TW201514198A - 治療或預防結核病的組合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示基於酵母之免疫治療組合物及融合蛋白用於治療及/或預防TB感染及其症狀,以及使用基於酵母之免疫治療組合物及融合蛋白預防性及/或治療性治療TB及/或其症狀之方法。
Description
本發明係根據由美國國家衛生研究院(National Institutes of Health)之國家過敏及感染性疾病研究院(National Institute of Allergy and Infectious Disease)授與之授權號1 R01 AI105053-01,在政府支持下進行。美國政府具有本發明之某些權利。
本申請案根據35 U.S.C.5119(e)主張2013年8月30日申請之美國臨時專利申請案第61/872,498號及2014年6月24日申請之美國臨時專利申請案第62/016,541號之優先權。美國臨時專利申請案第61/872,498號及美國臨時專利申請案第62/016,541號中之每一者之全部揭示內容以引用之方式併入本文中。
根據2013年10月3日執行之美國國家衛生研究院之國家過敏及感染性疾病學會授與之授權號1 R01 AI105053-01,本發明係由研究子合同協議之當事人或以其名義進行。研究子合同協議之當事人為:GlobeImmune,Inc.(主要受益人)及科羅拉多州大學(Colorado State University)(次要受益人)。
本申請案含有藉由EFS-Web以文本文件形式以電子方式提交之序
列表。名為「3923-45-PCT_ST25」之文本文件具有192KB位元組之尺寸,且係在2014年8月25日記錄。文本文件中所含資訊遵循37 CFR§ 1.52(e)(5)以全文引用的方式併入本文中。
本發明大體上係關於基於酵母之免疫治療組合物及預防及/或治療結核病之方法。
結核病(核TB」,結核桿菌(tubercle bacillus)之縮寫,亦稱為「MTB」)係由分支桿菌(Mycobacterium)感染,最典型地結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)引起,且排在感染性疾病死亡率之病源學之前三名。產生此病原體之藥物抗性病毒株作為一般健康危害源及潛在生物恐怖主義試劑尤其危險。結核病主要影響肺,但其亦可影響身體之其他部位,諸如大腦、腎或脊椎,且其藉由呼吸流之傳遞經由空氣傳播(例如由受感染個人之咳嗽或打噴嚏引起)。儘管許多TB感染為潛伏性(無征狀),但約10%的此等潛伏性感染最終變成活動性疾病,其在未經治療時殺死超過50%受感染患者。
認為全世界約三分之一的人群已感染結核分枝桿菌(M.tuberculosis)。TB病例之絕對數目儘管自二十世紀早中期開始已減少,但根據疾病控制中心(Centers for Disease Control;CDC),在2011年,全世界約9百萬人罹患TB疾病,且全世界有約140萬例TB相關死亡。此外,TB為受TB感染之人群之主要殺手。亦根據CDC,在2011年,美國報導總共10,528例TB病例(比率為每100,000人中3.4例)。因此,全世界仍需要TB之防治性及治療性治療。
TB之治療係困難的且在長時間段(例如6-9個月)內投與多種抗生素。因此,治療之完成在患者順應性受到挑戰。此外,抗生素抗性為一個問題,其中多藥物抗性結核病(MDR-TB)感染(由至少對當前兩種
最有效TB藥物異菸肼及利福平(rifampin)具有抗性之生物體引起)之發病率持續增加。此外,儘管較罕見,但亦出現藥物抗性極高之TB(XDR TB)之病例,一種對異菸肼及利福平加任何氟喹諾酮及三種可注射第二線藥物(亦即阿米卡星(amikacin)、康黴素(kanamycin)或卷麯黴素(capreomycin))中之至少一者具有抗性之MDR TB。
在美國,結核病之預防主要經由TB篩檢及監測程式進行且在世界上其他地區,藉由芽孢桿菌卡莫特-蓋蘭(BCG)TB疫苗(Bacillus Calmette-Guérin(BCG)vaccine)之疫苗接種進行。BCG疫苗為最初來源於牛分支桿菌(Mycobacterium bovis)之菌株的活疫苗,其由Calmette及Guerin在十九世紀早期在法國里爾(Lille)的巴斯德研究所(Pasteur Institute)滅毒。儘管BCG疫苗在某些兒科病例中展示一些作用,但未證實疫苗在成年人TB中有效,其功效在少年及青少年中減弱,且疫苗可受到結核菌素皮膚測試干擾,該等測試為預防篩檢方法中所使用之主要TB偵測手段。
已知CD4+ Th1細胞經由干擾素(IFN)γ之產生靶向細胞內病原體,諸如結核分枝桿菌,且CD8+細胞毒性T細胞(CTL)之產生在對抗TB中為重要的(Billeskov等人,J.Immunol.179:3973-81(2007);Elvang等人,PLoS One 4:5139(2009))。然而,單獨的CD4+ Th1及CD8+ T細胞未說明對TB之抗性/敏感性,如可由亦胞外顯示自身之疾病預見。現在顯而易見,TB之細胞外靶向屬於稱為Th17之CD4+ T細胞亞型之範圍,其針對其分泌之細胞激素IL-17(Hunter等人,Nat Rev Immunol 5,521-31(2005))。Th17反應之量值與臨床結果(Khader等人,Nat Immunol 8:369-77(2007))及TB中之疾病嚴重度(Chen等人,J.Clin.Immunol.2010年線上公開)相關。若Th1及Th17反應皆為生產性免疫性所需的(Khader等人,見上文(2007);Khader及Cooper,Cytokine 41:79-83(2008)),則TB可藉由阻礙任一路徑而逃避免疫系
統。實情為,已報導TB可引起T細胞上IL-6受體之下調(Chen等人,見上文,2010),IL-6為Th17細胞之誘導中之關鍵細胞激素,因此否定Th17路徑且破壞免疫設備中之重要組分。最終,Ordway等人(Clin Vaccine Immunol.2011年9月;18(9):1527-35,2011年7月27日電子出版)之近期研究表明BCG疫苗接種顯著延緩但不阻止CD4+T細胞之Treg群體之出現,進一步減少長期保護。此論文在對照小鼠及先前已接種芽孢桿菌卡莫特-葢蘭(BCG)TB疫苗之小鼠中比較針對兩種高毒性W-Beijing病毒株之宿主免疫反應。結果表明CD4+效應子T細胞反應在攻擊後一個月達到峰值,接著在第60天衰減,伴隨肺、引流淋巴結及脾中Treg細胞(CD4+Foxp3+細胞)之出現頻率增加。
有效暴露後疫苗已長時間成為本領域中許多研究人員之目標。然而,此類疫苗為廣泛成功或尚未證實在人類中有效。舉例而言,由科羅拉多州大學集中於抗原研究之科學家評估之某些疫苗(簡稱為培養物濾液,例如次單位疫苗,其由來自在MPL-TeoA佐劑中乳化之結核分枝桿菌之對數生長中期(mid-log-phase)培養物濾液蛋白質(CFP)組成且補充有重組白細胞介素2(rIL-2)或編碼抗原85A之DNA疫苗(Turner等人,見上文2000))未成功調節結核分枝桿菌之噴霧感染之過程。在2010年,Bertholet等人報導針對TB之重組次單位疫苗,稱為ID93,其組合屬於Mtb蛋白質家庭之四種抗原,該四種抗原與穩定的水包油型基於單磷醯基脂質A之佐劑中之毒性(Rv2608、Rv3619、Rv3620)或潛伏性(Rv1813)有關。在TB之三中動物模型中,疫苗為免疫原性且在兩種模型中展示對毒性TB病毒株之攻擊的保護。然而,單獨的重組蛋白質通常無免疫原性,且實現人類中重組蛋白質(諸如ID93)之成功使用的佐劑研發仍然為一項挑戰。儘管此類佐劑為進行中的研究及臨床試驗之目標,但仍需發現次單位疫苗(諸如ID93)作為暴露前或暴露後疫苗在人類中是否有效。正在研究若干種其他疫苗候
選物,但皆未在人類臨床試驗中展示功效。在2013年2月,報導最近的針對TB之新型疫苗(表現抗原85A且由牛津大學(Oxford University)之研究人員研發之重組修飾牛痘病毒Ankara)不能提供針對嬰兒中結核病或結核分枝桿菌感染之顯著保護(Tameris等人,Lancet.2013年3月23日;381(9871):1021-8)。
研發暴露前或暴露後疫苗中之挑戰之一部分為抗原選擇。由科羅拉多州大學(CSU)之研究者在2000年進行之全面研究(Turner等人,見上文2000)表明在治療情形中,不存在顯而易見的得益於基於結核分枝桿菌之某些「免疫顯性」抗原之暴露後疫苗的物質。抗原及當前研發中之疫苗之綜述可見於Orme等人(Drugs(2013)73:1015-1024)。儘管免疫顯性抗原仍保持受到多種TB疫苗工作之關注,但CSU之研究者最近亦集中於由應力條件(例如壞死、宿主氧化氮產生等)下之芽孢桿菌產生之抗原;此等抗原包括一些視為「潛伏性」抗原之抗原。此類潛伏性抗原包括與原生肺肉芽腫中之桿菌用於產生蛋白質以達成積聚鐵之目的之特定作用有關的抗原。CSU研究者廣泛定義受低劑量結核分枝桿菌噴霧感染之天竺鼠中疾病病程之病理學。一項研究(其中主要病灶中之鐵分佈(作為營養不良性鈣化過程之一部分)為主要關注點)產生意外觀測結果,壞死中心中之細胞外桿菌以及可能仍存在於此結構之邊緣上的巨噬細胞中之桿菌(Lenaerts等人,2007;Basaraba等人,2008;Orme等人,2011)由三價鐵包圍。此等研究者先前注意到長期受TB感染之小鼠之肺中具有T細胞,其識別細菌鐵蛋白且產生IFN-γ。製備包括此抗原之後續融合蛋白疫苗,且在天竺鼠暴露後模型中具有適度的保護活性。CSU研究者報導由「鐵聚集」蛋白質(在本文中亦稱為「鐵代謝抗原」),亦即Rv1909、Rv2359及Rv2711形成之重組次單位疫苗(Orme,Drugs(2013)73:1015-1024)。
最終,如Orme等人,2011,見上文中詳細論述,TB之發病機制
之盛行觀點(其已保持多年)為炎症驅動細胞募集及肉芽腫形成,且肉芽腫變得新生血管化。病灶之中心產生壞死,而淋巴細胞保持在病灶邊緣。此等病灶接著可成穴,將桿菌釋放至呼吸道中。然而,最近由最近資料支持之TB感染之替代性模型指出主要病灶及其壞死並非終點,而實情為極早期事件,與後天免疫性之產生無關。在此模型中,局部脈管之崩潰允許桿菌存留及存活(可能在原始生物膜中),肺中形成繼發性病灶,T細胞免疫性降低(與桿菌之存活無關),且一些此等病灶侵蝕至鄰近的呼吸道或血管中,導致TB感染之傳播及洩露。TB之發病機制之此等不同觀點與應如何設計預防性或治療性疫苗直接相關,再次引導回基於原發性病灶之靶向免疫顯性抗原迄今未產生有效疫苗之想法。實際上,對結核病病原體之生物學理解不足已成為疫苗研發之主要障礙。
因此,此項技術中仍然需要經改良之針對TB之暴露前及/或暴露後疫苗。
本發明之一個實施例係關於免疫治療組合物,其包含:(a)酵母媒介物;及(b)包含至少一種TB抗原之融合蛋白。TB抗原可包括(但不限於)選自以下之TB蛋白質:Rv0125、Rv1196、Rv1411(Rv1411c)、Rv1738、Rv1813、Rv1909(Rv1909c)、Rv2032、Rv2359、Rv2608、Rv2660、Rv2711、Rv3130、Rv3619、Rv3620、Rv3841、Ag85A、Ag85B、TB10.4及ESAT-6。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv1738、Rv2032、Rv3130或Rv3841中之一或多者之TB抗原。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv1738、Rv2032、Rv3130或Rv3841中之兩者或兩者以上之TB抗原。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv1738、Rv2032、Rv3130及Rv3841中之每一者之TB抗原。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711或Rv1909c中之一或多者之
TB抗原。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711及Rv1909c中之兩者或兩者以上之TB抗原。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711及Rv1909c中之每一者之TB抗原。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711或Rv1909c中至少一者之TB抗原,及來自Rv1738、Rv2032、Rv3130及Rv3841中之至少一者或多者之TB抗原。在與本發明之以上態樣中任一項有關之另一實施例中,融合蛋白進一步包含來自Rv1411c之TB抗原。在一個態樣中,融合蛋白包含來自Rv2032、Rv1411c及Rv2359中之每一者之TB抗原。
本發明之另一實施例係關於免疫治療組合物,其包含:(a)酵母媒介物;及(b)包含TB抗原之融合蛋白,其中TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少80%一致的胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在另一實施例中,TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在另一實施例中,TB抗原與選自以下之胺基酸序列至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致或94%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在另一實施例中,TB抗原與選自以下之胺基
酸序列至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致或99%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在另一實施例中,TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少99%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在另一實施例中,TB抗原包含選自以下之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在一個態樣中,TB抗原包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列或由其組成。在一個態樣中,TB抗原包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列或由其組成。在一個態樣中,TB抗原包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列或由其組成。
在本發明之關於免疫治療組合物之此等實施例中之任一者之一個態樣中,融合蛋白包含選自以下之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48。在一個態樣中,融合蛋白包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列或由其組成。在一個態樣中,融合蛋白包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列或由其組成。在一個態樣中,融
合蛋白包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列或由其組成。
在本發明之上述實施例及態樣中之任一者中,在另一態樣中,酵母媒介物為完全酵母。在一個態樣中,酵母媒介物為完全、經殺死或不活化酵母。在一個態樣中,酵母媒介物為完全、熱不活化酵母。
在本發明之上述實施例及態樣中之任一者中,在另一態樣中,酵母係來自選自由以下組成之群的酵母屬:酵母菌屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、漢森酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)及耶氏酵母屬(Yarrowia)。在一個態樣中,酵母來自酵母菌屬。在一個態樣中,酵母來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
在本發明之上述實施例及態樣中之任一者中,在另一態樣中,在適用於藉由注射投與個體之醫藥學上可接受之賦形劑中調配組合物。
本發明之另一實施例係關於免疫治療組合物,其包含:(a)來自釀酒酵母之完全、熱不活化酵母;及(b)由酵母表現之TB融合蛋白,其中融合蛋白包含選自以下之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48。在一個態樣中,融合蛋白包含SEQ ID NO:15之胺基酸序列或由其組成。在一個態樣中,融合蛋白包含SEQ ID NO:33之胺基酸序列或由其組成。在一個態樣中,融合蛋白包含SEQ ID NO:45之胺基酸序列或由其組成。
本發明之另一實施例係關於包含TB抗原之融合蛋白,其中TB抗
原包含與以下胺基酸序列至少80%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在一個態樣中,TB抗原包含與以下胺基酸序列至少85%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在一個態樣中,TB抗原包含與以下胺基酸序列至少90%一致、91%一致、92%一致、93%一致或94%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在一個態樣中,TB抗原包含與以下胺基酸序列至少95%一致、96%一致、97%一致、98%一致或99%一致之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在一個態樣中,TB抗原包含選自以下之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。在一個態樣中,融合蛋白包
含選自以下之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48。
本發明之另一實施例係關於重組核酸分子,其包含編碼上文或本文中其他地方描述之融合蛋白中之任一者的核酸序列。
本發明之另一實施例係關於經分離之重組細胞,其經上文或本文中其他地方所描述之此類重組核酸分子轉染。在一個態樣中,細胞為酵母細胞。
本發明之另一實施例係關於組合物,其包含上文或本文中其他地方所描述之經分離之重組細胞。
本發明之另一實施例係關於治療個體中結核病(TB)感染或至少一種由TB感染引起之症狀的方法。該方法包括向感染TB之個體投與上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種中之至少一者的步驟。向個體投與組合物可降低個體中之TB感染或至少一種由TB感染引起之症狀。在一個態樣中,該方法進一步包括向個體投與一或多種額外的適用於治療或改善TB感染之症狀的藥劑。在一個態樣中,該額外藥劑為化學治療藥物或抗生素。此類額外藥劑可包括(但不限於)異菸肼(INH)、利福平(RIF)、利福噴丁(rifapentine)(RPT)、乙胺丁醇(ethambutol)(EMB)、吡嗪醯胺(pyrazinamide)(PZA)及BCG疫苗。在一個態樣中,藥劑為BCG疫苗,且在投與免疫治療組合物之前投與BCG疫苗。在一個態樣中,該方法進一步包括直接觀測療法(DOT)。在本發明之此實施例之一個態樣中,個體患有潛伏性TB感染。在一個態樣中,個體患有活動性TB感染。在本發明之此實施例之一個態樣中,向個體投與免疫治療組合物可有效地增強一種藥劑
之功效或與其功效起協同作用,該藥劑適用於治療或改善TB感染之症狀或延緩TB感染及/或其症狀之進程,足以增加藥劑之治療效用或足以提供藥劑額外時間以向個體提供治療效益。在一個態樣中,與不存在組合物之情況相比,向個體投與組合物可降低或延遲個體之肺中繼發性結核病病灶之形成。在一個態樣中,與不存在組合物之情況相比,向個體投與組合物可降低或延遲對淋巴結或其他組織或器官之TB感染之傳播。在一個態樣中,向個體投與組合物可引起針對一或多種TB抗原之抗原特異性、細胞免疫反應。本發明之此等態樣均無需排除本發明之其他態樣。
本發明之另一實施例係關於治療已暴露於引起TB之生物體之個體或個體群體的方法。該方法包括向個體或個體群體投與上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種中之至少一者的步驟。在一個態樣中,該方法進一步包括向個體投與一或多種額外的適用於治療或改善TB感染之症狀的藥劑。在一個態樣中,該額外藥劑為化學治療藥物或抗生素。此類額外藥劑可包括(但不限於)異菸肼(INH)、利福平(RIF)、利福噴丁(RPT)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪醯胺(PZA)及BCG疫苗。在一個態樣中,該方法進一步包括直接觀測療法(DOT)。
本發明之另一實施例係關於預防或延緩個體中TB感染之發作或嚴重度的方法。該方法包括向未感染TB之個體投與上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種中之至少一者的步驟。在一個態樣中,該方法進一步包括投與個體BCG疫苗。在一個態樣中,在投與免疫治療組合物之前投與BCG疫苗。
本發明之另一實施例係關於使個體群體對TB免疫之方法。該方法包括向個體群體投與上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種中之至少一者的步驟。在一個態樣中,該方法進一步包
括向個體群體投與BCG疫苗之步驟。在一個態樣中,該方法進一步包括向個體群體投與BCG疫苗。在一個態樣中,在投與免疫治療組合物之前向個體群體投與BCG疫苗。
在上文或本文中其他地方所描述之方法中之任一種的一個態樣中,以1 Y.U.與80 Y.U.之間的劑量投與免疫治療組合物。在一個態樣中,藉由皮下注射投與免疫治療組合物。
本發明之另一實施例係關於上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種,其係用於治療TB感染或其症狀。
本發明之另一實施例係關於上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種,其係用於預防TB感染或其症狀。
本發明之另一實施例係關於上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種的用途,其係用於製備用以治療TB感染或其症狀的藥劑。
本發明之另一實施例係關於上文或本文中其他地方所描述之免疫治療組合物中之任一種的用途,其係用於製備用以預防TB感染或其症狀的藥劑。
圖1A為示意圖,其展示用於基於酵母之免疫治療組合物中之表現的融合蛋白之組織,其包含N端穩定肽(灰色)、來自rv2359之TB抗原(白色)及C端六組胺酸肽(黑色)。
圖1B為示意圖,其展示用於基於酵母之免疫治療組合物中之表現的融合蛋白之組織,其包含N端穩定肽(灰色)、來自rv1909c之TB抗原(淺灰色)及C端六組胺酸肽(黑色)。
圖1C為示意圖,其展示用於基於酵母之免疫治療組合物中之表現的融合蛋白之組織,其包含N端穩定肽(灰色)、來自rv2711之TB抗原(中等灰色)及C端六組胺酸肽(黑色)。
圖1D為示意圖,其展示用於基於酵母之免疫治療組合物中之表現的融合蛋白之組織,其包含N端穩定肽(灰色)、來自rv2359之TB抗原(白色)、來自rv2711之TB抗原(中等灰色)、來自rv1909c之TB抗原(淺灰色)及C端六組胺酸肽(黑色)。
圖2為西方墨點法之數位化影像,其展示基於酵母之免疫療法組合物中五種不同抗原之表現(rv2359=由SEQ ID NO:6表示之融合蛋白;rv2711=由SEQ ID NO:9表示之融合蛋白;rv1909C=由SEQ ID NO:12表示之融合蛋白;ESAT-6=由SEQ ID NO:18表示之融合蛋白;融合物=由SEQ ID NO:15表示之「3-鐵」融合蛋白;Yvec=空載體酵母(陰性對照))。抗原表現量定量為每YU之抗原(ng)(107個酵母細胞;b.d.=低於偵測值;N/A=不適用)。箭頭表示展示抗原表現之帶。
圖3為曲線,其展示與對照酵母(Ovax,表現無關抗原之基於酵母之免疫治療劑,雞卵白蛋白)相比,在用重組TB抗原Rv2359活體外刺激(IVS)之後,來自經GI-19004(表現3-鐵融合蛋白之基於酵母之免疫治療劑,稱為「融合物」)免疫之小鼠的脾細胞之干擾素-γ(IFN-γ)產生。
圖4為曲線,其展示與對照酵母(Ovax)相比,在用以兩種不同濃度提供之活GI-19004之離心澄清溶解物活體外刺激(IVS)之後,來自經GI-19004(表現3-鐵融合蛋白之基於酵母之免疫治療劑,稱為「融合物)」免疫之小鼠的脾細胞之干擾素-γ(IFN-γ)產生。
圖5為西方墨點法之數位化影像,其展示U2及UL2培養基中基於酵母之免疫療法組合物中三種不同TB抗原之表現(rv1738=由SEQ ID NO:21表示之融合蛋白;rv2032=由SEQ ID NO:24表示之融合蛋白;rv3130=由SEQ ID NO:27表示之融合蛋白)。箭頭表示展示抗原表現之帶。Pmol NS3-his std.=分子量標準。
圖6為西方墨點法之數位化影像,其展示U2及UL2培養基中基於
酵母之免疫療法組合物中三種不同TB抗原之表現(rv3841=由SEQ ID NO:30表示之融合蛋白;Ag85A=由SEQ ID NO:39表示之融合蛋白;rv1411=由SEQ ID NO:42表示之融合蛋白)。箭頭表示展示抗原表現之帶。Pmol NS3-his std.=用於抗原定量之分子量標準:與六組胺酸抗原決定基標籤融合之HCV NS3蛋白酶。
圖7為西方墨點法之數位化影像,其展示U2及UL2培養基中基於酵母之免疫療法組合物中三種不同TB抗原之表現(Ag85A=由SEQ ID NO:39表示之融合蛋白;1738-2032-3130-3841*=由SEQ ID NO:33表示之融合蛋白;2032-1411-2359**=由SEQ ID NO:45表示之融合蛋白)。箭頭表示展示抗原表現之帶。Pmol NS3-his std.=分子量標準。
圖8為西方墨點法之數位化影像,其展示U2及UL2培養基中基於酵母之免疫療法組合物中四種不同TB抗原之表現(2032-3841=由SEQ ID NO:36表示之融合蛋白;3130=由SEQ ID NO:27表示之融合蛋白;1411=由SEQ ID NO:42表示之融合蛋白;2032-1411-2359=由SEQ ID NO:45表示之融合蛋白)。箭頭表示展示抗原表現之帶。Pmol NS3-his std.=分子量標準。
圖9為條形圖,其展示對於多種不同的基於酵母之免疫療法組合物,每個酵母單元(YU;一個YU=107個酵母細胞)之經表現之TB抗原的奈克(Ng)數。表示之融合蛋白為:(1)UL2培養基中由SEQ ID NO:15表示之3-鐵融合物(3-鐵融合物-UL2);(2)U2培養基中由SEQ ID NO:21表示之Rv1738(1738-U2);(3)UL2培養基中由SEQ ID NO:21表示之Rv1738(1738-UL2);(4)U2培養基中由SEQ ID NO:27表示之Rv3130(3130-U2);(5)UL2培養基中由SEQ ID NO:27表示之Rv3130(3130-UL2);(6)U2培養基中由SEQ ID NO:33表示之Rv1738-Rv2032-Rv3130-Rv3841(1738-2032-3130-3841-U2);(7)UL2培養基中由SEQ ID NO:33表示之Rv1738-Rv2032-Rv3130-Rv3841(1738-2032-3130-
3841-UL2);(8)U2培養基中由SEQ ID NO:45表示之Rv2032-Rv1411-Rv2359(2032-1411-2359-U2);(9)UL2培養基中由SEQ ID NO:45表示之Rv2032-Rv1411-Rv2359(2032-1411-2359-UL2);(10)U2培養基中由SEQ ID NO:36表示之Rv2032-Rv3841(2032-3841-U2);(11)UL2培養基中由SEQ ID NO:36表示之Rv2032-Rv3841(2032-3841-UL2);(12)U2培養基中由SEQ ID NO:24表示之Rv2032(2032-U2);(13)UL2培養基中由SEQ ID NO:24表示之Rv2032(2032-UL2);(14)U2培養基中由SEQ ID NO:30表示之Rv3841(3841-U2);(15)UL2培養基中由SEQ ID NO:30表示之Rv3841(3841-UL2);(16)U2培養基中由SEQ ID NO:39表示之Ag85A(A85-U2);(17)UL2培養基中由SEQ ID NO:39表示之Ag85A(A85-UL2);(18)U2培養基中由SEQ ID NO:42表示之Rv1411c(1411-U2);(19)UL2培養基中由SEQ ID NO:42表示之Rv1411c(1411-UL2);(20)對照物1(HCV抗原融合蛋白對照物);及(21)(癌症抗原融合蛋白對照物)。
本發明大體上係關於用於預防及/或治療結核病(TB)之組合物及方法,例如分枝桿菌(通常結核分支桿菌)之菌株的感染,及感染之後遺症。本發明包括基於酵母之免疫治療組合物(亦稱為「基於酵母之結核病免疫療法」或「基於酵母之TB免疫療法」或「基於酵母之TB免疫治療劑」),其包含酵母媒介物及經設計以引發個體中針對TB感染之預防性及/或治療性免疫反應的TB抗原,及此類組合物預防及/或治療TB感染及其相關症狀之用途。本發明亦包括本發明之基於酵母之組合物中所使用之重組核酸分子,以及由此編碼之蛋白質及融合蛋白,其係用於TB感染之任何免疫治療組合物及/或任何治療性或預防性方案,包括任何組合本發明之基於TB特異性酵母之組合物與任何一或多種其他用於TB感染之治療性或預防性組合物、藥劑、藥物、
化合物及/或方案的治療性或預防性方案。
本發明描述基於酵母之TB免疫療法及使用此類免疫療法達成以下目的之方法:預防、降低或消除可偵測的TB分枝桿菌感染;降低、消除及/或延緩繼發性結核病病灶之形成;降低、消除及/或延緩TB分枝桿菌傳播至淋巴結或其他器官或身體系統;延長受感染個體之存活期;改善TB感染或症狀,足以改良化學治療劑或其他TB藥物根除或治療感染之功效;改善個體中感染之至少一種症狀;延緩或預防症狀之發作及/或嚴重度及/或由感染引起之下游後遺症,降低由感染引起之器官或生理系統損害,改良免疫反應,包括針對TB生物體(分支桿菌)之長期記憶免疫反應,及/或改良受TB感染之個體或個體群體之一般健康狀況。咸信本發明之基於酵母之TB免疫療法組合物適用於與TB化學療法協同作用且藉此縮短活動性TB疾病或潛在結核病感染之治療。
本發明人在研發針對TB之疫苗方法之問題領域中研發創新的溶液,其包括疫苗(免疫療法)平台(亦即基於酵母之免疫療法)之使用,其特異性靶向與針對TB之免疫性相關的T細胞路徑,與具有更大的臨床效用潛力之新穎目標抗原(如下文描述)之選擇組合,及用於基於酵母之免疫治療劑中之表現的此等抗原之設計。本文中所描述之實驗亦描述TB之動物模型中疫苗之臨床前測試,及結核分枝桿菌之新出現的常毒性多藥物抗性(MDR)病毒株中疫苗之評估。本發明之基於酵母之TB免疫治療劑具有額外益處,其可大規模快速生產,具有極佳穩定性、其他免疫療法(諸如基於病毒載體之免疫療法及一些輔助子單元療法)所不具有的特徵。
本發明之基於酵母之TB特異性免疫治療組合物在不同類型之免疫療法中為獨特的,在於此等組合物引起針對目標TB之先天性免疫反應以及適應性免疫反應。基於酵母之免疫療法引起CD4+依賴性
Th17及Th1 T細胞反應,以及抗原特異性CD8+ T細胞反應。如上文所論述,咸信所有此等類型之細胞免疫反應之產生對TB之長期控制為重要的。此外,基於酵母之免疫療法降低與IL-6之產生相關的路徑中調節T細胞(Treg)之數目或活性,IL-6在TGFβ(小鼠)或IL1β(人類)存在下以Treg為代價驅動Th17細胞形成。Th17細胞產生之附加益處為此等細胞分泌若干種增加CD8+ T細胞之耐久性的細胞激素(包括IL-21),及其他引起巨噬細胞/嗜中性白血球介導之細胞外病原體之清除的細胞激素。基於酵母之免疫療法亦引起抗原呈現細胞之IL-12產生,且此有助於Th1細胞亞型,最終引起較好的CTL反應,其對諸如TB之細胞內病原體之消除為重要的。因此,由基於酵母之免疫療法引起之免疫反應之廣度代表理想平台,可藉由其解決提供暴露後(及曝光前)疫苗之挑戰。
此外,本發明之組合物靶向之特定TB抗原與由多種先前技術疫苗使用之抗原不同,且咸信與先前描述之疫苗靶向之抗原相比具有更大的臨床功效潛力(更詳細地論述於下文中)。舉例而言,儘管上述疫苗中所使用之免疫顯性抗原可用於本發明之基於酵母之免疫治療劑中,但較佳抗原並非免疫顯性抗原,而實情為由芽孢桿菌在應力條件(例如壞死、宿主氧化氮產生等)下產生之抗原。此等抗原包括稱為「潛伏」抗原之抗原。用於本發明之基於酵母之免疫治療劑中之較佳抗原包括與原發性肺肉芽腫中桿菌產生蛋白質以達成聚集鐵之目的之特定作用相關的TB抗原,以及其他在低劑量氧化氮及低氧條件(模擬分枝桿菌在潛伏感染階段期間遇到的條件)下存在或呈現之TB抗原,其可包括(但不限於)與NAD(P)H還原酶活性、巨噬細胞中之三酸甘油酯合成酶聚集、細菌鐵蛋白/鐵捕捉及toll樣受體促效劑相關之抗原。藉由靶向此類抗原,不受理論約束,本發明人咸信代替主要靶向原發性病灶之破壞或減少,本發明之基於酵母之免疫治療劑適用於:(i)降
低、改善及/或延緩繼發性結核病病灶之形成或嚴重度,(ii)降低、改善及/或延緩結核分枝桿菌傳播至淋巴結及其他器官,(iii)延長受感染個體之存活欺,(iv)提供持久的針對結核分枝桿菌感染之保護性免疫性,及(v)增強用於治療感染之其他藥物之功效。實際上,本發明之免疫療法之重要目標為改善或延緩感染之發展及對組織及器官之損害,以足夠長地延長存活期以使抗菌化學治療劑能夠控制感染。
基於酵母之免疫治療組合物係以生物學或醫藥學上可接受之組合物形式投與。因此,並非使用酵母作為抗原產生系統,接著純化來自酵母之抗原(例如以形成子單元,或重組蛋白質疫苗),如本文所描述之全部酵母媒介物必須適用於且經調配用於投與患者。因此,本發明之基於酵母之免疫治療組合物含有可易於偵測之酵母DNA且含有實質上超過5%酵母蛋白質;通常,本發明之基於酵母之免疫治療劑含有超過70%、超過80%或通常超過90%酵母蛋白質,以酵母細胞中全部蛋白質之百分比計。
投與患者基於酵母之免疫治療組合物以使患者免疫,從而達到治療及/或預防目的。在本發明之一個實施例中,基於酵母之組合物經調配以用於在醫藥學上可接受之賦形劑或調配物中投藥。在一個態樣中,組合物應經調配以適用於投與人類個體(例如生產條件應適用於人類,且任何用於完成組合物及/或製備用於投藥之免疫治療劑之劑量的賦形劑或調配物應適用於人類)。在本發明之一個態樣中,基於酵母之免疫治療組合物經調配以用於藉由患者或個體之注射投藥,諸如藉由非經腸途徑(例如藉由皮下、腹膜內、肌肉內或皮內注射,或另一種適合的非經腸途徑)。在一個實施例中,將基於酵母之免疫治療組合物凍乾以用於儲存、稍後在適合的可注射稀釋劑中調配。
在一個實施例中,酵母表現抗原(例如可藉由西方墨點法偵測),且預期抗原不聚集且未經設計以在酵母中聚集。因此,抗原不在酵母
中形成包涵體,及/或不在酵母中形成極大型粒子(VLP)或其他大型抗原粒子。在另一實施例中,抗原係以酵母中之可溶蛋白質形式產生,及/或不自酵母分泌或不實質上或主要自酵母分泌。在本文中所描述之本發明之所有實施例中,基於酵母之免疫治療劑應易於由免疫系統之樹突狀細胞吞噬,且酵母及抗原易於由此類樹突狀細胞處理,以引起針對引起結核病之生物體(例如結核分枝桿菌)之有效免疫反應。
本發明之一個實施例係關於基於酵母之免疫療法組合物,其可用於預防及/或治療TB感染及/或緩解至少一種由TB感染引起之症狀或後遺症。根據本發明,「TB感染」係指個體受到生物體之一或多種病毒株感染,該一或多種病毒株引起結核病,且最通常受結核分支桿菌之一或多種病毒株感染。該組合物包含:(a)酵母媒介物;及(b)一或多種抗原,其包含TB蛋白質及/或其免疫原性結構域。根據本發明,「TB蛋白質」為來自生物體的蛋白質,其引起結核病,且最通常為來自結核分支桿菌生物體之蛋白質(亦即由此類生物體表現、由此類生物體產生或形成此類生物體之一部分的蛋白質,使得靶向蛋白質有效靶向生物體)。「TB抗原」為包含TB蛋白質或TB蛋白質之至少一個免疫原性結構域(下文中定義)之抗原(下文中定義)。與酵母媒介物結合,TB蛋白質由酵母媒介物最典型地表現為重組蛋白質(例如由完整酵母或酵母球形質體,其可視情況進一步被處理成酵母胞質體、酵母殘骸或酵母膜提取物或其溶離份),但在本發明之一個實施例中,一或多種此類TB蛋白質裝載至酵母媒介物或以其他方式與本文所描述之酵母媒介物複合、連接至本文所描述之酵母媒介物、與本文所描述之酵母媒介物混合或與本文所描述之酵母媒介物一起投與以形成本發明之組合物。根據本發明,對「異源」蛋白質或「異源」抗原(包括異源融合蛋白,與本發明之酵母媒介物結合)之參考意謂蛋白質或抗
原並非由酵母天然表現之蛋白質或抗原,但包括異源抗原或異源蛋白質之融合蛋白亦可包括亦由酵母天然表現之酵母序列或蛋白質或其部分(例如本文所描述之α因子前原序列)。
本發明之一個實施例係關於經設計以用於本發明之基於酵母之免疫療法組合物中之表現及使用的TB抗原。此類TB抗原包括融合蛋白(其包含至少一種TB蛋白質或其免疫原性結構域)與N端及/或C端肽(如下文描述)之融合物。編碼此類蛋白質之融合蛋白及/或重組核酸分子亦可用於非基於酵母之免疫治療組合物中、與非基於酵母之免疫治療組合物組合或或產生非基於酵母之免疫治療組合物,該非基於酵母之免疫治療組合物可包括(但不限於)DNA疫苗、蛋白質次單位疫苗、重組基於病毒之免疫治療組合物、殺死或不活化病原體疫苗及/或樹突狀細胞疫苗。在另一實施例中,此類融合蛋白或TB抗原可用於TB之診斷分析法及/或產生針對TB之抗體。本文中描述例示性TB融合蛋白,其提供TB抗原之所選擇部分,包括例如鐵聚集抗原,包括(但不限於)Rv1909、Rv2359及Rv2711,及/或此等抗原中之任一種、兩種或所有三種之配置;及亦包括例如低氧彙集抗原,包括(但不限於)Rv1738、Rv2032、Rv3130及Rv3841,及/或此等抗原中之任一種、兩種、三種、四種或更多種之配置;及包括例如作為TLR促效劑之TB抗原,包括(但不限於)Rv1411c。本文中亦描述其他例示性TB融合蛋白,其提供不同類型之TB抗原之所選擇部分,包括(但不限於)包含鐵聚集抗原、TLR促效劑TB抗原及低氧彙集抗原之融合蛋白。本文中亦描述包含免疫顯性TB抗原之抗原,包括(但不限於)Ag85A。
TB抗原及構築體. 本發明之一個實施例係關於新穎的TB抗原及融合蛋白以及編碼此等抗原及蛋白質之重組核酸分子。本文中描述不同TB抗原,其係用於基於酵母之免疫治療組合物或其他組合物(例如其他免疫治療或診斷組合物),其提供來自一或多種蛋白質之一種、
兩種或多種(三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或更多種)抗原,其可以獨立抗原形式提供或含於同一個融合蛋白內且由同一個重組核酸構築體(重組核酸分子)編碼。本發明之組合物中所使用之抗原包括用於使動物免疫(預防性或治療性)的至少一種TB蛋白質或其免疫原性結構域。組合物可包括一種、兩種、三種、四種、數種、若干或複數種TB抗原,包括一種、兩種、三種、四種或更多種TB蛋白質之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個免疫原性結構域。在一些實施例中,抗原為融合蛋白。在本發明之一個態樣中,融合蛋白可包括兩種或兩種以上蛋白質。在一個態樣中,融合蛋白可包括一或多種蛋白質之兩個或兩個以上免疫原性結構域及/或兩個或兩個以上抗原決定基。含有此類抗原之免疫治療組合物可在大量患者中提供抗原特異性免疫接種。
本發明描述新穎的酵母免疫治療組合物,其含有單獨的或呈獨特組合形式之特定結核分枝桿菌抗原,該等抗原可包括(但不限於)Rv0125、Rv1196、Rv1411(Rv1411c)、Rv1738、Rv1813、Rv1909(Rv1909c)、Rv2032、Rv2359、Rv2608、Rv2660、Rv2711、Rv3130、Rv3619、Rv3620、Rv3841、Ag85A、Ag85B、TB10.4及ESAT-6(早期分泌之抗原目標6)。在本發明之一個實施例中,用於TB之預防或治療的基於酵母之免疫治療組合物包括一或多種單獨提供或與其他TB抗原組合之鐵聚集抗原,其呈融合蛋白及/或由酵母表現之個別抗原形式以形成新穎TB疫苗。在一個態樣中,鐵聚集抗原包括(但不限於)Rv1909、Rv2359及/或Rv2711,其可單獨或以此等抗原中之任何兩種或所有三種之組合形式產生,及/或其可在融合蛋白中與其他TB抗原(諸如本文中所描述之低氧彙集抗原中之任一或多者及/或本文中所描述之TLR促效劑抗原)組合。在本發明之一個實施例中,用於TB之預防或治療的基於酵母之免疫治療組合物包括一或多種低
氧彙集抗原,其呈融合蛋白及/或由酵母表現之個別抗原形式以形成新穎的TB疫苗。在一個態樣中,低氧彙集抗原包括(但不限於)Rv1738、Rv2032、Rv3130及/或Rv3841,其可單獨或以此等抗原中之任何兩種、三種或所有四種之組合形式產生,及/或其可在融合蛋白中與其他TB抗原(諸如本文中所描述之鐵聚集抗原中之任一或多者及/或本文中所描述之TLR促效劑抗原)組合。在一個實施例中,用於TB之預防或治療的基於酵母之免疫治療組合物包括一或多種TB抗原,其為toll樣受體(TLR)促效劑,呈融合蛋白及/或由酵母表現之個別抗原形式以形成新穎的TB疫苗。在一個態樣中,TLR促效劑抗原包括(但不限於)Rv1411c,其可單獨或與一或多種其他TB抗原(諸如本文中所描述之低氧彙集抗原中之任一或多者及/或本文中所描述之鐵聚集抗原中之任一或多者)組合產生。根據本發明,除本文中所描述之低氧彙集抗原、鐵聚集抗原及/或TLR促效劑抗原以外,基於酵母之免疫療法組合物中可使用之其他TB抗原包括(但不限於)此項技術中已知的抗原,如:Ag85A、Ag85B、TB10.4、Rv1196、Rv0125、ESAT-6、Rv2660、Rv1813、Rv2608、Rv3619及Rv3620。
在本發明之一個態樣中,用於本發明之基於酵母之組合物中之TB抗原包括(以單獨抗原或此等抗原之任何組合之融合物形式)Rv1909c、Rv2359、Rv2711、Rv1738、Rv2032、Rv3130、Rv3841、Rv1411c、Ag85A、Ag85B、ESAT6及/或TB10.4。在本發明之一個態樣中,抗原為全長個別抗原。在一個態樣中,抗原為抗原之不同結構域之融合物,諸如彼此融合之抗原之保存性免疫原性區域。本發明涵蓋之融合蛋白之實例包括(但不限於)Ag85-ESAT6-TB10.4融合物、Rv2359-Rv2711-Rv1909c融合物、Rv1738-Rv2032-Rv3130-Rv3841融合物、Rv2032-Rv3841融合物、Rv2032-Rv1411c-Rv2359融合物或Rv2032-Rv1411c-Rv2711融合物。融合蛋白具有更易於在基於
酵母之免疫療法組合物中製造及更易於以單一疫苗形式投與之益處。單一抗原構築體可具有以下益處:天然抗原序列有時在酵母中以較高含量積聚及/或由免疫系統更有效地處理。通常,對於用於基於酵母之免疫治療組合物中,必須使用多種抗原構築體、融合蛋白內抗原之裝置(當使用融合蛋白時)、啟動子、培養基及轉錄誘導方法最佳化酵母內之生長率及抗原表現。此外,使用活體外、離體及/或活體內進行之免疫測試來鑑別大部分有希望的候選物。
作為本發明之一個實施例,重組核酸分子及由其編碼之蛋白質(包括融合蛋白)可用於基於酵母之免疫療法組合物中,或用於TB抗原之任何其他適合的目的,包括活體外分析法、用於產生抗體或用於另一種免疫療法組合物中,包括另一種疫苗,其並非基於本文中所描述之基於酵母之免疫療法。蛋白質之酵母表現為一個較佳實施例,但可使用其他表現系統產生蛋白質以用於除基於酵母之免疫療法組合物以外的應用。
根據本發明,術語「抗原」在本文中之一般用途係指蛋白質(例如肽、不完全蛋白質、全長蛋白質)之任何部分,其中該蛋白質為天然存在或經合成方式衍生,係指細胞組合物(全細胞、細胞裂解物或經破壞之細胞)、生物體(整個生物體、裂解物或經破壞之細胞)或碳水化合物或其他分子或其部分。抗原可引發抗免疫系統之要素(例如T細胞,抗體)所遇到之相同或相似抗原的抗原特異性免疫反應(例如體液及/或細胞介導免疫反應)。
抗原可如單個抗原決定基,單個免疫原性結構域一樣小或更大,且可包括多個抗原決定基或免疫原性結構域。同樣,抗原之大小可如約8-12個胺基酸(亦即肽)一般小及如全長蛋白質、多聚體、融合蛋白、嵌合蛋白質、全細胞、完整微生物或其任何部分(例如微生物之全細胞或提取物之溶解物)一般大。此外,抗原可包括可裝載至酵
母媒介物劑或本發明之組合物中之碳水化合物。應瞭解在一些實施例中(例如當抗原藉由酵母媒介物由重組核酸分子表現時),抗原為蛋白質、融合蛋白、嵌合蛋白質或其片段,而非整個細胞或微生物。
當抗原表現於酵母中時,抗原具有能夠以重組方式表現於酵母中之最小尺寸,且長度典型地為至少或超過25個胺基酸,或長度為至少或超過26個、至少或超過27個、至少或超過28個、至少或超過29個、至少或超過30個、至少或超過31個、至少或超過32個、至少或超過33個、至少或超過34個、至少或超過35個、至少或超過36個、至少或超過37個、至少或超過38個、至少或超過39個、至少或超過40個、至少或超過41個、至少或超過42個、至少或超過43個、至少或超過44個、至少或超過45個、至少或超過46個、至少或超過47個、至少或超過48個、至少或超過49個或至少或超過50個胺基酸,或長度為至少25-50個胺基酸、長度為至少30-50個胺基酸或長度為至少35-50個胺基酸,或長度為至少40-50個胺基酸,或長度為至少45-50個胺基酸。可表現較小的蛋白質,且可表現顯著較大的蛋白質(例如長度為數百個胺基酸或甚至長度為數千個胺基酸)。在一個態樣中,可表現全長蛋白質或其結構或功能結構域或其免疫原性結構域(缺乏一或多個來自N端及/或C端之胺基酸(例如缺乏約1個至約20個來自N端及/或C端之胺基酸))。融合蛋白及嵌合蛋白質亦為可在本發明中表現之抗原。「目標抗原」為藉由本發明之免疫治療組合物特異性靶向之抗原(亦即抗此抗原需要引發免疫反應)。「TB抗原」為由一或多種TB蛋白質衍生、設計或產生使得靶向抗原亦靶向引起結核病之生物體(例如結核分支桿菌)的抗原。
當涉及刺激免疫反應時,術語「免疫原」為術語「抗原」之子集,且因此在一些情況下可與術語「抗原」互換使用。如本文所用,免疫原描述引發體液及/或細胞介導免疫反應之抗原(亦即為免疫原
性),以使得向增加抗藉由個體之免疫系統所遇到之相同或相似抗原的抗原特異性免疫反應之個體投與該免疫原。在一個實施例中,免疫原引起細胞介導之免疫反應,包括CD4+ T細胞反應(例如Th1、Th2及/或Th17)及/或CD8+ T細胞反應(例如CTL反應),及/或降低Treg(調節性T細胞)之數目或出現頻率。
既定抗原之「免疫原域」可為含有至少一種當投與至動物時充當免疫原之抗原決定基之抗原的任何部分、片段或抗原決定基(例如肽片段或次單位或抗體抗原決定基或其他構形抗原決定基)。因此,免疫原域大於單個胺基酸且至少為足以含有至少一個可充當免疫原之抗原決定基之大小。舉例而言,單個蛋白質可含有多個不同免疫原域。免疫原域不受蛋白質內直鏈序列限制;舉例而言,在體液免疫反應之情況下,免疫原域可含有直鏈抗原決定基及/或構形抗原決定基。
既定蛋白質之「功能性結構域」為蛋白質之一部分或功能單元,其包括直接或間接負責與蛋白質相關、屬於蛋白質或由蛋白質進行之至少一種生物或化學功能的序列或結構。舉例而言,功能性結構域可包括酵素活性之活性位點、配體結合位點、受體結合位點、分子或部分(諸如鈣)之結合位點、磷酸化位點或轉活化結構域。
既定蛋白質之「結構性結構域」為蛋白質之一部分或蛋白質之整體結構中之元素,其具有可鑑別的結構(例如其可為屬於及表示蛋白質類型或家族一個之若干種蛋白質的主要或第三結構)、本身穩定及/或可獨立於蛋白質之其餘部分摺疊。結構性結構域通常與其所屬之蛋白質之生物功能相關或主要表徵該生物功能。
本文將抗原決定基定義為當在免疫系統之適合的共刺激信號及/或活性細胞之情形下提供至免疫系統時,足以引起免疫反應之既定抗原內之單個免疫原性位點。換言之,抗原決定基為藉由免疫系統之組
分識別之抗原的一部分且亦可為稱為抗原決定子。熟習此項技術者應認識到T細胞抗原決定基不同於B細胞或抗體抗原決定基之大小及組成,及經由I類MHC路徑呈現之抗原決定基不同於經由II類MHC路徑呈現之抗原決定基之大小及結構屬性。舉例而言,藉由I類MHC分子呈現之T細胞抗原決定基長度典型地在8個與11個胺基酸之間,而藉由II類MHC分子呈現之抗原決定基之長度限制較少且可為8個胺基酸至25個胺基酸或更長。此外,T細胞抗原決定基已預測視藉由抗原決定基結合之特定MHC分子而定之結構特徵。抗原決定基可為直鏈序列抗原決定基或構形抗原決定基(保存性結合區)。大部分抗體識別構形抗原決定基。
在本文中所描述之用於基於酵母之免疫療法組合物之TB抗原中之任一者中,包括融合蛋白中之任一者,可應用以下額外實施例。首先,視情況選用N端表現序列及/或C端標籤,且若使用,則可選自下文描述之若干不同序列以改良表現、穩定性及/或實現蛋白質之鑑別及/或純化。在一個態樣中,完全忽略N端或C端中之一或兩者。此外,此項技術中已知適用於酵母的多種不同啟動子且涵蓋用於表現本發明之TB抗原。此外,可出於多種原因在融合蛋白之各部分之間引入短的介入連接子序列(例如1、2、3、4或5個或更多個胺基酸肽),包括用於引入限制酶位點以促進選殖及/或用於構築體之後續操作。最終,如本文中其他地方詳細論述,本文中所描述之序列為例示性的,且可如本文中其他地方詳細描述經修飾以取代、添加或刪除序列,以便適應來自特定TB菌株之蛋白質之偏好,或較佳T細胞抗原決定基之共同序列及包涵體,包括顯性及/或次顯性T細胞抗原決定基。
如上文所論述,視情況地,用作本發明之基於酵母之免疫治療組合物之組分的蛋白質(包括融合蛋白)可使用構築體產生,該等構築體尤其適用於改良或增強酵母中重組抗原之表現或表現之穩定性。典
型地,所需抗原蛋白質或肽在其胺基封端(N端)末端與以下融合:(a)使酵母媒介物中之融合蛋白穩定或防止經表現之融合蛋白之轉譯後修飾的特定合成肽(此類肽詳細描述於例如2004年8月12日公開之美國專利公開案第2004-0156858 A1號中,其以全文引用之方式併入本文中);(b)內源酵母蛋白質之至少一部分,包括(但不限於)α因子,其中融合搭配物提供酵母中蛋白質之改良之穩定性及/或防止蛋白質由酵母細胞轉譯後修飾(此類蛋白質亦詳細描述於例如美國專利公開案第2004-0156858 A1號中,見上文);及/或(c)酵母蛋白質之至少一部分,其引起融合蛋白在酵母之表面上表現(例如Aga蛋白質,更詳細地描述於本文中)。可增強抗原在酵母細胞內表現之穩定性及/或防止蛋白質在酵母內轉譯後修飾的例示性合成序列包括序列M-A-D-E-A-P(SEQ ID NO:1)。除表現產物之增強之穩定性以外,此等融合搭配物似乎不會不利地影響針對構築體中免疫抗原之免疫反應,意謂融合蛋白中N端肽之存在不與TB抗原就針對目標TB生物體之免疫反應之誘發進行競爭。此外,合成融合肽可經設計以提供可由諸如抗體之選擇劑識別之抗原決定基。在一個實施例中,TB抗原在N端連接至酵母蛋白質,諸如α因子前原序列(亦稱為α因子信號前導子序列,其胺基酸序列在本文中由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3例示)。酵母α因子前原序列之其他序列此項技術中已知且涵蓋用於本發明中。
此外,本發明視情況包括使用與抗原編碼構築體之C端融合,尤其用於選擇及識別蛋白質之肽。該等肽包括(但不限於)任何合成或天然肽,諸如肽標籤(例如六組胺酸)或任何其他短抗原決定基標籤。連接至本發明之抗原之C端的肽可在添加或不添加本文中論述之N端肽的情況下使用。
用於設計本文中所描述之融合蛋白的TB序列係基於特定TB蛋白質之分離物。然而,在本發明之一個實施例中,將相應序列或甚至來
自任何其他TB菌株或分離物之在相應序列中產生之單一或小型胺基酸取代、插入或缺失添加至或取代至本文中所描述之TB抗原中任何基於或來源於一種特定菌株或分離物之部分中。在一個實施例中,TB抗原可由用來自一或多種不同TB菌株/分離物之相應序列取代本文中所描述之TB抗原之全部序列來產生。添加至一個TB菌株中或用來自一種TB菌株之序列取代另一個例如允許定製免疫治療組合物,例如以靶向在特定地區或國家最流行的TB序列。類似地,在本發明之一個實施例中,亦使用來源於既定TB菌株、由既定TB菌株測定或公開關於既定TB菌株之共同序列的全部或之一部分在既定TB抗原之序列中產生變化,以更接近或精確地對應於共同序列。根據本發明且如在此項技術中通常理解,「共同序列」典型地為基於在多個序列比對之後既定序列之特定位置處之最常見核苷酸或胺基酸的序列。
作為上述類型之修飾之特定實例,TB抗原可經修飾以改變來自一種分離物之既定序列中之T細胞抗原決定基以更接近或精確地對應於來自不同分離物之T細胞抗原決定基,或更接近或精確地對應於T細胞抗原決定基之共同序列。此類T細胞抗原決定基可包括顯性抗原決定基及/或次顯性抗原決定基。橫跨來自不同菌株之例示性序列的主要TB蛋白質之比對可使用公開可得的軟體容易地產生,該軟體將告知例如共同序列之產生。此外,已公開多種TB蛋白質之共同序列。
根據本發明之任何實施例,如本文所描述或如公開可得之序列中以其他方式已知或描述,對「全長」蛋白質(或全長功能性結構域、全長結構性結構域或全長免疫性結構域)之參考包括蛋白質之全長胺基酸序列或功能性結構域、結構性結構域或免疫性結構域。「接近全長「之蛋白質或域(亦為蛋白質之同系物類型)藉由自此類全長蛋白質或全長域之N端及/或C端添加或缺失或省略1、2、3、4、5、6、
7、8、9或10個胺基酸在全長蛋白質或域上有所不同。通常對蛋白質或結構域之參考可包括全長及接近全長之蛋白質以及其其他同系物。舉例而言且出於明晰之目的,與原生TB蛋白質相比,本文中所描述之TB抗原之多個胺基酸序列為「幾乎全長」TB蛋白質,因為位置1處之甲硫胺酸不包括於胺基酸序列中(亦即TB蛋白質序列係關於原生蛋白質自位置2參考),因為N端及C端序列典型地連接至TB蛋白質以產生融合蛋白以用於酵母中之表現,且因此通常忽略原生蛋白質之位置1處的甲硫胺酸以促進融合蛋白構築。
在一個態樣中,TB抗原具有包含全長或幾乎全長TB蛋白質之直鏈序列或其功能性、結構性或免疫原性結構域之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%由其組成的胺基酸序列。在一個態樣中,TB抗原包含與全長或幾乎全長TB蛋白質或其功能性、結構性或免疫原性結構域至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列或由其組成。
在本發明之一個實施例中,用於本發明之組合物或方法中之TB抗原為包含TB抗原之融合蛋白,其中TB抗原包含一或多種稱為「鐵聚集抗原」之TB抗原或其至少一個功能性、結構性或免疫原性結構域或由其組成。適用於本發明之TB鐵聚集抗原包括:Rv2359、Rv2711及Rv1909。適用於本發明之包含TB鐵聚集抗原之基於酵母之免疫治療組合物之一個實例描述於本文中。在此實施例中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv2359蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為具有SEQ ID NO:4之胺基酸序列的單一多肽。如上文所論述,含有TB抗原且適用於本發明之融合蛋白可使用如本文所描述之N端及/或C端序列中之任一種
構築,及/或可在融合蛋白中蛋白質或結構域之間引入胺基酸連接子。在由SEQ ID NO:4表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:4之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:4之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:6表示。SEQ ID NO:6具有以下自N端至C端在訊框中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:6之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:6之位置7-8);3)SEQ ID NO:4之Rv2359抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:6之位置9-137);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:6之位置138-143)。由SEQ ID NO:6表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:5之核酸序列之載體中。表現SEQ ID NO:6之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱為GI-19001。
作為適用於本發明之包含TB鐵聚集抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv2711蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為具有SEQ ID NO:7之胺基酸序列的單一多肽。在由SEQ ID NO:7表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:7之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:7之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:9表示。SEQ ID NO:9具有以下自N端至C端在訊框中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺
基酸序列(SEQ ID NO:9之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:9之位置7-8);3)SEQ ID NO:7之Rv2711抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:9之位置9-237);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:9之位置238-243)。由SEQ ID NO:9表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:8之核酸序列之載體中。表現SEQ ID NO:9之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19002。
作為適用於本發明之包含TB鐵聚集抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv1909c蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為具有SEQ ID NO:10之胺基酸序列的單一多肽。在由SEQ ID NO:10表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:10之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:10之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:12表示。SEQ ID NO:12具有以下在自N端至C端之框架中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:12之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:12之位置7-8);3)SEQ ID NO:10之Rv1909c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:12之位置9-155);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:12之位置156-161)。由SEQ ID NO:12表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:11之核酸序列之載體中。表現SEQ ID NO:12之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19003。
作為適用於本發明之包含TB鐵聚集抗原之基於酵母之免疫治療
組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含三種不同鐵聚集TB抗原(融合以形成單一融合蛋白)之融合蛋白。此蛋白質中之TB抗原為包含來自Rv2359之TB抗原、來自Rv2711之TB抗原及來自Rv1909c之TB抗原的單一多肽,具有SEQ ID NO:13之胺基酸序列。在由SEQ ID NO:13表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:13之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:13之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:15表示。SEQ ID NO:15具有以下在自N端至C端之框架中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:15之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:15之位置7-8);3)SEQ ID NO:4之Rv2359抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:15之位置9-137);4)SEQ ID NO:7之Rv2711抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:15之位置138-366);5)SEQ ID NO:10之Rv1909c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:15之位置367-513);及6)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:15之位置514-519)。由SEQ ID NO:15表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:14之核酸序列之載體中。由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15表示之胺基酸序列中TB抗原之組合在本文中亦可稱為「3-鐵融合物」。表現SEQ ID NO:15之本發明之基於酵母之免疫治療組合物在本文中可稱為GI-19004或「3-鐵Tarm」或「Tarm3-鐵」。
作為適用於本發明之包含TB之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含來自TB ESAT-6蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原
為具有SEQ ID NO:16之胺基酸序列的單一多肽。在由SEQ ID NO:16表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:16之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:16之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:18表示。SEQ ID NO:18具有以下自N端至C端在訊框中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:18之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:18之位置7-8);3)SEQ ID NO:16之-6抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:18之位置9-102);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:18之位置103-108)。由SEQ ID NO:18表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:17之核酸序列之載體中。表現SEQ ID NO:18之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19005。
在本發明之一個實施例中,用於本發明之組合物或方法中之TB抗原為包含TB抗原之融合蛋白,其中TB抗原包含一或多種稱為「低氧彙集抗原」之TB抗原或其至少一個功能性、結構性或免疫原性結構域或由其組成。適用於本發明之TB低氧彙集抗原包括(但不限於):Rv1738、Rv2032、Rv3130及Rv3841。
適用於本發明之包含TB低氧彙集抗原之基於酵母之免疫治療組合物之一個實例描述於本文中。在此實施例中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1控制下經工程改造以表現包含來自Rv1738蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為具有SEQ ID NO:19之胺基酸序列的單一多肽。在由SEQ ID NO:19表示之TB抗原之一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID
NO:19之N端或SEQ ID NO:19之位置2-94。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:19之C端或SEQ ID NO:19之位置2-94。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:21表示。SEQ ID NO:21具有以下在自N端至C端之框架中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:21之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:21之位置7-8);3)SEQ ID NO:19之位置2-94之Rv1738抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:21之位置9-101);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:21之位置102-107)。由SEQ ID NO:21表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:20之核酸序列之載體中。
作為適用於本發明之包含TB低氧彙集抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含TB Rv2032蛋白質之抗原的融合蛋白。TB Rv2032蛋白質為假定的NAD(P)H硝基還原酶。在一個態樣中,此抗原由突變不活化以消除FMN結合。在一個態樣中,不活化突變為全長TB Rv2032胺基酸序列在位置14的單一胺基酸取代,其用非丙胺酸胺基酸取代原生蛋白質中之丙胺酸。在一個態樣中。非丙胺酸胺基酸殘基為精胺酸(亦即A14R突變)。基於Rv2032之TB抗原為具有SEQ ID NO:22之胺基酸序列的單一多肽。SEQ ID NO:22含有不活化突變,其為在原生Rv2032序列中發生之精胺酸取代丙胺酸,其位於SEQ ID NO:22之位置13。在由SEQ ID NO:22表示TB抗原之一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:22之N端或SEQ ID NO:22之位置2-331。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:22之C端或SEQ ID NO:22之位置2-331。在上
述態樣中之任一者中,短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計由酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白由SEQ ID NO:24表示。SEQ ID NO:24具有以下序列元件融合於自N端至C端之框架中:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:24之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:24之位置7-8);3)SEQ ID NO:22之位置2-331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:24之位置9-338);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:24之位置339-344)。SEQ ID NO:24含有不活化突變,其為在原生Rv2032序列中發生之精胺酸取代丙胺酸,其位於SEQ ID NO:24之位置21。由SEQ ID NO:24表示之融合蛋白係由重組核酸分子編碼,其用於插入具有SEQ ID NO:23之核酸序列之載體中。
作為適用於本發明之包含TB低氧彙集抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv3130蛋白質之抗原的融合蛋白。Rv3130為所提議的三醯基甘油合成酶(Sirakova及Dubey,2006,Microbiol.152(Pt9):2717-2725)。TB抗原為具有SEQ ID NO:25之胺基酸序列的單一多肽。在由SEQ ID NO:25表示之TB抗原之一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:25之N端或SEQ ID NO:25之位置2-463。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:25之C端或SEQ ID NO:25之位置2-463。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:27表示。SEQ ID NO:27具有以下在自N端至C端之框架中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:27之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:27之位置7-8);
3)SEQ ID NO:25之位置2-463之Rv3130抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:27之位置9-470);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:27之位置471-476)。由SEQ ID NO:27表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:26之核酸序列之載體中。
作為適用於本發明之包含TB低氧彙集抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv3841蛋白質之抗原的融合蛋白。Rv3841具有所提議的區分蛋白質空腔內部呈生物可用三價鐵礦物質形式之鐵的功能(蛋白質具有球形多子單元結構)(Biochemistry,2012,51(49)9900-9910)。在一個態樣中,此抗原由突變不活化以消除金屬結合。在一個態樣中,不活化突變為胺基酸主結構「EXXH」之缺失,該主結構為原生Rv3841蛋白質中位置55-58處的「ERNH」。TB抗原為具有SEQ ID NO:28之胺基酸序列的單一多肽。SEQ ID NO:28包括ERNH序列之四個胺基酸缺失,該序列相對於SEQ ID NO:28在位置53與54之間以其他方式出現。在由SEQ ID NO:28表示之TB抗原之一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:28之N端或SEQ ID NO:28之位置2-181。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:28之C端或SEQ ID NO:28之位置2-181。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:30表示。SEQ ID NO:30具有以下在自N端至C端之框架中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:30之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:30之位置7-8);3)SEQ ID NO:28之位置2-181之Rv3841抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:30之位置9-183);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID
NO:30之位置184-189)。SEQ ID NO:30包括ERNH序列之四個胺基酸缺失,該序列相對於SEQ ID NO:30在位置61與62之間以其他方式出現。由SEQ ID NO:30表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:29之核酸序列之載體中。
作為適用於本發明之包含TB低氧彙集抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含四種不同低氧彙集TB抗原(融合以形成單一融合蛋白)之融合蛋白。此蛋白質中之TB抗原為單一多肽,其包含來自Rv1738之TB抗原、來自Rv2032之TB抗原、來自Rv3130之TB抗原及來自Rv3841之TB抗原,具有SEQ ID NO:31之胺基酸序列。在由SEQ ID NO:31表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:31之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:31之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:33表示。SEQ ID NO:33具有在自N端至C端之框架中融合的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:33之位置7-8);3)SEQ ID NO:19之位置2-94之Rv1738抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置9-101);4)SEQ ID NO:22之位置2-331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置102-431);5)SEQ ID NO:25之位置2-463之Rv3130抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置432-893);6)SEQ ID NO:28之位置2-181之Rv3841抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置894-1068);及7)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:33之位置1069-1074)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv3841抗原(SEQ ID NO:28)中之每一者之上述去活化突
變亦包括於此融合蛋白中。由SEQ ID NO:33表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:32之核酸序列之載體中。由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33表示之胺基酸序列中TB抗原之組合在本文中亦可稱為「低氧4-基因融合物」。
作為適用於本發明之包含TB低氧彙集抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含兩種不同低氧彙集TB抗原(融合以形成單一融合蛋白)之融合蛋白。此蛋白質中之TB抗原為單一多肽,其包含來自Rv2032之TB抗原及來自Rv3841之TB抗原,具有SEQ ID NO:34之胺基酸序列。在由SEQ ID NO:34表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:34之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:34之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:36表示。SEQ ID NO:36具有以下在自N端至C端之框架中融合的序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:36之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子(SEQ ID NO:36之位置7-8);3)SEQ ID NO:22之位置2-331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:36之位置9-338);4)SEQ ID NO:28之位置2-181之Rv3841抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:36之位置339-513);及5)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:36之位置514-519)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv3841抗原(SEQ ID NO:28)中之每一者之上述去活化突變亦包括於此融合蛋白中。由SEQ ID NO:36表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:35之核酸序列之載體中。
作為適用於本發明之包含TB之基於酵母之免疫治療組合物的另
一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含來自TB Ag85a蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為具有SEQ ID NO:37之胺基酸序列的單一多肽。在由SEQ ID NO:37表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:37之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:37之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:39表示。SEQ ID NO:39具有以下自N端至C端在訊框中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:39之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:39之位置7-8);3)SEQ ID NO:37之Ag85a抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:39之位置9-345);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:39之位置346-351)。由SEQ ID NO:39表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:38之核酸序列之載體中。
在本發明之一個實施例中,用於本發明之組合物或方法中之TB抗原為包含TB抗原之融合蛋白,其中TB抗原包含一或多種稱為「Toll樣受體促效劑」或「TLR促效劑」之TB抗原或其至少一個功能性、結構性或免疫原性結構域或由其組成。適用於本發明之TB TLR促效劑抗原包括Rv1411c。在適用於本發明之TB之基於酵母之免疫治療組合物的一個實例中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含TB Rv1411c蛋白質之融合蛋白。TB抗原為具有SEQ ID NO:40之胺基酸序列的單一多肽。Rv1411c為抑制巨噬細胞中II類MHC抗原表現之膜蛋白質及TLR-2配體(Gehring等人,2004,J.Immunol.173(4):2660-2668)。因此,對於用於本發明中,在一個態樣中,需要消除蛋白質之促效劑活性,因為最終需要針
對TB之免疫反應。將消除結合之潛在突變位點包括相對於原生TB蛋白質之位置91處的纈胺酸,其可例如突變成為色胺酸或其他非纈胺酸殘基以阻斷TLR2促效劑脂質之結合袋(Drage及Tsai,2010,Nature Structural Mol.Biol.17(9):1088-1095)。原生蛋白質中之其他纈胺酸殘基亦可經突變以阻斷TLR活性(例如在相對於原生蛋白質或SEQ ID NO:40之位置194及217處),但一個纈胺酸殘基之突變足以不活化蛋白質。SEQ ID NO:40之胺基酸序列含有對應於原生蛋白質中位置91(V91W)的纈胺酸至色胺酸之不活化突變(亦在相對於SEQ ID NO:40之位置91處發生)。在由SEQ ID NO:40表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:40之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:40之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:42表示。SEQ ID NO:42具有以下自N端至C端在訊框中融合之序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:42之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:42之位置7-8);3)SEQ ID NO:40之Rv1411c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:42之位置9-244);及4)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:42之位置245-250)。由SEQ ID NO:42表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:41之核酸序列之載體中。
作為適用於本發明之包含多種TB抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含一個低氧彙集TB抗原(Rv2032)、一個TLR促效劑蛋白質(Rv1411c)及一個鐵聚集抗原(Rv2359)(融合以形成單一融合蛋白)之融合蛋白,TB抗原融合蛋白具有SEQ ID NO:43之胺基酸
序列。在由SEQ ID NO:43表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:43之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:43之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:45表示。SEQ ID NO:45具有以下在自N端至C端之框架中融合的序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子(SEQ ID NO:45之位置7-8);3)SEQ ID NO:22之位置2-331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置9-338);4)SEQ ID NO:40之Rv1411c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置339-574);5)SEQ ID NO:4之Rv2359蛋白質之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置575-703);及6)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:45之位置704-709)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv1411c抗原(SEQ ID NO:40)中之每一者之上述去活化突變亦包括於此融合蛋白中。由SEQ ID NO:45表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:44之核酸序列之載體中。
作為適用於本發明之包含多種TB抗原之基於酵母之免疫治療組合物的另一實例,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性啟動子CUP1之控制下經工程改造以表現包含一個低氧彙集TB抗原(Rv2032)、一個TLR促效劑蛋白質(Rv1411c)及一個鐵聚集抗原(Rv2711)(融合以形成單一融合蛋白)之融合蛋白,TB抗原融合蛋白具有SEQ ID NO:46之胺基酸序列。在由SEQ ID NO:46表示之TB抗原的一個態樣中,選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3之N端序列連接至SEQ ID NO:46之N端。在一個態樣中,六組胺酸標籤連接至SEQ ID NO:46之C端。在上述態樣中之任一者中,將短肽連接子插入N端序列與TB抗原序列
之間及/或TB抗原序列與C端序列之間。一種經設計以用於酵母表現且在實例中描述之此類融合蛋白在本文中由SEQ ID NO:48表示。SEQ ID NO:48具有以下在自N端至C端之框架中融合的序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置1-6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:48之位置7-8);3)SEQ ID NO:22之位置2-331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置9-338);4)SEQ ID NO:40之Rv1411c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置339-574);5)SEQ ID NO:7之Rv2711蛋白質之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置575-803);及6)六組胺酸標籤(SEQ ID NO:48之位置804-809)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv1411c抗原(SEQ ID NO:40)中之每一者之上述去活化突變亦包括於此融合蛋白中。由SEQ ID NO:48表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:47之核酸序列之載體中。
促效劑抗原. 在本發明之一些態樣中,可對野生型或參考TB蛋白質中之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或十個以上胺基酸進行胺基酸插入、缺失及/或取代,限制條件為當用作本發明之酵母-TB免疫治療組合物中之抗原時,所得TB蛋白質引起針對目標或野生型或參考TB蛋白質之免疫反應,其可包括增強之免疫反應、降低之免疫反應或實質上類似的免疫反應。
舉例而言,本發明包括TB促效劑抗原(在本文中亦稱為「經改變之肽配體」(APL))之用途,其為可包括一或多個T細胞抗原決定基,且特定言之細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定基之TB抗原,該等抗原決定基已藉由不同胺基酸殘基之一或多個胺基酸殘基之取代而突變。突變之目的在於引起針對TB促效劑抗原決定基之T細胞反應,其與針對原生抗原之反應相比得到增強/擴增/改良,其可藉由改良抗原決定基針對MHC分子或在MHC表現之情形下識別抗原決定基之T細胞
受體的親合力或親和力而實現。因此,TB抗原促效劑可改良針對感染宿主之原生TB蛋白質之T細胞反應的效能或功效。
本發明亦包括上述融合蛋白中之任一者之同系物,以及作為此類融合蛋白之一部分或本文中其他地方所描述之個別TB蛋白質或其部分(包括任何功能性及/或免疫原性結構域)的同系物、變異體或突變體之用途。在一個態樣中,本發明包括融合蛋白或個別(單一)TB蛋白質或TB抗原之用途,在蛋白質之整個長度上或相對於中形成蛋白質的既定片段或其結構域(免疫原性結構域或功能性結構域(亦即具有至少一種生物活性之結構域),該融合蛋白或個別(單一)TB蛋白質或TB抗原包含與本文所述之融合蛋白或個別TB蛋白質或TB抗原中之任一者之胺基酸序列至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的胺基酸序列或由其組成,包括本文中藉由特定序列識別符參考之TB蛋白質、TB抗原及融合蛋白中之任一者(例如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:48中之任一者)。
本發明之另一態樣包括TB抗原,其包含由以下中之任一或多者表示之胺基酸序列、主要由以下中之任一或多者表示之胺基酸序列組成或由以下中之任一或多者表示之胺基酸序列組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ
ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:48。TB抗原適用於本文中所描述之本發明之任何實施例,包括本文中所描述之基於酵母之免疫療法組合物。
基於酵母之免疫療法組合物. 在本發明之各種實施例中,本發明包括至少一種「基於酵母之免疫治療組合物」(該短語可與「基於酵母之免疫療法產物」、「基於酵母之免疫療法組合物」、「基於酵母之組合物」、「基於酵母之免疫治療」、「基於酵母之疫苗」或此等短語之衍生物互換使用)之用途。「免疫治療組合物」為引發免疫反應足以在受試者中實現至少一個治療效益之組合物。如本文所用,基於酵母之免疫治療組合物係指包括酵母媒介物組分及引發免疫反應足以在個體中實現至少一種治療效益之組合物。更特定言之,基於酵母之免疫治療組合物為包括酵母媒介物組分且可引發或誘發免疫反應(諸如細胞免疫反應,包含(但不限於)T細胞介導之細胞免疫反應)之組合物。適用於本發明之基於酵母之免疫治療組合物可例如在個體中引發免疫反應使得保護個體免受TB感染及/或治療TB感染或由TB感染引起之症狀。
本發明之基於酵母之免疫療法組合物可用於「預防性」或「治療性」環境。當以預防方式提供時,當尚未偵測或出現活動性感染時,在活動性TB感染(下文中定義)之任何症狀之前提供本發明之組合物,但可包括暴露前及暴露後情形。此類組合物可在出生時或嬰兒期、兒童期早期或晚期時投與,或投與成年人,特定言之具有變成感
染TB之高風險(例如由於地理位置、病史或工作領域)的成年人,或咸信或已知已暴露於TB但尚未發展活動性感染之成年人。酵母-TB免疫療法組合物之預防性投藥用於預防後續TB感染,預防、延緩或減弱活動性TB感染或疾病、更快速或更全面地解析感染(若隨後發生活動性TB感染)及/或改善活動性TB感染之症狀(若其隨後出現)。
當以治療方式提供時,一旦暴露後個體中產生活動性感染(亦稱為TB疾病)即提供本發明之組合物。此類組合物可投與任何已鑑別為患有活動性TB感染(TB疾病)之個體(嬰兒、兒童、成年人)。當以治療方式提供時,療法之一個目標為改善、降低或消除TB感染之至少一種症狀且較佳消除感染或降低個體中之微生物負載,提供感染之長期持續緩解,及/或提供針對後續TB感染之長期免疫性。
如本文所用,「暴露前」意謂個體尚未暴露於或尚未知已暴露於引起TB之生物體(亦即未患有TB感染)。如本文所用,「暴露後」意謂個體已知至已暴露於引起TB之生物體,其最典型地藉由結核菌素皮膚測試或TB血液測試之陽性反應檢驗,兩種測試皆為此項技術中所熟知的。暴露後個體可包括患有「潛伏性感染」之個體及患有「活動性感染」或「TB疾病」之個體。患有「潛伏性感染」之個體不感覺虛弱及不具有TB疾病之症狀,但對TB感染測試為陽性(例如藉由結核菌素皮膚測試或TB血液測試)。此外,此等個體典型地具有正常胸部X射線及陰性痰液測試,且咸信不為傳染性(亦即不會將TB生物體傳播至其他人)。患有潛伏性TB感染之人員若未經治療,則具有約5%-10%的機率在其生命中之某一時間點出現活動性感染。患有「活動性感染」或「TB疾病」之個體(該等術語在本文中可互換使用)為TB感染測試為陽性(藉由結核菌素皮膚測試或TB血液測試)且TB生物體開始倍增且戰勝免疫系統之人員。此外,TB疾病可藉由陽性異常胸部X射線、陽性痰液塗片或培養物(對於TB生物體)鑑別。此類人員可具有
原因不明的體重減輕、食慾不振、盜汗(night sweats)、發熱、疲勞、發冷、持續3週或更長時間的咳嗽、咳血或胸痛。此等個體為傳染性(亦即可將感染傳播/傳遞至其他人)。
典型地,基於酵母之免疫療法組合物包括酵母媒介物及至少一種抗原,其包括一或多種TB蛋白質或其免疫原性結構域,該抗原由酵母媒介物表現、連接至酵母媒介物或與酵母媒介物混合,,其中該抗原對酵母為異源的。在一些實施例中,抗原係作為融合蛋白提供。本文中描述若干種適用於本發明之組合物及方法的TB融合蛋白。在本發明之一個態樣中,融合蛋白可包括兩種或兩種以上不同的TB蛋白質。在一個態樣中,融合蛋白可包括一或多種TB蛋白質之兩個或兩個以上免疫原性結構域,或一或多種TB蛋白質之兩個或兩個以上抗原決定基。
在本發明中使用之基於酵母之免疫療法組合物中之任一者中,本發明包括以下關於酵母媒介物之態樣。根據本發明,酵母媒介物為任何可與一或多種抗原、其免疫原性結構域或其抗原決定基結合用於本發明之治療組合物中之酵母細胞(例如完全或完整細胞)或其衍生物(參見下文),或在一個態樣中,酵母媒介物可單獨或作為佐劑使用。因此酵母媒介物可包括(但不限於)活的完整(完全)酵母微生物(亦即具有包括細胞壁之所有其組分之酵母細胞)、經殺死(死的)或不活化的完整酵母微生物或完整酵母之衍生物,其包括:酵母球形質體(亦即缺少細胞壁之酵母細胞)、酵母胞質體(亦即缺少細胞壁及細胞核之酵母細胞)、酵母殘骸(亦即缺少細胞壁、細胞核及細胞質之酵母細胞)、亞細胞酵母膜提取物或其碎片(亦稱為酵母膜粒子及預先作為亞細胞酵母粒子)、任何其他酵母粒子或酵母細胞壁製劑。
酵母原生質球狀體典型地藉由酶促消化酵母細胞壁來製得。此方法描述於例如Franzusoff等人,1991,Meth.Enzymol.194,662-674
中,其以全文引用之方式併入本文中。
酵母胞質體典型地藉由去核酵母細胞來製得。此類方法描述於例如Coon,1978,Natl.Cancer Inst.Monogr.48,45-55中,其以全文引用的方式併入本文中。
酵母殘骸典型地藉由重封透性化或溶胞細胞來製得且可(但非必需)含有至少一些該細胞之細胞器官。此方法描述於例如Franzusoff等人,1983,J.Biol.Chem.258,3608-3614及Bussey等人,1979,Biochim.Biophys.Acta 553,185-196,各文獻以引用方式全文併入本文中。
酵母膜顆粒(亞細胞酵母膜提取物或其部分)係指缺少天然核或細胞質的酵母膜。該顆粒可為任何尺寸,包括自天然酵母膜尺寸至藉由超音波處理或熟習此項技術者已知之其他膜破壞方法隨後重封而製得之微粒之尺寸範圍內之尺寸。用於生產亞細胞酵母膜提取物之方法描述於例如Franzusoff等人,1991,Meth.Enzymol.194,662-674中。當在製備酵母膜粒子之前抗原或其他蛋白質由酵母以重組方式表現時,亦可使用含有酵母膜部分之酵母膜粒子之碎片及抗原或其他相關蛋白質。抗原或其他相關蛋白質可在膜內部、膜之任一表面上或其組合中載運(亦即蛋白質可位於膜內部及外部及/或跨越酵母膜粒子之膜)。在一個實施例中,酵母膜粒子為重組酵母膜粒子,其可為包括膜表面或至少部分嵌入膜內之至少一種所需抗原或其他所關注之蛋白質的完整、經破壞或經破壞及重封之酵母膜。
酵母細胞壁製劑之實例為攜有其表面上或至少部分嵌入細胞壁內之抗原的經分離之酵母細胞壁製劑,以使得當投與動物時酵母細胞壁製劑刺激產生抗疾病標靶之所需免疫反應。
可使用任何酵母菌株製備本發明之酵母媒介物。酵母為屬於以下三個綱之一之單細胞微生物:子囊菌(Ascomycetes)、擔子菌
(Basidiomycetes)及不完全真菌(Fungi Imperfecti)。選擇用作免疫調節劑之酵母類型的一個主要考慮因素為酵母之致病性。在一個實施例中,酵母為非致病菌株,諸如釀酒酵母。選擇非致病性酵母菌株使投與酵母媒介物之個體之任何不良作用減至最小。然而,若酵母之致病性可由熟習此項技術者已知之任何方式(例如突變株)消除,則可使用致病酵母。
可用於本發明之酵母菌株之屬包含(但不限於)酵母菌屬、假絲酵母屬、隱球酵母屬、漢森酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬、裂殖酵母屬及耶氏酵母屬。在一個態樣中,酵母屬係選自酵母菌屬、假絲酵母屬、漢森酵母屬、畢赤酵母屬或裂殖酵母屬,且在一個態樣中,酵母屬係選自酵母屬、漢森酵母屬及畢赤酵母屬,且在一個態樣中,使用酵母菌屬。可用於本發明之酵母菌株之種包括(但不限於)釀酒酵母、卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、白色念珠菌(Candida albicans)、乳酒假絲酵母(Candida kefyr)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)、羅倫隱球酵母(Cryptococcus laurentii)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、漢森酵母(Hansenula anomala)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、乳酸馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus var.lactis)、甲醇酵母(Pichia pastoris)、紅酵母(Rhodotorula rubra)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。應瞭解許多此等物種包括多種亞種、菌型、亞型等,其意欲包括於前述物種中。在一個態樣中,用於本發明之酵母種包括釀酒酵母(S.cerevisiae)、白色念珠菌(C.albicans)、多形漢森酵母(H.polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)及粟酒裂殖酵母(S.pombe)。釀酒酵母由於其相對易於操作且為「普遍認為安全」或
「GRAS」用作食品添加劑(GRAS,FDA建議規則62FR18938,1997年4月17日)而為適用的。本發明之一個實施例為能夠將質體複製至尤其高之複本數的酵母菌株,諸如釀酒酵母cir菌株。釀酒酵母菌株一種此類菌株,其能夠支持表現載體,該等表現載體實現一或多種目標抗原及/或抗原融合蛋白及/或其他蛋白質以較高量表現。此外,本發明中可使用任何突變體酵母菌株,包括展現所表現靶抗原之轉譯後修飾減少(諸如擴大N-連接糖基化之酶中的突變)的彼等菌株。
本發明涵蓋產生酵母媒介物以及表現、組合及/或締合酵母媒介物與相關抗原及/或藥劑以產生基於酵母之免疫療法組合物的方法。
根據本發明,術語「酵母媒介物-抗原複合物」或「酵母-抗原複合物」通常用於描述酵母媒介物與抗原之任何關聯,且當該組合物用於引發如上文所述之免疫反應時,可與「基於酵母之免疫治療組合物」互換使用。該關聯包括:由酵母(重組酵母)表現抗原、將抗原引入酵母、抗原與酵母之實體連接及將酵母與抗原一起混合於諸如緩衝液或其他溶液或調配物中。該等類型之複合物在下文詳述。
在一個實施例中,用於製備酵母媒介物之酵母細胞使用編碼蛋白質(例如抗原)之異源核酸分子轉染,以使得藉由酵母細胞表現蛋白質。該酵母在本文中亦稱為重組酵母或重組酵母媒介物。酵母細胞接著可作為完整細胞裝載入樹突狀細胞內,或將酵母細胞殺死,或其可諸如藉由形成酵母球形質體、胞質體、殘骸或亞細胞顆粒而衍生化,繼任一者之後將該衍生物裝載入樹突狀細胞內。亦可將酵母原生質球狀體直接用重組核酸分子轉染(例如自完全酵母製得原生質球狀體且接著轉染)用以製造表現抗原之重組原生質球狀體。
通常,酵母媒介物及抗原及/或其他藥劑可與本文中所描述之任何技術關聯。在一個態樣中,酵母媒介物與抗原及/或藥劑一起裝載至細胞內。在另一態樣中,抗原及/或藥劑與酵母媒介物共價或非共
價連接。在又一態樣中,酵母媒介物以及抗原及/或藥劑藉由混合而締合。在另一態樣中及在一個實施例中,抗原及/或藥劑藉由酵母媒介物或藉由自其衍生酵母媒介物之酵母細胞或酵母球形質體重組表現。
待由本發明之酵母媒介物產生之抗原及/或其他蛋白質之數目為可由酵母媒介物合理產生之任何數目的抗原及/或其他蛋白質,且典型地在至少一種至至少約6種或6種以上範圍內,包括2種至3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或10種以上異源抗原及/或其他蛋白質或藥劑。
抗原或其他蛋白質在本發明之酵母媒介物中表現使用熟習此項技術者已知之技術實現。簡言之,編碼至少一種所需抗原或其他蛋白質之核酸分子以核酸分子與轉錄控制序列可操作性連接之方式插入表現載體中以便當轉化至宿主酵母細胞中時,能夠實現核酸分子之組成性或經調節之表現。編碼一或多種抗原及/或其他蛋白質之核酸分子可位於與一或多個表現控制序列可操作性連接之一或多個表現載體上。尤其重要的表現控制序列為控制轉錄起始的彼等序列,諸如啟動子序列及上游活化序列。任何適當酵母啟動子可用於本發明且多種該等啟動子已為熟習此項技術者所熟知。用於在釀酒酵母中表現之啟動子包括(但不限於)編碼以下酵母蛋白質之基因的啟動子:乙醇脫氫酶I(ADH1)或II(ADH2)、CUP1、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙醣異構酶(TPI)、轉譯延伸因子EF-1 α(TEF2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH;對於磷酸丙醣脫氫酶亦稱為TDH3)、半乳糖激酶(GAL1)、半乳糖-1-磷酸尿苷酸轉移酶(GAL7)、UDP-半乳糖差向異構酶(GAL10)、細胞色素c1(CYC1)、Sec7蛋白質(SEC7)及酸性磷酸酶(PHO5),包括雜合啟動子(諸如ADH2/GAPDH及CYC1/GAL10啟動子),及包括當細胞中之葡萄糖濃度為低(例如約0.1%至約0.2%)時誘
發之ADH2/GAPDH啟動子,以及CUP1啟動子及TEF2啟動子。同樣,很多上游活化序列(UAS)(亦稱為強化子)係已知的。用於在釀酒酵母中表現之上游活化序列包括(但不限於)編碼以下蛋白質之基因之UAS:PCK1,TPI,TDH3,CYC1,ADH1,ADH2,SUC2,GAL1,GAL7及GAL10,以及其他藉由GAL4基因產物活化之UAS,其中在一個態樣中使用ADH2 UAS。由於ADH2 UAS係由ADR1基因產物活化,因此當異源基因與ADH2 UAS操作性連接時,過度表現ADR1基因較佳。用於在釀酒酵母中表現之轉錄終止序列包括α因子、GAPDH及CYC1基因之終止序列。
待在甲基營養型酵母中表現基因之轉錄控制序列包括編碼乙醇氧化酶及甲酸脫氫酶之基因的轉錄控制區域。
將核酸分子轉染入本發明之酵母細胞可藉由將核酸分子投與至細胞內之任何方法達成且包括(但不限於):擴散、主動輸送、浴式超音波處理、電穿孔、微注射、脂質轉染、吸附及原生質體融合。經轉染之核酸分子可使用熟習此項技術者已知之技術整合至酵母染色體中或維持在染色體外之載體上。攜有該等核酸分子之酵母媒介物之實例詳細揭示於本文中。如上所述,酵母胞質體、酵母殘骸及酵母膜顆粒或細胞壁製劑亦可藉由用所要核酸分子轉染完整酵母微生物或酵母球形質體、於其中產生抗原且接著使用熟習此項技術者已知之技術進一步操作該等微生物或球形質體以產生含有所要抗原的胞質體、殘骸或亞細胞酵母膜提取物或其部分來重組產生。
在本發明之一個態樣中,酵母媒介物經操作以使得抗原藉由將所表現之抗原產物部分地或完全地傳遞或遷移至酵母媒介物表面上來表現或提供(細胞外表現)。達成本發明之此態樣的一種方法係利用間隔臂使一或多個抗原定位於酵母媒介物表面上。舉例而言,可使用間隔臂產生抗原或其他相關蛋白質之融合蛋白,其中蛋白質使抗原或其
他相關蛋白質靶向酵母細胞壁。舉例而言,一種可用於靶向其他蛋白質之此類蛋白質為酵母蛋白質(例如細胞壁蛋白質2(cwp2)、Aga2、Pir4或Flo1蛋白質),其使得抗原或其他蛋白質能夠靶向酵母細胞壁,使得抗原或其他蛋白質位於酵母表面上。除酵母蛋白質外的其他蛋白質可用於間隔臂;然而,對於任何間隔臂蛋白質而言,最需要具有針對靶抗原而非間隔臂蛋白質的免疫原反應。因而,若間隔臂使用其他蛋白質,則所用間隔臂蛋白質不應產生針對間隔臂蛋白質本身而使得針對靶抗原的免疫反應被壓倒的該廣泛免疫反應。熟習此項技術者應以針對間隔臂蛋白質之免疫反應比針對靶抗原之免疫反應小為目標。間隔臂可經構築以具有裂解位點(例如蛋白酶裂解位點),其使抗原視需要易於自酵母移除或處理。可使用任何已知的測定免疫反應之量值的方法(例如抗體產生、裂解分析等)且為熟習此項技術者容易地已知的。
另一種定位待在酵母表面上暴露之目標抗原或其他蛋白質的方法為使用信號序列(諸如糖基磷脂醯肌醇(GPI))以將目標錨定至酵母細胞壁。或者,定位可藉由附加使相關抗原經由遷移至內質網(ER)內靶向分泌通道之信號序列以使得抗原與結合於細胞壁之蛋白質(例如,cwp)結合而達成。
在一個態樣中,間隔臂蛋白質為酵母蛋白質。酵母蛋白質可由酵母蛋白質之約2個與約800個之間的胺基酸組成。在一個實施例中,酵母蛋白質為約10至700個胺基酸。在另一實施例中,酵母蛋白質為約40至600個胺基酸。本發明之其他實施例包括為至少250個胺基酸、至少300個胺基酸、至少350個胺基酸、至少400個胺基酸、至少450個胺基酸、至少500個胺基酸、至少550個胺基酸、至少600個胺基酸或至少650個胺基酸的酵母蛋白質。在一個實施例中,酵母蛋白質長度為至少450個胺基酸。另一個最佳化抗原表面表現(若需要)之考慮因
素為抗原及間隔臂組合是否應表現為單體或二聚體或三聚體,或甚至更多的連接在一起的單元。單體、二聚體、三聚體等之此使用允許抗原之適合的間隔或摺疊,使得抗原之某一部份(若非全部)在酵母媒介物表面上以其免疫原性更高的方式顯示。
使用酵母蛋白質可使酵母媒介物中融合蛋白之表現穩定、防止經表現之融合蛋白之轉譯後修飾及/或使融合蛋白靶向酵母中(例如待在酵母細胞表面上表現)之特定區室。對於傳遞至酵母分泌腺路徑,所使用之例示性酵母蛋白質包括(但不限於):Aga(包括(但不限於)Aga1及/或Aga2);SUC2(酵母轉化酵素);α因子信號前導子序列;CPY;用於其在細胞壁中之定位及保留的Cwp2p;用於在子代細胞形成之初始階段期間酵母細胞芽處之定位的BUD基因;Flo1p;Pir2p;及Pir4p。
可使用其他序列使蛋白質靶向酵母媒介物之其他部分、保留蛋白質及/或使蛋白質穩定,例如在細胞溶質或粒線體或內質網或細胞核中。可用於以上任一實施例之合適酵母蛋白質的實例包括(但不限於):TK、AF、SEC7;用於其在葡萄糖中可抑制表現及胞內定位的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶PCK1、磷酸甘油酸激酶PGK及磷酸丙醣異構酶TPI基因產物;熱休克蛋白SSA1、SSA3、SSA4、SSC1,其表現可誘發且其蛋白質在細胞暴露於熱處理後具有更高熱穩定性;用於輸入粒線體內的粒線體蛋白質CYC1;ACT1。
在本發明之一個實施例中,作為在酵母媒介物中重組表現抗原或其他蛋白質之替代方案,將酵母媒介物與蛋白質或肽,或與充當抗原及/或適用作本發明之免疫調節劑或生物反應調節劑之碳水化合物或其他分子裝載入細胞內。隨後可將目前細胞內含有抗原及/或其他蛋白質之酵母媒介物投與個體或裝載入諸如樹突狀細胞之載體中。肽及蛋白質可由熟習此項技術者已知之技術(諸如擴散、主動輸送、脂
質體融合、電穿孔、吞噬、冷凍-融化循環及浴式超音波處理)直接插入本發明之酵母媒介物內。可直接裝載肽、蛋白質、碳水化合物或其他分子之酵母媒介物包括完整酵母以及球形質體、殘骸或胞質體,在製造之後其可裝載抗原及其他試劑。或者,完整酵母可裝載抗原及/或試劑,且隨後可自其製備球形質體、殘骸、胞質體或亞細胞顆粒。在此實施例中,任何數目之抗原及/或其他藥劑可裝載入酵母媒介物中,至少1個、2個、3個、4個或任何全整數個至多數百或數千個抗原及/或其他藥劑,例如將藉由裝載微生物或其部分提供。
在本發明之另一實施例中,抗原及/或其他藥劑與酵母媒介物在實體上連接。抗原及/或其他藥劑與酵母媒介物之實體連接可藉由適合於本領域中之任何方法實現,包括共價及非共價締合方法,其包括(但不限於)使抗原及/或其他藥劑與酵母媒介物之外表面化學交聯,或使抗原及/或其他藥劑與酵母媒介物之外表面生物連接,諸如藉由使用抗體或其他結合搭配物。化學交聯可例如藉由包括戊二醛鍵、光親和標記、用碳化二亞胺處理、用能夠連接二硫鍵之化學物質處理及用本領域中之其他交聯化學標準物處理之方法實現。或者,化學物質可與改變酵母膜之脂質雙層或細胞壁之組成之電荷的酵母媒介物接觸,以使得酵母外表面較可能與具有特定電荷特徵之抗原及/或其他藥劑融合或結合。諸如抗體、結合肽、可溶性受體及其他配體的靶向劑亦可作為融合蛋白併入抗原中或以其他方式與抗原結合以使抗原與酵母媒介物結合。
在又一實施例中,酵母媒介物及抗原或其他蛋白質藉由更加被動的非特異性或非共價結合機制彼此結合,諸如藉由輕輕地使酵母媒介物及抗原或其他蛋白質在緩衝液或其他合適之調配物(例如混雜物)中混合在一起。
用於生產重組酵母媒介物及藉由酵母媒介物表現抗原及/或其他
蛋白質之有效條件包括可在其中培養酵母菌株之有效培養基。有效培養基一般為包含可同化碳水化合物、氮及磷酸來源以及適當鹽類、礦物質、金屬及其他養分(諸如維生素及生長因子)之水性培養基。培養基可包含複合養分或可為限定基本培養基。本發明之酵母菌株可於多種容器內培養,包括(但不限於)生物反應器、錐形依氏燒瓶(Erlenmeyer flask)、試管、微量滴定盤及皮氏培養皿(Petri plate)。培養係在適於酵母菌株之溫度、pH值及氧含量下進行。此等培養條件被一般熟習此項技術者很好地掌握(參見例如Guthrie等人(編),1991,Methods in Enzymology,第194卷,Academic Press,San Diego)。
在本發明之一些實施例中,酵母在中性pH值條件下生長,其更詳細地描述於PCT公開案第WO 2008/097863號中。如本文所用,術語「中性pH值」之一般用途係指在約pH 5.5與約pH 8之間的pH值範圍,且在一個態樣中在約pH 6與約8之間。使用中性pH值使酵母細胞生長意謂酵母細胞在培養物中之大部分或所有時間中(亦即自酵母生長開始至酵母收集)均在中性pH值中生長。在一個實施例中,酵母在保持pH值為至少5.5(亦即培養基之pH值不允許下降至低於pH 5.5)之培養基中生長。在另一態樣中,酵母在pH值保持為約6、6.5、7、7.5或8下生長。使用中性pH值培養酵母有助於若干生物作用,其為使用酵母作為媒介物進行免疫調節所需的特徵。舉例而言,在中性pH值中培養酵母允許酵母良好生長而對細胞產生時間無不良作用(例如減緩翻倍時間)。使用中性pH值可產生具有柔韌細胞壁之酵母及/或在所有收集密度(包括高細胞密度)下對細胞壁消化酶(例如葡聚糖酶)較敏感之酵母。此特點為所需的,因為與在酸性更強之條件下生長的酵母相比,具有可撓性細胞壁之酵母可誘發不同的或經改良的免疫反應,例如藉由促進吞噬酵母之抗原呈現細胞之細胞激素分泌(例如Th1型細
胞激素,包括(但不限於)IFN-γ、白細胞介素-12(IL-12)及IL-2,以及促炎性細胞激素,諸如IL-6)。此外,藉由此類培養方法實現對位於細胞壁中之抗原的更大的近接性。在另一態樣中,對一些抗原使用中性pH值允許藉由用二硫蘇糖醇(DTT)處理來釋放二硫化物結合之抗原,此在此類抗原表現酵母在較低pH值(例如pH 5)之培養基中培養時係不可能的。
在一個實施例中,酵母糖基化之量之控制係用於控制抗原之酵母(特定言之表面上)表現。酵母糖基化之量可影響表面上表現之抗原的免疫原性及抗原性,因為糖部分傾向於為大型。因此,在本發明之酵母之調節中應考慮酵母表面上糖部分之存在及其對目標抗原周圍三維空間之影響。可使用任何方法降低酵母之糖基化之量(或視需要使其增加)。舉例而言,可使用經選擇以具有低糖基化之酵母突變菌株(例如mnn1、och1及mnn9突變體),或可藉由使目標抗原上糖基化受體序列突變來消除。或者,可使用具有簡稱為糖基化模式之酵母,例如,畢赤酵母。亦可使用降低或改變糖基化之方法來處理酵母。
在本發明之一個實施例中,將酵母媒介物及抗原或其他蛋白質細胞內裝載至載體(諸如樹突狀細胞或巨噬細胞)中以形成本發明之治療組合物或疫苗。或者,可在不存在酵母媒介物之情況下將抗原或其他蛋白質裝載至樹突狀細胞中。
在一個實施例中,完整酵母(有或無異源抗原之表現)可以製備酵母細胞壁製劑、酵母膜顆粒或酵母片段(亦即,不完整)的方式磨碎或處理,且在一些實施例中將酵母片段與包括抗原的其他組合物(例如DNA疫苗、蛋白質亞單位疫苗、殺死或滅活的病原體)一起提供或投與以增強免疫反應。舉例而言,可使用酶促處理、化學處理或物理力(例如機械剪切或超音波處理)將酵母粉碎為可用作佐劑的部分。
在本發明之一個實施例中,適用於本發明之酵母媒介物包括已
經殺死或不活化之酵母媒介物。殺死或不活化酵母可藉由此項技術中已知之多種合適之方法中的任一者實現。舉例而言,熱不活化酵母為不活化酵母之標準方式,且視需要本領域之技術人員可藉由此項技術中已知之標準方法監測目標抗原之結構變化。或者,可使用其他不活化酵母之方法,諸如化學法、電法、放射法或UV法。參見,例如揭示於標準酵母培養教科書(諸如Methods of Enzymology,第194卷,Cold Spring Harbor Publishing(1990))中之方法。所使用之不活化策略中之任一者應考慮目標抗原之二級、三級或四級結構且保留該結構以使其免疫原性最佳化。
可使用熟習此項技術者已知的多種技術將酵母媒介物調配成本發明之基於酵母之免疫療法組合物或產物,包括直接投與個體或首先裝載至載體(諸如樹突狀細胞)之製劑。舉例而言,酵母媒介物可藉由凍乾來乾燥。亦可藉由將酵母壓擠成餅或錠劑(諸如對烘焙或釀造操作中所用之酵母執行)來製備包含酵母媒介物之組合物。此外,酵母媒介物可與醫藥學上可接受之賦形劑混合,諸如宿主或宿主細胞所耐受之等張緩衝液。該等賦形劑之實例包括水、生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液、漢克氏溶液(Hank's solution)及其他水性生理平衡鹽溶液。亦可使用非水媒介物,諸如非揮發性油、芝麻油、油酸乙酯或三酸甘油酯。其他適用之組合物包括含有黏度增強型試劑(諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇、甘油或聚葡萄糖)之懸浮液。賦形劑亦可含有少量添加劑,諸如增強等滲性及化學穩定性之物質。緩衝液之實例包括磷酸鹽緩衝液、碳酸氫鹽緩衝液及Tris緩衝液,而防腐劑之實例包括硫柳汞、間甲酚或鄰甲酚、福馬林及苯甲醇。標準調配物可為液體可注射物或可吸收於適合液體中形成注射用懸浮液或溶液之固體。因此,在非液體調配物中,賦形劑可包含(例如)右旋糖、人類血清白蛋白及/或防腐劑,可在投與前向其添加無菌
水或生理食鹽水。
在本發明之一個實施例中,組合物可包括其他試劑(亦可稱為生物反應改質劑化合物)或製造該等試劑/改質劑之能力。舉例而言,酵母媒介物可經至少一種抗原及至少一種試劑/生物反應改質劑化合物轉染或裝載有該等物,或本發明之組合物可與至少一種試劑/生物反應改質劑一起投與。生物反應調節劑包括佐劑及其他可調節免疫反應之化合物(可稱為免疫調節化合物)以及改變另一化合物或試劑之生物活性的化合物(諸如基於酵母之免疫治療劑),該生物活性並非限於免疫系統效應。某些免疫調節化合物可刺激保護性免疫反應而其他則可抑制有害免疫反應,且免疫調節是否適用於與給定基於酵母之免疫治療劑組合,至少部分可視待治療或預防之疾病病況或病症及/或待治療在個體而定。某些生物反應調節劑優先增強細胞介導之免疫反應,而其他優先增強體液免疫反應(亦即與體液免疫相比,可激發其中存在細胞免疫增強的免疫反應;或反之亦然)。某些生物反應改質劑具有與以酵母為基礎之免疫療法之生物特性相同的一或多個特性或增強或補充基於酵母之免疫療法之生物特性。存在許多熟習此項技術者已知之技術用於量測免疫反應之刺激或抑制以及用於自體液免疫反應區分細胞介導免疫反應,及用於區分一種類型之細胞介導反應與另一種(例如Th17反應相對於Th1反應)。
適用於本發明之試劑/生物反應改質劑可包括(但不限於)細胞激素、趨化因子、激素、脂質衍生物、肽、蛋白質、多醣、小分子藥物、抗體及其抗原結合片段(包括(但不限於)抗細胞因子抗體、抗細胞因子受體抗體、抗趨化因子抗體)、維生素、聚核苷酸、結合核酸之部分、適體及生長調節劑。一些適合的藥劑包括(但不限於)IL-1或IL-1之促效劑或IL-1R之促效劑、抗IL-1或其他IL-1拮抗劑;IL-6或IL-6之促效劑或IL-6R之促效劑、抗IL-6或其他IL-6拮抗劑;IL-12或IL-12
之促效劑或IL-12R之促效劑、抗IL-12或其他IL-12拮抗劑;IL-17或IL-17之促效劑或IL-17R之促效劑、抗IL-17或其他IL-17拮抗劑;IL-21或IL-21之促效劑或IL-21R之促效劑、抗IL-21或其他IL-21拮抗劑;IL-22或IL-22之促效劑或IL-22R之促效劑、抗IL-22或其他IL-22拮抗劑;IL-23或IL-23之促效劑或IL-23R之促效劑、抗IL-23或其他IL-23拮抗劑;IL-25或IL-25之促效劑或IL-25R之促效劑、抗IL-25或其他IL-25拮抗劑;IL-27或IL-27之促效劑或IL-27R之促效劑、抗IL-27或其他IL-27拮抗劑;I型干擾素(包括IFN-α)或I型干擾素或其受體之促效劑或拮抗劑;II型干擾素(包括IFN-γ)或II型干擾素或其受體之促效劑或拮抗劑;抗CD40抗體、CD40L、抗CTLA-4抗體(例如針對釋放能力缺失的T細胞);T細胞共刺激劑(例如抗CD137、抗CD28、抗CD40);阿侖單抗(alemtuzumab)(例如CamPath®)、地尼介白素迪夫托斯(denileukin diftitox)(例如ONTAK®);抗CD4;抗CD25;抗PD-1、抗PD-L1、抗PD-L2;阻斷FOXP3之藥劑(例如消除活性/殺死CD4+/CD25+ T調節性細胞);Flt3配體、咪喹莫特(imiquimod)(AldaraTM)、顆粒球巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF);顆粒球集落刺激因子(G-CSF)、沙格司亭(sargramostim)(Leukine®);激素,包括(但不限於)促乳素及生長激素;Toll樣受體(TLR)促效劑,包括(但不限於)TLR-2促效劑、TLR-4促效劑、TLR-7促效劑及TLR-9促效劑;TLR拮抗劑,包括(但不限於)TLR-2拮抗劑、TLR-4拮抗劑、TLR-7拮抗劑及TLR-9拮抗劑;消炎劑及免疫調節劑,包括(但不限於)COX-2抑制劑(例如塞內昔布(Celecoxib)、NSAIDS)、糖皮質激素、士他汀(statins)及撒利多胺(thalidomide)以及其類似物,包括IMiDTM(其為撒利多胺之結構性及功能性類似物(例如REVLIMID®(來那度胺(lenalidomide))、ACTIMID®(泊利度胺(pomalidomide)));促炎劑,諸如真菌或細菌組分或任何促炎性細胞激素或趨化細胞素;免疫治療疫
苗,包括(但不限於)基於病毒之疫苗、基於細菌之疫苗或基於抗體之疫苗;及任何其他免疫調節劑、免疫增強劑、消炎劑及/或促炎劑。本發明涵蓋該等試劑之任何組合,且與基於酵母之免疫治療劑組合或以一種方案(例如同時、依次或以其他形式)與其一起投與之該等試劑中之任一者為本發明所包涵之組合物。該等試劑已為本領域中所熟知。此等試劑可單獨使用或與本文所述之其他試劑組合使用。
試劑可包括給定蛋白質或肽或其功能域之促效劑及拮抗劑。如本文所用,「促效劑」為與受體或配體結合且產生或觸發反應之任何化合物或試劑,包括(但不限於)小分子、蛋白質、肽、抗體、核酸結合劑等,其可包括模擬與受體或配體結合之天然存在物質之作用的試劑。「拮抗劑」為阻斷或抑制或降低促效劑作用之任何化合物或試劑,其包括(但不限於)小分子、蛋白質、肽、抗體、核酸結合劑等。
本發明之組合物可進一步包括任何其他適用於預防或治療TB感染之化合物或組合物或任何治療或改善TB感染之任何症狀的化合物或可與其一起(同時、依序或間歇)投與。已知多種藥劑(包括不同抗菌化學治療藥物(例如抗生素))適用於治療或改善TB感染。此外,本發明之組合物可與其他免疫治療組合物(包括預防性及/或治療性免疫療法)一起使用。
當前批准四種方案用於治療潛伏性TB感染,且包括使用藥物異菸肼(INH)、利福平(RIF)及利福噴丁。在第一種方案中,持續9個月(1)每天或(2)每週兩次投與INH且與直接觀測療法(DOT)結合。DOT為世界衛生組織結核病控制策略(World Health Organization tuberculosis control strategy)之名稱且包括(a)關於TB監測、記錄及訓練之系統的政府承諾;(b)藉由痰液塗片顯微法進行之情況偵測;(c)由醫療工作在至少第一個兩個月內直接觀測之標準化治療方案;(d)常規藥物供應;及(e)允許評估治療結果之標準化記錄及報導系統。在第二種經
批准之用於治療潛伏性感染之方案中,持續6個月(1)每天或(2)每週兩次投與INH且與DOT結合。在第三種方案中,持續3個月每週組合投與INH及RPT且與DOT結合。最終,第四種經批准之用於治療潛伏性感染之方案持續4個月每天投與RIF。
當前存在10種由美國食品藥物管理局(U.S.Food and Drug Administration;FDA)批准用於治療活動性TB感染(TB疾病)之藥物。形成大部分治療方案之核心的一線藥物為INH、RIF、乙胺丁醇(EMB)及吡嗪醯胺(PZA)。TB疾病治療通常以2個月治療開始,接著選擇若干不同選項用於4或7個月之持續治療。舉例而言,較佳療程包括持續8週每天投與INH、RIF、PZA及EMB之初始療程,接著接續期:(1)持續18週每天投與INH及RIF或持續18週每週兩次投與INH及RIF。替代性協定包括持續2週每天投與INH、RIF、PZA及EMB之初始療程,接著持續6週每週兩次投與所有四種藥物,接著持續18週每週兩次投與及RIF之接續期。另一種替代性協定包括持續8週每週三次投與INH、RIF、PZA及EMB之初始療程,接著持續18週每週三次投與INH及RIF之接續期。藥物抗性TB定義為對至少一種一線藥物具有抗性之TB分枝桿菌,且多藥物抗性(MDR)TB對一種以上TB藥物且至少對INH及RIF具有抗性。TB之此等形式之治療較複雜且涉及DOT以及一或多種經由藥物敏感性測試鑑別為適用於患者之藥物。
投與本發明之基於酵母之TB免疫療法組合物之方法中之任一種可與芽孢桿菌卡莫特-蓋蘭(BCG)疫苗之投藥組合。BCG疫苗為最初來源於牛分支桿菌之菌株的活疫苗,其由Calmette及Guerin在十九世紀早期在法國里爾的巴斯德研究所滅毒。BCG疫苗可作為激活免疫接種投與,接著投與基於酵母之TB免疫療法組合物之輔助劑(1種、2種、3種、4種、5種或5種以上)。BCG疫苗之輔助劑亦可在基於酵母之TB免疫療法組合物之輔助劑之前、與基於酵母之TB免疫療法組合物之輔
助劑同時或在基於酵母之TB免疫療法組合物之輔助劑之後投與。或者,基於酵母之免疫療法組合物可用作激活免疫接種,接著投與BCG疫苗之輔助劑。藉由皮內注射投與BCG疫苗,典型地利用無菌多重穿刺器件或藉由沖洗及穿刺經皮投與。人類成年人之劑量通常為2-8×105cfu,且1-4×105cfu為兒科劑量。
基於酵母之TB免疫療法組合物亦可以類似方式(例如激活-輔助或甚至同時投藥)與其他預防性或免疫治療疫苗組合,諸如正在研發中的疫苗中之任一種(例如輔佐次單位疫苗、DNA疫苗、病毒載體疫苗、全細胞或滅毒或分段分支桿菌疫苗等)。
本發明亦包括一種套組,其包含本文中所描述之組合物中之任一種或本文中所描述之組合物之個體組分中之任一種。
本發明之組合物(其可包括任一或多種(例如兩種、三種、四種、五種或五種以上之組合)本文中所描述之基於酵母之免疫治療組合物、包括TB蛋白質及融合蛋白之TB抗原及/或編碼上述此類TB蛋白質或融合蛋白之重組核酸分子,及其他包含本文中所描述之此類基於酵母之組合物、抗原、蛋白質、融合蛋白或重組分子的組合物)可用於多種活體內及活體外方法中,包括(但不限於)治療及/或預防TB感染及其後遺症、TB之診斷分析或產生針對TB之抗體。
本發明之一個實施例係關於在個體或個體群體中預防或治療TB感染(潛伏性或活動性)及/或預防、改善或治療TB感染之至少一種症狀(潛伏性或活動性)的方法。該方法包括投與受TB感染之個體或個體群體一或多種本發明之免疫治療組合物的步驟。在一個態樣中,組合物為包含一或多種本文所描述之TB抗原的免疫治療組合物,其可包括基於酵母之免疫治療組合物。在一個實施例中,個體或個體群體為「暴露前」個體或個體群體。在一個實施例中,個體或個體群體患有
潛伏性TB感染。在一個實施例中,個體或個體群體患有活動性TB感染(TB疾病)。在一個態樣中,個體或個體群體額外用至少一種其他該治療TB感染(潛伏性或活動性,取決於個體或個體群體是否患有潛伏性或活動性TB感染)之防治性及/或治療性化合物或方案治療。此類治療化合物及方案已在上文中詳細描述,且可包括任何當前批准之化合物或方案,或其他類型之療法,包括(但不限於)其他免疫治療組合物及方案。
本發明之另一實施例係關於使個體或個體群體針對TB免疫,以在個體或個體群體中預防TB感染及/或降低或延緩TB感染發作或嚴重度之方法。該方法包括投與未感染TB(或咸信未感染TB)之個體或個體群體本發明之組合物的步驟。在一個態樣中,組合物為免疫治療組合物,其包含一或多種本文所描述之TB抗原,包括一或多種基於酵母之免疫治療組合物。在一個實施例中,本發明之基於酵母之免疫治療與BCG疫苗或其他包含TB抗原之疫苗結合投與。
如本文所用,短語「治療」TB感染或其任何排列(例如「TB感染之治療」等)通常係指一旦出現感染(潛伏性或活動性)便施用或投與本發明之組合物,從而:降低或消除可偵測之TB分枝桿菌(例如肺、脾、淋巴結或其他可存在TB感染之器官的分支桿菌負荷);降低、消除及/或延緩繼發性結核病病灶之形成;降低、消除及/或延緩TB分枝桿菌傳播至淋巴結或其他器官或身體系統;延長存活期;改善TB感染或症狀,足以改良其他化學治療性TB藥物在根除或治療感染方面的功效或效用或所需引入時間或與其協同作用;降低或解析個體中至少一種由感染引起之症狀;延緩或預防由感染引起之症狀及/或下游後遺症之發作及/或嚴重度、降低由感染引起之器官或生理學系統損害、改良針對TB生物體之免疫反應、改良針對TB生物體之長期記憶免疫反應及/或改良個體或個體群體之一般健康狀況。在本發明之一
個態樣中,向個體投與免疫治療組合物可有效地增強適用於治療或改善TB感染之症狀或延緩TB感染及/或其症狀之進程的藥劑之功效或與該藥劑協同作用,足以增加藥劑之治療效用或足以使藥劑具有額外時間以向個體提供治療效益。
「預防」TB感染或其任何排列(例如「TB感染之預防」等)通常係指在TB感染出現之前施用或投與本發明之組合物,從而預防TB分枝桿菌之感染,或感染應較晚發生,至少延緩發作、降低嚴重度及/或降低感染持續時間及/或由感染引起之生理學損害,包括預防或降低個體中由感染引起之至少一種症狀之嚴重度或發病率、延緩或預防繼發性TB病灶之形成、延緩或預防疾病之復發及/或延緩或預防個體或個體群體中由感染引起之症狀及/或下游後遺症之發作及/或嚴重度。
本發明包括向個體傳遞(投藥、免疫接種)本發明之一或多種免疫治療組合物,包括基於酵母之免疫療法組合物。投藥過程可在活體外或活體內進行但典型地在活體內進行。活體外投藥係指在患者體外進行一部分調節步驟,諸如在以使酵母媒介物、抗原及任何其他試劑或組合物裝載至細胞中之條件下,向自患者移除之細胞(樹突狀細胞)群投與本發明之組合物,及將細胞返回至患者體內。本發明之治療組合物可藉由任何適當投藥方式返回至患者中或投與患者。
組合物之投藥可為全身性、經黏膜及/或接近目標部位(例如靠近感染部位)之位置。較佳投藥途徑對於熟習此項技術者顯而易見,此視欲預防或治療之病狀類型、所用抗原及/或靶細胞群或組織而定。較佳投藥方法包括(但不限於):靜脈內投藥、腹膜內投藥、肌內投藥、節內投藥、冠脈內投藥、動脈內投藥(例如,投入頸動脈內)、皮下投藥、經皮傳遞、氣管內投藥、皮下投藥、關節內投藥、心室內投藥、吸入(例如氣霧劑)、顱內投藥、脊柱內投藥、眼內投藥、經耳投
藥、鼻內投藥、經口投藥、經肺投藥、導管注入及直接注入至組織內。在一個態樣中,投藥途徑包括:靜脈內、腹膜內、皮下、鞘內、皮內、節點內、肌肉內、經皮、吸入、鼻內、口服、眼內、關節內、顱內及脊柱內。非經腸傳遞包括皮層內、肌肉內、腹膜內、胸膜內、肺內、靜脈內、皮下、心房導管及靜脈導管途徑。經耳傳遞可包括滴耳劑,鼻內傳遞可包括滴鼻劑或鼻內注射,且眼內傳遞可包括滴眼劑。氣溶膠(吸入)傳遞亦可使用本領域中標準方法進行(參見,例如Stribling等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 189:11277-11281,1992)。其他調節黏膜免疫性之投藥途徑可適用於治療TB感染。該等途徑包括支氣管、皮層內、肌肉內、鼻內、其他吸入器、直腸、皮下、局部、經皮、陰道及尿道途徑。在一個態樣中,本發明之免疫治療組合物經皮下投與。
關於本發明之基於酵母之免疫療法組合物,通常,適合的單次劑量為當在適合的時段一或多次投與時,能夠向患者身體之既定細胞類型、組織或區域有效提供可有效地引發針對一或多種TB抗原或抗原決定基之抗原特異性免疫反應的量的酵母媒介物及抗原(若包括)的劑量。舉例而言,在一個實施例中,本發明之酵母媒介物之單次劑量為每公斤接受組合物投藥之生物體之體重約1×105至約5×107個酵母細胞等效物。在一個態樣中,本發明之酵母媒介物之單次劑量為每劑量(亦即每個有機體)約0.1 Y.U.(1×106個細胞)至約100 Y.U.(1×109個細胞),包括增量為0.1×106個細胞的任何中間劑量(亦即1.1×106、1.2×106、1.3×106……)。在一個實施例中,劑量包括1 Y.U.與40 Y.U.之間的劑量、1 Y.U.與50 Y.U.之間的劑量、1 Y.U.與60 Y.U.之間的劑量、1 Y.U.與70 Y.U.之間的劑量、1 Y.U.與80 Y.U.之間的劑量,且在一個態樣中,10 Y.U.與40 Y.U.、50 Y.U.、60 Y.U.、70 Y.U.或80 Y.U.之間的劑量。在一個實施例中,在個體上兩個、三個、四個或四個以
上不同部位但在同一給藥期間投與劑量。舉例而言,在一個給藥時間段期間可藉由注射10 Y.U.劑量將40 Y.U.劑量投與個體上之四個不同部位,或在相同給藥時間段期間,可藉由注射5 Y.U.劑量將20 Y.U.劑量投與個體上之四個不同部位或藉由注射10 Y.U.劑量投與個體上之兩個不同部位。本發明包括在個體上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上不同部位投藥一定量之基於酵母之免疫療法組合物(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 Y.U.或20 Y.U.以上)以形成單次劑量。
治療組合物之「輔助劑」或「增強免疫」係例如在針對抗原之免疫反應衰減時或視需要投與,以提供免疫反應或誘發針對特定抗原之記憶反應。可在最初投藥之後約1、2、3、4、5、6、7或8週相隔、一個月、兩個月、一個季度、一年、若干年投與輔助劑。在一個實施例中,投藥時程為在數週、數月、數年時段內投與至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或10次以上每公斤生物體體重組合物之約1×105至約5×107個酵母細胞等效物。在一個實施例中,每週投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或10次以上劑量,接著視需要每月一次給藥以達成TB分支桿菌之所需抑制或消除。在一個實施例中,以每週4次協定投與劑量(每4週,或在第4週、第8週、第12週之第1天等,在2與10次劑量之間或更長,如由臨床醫師確定)。可投與額外劑量。
關於本文中所描述之基於酵母之免疫治療組合物之投藥,可投與個體或個體群體單一組合物或可投與此類組合物之組合。因此,可以「香辛料架」方法選擇兩種或兩種以上組合物以最有效地預防或治療個體或個體群體中之TB感染。舉例而言,在本文中所描述之TB組合物中,含有Rv1909抗原之基於酵母之免疫治療之組合可與含有Rv2359及/或Rv2711抗原之基於酵母之免疫治療劑組合或同時投與或依序投與。作為另一實例,含有Rv1738抗原之基於酵母之免疫治療
之組合可與含有Rv2032抗原及/或Rv3130抗原及/或Rv3841抗原之基於酵母之免疫治療劑組合或同時投與或依序投與。可使用本文中其他地方描述之TB抗原中之任一者同時或依序投與類似組合,例如兩種、三種、四種或四種以上包含以下TB抗原中之一或多者之基於酵母之免疫治療劑的任何組合:Rv0125、Rv1196、Rv1411(Rv1411c)、Rv1738、Rv1813、Rv1909(Rv1909c)、Rv2032、Rv2359、Rv2608、Rv2660、Rv2711、Rv3130、Rv3619、Rv3620、Rv3841、Ag85A、Ag85B、TB10.4及ESAT-6。本發明之此態樣在需要關於既定患者、患者群體、TB菌株、地理區域及/或伴隨療法定製或個人化治療或預防方案時尤其適用。
在本發明之一個態樣中,一或多種額外治療劑與基於酵母之免疫療法組合物依序投與。在另一實施例中,一或多種額外治療劑在投與基於酵母之免疫療法組合物之前投與。在另一實施例中,一或多種額外治療劑在投與基於酵母之免疫療法組合物之後投與。在一個實施例中,一或多種額外治療劑與基於酵母之免疫療法組合物以交替劑量投與,或以其中基於酵母之組合物在該等藥劑之一或多次連續劑量之間的處方間隔或與其一起投與的協定投與。在一個實施例中,在開始投與該等額外藥劑之前,在一段時間內以一或多次劑量投與基於酵母之免疫療法組合物。換言之,基於酵母之免疫治療組合物以單藥療法投與一段時間,且接著添加額外治療(例如化學療法),與新劑量之基於酵母之免疫療法同時或以與基於酵母之免疫療法交替之方式進行。或者,在開始投與基於酵母之免疫療法組合物之前,在一段時間內投與藥劑。在一個態樣中,酵母經工程改造以表現或運載藥劑,或不同的酵母經工程改造或產生以表現或運載藥劑。
在本發明之一個態樣中,當抗TB化合物療法之療程開始時(例如本文中其他地方描述之受批准藥物或方案中之任一種),在相同時段
或該時段之至少一部分內投與額外劑量之免疫治療組合物,且可在抗TB化合物之療程結束後繼續投與。然而,整個期間內的免疫療法之給藥時程可且預期典型地與抗TB化合物不同。舉例而言,免疫治療組合物可每天、每週、每兩週、每三週、每個月、每兩個月或每3-6個月或如由醫師確定之更長間隔投與,且最典型地每週投與,接著每個月、每兩週或每月投與,其中當前抗TB藥物係每天、每週兩次、每週三次或每兩週一次投與。
在本發明之態樣中,免疫治療組合物及其他藥劑可一起(同時)投與。如本文所用,同時使用無需意謂所有化合物之所有劑量皆在同一天同一時間投與。實情為,同時使用意謂各療法組分(例如免疫療法及抗TB療法)在大致相同期間(數小時內,或彼此間隔至多1-7天)開始且在通常相同時段內投與,注意各組分可具有不同給藥時程(例如免疫療法每月一次,抗TB藥物每天一次)。此外,在同時投藥期間之前或在同時投藥期間之後,藥劑或免疫治療組合物中之任一者可在無另一或其他藥劑之情況下投與。
在本發明之方法中,組合物及治療性組合物可投與動物,包括任何脊椎動物,特別投與脊椎動物哺乳綱之任何成員,包含(但不限於)靈長類動物、嚙齒動物、家畜及家養寵物。家畜包括欲消費或製造有用產品之哺乳動物(例如用於羊毛生產之綿羊)。欲治療或保護之哺乳動物包括人類、狗、貓、小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬及豬。
「個體」為脊椎動物,諸如哺乳動物,包括(但不限於)人類。哺乳動物包括(但不限於)農畜、運動型動物、寵物、靈長類動物、小鼠及大鼠。術語「個體」可與術語「動物」、「受檢者」或「患者」互換使用。
除非另外指明,否則本發明之實踐將採用熟習此項技術者所熟知之習知分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學、核酸化學及免疫學技術。此類技術在文獻中全面說明,諸如Methods of Enzymology,第194卷,Guthrie等人編,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990);Biology and activities of yeasts,Skinner等人編,Academic Press(1980);Methods in yeast genetics:a laboratory course manual,Rose等人,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1990);The Yeast Saccharomyces:Cell Cycle and Cell Biology,Pringle等人編,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997);The Yeast Saccharomyces:Gene Expression,Jones等人編,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1993);The Yeast Saccharomyces:Genome Dynamics,Protein Synthesis,and Energetics,Broach等人編,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1992);Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人,1989)及Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook及Russel,2001),(在本文中共同稱為「Sambrook」);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編,1987,包括至2001年的增刊);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編,1994);Harlow及Lane(1988),Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Publications,New York;Harlow及Lane(1999)Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(在本文中共同稱為「Harlow and Lane」),Beaucage等人編,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley & Sons,Inc.,New York,2000);Casarett及Doull,Toxicology The Basic Science of Poisons,C.Klaassen編,第6版
(2001),及Vaccines,S.Plotkin及W.Orenstein編,第3版(1999)。
「TARMOGEN®」(GlobeImmune公司,Louisville,Colorado)一般係指在細胞外(在其表面上)、細胞內(內部或在細胞溶質上)或細胞外及細胞內兩者表現一或多種異源抗原之酵母媒介物。TARMOGEN®產品已經大體描述(參見例如美國專利第5,830,463號)。某些基於酵母之免疫療法組合物及製造及大體上使用該組合物之方法亦詳細描述於例如美國專利第5,830,463號、美國專利第7,083,787號、美國專利第7,736,642號、Stubbs等人,Nat.Med.7:625-629(2001)、Lu等人,Cancer Research 64:5084-5088(2004)及Bernstein等人,Vaccine 2008年1月24日;26(4):509-21中,其中之每一者均以全文引用的方式併入本文中。
如本文所用,術語「類似物」係指在結構上類似於另一化合物但組成略有不同(如由於一個原子經一不同元素之原子置換或由於存在特定官能基,或一個官能基經另一官能基置換)之化合物。因此,類似物為相對於參考化合物在功能及外觀上類似或相當,但具有不同結構或起源之化合物。
當用於描述化合物時,術語「經取代」、「經取代之衍生物」及「衍生物」意謂至少一個結合至未經取代之化合物之氫經不同的原子或化學部分置換。
儘管衍生物具有與母化合物類似之實體結構,但衍生物可具有與母化合物相比不同的化學及/或生物特性。該等特性可包括但不限於:增加或降低之母化合物活性、與母化合物相比新穎之活性、增強或降低之生物可用性、增強或降低之功效、增強或降低之活體外及/或活體內穩定性及/或增強或降低之吸收特性。
一般而言,術語「生物活性」表明化合物(包括蛋白質或肽)具有
對細胞或生物體之代謝或其他過程具有效應之至少一種可偵測活性,如活體內(亦即在天然生理環境中)或活體外(亦即在實驗室條件下)量測或觀測。
根據本發明,術語「調節(modulate)」可與「調節(regulate)」互換使用且通常係指上調或下調特定活性。如本文所用,就特定活性而言,術語「上調」通常可用於描述誘發、起始、增加、加強、強化、改良、增強、放大、促進或提供中之任一者。類似地,就特定活性而言,術語「下調」通常可用於描述減少、減小、抑制、改善、降低、減輕、阻斷或阻止中之任一者。
在本發明之一個實施例中,可製得本文所述之胺基酸序列中之任一者使其具有至少一個及至多約20個側接特定胺基酸序列之C端及/或N端中之每一者的額外異源胺基酸。所得蛋白質或多肽可稱為「基本上由」特定胺基酸序列「組成」。根據本發明,異源胺基酸為一胺基酸序列,其並非天然存在(亦即,非活體內天然存在)側接特定胺基酸序列,或者與特定胺基酸序列之功能無關,或者若對於給定胺基酸序列所衍生之有機體,在天然存在的序列中之側接編碼特定胺基酸序列的天然存在之核酸序列(當其存在於基因中時)的核苷酸係使用標準密碼子使用轉譯,則該胺基酸序列將不由側接編碼特定胺基酸序列的天然存在之核酸序列的核苷酸編碼。類似地,當在本文中提及核酸序列使用時,短語「基本上由……組成」係指編碼特定胺基酸序列的核酸序列,該編碼該特定胺基酸序列之核酸序列之5'端及/或3'端可各由至少一個且至多高達約60個額外異源核苷酸側接。異源核苷酸並非天然存在(亦即,非活體內天然存在)側接編碼特定胺基酸序列之核酸序列(當其存在於天然基因中時),或不編碼賦予任何額外功能至蛋白質或改變具有特定胺基酸序列之蛋白質之功能的蛋白質。
根據本發明,短語「選擇性結合」係指本發明之抗體、抗原結
合片段或結合搭配物優先結合至特定蛋白質之能力。更特定言之,短語「選擇性結合」係指一種蛋白質與另一種蛋白質(例如,針對抗原之抗體、其片段或結合搭配物)之特異性結合,其中如由任何標準檢定法(例如,免疫檢定)所量測的結合量在統計學上顯著高於該檢定之本底對照物。舉例而言,當執行免疫檢定時,對照物通常包括僅含有抗體或抗原結合片段(亦即,不存在抗原)的反應孔/管,其中將不存在抗原之情況下抗體或其抗原結合片段之反應量(例如,與孔之非特異性結合)視為本底。結合可使用此項技術中之多種標準方法量測,包括酶免疫檢定(例如,ELISA、免疫墨點檢定等)。
提及本發明中使用之蛋白質或多肽包括全長蛋白質、融合蛋白,或任何片段、域、構形抗原決定基,或該等蛋白質之同系物,包括蛋白質之功能性域及免疫域。更特定言之,根據本發明,分離蛋白質為已自其天然環境中移除(亦即,已經受人類操縱)的蛋白質(包括多肽或肽),且可包括例如純化蛋白質、部分純化蛋白質、重組製得蛋白質及合成製得蛋白質。因而,「分離」並不反映蛋白質經純化之程度。較佳地,本發明之經分離蛋白質係重組製得。根據本發明,術語「改質」及「突變」可互換使用,尤其對於本文所描述之蛋白質或其部分之胺基酸序列(或核酸序列)之改質/突變。
如本文所用,術語「同系物」用於指藉由對於天然存在之蛋白質或肽之微量改質而不同於天然存在之蛋白質或肽(亦即,「原型」或「野生型」蛋白質),但維持天然存在形式之基本蛋白質及側鏈結構之蛋白質或肽。該等變化包括但不限於:一個或幾個胺基酸側鏈之變化;一個或幾個胺基酸之變化,包括缺失(例如截短型蛋白質或肽)、插入及/或取代;一個或幾個原子之立體化學之變化;及/或包括但不限於甲基化、糖基化、磷酸化、乙醯化、豆蔻醯化、異戊烯化、棕櫚酸化、醯胺化及/或添加糖基磷脂醯肌醇之微量衍生化。同系物可具
有與天然存在之蛋白質或肽相比增強、減弱或實質上類似的特性。同系物可包括蛋白質之促效劑或蛋白質之拮抗劑。同系物可利用此項技術中已知之用於生產蛋白質之技術來生產,該等技術包括但不限於:直接改質經分離之天然存在的蛋白質、直接蛋白質合成,或使用例如典型或重組DNA技術來改質編碼蛋白質之核酸序列以實現隨機或靶向突變誘發。
給定蛋白質之同系物可包含一胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成,該胺基酸序列與參考蛋白質之胺基酸序列具有至少約45%、或至少約50%、或至少約55%、或至少約60%、或至少約65%、或至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約91%之一致性,或至少約92%之一致性,或至少約93%之一致性,或至少約94%之一致性,或至少約95%之一致性,或至少約96%之一致性,或至少約97%之一致性,或至少約98%之一致性,或至少約99%之一致性(或按全整數增量計,在45%與99%之間的任何百分比一致性)。在一實施例中,同系物包含一胺基酸序列、基本上由其組成或由其組成,該胺基酸序列與參考蛋白質之天然存在之胺基酸序列具有低於100%之一致性、低於約99%之一致性、低於約98%之一致性、低於約97%之一致性、低於約96%之一致性、低於約95%之一致性等(增量為1%)直至低於約70%之一致性。
同系物可包括「接近全長」之蛋白質或蛋白質域,其意謂此類同系物藉由添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個來自該等全長蛋白質或全長功能性域或全長免疫域之N端及/或C端之胺基酸而不同於全長蛋白質、功能性域或免疫域(該等蛋白質、功能性域或免疫域在本文中描述或以其他方式已知或描述於公開可用之序列中)。
如本文所用,除非另外說明,否則提及百分比(%)一致性係指使用以下來執行之對同源性的評估:(1)BLAST 2.0 Basic BLAST同源搜
尋,其使用具有標準預設參數之blastp及blastn,前者用於胺基酸搜尋,後者用於核酸搜尋,其中查詢序列藉由預設過濾較低複雜度區域(在Altschul,S.F.,Madden,T.L.,Schääffer,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.& Lipman,D.J.(1997)「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs.」Nucleic Acids Res.25:3389-3402,其以全文引用的方式併入本文中);(2)BLAST 2比對(使用下文所描述之參數);(3)及/或具有標準預設參數之PSI-BLAST(位置特異性疊代BLAST)。應注意,歸因於BLAST 2.0 Basic BLAST與BLAST 2之間標準參數之一些差異,使用BLAST 2程式可認定兩個特定序列具有顯著同源性,而使用其中一個序列作為查詢序列來以BLAST 2.0 Basic BLAST執行搜尋可能無法識別具有最高匹配度之第二序列。此外,PSI-BLAST提供自動便用型之「概況」搜尋,其為尋找序列同系物之敏感方式。該程式首先執行間隙BLAST資料庫搜尋。PSI-BLAST程式使用所返回之來自任何顯著比對之資訊以建構位置特異性記分矩陣,其置換查詢序列以用於下一輪資料庫搜尋。因此,應理解,一致性百分比可使用此等程式中之任一者來判定。
兩個特定序列可使用如Tatusova及Madden,(1999),「Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences」,FEMS Microbiol Lett.174:247-250(該文獻以全文引用的方式併入本文中)中所描述之BLAST 2彼此比對。BLAST 2序列比對係使用BLAST 2.0演算法以blastp或blastn執行,以在該兩個序列之間執行間隙BLAST搜尋(BLAST 2.0),從而允許將缺口(缺失及插入)引入所得比對中。為了本文清晰性之目的,使用如下標準預設參數執行BLAST 2序列比對。
對於blastn,使用0 BLOSUM62矩陣:
匹配之獎勵=1
不匹配之懲罰值=-2
打開缺口(5)及延伸缺口(2)懲罰值
缺口x_下降(50)預期(10)字尺寸(11)過濾(打開)
對於blastp,使用0 BLOSUM62矩陣:
打開缺口(11)及延伸缺口(1)懲罰值
缺口x_下降(50)預期(10)字尺寸(3)過濾(打開)
經分離核酸分子為已自其天然環境中移除(亦即,已經受人類操縱)之核酸分子,其天然環境為核酸分子天然存在於其中的基因組或染色體。因而,「分離」不必反映核酸分子已經純化的程度,但表明該分子不包括該核酸分子天然存在於其中的完整基因組或完整染色體。分離核酸分子可包括基因。包括基因的分離核酸分子不為包括該基因的染色體片段,而是包括與該基因有關之編碼區及調節區,但無天然存在於同一染色體上之其他基因的染色體片段。分離核酸分子亦可包括由通常不與該特定核酸序列天然側接的其他核酸(亦即,異源序列)側接(亦即,在該序列之5'端及/或3'端)的核酸序列。分離核酸分子可包括DNA、RNA(例如,mRNA)或DNA或RNA之衍生物(例如,cDNA)。儘管短語「核酸分子」主要係指實體核酸分子且短語「核酸序列」主要係指核酸分子上之核苷酸之序列,但該兩個短語可互換使用,尤其就能夠編碼蛋白質或蛋白質域的核酸分子或核酸序列而言。
重組核酸分子為可包括編碼本文所描述之任何一或多種蛋白質之任何核酸序列中之至少一者的分子,本文所描述之任何一或多種蛋白質係以可操作方式與能夠有效調節細胞中待轉染之核酸分子表現之任何轉錄控制序列中之至少一者連接。儘管短語「核酸分子」主要係指實體核酸分子且短語「核酸序列」主要係指核酸分子上之核苷酸序列,但兩個短語可互換使用,尤其就能夠編碼蛋白質之核酸分子或核
酸序列而言。另外,短語「重組分子」主要係指以可操作方式與轉錄控制序列連接之核酸分子,但該短語可與短語「核酸分子」(投與動物)互換使用。
重組核酸分子包括重組載體,該重組載體為以可操作方式與編碼本發明之融合蛋白的經分離核酸分子連接的任何核酸序列,通常為異源序列,該重組載體能夠實現融合蛋白之重組製造且能夠將核酸分子傳遞至根據本發明之宿主細胞中。此類載體可含有非自然發現與待插入載體中之經分離核酸分子相鄰之核酸序列。該載體可為RNA或DNA,原核或真核,且在本發明中較佳為病毒或質體。重組載體可用於選殖、定序及/或以其他方式操縱核酸分子,且可用於傳遞該等分子(例如,以DNA組合物或基於病毒載體之組合物之形式)。重組載體較佳用於表現核酸分子,且亦可稱為表現載體。較佳重組載體能夠表現在轉染宿主細胞中。
在本發明之重組分子中,核酸分子以可操作方式與含有與宿主細胞相容且控制本發明之核酸分子之表現的調節序列(諸如轉錄控制序列、轉譯控制序列、複製起點及其他調節序列)之表現載體連接。特定言之,本發明之重組分子包括以可操作方式連接至一或多個轉錄控制序列之核酸分子。短語「以可操作方式連接」係指以在轉染(亦即,轉化、轉導或轉染)至宿主細胞中時使得分子表現之方式將核酸分子連接至表現控制序列。
根據本發明,術語「轉染」係用於指可將外源核酸分子(亦即,重組核酸分子)插入細胞中之任何方法。當該術語用於指將核酸分子引入微生物細胞(諸如藻、細菌及酵母)中時,術語「轉化」可與術語「轉染」互換使用。在微生物系統中,術語「轉化」用於描述歸因於藉由微生物獲取外源性核酸之遺傳性變化,且基本上與術語「轉染」同義。因此,轉染技術包括但不限於轉化、化學處理細胞、粒子轟
擊、電穿孔、顯微注射、脂質體轉染、吸附、侵染及原生質體融合。
以下實驗結果為說明之目的提供且不意欲限制本發明之範疇。
以下實例描述若干用於治療或防止TB侵染之基於酵母之免疫治療組合物之生產。
在第一個實驗中,酵母(例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv2359蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致130種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:4表示。包含SEQ ID NO:4且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:6表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:6之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:6之位置7至8);3)SEQ ID NO:4之Rv2359抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:6之位置9至137);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:6之位置138至143)。由SEQ ID NO:6表示之融合蛋白係藉由重組核酸序列編碼以用於插入具有SEQ ID NO:5之核酸序列之載體中。此融合蛋白在圖1A中示意性地說明。表現SEQ ID NO:6之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19001。
在第二個實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv2711蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致230種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:7表示。包含SEQ ID NO:7且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:9表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:9之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:9之位置7至8);3)SEQ
ID NO:7之Rv2711抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:9之位置9至237);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:9之位置238至243)。由SEQ ID NO:9表示之融合蛋白係藉由重組核酸序列編碼以用於插入具有SEQ ID NO:8之核酸序列之載體中。此融合蛋白在圖1C中示意性地說明。表現SEQ ID NO:9之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19002。
在第三個實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB Rv1909c蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致147種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:10表示。包含SEQ ID NO:10且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:12表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:12之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:12之位置7至8);3)SEQ ID NO:10之Rv1909c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:12之位置9至155);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:12之位置156至161)。由SEQ ID NO:12表示之融合蛋白係藉由重組核酸序列編碼以用於插入具有SEQ ID NO:11之核酸序列之載體中。此融合蛋白在圖1B中示意性地說明。表現SEQ ID NO:12之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19003。
在第四個實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含三種不同鐵積聚TB抗原、經稠合以形成單一融合蛋白之抗原。此融合蛋白中之TB抗原為包含來自Rv2359之TB抗原、來自Rv2711之TB抗原及來自Rv1909c之TB抗原的單一多肽,具有SEQ ID NO:13之胺基酸序列。包含SEQ ID NO:13且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:15表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺
基酸序列(SEQ ID NO:15之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:15之位置7至8);3)SEQ ID NO:4之Rv2359抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:15之位置9至137);4)SEQ ID NO:7之Rv2711抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:15之位置138至366);5)SEQ IDS NO:10之Rv1909c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:15之位置367至513);及6)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:15之位置514至519)。由SEQ ID NO:15表示之融合蛋白係藉由重組核酸序列編碼以用於插入具有SEQ ID NO:14之核酸序列之載體中。由SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15表示之胺基酸序列中TB抗原之組合在本文中亦可稱為「3-鐵融合物」。此融合蛋白在圖1D中示意性地說明。表現SEQ ID NO:15之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19004。
在第五個實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB ESAT-6蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致94種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:16表示。包含SEQ ID NO:16且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:18表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:18之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:18之位置7至8);3)SEQ ID NO:16之ESAT-6抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:18之位置9至102);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:18之位置103至108)。由SEQ ID NO:18表示之融合蛋白係藉由重組核酸序列編碼以用於插入具有SEQ ID NO:17之核酸序列之載體中。表現SEQ ID NO:18之本發明之基於酵母的免疫治療組合物在本文中可稱作GI-19005。
為了生產上文所描述之五種酵母免疫療法組合物,簡言之,首先密碼子最佳化上文所描述之編碼TB抗原之DNA以用於在酵母中表現,且隨後在酵母2μm表現載體中在CUP1促進劑(pGI-100)後方插
入。藉由乙酸鋰/聚乙二醇轉染將所得質體引入釀酒酵母W303α酵母中,且在缺少尿嘧啶及白胺酸(ULDM;不含尿苷及白胺酸之培養基)之固體最小板(solid minimal plate)上選擇轉染物。自板接種缺少尿苷及白胺酸之液體培養物(UL2培養基:20g/L葡萄糖;6.7g/L含有硫酸銨之酵母氮基底;及0.04mg/mL組胺酸、色胺酸及腺嘌呤中之每一者),且在30℃、250rpm下使起始培養物生長20h。主要培養物用於接種除了GI-19003)或缺少尿苷之僅用於GI-19003之液體培養基之所有培養物之相同調配物之最終培養物(U2培養基:20g/L葡萄糖;6.7g/L含有硫酸銨之酵母氮基底;0.04mg/mL組胺酸、色胺酸及腺嘌呤中之每一者;及0.06mg/mL白胺酸),且持續生長直至達到1.1至4.0YU/mL之密度。在30℃下於1-4YU/ml之起始密度下用500μM硫酸銅誘發培養物3個小時。隨後採集來自各培養物之細胞,將其PBS-洗滌且在在PBS中於56℃下加熱殺死1小時。
在加熱殺死培養物之後,在PBS中洗滌細胞三次,且藉由玻璃珠破裂繼而在SDS溶解緩衝液中使其沸騰來分離完全蛋白質。完全蛋白質之量化係藉由皮爾斯(Pierce)660nm蛋白質檢定進行,且TB抗原含量係使用組胺酸抗體(anti-His)標籤單株抗體探針藉由西方墨點法繼而內插至組胺酸標籤HCV NS3蛋白質標準曲線量測。
結果在圖2中顯示。圖2顯示表現以下酵母之銅誘導性表現:表現包含Rv2359抗原之融合蛋白之酵母(表現SEQ ID NO:6之GI-19001;在圖2中以「rv2359」指示)、表現包含Rv2711抗原之融合蛋白之酵母(表現SEQ ID NO:9之GI-19002;在圖2中以「rv2711」指示)、表現包含Rv1909c抗原之融合蛋白之酵母(表現SEQ ID NO:12之GI-19003;在圖2中以「rv1909C」指示)、表現包含「3-鐵融合物」之融合蛋白之酵母(表現SEQ ID NO:15之GI-19004;在圖2中以「融合物」指示)及表現TB ESAT-6抗原之酵母(表現SEQ ID NO:18之GI-19005;在圖2中
以「ESAT-6」指示)。對照物酵母(空載體)用作對照物(在圖2中以「Yvec」指示)。每一通道裝載8μg完全蛋白質。圖2顯示,表現本發明之鐵積聚抗原(Rv2359、Rv2711、Rv1909c)之基於TB酵母之免疫療法組合物中之每一者表現TB蛋白質,且可藉由西方墨點法識別,但顯示未偵測到ESAT-6抗原之表現(b.d.=低於此檢定之偵測極限)。含有所有三種鐵積聚抗原(3-鐵融合蛋白或「融合物」)之融合蛋白累積至與個別抗原中之任一者相比高得多的程度(計算:Rv2359=495ng抗原/107個酵母細胞;Rv2711=3333ng抗原/107個酵母細胞;Rv1909c=380ng抗原/107個酵母細胞;融合物=7778ng抗原/107個酵母細胞)。被稱為GI-19004之表現SEQ ID NO:15之3-鐵融合蛋白之酵母經選擇用於實例2中所描述的實驗。
以下實例顯示用表現3-鐵融合物TB抗原之基於酵母之免疫治療組合物對小鼠進行免疫之結果。
簡言之,用GI-19004之4 Y.U.(4 x 107個酵母細胞)每週一次皮下免疫DBA小鼠2週,該組合物為表現SEQ ID NO:15之「3-鐵」融合蛋白之基於酵母的免疫療法組合物。七天後,在4U/ml鼠IL-2存在下用重組純化TB鐵抗原活體外刺激脾細胞4天。在圖3中所示的實驗中(表現SEQ ID NO:15之蛋白質之3-鐵融合物的酵母,在圖3中指示為「融合物」),用重組純化鐵抗原rv2359再刺激脾細胞。藉由ELISpot檢定量測IFN-γ產量。Ovax為表現無關抗原雞卵白蛋白之對照物酵母。圖3顯示用表現三種鐵積聚抗原之融合蛋白之GI-19004進行免疫在自小鼠分離之免疫細胞中引出穩定的抗原特異性(rv2359)干擾素-γ(IFN-γ)之免反應,表明強細胞介導免疫反應及CD8+ T細胞反應(P值係使用ANOVA;rr:反應比率(融合物/Ovax之ELISpot比率)判定)。
圖4顯示使用來自用GI-19004免疫的小鼠之脾細胞所執行的額外
ELISpot檢定之結果。在此實驗中,小鼠如上文對於圖3中所示的實驗所描述經免疫,且分離脾細胞用於用抗原進行活體外刺激且藉由ELISpot檢定進行評估。在此實驗中用於活體外刺激脾細胞之抗原不為重組Rv2359,但為活GI-19004之離心清除溶解物(其表現3-鐵融合物,因此可為所有三種TB抗原,且亦含有來自溶解物之整體酵母抗原)。溶解物抗原係以6μg/mL或18μg/mL之濃度使用。Ovax(將卵白蛋白表現為無關抗原之酵母)充當用於抗原特異性之對照物。如圖4中所示,用表現三種鐵積聚抗原之融合蛋白的GI-19004所進行之免疫在自小鼠分離之免疫細胞中引出穩定的抗原特異性(此次使用所有三種抗原)、干擾素-γ(IFN-γ)所有三種抗原反應。歸因於溶解物中存在酵母抗原,在此實驗中之Ovax對照物反應較高,所有基於酵母之組合物均為如此;然而,與由Ovax引起之反應相比,由GI-19004引起之反應在統計學上為顯著的(P<0.0001)。
此等實驗顯示,表現分支桿菌鐵積聚抗原之基於酵母的免疫療法組合物可在僅兩次免疫之後引發穩定的抗原特異性IFN-γ免疫反應。
以下實例描述評估本發明之基於酵母的TB免疫療法組合物之額外實驗。
在此實驗中,除了表現Ag85B、TB10.4之基於酵母的免疫療法組合物,及/或TB蛋白質之融合物或其免疫原性域(例如,Ag85B-ESAT6-TB10.4),或表現如在實例4中所描述的其他抗原的基於酵母之免疫療法組合物(如對於本文中所描述之其他基於酵母的免疫療法組合物所描述而生產)外,表現如上文實例1中所描述之TB抗原之重組酵母之培養盤經進一步最佳化以用於生長及抗原表現。選擇彼等符合預定義之生長及抗原表現指標的候選免疫治療劑用於免疫評估。使用多
種促進劑、培養基及轉錄誘發方法使病毒株內之生長速率及抗原表現最佳化。其次,在小鼠體內於培養活體內及活體外相關檢定中測試酵母疫苗候選物以展示特異性、效能及潛在功效,諸如用於實例2之檢定。針對對於上述酵母病毒株之可調適的抗原特異性免疫反應之檢定係在小鼠中使用經典活體內及活體外測試進行,該等測試如由先前(Stubbs等人,supra 2001;Lu等人,Cancer Res 64,5084-8(2004);Haller等人,Vaccine 25,1452-63(2007),Tamburini等人,J.Immunotherapy 35:14-22(2012))所描述,包括:1)腫瘤保護,2)CTL檢定,3)淋巴細胞增殖檢定(LPA)及;4)Th17刺激。測試1至測試3經設計以探測針對酵母疫苗中之TB抗原的CD4+及CD8+ T細胞介導活性,而測試4將表明TB免疫治療劑在已接種疫苗之動物中調節Treg活性之能力。此等實驗識別大部分免疫原性基於TB酵母之免疫療法產品用於在Mtb難題實驗中之後續測試(參見額外實例)。
以下實例描述生產若干用於治療或防止TB侵染之額外的基於酵母之免疫治療組合物,包括表現一或多種低氧池抗原之酵母、表現TLR促效劑抗原之酵母、表現另一TB抗原之酵母及表現多種TB抗原之組合之酵母。
在以下實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB低氧池Rv1738蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致94種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:19表示。包含SEQ ID NO:19且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:21表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:21之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:21之位置7至8);3)SEQ ID NO:19之位置2至94之Rv1738抗原之胺基酸序列(SEQ
ID NO:21之位置9至101);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:21之位置102至107)。由SEQ ID NO:21表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:20之核酸序列之載體中。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB低氧池Rv2032蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致331種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:22表示。SEQ ID NO:22含有不活化突變,其為在原生Rv2032序列中進行之精胺酸取代丙胺酸,其位於SEQ ID NO:22之位置13處。包含SEQ ID NO:22且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:24表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:24之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:24之位置7至8);3)SEQ ID NO:22之位置2至331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:24之位置9至338):及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:24之位置339至344)。SEQ ID NO:24含有不活化突變,其為在原生Rv2032序列中進行之精胺酸取代丙胺酸,其位於SEQ ID NO:24之位置21處。由SEQ ID NO:24表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:23之核酸序列之載體中。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB低氧池Rv3130蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致463種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:25表示。包含SEQ ID NO:25且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:27表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:27之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:27之位置7至8);3)SEQ ID NO:25之位置2至463之Rv3130抗原之胺基酸序列(SEQ
ID NO:27之位置9至470);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:27之位置471至476)。由SEQ ID NO:27表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:26之核酸序列之載體中。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB低氧池Rv3841蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致181種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:28表示。SEQ ID NO:28包括ERNH序列之四個胺基酸不活化缺失,若不缺失,該序列將就SEQ ID NO:28而言以其他方式在位置53與54之間出現。包含SEQ ID NO:28且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:30表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:30之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:30之位置7至8);3)SEQ ID NO:28之位置2至181之Rv3841抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:30之位置9至183);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:30之位置184至189)。SEQ ID NO:30包括ERNH序列之四個胺基酸缺失,若不缺失,該序列將就SEQ ID NO:30而言以其他方式在位置61與62之間出現。由SEQ ID NO:30表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:29之核酸序列之載體中。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含四種不同低氧池TB抗原之融合蛋白。在此蛋白質中之TB抗原形成單一多肽,該單一多肽包含來自Rv1738之TB抗原、來自Rv2032之TB抗原、來自Rv3130之TB抗原及來自Rv3841之TB抗原,具有SEQ ID NO:31之胺基酸序列。包含SEQ ID NO:31且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:33表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個
胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:33之位置7至8);3)SEQ ID NO:19之位置2至94之Rv1738抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置9至101);4)SEQ ID NO:22之位置2至331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置102至431);5)SEQ ID NO:25之位置2至463之Rv3130抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置432至893);6)SEQ IDS NO:28之位置2至181之Rv3841抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:33之位置894至1068);及7)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:33之位置位置1069至1074)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv3841抗原(SEQ ID NO:28)中之每一者之上述去活化突變亦包括於此融合蛋白中。由SEQ ID NO:33表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:32之核酸序列之載體中。由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:33表示之胺基酸序列中之TB抗原之組合在本文中亦可稱為「低氧4-基因融合物」。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含兩種不同低氧池TB抗原之融合蛋白。此蛋白質中之TB抗原形成單一多肽,該單一多肽包含來自Rv2032之TB抗原及來自Rv3841之TB抗原,具有SEQ ID NO:34之胺基酸序列。包含SEQ ID NO:34且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:36表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:36之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:36之位置7至8);3)SEQ ID NO:22之位置2至331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:36之位置9至338);4)SEQ ID NO:28之位置2至181之Rv3841抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:36之位置339至513);及5)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:36之位置514至519)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv3841抗原(SEQ ID NO:28)中之每一者之上述去活化突變亦包括於此
融合蛋白中。由SEQ ID NO:36表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:35之核酸序列之載體中。
在以下實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB Ag85a蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致337種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:37表示。包含SEQ ID NO:37且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:39表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:39之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:39之位置7至8);3)SEQ ID NO:37之Ag85a抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:39之位置9至345);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:39之位置346至351)。由SEQ ID NO:39表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:38之核酸序列之載體中。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含來自TB TLR促效劑Rv1411c蛋白質之抗原的融合蛋白。TB抗原為大致236種胺基酸之單一多肽,其由SEQ ID NO:40表示。SEQ ID NO:40之胺基酸序列含有對應於原生蛋白質中位置91(V91W)的纈胺酸至色胺酸之不活化突變(亦在相對於SEQ ID NO:40之位置91處發生)。包含SEQ ID NO:40且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:42表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:42之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:42之位置7至8);3)SEQ ID NO:40之Rv1411c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:42之位置9至244);及4)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:42之位置245至250)。由SEQ ID NO:42表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:41之核酸序列之載體
中。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含三種不同TB抗原之融合蛋白。在此蛋白質中之TB抗原形成單一多肽,該單一多肽包含來自Rv2032之TB低氧池抗原、來自Rv1411c之TB TLR促效劑蛋白質、來自Rv2359之TB鐵積聚抗原,具有SEQ ID NO:43之胺基酸序列。包含SEQ ID NO:43且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:45表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:45之位置7至8);3)SEQ ID NO:22之位置2至331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置9至338);4)SEQ ID NO:40之Rv1411c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置339至574);5)SEQ ID NO:4之Rv2359蛋白質之胺基酸序列(SEQ ID NO:45之位置575至703);及6)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:45之位置704至709)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv1411c抗原(SEQ ID NO:40)中之每一者之上述去活化突變亦包括於此融合蛋白中。由SEQ ID NO:45表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:44之核酸序列之載體中。
為了生產上文所描述之各種酵母免疫療法組合物,簡言之,首先密碼子最佳化上文所描述之編碼TB抗原之DNA以用於在酵母中表現,且隨後在酵母2μm表現載體中在CUP1促進劑(pGI-100)後方插入。藉由乙酸鋰/聚乙二醇轉染將所得質體引入釀酒酵母W303α酵母中,且在缺少尿嘧啶及白胺酸(ULDM;尿苷及白胺酸丟棄培養基)或缺少尿嘧啶(UDM)之固體最小板上選擇轉染物。分別自ULDM及UDM板接種缺少尿苷及白胺酸(UL2培養基:20g/L葡萄糖;6.7g/L含有硫酸銨之酵母氮基底;及0.04mg/mL組胺酸、色胺酸及腺嘌呤中之每一
者)或缺少尿嘧啶(UDM;與UL2相同但含有0.06mg/mL白胺酸)之液體培養物,且在30℃(250rpm)下使起始培養物生長20h。主要培養物用於接種所有培養物之相同調配物之最終培養物,且持續生長直至達到1.1至4.0YU/mL之密度。在30℃下於1-4YU/ml之起始密度下用500μM硫酸銅誘發培養物4個小時。隨後採集來自各培養物之細胞,將其PBS-洗滌且在在PBS中於56℃下加熱殺死1小時。
在加熱殺死培養物之後,在PBS中洗滌細胞三次,且藉由玻璃珠破裂繼而在SDS溶解緩衝液中使其沸騰來分離完全蛋白質。完全蛋白質之量化係藉由皮爾斯660nm蛋白質檢定進行,且TB抗原含量係使用組胺酸抗體標籤單株抗體探針藉由西方墨點法繼而內插至組胺酸標籤HCV NS3蛋白質標準曲線量測。
顯示低氧池抗原之三者藉由酵母在U2及UL2培養基兩者中之表現的結果在圖5中顯示。圖5顯示以下酵母之銅誘導性表現(參見箭頭):表現包含Rv1738抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:22;在圖5中以「rv1738」指示)、表現包含Rv2032抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:24;在圖5中以「rv2032」指示)及表現包含Rv3130抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:27;在圖5中以「rv3130」指示)。圖5顯示,表現本發明之低氧池抗原之基於TB酵母的免疫療法組合物中之每一者均表現TB蛋白質,且可藉由西方墨點法識別。rv2032蛋白質係以與在此實驗中所預期相比略微較高的分子量作用,但此有時以一級序列之形式發生可影響SDS-PAGE凝膠中之SDS結合及遷移速率。
顯示TB蛋白質Rv3841、Ag85A及1411c在U2及UL2培養基兩者中之表現的結果在圖6中顯示。圖6顯示以下酵母之銅誘導性表現(參見箭頭):表現包含TB低氧池Rv3841抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:30;在圖6中以「rv3841」指示)、表現包含Ag85A抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:39;在圖6中以「Ag85A」指示)及表現包含TB
TLR促效劑Rv1411c抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:42;在圖6中以「rv1411」指示)。圖6顯示,表現本發明之TB抗原之基於TB酵母的免疫療法組合物中之每一者均表現蛋白質,且可藉由西方墨點法識別。
圖7顯示TB蛋白質Ag85A、低氧4-基因融合物(Rv1738-Rv2032-RV3130-Rv3841)及低氧TLR-鐵融合物(Rv2032-Rv1411c-Rv2359)在U2及UL2培養基兩者中之表現。特定言之,圖7顯示以下酵母之銅誘導性表現(參見箭頭):表現包含TB抗原Ag85A之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:39;在圖7中以「Ag85A」指示)、表現「低氧4-基因融合物」蛋白質之酵母(SEQ ID NO:33;在圖7中以「1738-2032-3130-3841*」指示)及表現包含低氧池抗原、TB TLR促效劑Rv1411c抗原及TB鐵積聚抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:45;在圖7中以「2032-1411-2359**」指示)。圖7顯示,表現本發明之TB抗原之基於TB酵母的免疫療法組合物中之每一者均表現蛋白質,且可藉由西方墨點法識別。此實驗顯示低氧4-基因融合物之一些蛋白分解,但抗原表現仍為穩定的。
圖8顯示TB2-基因融合物(Rv2032-Rv3841)、TB低氧池抗原Rv3130、TB TLR促效劑Rv1411c及低氧TLR-鐵融合物(Rv2032-Rv1411c-Rv2359)在U2及UL2培養基兩者中之表現。特定言之,圖8顯示以下酵母之銅誘導性表現(參見箭頭):表現包含低氧池抗原Rv2032及Rv3841之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:36;在圖8中以「2032-3841」指示)、表現Rv3130蛋白質之酵母(SEQ ID NO:27;在圖8中以「3130」指示)、表現Rv1411c蛋白質之酵母(SEQ ID NO:42;在圖8中以「1411」指示)及表現包含低氧池抗原、TB TLR促效劑Rv1411c抗原及TB鐵積聚抗原之融合蛋白之酵母(SEQ ID NO:45;在圖8中以「2032-1411-2359」指示)。圖8顯示,表現本發明之TB抗原之基於TB
酵母的免疫療法組合物中之每一者均表現蛋白質,且可藉由西方墨點法識別。
圖9為說明上文所描述之各種融合蛋白在Ng/YU;1YU=107個酵母細胞)中之表現的圖表。在圖9中所表示之融合蛋白為:(1)UL2培養基中由SEQ ID NO:15表示之3-鐵融合物(3-鐵融合物-UL2);(2)U2培養基中由SEQ ID NO:21表示之Rv1738(1738-U2);(3)UL2培養基中由SEQ ID NO:21表示之Rv1738(1738-UL2);(4)U2培養基中由SEQ ID NO:27表示之Rv3130(3130-U2);(5)UL2培養基中由SEQ ID NO:27表示之Rv3130(3130-UL2);(6)U2培養基中由SEQ ID NO:33表示之Rv1738-Rv2032-Rv3130-Rv3841(1738-2032-3130-3841-U2);(7)UL2培養基中由SEQ ID NO:33表示之Rv1738-Rv2032-Rv3130-Rv3841(1738-2032-3130-3841-UL2);(8)U2培養基中由SEQ ID NO:45表示之Rv2032-Rv1411-Rv2359(2032-1411-2359-U2);(9)UL2培養基中由SEQ ID NO:45表示之Rv2032-Rv1411-Rv2359(2032-1411-2359-UL2);(10)U2培養基中由SEQ ID NO:36表示之Rv2032-Rv3841(2032-3841-U2);(11)UL2培養基中由SEQ ID NO:36表示之Rv2032-Rv3841(2032-3841-UL2);(12)U2培養基中由SEQ ID NO:24表示之Rv2032(2032-U2);(13)UL2培養基中由SEQ ID NO:24表示之Rv2032(2032-UL2);(14)U2培養基中由SEQ ID NO:30表示之Rv3841(3841-U2);(15)UL2培養基中由SEQ ID NO:30表示之Rv3841(3841-UL2);(16)U2培養基中由SEQ ID NO:39表示之Ag85A(A85-U2);(17)UL2培養基中由SEQ ID NO:39表示之Ag85A(A85-UL2);(18)U2培養基中由SEQ ID NO:42表示之Rv1411c(1411-U2);(19)UL2培養基中由SEQ ID NO:42表示之Rv1411c(1411-UL2);(20)對照物1(HCV抗原融合蛋白對照物);及(21)(癌症抗原融合蛋白對照物)。
總體而言,此等實驗顯示所有TB融合蛋白均成功地在酵母中表
現,其中一些具有與在其他臨床前研究項目中生產及選擇的基於酵母之免疫療法產品相比程度格外高的抗原表現。包含兩種或兩種以上TB抗原之融合蛋白為用於臨床前產品之有吸引力的候選物,歸因於其在酵母中之強抗原表現以及在單一產品中之寬TB序列表示。
在另一實驗中,酵母(例如釀酒酵母)在銅誘導性促進劑CUP1控制下經工程改造以表現包含三種不同TB抗原之融合蛋白。此蛋白質中之TB抗原在銅誘導性促進劑CUP1控制下形成包含一個低氧池TB抗原(Rv2032)、一個TLR促效劑蛋白質(Rv1411c)及一個鐵積聚抗原(Rv2711)之經稠合以形成單一融合蛋白之單一多肽,該TB抗原融合蛋白具有SEQ ID NO:46之胺基酸序列。包含SEQ ID NO:46且由酵母表現之融合蛋白為單一多肽,其具有在自N端至C端之框架中融合之由SEQ ID NO:48表示的以下序列元件:1)SEQ ID NO:1之N端肽之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置1至6);2)Thr-Ser之兩個胺基酸連接子序列(SEQ ID NO:48之位置7至8);3)SEQ ID NO:22之位置2至331之Rv2032抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置9至338);4)SEQ ID NO:40之Rv1411c抗原之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置339至574);5)SEQ IDS NO:7之Rv2711蛋白質之胺基酸序列(SEQ ID NO:48之位置575至803);及6)六聚組胺酸標籤(SEQ ID NO:48之位置804至809)。Rv2032抗原(SEQ ID NO:22)及Rv1411c抗原(SEQ ID NO:40)中之每一者之上述去活化突變亦包括於此融合蛋白中。由SEQ ID NO:48表示之融合蛋白係藉由重組核酸分子編碼以用於插入具有SEQ ID NO:47之核酸序列之載體中。
以下實例描述對於用於TB之基於酵母的免疫治療劑在受高毒性TB病毒株攻擊的動物模型中之功效的測試。
在此實驗中,上述實例2、實例3及/或實例4中選擇之基於酵母之
免疫治療劑用於測試在鼠TB攻擊模型中之功效。小鼠將用基於酵母之TB免疫療法組合物免疫且隨後用兩種不同的高毒性TB病毒株攻擊,如下:
部分1:首先,使用至少兩個不同的免疫流程,其中一個可與基準BCG方法良好地共同作用,且一個用於其他基於酵母之免疫治療劑(GlobeImmune公司,Louisville,Colorado)之臨床研究,以最佳地增強Th1/Th17軸線。流程1:在兩個或兩個以上位點處用酵母皮下(s.c.)免疫小鼠(實例3中判定之劑量)三次,相隔為一個月,休息10週,攻擊,隨後於其後第30天、第60天及第90天檢定;或流程2:每週皮下免疫小鼠一個月,其後每月一次,且在第二次每月免疫之後第30天、第60天及第90天檢定。
小鼠。購自Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine之不含特異性病原體之雌性、6至8週齡C57BL/6小鼠。將小鼠維持在科羅拉多州立大學(Colorado State University)(CSU)之生物安全III級生物危害設施中,且任意給予無菌水及鼠食。所有實驗協定均需經科羅拉多州立大學之動物照護及使用委員會(Animal Care and Use Committee)批准。在噴霧攻擊之前用所指示之疫苗候選物(亦即,所選擇之基於酵母之免疫治療劑)對動物皮下接種疫苗。對照物小鼠僅注射稀釋劑。隨後使用經校準以將50至100個細菌傳遞入各鼠之肺中的Glas-Col曝露裝置(Terre Haute,IN)藉由低劑量噴霧曝露至結核分枝桿菌(M.tuberculosis)攻擊小鼠。Dr B.Kreiswirth(Public Health Research Institute,New Jersey)善意地提供了臨床W-Beijing病毒株HN878,且Dr K.Eisenach(University of Arkansas)善意地提供了W-Beijing病毒株SA161。在所指示的時間點處之在感染動物(n=5)之肺中的細菌負荷係藉由以下判定:在養分7H11瓊脂上電鍍全器官勻漿之系列稀釋液,且在37℃下在潮濕空氣中培育3週之後計數菌落形成單位。用於
組織學,採集來自各鼠之顱腦肺葉且用4%多聚甲醛固定在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。製備切片且使用蘇木精及曙紅(H & E)染色。
酵母誘發IL-6(Cereda等人,Vaccine(2011)),其為產生Th17及調節CD8+ T細胞活化之主要因素。先前所產生之實驗證據(在此未顯示之資料)表明,藉由增加劑量或降低免疫之間的間隔增加所投與之酵母可增加Th17活性。由於流程2相對於流程1更可能導致增加的Th17活性,追蹤功效以確定其是否與給藥有關。吾人預期,劇烈嚙合Th17路徑為有益的,且因此免疫流程2更有效。然而,若顯性較低之Th17反應提供更大功效,則流程1應執行地更好。
部分2:若由於上述部分1中所執行的實驗發生部分保護,則其他改質以與CD8+ T細胞調節關聯之Th17頻率之增加或降低為目標以確定功效信號是否可藉由「精確調諧」臨界酵母誘發Th17 CD4+ T細胞路徑增強。增強Th17活性之一個方式為增大增加IL-6量之酵母免疫,例如藉由每週免疫進一步調節流程2。在另一實驗中,對動物進行評估以確定降低Th17活性是否改質結果。在此實驗中,用抗IL-6阻斷抗體(研發系統)治療動物。吾人預期,藉由使用此協定,Th17反應將減少且CD8+反應將增強,且因此確定了之對於Th17活性之調節(藉由增加或降低)係如何影響攻擊結果。
部分3:在第三組實驗中,為了輔助對於用基於酵母之免疫療法免疫且用TB攻擊的動物、其中如由上文所描述的檢定經定義之免疫相關資料經追蹤以僅作為免疫之結果的一平行動物組中之T細胞子集之免疫資料之解釋。對於免疫反應之演進的此等資料對選擇在感染動物或隨後經治癒的感染動物中最相關地執行之免疫研究具有價值。此等實驗之一主要焦點識別酵母誘發反應之免疫表現型且使其與感染動物之臨床結果相關,其中吾人預期Th17反應在總功效中為重要的。
以下實例描述測試基於酵母之免疫治療劑在更臨床相關且敏感的天竺鼠攻擊模型中之功效。
天竺鼠模型具有更為臨床相關之超越鼠模型之優勢。為了測試預防活性,天竺鼠已使用實例5中之小鼠之實驗結果所提供的資訊及導引接種疫苗。以2000萬個酵母(皮下)起始給藥,如在實例5中所描述。另外,在此實驗中,向天竺鼠給予BCG初次免疫(BCG prime)以確定BCG係干擾後續酵母免疫、增強後續酵母免疫或對其無效應。此等實驗經設計以模型化已用BCG治療之人類。用BCG對動物接種疫苗(104個桿菌/菌落形成單位,皮下),隨後在十週後用表現TB抗原之酵母(例如,來自實例1或實例4之基於酵母之TB免疫治療劑中之任一者,包括GI-19004或表現低氧池抗原之酵母)接種疫苗。
將不含特異性病原體之白化Hartley品系天竺鼠(Charles River Breeding Laboratories公司,Wilmington,MA)圈養在CSU ABL-III設施中,且用不鏽鋼餵食器任意提供商業食物及自來水。將天竺鼠維持在溫度及濕度經控制的環境中且曝露於12小時亮/暗循環。在大致兩週以馴養之後,稱重各天竺鼠,植入微晶片,且隨後基於平均重量將其指派入特異性組。各動物均植入有個別玻璃囊封應答器(IMI-1000;Bio Medic Data Systems公司,Rockville,MD),該應答器各預程式化有其自身的10數位文字數字編碼且預加載至其自身的無菌針總成中。此等者皮下給予至頸之後頸中。
低劑量噴霧攻擊。對於各噴霧感染,將結核分枝桿菌之特定品系之解凍等分試樣稀釋在無菌水中,總體積至多為20ml(106個CFU/ml)。使用麥迪遜(Madison)感染腔室(University of Wisconsin Machine Shop,Madison,WI)霧化來自各治療組之天竺鼠,起始體積為15ml有效儲備液(噴霧週期:5分鐘;雲衰變週期:10分鐘)。分枝桿菌之所估計的保持力在每天竺鼠25與30 CFU範圍內,如藉由在感
染後五週之後計數原生肺病變所測定(間接),且其已藉由磁共振成像分析直接證實(Kraft等人,Infect Immun 72:5963-71(2004))。
動物監視。在噴霧感染之後,每天觀測動物且使用Karnofsky標度之改良版本評估疼痛及窘迫。此包括任何潛在的重量損失、可移動性、呼吸模式及外周性紫紺。評分為6(或以上)之天竺鼠被認為瀕死的,需要即刻將其安樂死。執行安樂死允許在任何組織自分解之前進行肺組織分析。經由腹膜內注射經由過劑量(每0.25kg體重1ml)戊巴比妥鈉(Sleepaway)人性化地使天竺鼠安樂死。
測定目標器官中之細菌負載。為了測定細菌負載,無菌打開腹腔及胸腔,且將來自個別動物之右肺、引流肺門淋巴結群及脾置放入填充有20ml無菌鹽水之小瓶中。使用手持型組織均質機單獨地均質化個別組織樣品。隨後將組織勻漿之系列稀釋液電鍍至複製Middlebrook 7H11瓊脂板上且在37℃下培育大致21天。平均化來自於來自複製板之適當稀釋象限(亦即,20 CFU<最佳象限CFU計數<200 CFU)之活菌落之數目且將其表示為log10 CFU每一完整右肺。
免疫病理學。用於組織學,用5ml 10%中性緩衝福馬林當場灌注左肺葉且隨後將其置放入30ml固定劑中隔夜。將樣本單獨地嵌入石蠟,自左顱腦肺葉之等效區域(亦即,沿著左主支氣管)以4μm切片分段,且用H&E且藉由Ziehl-Neelsen方法單獨地染色以分別用於組織學及耐酸評估。所用之額外染色為梅森氏(Masson外染色三色染色法(用於血纖維蛋白)及普魯士藍(用於鐵沈積物)。經委員會認證之獸醫病理學家隨後執行盲性審查且根據以下參數對切片評分:受影響的肺之%、等級分、主要病變之數目及相關嚴重程度及最後,次要病變之嚴重程度(Basaraba,2008)。
吾人預期,最高功效將伴隨包括CD8+及Th1/Th17 CD4+ T細胞子集之多子集免疫反應之產生而發生。
在評估曝露後治療之額外實驗中,使天竺鼠感染,十天後,向其皮下給予基於酵母之免疫治療劑產品。亦給予一些動物10至30天之藉由溫緩管飼之TMC207[每天15mg/kg]共同治療。在疫苗接種之後第10天、第30天及第60天執行檢定。
以下實例描述基於酵母之免疫療法在臨床中用於TB之用途。
歸因於與當前多劑方案之非順從或當前多劑方案之無效性,可能已出現MDR TB(經定義為至少對前線藥物異菸肼(isoniazid)及利福平(rifampin)具有抗性)及XDR TB(亦對氟喹諾酮及諸如卷麯黴素(capreomycin)或阿米卡星(amikacin)之至少一種「可注射劑」具有抗性)。首先使用經鑑定為實例1至實例6中所執行的實驗之結果的基於TB酵母之免疫療法產品,加上在具有MDR及XDR TB之個體中之多藥物方案進行經控制的臨床試驗,以得到早期的安全性、免疫原性及治療效用評定。功效端點包括在痰樣品中之分支桿菌清除及完成反應之時間。安全性及免疫學資料亦充當用於在公共緊急曝露情形中作為曝露後預防劑之潛在用途之至關重要的基礎。
除了來自MDR及XDR TB中之治療性試驗之資料之外,亦進行了為了在健康志願者體內產生安全性及免疫原性之臨床項目,來支持實施曝露後疫苗項目,其係出於產生可經部署至涉及MDR TB或XDR TB之事件的第一反應者及受害者之疫苗儲備之目的。該等治療之目標為防止慢性感染之產生且減小傳染性、發病率及死亡率。此策略滿足了即刻公共緊急偶發事故需要且建立了以通用預防劑之形式進一步開發TB酵母免疫療法產品之基礎。凍乾之基於TB酵母的免疫療法產品之有效及可調式製造製程以及較長存放期理想地適合於搶先式儲備策略。
首先,儲備TB酵母免疫療法產品之曝光前預防性用途在已偵測
到經確認的次要情況之公共安全性事件的上下文中使用。疫苗之該等部署將用以限制次級曝露且緩和公共恐慌。另外,TB酵母免疫療法產品用於曝光前預防之進一步發展高度適用於第一反應者或可能曝露於TB之人員。TB酵母免疫療法產品亦適用於與BCG組合以擴增當前疫苗接種程式。
以下實例描述對於稱為GI-19004之基於酵母的免疫治療劑之給藥的初始測試,及對於臨床上相關且敏感的天竺鼠曝露後模型之潛在功效之疫苗接種協定評估及初始評估。
在此使用基於酵母之TB免疫治療劑的用以評估給藥及初步曝露後資料之預備實驗中,使天竺鼠感染結核分枝桿菌病毒株(Midori X004619)之低劑量氣霧劑,且隨後在十天後,每兩週皮下給予天竺鼠GI-19004,其為表現SEQ ID NO:15之「3-鐵」融合蛋白之基於酵母的免疫療法組合物(參見實例1及實例2),給藥三次,繼而評估肺、脾及淋巴結cfu's、組織學及存活率。
特定言之,將不含病原體之雌性Hartley遠親雜交天竺鼠(Charles River Breeding Laboratories公司,Wilmington,MA)圈養在CSU ABL-III設施中,且用不鏽鋼餵食器任意提供商業食物及自來水。將天竺鼠維持在溫度及濕度經控制的環境中且曝露於12小時亮/暗循環。在大致兩週以馴養之後,稱重各天竺鼠,植入微晶片,且隨後基於平均重量將其指派入特異性組。各動物均植入有個別玻璃囊封應答器(IMI-1000;Bio Medic Data Systems公司,Rockville,MD),該應答器各預程式化有其自身的10數位文字數字編碼且預加載至其自身的無菌針總成中。此等者經皮下給予至頸之後頸中。天竺鼠重量範圍為500至550公克。
低劑量噴霧攻擊。對於各噴霧感染,將結核分枝桿菌Midori
X004619之解凍等分試樣稀釋在無菌水中(1.17×107個CFU/ml)。使用麥迪遜感染腔室(University of Wisconsin Machine Shop,Madison,WI)霧化來自各治療組之天竺鼠,起始體積為15ml有效儲備液(噴霧週期:5分鐘;雲衰變週期:10分鐘)。分枝桿菌之所估計的保持力在每天竺鼠25與30 CFU範圍內,如藉由在感染後五週之後計數原生肺病變所測定(間接),且其已藉由磁共振成像分析直接證實(Kraft等人,Infect Immun 72:5963-71(2004))。
用GI-19004基於酵母之免疫治療劑進行疫苗接種。在用Mtb病毒株感染之後10天,將天竺鼠分成四個組(各組指派15隻天竺鼠;組1中之一隻天竺鼠在研究開始之前死亡,且因此彼組以14隻天竺鼠進行)。如下對四個組接種疫苗:組1(未經治療之對照物):皮下投與100μl鹽水;組2(抗原對照物):3 Y.U.稱為「Ovax」或「Oval-Tarm」之對照物酵母免疫治療劑(表現無關對照物抗原卵白蛋白之完全、經加熱殺死之酵母),以分次劑量之形式皮下投與至兩個單獨位點(1.5 Y.U.在100μl中投與至後頸,且1.5 Y.U.在100μl中投與至側腹);組3(低劑量治療):3 Y.U.GI-19004(「3-鐵融合物Tarm(低)」),以分次劑量之形式皮下投與至兩個單獨位點(1.5 Y.U.在100μl中投與至後頸,且1.5 Y.U.在100μl中投與至側腹);或組4(高劑量治療):6 Y.U.GI-19004(「3-鐵融合物Tarm(高)」),以分次劑量之形式皮下投與至兩個單獨位點(3 Y.U.在100μl中投與至後頸,且3 Y.U.在100μl中投與至側腹)。
兩週後(感染後第25天)投與第二次疫苗接種(與上文相同的給藥),繼而在彼之後的兩週(感染後第40天)第三次疫苗接種(與上文相同的給藥)。在感染後第50天,將來自各組之五隻天竺鼠安樂死,且收集肺、脾及淋巴結用於CFU測定及組織學。亦自肺葉分離RNA以藉
由即時PCR評估介白素-17(IL-17)產量。追蹤其餘的動物(組1中9隻且組2、3及4中之每一者中10隻)以追蹤存活率。在第109天終止實驗。
動物監視。在噴霧感染之後,每天觀測動物且使用Karnofsky標度之改良版本評估疼痛及窘迫。此包括任何潛在的重量損失、可移動性、呼吸模式及外周性紫紺。評分為6(或以上)之天竺鼠被認為瀕死的,需要即刻將其安樂死。執行安樂死允許在任何組織自分解之前進行肺組織分析。經由腹膜內注射經由過劑量(每0.25kg體重1ml)戊巴比妥鈉(Sleepaway)人性化地使天竺鼠安樂死。
測定目標器官中之細菌負載。為了測定細菌負載,無菌打開腹腔及胸腔,且將來自個別動物之右肺、引流肺門淋巴結群及脾置放入填充有20ml無菌鹽水之小瓶中。使用手持型組織均質機單獨地均質化個別組織樣品。隨後將組織勻漿之系列稀釋液電鍍至複製Middlebrook 7H11瓊脂板上且在37℃下培育大致21天。平均化來自於來自複製板之適當稀釋象限(亦即,20 CFU<最佳象限CFU計數<200 CFU)之活菌落之數目且將其表示為log10 CFU每一完整右肺。
免疫病理學。用於組織學,用5ml 10%中性緩衝福馬林當場灌注左肺葉片且隨後將其置放入30ml固定劑中隔夜。將樣本單獨地嵌入石蠟,自左顱腦肺葉之等效區域(亦即,沿著左主支氣管)以4μm切片分段,且用H&E且藉由Ziehl-Neelsen方法單獨地染色以分別用於組織學及耐酸評估。所用之額外染色為梅森氏三色染色法(用於血纖維蛋白)及普魯士藍(用於鐵沈積物)。
RNA即時PCR分析。在RNA溶解溶液中均質化肺組織,且根據標準程序製備RNA及cDNA。藉由即時PCR評估IL17A mRNA等級,且將結果校正至相同樣品中之管家基因(GAPDH)之等級。
結果。此實驗為預備實驗,其用以評估初始酵母免疫治療劑給藥及在感染後的天竺鼠模型中對於結核病之潛在功效,且僅在單一時
間點處評估細菌負載及組織學。儘管來自經檢查之所有目標器官中之第50天細菌負載評估之結果均不為統計學上顯著的,但較低劑量之GI-19004(「3-鐵Tarm Low」)與鹽水對照物(未顯示之資料)相比在肺(初始感染之器官)中似乎顯示朝向較低CFU之趨勢。在脾及淋巴結中之結果對於較低或較高劑量GI-19004(未顯示之資料)均未顯示此趨勢。存活率在此預備試驗(未顯示之資料)中之組中為不可識別的,且因此研究在第109天提早終止。進一步給藥及免疫最佳化將如下文所論述執行。來自針對IL-17之RNA分析之結果在此申請時為不可用的。
倘若GI-19004不以通常為治療性疫苗之焦點的免疫顯性抗原為目標,而代替地以包括以結核分枝桿菌感染進展之形式出現的彼等者之潛伏抗原為目標,則預期GI-19004對減小、減緩或阻止次要病變形成(而非藉由減小主要病變)為最有益的。改善或延遲次要病變形成之一個目標為將存活率延長至足夠長以允許抗菌化學治療劑對感染進行控制。然而,此初始研究未經設計以全面評估此等參數且被提早終止;因此,結果視為初步的且主要適用於評估額外給藥及協定最佳化。儘管如此,來自肺cfu中之低劑量GI-19004之結果可視為令人鼓舞的。未來的實驗將在多個時間點處研究CFU資料及組織學,以便追蹤基於酵母之TB免疫療法對於多種活體內參數之影響,包括次要病變形成之減少或減緩、淋巴結感染之傳播之減少及引發抵抗最相關的TB病毒株之持久的保護免疫性之能力。在額外實驗中,經委員會認證之獸醫病理學家隨後執行盲性審查且根據以下參數(非可用之資料)對切片評分:受影響的肺之%、等級分、主要病變之數目及相關嚴重程度及最後,次要病變之嚴重程度(Basaraba,2008)。
綜合而言,在實例2及實例8中之結果顯示,稱為GI-19004之基於酵母之TB免疫治療劑為活體內免疫原性,且可在一些劑量下對肺細
菌負載具有影響。未來的研究將集中在由GI-19004及其他基於酵母之免疫治療劑活體內產生之免疫反應之類型及品質上,且集中在此等組合物之以下能力上:(i)減小或改善次要結核病病變之形成或嚴重程度,(ii)減小結核分枝桿菌向淋巴結及其他器官之傳播,(iii)延長經感染之個體的存活率,(iv)提供抵抗結核分枝桿菌感染之持久免疫性,及(v)增強其他用於治療感染的藥物之功效。
以下實例描述在鼠TB攻擊模型中對於表現稱為Ag85A之結核分枝桿菌抗原之基於酵母的免疫治療劑之初始測試。
在此預備實驗中,在實例4中描述之表現來自TB Ag85a蛋白質(SEQ ID NO:37)之抗原的基於酵母的免疫治療劑用於鼠TB攻擊模型。簡言之,用基於酵母之Ag85A免疫療法組合物(在此實例中指代為「Tarm-Ag85A」)每三週免疫小鼠,給藥三次,且隨後用高毒性結核分枝桿菌病毒株Midori X004619攻擊。
更特定言之,將不含病原體之雌性、6至8週齡C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)維持在科羅拉多州立大學(CSU)之生物安全III級生物危害設施中,且任意給予無菌水及鼠食。將小鼠分成五個組(組1中20隻小鼠,且組2至組5中之每一者中17隻小鼠)。對五個組免疫三次,免疫以相隔三週間隔,如下:
組1(未經治療之對照物):用100μl鹽水皮下假免疫;
組2(BCG對照物):用以100μl經皮下傳遞之106個BCG免疫;
組3(Ag85對照物):用以100μl經肌肉內傳遞之0.5μg重組Ag85(IDRI)免疫;
組4(治療組):用4 Y.U.表現稱為「Tarm-Ag85A」之Ag85A的酵母免疫治療劑免疫,以分次劑量之形式皮下投與至四個單獨位點(1 Y.U.在100μl中投與至內右大腿;1 Y.U.在100μl中投與至內左大腿;
1 Y.U.在100μl中投與至內右肩胛骨;且1 Y.U.在100μl中投與至內左肩胛骨)。
組5(抗原對照物):用4 Y.U.稱為「Ovax」或「Tarm-Oval」之對照物酵母免疫治療劑(表現無關對照物抗原卵白蛋白之完全、經加熱殺死之酵母),以分次劑量之形式皮下投與至四個單獨位點(1 Y.U.在100μl中投與至內右大腿;1 Y.U.在100μl中投與至內左大腿;1 Y.U.在100μl中投與至內右肩胛骨;且1 Y.U.在100μl中投與至內左肩胛骨)。
在第三次及最終免疫之後六週,將來自各組之兩隻小鼠人性化地安樂死。收集肺及脾,且用IDRI重組Ag85A刺激細胞。藉由ELISA及藉由即時PCR評估細胞之IFN-γ產量。
隨後使用經校準以將50至100個細菌傳遞入各鼠之肺中的Glas-Col曝露裝置(Terre Haute,IN)藉由低劑量噴霧曝露至結核分枝桿菌病毒株Midori X004619感染亦在第三次及最終免疫之後休息六週的其餘小鼠。在曝露後第1天(僅組1鹽水對照物);第15天(所有五個組);第30天(所有五個組)及第49天(所有五個組)人性化地將小鼠之子組安樂死,且收集肺及脾用於CFU評估。亦收集肺用於組織學、即時PCR分析(細胞激素)及流動式細胞量測術(評估CD4-CD44、62L、IL-17及Ly6A表現;IFN-γ表現;及Foxp3+細胞)。
在所指示的時間點處之在感染動物之肺中的細菌負荷係藉由以下判定:在養分7H11瓊脂上電鍍全器官勻漿之系列稀釋液,且在37℃下在潮濕空氣中培育3週之後計數菌落形成單位。用於組織學,採集來自各鼠之顱腦肺葉片且用4%多聚甲醛固定在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。製備切片且使用蘇木精及曙紅(H & E)染色。
結果在此申請時為不可用的,但吾人預期用Tarm-Ag85A免疫之小鼠將至少顯示朝向與鹽水對照物小鼠相比較低的肺CFU、與鹽水對
照物小鼠相比改良的組織學之指示及/或針對結核病抗原之IFN-γ產量及Th17型免疫反應之發展的趨勢。此等實驗之主要焦點識別酵母誘發反應之免疫表現型且使其與經感染動物之臨床結果相關,其中吾人預期,Th17反應之誘發及Th17及Th1反應之相對量值為決定基於酵母之TB免疫治療劑之總功效之重要因素。
以下實例描述在用於TB之鼠模型中之加強免疫(prime-boost)協定中測試基於酵母之免疫治療劑對TB之作用。
在此實驗中,稱為GI-19004之基於酵母的免疫治療劑,其為表現SEQ ID NO:15之「3-鐵」融合蛋白之基於酵母的免疫療法組合物(參見實例1及實例2),係用於鼠TB攻擊模型(使用適合於彼動物模型且如本文中所描述之其他實例所確定或使用之給藥,類似的設計可容易地經調適以用於天竺鼠)。在額外實驗中,在實質上類似的協定中設計,使用表現不同抗原之基於酵母的TB免疫治療劑,該等抗原諸如低氧池抗原或低氧池抗原、鐵積聚抗原及TLR促效劑抗原之組合,所有均描述於實例4中。
簡言之,小鼠首先用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin)(BCG)疫苗免疫,繼而每三週用基於酵母之GI-19004免疫療法組合物免疫,給藥三次,繼而用高毒性結核分枝桿菌病毒株Midori X004619攻擊。
更特定言之,將不含病原體之雌性、6至8週齡C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine)維持在科羅拉多州立大學(CSU)之生物安全III級生物危害設施中,且任意給予無菌水及鼠食。將小鼠分組且如下對其免疫:
組1(未經治療之對照物):用100μl鹽水皮下假免疫;
組2(僅BCG對照物):用以100μl經皮下傳遞之106個BCG免疫一次;
組3(治療組):用以100μl經皮下傳遞之106個BCG免疫;隨後,10週後,用具有4 Y.U.與10 Y.U.之間的GI-19004(「3-鐵融合物Tarm」)之第一輔助劑,以分次劑量之形式皮下投與至四個單獨位點((例如,在總共4 Y.U.下:1 Y.U.在100μl中投與至內右大腿;1 Y.U.在100μl中投與至內左大腿;1 Y.U.在100μl中投與至內右肩胛骨;且1 Y.U.在100μl中投與至內左肩胛骨)。在第一輔助劑之後2、3或4週投與用GI-19004(與上文相同之給藥)之第二次免疫,在第二輔助劑之後2、3或4週投與用GI-19004(與上文相同之給藥)之第三次免疫。
組5(抗原對照物):用106個BCG以100μl皮下傳遞免疫;隨後,10週後,用具有4 Y.U.與10 Y.U.之間的對照物酵母免疫治療劑(稱為「Ovax」或「Tarm-Oval」)(表現無關對照物抗原卵白蛋白之完全、經加熱殺死之酵母)之第一輔助劑,以分次劑量之形式皮下投與至四個單獨位點((例如,在總共4 Y.U.下:1 Y.U.在100μl中投與至內右大腿;1 Y.U.在100μl中投與至內左大腿;1 Y.U.在100μl中投與至內右肩胛骨;且1 Y.U.在100μl中投與至內左肩胛骨)。在第一輔助劑之後2、3或4週投與用Tarm-Oval(與上文相同之給藥)之第二次免疫,在第二輔助劑之後2、3或4週投與用Tarm-Oval(與上文相同之給藥)之第三次免疫。
在伴隨基於酵母之免疫療法的第三次及最終輔助劑之後的6至8週之間,人性化地將來自各組之幾隻小鼠安樂死。收集肺及脾且用重組抗原刺激細胞以用於活體外分析。藉由ELISA且藉由即時PCR評估細胞之IFN-γ產量。
隨後使用經校準以將50至100個細菌傳遞入各鼠之肺中的Glas-Col曝露裝置(Terre Haute,IN)藉由低劑量噴霧曝露至結核分枝桿菌病毒株(例如,Midori X004619)感染亦在第三次及最終免疫之後休息6至8週的其餘小鼠。在曝露後第1天(僅組1鹽水對照物);第15天(所有
組);第30天(所有組)及第49天(所有組)人性化地將小鼠之子組安樂死,且收集肺及脾用於CFU評估。亦收集肺用於組織學、即時PCR分析(細胞激素)及流動式細胞量測術(評估CD4-CD44、62L、IL-17及Ly6A表現;IFN-γ表現;及Foxp3+細胞)。在所指示的時間點處之在感染動物之肺中的細菌負荷係藉由以下判定:在養分7H11瓊脂上電鍍全器官勻漿之系列稀釋液,且在37℃下在潮濕空氣中培育3週之後計數菌落形成單位。為了組織學,採集來自各鼠之顱腦肺葉片且用4%多聚甲醛固定在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。製備切片且使用蘇木精及曙紅(H & E)染色。
吾人預期,用BCG免疫且用GI-19004增強之小鼠將顯示與鹽水對照物小鼠相比較低的肺CFU、與鹽水對照物小鼠相比改良的組織學之指示及/或針對結核病抗原之IFN-γ產量及Th17型免疫反應之發展。吾人亦預期,GI-19004將顯示與僅BCG免疫相比改良的針對結核病感染之免疫性及/或保護。
雖然已對本發明之各種實施例進行詳細描述,但顯而易見,熟習此項技術者將會想到彼等實施例之改良及修改。然而,應明確地理解,該等改良及修改係在本發明範疇內,如在以下申請專利範圍中所闡述。
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<223> 合成肽
<400> 1
<210> 2
<211> 89
<212> PRT
<213> 釀酒酵母
<400> 2
<210> 3
<211> 89
<212> PRT
<213> 釀酒酵母
<400> 3
<210> 4
<211> 129
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 4
<210> 5
<211> 452
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(444)
<400> 5
<210> 6
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 6
<210> 7
<211> 229
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 7
<210> 8
<211> 752
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(744)
<400> 8
<210> 9
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 9
<210> 10
<211> 147
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 10
<210> 11
<211> 506
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(498)
<400> 11
<210> 12
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
<210> 13
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<400> 13
<210> 14
<211> 1580
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(1572)
<400> 14
<210> 15
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 15
<210> 16
<211> 94
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 16
<210> 17
<211> 347
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (13)..(339)
<400> 17
<210> 18
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 18
<210> 19
<211> 94
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 19
<210> 20
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(324)
<400> 20
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 21
<210> 22
<211> 331
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 22
<210> 23
<211> 1035
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1035)
<400> 23
<210> 24
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 24
<210> 25
<211> 463
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 25
<210> 26
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1431)
<400> 26
<210> 27
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 27
<210> 28
<211> 181
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 28
<210> 29
<211> 570
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(570)
<400> 29
<210> 30
<211> 189
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 30
<210> 31
<211> 1060
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 31
<210> 32
<211> 3225
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3225)
<400> 32
<210> 33
<211> 1074
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 33
<210> 34
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 34
<210> 35
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1560)
<400> 35
<210> 36
<211> 519
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 36
<210> 37
<211> 337
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 37
<210> 38
<211> 1056
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1056)
<400> 38
<210> 39
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 39
<210> 40
<211> 236
<212> PRT
<213> 結核分支桿菌
<400> 40
<210> 41
<211> 753
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(753)
<400> 41
<210> 42
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 42
<210> 43
<211> 695
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 43
<210> 44
<211> 2130
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2130)
<400> 44
<210> 45
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 45
<210> 46
<211> 795
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 46
<210> 47
<211> 2430
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2430)
<400> 47
<210> 48
<211> 809
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
Claims (68)
- 一種免疫治療組合物,其包含:a)酵母媒介物;及b)包含至少一種TB抗原之融合蛋白,其中該至少一種TB抗原係來自選自以下之TB蛋白質:Rv0125、Rv1196、Rv1411(Rv1411c)、Rv1738、Rv1813、Rv1909(Rv1909c)、Rv2032、Rv2359、Rv2608、Rv2660、Rv2711、Rv3130、Rv3619、Rv3620、Rv3841、Ag85A、Ag85B、TB10.4及ESAT-6。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv1738、Rv2032、Rv3130或Rv3841中之一或多者的TB抗原。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv1738、Rv2032、Rv3130或Rv3841中之兩者或兩者以上的TB抗原。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv1738、Rv2032、Rv3130及Rv3841中之每一者的TB抗原。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711或Rv1909c中之一或多者的TB抗原。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711及Rv1909c中之兩者或兩者以上的TB抗原。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711及Rv1909c中之每一者的TB抗原。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv2359、Rv2711或Rv1909c中之至少一者的TB抗原,及來自Rv1738、Rv2032、Rv3130及Rv3841中之至少一者或多者的TB抗原。
- 如請求項2至8中任一項之免疫治療組合物,其中該融合蛋白進一步包含來自Rv1411c之TB抗原。
- 如請求項1之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含來自Rv2032、Rv1411c及Rv2359中之每一者的TB抗原。
- 一種免疫治療組合物,其包含:a)酵母媒介物;及b)包含TB抗原之融合蛋白,其中該等TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少80%一致的胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項11之免疫治療組合物,其中該等TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項11之免疫治療組合物,其中該等TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項11之免疫治療組合物,其中該等TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項11之免疫治療組合物,其中該等TB抗原包含與選自以下之胺基酸序列至少99%一致的胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項11之免疫治療組合物,其中該等TB抗原包含選自以下之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項11至16中任一項之免疫治療組合物,其中該TB抗原包含SEQ ID NO:13之胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項11至16中任一項之免疫治療組合物,其中該TB抗原包含SEQ ID NO:31之胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項11至16中任一項之免疫治療組合物,其中該TB抗原包含SEQ ID NO:43之胺基酸序列或由其組成。
- 如請求項11至16中任一項之免疫治療組合物,其中該融合蛋白具有選自以下之胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48。
- 如請求項11至16中任一項之免疫治療組合物,其中該融合蛋白具有SEQ ID NO:15之胺基酸序列。
- 如請求項11至16中任一項之免疫治療組合物,其中該融合蛋白具有SEQ ID NO:33之胺基酸序列。
- 如請求項11至16中任一項之免疫治療組合物,其中該融合蛋白具有SEQ ID NO:45之胺基酸序列。
- 如請求項1至23中任一項之免疫治療組合物,其中該酵母媒介物為完全酵母。
- 如請求項1至23中任一項之免疫治療組合物,其中該酵母媒介物為完全、經殺死或不活化酵母。
- 如請求項1至23中任一項之免疫治療組合物,其中該酵母媒介物為完全、熱不活化酵母。
- 如請求項1至26中任一項之免疫治療組合物,其中該酵母係來自選自由以下組成之群的酵母屬:酵母菌屬(Saccharomyces)、假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、漢森酵母屬(Hansenula)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)及耶氏酵母屬(Yarrowia)。
- 如請求項1至26中任一項之免疫治療組合物,其中該酵母係來自酵母菌屬。
- 如請求項1至28中任一項之免疫治療組合物,其中該酵母係來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
- 如請求項1至29中任一項之免疫治療組合物,其中該組合物係在適於藉由注射投與個體之醫藥學上可接受之賦形劑中調配。
- 一種免疫治療組合物,其包含:a)來自釀酒酵母之完全、熱不活化酵母;及b)由該酵母表現之TB融合蛋白,其中該融合蛋白包含選自以下之胺基酸序列或由其組成:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48。
- 如請求項31之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含SEQ ID NO:15。
- 如請求項31之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含SEQ ID NO:33。
- 如請求項31之免疫治療組合物,其中該融合蛋白包含SEQ ID NO:45。
- 一種包含TB抗原之融合蛋白,其中該等TB抗原包含與以下胺基酸序列至少80%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項35之融合蛋白,其中該等TB抗原包含與以下胺基酸序列至少85%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項35之融合蛋白,其中該等TB抗原包含與以下胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項35之融合蛋白,其中該等TB抗原包含與以下胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項35之融合蛋白,其中該等TB抗原包含選自以下之胺基酸序列:SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:46。
- 如請求項35之融合蛋白,其中該融合蛋白包含選自以下之胺基酸序列:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:48。
- 一種重組核酸分子,其包含編碼如請求項35至40中任一項之融合蛋白的核酸序列。
- 一種經分離之重組細胞,其經如請求項41之重組核酸分子轉染。
- 如請求項42之經分離之重組細胞,其中該細胞為酵母細胞。
- 一種組合物,其包含如請求項42或請求項43之經分離之重組細胞。
- 一種治療個體之結核病(TB)感染或至少一種由TB感染引起之症狀的方法,其包含向已感染TB之個體投與至少一種如請求項1至34中任一項之免疫治療組合物,其中向該個體投與該組合物降低該個體之TB感染或至少一種由TB感染引起之症狀。
- 如請求項45之方法,其進一步包含向該個體投與一或多種其他適用於治療或改善TB感染之症狀的藥劑。
- 如請求項46之方法,其中該藥劑為化學治療藥物或抗生素。
- 如請求項46之方法,其中該藥劑係選自異菸肼(isoniazid)(INH)、利福平(rifampin)(RIF)、利福噴丁(rifapentine)(RPT)、乙胺丁醇(ethambutol)(EMB)、吡嗪醯胺(pyrazinamide)(PZA)及BCG疫苗。
- 如請求項46之方法,其中該藥劑為BCG疫苗,且其中該藥劑係在該免疫治療組合物投藥之前投與。
- 如請求項45至49中任一項之方法,其中該個體患有潛伏性TB感染。
- 如請求項45至49中任一項之方法,其中該個體患有活動性TB感染。
- 如請求項45至51中任一項之方法,其中向該個體投與該組合物可有效地增強適用於治療或改善TB感染症狀的藥劑的功效。
- 如請求項45至51中任一項之方法,其中與不存在該組合物相比,向該個體投與該組合物可降低或延緩該個體之肺部中繼發 性結核病病灶之形成。
- 如請求項45至51中任一項之方法,其中與不存在該組合物相比,向該個體投與該組合物可降低或延緩該TB感染傳播至淋巴結。
- 如請求項45至51中任一項之方法,其中向該個體投與該組合物可引發對抗一或多種TB抗原之抗原特異性細胞免疫反應。
- 一種治療已暴露於引起TB之生物體的個體或個體群體之方法,其包含投與該個體或個體群體至少一種如請求項1至34中任一項之免疫治療組合物。
- 如請求項56之方法,其進一步包含投與該個體或個體群體一或多種其他適用於治療或改善TB感染之症狀的藥劑。
- 如請求項57之方法,其中該藥劑為化學治療藥物或抗生素。
- 如請求項57之方法,其中該藥劑係選自異菸肼(INH)、利福平(RIF)、利福噴丁(RPT)、乙胺丁醇(EMB)、吡嗪醯胺(PZA)及BCG疫苗。
- 一種預防或延緩個體TB感染之發作或嚴重度的方法,其包含向未感染TB之個體投與至少一種如請求項1至34中任一項之組合物。
- 一種使個體群體針對TB免疫之方法,其包含投與該個體群體至少一種如請求項1至34中任一項之組合物。
- 如請求項61之方法,其進一步包含向該個體群體投與BCG疫苗。
- 如請求項45至62中任一項之方法,其中該免疫治療組合物係以1 Y.U.與80 Y.U.之間的劑量投與。
- 如請求項45至62中任一項之方法,其中該免疫治療組合物係藉由皮下注射投與。
- 如請求項1至34中任一項之組合物,其係用於治療TB感染或其症 狀。
- 如請求項1至34中任一項之組合物,其係用於預防TB感染或其症狀。
- 一種如請求項1至34中任一項之組合物之用途,其係用於製備用以治療TB感染之藥劑。
- 一種如請求項1至34中任一項之組合物之用途,其係用於製備用以預防TB感染之藥劑。
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