CN107349194A - 一种磺酸酯类化合物在制备抗宫颈癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了(1R,5S)‑(6,6‑二甲基二环［3,1,1］庚‑2‑烯‑2‑基)磺酸酯类化合物在制备抗宫颈癌药物中的应用，所述(1R,5S)‑(6,6‑二甲基二环［3,1,1］庚‑2‑烯‑2‑基)磺酸酯类化合物为如下化学式中的一种：(1R,5S)‑(6,6‑二甲基二环［3,1,1］庚‑2‑烯‑2‑基)苯磺酸酯、(1R,5S)‑(6,6‑二甲基二环［3,1,1］庚‑2‑烯‑2‑基)对甲苯磺酸酯。本发明结合细胞周期检测、细胞凋亡检测和抑制宫颈癌细胞株活性上验证了上述化合物的效果，结果显示，上述化合物具备显著的抑制宫颈癌细胞活性效果，且低毒、高效、稳定，丰富了抗癌化合物库，为制备抗癌药物或药物组合物提供了有力的技术支持。

Description

一种磺酸酯类化合物在制备抗宫颈癌药物中的应用
技术领域
本发明属于药物与有机合成技术领域，更具体地，涉及一种磺酸酯类化合物在制备抗宫颈癌药物中的应用。
背景技术
在世界范围内，宫颈癌是女性第4位常见的恶性肿瘤。2012年，全球全年发生宫颈癌528 000例，年死亡数为266 000例，并呈现出年轻化趋势。2016年美国新发宫颈癌12 990例,死亡4120例。85％宫颈癌发生于发展中国家，并且在这些国家中宫颈癌居癌症死因的首位，形势严峻。目前，有能治愈宫颈癌的治疗措施多是手术切除，宫颈癌早期症状不明显，多于中晚期才能诊断出，常予于广泛性子宫切除术加双侧盆腔淋巴结切除术，但鉴于宫颈癌年轻化的趋势和术后生育功能的丧失等特点，多数患者选择经皮治疗、射频消融、动脉栓塞、化疗等姑息性治疗方法，为患者后期的治疗创造机会。其中，化疗药物在抑制肿瘤细胞增殖、稳定瘤体生长、改善症状体征、减毒增效、预防复发、提高生存质量、延长生存期等的作用尤为重要。
从传统中药中寻找高效低毒的有效部位或活性成份治疗宫颈癌已成为当今研究热点,具有重要的研究价值和应用前景；同时，肿瘤细胞的耐药性和抗癌药物的毒副作用严重影响了患者的化疗效果，开发和寻找新型的抗癌药物亦是研究的重要任务。
发明内容
本发明提供了(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)磺酸酯类化合物在制备抗宫颈癌药物中的应用。
本申请人前期研究表明松针油中有效成分α-蒎烯具有诱导肝癌细胞Bel-7402凋亡的作用，且其作用机制与抑制端粒酶活性和多种诱导凋亡的相关基因表达有关。在此基础上，我们发现以下两种α-蒎烯的衍生物(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)苯磺酸酯(简称化合物A)和(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)对甲苯磺酸酯(简称化合物B)存在抗宫颈癌作用。
本发明的技术目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)磺酸酯类化合物在制备抗宫颈癌药物中的应用，所述(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)磺酸酯类化合物为如下化学式中的一种：
(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)苯磺酸酯；
(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)对甲苯磺酸酯。
进一步地，所述药物包括药学上可接受的盐或载体。
本发明还提供了所述(1R,5S)-(6,6-二甲基二环[3,1,1]庚-2-烯-2-基)磺酸酯类化合物的制备方法，包括如下步骤：
S1.将α-蒎烯加入溶剂溶解；
S2.在S1溶解的溶液中滴加SeO2和V2O5，反应完成后回收溶剂，加入有机层萃取，有机层经洗涤分离有机层，干燥，抽滤，回收溶剂，即得化合物I
S3.称取纯化后的S2中化合物I，加入溶剂及缚酸剂，冰浴搅拌下加入磺酸类化合物或者磺酰氯类化合物，加热回流反应；
S4.待反应结束后冷却至室温，减压蒸馏，去除溶剂；经过萃取和柱层析得到无色透明或淡黄色粘稠液体，得到目标化合物A和B。
其中，步骤S1、S2所述溶剂为C1-C5的醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈或四氢呋喃。溶剂的用量适量即可。
更优选地，S1中溶剂为二氯甲烷。
优选地，步骤S3中溶剂为C1～C5的醇、二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈、二硫化碳或四氢呋喃。
更优选地，步骤S3所述溶剂为二氯甲烷，可获得较高的转化率和收率。
优选地，步骤S3中所述缚酸剂为N,N'-二叔丁基乙二胺、二环己基碳二亚胺、三乙胺、吡啶、碳酸氢钠、二异丙基乙二胺等有机碱或无机碱。
优选地，步骤S3所述缚酸剂的加入量按照化合物I摩尔量的1.1～5倍量确定。
优选地，步骤S3所述苯磺酸或本磺酰氯的加入量按照化合物I摩尔量的1.1-3倍量确定。
优选地，步骤S4中所述的溶剂为二氯甲烷，萃取液是石油醚，柱层析洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯，比例为3：1～50：1。
本发明将化合物A和B在体外针对宫颈癌Hela细胞进行活性检测及活性机制的初步研究。初步研究结果显示，A与B两种物质均能显著抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，且其作用可能与阻滞细胞周期和诱导凋亡有关，流式细胞分析显示A与B物质作用后宫颈癌细胞均被阻滞在G1/S期，并存在显著的早期凋亡。
针对A与B两种化合物是否在体内具有抗宫颈癌作用，我们目前已经建立了裸鼠移植性宫颈癌的动物模型，我们采用此模型通过灌胃给药和局部给药两种方式观察化合物B对宫颈癌的治疗作用，结果显示化合物B能够抑制肿瘤的生长。
同现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了倍半萜类α-蒎烯类衍生物A和B在制备抗宫颈癌药物方面的良好应用。体外抗癌实验表明本发明提供的化合物具有明显抗宫颈癌效果，有低毒、高效、稳定等特点，丰富了抗癌化合物库，为制备抗癌药物或药物组合物提供了有力的技术支持。
附图说明
图1为化合物A的高效液相色谱图；其中，图1为化合物A以C18反相柱为固定相、乙腈和水(比例为70:30)、柱温30℃、流速1ml/min、波长为270nm，出峰时间为20.5-22.0min的高效液相色谱图。
图2为化合物B的高效液相色谱图；其中，图2为化合物B以C18反相柱为固定相、乙腈和水(比例为75:25)、柱温30℃、流速1ml/min、波长为275nm，出峰时间为29-31.0min的高效液相色谱图。
图3为化合物A电喷雾正离子模式质谱图。
图4为化合物B电喷雾正离子模式质谱图。
图5为化合物A的1H-NMR图。
图6为化合物B的1H-NMR图。
图7为化合物A、B分别作用于Hela、HepG2细胞24h、48h、72h后的IC50折线图。
图8为化合物A的细胞周期检测图。
图9为化合物B的细胞周期检测图。
图10为化合物A、B作用Hela细胞前后用PI染色检测分析各个时相比例折线图。图线表明化合物A、B均能使Hela细胞的S期显著增多，G2期显著减少，从而使细胞阻滞到G1/S期。
图11为化合物A的细胞凋亡检测图。
图12为化合物B的细胞凋亡检测图。
图13为化合物A分别在40μmol/L和80μmol/L作用下检测细胞凋亡的各个形态的比例图。由图可知化合物A可引起Hela细胞的早期凋亡。
图14为化合物B分别在40μmol/L和80μmol/L作用下检测细胞凋亡的各个形态的比例图。由图可知化合物B可引起Hela细胞的晚期凋亡。
图15为实施例7中化合物B对肿瘤组织实体大小的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图进一步说明本发明。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的原料。
实施例1：化合物A的合成
合成路线如下：
第一步：
第二步：
详细步骤如下：
第一步：在反应瓶中，加入1.36g的α-蒎烯溶于30mL无水乙醇溶液中，加入活化SeO2粉末1.2g、选择性氧化催化剂V2O5 0.1g，加热至35-45℃，反应15-30h至反应终点。45℃真空旋蒸回收溶剂，过滤，柱层析(洗脱剂是石油醚：乙酸乙酯1:3-3:1)，无水硫酸钠干燥，回收溶剂，减压蒸馏得化合物I。化合物I的ESI-MS(M+H)+:137.24；
1H-NMR(400MHZ,CDCl3):5.19(s,1H),2.06-2.31(d,2H),2.07(s,1H),1.93(s,1H),1.62-1.87(d,2H),1.66(m,3H),1.05(m,6H).
第二步：取纯化后的化合物I 1.52g(10mmol)溶于二氯甲烷10-20ml，加入二环己基碳二亚胺(简称DCC)10-20mmol，冰浴搅拌均匀后缓慢滴入苯磺酸3.17g(20mmol)，再加入4-二甲氨基吡啶(简称DMAP)0.1mmol，常温反应6-12h至反应终点。35℃真空旋蒸回收溶剂，过滤，柱层析(洗脱剂是石油醚：乙酸乙酯(3:1-50:1)，无水硫酸钠干燥，回收溶剂，减压蒸馏得化合物A。
化合物A的ESI-MS(M+H)+:293.74
1H-NMR(400MHZ,CDCl3)见实施例3。
实施例2化合物B的合成
第一步：
第二步：
第一步：同实施例1第一步。
第二步：取纯化后的化合物I 1.52g(10mmol)溶于二氯甲烷10-20ml，冰浴搅拌均匀后缓慢滴入10ml溶有对甲苯磺酰氯3.81g(20mmol)的混合溶液，再加入N,N'-二叔丁基乙二胺10mmol，加热至45℃，反应30-48h至反应终点。45℃真空旋蒸回收溶剂，过滤，柱层析(洗脱剂是石油醚：乙酸乙酯(3:1-50:1)，无水硫酸钠干燥，回收溶剂，减压蒸馏得化合物B。
化合物B的ESI-MS(M+H)+:306.06.
1H-NMR(400MHZ,CDCl3)见实施例3。
实施例3化合物A和B的提纯和鉴定
(1)提纯：化合物A和B的粗产物经石油醚萃取取上层，再经柱层析(展开剂：石油醚/乙酸乙酯为3/1-100/1)可得到单一显色点。
(2)鉴定：化合物A和B的紫外(365nm)显浅红色、香草醛硫酸溶液喷雾高温烘干显浅紫色，终产物为无色或浅黄色透明粘稠液体。
其HPLC、MS、H1NMR结果如下：①HPLC：化合物A以C18反相柱为固定相、乙腈和水(比例为70:30)、柱温30℃、流速1ml/min、波长为270nm，出峰时间为20.5-22.0min(见图1)；化合物B以C18反相柱为固定相、乙腈和水(比例为75:25)、柱温30℃、流速1ml/min、波长为275nm，出峰时间为29-31.0min(见图2)。②MS：化合物A、B电喷雾正离子模式质谱如下(见图3、4)。③H1NMR：化合物A、B核磁共振氢谱如下(见图5、6)。
实施例4化合物A和B的活性筛选
取对数生长期的宫颈癌Hela细胞调整细胞数至1-8*103个接种于96孔细胞培养板中，孵育至贴壁后设置空白组、阳性对照组(白藜芦醇80μmol/L)、给药组(5-640μmol/L多个不同浓度组)给药，分别给药24h、48h、72h后加入MTT(10μL/孔)，孵育4h后弃上清加入DMSO溶液在37℃下缓慢振摇10min，用酶标仪570nm波长检测，与抗肝癌活性(对HepG2细胞的MTT检测结果)与抗宫颈癌活性对比如下(见图7、表1)，结果表明化合物A和B对宫颈癌细胞致死率均大于肝癌细胞。
表1：化合物A、B分别作用于Hela、HepG2细胞24h、48h、72h后的IC50值汇总表
实施例5化合物A和B的细胞周期检测
收集化合物A和B不同浓度处理后的宫颈癌Hela细胞，以PBS缓冲液清洗2次，将细胞沉淀充分混匀，以70％的冷乙醇4℃固定24h以上离心去除乙醇固定液，用PBS清洗2次后，加入PI染色剂，流式细胞仪分析含不同量DNA的细胞分布。应用分析系统进行数据处理，结果显示A和B均能显著抑制宫颈癌Hela细胞的增殖，且其作用可能与阻滞细胞周期有关，流式细胞分析显示A和B作用后宫颈癌细胞被阻滞在G1/S期，其结果下(见图8～10、表2)。
表2：化合物A、B作用Hela细胞前后用PI染色检测分析各个时相比例表
实施例6化合物A和B的细胞凋亡检测
收集化合物A和B不同浓度处理24h后的宫颈癌Hela细胞，以PBS缓冲液清洗2次，将细胞沉淀充分混匀，加入PI和Annexin Ⅴ FITC染色剂，流式细胞仪分析细胞凋亡进程。应用分析系统进行数据处理，结果显示A和B均能显著诱导宫颈癌Hela细胞凋亡，且化合物A主要诱导宫颈癌细胞的早期凋亡、化合物B主要诱导宫颈癌细胞晚期凋亡，其结果如下(见图11-14、表3)。
表3：化合物A、B分别在40μmol/L和80μmol/L作用下检测细胞凋亡的各个形态比例汇总表
实施例7建立裸鼠荷瘤模型探讨化合物B体内抗癌活性
取6-8周龄、体重18-22g雌性裸鼠18只，于左腋下注射01-0.2ml细胞悬液(约2*106个)，1-2周后瘤径大于4mm开始给药，平均分三组：阴性对照组(生理盐水灌胃)；阳性对照组(5-氟尿嘧啶10mg/kg灌胃)，化合物B给药组(80mg/kg灌胃)。给药期间，灌胃每2天一次，体重和瘤径测量每两天一次其结果如下(见表4)。给药2周后，解剖裸鼠，分取肿瘤组织(见图15)、肝脏、脾脏等。结果显示化合物B给药组的抑瘤率在15％左右，其肝脾体重指数显示化合物B对动物肝功能有部分影响，对脾脏功能影响较小(见表5)。化合物B对肝脏的影响将进一步做组织切片研究，肿瘤的抑制机制亦正在研究中。
表4：裸鼠荷瘤给药后体重、瘤径变化
表5：给药15天后裸鼠肝脏和脾脏与体重的比值

Claims (2)

1.(1R,5S)-(6,6-二甲基二环［3,1,1］庚-2-烯-2-基)磺酸酯类化合物在制备抗宫颈癌药物中的应用，其特征在于，所述(1R,5S)-(6,6-二甲基二环［3,1,1］庚-2-烯-2-基)磺酸酯类化合物为如下化学式中的一种：
(1R,5S)-(6,6-二甲基二环［3,1,1］庚-2-烯-2-基)苯磺酸酯；
(1R,5S)-(6,6-二甲基二环［3,1,1］庚-2-烯-2-基)对甲苯磺酸酯。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括药学上可接受的盐或载体。
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