單核球細胞。
抗原呈現細胞宜來自哺乳動物，更宜來自人。
本說明書中，MHC分子可為MHCI分子或MHCII分子中任一者，為MHCII分子較理想。人之MHC稱為人白血球型抗原(HLA)。MHCI分子進一步區分成典型的第I類分子(第Ia類)和非典型的第I類分子(第Ib類)。典型的第I類分子於人可列舉HLA-A、HLA-B、HLA-C，非典型的第I類分子於人 可列舉HLA-E、HLA-F、HLA-G。另一方面，MHCII分子於人可列舉HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP。
MHC分子即使在同種動物間也會在個體之胺基酸序列有若干不同，進一步區分成稱為同種異型之數種類型。例如：HLA-DR已知有DR1、DR2、DR3、DR4‧‧‧之多數同種異型。此等同種異型在MHC基因上係彼此連鎖，故只要在此區域內不發生基因重組，則此等同種異型會成組而代代相傳。其單位稱為單倍型(haplotype)。來自患者之幹細胞(例如iPS細胞)即使繼代‧分化，基本上患者之MHC基因序列會以原本狀態保持，所以使該幹細胞分化而得之抗原呈現細胞，會維持患者擁有之MHC分子之同種異型。
各同種異型會各自和不同的抗原胜肽斷片(抗原決定位)形成複合體，並於細胞表面呈現抗原決定位，所以同種異型之各組，換言之，具有該同種異型之組之患者分別對於目標蛋白質之免疫原性、副作用等之有無、程度會有不同。同種異型、單倍型(haplotype)係於人種、民族有特徵性的樣式，故可利用在解析各人種、民族對於目標蛋白質之免疫原性、副作用等之有無等。
因此，為了對於一定集團(人種、民族等)預測蛋白質之免疫原性，使用該集團具有之MHC分子之同種異型之一連串抗原呈現細胞為有利。
再者，個人擁有之同種異型能利用基因診斷(例如：將經聚合酶連鎖反應(PCR)放大的DNA和固定有探針的珠粒雜交，將其螢光強度數值化而進行數據解析以指定出HLA基 因型之HLA基因型解析法)等而簡便地指定，故可依據指定之同種異型之資訊，而決定是否對於目標蛋白質有免疫原性、副作用等。基因診斷法之其他具體例，例如International Journal of lmmunogenetics,2011；38：6,pp.463-473記載之方法。
因此，於一理想的實施態樣，抗原呈現細胞也可表現欲投予目標蛋白質之對象(例如哺乳動物，較佳為人)之MHC分子之1或多數同種異型。
於一理想之態樣，本發明之幹細胞或來自其之前驅細胞也可使用表現欲解析之對象(例如：人患者或人健常者)擁有之MHC分子之1或多數同種異型之細胞，例如也可以含有前述對象擁有之MHC分子之同種異型之全部集合的方式使用表現前述對象之MHC分子之1或多數同種異型之1或多數細胞。或，也可收集表現在欲解析之人種、民族之表現頻度高之MHC分子之1或多數同種異型之細胞，藉由收集多數例如如此的細胞，可以涵蓋前述人種、民族中之一定比例(例如30%~80%以上)的人口而解析免疫原性。適當進行例如：人患者彼此、人患者與人健常者、人健常者彼此等的比較解析為有利。
本發明中，使幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化為抗原呈現細胞之方法，只要是該技術領域中具有通常知識者公知之方法即可，並不特別限定。例如：就使ES細胞、iPS細胞等幹細胞分化為單核球、巨噬細胞、B細胞、或樹狀細胞等之方法而言，可以使用在WO2009/120891；WO2009/074341；Regen.Med.(2009)4(4),p.513-526；WO2012/115276；WO2012/043651；PLoS One,July 2011,Vol.6, Issue7,e22261；Gene Therapy(2011),1-1024 March 2011,doi：10.1038/gt.2011.22；科學技術進行機構CREST戰略的創造研究推進事業 人工多能性幹細胞(iPS細胞)製作．控制等醫療基盤技術之H20-23研究報告；International Journal of Cancer 2013 Jul 3.doi：10.1002/ijc.28367；Zhuang,L.et al.J.Immunol.Methods(2012)；PLoS One,April 2013,Vol.8,Issue4,e59243；NATURE IMMUNOLOGY Vol.5,No.4,2004,pp.410-417記載之方法。例如，Regen.Med.(2009)4(4),p.513-526揭示於無血清培養基下從人ES細胞誘導分化為樹狀細胞之活體外(in vitro)分化誘導法。該方法中，揭示以下方法：使用骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Protein)-4(BMP-4)、粒細胞-巨噬細胞(Granulocyte Macrophage)-群落刺激因子(Colony Stimulating Factor)(GM-CSF)、幹細胞因子(Stem Cell Factor)(SCF)、及血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor)(VEGF)使人ES細胞分化為單核球；然後，使該單核球進一步使用GM-CSF及介白素(Interleukin)-4(IL-4)分化為未成熟樹狀細胞；再使該未成熟樹狀細胞使用包括GM-MSF、TNF-α、介白素(Interleukin)-1β(IL-1β)、干擾素(Interferon)-γ(IFN-γ)、及PGE2而構成之成熟化混合成分(maturation cocktail)分化為成熟樹狀細胞。又，PLoS One,April 2013,Vol.8,Issue4,e59243揭示依據由ES細胞及iPS細胞分化之單核球獲得有機能的巨噬細胞及樹狀細胞。再者，NATURE IMMUNOLOGY Vol.5,No.4,2004,pp.410-417記載從ES細胞製作T細胞之方法作為主題，但揭示其製作之過程也可製作B 細胞(例如該文獻中，p.411之右欄第2段落~p.412之左欄第2段落；Fig.1)。
如上，針對將幹細胞分化為抗原呈現細胞(表現MHC分子之細胞)之技術本身的關連技術已有人報告。但是該等文獻均是為了利用在再生醫療、免疫療法，並非為了應用在蛋白質之抗原決定位序列解析。
本發明中，作為使幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化為抗原呈現細胞之具體方法而言，較佳為參照WO2012/115276。該方法例如於抗原呈現細胞為樹狀細胞時，在提供幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞之步驟之後，尚可包括以下步驟：(a)幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化而獲得中胚層前驅細胞之步驟；(b)使前述中胚層前驅細胞分化而獲得單核球細胞之步驟；及(c)使前述單核球細胞分化而獲得未成熟樹狀細胞，並視情形對於前述未成熟樹狀細胞進行刺激而獲得成熟樹狀細胞之步驟。
又，前述步驟(a)及前述步驟(b)可連續進行。再者，前述步驟(a)~(c)之中，至少前述步驟(c)可使用無血清培養基，前述步驟(b)與(c)兩者均使用無血清培養基較佳，前述步驟(a)~(c)均使用無血清培養基更佳。
前述血清也可指人血清、猴血清、胎牛血清、羊血清、兔血清、大鼠血清、天竺鼠血清、小鼠血清等哺乳動物來源之血清。
前述無血清培養基係指未添加血清且未添加B-27 等市售之血清代替物的培養基，較佳為含有白蛋白或白蛋白代替物、運鐵蛋白或運鐵蛋白代替物、胰島素或胰島素代替物、及亞硒酸中之至少一者之培養基。更佳為含有胰島素-運鐵蛋白-硒-X補充物(ITS)之培養基。理想的無血清培養基，例如：對於最小必須培養基(MEM)、Dulbecco’s修飾之eagle培養基(DMEM)、Iscove's修飾之Dulbecco's培養基(IMDM)、StemPro-34培養基(Life Tech)、Stem品系II(SIGMA)或靈長類ES細胞培養基(ReproCELL)等添加了ITS之培養基。
前述步驟(a)也可包括以下步驟：藉由將幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞以含有BMP家族蛋白質之培養基進行培養，然後以含有增殖因子及造血因子之培養基培養，或是以含有VEGF之培養基培養後以含有造血因子之培養基培養以獲得中胚層前驅細胞。又，前述步驟(b)也可包括以下步驟：以含有造血因子之培養基進行培養，而使前述中胚層前驅細胞分化而獲得單核球細胞。前述步驟(a)及前述步驟(b)可連續進行。
前述BMP家族蛋白質也可指屬於TGF-β超級家族之具有約20種次類別之細胞激素。本發明之理想BMP家族蛋白質為BMP2及/或BMP4，更佳為BMP4。
前述增殖因子較佳為VEGF，具體而言可為VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PlGF(胎盤生長因子(placental growth factor))-1、PlGF-2或該等的選擇性剪接(splicing)變異體(例如：VEGF-A已知是由121個、165個、189個或206個胺基酸構成的變異體)。本發明中理想的VEGF為VEGF-A。再者，前述增殖因子可除了VEGF更含有bFGF。
前述造血因子係促進血球之分化‧增殖之因子，可為例如：Stem Cell Factor(SCF)、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)、紅血球生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、介白素(IL)類或Flt3-配體。前述介白素類可為IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、或IL-9等。
前述步驟(b)中之理想造血因子可從由SCF、TPO、IL-3、Flt3-配體、GM-CSF及M-CSF構成之群組中選擇。造血因子可單獨使用也可組合使用。
更佳為組合使用VEGF與造血因子作為增殖因子並進行前述步驟(a)後，接著使用GM-CSF與M-CSF之組合作為造血因子而進行前述步驟(b)。前述步驟(b)中，宜每隔數日更換培養基(例如每隔3~4日)並進行培養為佳。
依前述步驟(b)獲得非黏附性細胞(單核球細胞(樣細胞))後，可於前述步驟(c)作為單核球使用。針對前述非黏附性細胞是否有單核球細胞之特性，例如可使用流式細胞儀等，將MHCII分子之表現以外更將單核球細胞之標記即CD14、CD45hi、CD11a、CD11b或CD15等的表現作為指標進行判定。又，考量使向樹狀細胞之誘導效率改善之觀點，例如可以從非黏附性細胞使用磁珠法等只分離CD14陽性細胞，以提供用於誘導為樹狀細胞之單核球之細胞比例。
前述步驟(c)可更包含以下步驟：(ci)以含有造血因子之培養基將前述單核球(浮游)培養並使其分化而獲得未成熟樹狀細胞(樣細胞)之步驟，及視情形包括以 下步驟：(cii)使獲得之未成熟樹狀細胞(樣細胞)進一步和免疫原，及視情形和發炎性細胞激素接觸，以誘導為成熟樹狀細胞(樣細胞)之步驟。
針對前述未成熟樹狀細胞樣細胞或成熟樹狀細胞樣細胞是否有樹狀細胞之特性，例如可使用流式細胞儀等，將MHCII分子之表現以外是否更表現為樹狀細胞標記之CD11b、CD11c、CD40、CD80、CD83、CD86、CD123、CD205、CD206、CD209、CCR7中之至少一者作為指標。再者，針對樹狀細胞是否有未成熟樹狀細胞之特性、還是有成熟樹狀細胞之特性，例如可以將MHCII分子(HLA-DR等)的表現變動等作為指標而驗證。
前述造血因子也可為上述因子。較佳為造血因子使用GM-CSF、IL-3及IL-4之組合、或GM-CSF及IL-4之組合。
前述免疫原及前述發炎性細胞激素若和未成熟樹狀細胞接觸，會給予該細胞刺激(pulse)，而誘導為成熟樹狀細胞。未成熟樹狀細胞的抗原吞噬能力高但抗原呈現能力低，藉由抗原浸入活體內等而使其成熟為成熟樹狀細胞，使抗原呈現所必要之MHCII分子等蛋白質的表現增強，能使抗原呈現能力提高。
前述免疫原可為導入到活體內時會引起免疫回應之任意物質，例如：脂多糖(LPS，存在於病原體)。該技術領域中具有通常知識者可理解：本發明中，當欲評價之蛋白質具有 免疫原性時，該蛋白質可作為免疫原作用。因此於一理想之實施態樣，前述未成熟樹狀細胞藉由接觸具免疫原性之目標蛋白質，會誘導成成熟樹狀細胞。
前述發炎性細胞激素可為例如：腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor)-α(TNF-α)、TNF-β、IL-12、或IFN-γ。前述免疫原及前述發炎性細胞激素適當地單獨使用或組合使用。
又，當就抗原呈現細胞而言，欲獲得巨噬細胞而不是樹狀細胞時，可依PLoS One,April 2013,Vol.8,Issue4,e59243記載之方法，將前述步驟(c)替換為實施下列步驟：(d)使前述單核球細胞分化而得到巨噬細胞之步驟。於此情形，造血因子宜使用GM-CSF或M-CSF，使前述單核球細胞向巨噬細胞分化。再者，例如可藉由添加IFN-γ或LPS，使其向M1巨噬細胞分化，或例如可藉由添加IL-4或IL-13，使其向M2巨噬細胞分化(巨噬細胞已知會因為接收協助者T細胞產生之細胞激素而活化，已知有典型性活化(M1巨噬細胞)與選擇性活化(M2巨噬細胞))。
前述各步驟使用之增殖因子、造血因子、細胞激素等的各濃度只要是可獲得目的之抗原呈現細胞之濃度即可，可由該技術領域中具有通常知識者適當決定BMP4之濃度可為例如：5~150ng/ml，10~100ng/ml更佳，20~80ng/ml又更佳。VEGF之濃度可為例如：20~100ng/ml，30~70ng/ml更佳，40~50ng/ml又更佳。bFGF之濃度可為例如：10~100ng/ml，20~50ng/ml更佳。SCF之濃度可為例如：20~100ng/ml， 30~70ng/ml更佳，40~50ng/ml又更佳。IL-3之濃度可為例如：5~100ng/ml，30~70ng/ml更佳。TPO之濃度可為例如：1~25ng/ml，1~10ng/ml更佳。Flt3-配體之濃度可為例如：10~100ng/ml，30~70ng/ml更理想。GM-CSF之濃度可為例如：5~250ng/ml，50~200ng/ml更理想。M-CSF之濃度可為例如：5~100ng/ml，30~70ng/ml更理想。IL-4之濃度可為例如：3~100mg/ml，10~70ng/ml更理想。TNF-α之濃度可為例如：0.05~50ng/ml，0.1~20ng/ml更理想。LPS的情形，可為例如：0.01~100μg/ml，0.1~10μg/ml更理想。該等增殖因子、造血因子、細胞激素等也可因應目的而適當組合使用，最適之濃度可由該技術領域中具有通常知識者適當決定。
又，欲評價之(目標)蛋白質之濃度可因應目的而為例如能鑑定該蛋白質之抗原決定位之濃度，或可為能夠評價該蛋白質在對象(例如哺乳動物，較佳為人)是否有免疫原性之濃度，或可為能刺激未成熟樹狀細胞而誘導成成熟樹狀細胞之濃度，該技術領域中具有通常知識者可以適當決定此濃度。如此的濃度，可為例如0.01~1000μg/ml，0.1~100μg/ml更理想。
該技術領域中具有通常知識者可也考慮對於細胞添加之因子之種類、組合而適當地將各步驟之期間予以最適化，以獲得目的之抗原呈現細胞。前述步驟(a)之期間可為例如：2日以上，2~10日較理想，5~8日更理想。前述步驟(b)之期間可為例如：1日以上，20~200日較理想，50~150日更理想。前述步驟(c)之中，前述步驟(ci)之期間可為例如：1日以上，1~10日較理想，4~6日更理想。前述步驟(cii)之期間可為例如：12 小時以上，12~36小時較理想，24小時(1日)更理想。前述步驟(d)之期間可為例如：1日以上，1~20日較理想，例如可於第5~15日，使巨噬細胞進一步分化為M1巨噬細胞或M2巨噬細胞。但是該技術領域中具有通常知識者當然可考慮各培養條件而適當決定最適培養期間。
又，本發明也可關於包括前述步驟(a)~(c)之從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞於活體外(in vitro)製造樹狀細胞之方法，及由該方法獲得或能獲得之樹狀細胞。亦即，該方法製造之樹狀細胞不只表現MHCII分子，還表現協助者T細胞之共刺激分子CD80、CD86並表現糖鏈受體CD206、CD209，故啟示有協助者T細胞活化能力及對於病毒等之抵抗性。利用使用該方法獲得之樹狀細胞之蛋白質之抗原決定位之序列解析可期待貢獻於免疫原性低之蛋白質之開發，此外也成為對於自體免疫疾病、對於病毒等之抗原呈現細胞之研究之優良材料。
亦即，本發明就其他態樣而言例如提供以下態樣：
[23]一種從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞於活體外製造樹狀細胞之方法，包含以下步驟：(a’)使幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化而獲得中胚層前驅細胞；(b’)使該中胚層前驅細胞於含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之無血清培養基分化而獲得單核球細胞；及(c’)於無血清培養基使該單核球細胞分化而獲得未成熟樹狀細 胞，並視情形進一步刺激該未成熟樹狀細胞而獲得成熟樹狀細胞。
[24]如[23]之方法，其中，該步驟(c’)包含步驟((c1’)並視情形包含(c2’)；(c1’)使該單核球細胞於含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及介白素4(IL-4)之無血清培養基分化而獲得未成熟樹狀細胞；(c2’)使該未成熟樹狀細胞和免疫原接觸並視情形和發炎性細胞激素接觸而誘導為成熟樹狀細胞。
[25]一種樹狀細胞，係利用如[23]或[24]之方法獲得。
[26]如[25]之樹狀細胞，其中，除了表現MHCII分子更表現CD80、CD86、CD206及CD209中之至少一者。
[27]如[26]之樹狀細胞，表現CD80、CD86、CD206及CD209全部。
[28]一種細胞組成物，包含如[25]至[27]中任一項之樹狀細胞。
前述樹狀細胞或前述細胞組成物也可作為為了實施對付傳染病或惡性腫瘤之免疫細胞療法或為了治療自體免疫疾病或伴隨臓器移植之排斥反應等而控制免疫回應之細胞醫藥。該細胞醫藥為了安定地保持樹狀細胞，可以適當組合使用助劑，例如培養基等。
又，本發明於一態樣，係關於一種鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，包含以下步驟：(A)使目標蛋白質接觸從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分 化之表現主要組織相容複合物(MHC分子)之細胞；(B)從該表現MHC分子之細胞將該目標蛋白質所含之胜肽與MHC分子之複合體予以單離；及(C)從該複合體將該胜肽溶離並鑑定。
該方法可更包含以下步驟：(D)驗證已鑑定之胜肽是否為誘導免疫原性之抗原決定位。該方法可以全程於活體外實施。
又，為了避免檢測到來自血清中之蛋白質之胜肽之胺基酸序列，前述步驟(A)宜於無血清下進行較佳。
使用前述用以鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，可比較例如在不同蛋白質間、不同蛋白質製劑間、或不同生物醫藥品間之免疫原性(或抗原性)之程度。再者，也可利用在製造之蛋白質之品質管理。
本發明中，為了獲得例如100ng MHC分子所必要之表現MHC分子之細胞之細胞量，取決於細胞數、MHC分子之表現強度、表現之程度，可以由該技術領域中具有通常知識者決定適當最適的細胞量。
MHCII分子之各同種異型(例如：HLA-DQ1)能保持大約500~1000個不同的胜肽斷片(Chicz R M et al.,J Exp.Med.1993,178,27-47；Chicz R M & Urban R G,Immunol.Today,1993,15,155-160)。但是該等不同的胜肽中的大部分只有非常少的副本數，所以在活體內發揮生理學作用的可能性不大高。另一方面，涉及免疫原性且例如活化協助者T細胞之胜肽斷片會達到中程度~高之副本數(Latek R R & Unanue E R, Immunol.Rev.1999,172：209-228)。該等中程度~高之副本數之胜肽，占從MHCII分子溶離之胜肽總量之約40~50%，相當於約10~200個之各個胜肽。
許多和MHCII分子形成複合體之胜肽斷片，係就共同具有對於以T細胞受體認識所不可欠缺的大約10~13個共通核心序列且2~5個C末-及N末被截斷之變異體的形式呈現(Rudensky AY et al,Nature 1992,359,429-431；Chicz et al.Nature 1992,358：764-768)。該等變異體構成相同的抗原決定位。其係指重要的不同的抗原決定位的數實際上更少，例如：約5~70個之範圍。
前述胜肽係來自目標蛋白質(之胺基酸序列)且能和抗原呈現細胞(具體而言，是表現MHC分子之細胞)表面上之MHC分子形成複合體之胜肽。該胜肽也可以和細胞內或細胞外之MHC分子結合。MHCII分子之各同種異型可以和多樣胜肽形成複合體，進行溶離之各胜肽之序列決定所須之胜肽量例如可以只有飛莫耳(femtomol)量。依本發明之方法，例如可從約0.1~5μg之MHC分子單離出約飛莫耳量之結合於該分子之胜肽斷片，並且鑑定該胜肽之序列。
為了從抗原呈現細胞將MHC分子與前述胜肽之複合體單離，可將該細胞之細胞膜可溶化。該溶解可使用該技術領域中具有通常知識者公知之方法，例如：冷凍熔解、界面活性劑之使用、或組合此等方法而實施。界面活性劑可使用例如：Triton X-100(TX100)、Nonidet P-40(NP-40)、Tween20、Tween80、正辛基糖苷、ZWITTERGENT、Lubrol、或CHAPS。 細胞細片及核可利用離心分離而從已可溶化之包括MHC分子-胜肽複合體之細胞溶解物除去。
也可對於已可溶化之包括MHC分子-胜肽複合體之細胞溶解物進行免疫沈降或免疫親和性層析而將MHC分子-胜肽複合體精製。免疫沈降或免疫親和性層析用途，可使用對於MHC分子為專一性且適合該等方法之抗體(抗MHCI分子抗體，例如：抗HLA-A抗體、抗HLA-B抗體、抗HLA-C抗體、或抗HLA-ABC抗體等；或抗MHCII分子抗體，較佳為抗HLA-DR抗體、抗HLA-DQ抗體或抗HLA-DP抗體)。該專一性抗體宜為單株抗體較佳，也可以共價鍵或非共價鍵地例如介由Protein A而鍵結於珠粒(例如Sepharose珠粒或瓊脂糖珠粒)。例如可以使抗體之胺基以共價鍵鍵結於經CNBr活化之Sepharose並使其固層化。該單株抗體可購買市售品或可使用Protein A-或Protein G-親和性層析而從對應的各融合瘤細胞之上清精製。
MHC分子之免疫分離(immunoisolation)例如可以將抗體-珠粒和細胞溶解物一起邊旋轉邊溫育數小時以進行。又，已結合MHC分子-胜肽複合體之抗體-珠粒之洗滌也可於Eppendorf管內進行。免疫沈降之結果，可使用認識已改性之MHC分子之抗體而以SDS-PAGE及西方點墨法進行解析。
藉由將已和MHC分子形成複合體之胜肽溶離，可獲得來自目標蛋白質並已被抗原呈現細胞分解之胜肽之混合物。
該胜肽也可使用該技術領域中具有通常知識者公 知之方法，例如以稀釋之酸、例如稀釋之乙腈(Jardetzky T S et al.,Nature 1991 353,326-329)、稀釋之乙酸及加熱(Rudensky A Y et al.,Nature 1991,353,622-626；Chicz R M et al,Nature 1992,358,764-768)、或稀釋之三氟乙酸(Kropshofer H et al.,J Exp Med 1992,175,1799-1803)進行溶離。胜肽宜以稀釋之三氟乙酸於例如37℃溶離較佳。
在從MHC分子-胜肽複合體將胜肽溶離之前，為了將殘留的界面活性劑除去，也可以用水或低鹽緩衝液洗滌。低鹽緩衝液可使用濃度0.5~10mM之Tris緩衝液、磷酸緩衝液、或乙酸緩衝液。或，MHC分子-胜肽複合體也可以用HPLC用之超高純度水洗滌。該洗滌也可以利用超過濾進行。超過濾可於具有例如：30kD、20kD、10kD、或5kD之截止(cutoff)值及0.5~1.0ml之管體積之超過濾管內進行。超過濾管內之洗滌可以用保持MHC分子-胜肽複合體之珠粒之體積數十倍之體積進行例如：4~12次。
也可使用此超過濾管從MHC分子-胜肽複合體將胜肽溶離。其次，也可將已溶離之胜肽利用冷凍乾燥或離心蒸發器進行乾燥。
藉由將已溶離之胜肽之混合物利用液體層析質量分析(LC/MS)分級並進行序列解析，進行各胜肽(之胺基酸序列)之鑑定亦可。
可利用序列解析，將胜肽混合物中之各胜肽之胺基酸序列利用就飛莫耳量之胜肽進行定序充分公知之方法進行。
利用鑑定可得知來自胜肽之蛋白質、及該胜肽來自該蛋白質中的哪個序列。
已溶離之胜肽之混合物，例如宜組合逆相層析與陰離子交換層析或陽離子交換層析，或以逆相層析單獨進行分級較佳。分級可以使用在質量分析計之奈米流電灑(nanoflow electrospray)供給源，或在MALDI解析用板上連接點畫出級分之微分級裝置中之任一者的利用融合矽土微毛細管柱(fused-silica micro-capillary column)之HPLC模式進行。
質量分析技法可使用電灑離子化串聯型質量分析(ESI-MS)或MALDI-post source decay(PSD)MS，ESI-MS為較佳。
各胜肽之胺基酸序列解析可使用該技術領域中具有通常知識者公知之各種方式決定。序列解析，也可利用使用了例如MASCOT演算法或SEQUEST演算法之胜肽斷片光譜之電腦解析進行。該等演算法，為了進行實驗及理論製作之串聯質量光譜之相互相關解析，宜為使用蛋白質及核苷酸序列數據基礎者較佳。藉此，可進行自動化高通量序列解析。
為了進行溶離獲得之全部胜肽之定性分析，也可進行基質輔助雷射脫附游離飛行時間質量分析(MALDI-TOF)。利用MALDI-TOF解析，可以提供關於胜肽混合物之複雜性及主要胜肽之存在之大致概要。
為了推定從和MHC分子之複合體溶離之各單一胜肽之量，也可以將微毛細管柱之通過物於214nm之檢測波長使用UV檢測器進行解析。將欲解析之胜肽之峰部面積和階段性 量之標準胜肽(對照)之峰部面積比較而推定胜肽之量亦可。
藉由從MHC分子將胜肽溶離，可獲得來自目標蛋白質且在抗原呈現細胞中天然地斷片化的胜肽的集合。為了鑑定出偽陽性胜肽並加以排除，宜除了暴露於目標蛋白質之抗原呈現細胞之集合，更準備作為陰性對照之未暴露於目標蛋白質之抗原呈現細胞之集合並進行比較解析較佳。也可和未暴露於目標蛋白質之抗原呈現細胞比較，將能只在暴露於目標蛋白質之抗原呈現細胞檢測出之胜肽鑑定作為胜肽所來源之蛋白質之抗原決定位的作用，並鑑定其有抗原性。
已鑑定之胜肽，可以將MHC結合模體、MHC結合能力、或利用協助者T細胞所為之認識等作為指標，而驗證是否作為抗原決定位之作用。或，也可以適當組合電腦模擬(in silico)之抗原決定位預測演算法。
MHC結合模體，係指為了和MHC分子形成安定複合體所須之和特定MHC分子(對偶基因多型)結合之胜肽共通之結構特徵。為MHCII分子之情形，胜肽長為12~18個胺基酸且為各式各樣，因胜肽結合溝之兩端開放，即便更長胜肽也能結合。在許多MHCII分子，涉及結合之最多4個殘基(稱為「錨定殘基」)可以容納在9元體之核區域(nonameric core region)包括的相對位置：P1、P4、P6、及P9中。但是此核區域距胜肽之N末端的距離可能會變動。於許多情形，2~4個N末端殘基位在核區域之前。因此P1錨定殘基會位在能和MHCII分子形成複合體之許多胜肽之位置3、4、或5。例如從HLA-DR分子溶離之胜肽可能共有如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、甲硫 胺酸、白胺酸、異白胺酸、或纈胺酸之疏水性P1錨定殘基。錨定殘基之位置及種類可以從頻繁出現的MHC分子的胜肽結合模體推定。胜肽序列之模體驗證可用的電腦演算法可以從例如：「Tepitope」(www.vaccinome.com、J.Hammer,Nutley、USA)取得。
MHC結合能力也可使用檢測出之胜肽本身(例如也可使用合成胜肽)和所望之MHC分子，依該技術領域中具有通常知識者公知之方法驗證(Kropshofer H et al.,J.Exp.Med.1992,175,1799-1803；Vogt A B et al.,J.Immunol.1994,153,1665-1673；Sloan V S et al.,Nature 1995,375,802-806)。或也可使用利用表現MHC分子之細胞株與已生物素化之胜肽之細胞結合分析法來驗證MHC結合能力(Arndt S O et al,EMBO J.,2000,19,1241-1251)。胜肽向MHC之相對結合能力，可藉由測定使加標識之報告體胜肽之結合減少至50%所須之濃度(IC50)以決定。又，胜肽可使用已鑑定之各胜肽，或也可使用具有和鑑定之胜肽共通之序列(核心序列)之胜肽。又，據認為檢測之胜肽依存於MHC分子之同種異型種類、對於MHC分子之結合親和性之強度等。
刺激協助者T細胞之能力在驗證已鑑定之胜肽是否作為抗原決定位作用方面特別重要。當鑑定之胜肽會刺激協助者T細胞時，可作為判定該胜肽具免疫原性之指標之一。就該判定方法而言，可以測試依本發明之方法鑑定之胜肽是否有活化協助者T細胞之能力。又，胜肽可使用已鑑定之各胜肽，或使用具有和已鑑定之胜肽共通之序列(核心序列)之胜肽。
協助者T細胞之細胞回應可依該技術領域中具有通常知識者公知之各種活體外的方法測定。例如在欲評價之胜肽存在下同時培養協助者T細胞及表現MHC分子之細胞(例如單核球、巨噬細胞、或樹狀細胞等)，將協助者T細胞之細胞增殖作為指標，測定DNA複製時是否有帶入經放射性物質標定之胸腺嘧啶(T)。或可將胸腺嘧啶替換為使用5-溴-2'-去氧尿苷(BrdU)，於此情形，可將DNA複製時帶入了BrdU之協助者T細胞以對抗BrdU之單株抗體處理，然後，使用酵素或經螢光標記之二次抗體來測定BrdU之帶入量(例如：5-Bromo-2’-deoxyuridine Labeling & Detection Kit III,Roch-Biochem,Cat No.1 444 611)。或也可使用將因協助者T細胞之增殖造成之螢光色素標籤5,6-羧基螢光素二乙酸琥珀醯亞胺基酯(5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)稀釋作為指標之流式細胞儀法之Naive Primary T cell Assay(Proimmune)進行測定。或不測定細胞增殖而是測定從協助者T細胞產生之各種細胞激素，以評價協助者T細胞之細胞回應亦可。如此的細胞激素，例如：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、或轉形生長因子(Transforming growth factor)-β(TGF-β)。細胞激素之測定法可列舉該技術領域中具有通常知識者公知之各種方法，例如：ELISA或ELISPOT等。
作為表現MHC分子之細胞，較佳為使用在本發明如前述，依從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞製造樹狀細胞之方法製造之樹狀細胞。表現MHC分子之細胞可以於分析之前利用以例如電離放射線或絲裂黴素C進行處理使成為非增殖 性。
又，本發明於另一態樣，係關於免疫原性減少或消失之蛋白質之製造方法，包含以下步驟：(1)依上述方法鑑定蛋白質之抗原決定位；(2)修飾該抗原決定位以使對於MHC分子之結合減少或消失；及(3)製造具有經修飾之抗原決定位之蛋白質。
又，本發明於其他態樣，也關於依前述製造方法獲得之(obtained)蛋白質、或能獲得之(obtainable)蛋白質。「能獲得之(obtainable)蛋白質」係指若使用前述製造方法能獲得之蛋白質。
關於前述步驟(2)，對於抗原決定位已鑑定之胜肽可進行抗原決定位之胺基酸序列之改變或修飾以使向MHC分子之結合減少或消失、或使免疫原性減少或消失。免疫原性之減少或消失只要是該技術領域中具有通常知識者公知之方法即可，並無特殊限定，例如可將上述MHC結合模體、MHC結合能力、或利用協助者T細胞所為之認識等作為指標來決定。或可適當組合電腦模擬(in silico)之抗原決定位預測演算法。
該改變或修飾可依該技術領域中具有通常知識者公知之方法進行。例如：將編碼為包括抗原決定位之蛋白質之胺基酸序列的DNA核苷酸序列中，DNA序列之所望之一或多數核苷酸使用例如部位專一性變異導入法、相同重組法使其插入、取代、或缺失等亦可。例如能將對於MHC分子之結合重要之一或多數錨定殘基改變為其他胺基酸殘基，並藉此使免疫 原性減少或消失者較佳。或，例如可將對於協助者T細胞之利用T細胞受體、或B細胞之利用B細胞受體等認識抗原決定位時為重要之胺基酸殘基改變為其他胺基酸殘基。用以交換在對於MHC分子之結合為重要之錨定殘基之方法，係該技術領域中具有通常知識者周知。例如可以用丙胺酸、脯胺酸、甘胺酸或帶電胺基酸殘基來去代HLA-DR1拘束性T細胞抗原決定位之P1錨定(Kropshofer et al.,EMBO J.15,1996,6144-6154)。
關於前述步驟(3)，具有經修飾之抗原決定位之蛋白質可以用化學合成，也可用基因或生物學方式合成。以基因或生物學方式合成時，可利用將具有已修飾之抗原決定位之蛋白質之基因暫時性或永續性保持之寄主細胞、動物。寄主細胞、動物可作為例如用以製造、表現蛋白質之產生系使用。寄主細胞也可使用真核細胞或原核細胞。
能作為寄主細胞使用之真核細胞，例如：動物細胞、植物細胞、真菌細胞。動物細胞可列舉哺乳類細胞，例如：CHO(Puck et al.,(1958)J.Exp.Med.108(6)：945-956)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤、BHK(baby hamster kidney)、HeLa、Vero等、兩生類細胞例如非洲爪蟾卵母細胞(Valle et al.,Nature(1981)291：338-340)、及昆蟲細胞例如：Sf9、Sf21、Tn5。動物細胞中，當以大量表現為目的時，宜使用CHO細胞為較佳。向寄主細胞導入具經修飾之抗原決定位之蛋白質之基因的載體的方法，例如磷酸鈣法、DEAE葡聚糖法、使用陽離子微脂體DOTAP(Boehringer Mannheim製)之方法、電穿孔法、或脂轉染等方法。植物細胞，例如已知有煙草(Nicotiana tabacum) 來源之細胞及浮萍(Lemna minor)為蛋白質生產系，可藉由將該等細胞以培養癒傷組織的方法使其產生蛋白質。真菌細胞可使用酵母例如：糖化酵母(Saccharomyces)屬之細胞(啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、畢氏酵母(Saccharomyces pombe)等)、或絲狀菌例如：麴菌(Aspergillus)屬之細胞(黑麴菌(Aspergillus niger)等)之蛋白質表現系。使用原核細胞時，也可使用採用細菌細胞之產生系。細菌細胞，例如可使用大腸菌(E.coli)、枯草菌。
動物，例如基因重組動物或基音轉殖動物，動物種類無限定，可使用例如牛、羊、小鼠等。於此情形，可以例如使蛋白質分泌到乳等體液後回收。
本發明中，具有經修飾之抗原決定位之蛋白質可以連續或商業化地大量生產。生產之蛋白質、或含該蛋白質之組成物(例如：醫藥組成物)也包括在本發明。
又，本發明於另一態樣係關於預測蛋白質在對象中是否有免疫原性之方法， 包含以下步驟：(I)提供表現欲投予目標蛋白質之對象之MHC分子之1或多數同種異型之細胞，該細胞係從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化；(II)使目標蛋白質接觸該「表現MHC分子之1或多數同種異型之細胞」；(III)從該「表現MHC分子之1或多數同種異型之細胞」將該目標蛋白質所含之胜肽與MHC分子之複合體予以單離； (IV)從該複合體將該胜肽溶離並鑑定；及(V)視情形，驗證鑑定之胜肽是否為誘導免疫原性之抗原決定位；該鑑定之胜肽為誘導免疫原性之抗原決定位時，則指示該目標蛋白質在該對象具有免疫原性。
該技術領域中具有通常知識者能理解：前述預測方法可適當組合本說明書之上述說明之一或多數技術特徵而實施。
前述預測方法也可依據針對預定蛋白質之MHC分子之各同種異型或同種異型之集合而比較是否有免疫原性或程度。
前述預測方法宜提供表現前述對象之MHC分子之一或多數同種異型之一或多數細胞以包括前述對象擁有之MHC分子之同種異型之全部集合。前述幹細胞宜為來自前述對象(例如哺乳動物，較佳為人)之幹細胞(例如iPS細胞、ES細胞)。原因為：在使幹細胞分化而得之抗原呈現細胞中保守著MHC分子之同種異型，所以藉由使用來自前述對象之幹細胞，能夠製造具備該對象擁有之MHC分子之同種異型之全部集合之抗原呈現細胞。藉由使用該抗原呈現細胞，也能分別評價各對象(例如：人患者、健常人)之目標蛋白質是否有免疫原性(個別化醫療之實現)。換言之，該預測方法也係關於具有免疫原性之對象(例如患者)之選擇方法、或不具免疫原性之對象(例如患者)之選擇方法。或該預測方法也係關於指示MHC分子之一或多數特定同種異型因為和欲投予之蛋白質間之關係而涉及 免疫原性之方法。
規定MHC分子之同種異型(於人，為HLA基因型)之基因據認為在同一個體之體細胞大致為保守性。因此來自前述對象(例如哺乳動物，較佳為人)之幹細胞(例如iPS細胞、ES細胞)只要保守著MHC分子之同種異型，也可從前述對象之各種體細胞等製作。體細胞之例無特殊限定，例如也可從人等分離之PBMC製作iPS細胞。如此的報告，例如：Soares FA,Pedersen RA,Vallier L.,Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Sendai Virus,Methods Mol Biol.2015 Feb 17；Quintana-Bustamante O,Segovia JC.,Generation of Patient-Specific induced Pluripotent Stem Cell from Peripheral Blood Mononuclear Cells by Sendai Reprogramming Vectors,Methods Mol Biol.2014 Dec 19；Su RJ,Neises A,Zhang XB.,Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors,Methods Mol Biol.2014 Nov 18；Riedel M,Jou CJ,Lai S,Lux RL,Moreno AP,Spitzer KW,Christians E,Tristani-Firouzi M,Benjamin IJ.,Functional and pharmacological analysis of cardiomyocytes differentiated from human peripheral blood mononuclear-derived pluripotent stem cells,Stem Cell Reports.2014 May 29；3(1)：131-41.。又，從iPS細胞等幹細胞建立樹狀細胞等抗原呈現細胞之方法，已於本說明書列舉，有多數方法為人報告。因此若為該技術領域中具有通常知識者當然能理解： 例如可從預定對象(例如人患者)分離之PBMC等細胞製作iPS細胞等幹細胞後，使用該幹細胞建立樹狀細胞等抗原呈現細胞，將該細胞利用於前述預測方法。此時，作為在iPS細胞等幹細胞之製作時使用之前述對象來源之細胞，可為能指定MHC分子之同種異型(人中為HLA基因型)之細胞、已預先知曉(或能預測)MHC分子之同種異型細胞。或也可使用已預先知曉(或能預測)MHC分子之同種異型之iPS細胞。
本發明於另一態樣，係關於一種含有蛋白質作為有效成分之用於治療及/或預防對象之和前述蛋白質相關連之疾病之組成物，其特徵為：前述對象係(只)從依前述預測方法預測對於前述蛋白質無免疫原性之對象選擇。該「治療及/或預防用組成物」宜含有對於治療及/或預防有效量之蛋白質較理想，該技術領域中具有通常知識者能適當決定蛋白質之有效量。又，該「治療及/或預防用組成物」也可包括一或多數其他藥劑。
用語「預測對於蛋白質無免疫原性」，也係指目標蛋白質在對象不引起免疫原性、或只會引起從有效性、安全性等之觀點能容許之程度的免疫原性。
藉由配合人種、民族、集團、或個人而準備表示MHC分子之一或多數同種異型之細胞並評價蛋白質之免疫原性，以只對預測不具免疫原性之對象投予該蛋白質、或含有該蛋白質作為有效成分之治療及/或預防用組成物較佳。該組成物為醫藥組成物較佳。
使(醫藥)組成物含有該蛋白質而使用時，可依公知 之製劑學製造法予以製劑化後使用。例如：視需要以施以糖衣之錠劑、膠囊劑、酏劑、或微膠囊劑的形式經口，或於水或水以外之藥學上可容許之液中含有該蛋白質之無菌性溶液或懸浮液之形態以非經口的(例如：經皮的、鼻腔內的、經支氣管的、肌內的、或靜脈內)的方式使用。該(醫藥)組成物中可適商含有藥學上可容許之擔體、香味劑、賦形劑、載運劑(vehicle)、防腐劑、安定劑、或黏結劑而製造。能混合在錠劑、膠囊劑之添加劑，例如明膠、玉米澱粉、黃耆膠、阿拉伯膠之類之黏結劑、結晶性纖維素之類之賦形劑、玉米澱粉、明膠、藻酸之類之膨化劑、硬脂酸鎂之類之潤滑劑、蔗糖、乳糖或糖精之類之甘味劑、薄荷、冬青油或櫻桃之類之香味劑。調劑單位形態為膠囊時，除了上述材料可更含有如油脂之液狀擔體。注射用之無菌性溶液可使用如注射用蒸餾水之載運劑，依該技術領域中具有通常知識者周知之方法配方。注射用之水溶液，例如生理食鹽水、葡萄糖、含其他輔助藥之等張液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇。再者，也可以併用適當的溶解輔助劑，例如如乙醇之醇、丙二醇或聚乙二醇之類之多元醇、聚山梨糖醇酯80(TM)或HCO-50之類之非離子性界面活性劑。也可併用油性液，例如：麻油、大豆油，溶解輔助劑例如：苯甲酸苄酯或苯甲醇。又，也可以摻合例如磷酸鹽緩衝液或乙酸鈉緩衝液之類之緩衝劑、例如鹽酸普卡因之類之止痛劑，例如苯甲醇或苯酚之類之安定劑、或抗氧化劑。調製之注射液通常填充在適當的安瓿後使用。
該蛋白質、或含有該蛋白質作為有效成分之治療 及/或預防用組成物之投予量、投予方法、投予間隔等會因患者之體重、年齡、症狀等而變動，該技術領域中具有通常知識者可適當選擇並決定。
前述「和蛋白質相關連之疾病」中，蛋白質、及和該蛋白質相關連之疾病無特殊限定。蛋白質只要是當對於活體內投予時不產生例如免疫原性、有效性或安全性之問題的蛋白質則更理想。又，疾病無特殊限定，例如：自體免疫疾病(例如類風濕性關節炎、第I型糖尿病、多發性硬化症(MS)、脂瀉病、重症肌無力(MG)或全身性紅斑狼瘡(SLE))、癌症(例如黑色素瘤、乳腺癌、B細胞淋巴瘤、前列腺癌、腎癌)或傳染病(例如，HIV引起之疾病、C型病毒肝炎、麻疹病毒、分支桿菌)。
如此之蛋白質及和該蛋白質相關連之疾病之組合，例如：Self/Nonself 2010；1(4)pp.314-322；PHARM TECH JAPAN Vol.28,No.10(2012),pp.117(2065)-126(2074)；Sorensen,P.S.,et al.,Neurology,67(9),1681-3(2006)；Hesse,D.,et al.,Eur.J.Neurol.,14(8),850-9(2007)；Casadevall,N.,et al.,N.Engl.J.Med.,346(7),469-75(2002)；Gershon,S.K.,et al.,N.Eng.J.Med.,346(20),1584-6(2002)；Locatelli F.,et al.,Perit.Dial.Int.,27(Supp12),S303-7(2006)記載之例。
例如：蛋白質及和該蛋白質相關連之疾病之具體組合並不限定，分別可列舉：與異體移植排斥；Abciximab與PTCA附屬物；Rituximab與非何杰金氏淋巴瘤；Daclizumab與移植排斥；Trastuzumab與乳癌；Palivizumab與RSV預防； Basiliximab與移植排斥；Infliximab與類風濕關節炎或克羅恩病；Arcitumomab與大腸癌；Canakinumab與Cryopirin關連性周期性症候群；Fanolesomab與闌尾炎之成像；Imciromab與MI之心臟成像；Capromab與前列腺癌診斷；Nofetumomab與SCLC之檢測；Gemtuzumab與急性髓性白血病；Alemtuzumab與B細胞慢性淋巴細胞性白血病；Ibritumomab與非何杰金氏淋巴瘤；Adalimumab與類風濕關節炎、克羅恩病、PsA、JIA、強直性脊柱炎或牛皮癬；Omalizumab與哮喘；Efalizumab與銀屑病；Tositumomab與非何杰金氏淋巴瘤；Cetuximab與大腸癌；Bevacizumab與大腸癌、乳癌、腎癌或NSCL癌；Panitumumab與大腸癌；Ranibizumab與黃斑退化病變；Eculizumab與陣發性夜間血紅素尿症；Natalizumab與多發性硬化症(MS)或克羅恩病；Golimumab與類風濕關節炎，PsA，強直性脊柱炎；Cetolizumab pegol與類風濕關節炎或克羅恩病；Ofatumumab與CLL；Ustekinumab與牛皮癬；Tocilizumab與類風濕關節炎；Denosumab與骨質疏鬆；Prolastin與α1-抗胰蛋白酶缺乏症；Aralast與α1-抗胰蛋白酶缺乏症；Zemaira與α1-抗胰蛋白酶缺乏症；Kogenate FS與A型血友病；ReFacto與A型血友病；Zyntha與A型血友病；NovoSeven與血友病；Benefix與血友病B；ATryn與血栓栓塞；BabyBIG與嬰兒肉毒桿菌中毒(Infant botulism)；Berinert與血管性水腫(Angioedema)；Cinryze與血管性水腫；Rhophylac與ITP；Evithrom與凝血；Recothrom與凝血；Wilate與凝血；Cerezyme與高雪氏(Gacher)症；Exenatide或Byetta與第II型糖尿病；IntronA與白血病、卡波西肉瘤、 B/C型肝炎；Betaseron與多發性硬化症；NovoLog與第II型糖尿病；Leukine與癌之預防感染；NEUPOGEN與癌之預防感染；Retavase與心肌梗塞或肺栓塞；Humatrope與侏儒症；Adagen與先天性免疫不全；Pulmozyme與囊性纖維化；Procrit與慢性腎疾病之貧血；Proleukin與腫瘤等。
本發明於另一態樣，係關於[30]一種和蛋白質相關連之疾病之治療及/或預防方法，包括對於前述治療及/或預防為必要之對象投予前述蛋白質之步驟，且前述對象係(只)從依前述預測方法預測為對於前述蛋白質無免疫原性之對象選擇。
本發明於另一態樣，係關於：[31]一種前述蛋白質之用途，係使用在製造和蛋白質相關連之疾病之治療及/或預防用醫藥，前述治療及/或預防之對象係(只)從依前述預測方法預測為對於前述蛋白質無免疫原性之對象選擇。
本發明於另一態樣係關於幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞、或、從其分化之表現MHC分子之細胞在前述本發明之各種方法之用途。
該技術領域中具有通常知識者當然能理解該等本發明能將本說明書說明之一或多數技術特徵適當組合而實施。
該技術領域中具有通常知識者當然可理解：將本說明書記載之一或多數態樣任意組合者只要是基於該技術領域中具有通常知識者之技術常識於技術上無矛盾，則包括在本發明。
本說明書使用之用語係使用在說明特定之實施態樣，不理解為意欲限定發明。若非明示有不同之定義，本說明書使用之用語(包括技術用語及科學用語。)解釋為和本發明所屬之發明所屬之技術領域中該技術領域中具有通常知識者廣泛理解的含意相同，且不應被理想化或以過度形式的含意解釋。
本說明書使用之用語「包含」，除了從上下文應明確理解有不同含意的情形外，係意指存在記述之事項(構件、步驟、要素、數字等)，且不排除存在其他事項(構件、步驟、要素、數字等)。
本發明之實施態樣有時參照示意圖說明，但為了明確說明，有時會誇張表現。
本說明書記載之全部文獻(專利文獻、非專利文獻)可將其全部內容援用於本說明書作為參照，該技術領域中具有通常知識者參照技術常識可適當參酌內容並理解本發明。
本說明書記載之數值只要不違反上下文，可依該技術領域中具有通常知識者之技術常識理解為係有一定範圍之值。例如「1mg」之記載可理解為「約1mg」，且包括一定之變動量。又，本說明書中，當記載為例如：「1~5個」時，只要不違反上下文，可理解為分別具體記載「1個、2個、3個、4個、5個」之值。
以下將本發明參照實施例更詳細說明。但是本發明能以各種態樣實現，不解釋為限定於在此記載之實施例。
本說明書及申請專利範圍中，有時候未特別明 示，只要上文不矛盾，則本說明書及申請專利範圍記載之各名詞所代表之對象意指也可存在一或多數。
【實施例】
A.方法
-使用細胞-
人iPS細胞：Tic(JCRB1331)，從JCRB細胞庫導入；201B7，由iPS AcademiaJapan(股)公司導入。
餵養細胞：EmbryoMax初級小鼠胚胎纖維母細胞(MEF)，潮黴素抗性(Hygro resistant)，C57BL/6(由日本Millipore購入，Cat.：PMEF-HL)；SNL 76/7餵養細胞(SNL)(由Cell Biolabs,Inc購入，Cat.：CBA-316)。
-維持人iPS細胞(Tic)之未分化之培養方法-
1.使以蒸餾水稀釋成0.1%之來自豬皮之明膠(SIGMA，Cat.：G1890)加溫成溶膠狀，於60mm培養皿各加入2mL，並於37℃，5%CO2條件下放置30~180分鐘，製成明膠包被培養皿。
2.將餵養細胞(MEF)懸浮於加入了胚胎幹細胞胎牛血清(FBS)(Gibco，Cat.：10439-024)10%，L-麩醯胺酸(Invitrogen，Cat.：25030-081)2mM，盤尼西林/鏈黴素(Invitrogen，Cat.：15140-122)0.5%之DMEM(Gibco，Cat.：10569-010)，稀釋成1~2×105cells/mL，於明膠包被培養皿各接種4mL，於37℃，5%CO2條件下培養1日。
3.使用加入成鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)(WAKO，Cat.：064-04541)為10ng/mL之iPSellon(cardio，Cat.：007101)，以已接種餵養細胞之60mm培養皿，於37℃，5%CO2條件下實 施維持人iPS細胞之未分化之培養。
4.因應細胞之增殖，將已產生分化之群落以刮板除去，使其和中性蛋白酶、第I級(Roche Applied Science,Cat.：04 942 086 001)2U/mL反應，將先前剝離之餵養細胞從培養皿除去後，將人iPS細胞之群落使用刮板從培養皿回收，懸浮在已加入了bFGF使成為10ng/mL之iPSellon，並重新接種在已接種餵養細胞之60mm培養皿，於37℃，5%CO2條件下繼續培養。
-維持人iPS細胞(201B7)之未分化之培養方法-
1.將以蒸餾水稀釋為0.1%之來自豬皮之明膠加溫成溶膠狀，於60mm培養皿各添加2mL，於37℃，5%CO2條件下放置30~180分，製成明膠包被培養皿。
2.將餵養細胞(SNL)懸浮於已添加FBS 7%，L-麩醯胺酸2mM，盤尼西林/鏈黴素0.5%之DMEM(Gibco，Cat.：10569-010)，稀釋成1~2×105cells/mL，於明膠包被培養皿各接種4mL，於37℃，5%CO2條件下培養1日。
3.使用已加入bFGF成4ng/mL之靈長類ES細胞培養基(ReproCELL，Cat.：RCHEMD001)，於已接種餵養細胞之60mm培養皿，於37℃，5%CO2條件下實施維持人iPS細胞之未分化之培養。
4.因應細胞之增殖，將已產生分化之群落以刮板除去，使其和中性蛋白酶、第I級2U/mL反應，將先前剝離之餵養細胞從培養皿除去後，將人iPS細胞之群落使用刮板從培養皿回收，懸浮在已加入了bFGF使成為4ng/mL之靈長類ES細胞培養基，並重新接種在已接種餵養細胞之60mm培養皿，於37℃，5%CO2 條件下繼續培養。
-從人iPS細胞分化為單核球樣細胞之方法-
1.將以DMEM(Gibco，Cat.：10569-010)稀釋成40倍之已減少生長因子之Matrigel(BD biosciences,Cat.：356230)於60mm培養皿各添加2mL，於37℃，5%CO2條件下放置12~72小時，製成MG培養皿。
2.使以蒸餾水稀釋成0.1%之來自豬皮之明膠(SIGMA，Cat.：G1890)加溫成溶膠狀，於60mm培養皿各加入2mL，並於37℃，5%CO2條件下放置30~180分鐘，製成明膠包被培養皿。
3.針對維持未分化的狀態培養之人iPS細胞之群落，將中性蛋白酶、第I級(Roche Applied Science,Cat.：04 942 086 001)2U/mL加到培養皿，將先前剝離之餵養細胞從培養皿除去後，將人iPS細胞之未分化群落使用刮板從培養皿回收，懸浮於已添加胚胎幹細胞合格之胎牛血清(FBS)(Life Tech,Cat.：16141)20%，L-麩醯胺酸(Invitrogen，Cat.：25030-081)1%，盤尼西林/鏈黴素(Invitrogen，Cat.：15140-122)0.5%，2-巰基乙醇(Invitrogen，Cat.：21985-023)55μM之MEM Alpha 1x+Glutamax I(Life Tech，Cat.：32561-037)，各接種於已去除上清之明膠包被培養皿4mL，於1小時，37℃，5%CO2條件下培養，使餵養細胞黏附於培養皿底面，和人iPS細胞之群落分離。
4.將人iPS細胞之未黏附群落從明膠包被培養皿全量回收，懸浮於已加入胰島素-運鐵蛋白-硒-X100X(ITS)(Life Tech,Cat.：51500-056)成1/100倍之稀釋倍率之靈長類ES細胞培養基，並對於已去除上清之MG培養皿各接種3mL，於37℃ ，5%CO2條件下實施1日培養(參照第2圖上段左之照片)。
5.從培養皿將培養基全量除去後，添加已將ITS以1/100倍的方式添加、重組人類骨形成蛋白4(rhBMP4)(Humanzyme，Cat.：314-BP)以50ng/mL之方式添加的靈長類ES細胞培養基各7mL，於37℃，5%CO2條件下實施4日培養(參照第2圖上段中央之照片)。
6.從培養皿將培養基全量除去後，添加已將ITS以1/100倍的方式添加，重組人類血管內皮生長因子165(rhVEGF165)(R&D Systems,Cat.：293-VE)40ng/mL，重組人類幹細胞因子(rhSCF)(R&D Systems,Cat.：255-SC)50ng/mL之靈長類ES細胞培養基各4mL，於37℃，5%CO2條件下實施2日培養(參照第2圖上段右之照片)。
7.將培養基全量除去後，於已添加使ITS成為1/100倍，重組人類顆粒球巨噬體群落刺激因子(rhGM-CSF)(Humanzyme,Cat.：HZ-1082)成為100ng/mL，重組人類巨噬體群落刺激因子(rhM-CSF)(Humanzyme,Cat.：HZ-1039)成為50ng/mL之StemPro-34培養基(Life Tech.,Cat.：10640)各5mL，於37℃，5%CO2條件下培養，每隔3~4日更換培養液(參照第2圖下段中央之照片)。
8.將7.項之操作繼續120日。在培養50日左右開始出現非黏附性細胞，以7日~14日1次的頻度回收培養皿中之非黏附細胞，作為單核球樣細胞。
9.將製作之單核球樣細胞之一部分回收，使用抗HLA-DR抗體 (BD biosciences，Cat.：347364)、抗人HLA-DQ抗體(BD biosciences，Cat.：555563)、抗人HLA-DP抗體(Santa Cruz Biotechnology,Cat.：sc-53308)、抗人HLA-ABC抗體(BD biosciences，Cat.：555552)、抗人CD14抗體(BD biosciences，Cat.：558121)、抗人CD80抗體(BD biosciences，Cat.：561134)、抗人CD86抗體(BD biosciences，Cat.：561128)、抗人CD206抗體(BD biosciences，Cat.：551135)、抗人CD209抗體(BD biosciences，Cat.：551545)、抗人CD11b抗體(BD biosciences，Cat.：555388)，及抗人CD11c抗體(BD biosciences，Cat.：340544)染色，並使用流式細胞儀解析裝置BD FACSCanto(商標)II(BD Bioscience)分析。
-使用抗原-
就具免疫原性之蛋白質而言，使用以下的蛋白質作為陽性對照。
(1)為白樺花粉過敏原之Betula verrucosa,birch pollen allergen 1，同功型(Isofrom)a(Bet v1a)(#Bet v 1.0101；Biomay)(胺基酸序列：序列編號1)
(2)Infliximab(商品名：REMICADE(註冊商標)(田邊三菱製藥)(胺基酸序列：重鏈可變區：序列編號2；重鏈不變區：序列編號3；輕鏈可變區：序列編號4；輕鏈不變區：序列編號5)
又，Infliximab已於臨床確認為抗藥物抗體(Anti-drug antibody；ADA)，據認為存在抗原決定位序列(Self/Nonself 2010；1(4)pp.314-322；Current Rheumatology Report 2005；7：3-9；Current Opinion in Monoclonal Thrapeutics 2003；5(2)：172-179)。
(3)重組人類第VIII因子(rhFVIII)(商品名：ADVATE(註冊商標)(Baxter)(胺基酸序列：序列編號112)
rhFVIII已於臨床確認為抗藥物抗體(Anti-drug antibody；ADA)，據認為存在抗原決定位序列(Simon D.Van Haren et al,Mol Cell Proteomics 2011：10：M110.002246)。rhFVIII有通常之IgG抗體之2倍左右的分子量。
(4)Phleum pretense，提摩西草花粉過敏原1(Phl p1)(商品名：Phl p 1.0102(Biomay)(胺基酸序列：序列編號113)
Phl p1為禾本科花粉抗原，據報告有抗原決定位序列(Carla Oseroff et al,J of immunol 2010：185(2)：943-955)。
-熟成為樹狀細胞及暴露於抗原-
1.針對回收之單核球樣細胞，將培養基除去並以細胞濃度1×105cells/mL懸浮於已添加ITS使成為1/100倍，rhGM-CSF成為200ng/mL，重組人類 介白素-4(rhIL-4)(Humanzyme，Cat.：HZ-1075)成為10ng/mL之StemPro-34培養基，於6井板各接種3mL，於37℃，5%CO2條件下實施5日培養。
2.於各井加入Bet v1a 3.3μg/mL或Infiximab 10μg/mL，然後加入重組人類Tumor Necrosis Factor-α(rhTNF-α)(Humanzyme，Cat.：HZ-1014)10ng/mL，於37℃，5%CO2條件下培養1日，製成樹狀細胞樣細胞。rhFVIII，Phl p1之添加，係從各井去除培養上清2mL後，加入rhFVIII 30μg/mL或Phl p1 10μg/mL，然後添加rhTNF-α 10ng/mL，於37℃，5%CO2條件下培養1日，製成樹狀細胞樣細胞。
3.將樹狀細胞樣細胞從6井板全量回收，以1200rpm，5分鐘，4℃旋降後，去除全部上清，懸浮於4℃之DPBS 1mL。其次將全量移到Eppendorf管，以2500rpm，5分鐘，4℃的條件旋降，去除全部上清，製作細胞丸粒，保存在-80℃。
4.將製作之樹狀細胞樣細胞之一部分回收，使用抗人HLA-DR抗體、抗人HLA-DQ抗體、抗人HLA-DP抗體、抗人HLA-ABC抗體、抗人CD14抗體、抗人CD80抗體、抗人CD86抗體、抗人CD206抗體、抗人CD209抗體、抗人CD11b抗體，及抗人CD11c抗體染色，並使用流式細胞儀解析裝置BD FACSCanto(商標)II分析。
-抗HLA-DR珠粒之生成-
1.將抗HLA-DR抗體G46-6(BD Biosciences,Cat.：555809)固定在經CNBr活化的Sepharose珠(GE Healthcare，Cat.：17-0430-01)，使終濃度為1mg/mL，作成抗HLA-DR抗體固層化珠粒。
2.針對抗HLA-DR抗體固層化珠粒，保存在含0.02%疊氮化鈉(Wako，Cat.：190-14901)之PBS(Wako，Cat.：041-20211)中。
-HLA-DR-胜肽複合體之奈米級精製-
1.將已加入Tris(SIGMA，Cat.：T1503-1KG)20mM、MgCl2(MERCK，Cat.：1.05833.0250)5mM並使用HCl(MERCK，Cat.：1.00316.1000)調整成pH7.8之超純水(Wako，Cat.：210-01303)溶液中，加入10% TritonX-100(Roche Diag,Cat.：11332481001)使成為1/10倍、蛋白酶抑制劑混合物(11.6mg/mL PMSF(nakalai,Cat.：27327-94)、1.7mg/mL抑胃肽 (pepstatin)A(SIGMA,Cat.：P4265-25MG),1.7mg/mL抑凝乳蛋白酶素(chymostatin)(Roche Diag,Cat.：11004638001)、0.8mg/mL亮肽素(leupeptin)(SIGMA,Cat.：L9783-25MG)及133mg/mL疊氮化鈉(Wako,Cat.：190-14901)之混合物)使成為17/5000倍，製備為溶解緩衝液。
2.於樹狀細胞樣細胞之冷凍丸粒中將溶解緩衝液以冰冷條件下添加10倍量，以Thermomixer Confort(Eppendorf)以1100rpm，1小時，4℃的條件振盪，取得溶解物。
3.以14000rpm，10分鐘，4℃的條件旋降，將溶解物和細胞片、細胞核分離。
4.將抗HLA-DR抗體固層化珠粒相對於溶解物100μL添加5-10μL，以水平振盪機(horizontal shaker)以1100rpm，4℃的條件振盪一晚，使溶解物中之HLA-DR-胜肽複合體和抗HLA-DR抗體固層化珠粒結合。
5.將已結合於抗HLA-DR抗體固層化珠粒之HLA-DR-胜肽複合體以3000rpm，1分鐘，4℃的條件旋降後，以溶解緩衝液500μL洗滌1次，再以含0.1% Zwittergent 3-12(Calbiochem,Cat.：693015)之PBS 500μL洗滌2次。
-HLA-DR-関連胜肽之溶離-
1.將已結合於HLA-DR抗體固層化珠粒之HLA-DR-胜肽複合體懸浮於400μL之超純水，移到Ultrafree-MC filter(Durapore PVDF,0.22um)(Millipore)，並以14000rpm，10秒，4℃的條件懸降。
2.去除落到管底之超純水，將400μL之超純水加到濾器上，以 14000rpm，10-30秒，4℃的條件旋降，此洗滌操作重複10次。
3.加入含有0.1%三氟乙酸(Thermo Fisher Scientific，Cat.：28904)之超純水60uL，於37℃，30分溫育，從HLA-DR-胜肽複合體使胜肽混合物溶離後，以14000rpm，3分鐘，18℃的條件旋降，將從真空離心機5305C(Eppendorf)溶離之胜肽混合物乾燥。
-利用離子捕集MS/MS質量分析實施之胜肽之序列解析-
1.將已乾燥之胜肽混合物再溶解於含有2%乙腈(Wako,Cat.：018-19853)、0.5%乙酸(MERCK,Cat.：1.00066.0250)、1%甲酸(MERCK，Cat.：1.11670.1000)之超純水15μL將其中的5μL注入到連接於MS之nano-LC Ultimate 3000 RSLCnano system(Dionex)。LC分析條件可使用EP1715343A1記載之條件或和其類似之該技術領域中具有通常知識者公知之條件，並使用已組合逆相材料及離子交換材料之管柱，或逆相材料單獨的管柱，使用適當的緩衝液進行。將HPLC管柱連結於奈米LC電灑離子化源之Orbitrap Elite(Thermo)，依製造商的實驗步驟實施全掃描精密質量分析及利用MS-MS所為之質量分析。
2.胜肽之序列解析利用SEQUEST演算法實施。
B.結果
-已分化之細胞之特性-
第3A圖、第3B圖顯示由流式細胞儀解析獲得之檢查在使用Tic作成之單核球樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。認 為依本實施例獲得之單核球樣細胞有表現單核球之專一性標記CD14，此外，認為T細胞之活化分子CD80、CD86、黏附分子CD11b、CD11c有表現。
第4A圖、第4B圖顯示由流式細胞儀解析獲得之檢查在使用201B7作成之單核球樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。依本實施例獲得之單核球樣細胞和使用Tic作成之單核球樣細胞同樣，認為有單核球之專一性標記CD14表現，此外，認為有T細胞之活化分子CD80、CD86、黏附分子CD11b、CD11c表現。
第5A圖、第5B圖顯示由流式細胞儀解析獲得之檢查在使用Tic作成之樹狀細胞樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。依本實施例獲得之樹狀細胞樣細胞認為有抗原呈現分子HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP及HLA-ABC、樹狀細胞之專一性標記CD206、CD209表現，此外和單核球樣細胞同樣，認為有T細胞之活化分子CD80、CD86、黏附分子CD11b、CD11c表現。CD11c相較於單核球樣細胞時，認為表現有增加。另一方面，單核球之專一性標記CD14之表現減少。各標記之峰部為單一，故認為已均勻地製得有樹狀細胞之特徵之細胞。
第6A圖、第6B圖顯示由流式細胞儀解析獲得之檢查在使用201B7作成之樹狀細胞樣細胞之細胞表面表現之分子之結果。在由201B7製得之樹狀細胞樣細胞，亦和由Tic製得之樹狀細胞樣細胞同樣，認為有抗原呈現分子HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP及HLA-ABC、樹狀細胞之專一性標記CD206，CD209表現。和單核球樣細胞同樣，也認為有T細胞 之活化分子CD80、CD86、黏附分子CD11b、CD11c表現。
-使用Bet v1a之結果-
第7圖顯示將由Tic製得之樹狀細胞樣細胞暴露於Bet v1a時檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果(a)。本實施例中，從暴露於Bet v1a之樹狀細胞樣細胞萃取得之HLA-DR分子所分離之胜肽，檢測到Bet v1a之一部分胺基酸序列。
又，第7圖顯示於Bet v1a無處置時之條件(對照)檢測到之在暴露於Bet v1a時也檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果(b)。
又，該等檢測到之具體胺基酸序列也示於表1A，表1B。表中，抗原決定位編號代表在Bet v1a之胺基酸序列中從N末端起按順序見到的檢測到的胜肽的群。例如抗原決定位編號1檢測到18種胜肽。
【表1A】
(表1A記載之胜肽記載為序列編號6~36。)
(表1B記載之胜肽記載於序列編號37~60。)
2次測定(二重複)大約獲得同樣結果，可獲得再現性(未顯示第2次的數據)。又，在不同時間點(改變回收非黏附性細胞並添加GM-CSF及IL-4之時間點時)實施分化為樹狀細 胞樣細胞並促進HLA-DR等表現之上昇時，也檢測到同樣的胜肽序列(未顯示數據)。
第8圖顯示將由201B7製作之樹狀細胞樣細胞暴露於Bet v1a時檢測到的胜肽之胺基酸序列之解析結果(a)。 本實施例中，從暴露於Bet v1a之樹狀細胞樣細胞萃取得之HLA-DR分子所分離出之胜肽，檢測到Bet v1a之一部分胺基酸序列。
又，第8圖顯示於Bet v1a無處置時之條件(對照)檢測到之暴露於Bet v1a時也檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果(b)。
又，該等檢測到之具體胺基酸序列示於表1C，表1D。表中，抗原決定位編號代表於Bet v1a之胺基酸序列中從N末端起按順序見到的檢測到的胜肽之群。
【表1C】
(表1C記載之胜肽記載於序列編號114~131。)
(表1D記載之胜肽記載於序列編號132。)
2次測定(二重複)獲得大約相同結果，獲得再現性(第2次數據未顯示)。
-使用Infliximab之結果-
第9A圖顯示由Tic製得之樹狀細胞樣細胞暴露於 Infliximab時檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果(a)。本實施例中，從暴露於Infliximab之樹狀細胞樣細胞萃取得之HLA-DR分子分離出的胜肽，檢測到認為是Infliximab之H鏈及L鏈之一部分胺基酸序列。
(第9A圖記載之胜肽記載於序列編號133~151)。
又，第9B圖顯示於Infliximab無處置時之條件(對照)檢測到之暴露於Infliximab時也檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果(b)。只檢測到認為是Infliximab之H鏈之一部分胺基酸序列。
(第9B圖記載之胜肽記載於序列編號152~153)。
2次測定(二重複)獲得大約同樣結果，獲得再現性(第2次數據未顯示)。又，以不同時間點(改變回收非黏附性細胞並添加GM-CSF及IL-4之時間點時)實施分化為樹狀細胞樣細胞並促進HLA-DR等表現之上昇時，也檢測到同樣的胜肽序列(數據未顯示)。
-使用rhFVIII之結果-
第10A圖~第10H圖顯示將由Tic製得之樹狀細胞樣細胞暴露於rhFVIII時檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。本實施例中，從由暴露於rhFVIII之樹狀細胞樣細胞萃取得之HLA-DR分子分離出的胜肽，檢測到rhFVIII之一部分胺基酸序列。
(第10A圖~第10H圖記載之胜肽記載於序列編號154~250)。
2次測定(二重複)大約獲得同樣結果，獲得再現性 (第2次數據未顯示)。
-使用Phl p1之結果-
第11圖顯示將由Tic製得之樹狀細胞樣細胞暴露於Phl p1時檢測到的胜肽之胺基酸序列之解析結果。本實施例檢測到Phl p1之一部分胺基酸序列。
(第11圖記載之胜肽記載於序列編號251~253)。
2次測定(二重複)獲得大約同樣結果，獲得再現性(第2次數據未顯示)。又，在不同時間點從人iPS細胞開始單核球樣細胞之分化，並回收非黏附性細胞，進行向樹狀細胞樣細胞之分化，並促進HLA-DR等表現之上昇時，也檢測到同樣的胜肽序列(數據未顯示)。
又，上述方法中，藉由將已暴露於抗原之樹狀細胞樣細胞之HLA-DR分子上呈現的胜肽利用抗HLA-DR珠粒分離‧精製成HLA-DR-胜肽複合體，並以離子捕集MS/MS質量分析鑑定呈現之各胜肽之序列。在此，如例如第3B圖、第4B圖、第5B圖，確認在單核球樣細胞、樹狀細胞樣細胞等抗原呈現細胞中表現HLA-DQ分子、HLA-DP分子、HLA-A分子、HLA-B分子、HLA-C分子。因此該技術領域中具有通常知識者可理解若將HLA-DR分子改為利用其他MHCII分子(例如HLA-DQ分子或HLA-DP分子)、或MHCI分子，也能同樣地檢測到呈現抗原之胜肽並鑑定。
例如：Karbach J,Pauligk C,Bender A,Gnjatic S,Franzmann K,Wahle C,Jager D,Knuth A,Old LJ,Jager E.,Identification of new NY-ESO-1 epitopes recognized by CD4+T cells and presented by HLA-DQ B1 03011,Int J Cancer.2006 Feb 1；118(3)：668-74.中，使用呈現癌抗原之一種即NY-ESO-1之樹狀細胞製作抗原專一性T細胞，藉由以呈現同樣抗原之HLA-DQ分子表現EBV-B細胞株進行再刺激，可檢測到HLA-DQ分子呈現之NY-ESO-1中之胜肽序列，且揭示抗原呈現之T細胞抗原決定位可使用HLA-DQ分子鑑定。又，例如：Duquesnoy RJ,Marrari M,Tambur AR,Mulder A,Sousa LC,da Silva AS,do Monte SJ,First report on the antibody verification of HLA-DR,HLA-DQ and HLA-DP epitopes recorded in the HLA Epitope Registry,Hum Immunol.2014 Nov；75(11)：1097-103.中，揭示從資料庫可預測容易被HLA-DR分子、HLA-DQ分子、HLA-DP分子呈現之序列，並揭示HLA-DQ分子、HLA-DP分子和HLA-DR分子同樣會將特定序列進行抗原呈現。基於該等技術常識，該技術領域中具有通常知識者可理解：MAPPs在本發明之從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化之表現HLA-DQ分子、HLA-DP分子等其他MHCII分子之細胞也同樣能適用。
又，使用了MHCI分子之MAPPs在例如：Wahl A,Schafer F,Bardet W,Buchli R,Air GM,Hildebrand WH.,HLA class I molecules consistently present internal influenza epitopes.Proc Natl Acad Sci U S A.2009 Jan 13；106(2)：540-5.已報告。該文獻中，使流感病毒感作表現特定同種異型之HLA-B分子之細胞株，並實施利用MAPPs而在HLA-B分子上呈現之來自流感病毒之胜肽序列之檢測。又，如上述，已知 MHCI分子在許多細胞種類會表現，然從容易檢測MHCI分子-胜肽複合體之觀點，希望是利用高表現MHCI分子之細胞。於一實施態樣，使用MHCI分子之MAPPs可以利用本發明之從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化之樹狀細胞。
[比較例]
A.方法
-使用細胞-
人末梢血單核球細胞(PBMC)：(從Lonza co.,ltd.購入)。
-從人末梢血單核球細胞將單核球細胞分離-
1.對於人末梢血單核球細胞添加已加入人血清白蛋白低IgG(SIGMA，Cat.：A3782)使成為0.5%、EDTA 0.5M原溶液pH8.0(Invitrogen,Cat.：15575)使成為2mM之DPBS(Invitrogen，Cat：14190)80μL/107細胞，並添加CD14微珠(Miltenyi，Cat.：130-050-201)使成為20μL/107細胞，以旋渦混合器懸浮，於4℃，遮光下之條件靜置15分鐘。
2.於靜置15分鐘後之人末梢血單核球細胞加入含有人血清白蛋白低IgG 0.5%、2mM之EDTA 0.5M原溶液pH8.0之DPBS 20mL，以1200rpm，5分鐘，4℃的條件旋降後去除全部上清。本操作進行2次。
3.於已去除上清之人末梢血單核球細胞加入含有人血清白蛋白低IgG 0.5%、2mM之EDTA 0.5M原溶液pH8.0之DPBS使成為1.2×108細胞/mL，使其通過細胞分離用磁石LS管柱(Miltenyi，Cat.：130-042-401)，將回收之人末梢血單核球細胞作為單核球細胞。
-使用抗原-
和本發明之實施例同樣，使用白樺花粉過敏原Betula verrucosa,birch pollen allergen 1，同功型a(Bet v1a)(#Bet v 1.0101；Biomay)(胺基酸序列：序列編號1)。
-向樹狀細胞之分化及向抗原之曝露-
1.於回收之單核球細胞加入含有0.5%之人類血清白蛋白低IgG、2mM之EDTA 0.5M原溶液pH8.0之DPBS20mL，以1200rpm，5分鐘，4℃的條件旋降後將上清全部除去。
2.將已去除上清之單核球細胞使用已添加胎牛血清(FBS)(Gibco，Cat.：10270，26140)10%、非必須胺基酸(Gibco,Cat.：11140-035)1%、丙酮酸鈉(Gibco,Cat.：11360-039)1%、嘉那黴素(Gibco,Cat.：15160-047)1%、重組人類顆粒球巨噬體群落刺激因子r(rhGM-CSF)(R&Dsystems,Cat.：215-GM)50ng/mL、重組人類介白素-4(rhIL-4)(R&Dsystems,Cat.：204-IL)3ng/mL之RPMI 1640(Life Tech，Cat.：11875)懸浮成3×105cells/mL之細胞密度，於6井板各接種3mL，於37℃，5%CO2條件下實施5日培養，將培養5日後之單核球細胞作為樹狀細胞。
3.從培養5日後之各井去除上清2mL/井，加入Bet v1a 3.3μg/mL，然後加入來自Salmonella enterica血清型abortusequi之脂多糖(LPS)(SIGMA，Cat.：L5886)1μg/mL，於37℃，5%CO2條件下培養1日。
4.將1日培養後之樹狀細胞從6井板全量回收，以1200rpm，5分鐘，4℃的條件旋降後，將上清全部除去，懸浮於4℃之 DPBS 1mL。然後將全量移到Eppendorf管，以2500rpm，5分鐘，4℃的條件旋降，將上清全部除去，製成細胞丸粒，並保存在-80℃。
5.回收樹狀細胞之一部分，使用抗人HLA-DR抗體、抗人HLA-DQ抗體、抗人HLA-DP抗體、抗人HLA-ABC抗體、抗人CD14抗體、抗人CD80抗體、抗人CD86抗體、抗人CD206抗體、抗人CD209抗體、抗人CD11b抗體，及抗人CD11c抗體染色，並使用流式細胞儀解析裝置BD FACSCantoTMII分析。
-抗HLA-DR珠粒之生成-
和本發明之實施例同樣製備。
-HLA-DR-胜肽複合體之奈米級精製-
和本發明之實施例同樣製備。
-HLA-DR-関連胜肽之溶離-
和本發明之實施例同樣製備。
-離子捕集MS/MS質量分析所為之胜肽之序列解析-
和本發明之實施例同樣製備。
B.結果
-已分化之細胞之特性-
第12圖顯示利用流式細胞儀解析檢查獲得之單核球細胞之細胞表面表現之分子之結果。由比較例獲得之單核球細胞認為有單核球之專一性標記CD14之表現及抗原呈現分子HLA-DR之表現，此外認為有T細胞之活化分子CD86之表現。
又，第13A圖、第13B圖顯示利用流式細胞儀解析檢查獲得之樹狀細胞之細胞表面表現之分子之結果。由比較 例獲得之樹狀細胞中，認為有抗原呈現分子HLA-DR，HLA-DQ及HLA-ABC、樹狀細胞之專一性標記CD206、CD209之表現，此外，認為有T細胞之活化分子CD80、CD86、黏附分子CD11b、CD11c之表現。另一方面，未認為有CD14之表現。
-使用Bet v1a之結果-
第14圖~第20圖顯示供評價之各人供體之Bet v1a添加條件(第14圖、第15圖、第16圖、第17圖、第18圖、第19圖、第20圖之(a))及非添加條件(對照)(第14圖、第15圖、第16圖、第17圖、第18圖、第19圖、第20圖之(b))檢測到之胜肽之胺基酸序列之解析結果。又，該等檢測到之具體胺基酸序列分別示於表2~表8(分別對應於第14圖~第20圖。)。表中，抗原決定位編號係代表在Bet v1a之胺基酸序列，從N末端起按順序看到、檢測到的胜肽的群。
(表2記載之胜肽記載於序列編號61~63)
【表3】
(表3記載之胜肽記載於序列編號64~70)
(表4記載之胜肽記載於序列編號71~73)
【表5】
(表5記載之胜肽記載於序列編號74~79)
(表6記載之胜肽記載於序列編號80~92)
【表7】
(表7記載之胜肽記載於序列編號93~95)
(表8記載之胜肽記載於序列編號96~111)
從以Bet v1a非添加條件檢測到之胜肽(對照)，檢 測到於Bet v1a添加條件檢測到之一部分胜肽。但，於Bet v1a添加條件檢測到比Bet v1a非添加條件更多之胜肽。
-使用來自人iPS細胞之樹狀細胞樣細胞之MAPPs與使用來自PBMC之樹狀細胞之MAPPs之比較-
第21A圖、第21B圖顯示針對於Bet v1a添加條件檢測到之胜肽之胺基酸序列，使用2種來自人iPS細胞之樹狀細胞樣細胞時和使用來自PBMC之樹狀細胞時之比較。使用來自PBMC之樹狀細胞之解析中，因為供體間具有不同MHCII分子，所以據認為檢測到之胜肽之胺基酸序列在供體間會見到差異。又，針對由來自2種iPS細胞之樹狀細胞樣細胞間檢測到之胺基酸序列之差異，據認為原本供體間有不同類型之MHCII分子，所以在品系(line)間檢測序列會出現差異。儘管如此，使用來自人iPS細胞之樹狀細胞樣細胞而於Bet v1a添加條件檢測到之胜肽的許多共通序列和使用來自PBMC之樹狀細胞時檢測到之胜肽之序列一致。關於檢測到之胜肽序列140-155，和S.Mutschlener et al.,Journal of Allergy and Clinical Immunology Vol.125(3),2010就抗原決定位序列部分報告之序列為一致。
再者，使用來自人iPS細胞之樹狀細胞樣細胞時，比起使用來自PBMC之樹狀細胞時檢測到更多胜肽，呈現更多抗原。因此啟示當使用由幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化之樹狀細胞時，比使用來自PBMC之樹狀細胞時有更高感度。此顯示了本發明之無法預測之顯著效果。
由以上結果，可認為使用幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞之MAPPs有比使用PBMC之MAPPs以上之感度，係 作為減低蛋白質之免疫原性之有用方法。
[產業利用性]
本發明藉由應用例如蛋白質之抗原決定位序列解析，能使用在各種生物醫藥品之診斷、醫療領域。本研究在來自花粉之外來性蛋白質Bet v1a、Phl p1、抗體醫藥品Infliximab及帶有和內因性蛋白質同樣之胺基酸序列之醫藥品rhFVIII，均檢測到在MHC classII分子呈現之序列。本發明之MAPPs無論是天然‧非天然或外因性‧內因性等特徵，可以就生物醫藥品等各種蛋白質檢測出抗原決定位序列，據認為除了醫藥品開發之外，也可應用在過敏原、自體免疫疾病之抗原決定位之解析等廣泛用途。
[無序列表者]
序列編號133~序列編號150：Infliximab之H鏈之部分胜肽
序列編號151：Infliximab之L鏈之部分胜肽
序列編號152~序列編號153：Infliximab之H鏈之部分胜肽
<110> 中外製藥股份有限公司
<120> 鑑定蛋白質抗原決定位之方法
<130> IBPF15-523WO
<150> JP2014-144217
<151> 2014-07-14
<160> 253
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 158
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 1
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
<210> 3
<211> 318
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
<210> 5
<211> 97
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
<210> 6
<211> 33
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 6
<210> 7
<211> 32
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 7
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 8
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 9
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 10
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 11
<210> 12
<211> 26
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 12
<210> 13
<211> 23
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 13
<210> 14
<211> 25
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 14
<210> 15
<211> 24
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 15
<210> 16
<211> 23
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 16
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 17
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 18
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 19
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 21
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 22
<210> 23
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 23
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 24
<210> 25
<211> 23
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 25
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 26
<210> 27
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 27
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 28
<210> 29
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 29
<210> 30
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 30
<210> 31
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 31
<210> 32
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 32
<210> 33
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 33
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 35
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 36
<210> 37
<211> 23
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 37
<210> 38
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 38
<210> 39
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 39
<210> 40
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 40
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 41
<210> 42
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 42
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 43
<210> 44
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 44
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 45
<210> 46
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 46
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 47
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 48
<210> 49
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 49
<210> 50
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 50
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 51
<210> 52
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 52
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 53
<210> 54
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 54
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 55
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 56
<210> 57
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 57
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 58
<210> 59
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 59
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 60
<210> 61
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 61
<210> 62
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 62
<210> 63
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 63
<210> 64
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 64
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 65
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 66
<210> 67
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 67
<210> 68
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 68
<210> 69
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 69
<210> 70
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 70
<210> 71
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 71
<210> 72
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 72
<210> 73
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 73
<210> 74
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 74
<210> 75
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 75
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 76
<210> 77
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 77
<210> 78
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 78
<210> 79
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 79
<210> 80
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 80
<210> 81
<211> 24
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 81
<210> 82
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 82
<210> 83
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 83
<210> 84
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 84
<210> 85
<211> 27
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 85
<210> 86
<211> 25
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 86
<210> 87
<211> 23
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 87
<210> 88
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 88
<210> 89
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 89
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 90
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 91
<210> 92
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 92
<210> 93
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 93
<210> 94
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 94
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 95
<210> 96
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 96
<210> 97
<211> 27
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 97
<210> 98
<211> 25
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 98
<210> 99
<211> 23
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 99
<210> 100
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 100
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 101
<210> 102
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 102
<210> 103
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 103
<210> 104
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 104
<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 105
<210> 106
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 106
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 107
<210> 108
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 108
<210> 109
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 109
<210> 110
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 110
<210> 111
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 111
<210> 112
<211> 2332
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 112
<210> 113
<211> 180
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 113
<210> 114
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 114
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 115
<210> 116
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 116
<210> 117
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 117
<210> 118
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 118
<210> 119
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 119
<210> 120
<211> 20
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 120
<210> 121
<211> 26
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 121
<210> 122
<211> 30
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 122
<210> 123
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 123
<210> 124
<211> 13
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 124
<210> 125
<211> 17
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 125
<210> 126
<211> 12
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 126
<210> 127
<211> 16
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 127
<210> 128
<211> 18
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 128
<210> 129
<211> 14
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 129
<210> 130
<211> 21
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 130
<210> 131
<211> 15
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 131
<210> 132
<211> 19
<212> PRT
<213> Betula verrucosa
<400> 132
<210> 133
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 133
<210> 134
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 134
<210> 135
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 135
<210> 136
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 136
<210> 137
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 137
<210> 138
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 138
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 139
<210> 140
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 140
<210> 141
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 141
<210> 142
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 142
<210> 143
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 143
<210> 144
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 144
<210> 145
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 145
<210> 146
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 146
<210> 147
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 147
<210> 148
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 148
<210> 149
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 149
<210> 150
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 150
<210> 151
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Light Chain
<400> 151
<210> 152
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 152
<210> 153
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A partial peptide of Infliximab Heavy Chain
<400> 153
<210> 154
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 154
<210> 155
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 156
<210> 157
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
<210> 158
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 158
<210> 159
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159
<210> 160
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 160
<210> 161
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 161
<210> 162
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 162
<210> 163
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 163
<210> 164
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 164
<210> 165
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 165
<210> 166
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 166
<210> 167
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 167
<210> 168
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 168
<210> 169
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 169
<210> 170
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 170
<210> 171
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 171
<210> 172
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 172
<210> 173
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 173
<210> 174
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 174
<210> 175
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 175
<210> 176
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 176
<210> 177
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 177
<210> 178
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 178
<210> 179
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 179
<210> 180
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 180
<210> 181
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 181
<210> 182
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 182
<210> 183
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 183
<210> 184
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 184
<210> 185
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 185
<210> 186
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 186
<210> 187
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 187
<210> 188
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 188
<210> 189
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 189
<210> 190
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 190
<210> 191
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 191
<210> 192
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 192
<210> 193
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 193
<210> 194
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 194
<210> 195
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 195
<210> 196
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 196
<210> 197
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 197
<210> 198
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 198
<210> 199
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 199
<210> 200
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 200
<210> 201
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 201
<210> 202
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 202
<210> 203
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 203
<210> 204
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 204
<210> 205
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 205
<210> 206
<211> 26
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 206
<210> 207
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 207
<210> 208
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 208
<210> 209
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 209
<210> 210
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 210
<210> 211
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 211
<210> 212
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 212
<210> 213
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 213
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 214
<210> 215
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 215
<210> 216
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 216
<210> 217
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 217
<210> 218
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 218
<210> 219
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 219
<210> 220
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 220
<210> 221
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 221
<210> 222
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 222
<210> 223
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 223
<210> 224
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 224
<210> 225
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 225
<210> 226
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 226
<210> 227
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 227
<210> 228
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 228
<210> 229
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 229
<210> 230
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 230
<210> 231
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 231
<210> 232
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 232
<210> 233
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 233
<210> 234
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 234
<210> 235
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 235
<210> 236
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 236
<210> 237
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 237
<210> 238
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 238
<210> 239
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 239
<210> 240
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 240
<210> 241
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 241
<210> 242
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 242
<210> 243
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 243
<210> 244
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 244
<210> 245
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 245
<210> 246
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 246
<210> 247
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 247
<210> 248
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 248
<210> 249
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 249
<210> 250
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 250
<210> 251
<211> 29
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 251
<210> 252
<211> 15
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 252
<210> 253
<211> 11
<212> PRT
<213> Phleum pratense
<400> 253

Claims (28)

  1. 一種鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，包含以下步驟：(A)使目標蛋白質接觸從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化之表現主要組織相容複合物(MHC分子)之細胞；(B)從該表現MHC分子之細胞將該目標蛋白質所含之胜肽與MHC分子之複合體予以單離；及(C)從該複合體將該胜肽溶離並鑑定。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，更包含以下步驟：(D)驗證已鑑定之胜肽是否為誘導免疫原性之抗原決定位。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，該幹細胞係選自於由人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚胎幹細胞(ES細胞)、核移植ES細胞(ntES細胞)、胚胎生殖幹細胞(EG細胞)及成體幹細胞構成之群。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，該MHC分子為MHCII分子。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，該MHCII分子為HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其中該表現MHC分子之細胞更表現CD80、CD86、CD206及CD209中之至少一者。
  7. 如申請專利範圍第6項之方法，其中，該表現MHC分子之細胞表現CD80、CD86、CD206及CD209全部。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之方法，其中，該表現MHC分子之細胞為樹狀細胞。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之方法，其中，該表現MHC分子之細胞表現欲投予該目標蛋白質之對象之MHC分子之1或多數同種異型(allotype)。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之方法，其中，該步驟(A)於無血清下進行。
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項之方法，其中，該樹狀細胞係以包含以下步驟之方法製作：(a)使幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化而獲得中胚層前驅細胞；(b)使該中胚層前驅細胞分化而獲得單核球細胞；及(c)使該單核球細胞分化而獲得未成熟樹狀細胞，並視情形進一步刺激該未成熟樹狀細胞而獲得成熟樹狀細胞，且該步驟(a)~(c)中至少該步驟(c)使用無血清培養基。
  12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中，該步驟(b)包括使該中胚層前驅細胞在含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之無血清培養基中分化而獲得單核球細胞之步驟。
  13. 如申請專利範圍第11或12項之方法，其中，該步驟(c)包括步驟(c1)：(c1)使該單核球細胞在含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及介白素4(IL-4)之無血清培養基中分化而獲得未成熟樹狀細胞，及視情形包括步驟(c2)：(c2)使該未成熟樹狀細胞和免疫原接觸，並視情形和發炎性細胞激素接觸，誘導為成熟樹狀細胞。
  14. 如申請專利範圍第8至13項中任一項之方法，其中，該樹狀細胞為未成熟樹狀細胞，該未成熟樹狀細胞藉由和具有免疫原性之目標蛋白質接觸而誘導為成熟樹狀細胞。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項之方法，其中，該目標蛋白質選自於由細胞激素、趨化介素、成長因子、抗體、酵素、結構性蛋白、荷爾蒙、及該等的任一斷片所構成之群中之1種或1種以上。
  16. 一種免疫原性減少或消失之蛋白質之製造方法，包含以下步驟：(1)依如申請專利範圍第1至15項中任一項之鑑定蛋白質之抗原決定位之方法，鑑定蛋白質之抗原決定位；(2)修飾該抗原決定位以使對於MHC分子之結合減少或消失；及(3)製造具有經修飾之抗原決定位之蛋白質。
  17. 一種蛋白質，係根據如申請專利範圍第16項之方法獲得。
  18. 一種預測蛋白質在對象是否有免疫原性之方法，包含以下步驟：(I)提供表現欲投予目標蛋白質之對象之MHC分子之1或多數同種異型(allotype)之細胞，該細胞係從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化；(II)使目標蛋白質接觸該「表現MHC分子之1或多數同種異型之細胞」；(III)從該「表現MHC分子之1或多數同種異型之細胞」將該目標蛋白質所含之胜肽與MHC分子之複合體予以單離； (IV)從該複合體將該胜肽溶離並鑑定；及(V)視情形，驗證鑑定之胜肽是否為誘導免疫原性之抗原決定位；當該鑑定之胜肽為誘導免疫原性之抗原決定位時，則表示該目標蛋白質在該對象具有免疫原性。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中，提供1或複數個表現該對象之MHC分子之1或多數同種異型之細胞，以包含該對象擁有之MHC分子之同種異型之全部集合。
  20. 如申請專利範圍第18或19項之方法，其中，該幹細胞係來自該對象之人工多能性幹細胞(iPS細胞)。
  21. 一種組成物，係用於治療及/或預防對象中與該蛋白質相關之疾病之治療及/或預防用組成物，含有蛋白質作為有效成分；其特徵為：該對象係從根據如申請專利範圍第18至20項中任一項之方法預測對於該蛋白質不具免疫原性之對象選擇。
  22. 一種幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞、或從其分化之表現MHC分子之細胞之用途，係使用於如申請專利範圍第1至16及18至20項中任一項之方法。
  23. 一種從幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞製造樹狀細胞之方法，包含以下步驟：(a’)使幹細胞或來自幹細胞之前驅細胞分化而獲得中胚層前驅細胞；(b’)使該中胚層前驅細胞於含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺 激因子(GM-CSF)及巨噬細胞群落刺激因子(M-CSF)之無血清培養基分化而獲得單核球細胞；及(c’)於無血清培養基使該單核球細胞分化而獲得未成熟樹狀細胞，並視情形進一步刺激該未成熟樹狀細胞而獲得成熟樹狀細胞。
  24. 如申請專利範圍第23項之方法，其中，該步驟(c’)包含步驟(c1’)：(c1’)使該單核球細胞於含有顆粒球‧巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)及介白素4(IL-4)之無血清培養基分化而獲得未成熟樹狀細胞；及視情形包含步驟(c2’)：(c2’)使該未成熟樹狀細胞和免疫原接觸並視情形和發炎性細胞激素接觸而誘導為成熟樹狀細胞。
  25. 一種樹狀細胞，係利用如申請專利範圍第23或24項之方法獲得。
  26. 如申請專利範圍第25項之樹狀細胞，其除了表現MHCII分子，更表現CD80、CD86、CD206及CD209中之至少一者。
  27. 如申請專利範圍第26項之樹狀細胞，其表現CD80、CD86、CD206及CD209全部。
  28. 一種細胞組成物，包含如申請專利範圍第25至27項中任一項之樹狀細胞。
TW104122486A 2014-07-14 2015-07-13 鑑定蛋白質抗原決定位之方法 TWI719939B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2014-144217 2014-07-14
JP2014144217 2014-07-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201608240A true TW201608240A (zh) 2016-03-01
TWI719939B TWI719939B (zh) 2021-03-01

Family

ID=55078494

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104122486A TWI719939B (zh) 2014-07-14 2015-07-13 鑑定蛋白質抗原決定位之方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10718781B2 (zh)
EP (2) EP3929302A1 (zh)
JP (1) JP7012432B2 (zh)
TW (1) TWI719939B (zh)
WO (1) WO2016010002A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2020377402A1 (en) * 2019-11-06 2022-06-23 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Binding proteins to CUB domain-containing protein (CDCP1)

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
AU2002950778A0 (en) 2002-08-15 2002-09-12 The Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland A method of characterizing dendritic cells
EP1714981A3 (en) 2002-10-02 2006-12-20 F.Hoffmann-La Roche Ag Method for the identification of antigenic peptides
US9453219B2 (en) 2003-05-15 2016-09-27 Mello Biotech Taiwan Co., Ltd. Cosmetic designs and products using intronic RNA
ES2334936T3 (es) * 2005-04-20 2010-03-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Metodo de identificacion de epitopos relacionados con la inmunogenicidad en biofarmacos.
EP1715343B1 (en) 2005-04-20 2009-12-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the identification of epitopes related to immunogenicity in biopharmaceuticals
EP2206724A1 (en) 2005-12-13 2010-07-14 Kyoto University Nuclear reprogramming factor
EP2137296A2 (en) 2007-03-23 2009-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Somatic cell reprogramming
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
ES2589122T3 (es) 2007-08-31 2016-11-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Estimulación de la ruta de la Wnt en la reprogramación de células somáticas
WO2009057831A1 (ja) 2007-10-31 2009-05-07 Kyoto University 核初期化方法
AU2008286249B2 (en) 2007-12-10 2013-10-10 Kyoto University Efficient method for nuclear reprogramming
EP2072617A1 (en) 2007-12-12 2009-06-24 Trimed Biotech GmbH Method for producing dendritic cells
AU2008338989A1 (en) 2007-12-17 2009-06-25 Gliamed, Inc. Stem-like cells and method for reprogramming adult mammalian somatic cells
CN101970664B (zh) 2008-01-16 2013-08-21 林希龙 使用可诱导的重组核糖核酸因子生成不含肿瘤的类胚胎干细胞的多能性细胞
EP2250252A2 (en) 2008-02-11 2010-11-17 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
EP2090649A1 (en) 2008-02-13 2009-08-19 Fondazione Telethon Method for reprogramming differentiated cells
WO2009102983A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 President And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
AU2009225665B9 (en) 2008-03-17 2015-01-15 The Scripps Research Institute Combined chemical and genetic approaches for generation of induced pluripotent stem cells
WO2009114949A1 (en) 2008-03-20 2009-09-24 UNIVERSITé LAVAL Methods for deprogramming somatic cells and uses thereof
ES2755736T3 (es) 2008-03-26 2020-04-23 Biocon Ltd Proceso de fermentación mejorado para un coeficiente de rendimiento más alto de inhibidor de lipasa respecto al ácido graso consumido
JP5734836B2 (ja) 2008-03-27 2015-06-17 アステリアス バイオセラピューティクス インコーポレイテッド 霊長類多能性幹細胞の造血系統細胞への分化
CN102083968A (zh) 2008-04-07 2011-06-01 纽珀滕索有限公司 通过使用小分子调节剂诱导复能基因而重编程细胞
SG10201402428WA (en) 2008-06-27 2014-07-30 Univ Kyoto Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells
WO2010009015A2 (en) 2008-07-14 2010-01-21 Oklahoma Medical Research Foundation Production of pluripotent cells through inhibition of bright/arid3a function
WO2010147612A1 (en) 2009-06-18 2010-12-23 Lixte Biotechnology, Inc. Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53
WO2010033920A2 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for enhancing cell reprogramming
US20120021519A1 (en) 2008-09-19 2012-01-26 Presidents And Fellows Of Harvard College Efficient induction of pluripotent stem cells using small molecule compounds
WO2010042800A1 (en) 2008-10-10 2010-04-15 Nevada Cancer Institute Methods of reprogramming somatic cells and methods of use for such cells
WO2010050626A1 (en) 2008-10-30 2010-05-06 Kyoto University Method for producing induced pluripotent stem cells
US20110059526A1 (en) 2008-11-12 2011-03-10 Nupotential, Inc. Reprogramming a cell by inducing a pluripotent gene through use of an hdac modulator
WO2010068955A2 (en) 2008-12-13 2010-06-17 Dna Microarray MICROENVIRONMENT NICHE ASSAY FOR CiPS SCREENING
EP2401372A4 (en) 2009-02-27 2012-09-19 Univ Kyoto NEW NUCLEAR REPROGRAMMING SUBSTANCE
US20120122212A1 (en) 2009-03-06 2012-05-17 Marica Grskovic Tgf-beta pathway inhibitors for enhancement of cellular reprogramming of human cells
US9340775B2 (en) 2009-03-25 2016-05-17 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell produced by transfecting a human neural stem cell with an episomal vector encoding the Oct4 and Nanog proteins
US20120076762A1 (en) 2009-03-25 2012-03-29 The Salk Institute For Biological Studies Induced pluripotent stem cell generation using two factors and p53 inactivation
WO2010115050A2 (en) 2009-04-01 2010-10-07 The Regents Of The University Of California Embryonic stem cell specific micrornas promote induced pluripotency
WO2010124290A2 (en) 2009-04-24 2010-10-28 Whitehead Institute For Biomedical Research Compositions and methods for deriving or culturing pluripotent cells
WO2010147395A2 (en) 2009-06-16 2010-12-23 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Medium composition comprising neuropeptide y for the generation, maintenance, prologned undifferentiated growth of pluripotent stem cells and method of culturing pluripotent stem cell using the same
MX346002B (es) 2009-06-17 2017-03-01 Abbvie Biotherapeutics Inc Anticuerpos anti-vegf y sus usos.
JP5861191B2 (ja) 2010-09-30 2016-02-16 国立大学法人 熊本大学 ミエロイド系血液細胞の製造方法
EP2678425B1 (en) 2011-02-23 2017-08-23 Kyoto University Method for producing dendritic cells from pluripotent stem cells

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2016010002A1 (ja) 2017-04-27
WO2016010002A1 (ja) 2016-01-21
EP3929302A1 (en) 2021-12-29
EP3170901A1 (en) 2017-05-24
EP3170901A4 (en) 2018-01-24
TWI719939B (zh) 2021-03-01
US10718781B2 (en) 2020-07-21
EP3170901B1 (en) 2021-06-02
JP7012432B2 (ja) 2022-01-28
US20170219607A1 (en) 2017-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Palm et al. Remembrance of things past: long-term B cell memory after infection and vaccination
JP6259012B2 (ja) 脱毛症の治療方法
JP7018316B2 (ja) 養子細胞療法のためのｔ細胞株及びそのドナーの選択方法
CN105307725B (zh) 治疗自身免疫疾病的方法和组合物
JP6876746B2 (ja) 免疫療法のための医薬の組合わせ
Kool et al. Facilitated antigen uptake and timed exposure to TLR ligands dictate the antigen-presenting potential of plasmacytoid DCs
WO2012043651A1 (ja) ミエロイド系血液細胞の製造方法
CN105228640B (zh) Phf20和jmjd3组合物及其在肿瘤免疫治疗中的使用方法
TWI334442B (en) Process for producing cytotoxic lymphocyte
Abusarah et al. Engineering immunoproteasome-expressing mesenchymal stromal cells: A potent cellular vaccine for lymphoma and melanoma in mice
TW201245224A (en) Cytotoxic t cell inducing composition
US20230263889A1 (en) Pharmaceutical composition and method for inducing an immune response
Gong et al. Glycyrrhizic acid inhibits myeloid differentiation of hematopoietic stem cells by binding S100 calcium binding protein A8 to improve cognition in aged mice
JP6474788B2 (ja) 抗原特異的ｔ細胞応答を刺激するための方法
KR20150028225A (ko) 항원-특이적 조절 ｔ 세포의 유도 방법
TWI719939B (zh) 鑑定蛋白質抗原決定位之方法
JP4939219B2 (ja) 腫瘍の免疫療法のための方法
AU2022259170A1 (en) Cell bank composed of ips cells for introducing t cell receptor gene
JP2008509878A (ja) Ｂｏｂ−１特異的ｔ細胞及び使用法
WO2008028229A1 (en) Methods of identifying markers
Sarraf et al. Wnt5A supports antigen cross-presentation and CD8 T cell activation
Gigoux The role of inducible costimulator-mediated phosphoinositide 3-kinase activation in the differentiation and function of follicular helper T cells
KING Investigation of Complement Protein C1q-Implications for its protective roles against systemic lupus erythematosus