CN102391375A - 蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法，解决了现有抗体生产方法或生产成本高、提纯困难，或周期长、制备工艺复杂、效价低的问题。通过抗原表位选取与合成、多种多肽与载体的偶联、动物免疫及其检测及抗原亲和层析提取的方法获得抗体。本发明方法具有方法简单、成本低、周期短、制得的抗体效价高的优点。

Description

蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法

技术领域

本发明属于蛋白抗原的多克隆抗体生产技术领域，具体的说是一种蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法。

背景技术

抗体是免疫学检测中重要的工具，其主要制备方法是通过抗原免疫动物激发机体产生免疫球蛋白(简称抗体)，然后通过提取纯化制得抗体以用于免疫学检测或作物治疗性药物使用，抗原生产的方法主要包括人工提取天然抗原和人工合成制备完全抗原两种。人工提取的天然抗原天然立体构象好，能更好的刺激动物机体产生免疫反应，获得的抗体具有效价高、亲和力高的优点，但由于很多天然抗原在自然界天然状态下存量极微，人工提取极为困难，提纯成本高，因此人工提取天然抗原难以得到有效推广；而目前人工合成制备完全抗原特别是蛋白抗原，主要通过多肽合成或重组蛋白来实现，重组蛋白的技术目前还受到技术的制约，表达成功率不高，仅为20％甚至更低；单一多肽合成技术由于肽链较短，导致免疫原性不好，另外由于蛋白序列的多样性，很容易与其它蛋白有序列重复，造成生产出来的抗体特异性不好。另外还有一种基因工程免疫法由于基因工程免疫法很少用于抗体的制备，并且需要借助分子生物学平台，并且成功率低，抗体效价低，目前仅仅停留在实验室阶段。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述技术问题，提供一种蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法，其方法简单、成本低、周期短、制得的抗体效价高。

本发明方法包括

(1)抗原表位选取与合成：选取具有至少2个有效多肽表位的蛋白抗原，然后根据该蛋白抗原的至少2个有效多肽表位的多肽序列分别合成至少2种多肽。

(2)多种多肽与载体的偶联：将合成的至少2种多肽与载体进行偶联制备出完全抗原，同一载体上同时偶联有至少2种多肽，每种多肽的摩尔数大于载体摩尔数；

(3)动物免疫及其检测：将上述完全抗原进行动物免疫，并采用酶联免疫吸附分析法检测动物免疫效果，得到相应的ELISA效价不低于1∶100,000的动物免疫血清；

(4)抗原亲和层析提取：将上述动物免疫血清通过天然抗原亲和层析方法提取出针对上述蛋白抗原的抗体。

所述步骤(2)中，每种多肽与载体的摩尔比为5-15∶1，优选为10∶1。

所述具有至少2个有效多肽表位的蛋白抗原的选取可根据蛋白抗原的性质进行筛选获取，或通过已发表的文献数据获得，然后将获知的多肽序列人工合成为多肽，需要几个有效多肽表位就可分别合成对应的几种多肽。

步骤(2)中的的载体可根据具体生产的蛋白抗体进行合理选择，如常用的牛血清白蛋白，卵清白蛋白或血蓝蛋白等。

将含有两个以上抗原表位的蛋白抗原的多肽表位分别合成出来后，然后将上述至少2种多肽经化学偶联到载体上，同一载体上可偶联多种多肽，如合成了4种多肽，则同一载体上同时偶联有4种多肽，并且每种多肽的数量大于载体数量(即同一载体上的同种多肽的数量大于1，优选每种多肽与载体的摩尔比为5-15∶1)，通过化学偶联后得到的完全抗原经免疫动物制备动物抗血清，再通过亲和层析提纯获得针对完全抗原的抗体。由于本发明的抗体制备方法中抗原通过至少2个多肽表位人为富集和多样化(即同一载体上偶联了多种多个多肽)，具有了一定的立体构象，并起到了一个协同放大效应，所以其抗体的免疫效果较单一表位多肽和重组蛋白免疫方法以倍数增加，从而得出的抗体效价高于单一表位多肽和重组蛋白免疫方法，更为接近通过天然抗原蛋白获得的抗体，这是单一表位多肽和重组蛋白免疫所无法模拟和达到的。

本发明方法(下称A法)生产的抗体比传统天然抗原免疫法(下称B法)相比，成本低，抗原容易取得，但是抗体效价稍有逊色；与重组蛋白免疫法(C法)相比，抗原制备简便，生产周期短(比C法生产周期短2周)、效价高；与传统单一多肽免疫法(D法)相比，抗体生产周期缩短，效价更高，抗体特异性好。

附图说明

图1为本发明的技术流程图；

图2采用本法生产的抗体效价比较曲线图。

具体实施方式

下面以制备人次级淋巴小结激酶蛋白(Germinal Center Kinase，以下简称GCK)为例对本发明作进一步的阐述，但是不作为本发明内容的限制。

一、抗原表位的挑取：

根据抗原GCK已有文献记载或噬菌体展示表位筛选法得到的实验数据选取有效的多肽表位序列：本实施例中选取得多肽表位序列为GCK蛋白(蛋白序列号：NP_004570)的216-265位氨基酸His Leu HisPro Met Arg Ala Leu Met Leu Met Ser Lys Ser Ser Phe Gln Pro ProLys Leu Arg Asp Lys Thr Arg Trp Thr Gln Asn Phe His His Phe LeuLys Leu Ala Leu Thr Lys Asn Pro Lys Lys Arg Pro Thr Ala Glu(简称多肽1)和302-318位氨基酸：Glu Leu Glu Thr Tyr Asp MetPhe Pro Asp Thr Ile His Ser Arg Gly Gln(简称多肽2)，合成多肽后，然后每种多肽同时藕联载体卵清白蛋白制备成完全抗原。

其中，完全抗原的制备方法(碳二亚胺法或EDC法)如下：

1.将碳二亚胺盐酸盐平衡到室温；

2.将2毫克载体即冻干的牛血清白蛋白或卵清白蛋白或血蓝蛋白溶解到200微升藕联缓冲液(0.1M MES，pH4.5-5.0)中；

3、将步骤2中载体摩尔数10倍量的多肽1和10倍量的多肽2混合溶解到500微升藕联缓冲液(0.1M MES，Ph4.5-5.0)中，溶解完合后与步骤2所得溶液混合；

4、将10毫克碳二亚胺盐酸盐溶解于1毫升去离子水，并迅速取100微升加入到步骤3的混合液中；

5、磁力搅拌器室温搅拌反应4小时；

6、用脱盐柱纯化所得反应物即为完全抗原。

二、动物免疫及其检测

将完全抗原进行动物免疫及免疫效果检测，方法如下：

(1)动物免疫

选择适龄的健康雄性动物进行免疫，小鼠的首次免疫剂量为50μg～400μg/次，大鼠为100μg～1000μg/次，兔为200μg～1000μg/次，采用多点皮下注射方法，每间隔3周，进行加强免疫，剂量为首免的一半，每次免疫前耳静脉取血监测抗体效价，直到血清抗体ELISA效价达到1∶1,000,000以上。免疫佐剂为佛氏佐剂，首免用佛氏完全佐剂，以后用佛氏不完全佐剂，每次免疫前将完全抗原与佐剂按照同体积混合后通过超声波乳化。本实施例以家兔为免疫动物。

(2)免疫效果检测(抗体效价监测)

将天然抗原(GCK蛋白)用包被稀释液稀释到1μg/mL，100μL/孔，包被于96孔酶标板中，4℃过夜；拍干板孔中的液体，封闭液(含1％羊血清的0.01M TBS(8.5)，150μL/孔，室温封闭4小时；用TBS/Tween-20(0.05％)洗板后，待检血清与未免疫动物空白血清平行从1∶1,000倍比稀释后，100μL/孔，37℃孵育60分钟；用TBS/Tween-20(0.05％)洗板后，将HRP标记羊抗兔(1∶1,000稀释，武汉伊艾博科技有限公司生产)，100μL/孔加入，37℃孵育45分钟后，TBS/Tween-20(0.05％)洗板3次后，加入即用型3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)显色液(Sigma)，室温反应10分钟，每孔加100μL显色终止液(2M H₂SO₄)终止反应，通过酶标仪读取450nm吸光值(OD₄₅₀)。待检血清某个稀释度的450nm吸光值是空白血清的3倍时，该稀释度定义为该抗体的ELISA效价。

三、抗体制备

当完全抗原免疫的动物血清效价达到实验要求后，分别采用颈动物放血，收集全血，37℃放置1小时后，4℃过夜，离心分离血清；血清中加入质量百分比0.01％叠氮化钠，-20℃保存备用。

将多肽1和多肽2(多肽1∶多肽2摩尔比为1∶1)同时过量藕联到同一琼脂糖凝胶4B(GE Healthcare，17-0430-01)上制备亲和层析介质，层析介质装配成层析柱，从以上分离的血清中通过完整抗原亲和层析的方法提取针对该抗原的特异性抗体，藕联方法与亲和层析纯化方法参照该琼脂糖凝胶4B的产品说明书进行。

四、本法生产的抗体与传统各种方法生产的抗体效价比较。

以人GCK蛋白比较对象，以天然GCK蛋白包被酶标板，比较不同生产方法得到抗体的效价，其中B法、C法、D法为背景技术中介绍的三种现有方法，A法为本发明制备方法得到的试剂盒。

由图2可知，以上各法得到抗体的效价比较结果为：

B法＞A法＞C法＞D法：

结果：由比较实验得出，本发明方法生产的抗体较现有其它方法制得的抗体效价更高，仅比天然抗原免疫法(B法)稍逊，但是天然抗原不易取得，成本非常高。

Claims (2)

1.一种蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法，其特征在于：

(1)抗原表位选取与合成：选取具有至少2个有效多肽表位的蛋白抗原，然后根据该蛋白抗原的至少2个有效多肽表位的多肽序列分别合成至少2种多肽。

(2)多种多肽与载体的偶联：将合成的至少2种多肽与载体进行偶联制备出完全抗原，同一载体上同时偶联有至少2种多肽，每种多肽的摩尔数大于载体摩尔数；

(3)动物免疫及其检测：将上述完全抗原进行动物免疫，并采用酶联免疫吸附分析法检测动物免疫效果，得到相应的ELISA效价不低于1∶100,000的动物免疫血清；

(4)抗原亲和层析提取：将上述动物免疫血清通过天然抗原亲和层析方法提取出针对上述蛋白抗原的抗体。

2.如权利要求1所述的蛋白抗原多个多肽抗原表位偶联载体生产抗体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每种多肽与载体的摩尔比为5-15∶1。

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