TW201413244A - 聚合半抗原成為免疫原的技術方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係為將不具免疫原性之半抗原(hapten)直接聚合成為免疫原(immunogen)，並用於使動物產生對應抗體的技術方法。在半抗原分子含有胺基(NH2)及/或羧基(COOH)之化學結構的情況下，可利用特定的交聯劑將半抗原聚合成為大分子，並用作為免疫原注射於動物體內以產生標的抗體。

Description

聚合半抗原成為免疫原的技術方法
本發明係關於一種將半抗原直接聚合形成免疫原之方法，尤指一種將半抗原聚合成分子量係為4000 Da以上之大分子，以形成免疫原之方法。
免疫分析技術因其靈敏度高、專一性佳、省時、成本效益良好、以及操作方便等優點，故常被應用於醫學檢驗、食品檢測及環境檢測等用途。在該技術中，可專一辨識標的物之抗體為核心成分，能否生產該抗體分子即為成功發展免疫分析技術的首要步驟。然而，許多檢測標的物之分子量過小，無法直接激發動物體內產生抗體的免疫反應，故不具免疫原性(immunogenecity)，而被稱為半抗原(hapten)。為了使動物體內產生能夠辨識半抗原的抗體，目前學界及業界多藉化學方法將半抗原與載體蛋白分子(carrier protein)進行連結，形成半抗原-載體蛋白複合物(hapten-carrier protein complex)，期盼透過載體蛋白的免疫原性，併聯激活動物的免疫系統以產生辨識半抗原的抗體。然而此一策略仍有諸多限制，包括需選擇特定的載體蛋白、需考量半抗原與載體蛋白的鍵結方式及鍵結距離等因素，故不盡然能成功產生標的抗體；或者，即便動物已被併聯激活能表現可辨識半抗原的抗體，但該抗體也僅佔動物所生成抗體的些許部分，因而標的抗體之生成效率欠 佳，也造成後續抗體分離與純化的困難，進而升高標的抗體之生產成本。
以三聚氰胺(melamine)為例，由於其分子量僅有126 Da，並無法直接用來免疫注射動物以產生對應抗體；因而現行生產三聚氰胺抗體的研究，都是先將三聚氰胺進行化學修飾以增添額外的官能基，再將之與特定的載體蛋白進行連結，以作為免疫注射的免疫原。此一產生免疫原的步驟不僅過程繁瑣、耗時冗長、且需有專業訓練的操作人員，因此不能被輕易達成或推廣普及；此外，以此種免疫原所誘導產生的抗體，也多數是辨識載體蛋白，若有併聯誘發成功的話，則僅有少許抗體會針對修飾過的三聚氰胺，因此標的抗體的生產效能上仍有很大的改進空間。
為了使動物能針對標的半抗原產生專一性的抗體，本發明乃將不具免疫原性的半抗原直接聚合形成大分子的免疫原，如此不僅簡化將半抗原轉化為免疫原的步驟，更可因免除載體蛋白的參與而顯著提升生產標的抗體之效能。
本發明之主要目的係在提供一種將半抗原直接聚合形成免疫原之方法，其步驟包括：(A)提供含半抗原之反應溶液，其中半抗原係為含有兩個或兩個以上胺基之化學物質、含有兩個或兩個以上羧基之化學物質、或含有一個或一個以上胺基以及含有一個或一個以上羧基之化學物質；(B)加入交聯劑至含半抗原之反應溶液；以及(C)進行聚合反應得到免疫原。
步驟(C)中，當半抗原係為該含有兩個或兩個以上胺基之化學物質時，交聯劑係包含二醛類、多醛類、雙羧酸類、或多羧酸類；當半抗原係為該含有兩個或兩個以上羧基之化學物質時，交聯劑係包含二醇類、多醇類、雙胺類、或多胺類；當半抗原係為該含有一個或一個以上胺基以及含有一個或一個以上羧基之化學物質時，交聯劑係包含1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimide(EDC)，或彼此以羧基胺基脫水聯結。
此外，步驟(A)中，該含半抗原之反應溶液的濃度係為1×10-10 mM以上，其中又以1×10-10 mM至半抗原可溶解之最大飽和濃度為較佳。而步驟(B)中，該交聯劑之濃度係為1×10-10 mM以上，其中又以1×10-10 mM至交聯劑的最大濃度為較佳，又以125 mM至300 mM為更佳。
反應溫度對於半抗原之聚合反應有顯著的影響，步驟(C)中的聚合反應溫度係半抗原可承受之溫度範圍，較佳為37℃至80℃之溫度條件。
本發明中一較佳實施例，係將不具免疫原性的三聚氰胺半抗原直接聚合成為免疫原，並用以注射於動物體內，使動物產生標的抗體之技術方法。三聚氰胺具有三個胺基，利用交聯劑戊二醛進行連結反應，可將小分子之三聚氰胺聚合成為大分子的聚合物，該聚合反應如下圖所示。
其中，三聚氰胺之反應溶液之濃度係為1×10-10 mM至24 mM，較佳係為1×10-7 mM至20 mM；而作為交聯劑之戊二醛之濃度係為1×10-10 mM至300 mM，較佳為1×10-7 mM至300 mM，又以125 mM至250 mM為更佳。該聚合反應溫度係為0℃以上，又以4℃至80℃為較佳。
更詳細之反應條件如下所述。取0.9 mL濃度為20 mM之三聚氰胺溶液與0.1 mL濃度為2.5 M之戊二醛混合，於37℃下聚合反應三天後，可於液相中觀察到白色沉澱顆粒，利用膠體滲透層析儀(Gel Permation Chromatography，GPC)進行檢測，可知該沉澱顆粒的平均分子量係17,842 Da，最低10%之分子量平均值係為4,067 Da，最高10%之分子量平均值係為75,483 Da，是以證明上述的聚合反應已將三聚氰 胺轉型成大分子，並克服免疫原之分子量至少需大於4,000 Da的限制。
以本發明所製成之三聚氰胺聚合物為免疫原，對實驗動物進行系列的免疫注射，之後，取其血清分析是否含有對應三聚氰胺聚合物的抗體，結果發現本發明聚合而成之免疫原能成功引發動物體的免疫反應，並產生標的抗體，若將此抗體藉酵素免疫分析法來檢測三聚氰胺，其最低檢測濃度係達1.8 ppb。
本發明之方法顯示，如果小分子的胜肽、蛋白、激素、酵素、藥物、及毒物等物質存有胺基或羧基等結構，皆有可能利用交聯劑讓其彼此間聚合連接，使這些半抗原轉型成為免疫原，將其注入動物體內後可引發產生對應抗體的免疫反應，而此生成之抗體則可針對標的物質來發展免疫檢測方法或相關的免疫檢測產品。
實施例1 <聚合反應>
取2.52 mg之三聚氰胺，溶解於1 mL之水中，形成濃度為20 mM之三聚氰胺溶液，取0.9 mL該三聚氰胺溶液，與0.1 mL之戊二醛(2.5M)混合，並保存於37℃環境中，3天之後可由肉眼觀察到三聚氰胺聚合之白色顆粒沉澱物，而第7天達到最大聚合程度。
<聚合比例分析>
取20μL上述完成聚合反應之溶液，加入於G-10管柱中，以水為移動相(mobile phase)，沖提的流速控制為1 mL/2.5分鐘，並且每2.5分鐘收集一管沖洗液，隨後測定各管收集樣品對紫外光(214 nm)的吸光值；另外，也分別取20 μL之18 mM三聚氰胺及20 μL之250 mM之戊二醛加入於G-10管柱中，並以與前述相同的條件，進行移動相沖提與紫外光吸光值測定的操作。三組樣品的實驗結果如圖1，分析該結果可估計約有72.1%的三聚氰胺已被聚合形成大分子聚合物。
<三聚氰胺聚合物的分子大小分析>
將完成聚合反應之三聚氰胺樣品進行離心(10,000 g，10分鐘)及清水沖洗步驟共兩次，再以0.5 mL之富馬酸二甲酯(Dimethyl fumarate，DMF)回溶沉澱物，隨後將其注入膠體滲透層析儀以進行分析，分析實驗的條件如下：層析管柱為Jordi gel DVB(Polydivinylbenzene)管柱；移動相係0.3%的溴化鋰溶液(溶於DMF)，流速為1 mL/分鐘。分析之結果顯示聚合產物的平均分子量為17,842 Da，最低10%之分子量平均值係為4,067 Da，最高10%之分子量平均值係為75,483 Da，是以該聚合產物已超過免疫原分子量需大於4,000 Da之限制，可被直接使用於動物的免疫激活注射。
實施例2~9
實施例2~9係為於不同作用條件下，將三聚氰胺進行聚合反應之結果；其中「反應時間」係指產生肉眼可見顆粒沉澱物所需的時間。
由實施例1~3可比較溫度對三聚氰胺聚合反應的影響：隨著反應溫度的提升，產生肉眼可見顆粒沉澱物所需的時間愈短。圖2則係對實施例1~3的反應溶液，於進行聚合反應期間，測定其對波長600 nm之吸光值的變化情形，由於聚合反應的程度愈高，溶液愈混濁，溶液的600 nm吸光值亦隨之增大，故該吸光值的大小可表徵反應溶液的混濁情形，及做為判定三聚氰胺聚合程度的指標；由圖2的結果可知，加入18 mM之三聚氰胺與250 mM之戊二醛的反應溶液，其於37℃下(實施例1)約可於第7天達到最大聚合程度，若於24℃的條件下(實施例2)，則約於第10天才可達最大聚合程度，若是於4℃條件下(實施例3)行交聯反應，第10天起始能產生肉眼可見顆粒沉澱物，於21天之後也僅能達到實施例1同時期最大聚合程度的67%。實施例4~9的樣品雖未於聚合反應期間進行600 nm之吸光值測定，但卻可容易地以肉眼觀察到原本澄清的溶液發生混濁現象，故也顯示實施例4~9確有聚合反應發生。上述的結果證明溫度對於以 戊二醛為交聯劑之三聚氰胺聚合反應會有顯著影響：在本發明所測試的溫度範圍內，溫度越高越有利於加速聚合反應的進行。
實施例10
將實施例1所製備之三聚氰胺聚合樣品混合均勻，依注射動物種類的不同而取用不同的劑量(小鼠取用0.143 mL；兔子取用0.43 mL)，隨後進行離心(10,000g，10分鐘)、倒棄上層液、再加水清洗底部的白色顆粒沉澱物，重複此離心與清洗的步驟共3次，最後收集到的白色顆粒沉澱物，即為本發明指稱的免疫原。
將上述製備的免疫原加水至體積為0.5 mL，再加入0.5 mL佛蘭氏完全佐劑(complete Freund's Adjuvant,cFA)，經充分乳化後對動物進行第一次注射(小鼠：皮下注射0.1 mL×6，腹腔注射0.2 mL×2；兔子：皮下注射0.1 mL×6，肌肉注射0.2 mL×2)。經過28天後，取第一次注射的免疫原量加水至0.5 mL，再加入0.5 mL佛蘭氏不完全佐劑(incomplete Freund's Adjuvant,iFA)，乳化完成後對動物進行第二次注射(小鼠：皮下注射0.1 mL×6，腹腔注射0.2 mL×2；兔子：皮下注射0.1 mL×6，肌肉注射0.2 mL×2)。再經過14天後，取第一次注射的免疫原量加水至體積為1 mL，並對動物進行第三次注射(小鼠：皮下注射0.1 mL×6，腹腔注射0.2 mL×2；兔子：皮下注射0.1 mL×6，肌肉注射0.2 mL×2)。於第三次注射後的第3 天，抽取動物血液並分離血清，再將血清稀釋200倍以作為進行檢測分析時的一級抗體樣品。
<三聚氰胺的酵素免疫分析>
將三聚氰胺溶液進行系列稀釋之後，分別加入戊二醛溶液，使各樣品的三聚氰胺最終濃度分別為1800 ppm、180 ppm、18 ppm、1.8 ppm、180 ppb、18 ppb、1.8 ppb、0.18 ppb、及0.018 ppb，而戊二醛之最終濃度則皆為250 mM；另外，也準備僅含250 mM之戊二醛溶液，以作為對照組；上述溶液於70℃條件下作用4小時後，各自取出10 μL與990 μL二次水混合，即為待測的三聚氰胺樣品。
於含有200 μL待測樣品的微量離心管中，加入50 μL 1級抗體，經於室溫下反應1小時後，進行離心(12,000g，20分鐘)、倒棄上層液、加水清洗的過程共2次。隨後，依照1級抗體之不同而於各管中加入50 μL不同的2級抗體：如1級抗體為小鼠血清時，則2級抗體為與鹼性磷酸酶連結的兔對鼠抗體(rabbit anti-mouse IgG-alkaline phosphatase；Sigma A4312)；如1級抗體為兔血清時，則2級抗體為與鹼性磷酸酶連結的羊對兔抗體(goat anti-rabbit IgG-alkaline phosphatase；Sigma A3687)。上述樣品於室溫下反應1小時後，再次進行離心(12,000g，20分鐘)、倒棄上層液、與加水清洗的過程共2次，隨後以50 μL二次水回溶沉澱物，並加入於酵素免疫分析盤(ELISA plate)的樣品孔中，之後即可於各孔中加入50 μL之硝基苯磷酸二鈉(p-Nitrophenyl Phosphate；Sigma S0942)溶液(0.6 mg/mL於基底溶液中)， 並於室溫下進行3小時的呈色反應，最後以酵素免疫分析儀(ELISA reader)測讀各樣品孔的吸光值(405-490 nm)，並以Student’s t test進行統計(n=4，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001)。測讀及統計的結果如圖3所示，注射本發明生產之三聚氰胺聚合物的小鼠或兔子，其抗血清可有效辨識三聚氰胺，並且檢測的最小濃度可達1.8 ppb，而未注射免疫原的小鼠或兔子，其血清則不會與三聚氰胺作用，此一結果顯示本發明之聚合製備方法能將半抗原轉型為免疫原，而該免疫原則可有效引起動物生產標的抗體之免疫反應。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
圖1係本發明實施例1之三聚氰胺聚合比例分析圖。
圖2係本發明實施例1-3之溫度影響三聚氰胺聚合程度分析圖。
圖3係本發明實施例10之酵素免疫分析的吸光值分析圖。

Claims (12)

  1. 一種將半抗原直接聚合形成免疫原之方法，其步驟包括：(A)提供一含半抗原之反應溶液，其中，該含半抗原之反應溶液中之一半抗原係為一含有兩個或兩個以上胺基之化學物質、一含有兩個或兩個以上羧基之化學物質、或一含有一個或一個以上胺基以及一個或一個以上羧基之化學物質；(B)加入一交聯劑至該含半抗原之反應溶液；以及(C)進行聚合反應得到分子量大於4000 Da之免疫原。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該半抗原係為該含有兩個或兩個以上胺基之化學物質時，該交聯劑係至少一選自二醛類、多醛類、雙羧酸類、以及多羧酸類所組成之群組。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該半抗原係為該含有兩個或兩個以上羧基之化學物質時，該交聯劑係至少一選自二醇類、多醇類、雙胺類、以及多胺類所組成之群組。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該半抗原係為該含有一個或一個以上胺基以及一個或一個以上羧基之化學物質時，該交聯劑係包含EDC。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該半抗原係為該含有一個或一個以上胺基以及一個或一個以上羧基之化學物質時，係由彼此的胺基以及羧基行脫水反應而聯結。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(A)之該含半抗原之反應溶液之濃度係為1×10-10 mM以上。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(B)之該交聯劑之濃度係為1×10-10 mM以上。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中步驟(A)之該半抗原係為三聚氰胺。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(B)之該交聯劑係為戊二醛。
  10. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中步驟(C)之聚合反應溫度係為0℃至80℃。
  11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中，三聚氰胺之反應溶液之濃度係為1×10-10 mM至24 mM。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中，戊二醛之濃度係為1×10-10至300 mM。
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