TW201546077A - 用以治療發炎和／或腫瘤的新穎倍半萜類化合物之衍生物及包含此新穎倍半萜類化合物之衍生物的組合物 - Google Patents

Abstract

在此揭示新穎倍半萜類化合物之衍生物，和其作為治療發炎和/或腫瘤相關疾病之藥劑的用途。

Description

用以治療發炎和/或腫瘤的新穎倍半萜類化合物之衍生物及包含此新穎倍半萜類化合物之衍生物的組合物

本揭示內容係有關於倍半萜類化合物的領域，且特別是倍半萜類化合物之衍生物及其用於治療或預防發炎和/或腫瘤相關疾病的用途。

倍半萜為萜類化合物的一種，通常存在於植物和昆蟲之中。去氧膽草素(deoxyelephantopin,DET)為一種自地膽草屬植物如：燈豎朽(Elephantopus scaber)分離的倍半萜內酯，已知該化合物於活體外試驗中具有抑制多種癌細胞生長的功效。在本揭示內容中，本案發明人係提出多種不同去氧膽草素的衍生物，並研究其對不同腫瘤細胞株，包括對化療藥物具有抗性的細胞株在內的細胞毒殺效果。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容是基於意外發現特定的去氧膽草素(deoxyelephantopin，簡稱DET)衍生物，具有與DET相似或更佳的抗發炎和/或抗腫瘤活性；因此，去氧膽草素衍生物可用來開發能治療或預防發炎和/或腫瘤相關疾病的藥劑。

因此，本揭示內容一方面係提供一種新穎合成的倍半萜類化合物之衍生物，其具有下式(I)所示的結構： 其中：R是H或-(C=O)R₁；以及R₁分別是H、C_1-20烷基、C_1-20烯基、芳香基或雜芳基，其中： 該C_1-20烷基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：鹵素、羥基、烷醯氧基、烷氧基、苯基、萘基、異苯并呋喃基(isobenzofuranyl)、異苯噻吩基(isobenzothienyl)或異喹啉基(isoquinolyl)；該C_1-20烯基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：苯基、呋喃基、噻吩基(thienyl)或異苯并二氧戊環基(isobenzodioxolyl)；每一苯基和萘基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：鹵素、烷基、過氟化烷基、烷氧基或鹵代烷氧基；和該芳香基可不經取代或帶有鹵素、C_1-4低碳數烷基、烷氧基或鹵代烷氧基之取代基。

本揭示內容另一方面係提供一種藥學組合物，其可用以治療或預防一患有或疑似患有一炎症和/或腫瘤相關疾病的個體。所述藥學組合物包含一治療/預防有效量之式(I)化合物，以及一藥學可接受載體。

式(I)化合物的含量佔整體藥學組合物重量約0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中，式(I)化合物佔整體藥學組合物重量的至少1%(重量%)。在特定實施方式中，式(I)化合物佔整體藥學組合物重量的至少5%(重量%)。在另一些實施方式中，式(I)化合物佔整體藥學組合物重量的至少10%(重量%)。在又另一些實施方式中， 式(I)化合物佔整體藥學組合物重量的至少25%(重量%)。

依據某些較佳實施方式，所述藥學組合物更包含一化療藥劑或麩胱甘肽生物合成阻斷劑(gluthathione biosynthesis blocker)。在某些實施例中，所述化療藥劑是DET、紫杉醇或PLX4032。在其他實施例中，所述麩胱甘肽生物合成阻斷劑是丁硫堇硫醯亞胺(buthionine sulfoximine,BSO)或柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)。

適合以所述藥學組合物來治療之炎症是選自由發炎性皮膚病、發炎性腸疾病、過敏性肺部疾病、氣喘、過敏性鼻炎、自體免疫疾病、急性和慢性炎症、修格連氏症候群、人類免疫不足病毒感染及癌症組成的群組中。

適合以所述藥學組合物來治療之腫瘤相關疾病是一癌症，其係選自於乳癌、皮膚乳頭狀瘤、黑色素瘤、腦癌、肺癌、淋巴瘤、神經上皮瘤、腎癌、前列腺癌、胃癌、大腸癌及子宮癌所組成的群組中。

依據本發明某些實施方式，該癌症是一抗藥性癌症。在一實例中，該癌症是對PLX4032具有抗藥性的黑色素瘤。

依據本發明一特定實施方式，所述藥學組合物可降低該罹患癌症個體皮膚因施用PLX4032所造成的副作用，例如，因施用PLX4032而誘發生成的皮膚乳頭瘤。

本揭示內容亦涵蓋一種治療或預防一患有或疑似患有一炎症和/或腫瘤相關疾病之個體的方法。所述方法包含施用一治療或預防有效量之式(I)化合物至所述個體，以減緩、減輕和/或預防發炎和/或腫瘤相關疾病。

依據某些較佳實施方式，所述方法更包含在施用本發明式(I)化合物之前、同時或之後，施用其他已知可用以改善發炎症狀和/或腫瘤相關疾病的藥物，例如一化療藥劑或一麩胱甘肽生物合成阻斷劑，至所述個體。

適合以本發明方法進行治療之炎症是選自由發炎性皮膚病、發炎性腸疾病、過敏性肺部疾病、氣喘、過敏性鼻炎、自體免疫疾病、急性和慢性炎症、修格連氏症候群、人類免疫不足病毒感染及癌症組成的群組中。

適合以本發明方法進行治療之腫瘤相關疾病是一癌症，其係選自於乳癌、皮膚乳頭狀瘤、黑色素瘤、腦癌、肺癌、淋巴瘤、神經上皮瘤、腎癌、前列腺癌、胃癌、大腸癌及子宮癌所組成的群組中。

依據某些實施方式，該癌症是一抗藥性癌症。在一實例中，該癌症是對PLX4032具有抗藥性的黑色素瘤。

依據一特定實施方式，本發明方法可降低該罹患癌症個體皮膚上因施用PLX4032所造成的副作用，包括減少因PLX4032所誘發的皮膚乳頭瘤的數目及大小。

本揭示內容的一或多個實施方式，將詳述於下文實施方式中。透過以下的詳細說明與附隨之申請專利範圍將可更了解上述本揭示內容的特徵。需知，以上的概述及以下的詳細說明僅為例示，目的是用來闡述本揭示內容，而非用以限制本揭示內容之範疇。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖為依據本揭示內容一實施方式所示的DET、DETD-35和PTX對於MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的效果，分別以(A)遷移分析和(B)侵襲分析評估之；第2圖繪示分別經DET和DETD-35處理的MDA-MB-231細胞運度性之動力學特徵；(A)即時(Time-lapse)攝影系列影像圖；(B)各細胞經處理後的細胞 軌跡圖；(C)各細胞經處理後的平均遷移速率，觀察期間以30分鐘為間隔(D)各細胞經每一處理後12小時的總遷移距離；數據以平均值±標準偏差表示(n12)，直條圖上標記差異記號時，代表具有顯著差異(P<0.05,one-way ANOVA)；第3圖繪示DETD-35抑制雌性NOD/SCID小鼠的原位MDA-MB-231乳腺瘤生長效果；(A)腫瘤尺寸的時間進程；(B)動物體重；(C)第71天的腫瘤尺寸；(D)不同試驗組小鼠的器官指數；第4圖繪示DETD-35對於異種移植SCID小鼠中MDA-MB-231三陰性乳腺瘤肺部轉移的影響；(A)在不同處理組之間，肺部器官中的轉移肺部腫瘤數目的計算結果；(B)不同處理組織間，器官指數的分析結果(P<0.05；one-way ANOVA)；第5A圖係依據本揭示內容一實施方式所繪示之DETD-35、DETD-39和PTX個別對於MDA-MB-231細胞的抑制效果；第5B圖係依據本揭示內容一實施方式所繪示，併用DETD-35和PTX，或併用DETD-39和PTX對於MDA-MB-231細胞的抑制效果；第5C圖為第5B圖的等效線圖分析折線圖；第5D圖繪示第5B圖結果的併用係數 (combination index,CI)，其中CI<1代表協同效果；CI=1代表相加效果；以及CI>1代表拮抗效果；第6圖為依據本揭示內容一實施方式所繪示之DET和DETD-35能有效降低經(A)丁硫堇硫醯亞胺和(B)柳氮磺胺吡啶前處理的MDA-MB-231細胞之存活率；第7A、7B圖係依據本揭示內容一實施方式所繪示，PLX4032和DETD-35對於A375黑色素瘤細胞增殖抑制效果的直條圖；第7C圖係依據本揭示內容一實施方式所繪示，併用PTX和DETD-35對於A375黑色素瘤細胞增殖抑制效果的直條圖；第7D圖繪示第7C圖之結果的併用係數(CI)，其中CI<1代表協同效果；CI=1代表相加效果；以及CI>1代表拮抗效果；第8A圖係依據本揭示內容一實施方式所繪示，活體內BRAF^V600E突變黑色素瘤經PLX4032、DET、DETD-35、PLX4032+DET或PLX4032+DETD-35處理後腫瘤尺寸隨時間變化的情形；第8B圖係PLX4032、DET、DETD-35、PLX4032+DET或PLX4032+DETD-35處理對BRAF^V600E突變黑色素瘤重量的影響；第9A圖係依據本揭示內容一實施方式所繪示， PLX4032和DETD-35對於非抗藥性A375細胞和抗藥性A375細胞(A375-R)細胞增殖的抑制效果；第9B圖經PLX4032處理後的A375細胞和抗藥性A375-R細胞，於MAPK訊號路徑中的關鍵分子之表現量，於西方墨點法分析的結果；第9C圖為依據本揭示內容一實施方式所示之，單獨以PLX4032處理或併用PLX4032和DETD-35(1或3μM)處理後的A375-R細胞，其MAPK訊號路徑中關鍵分子之表現量，於西方墨點分析的結果；第10A圖係依據本揭示內容一實施方式所繪示，活體內對PLX4032具抗藥性之BRAF^V600E突變黑色素瘤經PLX4032、DET、DETD-35、PLX4032+DET或PLX4032+DETD-35處理後腫瘤尺寸隨時間變化的情形；第10B圖係PLX4032、DET、DETD-35、PLX4032+DET或PLX4032+DETD-35處理對具PLX4032抗藥性之BRAF^V600E突變黑色素瘤重量的影響；第11A圖係依據本揭示內容一實施方式，以DMBA/TPA處理誘發小鼠產生皮膚乳頭狀瘤之實驗平台，證明後，再施以PLX4032促皮膚乳頭狀瘤之副作用以及PLX4032與DET或DETD-35併用處理可減少小鼠皮膚乳頭狀瘤之照片；第11B圖繪示出DET或DETD-35處理延遲 PLX4032促DMBA/TPA處理誘發小鼠產生皮膚乳頭狀瘤之時間和所產生乳頭狀瘤數目的影響；以及第11C圖繪示出DET或DETD-35處理對PLX4032促DMBA/TPA處理誘發產生乳頭狀瘤體積的影響。

根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對本發明實施態樣與具體實施例提出說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數 型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。

1.名詞定義

除非本說明書另有定義，所述「烷基」一詞係指具有1至20個碳原子，且為直鏈、支鏈和/或環狀(「環烷基」)的烴基(即，1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2或1個碳原子)。烷基含1至4個碳原子的結構稱為「低碳數烷基」。舉例而言，烷基群組包含甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、2-異丙基-3甲基丁基、戊基、戊-2-基、己基、異己基、庚基、庚-2-基、4,4-二甲基戊基、辛基、2,2,4-三甲基戊基、壬基、癸基、十一烷基和十二烷基。環烷基結構可以是單環狀或多環狀，且其實例包括環丙基、環丁基、環戊基和環己基。除非另有定義者外，每個實例中一烷基團個別含有非必要的取代基，即，無取代基的烷基(unsubstituted alkyl)或帶有一或多個取代基的烷基(substituted alkyl)。在特定的實施方式中，所述烷基團是帶有取代基的C_2-10烷基。

除非本說明書另有定義，所述「烯基」是指具有2至20個碳原子，且為直鏈、支鏈和/或環狀的烴基(即，2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3或2個碳原子)，其中烯基包含一或多個碳-碳雙鍵。烯基結構的實例包含乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯 基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2丁烯基、2,3-二甲基-2-丁基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1-庚烯基、2-庚烯基、3-庚烯基、1-辛烯基、2-辛烯基、3-辛烯基、1-壬烯基、2-壬烯基和3-壬烯基。一或多個碳-碳雙鍵可以在烴基的內部(如2-丁烯基)或位在終端(如1-丁烯基)。除非另有定義者外，每個實例中一烯基團個別含有非必要的取代基，即，無取代基的烯基(unsubstituted alkenyl)或帶有一或多個取代基的烯基(substituted alkenyl)。在特定的實施方式中，所述烯基團是帶有取代基的C_2-10烯基。

除非另有定義者外，所述「烷氧基(alkoxy)」係指一-O-烷基團。烷氧基團的實例包含，但不限於，-OCH₃、-OCH₂CH₃、-O(CH₂)₂CH₃、-O(CH₂)₃CH₃、-O(CH₂)₄CH₃和-O(CH₂)₅CH₃。所述「低碳數烷氧基」係指-O-(低碳數烷基)；如，-OCH₃和-OCH₂CH₃。

除非本說明書另有定義，所述「芳香基(aryl)」係指一芳香環或一由碳和氫原子組成的部分芳香環系統。一芳香基可以包含複數個環彼此鍵結或融合在一起。芳香基的實例包含萘基和苯基。除非另有指明，每個實例中一芳香基團個別含有非必要的取代基，即，無取代基的芳香基(unsubstituted aryl)或帶有一或多個取代基的芳香基(substituted aryl)。在特定的實施方式中，所述芳香 基是帶有取代基的苯基。在另一實施方式中，所述芳香基是帶有取代基的萘基。

除非本說明書另有定義，所述「雜芳基」是指一芳香基中至少一碳原子帶有一雜原子(如，氮、氧或硫)。舉例而言，包含，但不限於，苯并呋喃基(benzofuranyl)、苯并噻吩基(benzothienyl)、喹啉基(quinolyl)、苯并二氧戊環基(benzodioxolyl)、呋喃基(furyl)和噻吩基(thienyl)。

除非本說明書另有定義，所述「烷基芳香基(alkylaryl)」或「烷基-芳香基(alkyl-aryl)」係指一烷基結合至一芳香基上。

除非本說明書另有定義，所述「鹵素(halogen,halo)」包含氟、氯、溴和碘。

除非本說明書另有定義，所述「取代(substituted)」當描述一化學結構或化學基團時，係指一衍生物其結構或基團中一或多個氫原子，被一原子、化學基團或官能基取代；即，但不限於，-OH、-CHO、烷氧基、烷醯氧基(如，-OAc)、烯基、烷基(例如，甲基、乙基、丙基、叔丁基)、芳香基、芳氧基、鹵素或鹵烷基(例如，-CCl₃、-CF₃、-C(CF₃)₃)。

在特定的實施方式中，所述「取代(substituted)」，當描述一化學結構或化學基團時，係指一 衍生物其結構或基團中一或多個氫原子被一或多個：烷氧基、烷醯氧基、烷基、芳香基、鹵素、鹵烷基或羥基取代。

除非本說明書另有定義，於一系列名詞前記載一或多個形容詞時，應當被解釋為該形容詞適用於每一個名詞。舉例而言，「不經取代或帶有取代基的烷基、烯基、芳香基或雜芳基(optionally substituted alky,alkenyl,aryl,or heteroaryl)」與「不經取代或帶有取代基的烷基、不經取代或帶有取代基的烯基、不經取代或帶有取代基的芳香基或不經取代或帶有取代基的雜芳基(optionally substituted alky,optionally substituted alkenyl,optionally substituted aryl,or optionally substituted heteroaryl)」的意思相同。

除非本說明書另有定義，一化合物的一「治療有效量」係指在治療或管理一疾病或病況時，足以提供一治療效果的量，或以延遲或減少該疾病或病況相關的徵狀。一化合物的治療有效量係指一治療藥劑量，若單獨使用或與其他藥劑併用，能提供一治療或管理疾病或病徵的治療效果。所述「治療有效量」一詞，可以涵蓋改善整體的治療效果、減少或防止一疾病或病況相關症狀的發生或增強其他治療藥劑的效果。

除非本說明書另有定義，一化合物的一「預 防有效量(prophylactically effective amount」係指一能夠預防一疾病或病況、一或多個與疾病/病況相關連的徵狀，或避免疾病或病況復發。一預防有效量可以是一治療藥劑量，單獨施用或併用其他藥物使用對於疾病皆具有預防效果。所述「預防有效量」一詞係涵蓋改善整體預防效果或增強另一預防性藥劑之效果的量。

除非本說明書另有定義，所述「治療(treat,treating or treatment)」係指施用於一患有特定疾病或病徵的患者之行為，其中該行為可減低患者的疾病或病徵、或一或多個症狀的嚴重度，或減緩或延緩疾病或病徵的進程。

需要注意的是，若無特定指明一結構的立體化學部分或一部份結構(例如，以粗線或虛線表示的部分)，則此結構或部分結構應解釋成可涵蓋所有的立體異構物。同樣地，當化合物含有一或多個不對稱中心，但其名稱並未具體定義該些不對稱中心所能涵蓋的立體化學結構時，則應將該化合物的範圍解釋成可涵蓋其純的光學異構物及由該些光學異構物所組成的混合物。再者，圖中所示具有不飽和價數的任一原子，均假設其可連接足夠的氫原子使其價數達到飽和。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實 施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

除非另有定義，否則單數型一(a)和該(the)在此包含複數。

2.新穎去氧膽草素衍生物(Novel Deoxyelephantopin Derivatives,DETD)

本發明包含如式(I)所示的化合物， 其中：R是H或-(C=O)R₁；以及R1分別是H、C_1-20烷基、C_1-20烯基、芳香基或雜芳基，其中：該C_1-20烷基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：鹵素、羥基、烷醯氧基、烷氧基、苯基、萘基、異苯并呋喃基、異苯噻吩基或異喹啉基；該C_1-20烯基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：苯基、呋喃基、噻吩基或異苯并二氧戊環基中，其中每一苯基和萘基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：鹵素、烷基、過氟化烷基、烷氧基或鹵代烷氧基；和該芳香基可不經取代或帶有鹵素、C_1-4低碳數烷基、烷氧基或鹵代烷氧基之取代基。

本發明化合物為去氧膽草素衍生物可包含一或多個立體中心；因此，所述化合物以不同的異構式存在，例如，外消旋鏡像異構物的混合物和/或非鏡像異構物的混合物。本發明涵蓋該些化合物的鏡像異構物，以及該些鏡像異構物和/或非鏡像異構物的混合物。鏡像異構物可利用不對稱合成法進行製備，或是利用常規技術 將之分離，例如，透過結晶、色層分析以及利用分離劑(resolving agent)加以分離。從外消旋混合物中分離出鏡像異構物的較佳方法為利用高效液相層析(high performance liquid chromatography,HPLC)。另一方面，也可在一溶劑中透過與一分離劑(resolving agent)之光學活性形式反應，而從外消旋異構物中將兩鏡像異構物彼此分離。視所用分離劑光學形式，可使二鏡像異構物中的其中一種異構物以一不溶性鹽類的形式被分離出來，相較於殘留於溶液內的異構物而言，被分離出來的異構物具有高產率和高光學純度。

本發明更包含所述化合物之立體異構物的混合物。再者，本發明亦涵蓋所述化合物的構型異構物(即，反式和順式異構物，無論是否包含雙鍵)，包括異構物所之混合物、純異構物或實質上為純異構物的形式。

3.合成方法

本發明包含一種以去氧膽草素(DET)作為起始化合物來製備式(I)化合物的方法，其中DET可依據本揭示內容「材料與方法」一節所示的萃取步驟，而從燈豎朽植物(Elephantopus scaber L.)中分離出來。

當分離得到DET後，再依據流程圖1所示的步驟製備DET衍生物。

簡言之，利用一強鹼(如，NaOH或KOH)反應將DET水解；接著，將得到的水解產物進行酸化，以得到化合物DETD-3，其為一新穎的C-8DET內酯。再以三種不同的方法分別產生其他DET衍生物(簡稱，DETDs)，其中DETD-4至DETD-61係以方法A或B製備的，而DETD-62係以方法C製備而成。

在方法A中，在1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺氯化氫(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDCI)和二甲氨基吡啶(dimethylaminopyridine,DMAP)存在下，讓DETD-3與一羧酸(R₁COOH)反應；且視羧酸反應物(R₁COOH)之R₁基的不同，可得到本揭示內容各種不同形式的酯類化合物，包含DETD-4至DETD-31、DETD-35、和DETD-39至 DETD-61等化合物。所述R₁基可以是烷基、支鏈烷基、環烷基、帶有取代基的烷基、芳香基或帶有取代基的芳香基、雜芳基或帶有取代基的雜芳基、烯基、炔基等。

在方法B中，DETD-3不再與羧酸(R₁COOH)反應，而是在三乙胺的存在下，改與一酸的氯化物反應(R₁COCl)，進而得到DETD-32至DETD-34，和DETD-36至DETD-38的酯類化合物。

在方法C中，在標準Mitsunobu條件下(Calvert et al.,Chemico-biological Interactions 1998,111-112：213-224.)，在偶氮二甲酸二乙酯(diethyl azodicarboxylate,DEAD)和三苯膦(triphenylphosphine,PPh₃)存在下，讓DETD-3與1-萘乙酸(1-naphthylacetic acid)反應得到DETD-62(epi-DETD-35)化合物。

新合成DETDs(即，式(I)化合物)的側鏈結構，如表1所示。

4.用途

本發明包含一種治療或預防一患有或疑似患有一炎症和/或腫瘤相關疾病之個體的方法。所述方法包含施予一治療或預防有效量之式(I)化合物或DETDs至該個體，以減緩、減輕和/或預防所述發炎和/或腫瘤相關疾病的徵狀。在某些實施方式中，所述方法更包含在施予式(I)化合物之前、之後或同時，對該個體施予一化療藥劑或一麩胱甘肽生物合成阻斷劑。所述化療藥劑可選自於PLX4032、多烯紫杉醇(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、樺木酸(betulinic acid)、4-S-半胱胺兒茶酚(4-S-cysteaminyl catechol)、4-S-半胱胺酚(4-S-cysteaminyl phenol)、維莫司(everolimus依)、硼替佐米(bortezomib)、卡鉑定(carboplatin)、達卡巴嗪(dacarbazine)、塞來昔布(celecoxib)、替莫唑胺(temozolomide)、蕾莎瓦(sorafenib)、沙利多邁(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)、丙戊酸(valproic acid)、長春鹼(vinblastine)、甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesylate)、波生坦(bosentan)、阿波胺(apomine)、三氧化砷(arsenic trioxide)、卡莫司汀(carmustine)、拉鉑立茲瑪(lambrolizuma)、抗CTLA-4藥物(anti-CTLA-4 drug)、抗程式性死亡受體-1(PD-1)藥物(anti-programmed death receptor-1(PD-1)drug)、易普利姆瑪(ipilimumab)、崔枚 利姆瑪(tremelimumab)、艾黴素(doxorubicin)、MEK抑制劑(MEK inhibitor)、卡培他濱(capecitabine)、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑(poly(ADP-ribose)polymerase (PARP)inhibitor)、磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)抑制劑、哺乳類雷帕黴素之標靶(mTOR)抑制劑(mammalian target of rapamycin(mTOR)inhibitor)和他莫昔芬(tamoxifen)所組成的群組中。依據本揭示內容某些較佳的實施方式，所述化療藥劑和所述麩胱甘肽生物合成阻斷劑可分別增強DET、DETDs或一已知抗癌藥物(即，紫杉醇)的作用效果。所述化療藥劑可以是DET、紫杉醇(PTX)或PLX4032；且所述麩胱甘肽生物合成阻斷劑可以是丁硫堇硫醯亞胺(BSO)或柳氮磺胺吡啶。

發炎相關疾病之特徵為一局部性或全身性、急性或慢性發炎。發炎相關疾病的實例包含發炎性皮膚病(如，皮膚炎(dermatitis)、濕疹(eczema)，異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、過敏性接觸性皮膚炎(allergic contact dermatitis)、蕁麻疹(urticarial)、壞死性血管炎(necrotizing vasculitis)、皮膚血管炎(cutaneous vasculitis)、過敏性血管炎(hypersensitivity vasculitis)、嗜酸細胞性肌炎(eosinophilic myositis)、多發性肌炎(polymyositis)、皮肌炎(dermatomyositis)、嗜酸性筋膜炎(eosinophilic fasciitis))、發炎性腸疾病(如，克隆氏症 (Crohn's disease)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis))、過敏性肺部疾病(如，過敏性肺炎(hypersensitivity pneumonitis)、嗜酸細胞性肺炎(eosinophilic pneumonia)、遲發型過敏反應(delayed-type hypersensitivity)、間質性肺病(interstitial lung disease,ILD)、特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)，以及ILD相關的類風濕性關節炎(ILD associated with rheumatoid arthritis))、氣喘和過敏性鼻炎。所述實例亦包含自體免疫疾病(如，類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、重症肌無力(myasthenia gravis)、幼發型糖尿病(juvenile onset diabetes)、腎小球性腎炎(glomerulonephritis)、自體免疫性甲狀腺炎(autoimmune thyroiditis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、全身性硬化症(systemic sclerosis)和多發性硬化症(multiple sclerosis))、急性和慢性炎症(如，全身性過敏反應(systemic anaphylaxia)或過敏性反應(hypersensitivity responses)、藥物過敏(drug allergies)、昆蟲叮咬過敏(insect sting allergies)、自體移植排斥(allograft rejection)和移植物抗宿主症(graft-versus-host disease))、修格連氏症候群、人類免疫不足病毒感染、癌症(如，腦癌、乳癌、乳頭狀瘤、黑色素瘤、前列腺癌、大腸癌、腎癌、卵巢 癌、甲狀腺癌、肺癌和造血功能相關癌症)以及腫瘤轉移。

腫瘤相關疾病係指不受控制的自體細胞增生，包含惡性和非惡性的細胞增生。腫瘤相關疾病的實例包含癌症，如，惡性腫瘤、肉瘤、轉移性疾病或造血腫瘤性疾病。轉移性腫瘤可源自於多種原發性腫瘤類型，包含但不限於，前列腺、大腸、肺、乳房、肝臟、甲狀腺、淋巴、腸胃道和生殖泌尿道。惡性腫瘤的實例，包含子宮頸、肺、前列腺、乳房、頭和頸、大腸以及卵巢組織形成的惡性腫瘤。造血腫瘤性疾病可發生於骨髓、淋巴或紅血球細胞系或其前驅細胞。在較佳的實例中，所述疾病可以由分化不良的急性白血病所產生，例如，紅血球母細胞白血病(erythroblastic leukemia)和急性巨核母細胞白血病(megakaryoblastic leukemia)。再者，所述骨髓疾病的實例包含，但不限於，急性原骨髓性白血病(acute promyeloid leukemia,APML)、急性骨髓性白血病(acute myelogenous leukemia,AML)和慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)；所述淋巴惡性腫瘤的實例包含，但不限於，急性淋巴母細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)，其包含B細胞系淋巴母細胞白血病(B-lineage ALL)和T細胞系淋巴母細胞白血病(T-lineage ALL)、慢性淋巴性白血性(chronic lymphocytic leukemia,CLL)、原淋巴細胞白血病(prolymphocytic leukemia,PLL)、髮樣細胞白血病(hairy cell leukemia,HLL)以及原發性巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia,WM)。此外，其他惡性淋巴瘤的實例，包含但不限於，非霍杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)及其變異、周邊T細胞淋巴瘤(peripheral T cell lymphomas)、成人T細胞白血病/淋巴瘤(adult T cell leukemia/lymphoma,ATL)、皮膚T細胞淋巴瘤(cutaneous T-cell lymphoma,CTCL)、巨顆粒淋巴性白血病(large granular lymphocytic leukemia)、霍杰金氏疾病(Hodgkin's disease)和里德-斯泰伯格氏疾病(Reed-Sternberg disease)。

所述式(I)化合物的施予劑量將會視治療、預防或管理的具體徵狀，以及患者的年齡、性別和生理狀況而定。上述因子之重要性在所屬領域中眾所周知，此外，亦可用日常實驗來提供其重要性。

5.藥學配方

本發明包含用以治療/預防一發炎和/或腫瘤相關疾病的藥學組合物，其包含一治療或預防有效量之式(I)化合物。

若以上述藥學組合物總重量為基準，本發明之式(I)化合物約佔該藥學組合物總重量的0.1%至99%(重量%)。在某些實施方式中，本發明之式(I)化合物 的量至少約佔該藥學組合物總重量的1%。在特定的實施方式中，所述式(I)化合物的量至少約佔該藥學組合物總重量的5%。在其他實施方式中，所述式(I)化合物的量至少約佔該藥學組合總重量的10%。在另一實施方式中，所述式(I)化合物的量至少約佔該藥學組合物總重量的25%。

在部分較佳的實施方式中，所述藥學組合物更包含一化療藥劑或一麩胱甘肽生物合成阻斷劑。所述化療藥劑可選自於由DET、PLX4032、多烯紫杉醇、紫杉醇、順鉑、奧沙利鉑、樺木酸、4-S-半胱胺兒茶酚、4-S-半胱胺酚、依維莫司、硼替佐米、卡鉑定、達卡巴嗪、塞來昔布、替莫唑胺、蕾莎瓦、沙利多邁、來那度胺、丙戊酸、長春鹼、甲磺酸伊馬替尼、波生坦、阿波胺、三氧化砷、卡莫司汀、拉鉑立茲瑪、抗CTLA-4藥物、抗程式性死亡受體-1(PD-1)藥物、易普利姆瑪、崔枚利姆瑪、艾黴素、MEK抑制劑、卡培他濱、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑、哺乳類雷帕黴素之標靶(mTOR)抑制劑和他莫昔芬所組成的物質群組中。依據其他較佳的實施方式，所述化療藥劑可以是DET、紫杉醇或PLX4032；以及所述麩胱甘肽生物合成阻斷劑可以是丁硫堇硫醯亞胺(BSO)或柳氮磺胺吡啶。

依據本發明某些特定實施方式，適合以所述藥學組合物來治療之炎症是選自由發炎性皮膚病、發炎性腸疾病、過敏性肺部疾病、氣喘、過敏性鼻炎、自體免疫疾病、急性和慢性炎症、修格連氏症候群、人類免疫不足病毒感染及癌症組成的群組中。

依據本發明其他特定實施方式，適合以所述藥學組合物來治療之腫瘤相關疾病是一癌症，其係選自於乳癌、皮膚乳頭狀瘤、黑色素瘤、腦癌、肺癌、淋巴瘤、神經上皮瘤、腎癌、前列腺癌、胃癌、大腸癌及子宮癌所組成的群組中。依據某些實施方式，該癌症是一抗藥性癌症。在一實例中，該癌症是對PLX4032具有抗藥性的黑色素瘤。

依據本發明一特定實施方式，所述藥學組合物可降低該罹患癌症個體皮膚因施用化療藥劑(如，PLX4032)所造成的副作用，例如減少因PLX4032所誘發的皮膚乳頭瘤的數目及大小。

所述藥學組合物為單一劑型可經由口服、黏膜(如，經鼻(nasal)、舌下(sublingual)、陰道(vaginal)、經頰(buccal)或直腸(rectal))、腸胃外(parenteral)(即，皮下注射(subcutaneous)、靜脈注射(intravenous)、彈九注射(bolus injection)、肌肉內注射(intramuscular)或動脈注射(intra-arterial))或經皮(transdermal))的方式施用至患 者。所述劑型的實例包含，但不限於：片劑(tablets)、錠劑(caplets)、膠囊(capsules)，例如，軟式彈性明膠膠囊(soft elastic gelatin capsules)、扁囊劑(cachets)、口含片(troches)、菱形釘劑(lozenges)、分散劑(dispersions)、栓劑(suppositories)、軟膏(ointments)、粥狀敷劑(cataplasms)(又稱，糊劑(poultices))、貼劑(pastes)、粉末(powders)、敷料(dressings)、乳霜(creams)、膏劑(plasters)、溶液(solutions)、貼片(patches)、氣霧劑(aerosols)(如，鼻噴劑或吸入劑)、凝膠(gels)。本發明之藥學組合物可以是液態的劑型，適用於口服或經黏膜的方式施用至患者，包含懸浮液(如，水溶性或非水溶性液體懸浮液，水包油乳劑或油包水乳劑)、溶液和酏劑(elixirs)；再者，本發明之藥學組合物亦可為適用於腸胃外方式施用的液體劑型；以及，該藥學組合物可以是無菌固體(如，晶體(crystalline)或非晶型固體(amorphous solids))，可再調配以提供腸胃外施用的適當液體劑型。

本發明之化合物可針對不同的施用途徑進行配方。舉例而言，若以口服方式施用，則需塗覆一腸衣膜保護本發明之化合物，以避免本發明之化合物經過腸胃道時被降解。所述配方亦可還有其他成分，使其能將有效成分傳遞至作用位置。舉例而言，化合物可以利用脂質體配方，以避免有效成分遭受酵素降解、在循環系 統中傳送，並且使有效成分通過細胞膜傳送至胞內位置。

另外，水溶性較差的化合物可添加溶解劑、乳化劑和界面活性劑配置成液體劑型(和適於再配置的劑型)。所述添加劑包含但不限於，環糊精(cyclodextrin)(如，α-環糊精或β-環糊精)和非水溶液溶劑，其包含但不限於，乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲醯胺、二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide,DMSO)、生物相容性油(biocompatible oils)(如，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油、甘油、四氫呋喃甲醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇、山梨糖醇酐的脂肪酸酯(fatty acid esters of sorbitan)和以上化合物的混合物(如，DMSO和玉米油之混合物)。

所述藥學組合物配方的類型和型態，依其用途而異。舉例而言，相較於用於慢性治療的劑型而言，用於急性治療的劑型會包含較大量的單一或多種活性成分。相對地，不經腸胃道的劑型可含較少量的單一或多種活性成分，其用量低於以口服劑型治療相同疾病所使用的活性成分用量。本發明亦涵蓋其他施用途徑所使用的劑型，其會隨著所屬技術領域通常技術內容而改變(參見Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing,Easton PA(1990))。

5.1口服劑型

本發明之藥學組合物適用於口服，可以是離散劑型，包含但不限於，片劑(即，咀嚼片(chewable tablets))、錠劑、膠囊和液體(即，調味糖漿)。可根據眾所接受的藥學製程來製備上述口服劑型，如Remington’s Pharmaceutical Sciences(18th ed.,Mack Publishing,Easton PA(1990))中所述的製程。所述口服劑型包含一預設活性成分的量，且可依據習知技術的藥學方法製備而成。一般的口服劑型可依照通常的藥學製程製備，配方成至少含有一種賦形劑。本發明之配方可搭配使用多種不同形式的賦形劑，視特定施用方式所需的劑型而定。

基於片劑和膠囊易於施用的特性，此二劑型為口服劑量劑型最佳的單位形式。視使用需求，可藉由標準水溶液或非水溶液技術進行包衣；亦可藉由常規藥學製程製備所述劑型。通常藥學組合物和劑型藉由混合活性成分與液體載體或磨碎的固體載體，或同時混合活性成分和液體、固體載體，再將產物定型至預設形式。再者，固體劑型可含有崩解劑，以增加溶解率；且固體劑型亦可含有潤滑劑，以利製造各種劑型(例如，片劑)。

5.2不經腸胃道的劑型

不經腸胃道的劑型的施用途徑包含，但不限於，皮下注射、靜脈注射(含彈丸注射)，肌肉內注射、動脈注射。當施用不經腸胃道的劑型，必需避免患者遭受污染物質感染，致使體內產生對抗污染物的免疫反應，因此，不經腸胃道的劑型必須是無菌的。不經腸胃道的劑型包含，但不限於，用於注射的液態配方、粉末狀配方且其可溶解或懸浮於藥學上可接受注射的載體，以及乳狀配方。

不經腸胃道的劑型可包含習知的載體。舉例而言，包含，但不限於，水和水溶性載體。所述水溶性載體包含，但不限於，氯化鈉溶液、林格氏溶液和葡萄糖溶液；水混溶性載體(water-miscible vehicles)的實例包含，但不限於，乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；且非水溶性載體包含，但不限於，玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate)和苯甲酸苯甲酯。

5.3經皮膚、局部和黏膜劑型

經皮膚、局部和黏膜劑型包含，但不限於眼藥水溶液(ophthalmic solutions)、噴霧劑、氣霧劑、乳霜、乳液、軟膏、凝膠、溶液、乳化劑、懸浮液或其他所屬領域具有通常知識者已知的型式(參見Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th eds.,Mack Publishing, Easton PA(1990))。經皮膚劑型包含「儲液型(reservoir type)」和「基質型(matrix type)」的貼片，所述貼片可施用於皮膚且經一特定貼附期間後，活性成分能穿透皮膚進入人體體內。

適用於本劑型的賦形劑(即，載體和稀釋劑)以及其他化學領域已知可應用至經皮膚、局部和黏膜劑型的物質皆可應用至所述配方，且針對特定組織所給予藥學組合物或劑型亦可應用至所述配方當中。

針對特定的治療組織，在施用本發明之活性成分的同時或前/後，可給予額外的成分。舉例而言，可額外添加穿透增強劑(penetration enhancers)，協助傳遞活性成分至組織中。

可調整藥學組合物或劑型的pH值，或接受藥學組合物或劑型施用組織的pH值，以改善單一或多種活性成分的傳遞效率。再者，可藉由調整溶劑載體的極性、離子強度或張力，以改善傳遞效率。除此之外，本發明之藥學組合物或劑型可以添加硬脂酸鹽，以改變一或多個活性成份的親水性或親脂性，進而改善傳遞的效率。據此，硬脂酸鹽可作為脂質載體，亦可作為乳化劑或表面活性劑或作為一傳遞增強劑或穿透增強劑。另外，亦可利用活性成分的各種鹽類、水合物或溶劑化物進一步調整最終組合物之特性。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

實施例 材料與方法 細胞培養

本實驗的細胞材料為：小鼠巨噬細胞(murine macrophage)RAW 264.7、人類正常上皮細胞株(human normal epithelial cell line)M10以及黑色素細胞(melanocyte)、黑色素瘤細胞株，包含：小鼠B16-F10(N-RAS突變)、人類MeWo(B-RAF和N-RAS野生型)、人類A375、A2058(B-RAF^V600E突變)、人類A375-R(對威羅非尼(vemurafenib)具有抗性的人類A375細胞)和人類SK-Mel-2(N-RAS突變)。乳癌細胞株包含：小鼠TS/A(ER+)、人類MDA-MB-231(ER-、Her2-、PR-)、人類MCF-7(ER+、Her2-)、人類SKBR3(ER-、Her2+)、人類BT474(ER+、Her2+)。腦癌細胞株U-87MG、大腸癌細胞株HCT-116、 腎癌細胞株A498、肺癌細胞株PC6、淋巴瘤細胞株U937、神經上皮瘤細胞株SK-N-MC、胃癌細胞株KATO III和子宮癌細胞株NES-SA。以上細胞株來自於ATCC(Manassas、VA)，並依照製造商建議的培養基進行培養，並於培養基中添加了10%胎牛血清(FBS)、100U/mL盤尼西林、和100μg/mL鏈黴素。細胞培養條件為37℃且內部有潮濕空氣與5%CO₂的培養箱中。

動物

雌性NOD/SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdcscid/IcrCrlBltw)、SCID小鼠(CB17-Prkdcscid/IcrCrlBltw)和FVB/N小鼠購自台灣實驗動物中心(BioLASCO Taiwan Co.,Ltd)。小鼠可自由食用實驗室的標準鼠飼料和蒸餾水，且飼養環境的光：暗循環期間分別為12小時：12小時，飼養溫度維持在22±2℃。所有實驗步驟經中央研究院實驗動物照護與使用委員會(台灣，中華民國)審核認可。

細胞存活率分析

將一般正常細胞或癌症細胞(2×10³至1×10⁴細胞/孔)接種於96-孔盤中，進行隔夜培養；細胞個別再以不同的化合物處理24至72小時。以MTT比色分析法測定細胞生長的情形。關於試驗細胞存活率之計算方式，其中單以載體(0.5%DMSO)處理的細胞存活率，定義為存 活率100%。經DETDs處理的細胞存活率，以下列公式計算：存活細胞數目(%)=OD₅₇₀(經處理的細胞)/OD₅₇₀(載體控制組)×100。

細胞趨性分析(Boyden chamber assay)

利用博伊登室(Boyden chamber)分析DET、DETD-35和PTX的抗遷移性和抗侵襲效力。以10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)作為趨化因子，與DMEM培養基(含0.05%DMSO、DET(2.5和4μM)、DETD-35(1.25和2.5μM)或PTX(2.5和4μM))添加至博伊登室下腔室中(直徑：6.5mm、孔徑：8mm Costar,Cambridge,MA,USA)。將MDA-MB-231細胞(5×10⁴cells/室)置於博伊登室上腔室中，並添加培養基(含0.1%FBS)。細胞培養於溫度條件37℃；含5%CO₂的大氣環境下，經24小時培養後，利用棉棒刮取膜上表面之非遷移細胞；而留在膜下的遷移細胞以DAPI溶液(1μg/ml 4,6-二甲脒-2-苯基吲哚)染色。以倒位螢光顯微鏡觀察遷移的細胞，其細胞計數的方式係以20X原放大倍率，計算三個區域內的細胞數。為了試驗化合物的抗侵襲效力，8-μm孔徑大小的過濾膜需先塗覆30μg凝膠基質(Matrigel)，培養在37℃，2小時；接著，以所述遷移分析步驟進行後續試驗。

化合物-藥物結合力分析

以指定濃度範圍中的DETDs和PLX4032或者是DETDs和PTX來測定DETDs和PLX4032或者是DETDs和PTX之間的協同效果。簡言之，將細胞(1.5×10³至5×10³細胞/孔)接種至96-孔盤中，再透過個別單獨施用化合物或藥物，或者是併用化合物及藥物對細胞進行處理，處理時間為24至72小時。以MTT分析法測量細胞增殖。以等效線圖分析(Isobologram analysis)和Chou-Talalay法測定化合物及藥物併用的效果。以併用係數(combination index,CI)測定DETDs和PLX4032或者是與PTX的相互作用，並利用CompuSyn軟體產生CI圖。二化合物的結合效力可歸納如下：當CI=1，代表相加作用(additive interaction)、當CI<1，代表協同作用(synergism)以及當CI>1，代表拮抗作用(antagonism)。

即時顯微攝影分析(Time-lapse microscope analysis)

取一12孔細胞培養盤，在其中塗覆25μg/ml纖維黏連蛋白(fibronectin)，經過1小時之後，將5×10⁴MDA-MB-231細胞接種至培養盤，並以DMEM(含10%血清)培養。接種後12小時，以倒立共軛聚焦顯微鏡(LSM 510 META)進行即時顯微攝影實驗(每30分鐘記錄一次影像)，該顯微鏡具備有光學相位差的環境室。使用Metamorph軟體(Molecular Devices)的物體追踪應用程式， 評估12個細胞在連續影像之間細胞核位移的平均值，作為細胞遷移速率。整體而言，細胞軌跡需持續記錄24小時。在即時攝影記錄一開始，細胞分別加入載體(DMSO，0.05%)、DET(2.5、4和10μM)以及DETD-35(1.25、2.5、4μM)進行處理，以完成上述的分析。

西方墨點法分析

依據先前公開文獻所述的實驗流程(Chiang et al.,British J Pharmacol 2005,146(3)：352-363.)，製備試驗細胞中的總細胞蛋白。以Bradford法(Bio-Rad)測定蛋白濃度。蛋白質樣本以5%至20%梯度SDS-PAGE解析，接著進行免疫轉漬。對抗ERK1/2和GAPDH之初級抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA,USA)，以及MEK、磷酸化ERK1/2(phospho-ERK1/2)和磷酸化MEK(phospho-MEK)皆購自Cell Signaling Technology(Danvers,MA,USA；並選用適當的山葵過氧化氫酶(horseradish peroxidase-conjugated)結合的次級抗體。利用增強的化學冷光(Amersham)及暴露於化學冷光的光片(BioMax；Kodak Co.)觀察與特定抗體反應的蛋白質帶。

測定一氧化氮(nitric oxide,NO)的產量

以化合物處理巨噬細胞(2×10⁵細胞/孔；96孔盤)，處理時間1小時，接著分別加入培養基(有/無添加100ng/μL LPS)，培養時間24小時。以Griess反應 法(參見Green et al.,Analytical Biochemistry 1982,126(1)：131-138.)測定細胞培養基中的亞硝酸濃度。為了對照Griess反應法所測得的結果，以MTT比色法測定巨噬細胞的存活率。

麩胱甘肽生物合成阻斷劑與DET和DETD-35對抗癌細胞增殖的協同效果

麩胱甘肽生物合成阻斷劑、丁硫堇硫醯亞胺(BSO)或柳氮磺胺吡啶，與DET或DETD-35併用經測定證實具有協同效果。簡言之，將細胞(5×10³細胞/孔)接種於96-孔盤並以BSO(濃度：100μM、45μM、18μM、7.2μM、2.8μM、1.15μM、461nM、184nM、74nM和29nM)和柳氮磺胺吡啶(62.75μM、25.10μM、10μM、4μM、1.6μM、642nM、257nM、102nM、41nM和16.4nM)進行前處理，處理時間30小時，接著添加12μM DET或3μM DETD-35至培養基中，經24小時之後，再以MTT進行分析。

抑制NOD/SCID小鼠黑色素瘤生長

本實施例以載有A375或A375-R黑色素瘤細胞的NOD/SCID小鼠(6週齡)，研究單獨使用PLX4032、DET、DETD-35、DET+ PLX4032或DETD-35 +PLX4032對黑色素瘤的影響。3x10⁶之A375或A375-R黑色素瘤細胞於第0天以皮下注射方式接種至NOD/SCID小鼠的 側腹上。接著，讓小鼠體內的腫瘤生長7天。之後，將實驗動物隨機分配為七組(n=8/組)：偽控制組(sham)，腫瘤(載體)控制組，PLX4032處理組(每天施予一次)、DET或DETD-35(每隔2天施予一次)處理組，以及PLX4032+DET處理組(每隔2天施予一次PLX4032+每隔4天施予一次DET)或PLX4032+DETD-35處理組(每隔2天施予一次PLX4032+每隔4天施用一次DETD-35)，其中PLX4032、DET或DETD-35係以腹腔注射(intraperitoneally,i.p.)方式注射至實驗動物體內，施予劑量為20毫克/公斤，在A375-R實驗中PLX4032的用量為75毫克/公斤。每隔3天測量一次小鼠的體重和其體內種瘤直徑，在第33天，試驗小鼠以頸椎脫位法(cervical dislocation)犧牲，採集腫瘤並以游標卡尺測量腫瘤的體積(V)，並以公式V=(L×W²)/2計算，其中L為腫瘤的長度，而W為腫瘤的寬度。

抑制NOD/SCID小鼠乳腺瘤生長

本實施例以載有MDA-MB-231癌細胞的NOD/SCID小鼠(6週齡)，研究DETD-35對乳腺瘤的影響。於第0天，注射5×10⁶MDA-MB-231細胞(溶於100μL凝膠基質(9.1毫克/mL)(Basement Membrane Matrix,Phenol Red-free))至小鼠乳腺脂肪墊。接著，讓小鼠體內的腫瘤生長，生長期間為7天。將實驗動物隨機分配為 三組(n=5/組)：偽控制組(sham)、腫瘤(載體)控制組和DETD-35(10毫克/公斤)處理組。DETD-35以腹腔注射(intraperitoneally,i.p.)方式注射至實驗動物體內(注射頻率：每三天一次)。每隔3天測量一次小鼠的體重和其體內種瘤直徑，在第71天，試驗小鼠以頸椎脫位法(cervical dislocation)犧牲，採集腫瘤並以游標卡尺測量腫瘤的體積(V)，並以公式V=(L×W²)/2計算，其中L為腫瘤的長度，而W為腫瘤的寬度。

抑制SCID小鼠中MDA-MB-231細胞之肺轉移

將雌性SCID小鼠(5週齡)分配至8個組別，分別為：PTX組(5毫克/公斤紫杉醇)、DETD-35-2組(2毫克/公斤DETD-35)、DETD-35-10組(10毫克/公斤DETD-35)、PTX-5+DETD-35-2組(5毫克/公斤紫杉醇和2毫克/公斤DETD-35；交互施用7個劑量之PTX和10個劑量之DETD-35)、腫瘤(載體)組(5%DMSO)和偽控制組(5%DMSO)。Pre-DETD-35-10組為i.v.注射1×10⁶MDA-MB-231細胞至小鼠體內前，且每兩天施用10毫克/公斤DETD-35至小鼠體內，每兩天一劑共施用三劑。所有其他藥物或化合物從試驗第1天起，每三天以i.p.注射的方式，注入小鼠體內。試驗最後一天(第71天)，以頸椎脫位法犧牲小鼠。接著，摘除小鼠肺部、肝臟、 腎臟和脾臟並記錄各器官的重量，並計算器官指數(器官重量/體重%)。計算試驗小鼠肺部的腫瘤聚落數。

兩階段皮膚癌動物模型

以二甲基苯并[a]蒽(dimethylbenz[a]anthracene,DMBA)(濃度為25微克溶於100微升丙酮中)處理6週齡大已剔毛的FVB/N雌鼠背部皮膚，一週後再以佛波醇-12-十四烷醯-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)(濃度為4微克溶於100微升丙酮中)局部處理已經DMBA處理過的皮膚部位，TPA處理頻率為每週2次。每週定期評估新生的腫瘤大小及數目，皮膚突起處直徑超過1毫米即稱為腫瘤。

實施例1 製備式(I)化合物 1.1製備去氧膽草素(DET)

以三倍體積的丙酮萃取乾燥的燈豎朽(Elephantopus scaber L.(Asteraceae))，萃取期間為3天，並重複2-3次；接著，將得到的粗萃物以醋酸乙酯(ethyl acetate,EA)進行分劃萃取，得到EA分劃萃取物。所述EA萃取物以矽膠管柱層析進行純化，洗提液為正己烷(hexane,H)/EA洗提液溶劑(H：E/3：1、H：E/1：1和H：E/1：2，v/v)。以薄層色層分析或HPLC分析確認DET分劃萃取物(DET containing fraction)。利用RP-18矽膠管柱層析(5μ,150×4.6mm)來確定DET分劃萃取物的HPLC條件或 DET純度，洗提液為55%MeOH。利用MPLC系統中的RP-C18管柱進行層析並收集DET分劃萃取物，洗提液的條件為：30%甲醇(MeOH)，2.5管柱體積(column volume,CV)、30-55%MeOH，5CV和55%MeOH，9.5CV。收集大量的DET分劃萃取物並以旋轉蒸發器蒸發乾燥。將乾燥的化學粉末溶解於丙酮中，得到DET結晶。以電灑游離質譜儀(ThermoFinnigan LCQ,San Jose,CA,USA)以及¹H和¹³C NMR(Brüker ADVANCE 500 AV)分光計鑑定DET的結構，並與先前公開文獻所揭示的光譜數據(But PPH et al.,Phytochemistry 1997,44(1)：113-116.)比對確認。

1.2合成DET衍生物(DETD) 1.2.1 DETD-1：

以公開文獻(Zhang et al.,Phytochemistry 1986,25(4)：899-904.)所揭示的內容和以下方法合成DETD-1及確認其結構。

1.2.2 DETD-3至DETD-62：

DETD-3衍生自DET。而依據前述流程圖1 所示的方法A、B或C，DETD-4至DETD-62衍生自DETD-3。

1.2.2.1 DETD-3：

在0℃下，將25毫升1N NaOH水溶液加入DET溶液(1.023克DET溶於25毫升二氧六環(dioxane))中。將混合物置於室溫下，持續攪拌至隔夜，接著冷卻至0℃。所述混合物加入2N HCl溶液進行酸化，並持續攪拌30分鐘。以AcOEt萃取二次，再以5%MeOH/AcOEt萃取。以鹵水(brine)清洗結合的有機層，接著以Na₂SO₄乾燥後，最後進行真空濃縮。得到的殘留物以SiO2管柱層析進行純化，得到新的C-8內酯DETD-3(C-8 lactone DETD-3)(0.744g,91%)。

DETD-3光譜數據：高解析質譜分析(High-Resolution Mass Spectroscopy)：C₁₅H₁₆O₅(M⁺+Na)299.0890的m/z計算值為299.0883。質子核磁共振(Proton Nuclear Magnetic Resonance)(¹H-NMR,400MHz,2%CD₃OD/CDCl₃)σ 6.94(1H,s)、6.41(1H,dd,J=2.9和1.2Hz)、6.32(1H,d,J= 2.9Hz)、5.47-5.43(1H,m)、4.56(1H,br d,J=10.0Hz)、4.27(1H,t,J=9.7Hz)、4.10(1H,ddd,J=10.7,6.4和1.6Hz)、3.19(1H,ddd,J=13.1,3.8和1.6Hz)、2.89-2.82(1H,m)、2.77(1H,dd,J=13.5和4.7Hz)、2.67(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.57(1H,br d,J=13.5Hz)、1.71(3H,d,J=1.4Hz)。¹³C核磁共振(¹³C-NMR,400MHz,DMSO-d₆)σ 172.9、169.4、155.2、140.3、136.3、127.2、126.2、125.7、80.9、78.5、67.7、50.9、40.5、31.8、19.0。

DETD-3 X射線晶體結構分析係在中央研究院化學所的X射線實驗室(台灣)執行。晶體數據和結構最佳化參數示於表2中。

1.2.2.2製備DETD-4至DETD-62

依據下列方法A、B或C，自DETD-3中製備出DETD-4至DETD-62。

方法A：將相關的羧酸(R₁COOH)、1-(3-二 甲基氨丙基)-3-乙基碳二醯亞胺氯化氫(EDCI)和二甲基胺基吡啶(dimethylaminopyridine,DMAP)加入至DETD-3溶液(DETD-3溶於二氯甲烷)。在室溫下，持續攪拌混合物至隔夜。以標準操作(Standard work-up)得到DETD-4至DETD-31、DETD-35，以及DETD-39至DETD-61的相關酯類。R₁基團可以是烷基、支鏈烷基、環烷基、帶有取代基的烷基、芳香基或帶有取代基的雜芳基、烯基、炔基等。

方法B：將相關的酸氯化物(R₁COCl)和三乙胺加入至DETD-3溶液中(DETD-3溶於二氯甲烷)。在室溫下，持續攪拌混合物至隔夜。以標準操作得到DETD-32至DETD-34，以及DETD-36至DETD-38的相關酯類。

方法C：在室溫下，依據標準Mitsunobu條件(參見Calvert et al.,Chemico-biological Interactions 1998,111-112：213-224.)，亦即，在偶氮二甲酸二乙酯(diethyl azodicarboxylate,DEAD)、三苯基膦(triphenylphosphine,PPh3)存在下，以1-萘乙酸處理DETD-3溶液(溶於四氫呋喃)，而得到DETD-62(epi-DETD-35)。

DETDs 4-62光譜數據

DETD-4(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.93(1H,s)、6.40(1H,d,J=2.7Hz)、7.516.10(1H,d,J=9.6Hz)、5.94(1H,d,J=2.1Hz)、5.65(1H,s)、5.45(1H,br s)、5.39(1H,t,J=10.0Hz)、4.57(1H,d,J=10.0Hz)、4.23(1H,dd,J=10.1和6.5Hz)、3.28(1H,d,J=13.1Hz)、3.15(1H,ddd,J=10.0,6.5和3.3Hz)、2.79(1H,dd,J=13.6和4.9Hz)、2.68(1H,dd,J=13.1和10.8Hz)、2.54(1H,d,J=13.6Hz)、1.95(3H,s)、1.87(3H,s)。

DETD-5(方法A，包含2%順式異構物)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.91(1H,s)、6.75(1H,dt,J=7.4和1.2Hz)、6.39(1H,d, J=2.9Hz)、7.515.93(1H,d,J=2.9Hz)、5.48-5.40(1H,m)、5.39(1H,t,J=10.0Hz)、4.46(1H,d,J=10.0Hz)、4.23(1H,ddd,J=10.7,6.6和1.6Hz)、3.32-3.22(1H,m)、3.19-3.02(2H,m)、2.78(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.68(1H,dd,J=13.1和10.8Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.25-2.16(2H,m)、1.86(3H,d,J=1.4Hz)、1.83(3H,s)、1.06(3H,t,J=7.5Hz)。

DETD-6(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.71(1H,d,J=16.0Hz)、7.55-7.50(2H,m)、7.44-7.38(3H,m)、6.94(1H,s)、6.41(1H,d,J=9.6Hzs)、7.516.40(1H,d,J=16.0Hz)、6.00(1H,d,J=2.5Hz)、5.50-5.44(2H,m)、4.51(1H,d,J=10.0Hz)、4.25(1H,ddd,J=10.5,6.5和1.6Hz)、3.33-3.26(1H,m)、3.19-3.11(1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.69(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.55(1H,d,J=13.5Hz)、1.89(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-7(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.61(1H,d,J=15.8Hz)、6.93(1H,s)、6.74(2H,d,J=9.6Hz)、7.516.41(1H,d,J=2.8Hz)、6.31(1H,s)、6.27(1H,s)、6.00(1H,d,J=2.8Hz)、5.52-5.43(2H,m)、4.50(1H,d,J=10.1Hz)、4.26(1H,ddd,J=10.1,6.6和1.7Hz)、3.89(9H,s)、3.29(1H,dd,J=13.1和1.7Hz)、3.14(1H,ddd,J=13.1,6.6和3.1Hz)、2.81(1H,dd,J=13.1和4.8Hz)、2.69(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.1Hz)、1.89(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-8(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、7.516.39(1H,d,J=2.9Hz)、5.96(1H,d,J=2.9Hz)、5.69(1H,s)、5.47-5.41(1H,m)、5.52-5.43(2H,m)、5.34(1H,t,J=10.0Hz)、4.45(1H,d,J=9.6Hz)、4.25-4.17(1H,m)、3.26(1H,d,J=13.1Hz)、3.10-3.01(1H,m)、2.78(1H,dd,J=13.1和4.9Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.1Hz)、2.16(3H,s)、1.92(3H,s)、1.86(3H,s)。

DETD-9(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.95(1H,s)、6.50(1H,d,J=2.9Hz)、6.19(1H,d,J=2.9Hz)、5.93(1H,s)、5.50-5.44(1H,m)、5.32(1H,t,J=10.1Hz)、4.20(1H,ddd,J=10.1,6.5，和1.5Hz)、3.28(1H,br d,J=13.1Hz)、3.21(1H,ddd,J=13.1,6.3，和3.1Hz)、2.83(1H,dd,J=13.1和4.8Hz)、2.69(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.57(1H,d,J=13.1Hz)、1.86(3H,d,J=1.2Hz)。

DETD-10(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.42(1H,d,J=2.8Hz)、5.97(1H,d,J=2.8Hz)、5.46-5.42(1H,m)、5.28(1H,t,J=10.1Hz)、4.42(1H,d,J=10.0Hz)、4.16(1H,ddd,J=10.0,6.5，和1.6Hz)、3.26(1H,dd,J=13.1和1.6Hz)、3.05(1H,ddd,J=13.0,6.2，和3.2Hz)、2.79(1H,dd,J=13.1和4.8Hz)、2.65(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.1Hz)、2.24-2.14(2H,m)、2.14-2.03(1H,m)、1.84(3H,d,J=1.2Hz)、0.93(6H,d,J=6.6Hz)。

DETD-11(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,br s)、6.50-6.42(1H,m)、6.17-5.95(1H,m)、 5.44(1H,br s)、5.31-5.11(1H,m)、4.46-4.32(1H,m)、4.24-4.15(1H,m)、3.26(1H,br d,J=12.9Hz)、3.14-3.02(1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.70-2.61(1H,m)、2.60-2.51(1H,m)、2.06(3H,s)、1.84(3H,br s)、0.88(3H,t,J=7.6Hz)。

DETD-12(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.91(1H,s)、6.40(1H,d,J=2.5Hz)、5.96(1H,d,J=2.5Hz)、5.63(1H,s)、5.46-5.41(1H,m)、5.34(1H,t,J=10.1Hz)、4.46(1H,d,J=10.1Hz)、4.24-4.16(1H,m)、3.30-3.22(1H,m)、3.10-3.02(1H,m)、2.78(1H,dd,J=13.5和4.7Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.44-2.34(1H,m)、2.12(3H,d,J=1.3Hz)、1.86(3H,d,J=1.3Hz)、1.07(3H,t,J=6.8Hz)。

DETD-13(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.43(1H,d,J=2.8Hz)、6.0和5.98(1H,d,J=2.8Hz,1：1)、5.46-5.41(1H,m)、5.25(1H,t,J=10.1Hz)、4.41(1H,d,J=10.3Hz)、4.19(1H,dd,J=10.3和6.3Hz)、3.07(1H,ddd,J=13.1,6.4和3.3Hz)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.5Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.40-2.30(1H,m)、1.84(3H,brs)、1.72-1.58(1H,m)、1.55-1.40(1H,m)、1.13和1.12(3H,d,J=7.0Hz,1：1)、0.88和0.87(3H,t,J=7.4Hz,1：1)。

DETD-14(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.93(1H,s)、6.48-6.32(1H,m)、6.06-5.88(1H,m)、5.44(1H,br s)、5.40-5.20(1H,m)、5.16-5.01(1H,m)、4.51-4.39(1H,m)、4.24-4.13(1H,m)、3.29-3.20(1H,m)、3.14-3.00(1H,m)、2.84-2.50(4H,m)、2.17和2.14(3H,br s)、1.86和1.83(3H,br s)、1.99-1.56(10H,m)。

DETD-16(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.44(1H,dd,J=3.1和0.8Hz)、6.02(1H,dd,J=2.6和0.8Hz)、5.46-5.41(1H,m)、5.26(1H,t,J=10.1Hz)、4.40(1H,br d,J=10.1Hz)、4.18(1H,ddd,J=10.1,6.3和1.7Hz)、3.26(1H,dd,J=13.0和2.2Hz)、3.07(1H,ddd,J=13.0,6.1和3.0Hz)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.6Hz)、2.65(1H,dd,J=13.0和10.7Hz)、2.53(1H,br d,J=13.5Hz)、2.22-2.14(1H,m)、1.85(3H,d,J=1.4Hz)、1.66-1.44(4H,m)、0.86(3H,t,J=1.4Hz)、0.85(3H,t,J=1.4Hz)。

DETD-17(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.93(1H,s)、6.43(1H,dd,J=3.1和0.8Hz)、5.96(1H,dd,J=2.7和0.8Hz)、5.47-5.42(1H,m)、5.28(1H,t,J=10.0Hz)、4.44(1H,br d,J=10.0Hz)、4.18(1H,ddd,J=10.7,6.4和1.7Hz)、3.27(1H,ddd,J=13.3,3.8和1.7Hz)、3.05(1H,ddd,J=13.0,6.4和3.1Hz)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.65(1H,dd,J=13.0和10.7Hz)、2.53(1H,br d,J=13.5Hz)、2.06(3H,s)、1.83(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-18(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.43(1H,d,J=3.1Hz)、5.97(1H,d,J=2.7Hz)、5.46-5.41(1H,m)、5.28和5.27(1H,t,J=10.0Hz, 1：1)、4.42(1H,d,J=10.0Hz)、4.18(1H,dd,J=10.6和6.1Hz)、3.26(1H,br d,J=13.3Hz)、3.09-3.01(1H,m)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.8Hz)、2.65(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.32和2.28(1H,dd,J=15.0和6.1Hz,1：1)、2.14-2.03(1H,m)、1.92-1.80(1H,m)、1.84(3H,d,J=1.2Hz)、1.39-1.15(4H,m)、0.92-0.85(6H,m)。

DETD-19(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.40(1H,d,J=3.1Hz)、6.12(1H,d,J=0.6Hz)、5.93(1H,d,J=2.7Hz)、5.61(1H,d,J=1.4Hz)、5.47-5.42(1H,m)、5.41(1H,t,J=10.0Hz)、4.47(1H,d,J=10.0Hz)、4.23(1H,ddd,J=10.5,6.5和1.7Hz)、3.28(1H,dd,J=13.3和1.8Hz)、3.14(1H,ddd,J=12.8,6.5,和3.3Hz)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.68(1H,dd,J=13.1和10.6Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.38-2.26(2H,m)、1.86(3H,d,J=1.4Hz)、1.07(3H,t,J=7.4 Hz)。

DETD-20(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,br s)、6.44(1H,d,J=3.1Hz)、6.02-5.96(1H,m)、5.46-5.42(1H,m)、5.24和5.23(1H,t,J=10.1Hz,1：1)、4.40(1H,d,J=9.8Hz)、4.18(1H,dd,J=9.8和6.4Hz)、3.27(1H,dd,J=13.1和1.6Hz)、3.12-3.04(1H,m)、2.79(1H,dd,J=13.6和4.8Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.48-2.36(1H,m)、1.84(3H,br s)、1.68-1.55(1H,m)、1.44-1.22(3H,m)、1.13和1.12(3H,d,J=6.9Hz,1：1)、0.89(3H,t,J=7.2Hz)。

DETD-21(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.94(1H,br s)、6.43(1H,d,J=2.9Hz)、6.01(1H,d,J=2.5Hz)、5.46-5.42(1H,m)、5.26(1H,t,J=10.3Hz)、4.40(1H,d,J=10.0Hz)、4.22-4.14(1H,m)、3.25(1H,dd,J=13.1和1.8Hz)、3.12-3.03(1H,m)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.52(1H,d,J=13.5Hz)、2.28-2.20(1H,m)、1.85(3H,d,J=1.2Hz)、1.69-1.38(4H,m)、1.35-1.10(4H,m)、0.92-0.81(6H,m)。

DETD-22(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.93(1H,br s)、6.43(1H,br d,J=3.1Hz)、6.00(1H,br d,J=2.5Hz)、5.47-5.42(1H,m)、5.24(1H,t,J=10.0Hz)、4.41(1H,d,J=10.0Hz)、4.18(1H,ddd,J=10.7,6.3和1.6Hz)、3.25(1H,dd,J=13.1和2.0Hz)、3.07(1H,ddd, J=12.7,6.4，和3.1Hz)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.8Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.45-2.34(1H,m)、1.84(3H,d,J=1.4Hz)、1.70-1.54(2H,m)、143-1.16(4H,m)、1.13(3H,d,J=7.0Hz)、0.88(3H,t,J=7.0Hz)。

DETD-23(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.45(1H,d,J=3.1Hz)、5.99(1H,d,J=2.5Hz)、5.48-5.42(1H,m)、5.29(1H,t,J=10.1Hz)、4.41(1H,br d,J=10.1Hz)、4.19(1H,ddd,J=10.1,6.4和1.6Hz)、3.76(1H,br s)、3.26(1H,dd,J=13.1和2.0Hz)、3.12-3.04(1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.4和4.8Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.0Hz)、2.52(1H,br d,J=13.4Hz)、2.40(2H,s)、1.98-1.88(2H,m)、1.83(3H,d,J=1.4Hz)、0.91(6H,t,J=7.3Hz)、0.89-0.82(6H,m)。

DETD-24(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.01(1H,dq,J=15.4和6.9Hz)、6.93(1H,s)、6.39(1H,d,J=3.1Hz)、5.94(1H,d,J=2.7Hz)、5.83(1H,dd,J=15.4和1.8Hz)、5.48-5.42(1H,m)、5.38(1H,t,J=10.1Hz)、4.46(1H,br d,J=10.0Hz)、4.22(1H,ddd,J=10.7,6.6和1.6Hz)、3.26(1H,dd,J=13.1和2.0Hz)、3.10(1H,ddd,J=12.8,6.6和3.2Hz)、2.78(1H,dd,J=13.4和4.9Hz)、2.67(1H,dd,J=13.4和10.7Hz)、2.53(1H,br d,J=13.4Hz)、1.91(3H,dd,J=6.9和1.8Hz)、1.85(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-25(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.05(1H,dt,J=15.6和6.4Hz)、6.93(1H,s)、6.40(1H,dd,J=8.5和3.0Hz)、5.96(1H,dd,J=14.6和2.5Hz)、5.79(1H,dt,J=15.6和1.7Hz)、5.48-5.42(1H,m)、5.38(1H,t,J=10.1Hz)、4.45(1H,t,J=10.0Hz)、4.26-4.15(1H,m)、3.31-3.20(1H,m)、3.16-3.00(2H,m)、2.78(1H,dd,J=13.7和4.9Hz)、2.54(1H,br d,J=13.5Hz)、2.30-2.20(1H,m)、1.85(3H,d,J=1.4Hz)、1.08(3H,t,J=7.4Hz)。

DETD-26(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.66(1H,d,J=15.9Hz)、7.47(2H,d,J=8.9Hz)、6.92(1H,s)、6.91(2H,d,J=8.9Hz)、6.41(1H,d,J=2.9Hz)、6.26(1H,d,J=15.9Hz)、6.01(1H,d,J=2.3Hz)、5.46(1H,t,J=10.1Hz)、5.47-5.43(1H,m)、4.50(1H,d,J=10.1Hz)、4.25(1H,ddd,J=10.6,6.7和1.7Hz)、3.85(3H,s)、3.29(1H,br d,J=11.3Hz)、3.14(1H,ddd,J=12.8, 6,4和3.2Hz)、2.80(1H,dd,J=13.4和4.9Hz)、2.69(1H,dd,J=13.4和10.6Hz)、2.54(1H,d,J=13.4Hz)、1.88(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-27(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.67(1H,d,J=16.0Hz)、7.41(2H,d,J=8.0Hz),7.20(2H,d,J=8.0Hz)、6.93(1H,s)、6.41(1H,d,J=2.9Hz)、6.34(1H,d,J=16.0Hz)、6.00(1H,d,J=2.3Hz)、5.46(1H,t,J=10.0Hz)、5.48-5.43(1H,m)、4.50(1H,d,J=10.0Hz)、4.25(1H,ddd,J=10.6,6.7和1.7Hz)、3.29(1H,dd,J=13.2和2.0Hz)、3.14(1H,ddd,J=12.7,6.3和3.2Hz)、2.80(1H,dd,J=13.4和4.8Hz)、2.69(1H,dd,J=13.4和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.4Hz)、2.38(3H,s)、1.88(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-28(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.65(1H,d,J=15.8Hz)、7.45(2H,d,J=8.6Hz)、7.37(2H,d,J=8.6Hz)、6.93(1H,s)、6.41(1H,d,J=3.1Hz)、6.37(1H,d,J=16.0Hz)、5.98(1H,d,J=2.1Hz)、5.46(1H,t,J=10.1Hz)、5.48-5.43(1H,m)、4.50(1H,d,J=10.0Hz)、4.25(1H,ddd,J=10.7,6.6和1.6Hz)、3.29(1H,br d,J=11.2Hz)、3.14(1H,ddd,J=12.7,6.4和3.2Hz)、2.80(1H,dd,J=13.4和4.9Hz)、2.69(1H,dd,J=13.4和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.4Hz)、2.38(3H,s)、1.88(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-29(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,3% CD₃OD in CDCl₃)σ 7.51(1H,s)、7.43(1H,d,J=16.0Hz)、6.96(1H,br s)、6.65(1H,d,J=3.1Hz)、6.52-6.48(1H,m)、6.41(1H,d,J=3.1Hz)、6.28(1H,d,J=16.0Hz)、6.01(1H,d,J=2.5Hz)、5.50-5.41(2H,m)、5.48-5.44(1H,m)、4.50(1H,d,J=10.1Hz)、4.24(1H,dd,J=10.5和6.4Hz)、3.27(1H,d,J=12.8Hz)、3.19-3.10(1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.7和5.0Hz)、2.70(1H,dd,J=12.8和11.0Hz)、2.55(1H,d,J=13.7Hz)、1.88(3H,s)。

DETD-30(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.81(1H,dd,J=3.8和1.2Hz)、7.60(1H,dd,J=5.0和1.2Hz)、7.14(1H,dd,J=5.0和3.8Hz)、6.94(1H,br s)、6.41(1H,d,J=3.1Hz)、6.08(1H,d,J=2.5Hz)、5.51(1H,t,J=10.1Hz)、5.48-5.44(1H,m)、4.55(1H,br d,J=10.0Hz)、4.26(1H,ddd,J=10.7,6.5和1.6Hz)、3.30(1H,br d,J=13.2Hz)、3.23(1H,ddd,J=12.8,6.4和3.1Hz)、2.80(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.71(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.5Hz)、1.90(3H,d,J=1.4 Hz)。

DETD-31(方法A)：

質子核磁共振(1H-NMR,400MHz,CDCl3)σ 8.04-7.99(2H,m)、7.63-7.58(1H,m)、7.48(1H,d,J=8.0Hz)、7.46(1H,d,J=7.4Hz)、6.95(1H,br s)、6.36(1H,d,J=3.3Hz)、5.97(1H,d,J=2.7Hz)、5.60(1H,t,J=10.0Hz)、5.48-5.44(1H,m)、4.55(1H,br d,J=10.0Hz)、4.26(1H,ddd,J=10.5,6.5和1.6Hz)、3.35-3.22(2H,m)、2.80(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.72(1H,dd,J=13.3和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.3Hz)、1.92(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-32(方法B)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.96(2H,d,J=8.0Hz)、6.97-6.92(3H,m)、6.35(1H,d,J=2.9Hz)、5.96(1H,d,J=2.3Hz)、5.58(1H,t,J=10.0Hz)、5.48-5.43(1H,m)、4.55(1H,d,J=10.0Hz)、4.29(1H,dd,J=9.4和7.1Hz)、3.31(1H,d,J=12.7Hz)、3.28-3.18(1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.72(1H,dd,J=12.9和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.5Hz)、1.91(3H,br s)。

DETD-33(方法B)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.89(2H,d,J=8.2Hz)、7.26(2H,d,J=8.0Hz)、6.94(1H,s)、6.35(1H,d,J=3.1Hz)、5.96(1H,d,J=2.7Hz)、5.58(1H,t,J=10.0Hz)、5.49-5.43(1H,m)、4.55(1H,d,J=10.0Hz)、4.29(1H,ddd,J=10.6,6.7，和1.6Hz)、3.36-3.27(1H,m)、3.24(1H,ddd,J=12.8,6.4，和3.1Hz)、2.80(1H,dd,J=13.6和4.8Hz)、2.72(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.5Hz)、2.42(3H,s)、1.91 (3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-34(方法B)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.86(2H,d,J=8.6Hz)、7.62(2H,d,J=8.4Hz)、6.94(1H,s)、6.35(1H,d,J=2.9Hz)、5.89(1H,d,J=2.7Hz)、5.59(1H,t,J=10.1Hz)、5.48-5.44(1H,m)、4.54(1H,d,J=10.1Hz)、4.29(1H,dd,J=9.5和6.7Hz)、3.31(1H,br d,J=13.5Hz)、3.28-3.20(1H,m)、2.81(1H,dd,J=13.5和4.7Hz)、2.72(1H,dd,J=13.1和10.9Hz)、2.53(1H,d,J=13.3Hz)、1.91(3H,d,J=1.0Hz)。

DETD-35(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.91-7.84(2H,m)、7.81(1H,d,J=8.0Hz)、7.51(1H,d,J=9.6Hz)、7.53-7.50(1H,m)、7.44(1H,t,J=8.0Hz)、7.37(1H,d,J=6.4Hz)、6.85(1H,s)、5.88(1H,d,J=3.1Hz)、5.44-5.38(1H,m)、5.20(1H,t,J=10.0Hz)、5.06(1H,d,J=2.7Hz)、4.33(1H,d,J=10.0Hz)、4.13-4.00(1H,m)、4.07(2H,d,J=10.8Hz)、3.18(1H,br d,J=12.9Hz)、2.93-2.86(1H,m)、2.77(1H,dd,J=13.4和4.8Hz)、2.55(1H,dd,J=12.9和10.8Hz)、2.50(1H,d,J=13.4Hz)、1.81(3H,d,J=1.0Hz)。

DETD-36(方法B)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.44(1H,d,J=3.1Hz)、6.04(1H,d,J=2.7Hz)、5.49-5.41(1H,m)、5.31(1H,t,J=10.0Hz)、4.46(1H,d,J=10.0Hz)、4.24-4.15(1H,m)、3.26(1H,br d,J=11.7Hz)、3.14-3.03(1H,m)、2.78(1H,dd,J=13.5和4.7Hz)、2.66(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.5Hz)、1.81(3H,d,J=1.4Hz)、1.64-1.52(1H,m)、1.05-0.86(4H,m)。

DETD-37(方法B)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.92(1H,s)、6.43(1H,dd,J=3.1和0.8Hz)、6.00(1H,dd,J=2.7和0.8Hz)、5.46-5.41(1H,m)、5.24(1H,t,J=10.0Hz)、4.42(1H,d,J=10.0Hz)、4.18(1H,ddd,J=10.7,6.4和1.6Hz)、3.26(1H,dd,J=13.1和2.2Hz)、3.10-3.02(1H,m)、2.79(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.74-2.66(1H,m)、2.65(1H,dd,J=13.1和10.6Hz)、2.54(1H,d,J=13.1Hz)、1.84(3H,d,J=1.6Hz)、1.93-1.84(1H,m)、1.80-1.63(4H,m)、1.63-1.55(2H,m)。

DETD-38(方法B)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 6.91(1H,s)、6.43(1H,dd,J=2.9和0.8Hz)、5.98(1H,dd,J=2.5和0.8Hz)、5.46-5.41(1H,m)、5.25(1H,t,J =10.0Hz)、4.40(1H,d,J=10.0Hz)、4.18(1H,ddd,J=10.7,6.4和1.6Hz)、3.30-3.22(1H,m)、3.06(1H,ddd,J=13.1,6.4和3.0Hz)、2.78(1H,dd,J=13.5和4.7Hz)、2.65(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.53(1H,d,J=13.1Hz)、2.32-2.21(1H,m)、1.92-1.80(2H,m)、1.83(3H,d,J=1.4Hz)、1.80-1.71(2H,m)、1.49-1.18(6H,m)。

DETD-39(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.66(1H,d,J=15.9Hz)、7.32(1H,t,J=8.0Hz)、7.11(1H,d,J=7.8Hz)、7.05-7.01(1H,m)、6.96(1H,dd,J=8.0和2.5Hz)、6.93(1H,br s)、6.41(1H,d,J=2.9Hz)、6.38(1H,d,J=15.9Hz)、6.00(1H,d,J=2.9Hz)、5.45(1H,t,J=10.1Hz)、4.50(1H,d,J=10.1Hz)、4.25(1H,ddd,J=10.5,6.6和1.6Hz)、3.84(3H,s)、3.29(1H,br d,J=13.0Hz)、3.19-3.11(1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.3和4.9Hz)、2.69(1H,dd,J=13.3和10.5Hz)、2.54(1H, d,J=13.3Hz)、1.89(3H,d,J=1.2Hz)。

DETD-40(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.70(1H,d,J=7.8Hz)、7.58(1H,d,J=8.4Hz)、7.56(1H,s)、7.49(1H,dd,J=8.4和7.8Hz)、7.34(1H,t,J=7.8Hz)、6.95(1H,s)、6.43(1H,d,J=3.1Hz)、6.20(1H,d,J=2.7Hz)、5.58(1H,t,J=10.1Hz)、5.49-5.44(1H,m)、4.59(1H,d,J=10.1Hz)、4.33-4.24(1H,m)、3.36-3.24(2H,m)、2.82(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.72(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.56(1H,d,J=13.5Hz)、1.93(3H,br s)。

DETD-41(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 8.07(1H,s)、7.89(1H,d,J=7.8Hz)、7.87(1H,d,J=7.8Hz)、7.50(1H,dt,J=7.8和1.2Hz)、7.42(1H,dt,J=7.8和1.2Hz)、6.96(1H,s)、6.43(1H,d,J=3.1Hz)、6.14(1H,d,J=2.5Hz)、5.56(1H,t,J=10.0Hz)、5.49-5.44(1H,m)、4.58(1H,d,J=10.0Hz)、4.27(1H,ddd,J=10.7,6.4和1.5Hz)、3.35-3.23(2H,m)、2.82(1H,dd,J=13.7和4.9Hz)、2.72(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.56(1H,d,J=13.5Hz)、1.92(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-42(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.79(1H,d,J=15.7Hz)、7.41(1H,d,J=5.1Hz)、7.27(1H,d,J=5.1Hz)、7.07(1H,dd,J=5.1和3.7Hz)、6.93(1H,br s)、6.41(1H,d,J=3.1Hz)、6.18(1H,d,J=15.7Hz)、5.99(1H,t,J=2.7Hz)、5.45(1H,t,J=10.0Hz)、5.47-5.42(1H,m)、4.48(1H,d,J=10.0Hz)、4.24(1H,dd,J=9.3和6.5Hz)、3.27(1H,br d,J=13.3Hz)、3.17-3.08 (1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.5和5.0Hz)、2.69(1H,dd,J=13.3和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.5Hz)、1.87(3H,br s)。

DETD-43(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.36-7.26(3H,m)、7.24-7.20(2H,m)、6.90(1H,br s)、6.18(1H,d,J=2.9Hz)、5.47(1H,t,J=2.4Hz)、5.44-5.40(1H,m)、5.24(1H,t,J=10.0Hz)、4.40(1H,d,J=10.0Hz)、4.14(1H,ddd,J=10.6,6.3和1.6Hz)、3.65(1H,d,J=15.2Hz)、3.60(1H,d,J=15.2Hz)、3.23(1H,br d,J=13.1Hz)、3.01(1H,ddd,J=12.8,6.3和3.0Hz)、2.78(1H,dd,J=13.5和4.9Hz)、2.62(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.52(1H,d,J=13.5Hz)、1.83(3H,d,J=1.5Hz)。

DETD-44(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.13(2H,d,J=8.5Hz)、6.90(1H,br s)、6.86(2H,d,J=8.5Hz)、6.22(2H,d,J=3.1Hz)、5.53(1H,t,J=2.4Hz)、5.43(1H,t,J=2.4Hz)、5.46-5.41(1H,m)、5.24(1H,t,J=10.0Hz)、4.40(1H,d,J=10.0Hz)、4.18-4.11(1H,m)、3.80(3H,s)、3.58(1H,d,J=15.4Hz)、3.53(1H,d,J=15.4Hz)、3.23(1H,br d,J=13.1Hz)、3.02(1H,ddd,J=12.6,6.3和3.1Hz)、2.77(1H,dd,J=13.4和4.8Hz)、2.63(1H,dd,J=13.1和10.7Hz)、2.52(1H,d,J=13.4Hz)、1.82(3H,br s)。

DETD-45(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.78(1H,d,J=10.2Hz)、7.70(1H,d,J=8.0Hz)、7.39(1H,t,J=8.0Hz)、7.21(1H,d,J=7.0Hz)、7.20-7.15(2H,m)、6.86(1H,br s)、5.90(1H,d,J=2.8Hz)、5.44-5.39(1H,m)、5.19(1H,t,J=10.0Hz)、5.04(1H,d,J=2.8Hz)、4.33(1H,d,J=10.0Hz)、4.15-3.99(3H,m)、3.93(3H,s)、3.18(1H,br d,J=12.5Hz)、2.94-2.85(1H,m)、2.77(1H, dd,J=13.5和4.8Hz)、2.62-2.46(2H,m)、1.81(3H,br s)。

DETD-46(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.71(1H,d,J=8.4Hz)、7.68(1H,d,J=9.1Hz)、7.60(1H,br s)、7.29(1H,d,J=8.4Hz)、7.18-7.10(2H,m)、6.89(1H,br s)、6.09(1H,d,J=3.1Hz)、5.46(1H,d,J=2.5Hz)、5.45-5.40(1H,m)、5.26(1H,t,J=10.0Hz)、4.40(1H,d,J=10.0Hz)、4.14(1H,dd,J=10.0和6.4Hz)、3.92(3H,s)、3.77(1H,d,J=15.1Hz)、3.72(1H,d,J=15.1Hz)、3.22(1H,d,J=13.1Hz)、3.05-2.95(1H,m)、2.77(1H,dd,J=13.3和4.8Hz)、2.60(1H,dd,J=13.1和10.8Hz)、2.51(1H,d,J=13.3Hz)、1.83(3H,br s)。

DETD-47(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.67(1H,d,J=16.0Hz)、7.48-7.42(2H,m)、7.36(1H,s)、7.30-7.25(1H,m)、6.96(1H,s)、6.42(1H,d,J=16.0Hz)、6.42(1H,d,J=2.5Hz)、5.99(1H,d,J=2.5Hz)、5.49(1H,t,J=10.1Hz)、5.47-5.48(1H,m)、4.51(1H,d,J=10.8Hz)、4.25(1H,dd,J=10.5和6.7Hz)、3.28(1H,d,J=13.1Hz)、3.18-3.14(1H,m)、2.81(1H,dd,J=13.7和4.8Hz)、2.71(1H,dd,J=13.1和10.5Hz)、2.56(1H,d,J=13.7Hz)、1.90(3H,s)。

DETD-48(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.77(1H,s)、7.72(1H,d,J=16.2Hz)、7.66(1H,d,J= 7.8Hz)、7.54(1H,t,J=7.8Hz)、6.95(1H,s)、6.47(1H,d,J=16.2Hz)、6.43(1H,d,J=2.8Hz)、6.00(1H,d,J=2.8Hz)、5.48(1H,t,J=10.0Hz)、5.48-5.45(1H,m)、4.51(1H,d,J=10.0Hz)、4.26(1H,ddd,J=10.5,6.8和2.0Hz)、3.30(1H,dd,J=13.2和2.0Hz)、3.19-3.12(1H,m)、2.82(1H,dd,J=13.7和4.8Hz)、2.70(1H,dd,J=13.2和10.5Hz)、2.55(1H,d,J=13.3Hz)、1.89(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-49(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.64(1H,d,J=15.6Hz)、7.11(1H,dd,J=8.3和1.8Hz)、7.03(1H,d,J=1.8Hz)、6.94(1H,s)、6.88(1H,d,J=8.3Hz)、6.42(1H,d,J=2.6Hz)、6.26(1H,d,J=15.6Hz)、6.02(1H,d,J=2.6Hz)、5.48(1H,t,J=10.1Hz)、5.48-5.45(1H,m)、4.50(1H,d,J=10.1Hz)、4.26(1H,ddd,J=10.5,6.6和1.8Hz)、3.93(3H,s)、3.92(3H,s)、 J=1.3Hz)、3.29(1H,dd,J=13.3和1.8Hz)、3.18-3.10(1H,m)、2.81(1H,dd,J=13.3和5.0Hz)、2.70(1H,dd,J=13.3和10.5Hz)、2.54(1H,d,J=13.3Hz)、1.89(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-50(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.66(1H,d,J=16.0Hz)、7.30(1H,t,J=7.7Hz)、7.10(1H,d,J=7.7Hz)、7.04-7.02(1H,m)、6.97-6.93(1H,m)、6.94(1H,s)、6.421H,d,J=3.0Hz)、6.37(1H,d,J=16.0Hz)、6.00(1H,d,J=3.0Hz)、5.46(1H,t,J=10.1Hz)、5.45-5.44(1H,m)、4.50(1H,d,J=10.1Hz)、4.25(1H,ddd,J=10.8,6.8和1.4Hz)、4.06(2H,q,J=7.0Hz)、3.29(1H,dd,J=13.3和2.1Hz)、3.15(1H,ddd,12,8,6.9和3.5Hz)、2.81(1H,dd,J=13.3和4.8Hz)、2.70(1H,dd,J=13.3和10.8Hz)、2.55(1H,d,J=13.3Hz)、1.89(3H,d,J=1.4Hz)、1.43(3H,t,J=7.0Hz)。

DETD-51(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.98(1H,d,J=7.8Hz)、7.90-7.85(1H,m)、7.75(1H,d,J=7.8Hz)、7.54(1H,dt,J=6.8和1.3Hz)、7.50(1H,dt,J=6.8和1.3Hz)、7.38(1H,t,J=6.8Hz)、7.31(1H,d,J=6.8Hz)、6.87(1H,s)、6.19(1H,d,J=2.8Hz)、5.65(1H,d,J=2.8Hz)、5.43(1H,dd,J=4.6和1.8Hz)、5.26(1H,t,J=10.1Hz)、4.30(1H,d,J=10.1Hz)、4.15(1H,ddd,J=10.5,6.4和1.4Hz)、3.40(2H,t,J=7.8Hz)、3.26-3.19(1H,m)、2.98-2.92(1H,m)、2.82-2.73(3H,m)、2.61(1H,dd,J=13.3和10.8Hz)、2.50(1H,d,J=13.8Hz)、1.85(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-52(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 8.84(1H,dd,J=4.1和1.8Hz)、8.16(1H,dd,J=8.3和1.4Hz)、7.79(1H,dd,J=8.3和1.4Hz)、7.62(1H,d,J=6.7Hz)、7.51(1H,dd,J=8.3和6.7Hz)、7.42(1H,dd,J=8.3和4.1Hz)、6.89(1H,br s)、6.25(1H,d,J=2.7Hz)、5.95(1H,d,J=2.7Hz)、5.43(1H,dd,J=4.8和2.1Hz)、5.28(1H,t,J=10.1Hz)、4.43(1H,d,J=10.1Hz)、4.36(1H,d,J=15.6Hz)、4.17(1H,ddd,J=10.8,6.7和1.5Hz)、4.10(1H,d,J=15.6Hz)、3.24(1H,dd,J=13.1和2.1Hz)、3.04(1H,ddd,J=13.1,6.7和3.3Hz)、2.781H,dd,J=13.2和4.8Hz)、2.63(1H,dd,J=13.1和10.8Hz)、2.53(1H,d,J=13.2Hz)、1.80(3H,d,J=1.4Hz)。

DETD-53(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.70(1H,d,J=8.7Hz)、7.69(1H,d,J=8.7Hz)、7.57(1H,br s)、7.29(1H,dd,J=8.7和1.8Hz)、7.16(1H,dd,J=8.7和2.5Hz)、7.12(1H,d,J=2.3Hz)、6.80(1H,br s)、 6.26(1H,d,J=2.8Hz)、5.69(1H,d,J=2.5Hz)、5.40-5.35(1H,m)、5.23(1H,t,J=10.0Hz)、4.21(1H,d,J=10.0Hz)、4.18-4.11(1H,m)、3.94(3H,s)、3.84(1H,q,J=7.0Hz)、3.21(1H,br d,J=13.3Hz)、2.95(1H,ddd,J=13.3,6.5和3.1Hz)、2.75(1H,dd,J=13.7和4.6Hz)、2.57(1H,dd,J=13.3和10.7Hz)、2.41(1H,d,J=13.3Hz)、1.85(3H,d,J=1.4Hz)、1.55(3H,d,J=7.0Hz)。

DETD-54(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.71(1H,d,J=8.3Hz)、7.68(1H,d,J=9.0Hz)、7.61(1H,br s)、7.31-7.26(1H,m)、7.16(1H,dd,J=9.0和2.3Hz)、7.12(1H,d,J=2.3Hz)、6.80(1H,br s)、5.56(1H,d,J=2.7Hz)、5.47-5.42(1H,m)、5.20(1H,t,J=10.1Hz)、4.78(1H,d,J=2.7Hz)、4.41(1H,d,J=10.1Hz)、4.12-4.05(1H,m)、3.94(3H,s)、3.77(1H,q,J=7.0Hz)、3.24-3.16(1H,m)、2.94(1H,ddd,J=12.8,6.1和3.1Hz)、2.81(1H,dd,J=13.3和4.6Hz)、2.63-2.52(2H,m)、1.86(3H,d,J=1.4Hz)、1.54(3H,d,J=7.0Hz)。

DETD-55(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 8.25和8.02(1H,d,J=8.7Hz,3：5)、7.90-7.82(3H,m)、7.68和7.64(1H,d,J=6.9Hz,5：3)、7.54-7.36(6H,m)、6.81和6.70(1H,br s,3：5)、6.01(5/8H,d,J=2.7Hz)、5.43-5.25(27/8H,m)、5.13和5.11(1H,t,J=10.1Hz,3：5)、4.30(3/8H,d,J=2.7Hz)、4.26-4.20(5/8H,m)、4.09-4.01(1H,m)、3.91(5/8H,d,J=10.1Hz)、3.17-3.12(3/8H,m)、3.11和3.08(3H,s,5：3)、2.84-2.68(2H,m)、2.54-2.25(2H,m)、1.95和1.92(3H,s,5：3)、1.85和1.83(3H,d,J=1.4Hz,3：5)。

DETD-56(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.87-7.80(4H,m)、7.55-7.49(2H,m)、7.42(1H,dd,J=8.5和1.4Hz)、6.81(1H,br s)、6.22(1H,d,J=3.2Hz)、5.78(1H,d,J=2.7Hz)、5.40-5.35(1H,m)、5.28(1H,t,J=10.1Hz)、4.92(1H,s)、4.24(1H,d,J=10.1Hz)、4.17-4.10(1H,m)、3.43(3H,s)、3.20(1H,dd,J=13.3和1.8Hz)、3.03(1H,ddd,J=12.9,6.5和3.2Hz)、2.72(1H,dd,J=13.3和4.7Hz)、2.58(1H,dd,J=12.9和10.8Hz)、2.38(1H,d,J=13.3Hz)、1.81(1H,d,J=1.4Hz)。

DETD-57(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.90-7.81(4H,m)、7.58-7.50(2H,m)、7.46(1H,dd,J=8.5和1.6Hz)、6.87(1H,br s)、5.70(1H,d,J=3.2Hz)、5.45-5.40(1H,m)、5.27(1H,t,J=10.1Hz)、5.03(1H,d,J=2.3Hz)、4.86(1H,s)、4.36(1H,d,J=10.1Hz)、4.15-4.07(1H,m)、3.37(3H,s)、3.20(1H,br d,J=12.8Hz)、3.03-2.95(1H,m)、2.76(1H,dd,J=13.3和4.8Hz)、2.59(1H,dd,J=12.8和10.8Hz)、2.48(1H,d,J=13.3 Hz)、1.84(1H,d,J=1.4Hz)。

DETD-58(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.90-7.85(1H,m)、7.68-7.64(1H,m)、7.44-7.36(2H,m)、7.32(1H,s)、6.89(1H,br s)、6.07(1H,d,J=2.7Hz)、5.45-5.41(1H,m)、5.37(1H,d,J=2.3Hz)、5.26(1H,t,J=10.1Hz)、4.37(1H,d,J=10.1Hz)、4.16-4.08(1H,m)、3.88(2H,s)、3.24-3.17(1H,m)、2.97(1H,ddd,J=13.0,6.0和3.2Hz)、2.78(1H,dd,J=13.3和4.7Hz)、2.60(1H,d,J=13.0Hz)、2.51(1H,d,J=13.3Hz)、1.84(1H,d,J=1.4Hz)。

DETD-59(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.59(1H,s)、7.47(2H,t,J=8.7Hz)、7.34-7.28(1H,m)、7.25(1H,m)、6.90(1H,br s)、6.22(1H,d,J=3.2Hz)、5.65(1H,d,J=2.3Hz)、5.45-5.41(1H,m)、5.30(1H,t,J=10.1Hz)、4.39(1H,d,J=10.1Hz)、4.20-4.09(1H,m)、3.70(2H,s)、3.22(1H,br d,J=12.8Hz)、3.02(1H,ddd,J=12.8,6.4和3.2Hz)、2.79(1H,dd,J=13.3和4.7Hz)、2.63(1H,dd,J=13.3和10.7Hz)、2.51(1H,d,J=13.3Hz)、1.84(1H,d,J=1.4Hz)。

DETD-60(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.65(1H,d,J=15.6Hz)、7.46(2H,d,J=8.7Hz)、6.94(1H,br s)、6.89(2H,d,J=8.7Hz)、6.41(1H,d,J=2.5Hz)、6.25(1H,d,J=15.6Hz)、6.01(1H,d,J=2.5Hz)、5.46(1H,t,J=10.1Hz)、5.48-5.42(1H,m)、4.50(1H,d,J=9.6和6.5Hz)、4.07(2H,q,J=6.9Hz)、3.28(1H,br d,J=11.9z)、3.19-3.10(1H,m)、2.80(1H,dd,J=13.3 和5.0Hz)、2.69(1H,dd,J=13.3和10.3Hz)、2.54(1H,d,J=13.3Hz)、1.89(1H,br s)、1.43(3H,t,J=6.9Hz)。

DETD-61(方法A)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.60(1H,d,J=16.0Hz)、7.06-6.97(2H,m)、6.94(1H,br s)、6.82(1H,d,J=7.7Hz)、6.41(1H,d,J=3.2Hz)、6.21(1H,d,J=16.0Hz)、6.02(2H,s)、6.00(1H,d,J=2.7Hz)、5.45(1H,t,J=10.1Hz)、5.49-5.43(1H,m)、4.50(1H,d,J=10.1Hz)、4.28-4.22(1H,m)、3.28(1H,br d,J=11.6Hz)、3.02(1H,ddd,J=13.0,6.4和3.2Hz)、2.80(1H,dd,J=13.3和4.8Hz)、2.69(1H,dd,J=13.0和10.7Hz)、2.54(1H,d,J=13.3Hz)、1.88(1H,d,J=1.4Hz)。

DETD-62(方法C)：

質子核磁共振(¹H-NMR,400MHz,CDCl₃)σ 7.96-7.91(1H,m)、7.91-7.85(1H,m)、7.80(1H,d,J=8.3Hz)、7.57-7.47(2H,m)、7.43(1H,dd,J=8.3和6.9Hz)、7.37(1H,d,J=6.9Hz)、7.03(1H,br s)、6.20(1H,d,J=3.4Hz)、5.84(1H,d,J=16.0Hz)、5.45(1H,d,J=3.4Hz)、5.27(1H,dd,J=16.0和9.6Hz)、5.24-5.17(1H,m)、4.44-4.35(1H,m)、3.99(2H,s)、3.57-3.48(1H,m)、3.21(1H,br d,J=13.0Hz)、2.83(1H,t,J=12.2Hz)、2.56(1H,dd,J=14.6和6.4Hz)、2.32(1H,d,J=14.6Hz)、2.51(1H,d,J=13.0Hz)、1.71(1H,s)。

實施例2 實施例1.2.2所示之DETD對抗乳癌細胞增殖的抑制效果

本實施例係測試實施例1.2.2所示之DETDs對抗乳癌細胞的活性，結果如表2所示。以MTT法測定DET和DETDs之IC₅₀值(抑制50%的細胞增殖率)。本實驗例係評估小鼠乳腺癌細胞TS/A(ER+,Her2-)、人類乳癌細胞MCF-7(ER+,Her2-)和MDA-MB-231(ER-,Her2-,PR-)經所述化合物處理24小時後的抑制效果。DET對於TS/A和MCF-7細胞的抑制活性(IC₅₀)，分別為2.3和5.0μM；但DET對於MDA-MB-231細胞的抑制效果較有限，IC₅₀約為14.0μM。本實施例測試了約60種DETDs，其 中以DETD-39(0.8μM)、DETD-26(1.5μM)和DETD-35(1.7μM)改善DET對於TS/A細胞的抗增生活性效果最佳。再者，DETD-6、DETD-39和DETD-7對於MCF-7細胞的抗增生活性效果最佳，IC50分別約為1.6μM、2.1μM和2.3μM；以及，DETD-39、DETD-34和DETD-35對於MDA-MB-231細胞的抗增生活性效果最佳，IC50分別約為1.9μM、2.2μM和3.5μM。此外，DETD-6、DETD-26和DETD-39對於正常乳腺上皮M10細胞具有部分毒性(參見表3)。

實施例3 DET和DETD-35抑制MDA-MB-231細胞遷移和侵襲

以Boyden chamber分析法研究DET和DETD-35對於MDA-MB-231細胞遷移和侵襲的影響；本實驗例以PTX作為參考控制組。實驗結果示於第1圖。DET(2.5和4μM)、DETD-35(1.25和2.5μM)和PTX(2.5和4μM)能顯著抑制細胞遷移，且其抑制效果隨著化合物的濃度增加而上升(第1A圖)。相較於各該化合物的載體控制組，施用較高濃度的DET(4μM)、DETD-35(2.5μM)和PTX(4μM)，造成的細胞抑制效果分別約為77%、84%和88%。然而，當施用較低濃度的DET(2.5μM)、DETD-35(1.25μM)和PTX(2.5μM)，其細胞遷移抑制的結果，則分別為16%、10%和87%(P<0.05)。Trans-well侵襲分析的結果顯示，DET和DETD-35具有抑制MDA-MB-231細胞侵襲的效果，使MDA-MB-231細胞無法穿透一薄層的凝膠基質(Matrigel matrix)。再者，實驗結果顯示，施用相對較高濃度的DET(4μM)、DETD-35(2.5μM)和PTX(4μM)能顯著抑制細胞侵襲，其抑制率分別為76%、80%和90%；而施用低濃度的DET(2.5μM)、DETD-35(1.25μM)和PTX(2.5μM)其抗侵襲效力分別為57%、64.6%和85%(P<0.05)。綜合以上結果顯示，DET和其衍生物DETD-35能減少細胞遷移和侵襲基底膜屏障的能 力(第1B圖)。

實施例4 相較於DET，DETD-35對於乳癌細胞運動性具有較佳的抑制效果

本實施例係利用即時顯微攝影(time-lapse microscopy)研究DET和DETD-35對於MDA-MB-231細胞運動性的影響。觀察及分析MDA-MB-231細胞經不同條件處理後24小時內的細胞遷移軌跡。結果顯示，在載體控制細胞中，細胞的運動性佳，該組細胞在連續運動中(0-24小時)可觀察到其外觀具有膜突起，且在24小時內，亦被記錄到一般的細胞增殖(第2A圖)。如第2B圖所示，在載體控制組中，觀察到自原點向外擴散的顯著細胞分散區域；相對地，經2.5μM DET處理的細胞的擴散區域相對較小，細胞移動受到限制。各別經10μM DET或1.25、2.5和4μM DETD-35處理的細胞，各組的細胞軌跡相對大幅的降低。相較於載體控制組細胞和經2.5μMDET處理的細胞，以DETD-35(1.25、2.5和4μM)或以較高濃度DET(4和10μM)處理的細胞，其平均移動速率明顯下降，抑制細胞移動的效果更為顯著(第2C圖)。再者，相較於控制組(186μM)，經DET(2.5、4、10μM)和DETD-35(1.25、2.5、4μM)處理後的細胞(144 vs.15 vs.9和70 vs.23 vs.3μM)，各組細胞移動的總距離顯著地較短。綜合以上的結果顯示，相較於DET，新穎合成的 倍半萜內酯(sesquiterpene lactone)DETD-35於抑制MDA-MB-231細胞的運動性上，具有更佳的生物活性。

實施例5 DETD-35降低NOD/SCID小鼠中原位乳腺瘤的生長

此實驗例係研究DETD-35對於載有MDA-MB-231癌細胞的異種移植NOD/SCID小鼠的治療效果。在第56天，相較於控制組，以腹腔注射10毫克/公斤DETD-35組的小鼠，其細胞生長具有顯著延遲的結果(P<0.05)(第3A圖)，且小鼠體重並沒有任何的影響(第3B圖)。在第71天，相較於控制組，DETD-35處理組的小鼠腫瘤體積減少1.8倍(1268 vs.712mm³)(第3C圖)。計算小鼠肺部、肝臟、腎臟和脾臟的器官指數(organ index)(器官重量/體重，%)，結果如第3D圖所示；該圖數據顯示，控制組的腎臟指數較高於偽控制組(sham group)和DETD-35處理組。

實施例6 DETD-35具有抑制MDA-MB-231細胞肺部轉移的潛力

比較經DETD-35前處理和後處理對於三陰性乳癌MDA-MB-231異種移植小鼠，相對於施用化療藥物PTX的效果。相較於腫瘤控制組，DETD-35前處理組(圖中以pre-DETD-35-10組表示)中的小鼠肺部的腫瘤聚落數量顯著降低83%，而DETD-35後處理組(圖中以 DETD-35-10表示)和PTX-5組的抑制效果分別為50%和62%。經DETD-35-2處理可抑制肺轉移9%，此一數據無統計上的顯著效果。相較於單一處理組，PTX-5+DETD-35-2交互處理組(圖中以PTX-5+DETD-35-2表示)的小鼠，其肺部腫瘤聚落大幅降低71%(P<0.05，第4A圖)。相較於其他組別，DETD-35-2處理組之小鼠體重有輕微降低，但該數據沒有統計上的差異(數據未顯示)。此外，在所有試驗動物中，其肺部、肝臟、腎臟和脾臟的器官指數並沒有顯著的差異(第4B圖)。

實施例7 DETD-35和DETD-39分別能增強PTX對抗MDA-MB-231細胞的抗增生效果

研究DETD-35和DETD-39是否具有協同(synergistically)PTX對抗MDA-MB-231細胞活性的效果，以MTT分析法測定各化合物的IC₆₀值。結果顯示，PTX、DETD-35和DETD-39對於MDA-MB-231之IC₆₀值分別約為23.8nM、3.32μM和3.79μM(第5A圖)。再者相較於單獨施用PTX組，施用1μM DETD-35或DETD-39，以及同時施用PTX和DET衍生物處理(co-treated)的細胞(PTX濃度：0、2、5、10、15、20和25nM)，具有更佳的抑制癌細胞增殖的效果(第5B圖)。基於每一化合物的IC₆₀值，以DETD-35(0-4μM)或DETD-39(0-4μM)以及 PTX(0-25μM)用於化合物-藥物的併用研究。利用等效線圖分析法(Classic isobologram analysis)和Chou-Talalay法研究化合物和藥物的協同作用。以CalcuSyn軟體(Version 2.0,Biosoft)計算併用係數(CI)，並以CI vs.Fa(影響部分(fraction affected))表示。CI<1代表協同效果(synergy)；CI=1代表相加效果(additive effect)；CI>1代表拮抗效果(antagonism)。基於實驗結果，可以發現併用PTX與DETD-35或DETD-39，確實具有協同抑制MDA-MB-231細胞生長的效果(第5C和5D圖)。

實施例8 DET和DETD-35分別能增強麩胱甘肽合成阻斷劑對抗MDA-MB-231細胞的抗增生效果

DET能誘導短暫性的ROS產生，其為一上游因子能引發一系列反應導致癌症細胞死亡(Lee and Shyur,Free Radical Biology & Medicine 2012,52(8)：1423-1436.)。DET的藥理特性使DET和其衍生物為一潛力藥劑，作為一新興的「氧化還原相關癌症治療藥劑(redox-directed cancer therapeutics)」(Wondrak G.T.,Antioxidants & Redox Signaling 2009,11(12)：3013-3069.)。r-麩胺醯半胱胺酸合成酶抑制劑(Gamma-glutamylcysteine synthetase inhibitor)：「丁硫氨酸硫醯亞胺(BSO)」和胱胺酸/麩胺酸轉運蛋白(cystine/glutamate transporter)(xCT)抑制劑：「柳氮磺吡 啶(sulfasalazine)」的功能為削弱麩胱甘肽抗氧化的防禦機制，本發明選用此二種藥物來研究併用藥物的效果。測試DET或其衍生物(DETD-35)與BSO或柳氮磺胺吡啶的之間的協同效果。若併用上述化合物及藥物具有協同效果，意即併用化合物和藥物具有極大潛力來預防或治療，對於DET/DETD-35和第II期藥物BSO或臨床藥物柳氮磺胺吡啶具有抗藥性的癌細胞，或增加其對於DET/DETD-35和第II期藥物BSO或臨床藥物柳氮磺胺吡啶的感受性。

在此實施例中，實驗結果顯示在一濃度範圍內，BSO或柳氮磺胺吡啶對於MDA-MB-231細胞不具有細胞毒性，但DET和DETD-35可增加癌細胞對於BSO或柳氮磺胺吡啶藥物的感受性。經BSO或柳氮磺胺吡啶處理30分鐘的MDA-MB-231細胞，再以DET(12μM)和DETD-35(3μM)處理24小時，該細胞存活率降低約70%、90%至1%或無法偵測(第6A、6B圖)。值得注意的是，在BSO施用濃度分別為0.5μM和3μM時，DET和DETD-35皆能協同增強BSO的抗癌細胞增生效果。類似的結果，亦可在DET或DETD-35與柳氮磺胺吡啶併用時觀察到，該柳氮磺胺吡啶的施用濃度為25μM和62μM(第6B圖)。綜合言之，DET和DETD-35與臨床藥物柳氮磺胺吡啶或第II期臨床試驗藥物BSO併用時，能致 敏化(sensitize)癌細胞對於化合物藥物之作用效果，以抑制三陰性乳癌細胞的活性。

實施例9 實施例1.2.2的DET和DETDs對抗黑色素瘤細胞增生的抑制效果

已知數個基因與黑色素瘤的發展及病理學相關；具體而言，在惡性黑色素瘤中，V-raf鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1(V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,B-RAF)的突變發生率約50-60%，以及神經母細胞瘤RAS病毒致癌基因同源物(neuroblastoma RAS viral oncogene homolog,N-RAS)發生率約30%(Yeh et al.,Oncogene 2006,25(50)：6574-6581.)。本實施例係利用野生型(wild-type)或突變的黑色素瘤細胞株，包含B16-F10、MeWo、A375、A2058、HTB-68和黑色素細胞(melanocyte)來研究原來之植物化合物(parental phytocompound)DET和新合成的DETDs對抗黑色素瘤細胞增殖的效果。表4所示的是DET和DETDs的IC₅₀值，係利用MTT試劑分析該化合物對抗黑色素瘤細胞(經24小時處理)的結果。結果顯示，在不同細胞之間，各細胞對於DET和DETDs的感受性效果不同。DET對於B16-F10和A375細胞的IC₅₀值約為6μM，但對其他黑色素瘤細胞株並沒有活性(試驗施用濃度約至10μM)。在其他約60種DETDs的試驗結果中(DETD-1至DETD-62)，其中DETD-6、-28、 -30、-33、-34、-35、-39、-45、-53-54、-55、-56、-58、-60和-61可抑制所有的黑色素瘤細胞類型，其IC₅₀值約1.6至9.9μM。DETD-35(IC₅₀=2.5至6.0μM)和DETD-39(IC₅₀=1.6至3.5μM)對抗黑色素瘤細胞增殖的效果最佳，但其中DETD-39對於正常人類黑色素細胞具有部分毒性，IC₅₀為9μM(表4)。

實施例10 DETD-35和PLX4032對抗A375黑色素瘤細胞的協同效果

為了研究併用DETD-35和PLX4032對於A375黑色素瘤細胞是否具有協同效果；首先，在此實施例中，利用MTT試劑進行各化合物的抗增生分析，得到各化合物IC₅₀值。所述結果指出PLX4032和DETD-35對於A375細胞的IC₅₀值分別約為0.07和0.85μM(第7A和7B圖)。基於各化合物的IC₅₀值，以DETD-35(濃度範圍0.1至1μM)和PLX4032(濃度範圍10至100nM)進行化合物-藥物的併用試驗。利用CalcuSyn軟體(Version 2.0,Biosoft)進行CI分析，定量化合物-藥物的協同效果，以CI vs.Fa(部分影響)表示。CI<1表示協同效果；CI=1表示相加效果；以及CI>1表示拮抗效果。實驗結果指出，併用DETD-35和PLX4032對於抑制A375黑色素瘤細胞生長具有協同效果(第7C和7D圖)。

發明人進一步依照前述「材料與方法」所述方式，在NOD/SCID小鼠體內植入A375人類黑色素瘤細胞，再分別於指定時間點對小鼠施用PLX4032、DET、DETD-35、PLX4032+DET、或PLX4032+DETD-35，據以評估單獨使用PLX4032、DET、DETD-35，PLX4032+DET或PLX4032+ DETD-35，於活體內抑制A375黑色素瘤的效果，結果示於第8A及8B圖。

第8A圖示出腫瘤體積隨時間變化的情形，第8B圖則是各處理對腫瘤重量的影響。結果顯示，無論是DET或DETD-35，都能抑制腫瘤生長，相較於載體控制組，黑色素瘤重量分別減少了約47.5%及70.5%，特別是DETD-35，其抑制腫瘤效果與PLX40332相當(約71.9%)。除此之外，當PLX4032與DETD-35併用時(如材料與方法中所述，在併用試驗中，PLX4032與DETD-35之施予次數僅為PLX4032或DETD-35單獨使用時施予次數的一半)，其抑制腫瘤效果與單獨使用PLX40332或DETD-35相去不遠(約72.3%)，表示PLX4032與DETD-35在小鼠體內抑制黑色素瘤時亦有協同作用。

實施例11 DETD-35克服A375人類黑色素瘤細胞對PLX4032所產生的抗藥性

為了探索DETD-35如何克服BRAF抑制劑的抗藥性機制，故利用對於PLX4032產生抗藥性之A375細胞(A375-R)作為試驗對象。簡言之，將A375黑色素瘤接種於T75盤中，接著以PLX4032(20、50、100、250、500、1000、2000nM)處理，經20個繼代培養，實驗期間約2個月，發展形成A375-R後天抗藥性細胞株。所述A375-R細胞株對於PLX4032的感受性較差，其藥物施用濃度為原本細胞株的100倍(IC₅₀：8.3 vs.0.07μM)；而DETD-35對於A375和A375-R的細胞存活率則具有一致 的抑制效果，DETD-35對於A375和A375-R的細胞的IC₅₀值皆為0.8μM(第9A圖)。再者，PLX4032可抑制A375細胞的MAPK磷酸化-MEK(phospho-MEK)和磷酸化-ERK(phospho-ERK)訊號分子，但對於A375-R細胞並無抑制該些訊號分子的效果(第9B圖)。依據經PLX4032處理的A375-R細胞中MAP激酶反應的結果，可進一步確認細胞株對於PLX4032確實產生了抗性。西方墨點分析的結果顯示DETD-35具有抑制A375-R細胞中MAP激酶反應的效果(第9C圖)。再者，當併用DETD-35與PLX40332時，亦可抑制MAPK訊號分子，故，DETD-35能克服癌細胞對於PLX4032所產生的抗藥性。

發明人進一步利用活體動物試驗，驗證上述DETD-35抑制對PLX4032具抗藥性癌細胞(即A375-R細胞)的結果。類似的，大致依照，「材料與方法」段落及實施例10所述方式，將對PLX4032產生抗藥性的不同處置植入NOD/SCID小鼠體內，再於指定時間點分別對小鼠施用PLX4032、DET、DET-35、PLX4032+DET、或PLX4032+DET-35，結果示於第10A及10B圖。

第10A圖示出經過不同處置後，腫瘤體積隨時間變化的情形，第10B圖則是不同處置對腫瘤重量的影響。一如預期，因為A375-R細胞對PLX4032具抗性，因此實驗小鼠對PLX4032(75毫克/公斤)處理並沒有反應， 腫瘤體積與重量也與控制組相去不遠。相反的，無論是DET或DET-35，都能明顯抑制A375-R腫瘤細胞的生長，相較於載體控制組，腫瘤重量分別減少了約32%及46.9%。更特別的是合併施予PLX4032與DET或是PLX4032與DET-35，則其效果遠較單獨使用DET或DET-35更好。合併使用PLX4032與DET-35後，腫瘤重量減少約65.3%，是所有組別中效果最好的，表示DET-35和PLX4032之協同效果。我們的結果顯示DET以及DETD-35單獨使用或與PLX4032併用時均能克服黑色素癌對PLX4032的抗藥性。

實施例12 DET-35延緩活體內PLX4032促進DMBA/TPA處理所誘發之乳頭狀瘤的生成與數目

本實施例採用了習知的DMBA/TPA誘發皮膚癌的動物模型，來模擬皮膚組織因為施用PLX4032所產生的副作用，以評估施予DETD-35是否可有效改善患者皮膚因施予PLX4032所產生的副作用。首先依照「材料與方法」所述方式，以DMBA處理小鼠腹部皮膚，一週後，再以每週2次的頻率對相同部位施予TPA、TPA+PLX4032、TPA+DET或TPA+DETD-35處理，結果繪示於第11A-11C圖中。

由第11A及11B圖結果可看出，DMBA+TPA處置會誘發小鼠產生乳頭狀瘤，且PLX4032會促進此一 由DMBA+TPA誘發的乳頭狀瘤的生成現象，此可由乳頭狀瘤數目增加獲得證實。但是，DET或DETD-35則能有效地減緩PLX4032促進的乳頭狀瘤生成現象，皮膚上乳頭狀瘤的數目可分別由控制組的25.6降低至11,7和4.8；腫瘤大小也由控制組的77.6立方毫米分別減少至26.3和8.9立方毫米(第11A-11C圖)。此外，無論是DET或DETD-35都不會影響實驗動物的體重(結果未示出)。

綜合以上，可知DET和DETD-35可有效地降低PLX4032對皮膚所造成的副作用，其中又以DETD-35的效果最為顯著。

實施例13 實施例1.2.2的DETDs結構活性與對抗多種癌細胞株增生的關連性

基於實施例1.2.2的DET和DETDs對於不同乳癌和黑色素瘤細胞株的毒性結果，本發明選用DETD-6、DETD-32、DETD-35和DETD-39進行更進一步的試驗，並在結構活性關連性的考量下，評估該些化合物對抗其他癌細胞株的抑制效果，結果如表5所示。該4種DETDs化合物除了能有效抑制乳癌和黑色素瘤細胞生長外，亦能有效抑制腦癌、肺癌、淋巴瘤、神經上皮瘤、腎癌、前列腺癌、胃癌、大腸癌以及子宮癌細胞增生。總而言之，在不同的癌細胞類型中，DETD-35的抑制效果最為顯著，且對於正常細胞株M10、黑色素細胞和巨 噬細胞無細胞毒性(表3和表4)。因此，DETD-35具有發展成為抗癌藥物的潛力。DETD-6和-39對於不同類型的癌症亦具有新穎的活性，但在體外試驗中，該二種藥物對於正常細胞具有部分毒性。

實施例14 LPS-刺激巨噬細胞(LPS-stimulated macrophages)產生一氧化氮(nitric oxide,NO)的抑制效果

脂質多醣體(lipopolysaccharide,LPS)位於革 蘭氏陰性細菌的外膜，能促進誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表現。所述一氧化氮合成酶能催化L-精胺酸的氧化脫氨作用，以產生一氧化氮(NO)。當產生大量NO時，其與超氧陰離子相互作用，產生高反應性氧化物，造成細胞性發炎、DNA、蛋白質和組織受損、癌變和抗凋亡產生。在此實施例中，本發明利用活體外LPS刺激RAW264.7細胞系統產生發炎反應，評估DET和其衍生物DETDs對於NO產生的影響。試驗細胞經LPS處理24小時後，測定培養基中亞硝酸鹽的濃度(相當於NO的濃度)。所述DET植物化合物為一已知NO抑制劑，IC₅₀值2.9μM。再者，大部分的DETD具有抑制巨噬細胞中LPS誘導NO生成的效果，其中又以經DETD-35和DETD-39處理的抑制效果最佳，其IC₅₀值降低2-3倍(1.5和1.0μM)。DETD-39亦顯示對於正常小鼠巨噬細胞RAW 264.7具有毒性，IC₅₀為3.5μM(表4)。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

Claims (31)

1. 一種式(I)化合物： 其中：R是H或-(C=O)R₁；以及R₁分別是H、C_1-20烷基、C_1-20烯基、芳香基或雜芳基，其中該C_1-20烷基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：鹵素、羥基、烷醯氧基、烷氧基、苯基、萘基、異苯并呋喃基、異苯噻吩基或異喹啉基；該C_1-20烯基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：苯基、呋喃基、噻吩基或異苯并二氧戊環基；每一苯基和萘基可不經取代或帶有至少一選自以下之取代基：鹵素、烷基、過氟化烷基、烷氧基或鹵代烷氧基；和該芳香基可不經取代或帶有鹵素、C_1-4低碳數烷基、烷氧基或鹵代烷氧基取代基。
2. 如請求項1所述之化合物，其中該雜芳基是噻吩基、異苯并呋喃基或異苯噻吩基。
3. 如請求項1所述之化合物，其中該芳香基是苯基或萘基。
4. 如請求項3所述之化合物，其中該苯基可不經取代或帶有鹵素、烷基或烷氧基取代基。
5. 如請求項1所述之化合物，其中該C_1-20烷基是環丙基、環戊基或環己基。
6. 如請求項1所述之化合物，其中R₁是該C_1-20烯基。
7. 如請求項6所述之化合物，其中R₁是一丙烯基。
8. 如請求項7所述之化合物，其中該丙烯基更帶有一苯基取代基。
9. 如請求項8所述之化合物，其中該苯基更帶有-OCH₃取代基。
10. 如請求項9所述之化合物，其中該R₁是一亞甲基(methylene)。
11. 如請求項10所述之化合物，其中該亞甲基更帶有一萘基取代基。
12. 一種用以治療一患有/疑似患有一炎症和/或腫瘤相關疾病之個體的藥學組合物，包含：一治療有效量之如請求項1所述的式(I)化合物；以及一藥學上可接受的載體。
13. 如請求項12所述之藥學組合物，其中在該式(I)化合物中，該雜芳基是噻吩基、異苯并呋喃基或異苯噻吩基。
14. 如請求項12所述之藥學組合物，其中在該式(I)化合物中，該芳香基是苯基或萘基。
15. 如請求項14所述之藥學組合物，其中該苯基可不經取代或帶有鹵素、烷基或烷氧基取代基。
16. 如請求項12所述之藥學組合物，其中在該式(I)化合物中，該C_1-20烷基是環丙基、環戊基或環己基。
17. 如請求項12所述之藥學組合物，其中在該式(I)化合物中，R₁是C_1-20烯基。
18. 如請求項17所述之藥學組合物，其中該R₁是一丙烯基。
19. 如請求項18所述之藥學組合物，其中該丙烯基更帶有一苯基取代基。
20. 如請求項19所述之藥學組合物，其中該苯基更帶有-OCH₃取代基。
21. 如請求項12所述之藥學組合物，其中在該式(I)化合物中，R₁是該C_1-20烷基。
22. 如請求項21所述之藥學組合物，其中該R₁是一亞甲基，並可不經取代或帶有一萘基取代基。
23. 如請求項12所述之藥學組合物，更包含一化療藥劑或一麩胱甘肽生物合成阻斷劑。
24. 如請求項23所述之藥學組合物，其中該化療藥劑係選自於DET、PLX4032、多烯紫杉醇、紫杉醇、順鉑、奧沙利鉑、樺木酸、4-S-半胱胺兒茶酚、4-S-半胱胺酚、依維莫司、硼替佐米、卡鉑定、達卡巴嗪、塞來昔布、替莫唑胺、蕾莎瓦、沙利多邁、來那度胺、丙戊酸、長春鹼、甲磺酸伊馬替尼、波生坦、阿波胺、三氧化砷、卡莫司汀、拉鉑立茲瑪、抗CTLA-4藥物、抗程式性死亡 受體-1(PD-1)藥物、易普利姆瑪、崔枚利姆瑪、艾黴素、MEK抑制劑、卡培他濱、聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制劑、磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑、哺乳類雷帕黴素之標靶(mTOR)抑制劑和他莫昔芬所組成的群組中。
25. 如請求項24所述之藥學組合物，其中該麩胱甘肽生物合成阻斷劑是丁硫堇硫醯亞胺(BSO)或柳氮磺胺吡啶。
26. 如請求項12所述之藥學組合物，其中該腫瘤相關疾病是一癌症係選自於乳癌、皮膚乳頭狀瘤、黑色素瘤、腦癌、肺癌、淋巴瘤、神經上皮瘤、腎癌、前列腺癌、胃癌、大腸癌及子宮癌所組成的群組中。
27. 如請求項26所述之藥學組合物，其中該癌症是一抗藥性癌症。
28. 如請求項27所述之藥學組合物，其中該癌症是對PLX4032具有抗藥性的黑色素瘤。
29. 如請求項28所述之藥學組合物，其可降低PLX4032對該個體所造成的副作用。
30. 如請求項29所述之藥學組合物，其中該副作用是指PLX4032於該個體皮膚上所誘發生成的乳頭瘤。
31. 如請求項12所述之藥學組合物，其中該發炎相關疾病係選自於發炎性皮膚病、發炎性腸疾病、過敏性肺部疾病、氣喘、過敏性鼻炎、自體免疫疾病、急性和慢性炎症、修格連氏症候群、人類免疫不足病毒感染及癌症組成的群組中。