TW201406783A - 人類ｃｄ３０配位子抗原結合蛋白質 - Google Patents

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Abstract

本發明提供與人類CD30L抗原結合蛋白質有關之組成物及方法。本文中所描述之組成物包括：人類CD30L抗原結合蛋白質、編碼人類CD30L抗原結合蛋白質之聚核苷酸、包含該等聚核苷酸之載體、宿主細胞及醫藥組成物。亦提供製備及使用該等組成物中之每一者之方法。

Description

人類CD30配位子抗原結合蛋白質
CD30配位子(CD30L、CD153)(CD30之天然存在之配位子)為II型細胞膜醣蛋白，其特異性結合CD30，引發CD30經其細胞質域傳輸信號。CD30及CD30L為相互作用細胞表面醣蛋白，其分別為TNFR及TNF超家族之成員(Durkop等人，Cell,68：421,1992；Smith等人，Cell,73：1349,1993；美國專利第5,480,981號；美國專利第5,677,430號；美國專利第6,143,869號及美國專利第6,652,854號)。CD30及CD30L之表現受限於免疫系統之細胞且經緊密調節。CD30主要於活性B細胞及具有活化/記憶表現型之T細胞子集上表現(Ellis等人，J.Immun.,151：2380,1993；Falini等人，Blood,85：1,1995)。CD30L於活性小鼠及人類T細胞上大量表現(Shimozato等人，Biochem.& Biophys.Res.Comm.,256：519,1999；Armitage,J.Biological Regulators & Homeostatic Agents,14：142,2000)。當B細胞通過生發中心(germinal center)時，CD30L之相對基因表現發生顯著變化(Klein等人，Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,100：2639,2003)。因此，B細胞上CD30L之表現可為階段及情形特異性。CD30L亦似乎為存在於脾濾泡中之獨特的小鼠樹突狀細胞樣副細胞群體的標記，在脾濾泡中，T細胞與B細胞相互作用(Kim等人，Immunity,18：643,2003)。
表現CD30/CD30L之細胞之間的相互作用似乎對產生強T細胞依賴性繼發性或類別切換性抗體反應為重要的。該作用之證據包括來自小鼠系統中之活體外(Shanebeck等人，Eur.J.Immunol.,25：2147-53,1995)及活體內(Gaspal等人，.J.Immunol.,174：3891-6,2005)研究之資料。此外，已證實在多種T細胞及/或B細胞依賴性自體免疫疾病模型中，用針對小鼠CD30L之阻斷型但非消耗型大鼠mAb對小鼠進行活體內處理可抑制疾病之發展或進程(美國專利第6,667,039號)。在具有強體液免疫組分之模型中，疾病抑制與疾病相關抗體反應之抑制相關。
因此，包含結合於CD30L之人類抗體及/或抗原結合區之組成物用於治療性及診斷性應用為有用的。
提供結合CD30L(尤其人類CD30L)之抗原結合蛋白質。人類CD30L抗原結合蛋白質可降低、抑制、阻礙及/或調節至少一種與CD30L/CD30相互作用有關的生物學反應，且因此適用於改善CD30L相關疾病或病症之影響。CD30L抗原結合蛋白質可用於例如降低、抑制、阻礙及/或調節CD30L/CD30相互作用。
在一個具體實例中，提供結合CD30L之C端區域(包括AA 201-234)之經分離抗原結合蛋白質。在另一具體實例中，提供一種抗原結合蛋白質，其結合CD30L之C端區域(包括AA 201-234)及位於胞外區之N端部分的CD30L中之另一區域(其由AA 75-95界定)。在本發明之其他具體實例中，抗原結合蛋白質具有至少一種選自由以下組成之群的性質：a)抑制CD30/CD30L相互作用；b)抑制CD30L誘導之IL-8誘導作用；c)與抗體A-F中之一者針對與人類CD30L之結合進行交叉競爭；d)與人類CD30L之解離常數至多70pM及e)以實質上等於或高於抗體A-F中之一者之親和力(較低KD)結合於人類CD30L。可由熟習此項技術者已知的方式確定親 和力(或KD)，諸如藉由SPR或藉由FACS，如本文中之實施例4中所描述。
在一個具體實例中，提供一種結合CD30L之經分離抗原結合蛋白質，其包含至少一個重鏈可變區，該至少一個重鏈可變區包含選自由以下組成之群的CDRH1、CDRH2及CDRH3：a)與如表3中所示之CDRH1相差不超過4、3、2或1個胺基酸取代、插入或缺失的CDRH1；b)與如表3中所示之CDRH2相差不超過7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、插入及/或缺失的CDRH2；c)與如表3中所示之CDRH3相差不超過11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、插入及/或缺失的CDRH3；及包含至少一個輕鏈可變區，該至少一個輕鏈可變區包含選自由以下組成之群的CDRL1、CDRL2及CDRL3：d)與如表3中所示之CDRL1相差不超過4、3、2或1個胺基酸取代、插入及/或缺失的CDRL1；e)與如表3中所示之CDRL2相差不超過2個或1個胺基酸取代、插入或缺失的CDRL2；f)與如表3中所示之CDRL3相差不超過2個或1個胺基酸取代、插入或缺失的CDRL3。在相關具體實例中，提供選自由以下組成之群的CDRH1：SEQ ID NO：14、15、16、17、18及33；選自由以下組成之群的CDRH2：SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24及34；選自由以下組成之群的CDRH3：SEQ ID NO：25、26、27、28、29及35；選自由以下組成之群的CDRL1：SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及30；選自由以下組成之群的CDRL2：SEQ ID NO：7、8、9、10及31；及選自由以下組成之群的CDRL3：SEQ ID NO：11、12、13及32。
另一具體實例提供一種結合人類CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含至少一個包含CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中CDR1包含SEQ ID NO：36、28、40、42或44之胺基酸殘基23-36，CDR2包含SEQ ID NO：36、28、40、42或44之胺基酸殘基52-58且CDR3包含SEQ ID NO：36、28、40、42或44之胺基酸殘基91-100；或b)包含CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中CDR1包含SEQ ID NO：46之胺基酸殘基25-36， CDR2包含SEQ ID NO：46之胺基酸殘基52-58且CDR3包含SEQ ID NO：46之胺基酸殘基91-100；及至少一個包含CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區，其中CDR1包含SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72之胺基酸殘基31-35，CDR2包含SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72之胺基酸殘基50-65且CDR3包含SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72之胺基酸殘基98-113。在相關具體實例中，提供一種抗原結合蛋白質，其包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區。在另一具體實例中，提供一種抗原結合蛋白質，其包含至少兩個重鏈可變區及至少兩個輕鏈可變區。
在另一具體實例中，提供一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區序列與如表2中所示之重鏈可變區序列相差不超過31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加及/或缺失；且其中輕鏈可變區序列與如表1中所示之輕鏈可變區序列相差不超過30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加及/或缺失。
另一具體實例提供一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70及72具有至少80%序列一致性的胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：36、38、40、42、44及46具有至少88%序列一致性的胺基酸序列。
在一個具體實例中，提供一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其係選自由以下組成之群：a)選自由SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60及62組成之群的重鏈可變區及SEQ ID NO：36之輕鏈可變區； b)SEQ ID NO：64之重鏈可變區及SEQ ID NO：38之輕鏈可變區；c)SEQ ID NO：66之重鏈可變區及SEQ ID NO：40之輕鏈可變區；d)SEQ ID NO：68之重鏈可變區及SEQ ID NO：42之輕鏈可變區；e)SEQ ID NO：70之重鏈可變區及SEQ ID NO：44之輕鏈可變區；及f)SEQ ID NO：72之重鏈可變區及SEQ ID NO：46之輕鏈可變區。在相關具體實例中，分離之抗原結合蛋白質為抗體。在另一相關具體實例中，抗體為單株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。在另一具體實例中，抗體片段為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。在相關具體實例中，抗原結合蛋白質為人類抗體。在另一相關具體實例中，抗原結合蛋白質為單株抗體。在另一相關具體實例中，抗原結合蛋白質為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。在相關具體實例中，抗原結合蛋白質為IgG1型或IgG2型。
另一具體實例提供分離之核酸分子，其編碼如上文所描述之抗原結合蛋白質。在相關具體實例中，至少一個重鏈可變區係由選自由SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71及73組成之群的分離之核酸分子編碼且至少一個輕鏈可變區係由選自由SEQ ID NO：37、39、41、43、45及47組成之群的分離之核酸分子編碼。在另一相關具體實例中，核酸分子與控制序列可操作地連接。在另一相關具體實例中，提供包含上述核酸之載體及包含該等載體之宿主細胞。在另一具體實例中，提供一種足以用作雜交探針、PCR引子或定序引子之分離之聚核苷酸，其為如上文所描述之核酸分子之片段或其補體。
另一具體實例提供一種製備如上文所描述之抗原結合蛋白質之方法，其包含由分泌抗原結合蛋白質之宿主細胞製備抗原結合蛋白質之步驟。
另一具體實例提供一種如上文所描述之分離之抗原結合蛋 白質，其中該抗原結合蛋白質具有至少一種選自由以下組成之群的性質：a)抑制CD30/CD30L相互作用；b)抑制CD30L誘導之IL-8誘導作用；c)與抗體A-F中之一者針對與人類CD30L之結合進行交叉競爭；d)解離常數70pM及e)以與抗體A-F中之一者實質上相同的Kd結合於人類CD30L。
在另一具體實例中，提供一種醫藥組成物，其包含至少一種如上文所描述之抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之賦形劑。相關具體實例進一步提供進一步包含標記基團或效應子基團之該等醫藥組成物。在另一相關具體實例中，標記基團係選自由以下組成之群：同位素標記、磁性標記、氧化還原活性部分、光學染料、生物素化基團及由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基。在另一相關具體實例中，效應子基團係選自由放射性同位素、放射性核種、毒素、治療基團及化學治療基團組成之群。在另一相關具體實例中，抗原結合蛋白質與標記基團偶合。
另一具體實例提供一種治療或預防患者與CD30L相關之病狀的方法，其包含投予有需要之患者有效量之至少一種如上文所描述之分離之抗原結合蛋白質。在另一相關具體實例中，分離之抗原結合蛋白質係單獨投予或以組合療法形式投予。
另一具體實例提供一種降低患者CD30L活性之方法，其包含投予有效量之至少一種如上文所描述之抗原結合蛋白質。
在另一具體實例中，提供一種與至少一種如上文所描述之抗原結合蛋白質競爭的抗原結合蛋白質。
在另一具體實例中，提供一種如上文所描述之抗原結合蛋白質，其完全或部分岩藻糖基化。
【詳述】
本發明提供與CD30L抗原結合蛋白質(包括阻斷CD30L與CD30之間相互作用的抗原結合蛋白質，諸如抗CD30L抗體、抗體片段及抗體衍生物，例如中和型抗CD30L抗體、抗體片段或抗體衍生物)有關之組成物、套組及方法。亦提供聚核苷酸以及其衍生物及片段，其包含編碼結合於CD30L之全部多肽或其一部分的核酸之序列，例如編碼全部抗CD30L抗體、抗體片段或抗體衍生物或其一部分的聚核苷酸，包含該等核酸之質體及載體，及包含該等聚核苷酸及/或載體及質體之細胞或細胞株。所提供之方法包括例如製備、鑑別或分離CD30L抗原結合蛋白質(諸如抗CD30L抗體)之方法；確定分子是否阻斷CD30L與CD30之間相互作用的方法；確定分子是否拮抗CD30L之方法；製備包含CD30L抗原結合蛋白質之組成物(諸如醫藥組成物)之方法；及向個體投予CD30L抗原結合蛋白質之方法，例如治療由CD30L介導之病狀及活體內或活體外阻斷CD30L與CD30之間相互作用的方法。
除非本文中另有定義，否則結合本發明所用之科學及技術術語應具有一般熟習此項技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有要 求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。通常，結合本文中所描述之細胞及組織培養物、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學結合使用之命名法及該等培養物及學科之技術係在此項技術中熟知及常用的。除非另有說明，否則本發明之方法及技術係通常根據此項技術中熟知的習知方法及如本說明書中引用及論述的各種通用及更特定參考文獻中所描述進行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow and Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。酶促反應及純化技術係根據製造商說明書以此項技術中常用實現方式或如本文中所描述進行。結合本文中所描述之分析化學、合成有機化學以及醫藥及藥物化學使用之術語及該等學科之實驗步驟及技術為此項技術中熟知及常用的。可使用標準技術進行化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及治療患者。
本申請案中引用之所有文獻或部分文獻(包括(但不限於)專利、專利申請案、論文、書籍及專題論文)均以全文引用的方式併入本文中以用於描述及說明目的，例如該等公開案中描述之方法可與本文中所描述之資訊結合使用。
術語「CD30配位子」(CD30L)係指能夠結合CD30之多肽類別(如Smith等人，Cell 73：1349-1360,1993及美國專利第5,480,981號中所揭示)，包括其CD30結合突變蛋白質；該等多肽包括細胞膜結合蛋白質(包含細胞質域、跨膜區及胞外域)以及保留CD30結合性質之截短蛋白質。該等截短蛋白質包括例如僅包含細胞外(受體結合)域之可溶性CD30L。亦包括CD30L片段，包括全長CD30L多肽之部分，其保留CD30結合能力或 能夠引導與CD30多肽或能夠傳輸生物學信號(諸如NF-κ B之活化)之一部分全長CD30特異性結合之抗體。
術語「CD30」係指作為TNF/NGF受體超家族之成員的受體，其選殖方法描述於Durkop等人，(Cell 68：421,1992)中。片語「可溶性CD30」(sCD30)係指包含CD30蛋白質之全部胞外域或其一部分且保留與CD30L特異性結合能力之可溶性分子。可溶性CD30多肽涵蓋高度純化形式之重組sCD30及天然存在sCD30蛋白質。
如本文中所用，片語「CD30之片段」係指全長CD30多肽之一部分，其保留CD30L結合能力或能夠引導與CD30多肽或能夠傳輸生物學信號(諸如NF-κ B之活化)之一部分全長CD30特異性結合之抗體。
如本文中所用片語「CD30/CD30L相互作用」係指CD30與CD30L之特異性結合，其引起由CD30進行之信號轉導。此包括其中至少一個結合搭配物為CD30或CD30L之片段的實例，亦即該術語可係指CD30片段與CD30L、CD30與CD30L片段或CD30片段與CD30L片段之結合相互作用。此外，CD30/CD30L相互作用可涉及CD30類似物(諸如對偶基因變異體或突變蛋白質)，其能夠特異性結合於CD30L，或可涉及CD30L類似物(諸如對偶基因變異體或突變蛋白質)，其可與CD30特異性結合。此外，CD30/CD30L相互作用可涉及內源CD30或CD30L蛋白質或可涉及由編碼重組蛋白質之核酸所轉染之細胞表現的重組CD30或CD30L。
術語「聚核苷酸」包括單股及雙股核酸且包括基因組DNA、RNA、mRNA、cDNA或其與在自然界中通常發現之序列無關的合成來源或一些組合。包含指定序列之分離之聚核苷酸除指定序列外可包括多達10種或甚至多達20種其他蛋白質或其部分之編碼序列，或可包括控制所述核酸序列之編碼區之表現的可操作地連接之調節序列及/或可包括載體序列。包含聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一種核苷酸之 經修飾形式。該等修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌核苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)及磷醯胺酸酯。
術語「寡核苷酸」意謂包含100個或100個以下核苷酸之聚核苷酸。在一些具體實例中，寡核苷酸之長度為10至60個鹼基。在其他具體實例中，寡核苷酸之長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股，例如用於構造突變基因。寡核苷酸可為正義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括用於偵測分析法之可偵測標記，諸如放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原性標記。寡核苷酸可用作例如PCR引子、選殖引子或雜交探針。
術語「多肽」或「蛋白質」意謂具有原生蛋白質之胺基酸序列之巨分子，亦即由天然存在且非重組細胞產生之蛋白質；或其係由經遺傳工程改造或重組細胞產生，且包含具有原生蛋白質之胺基酸序列之分子，或與原生序列相比具有一或多個胺基酸殘基缺失、插入及/或取代之分子。該術語亦包括胺基酸聚合物，其中一或多個胺基酸為相應天然存在之胺基酸及聚合物之化學類似物。術語「多肽」及「蛋白質」涵蓋CD30L抗原結合蛋白質(諸如抗體)及序列，其與抗原結合蛋白質序列相比具有一或多個胺基酸殘基缺失、添加及/或取代。術語「多肽片段」係指與全長原生蛋白質相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。該等片段與原生蛋白質相比亦可含有經修飾之胺基酸。在某些具體實例中，片段長度為約5至500個胺基酸。舉例而言，片段長度可為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。有效多肽片段包括抗體之免疫功能性片段，包括結合域。在CD30L抗原結合蛋白質(諸如抗體)情況下， 有效片段包括(但不限於)一或多個CDR區、重鏈或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分、可變區之一部分(包括不超過3個CDR)及其類似物。
「胺基酸」包括其在此項技術中之正常含義。20種天然存在胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub及D.R.Gren編)，Sinauer Associates：Sunderland,Mass.(1991)。20種習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如[α]-胺基酸、[α]-雙取代胺基酸、N-烷基胺基酸)及其他非習知胺基酸亦可為多肽之合適組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、[γ]-羧基麩胺酸、[ε]-N,N,N-三甲基離胺酸、[ε]-N-乙醯基離胺酸、O-磷絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、[δ]-N-甲基精胺酸及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中使用之多肽記號中，根據標準用法及慣例，左側方向為胺基端方向且右側方向為羧基端方向。
術語「分離之蛋白質」係指由蛋白質或多肽或其他將妨礙其治療性、診斷性、預防性、研究或其他用途之污染物純化的蛋白質，諸如抗原結合蛋白質(其實例可為抗體)。如本文中所用，「實質上純」意謂所描述之分子物質為主要存在之物質，亦即以莫耳計，其含量大於同一混合物中之任何其他個別物質。在某些具體實例中，實質上純分子為組成物，其中目標物質占所有存在的巨分子物質之至少50%(以莫耳計)。在其他具體實例中，實質上純組成物將占組成物中所有存在的巨分子物質之至少80%、85%、90%、95%或99%。在某些具體實例中，基本上均勻物質已純化至藉由習知偵測方法在組成物中無法偵測到污染物質的程度且因此組成物係由單一可偵測巨分子物質組成。
多肽(例如抗原結合蛋白質，諸如抗體)之「變異體」包含之胺基酸序列相對於另一多肽序列其胺基酸序列中插入、缺失及/或取代一 或多個胺基酸殘基。變異體包括融合蛋白質。多肽之「衍生物」為經與插入、缺失或取代變異體不同之某一方式化學修飾(例如經接合於另一化學部分)的多肽。
本說明書中結合生物材料(諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物)使用之術語「天然存在」或「原生」係指在自然界中發現之物質。在此情形下，「重組蛋白質」為使用重組技術(亦即經本文中所描述之重組核酸之表現)製備之蛋白質。製備重組蛋白質之方法及技術在此項技術中已為吾人所熟知。
術語「抗體」係指任何同型之完整免疫球蛋白或其可與完整抗體針對與目標抗原之特異性結合進行競爭之片段，且包括例如嵌合抗體、人類化抗體、完全人類抗體及雙特異性抗體。因此抗體為一種抗原結合蛋白質。除非另有說明，否則術語「抗體」除包含兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈之抗體外，亦包括其衍生物、變異體、片段及突變蛋白質，其實例描述於下文中。完整抗體通常將包含至少兩個全長重鏈及兩個全長輕鏈，但在一些情況下，其可包括較少的鏈，諸如天然存在於駱駝中之抗體，其可僅包含重鏈。抗體可僅由單一來源獲得，或可為「嵌合型」，亦即抗體之不同部分可來源於兩種不同的如下文進一步描述之抗體。可在融合瘤中、藉由重組DNA技術或由完整抗體之酶促或化學裂解製備抗原結合蛋白質、抗體或結合片段。
如本文中所用，術語抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)之「功能性片段」(或簡稱為「片段」)為抗原結合蛋白質，其包含缺少全長鏈中存在的至少一些胺基酸但仍能夠特異性結合於抗原之一部分(無論該部分係如何獲得或合成)抗體。該等片段由於其特異性結合於目標抗原且可與其他抗原結合蛋白質(包括完整抗體)針對與既定抗原決定基之特異性結合進行競爭而具有生物學活性。在一個態樣中，該片段將保留至少一個 存在於全長輕鏈或重鏈中之CDR，且在一些具體實例中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。該等生物學活性片段可由重組DNA技術製備，或可由抗原結合蛋白質(包括完整抗體)之酶促或化學裂解製備。片段包括(但不限於)免疫功能性片段，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、結構域抗體及單鏈抗體，且可來源於任何哺乳動物來源，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝或兔類。此外涵蓋本文中揭示之抗原結合蛋白質之功能性部分(例如一或多個CDR)可共價結合於第二蛋白質或小分子以產生針對體內特定目標、具有雙功能治療性質或具有延長之血清半衰期的治療劑。
當在抗原結合蛋白質(例如中和型抗原結合蛋白質或中和型抗體)情形中使用時，術語「競爭」意謂如由分析法測定之抗原結合蛋白質之間的競爭，其中所測試之抗原結合蛋白質(例如抗體或其免疫功能性片段)防止或抑制參考抗原結合蛋白質(例如配位子或參考抗體)與共同抗原(例如CD30L蛋白質或其片段)之特異性結合。可使用多種類型之競爭性結合分析法，例如：固相直接或間接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或間接酶免疫分析法(EIA)、夾心競爭分析法(參見例如Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 92：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，1986,J.Immunol.137：3614-3619)固相直接標記分析法、固相直接標記夾心分析法(參見例如Harlow及Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，1988,Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung，等人，1990,Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常，該分析法涉及使用結合於固體表面或細胞之純化抗原，該固體表面或該等細胞具有未經標記之測試抗原結合蛋白質及經標記之參考抗原結合蛋白質中之任一者。如熟習此項技術者已知，可使用不同方法。替代性方案包括 使參考抗原結合蛋白質結合於板，視情況經可撓性基質實現。其他變化可係基於添加次序，亦即抗原是否首先與板結合之參考抗原結合蛋白質或測試抗原結合蛋白質混合。在所有情況下均需要實現抗原結合蛋白質之抗原飽和以避免錯誤的非競爭性結果。
藉由在測試抗原結合蛋白質存在下測定結合於固體表面或細胞之標記量來量測競爭性抑制。通常，測試抗原結合蛋白質係過量存在。由競爭分析法鑑別之抗原結合蛋白質(競爭抗原結合蛋白質)包括與參考抗原結合蛋白質結合於同一抗原決定基之抗原結合蛋白質，及與由參考抗原結合蛋白質所結合之抗原決定基足夠近的相鄰抗原決定基結合從而發生位阻之抗原結合蛋白質。通常，當競爭抗原結合蛋白質過量存在時，其將抑制參考抗原結合蛋白質與共同抗原之特異性結合達至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些實施例中，抑制結合作用達至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指抗原上由抗原結合蛋白質結合之位點。抗原決定基可自相連胺基酸或由蛋白質之三級摺疊並置之非相連胺基酸形成。由相連胺基酸形成之抗原決定基通常可在暴露於變性溶劑後保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理時損失。抗原決定子可包括分子之化學活性表面基團(諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基)且可具有特定三維結構特徵及/或比電荷特徵。抗原決定基通常包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35個呈獨特空間構形形式之胺基酸。可使用此項技術中已知的方法測定抗原決定基。
抗原結合蛋白質之結合亦可由與抗原結合蛋白質相互作用之抗原區描述。該(等)相互作用區可由此項技術中已知的各種方法測定， 諸如藉由使用變異型抗原分子進行結合分析法或藉由如本文中例示之HXMS(參見實施例6)，從而測定抗原與抗原結合蛋白質之相互作用區。
HX-MS技術使得可易於在蛋白質之氫交換(HX)後進行質譜分析法(MS)。藉由用含有氘之水性溶劑置換含有氫之水性溶劑，在蛋白質中之既定位點併入氘原子將引起質量增加1Da。可在交換反應之中止樣品中藉由質譜分析法隨時間而變監測此質量增加。可藉由中止條件下之胃蛋白酶消化及根據所得肽之質量增加將氘標記資訊子定位(sub-localized)至蛋白質中之區域。可使用HX-MS藉由鑑別蛋白質-蛋白質複合物形成後氫交換降低之區域來探測與分子間相互作用(包括抗體-抗原相互作用)有關之位點。通常，將藉由標記之氫交換降低(由溶劑之空間排阻引起)來顯示結合界面。可藉由在存在及不存在各別結合搭配物情況下量測併入任一蛋白質成員中之氘之總量來簡單地藉由HX-MS隨時間而變偵測蛋白質-蛋白質複合物形成。HX-MS技術使用原生組分(亦即蛋白質及抗體或Fab片段)且係在溶液中進行。因此，HX-MS提供模仿活體內條件之可能性(關於HX-MS技術之評述，參見例如Wales及Engen,Mass Spectrom.Rev.25,158(2006))。
本文中所描述之某些抗原結合蛋白質經由人類CD30L之C端區域(由AA201-234界定)與CD30L相互作用或結合。抗原結合蛋白質可與人類CD30L之由AA 201-234界定之C端區域或諸如AA 205-230或AA 211-226之較小區域結合。如上文所描述，抗原決定基可為非相鄰且因此相互作用區域可為非相鄰。在一個具體實例中，本發明之抗原結合蛋白質結合於CD30L之至少兩個區域。本發明之該等其他抗原結合蛋白質可與如上文所定義之C端區域及人類CD30L中位於胞外域之N端部分的另一區域(諸如由全長hCD30L之AA70-100界定之區域)相互作用。除由AA 201-234、AA 205-230或AA 211-226界定之C端區域外，該等抗原結合蛋白質亦可結 合於AA 75-95或較短區域，諸如AA 80-90或AA 82-88。
CD30L抗原結合蛋白質
如本文中所用之「抗原結合蛋白質」意謂特異性結合於指定目標抗原之蛋白質；本文中提供之抗原為CD30L，尤其人類CD30L。抗原結合蛋白質包括例如阻斷或抑制CD30L與CD30之相互作用的抗原結合蛋白質。該等「阻斷型」抗原結合蛋白質可以針對CD30L或其片段、變異體或衍生物研發且在習知分析法中篩選其阻礙CD30L與CD30之相互作用的能力。合適分析法之實例為本文中所描述之測試抗原結合蛋白質抑制CD30L與CD30之相互作用之能力的分析法。抗原結合蛋白質亦包括抑制CD30L或活化CD30L之抗原結合蛋白質。與不存在抗原結合蛋白質下之生物反應相比，該抑制或中和作用在抗原結合蛋白質存在下破壞反應且可使用此項技術中已知及本文中所描述之分析法測定。本文中提供之抗原結合蛋白質例如誘導CD30+細胞產生IL-8。本文中揭示之抗原結合蛋白質亦不與其他TNF超家族成員(尤其4-1BBL、OX-40L、TNF α、TNF β、RANKL、Trail、CD40L或CD27L)結合。
不同CD30L抗原結合蛋白質可結合於CD30L之不同結構域或抗原決定基或藉由不同作用機制起作用。本文中所描述之用途並非意謂CD30L抗原結合蛋白質必須完全抑制CD30L誘導之活性；實情為，亦涵蓋降低CD30L之特定活性之抗原結合蛋白質之用途。抗原結合蛋白質亦包括針對與人類CD30L之結合進行交叉競爭；結合於人類CD30L之與本文中所描述之任一種參考抗原結合蛋白質相同之抗原決定基；以與本文中所描述之任一種參考抗原結合蛋白質實質上相同的Kd結合於人類CD30L；以與本文中所描述之任一種參考抗原結合蛋白質相同的解離速率結合於CD30L。各種量測該等特徵之方法係在此項技術中已知且描述於本文中。
亦提供消耗CD30L+細胞之CD30L抗原結合蛋白質。藉由該 等消耗型CD30L抗原結合蛋白質，抗原結合蛋白質與包含其目標抗原之細胞之結合引起抑制抗原或細胞功能或引起細胞死亡。在一個具體實例中，本發明之消耗型抗體與CD30L結合且可能阻斷或可能不阻斷CD30L配位子與CD30之結合。因此，消耗型抗原結合蛋白質特定地包括阻斷型及非阻斷型抗原結合蛋白質。在一個態樣中，消耗CD30L+細胞之CD30L抗原結合蛋白質可誘導細胞凋亡或漸進式細胞死亡，如由此項技術中已知的細胞凋亡分析法測定。該等CD30L抗原結合蛋白質可藉由以下機制而具有免疫調節作用：1)消除與CD30L+細胞相互作用以誘導免疫反應之細胞及/或2)消除其中CD30L為某一細胞型之細胞表面標記的細胞，該細胞型參與某一種免疫反應，但其可能無需與CD30+細胞相互作用即可參與該反應。在此情況下，CD30L將為與特定疾病有關之細胞型之標記且CD30/CD30L相互作用可能與疾病本身之病原性無關。另一具體實例包括包含結合毒素或細胞毒性劑之消耗型抗原結合蛋白質，其中該毒素或細胞毒性劑誘導結合抗原結合蛋白質結合物之細胞之消耗。
抗原結合蛋白質可包含結合於抗原之部分及視情況選用之使抗原結合部分採用促進抗原結合蛋白質與抗原之結合之構形的骨架或構架部分。抗原結合蛋白質之實例包括抗體、抗體片段(例如抗體之抗原結合部分)、抗體衍生物及抗體類似物。抗原結合蛋白質可包含替代性蛋白質骨架或人工骨架，該替代性蛋白質骨架或人工骨架具有移植之CDR或CDR衍生物。該等骨架包括(但不限於)包含突變之抗體衍生型骨架，該等突變係經引入以例如使抗原結合蛋白質之三維結構穩定，以及包含例如生物相容聚合物之全合成骨架。參見例如Korndorfer等人，Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics,(2003)第53卷，第1期：121-129；Roque等人，Biotechnol.Prog.,2004,20：639-654。此外，可使用肽抗體模擬劑(「PAM」)，以及基於抗體模擬劑之骨架(其利用纖維結合蛋白組分作為骨架)。
本文中所描述之某些抗原結合蛋白質為抗體或來源於抗體。該等抗原結合蛋白質包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、結構域抗體、合成抗體、抗體模擬劑、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物、抗體結合物、單鏈抗體及以上各者之片段。在一些情況下，抗原結合蛋白質為抗體之免疫片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。各種結構進一步描述及定義於本文中。
某些所提供之抗原結合蛋白質可包含一或多個如本文中所描述之CDR(例如1、2、3、4、5、6個或6個以上CDR)。在一些情況下，抗原結合蛋白質包含(a)多肽結構及(b)一或多個CDR，該一或多個CDR插入多肽結構中及/或與多肽結構接合。多肽結構可呈現多種不同形式。舉例而言，其可為或包含天然存在之抗體之構架或其片段或變異體，或可本質上為全合成。各種多肽結構之實例進一步描述於下文中。
某些如本文中提供之抗原結合蛋白質特異性結合於人類CD30L。如本文中所用之「特異性結合」意謂平衡解離常數(KD)為<10-8M至<10-10M，或<10-9M至<10-10M，更特定言之為<10-11M至<10-12M。在一個具體實例中，抗原結合蛋白質以高親和力結合，該高親和力由平衡解離常數(KD)表示為10-8，或諸如5.0×10-9或諸如10-9或甚至5.0×10-10。可如此項技術中已知的方式測定平衡解離常數。在該等具體實例中，通常藉由以低密度固定物質(此物質可為多價)且注射一系列滴定單價物質(締合相)，且接著得到解離相(複合物分解)來測定KD。與單價複合物之締合及解離對應之速率常數分別稱為締合速率常數k a 及解離速率常數k d 。接著用1：1結合模型擬合所得資料，該模型擬合3個參數：締合速率常數k a 、解離速率常數kd及Rmax(其係關於表面密度及化學計量)。比率k d /k a 等於平衡解離常數KD。
亦可如本文中之實施例4中所描述使用FACS分析測定KD， 其中抗體與表現於Ramos細胞上之CD30L結合。
一個具體實例係關於一種本文中所描述之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質對人類CD30L之親和力(或KD)為至少75pM，諸如50pM，諸如40pM。在其他具體實例中，抗原結合蛋白質對人類CD30L之解離常數(KD)為至多35pM，諸如至多25pM，諸如20pM，諸如至多15pM。在該等具體實例中，可如本文中之實施例4中所描述藉由FACS測定親和力(或KD)。
另一態樣提供活體外或活體內(例如當投予人類個體時)半衰期為至少1天之抗原結合蛋白質。在一個具體實例中，抗原結合蛋白質之半衰期為至少3天。在另一具體實例中，抗體或其部分之半衰期為4天或4天以上。在另一具體實例中，抗體或其部分之半衰期為8天或8天以上。在另一具體實例中，抗體或其抗原結合部分經衍生或修飾使得其半衰期長於未衍生或未修飾之抗體。在另一具體實例中，抗原結合蛋白質含有點突變以延長血清半衰期，諸如WIPO公開案第WO 00/09560號中所描述。
在將抗原結合蛋白質用於治療性應用之具體實例中，抗原結合蛋白質可降低、抑制、阻礙或調節CD30L之一或多種生物學活性，諸如誘導CD30+細胞產生IL-8。
一些所提供之抗原結合蛋白質具有通常與天然存在之抗體相關之結構。該等抗體之結構單元通常包含一或多個四聚體，各四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，但一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在典型抗體中，各配對或鏈對包括一個全長「輕」鏈(在某些具體實例中，約25kDa)及一個全長「重」鏈(在某些具體實例中，約50-70kDa)。每一個別免疫球蛋白鏈由若干個「免疫球蛋白域」組成，各免疫球蛋白域由約90至110個胺基酸組成且表現特徵摺疊圖案。該等結構域為構成抗體多肽之基本單元。各鏈之胺基端部分通常包括負責抗原識別之可變區。羧 基端部分與另一鏈端相比在進化方面更保守且稱為「恆定區」或「C區」。人類輕鏈通常分為κ輕鏈及λ輕鏈，且該等輕鏈中之每一者含有一個可變區及一個恆定域。重鏈通常分類為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈或ε鏈，且該等鏈將抗體之同型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干種次型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM次型包括IgM及IgM2。IgA次型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有4個重鏈及4個輕鏈；IgG及IgE同型含有2個重鏈及2個輕鏈；且IgM同型含有5個重鏈及5個輕鏈。重鏈恆定區(CH)通常包含一或多個可負責效應子功能之結構域。重鏈恆定區結構域之數目將視同型而定。IgG重鏈，例如各自含有3個CH區結構域，稱為CH1、CH2及CH3。所提供之抗原結合蛋白質可具有任何該等同型及次型，例如CD30L抗原結合蛋白質具有IgG1、IgG2或IgG4次型。若需要IgG4，則亦可能需要在絞鏈區中引入點突變(CPSCP->CPPCP)(如Bloom等人，1997,Protein Science 6：407中所描述)以緩和形成H鏈內二硫鍵(其可引起IgG4抗體中之異質性)的傾向。可使用子類轉換法將本文中提供之抗體的一種類型轉換為不同類型。參見例如Lantto等人，2002,Methods Mol.Biol.178：303-316。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區由約12個或12個以上胺基酸之「J」區相連，其中重鏈亦包括約10個以上胺基酸之「D」區。參見例如Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul,W.編)1989,New York：Raven Press。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
可變區
本文中提供之各種重鏈及輕鏈可變區(或結構域)描繪於表1及2中。該等可變區中之每一者均可連接至例如上述重鏈及輕鏈恆定區。此外，所產生之重鏈及輕鏈序列中之每一者均可組合形成完整抗原結合蛋白質結構。
互補決定區(CDR)為粗斜體，構架區(FR)為普通式。元件次序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
互補決定區(CDR)為粗斜體，構架區(FR)為普通式。元件次序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。
提供抗原結合蛋白質，其含有至少一個選自由如表1及2中所示之VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12及VH13組成之群的重鏈可變區(VH)及/或至少一個選自由如表1及2中所示之VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6組成之群的輕鏈可變區(VL)。
表2中列舉之每一重鏈可變區均可與表1中展示之任一輕鏈可變區組合形成抗原結合蛋白質。在一些情況下，抗原結合蛋白質包括來自表1及2中所列舉者之至少一個重鏈可變區及/或一個輕鏈可變區。在一些情況下，抗原結合蛋白質包括至少兩個與表1及2中所列舉者不同的重鏈可變區及/或輕鏈可變區。重鏈可變區之不同組合可與輕鏈可變區之不同組合中之任一者組合。
在其他情況下，抗原結合蛋白質含有兩個相同輕鏈可變區及/或兩個相同重鏈可變區。舉例而言，抗原結合蛋白質可為抗體或免疫功能性片段，其包含表1及2中列舉之輕鏈可變區對及重鏈可變區對之組合中的兩個輕鏈可變區及兩個重鏈可變區。該等包含兩個相同重鏈及輕鏈可變區之抗原結合蛋白質之實例包括：抗體A VH2/VL1；抗體A1 VH1/VL1；抗體A2 VH3/VL1；抗體A3 VH4/VL1；抗體A4 VH5/VL1；抗體A5 VH6/VL1；抗體A6 VH7/VL1；抗體A7 VH8/VL1；抗體B VH9/VL2；抗體C VH10/VL3；抗體D VH11/VL4；抗體E VH12/VL5及抗體F VH13/VL6。
一些所提供之抗原結合蛋白質包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，該重鏈可變區及/或輕鏈可變區之胺基酸序列在僅1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、31個或31個以上胺基酸殘基處與選自表1及2之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之序列不同，其中各該序列差異獨立地為一個胺基酸缺失、插入或取代。在一些抗原結合蛋白質中，輕鏈及重鏈可變區包含與表1及2中提供之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。其他抗原結合蛋白質(例如抗體或免疫功能片段)亦包括如本文中所描述之變異型重鏈區形式及/或變異型輕鏈區形式。
術語「一致性」係指兩個或兩個以上多肽分子或兩個或兩個以上聚核苷酸之序列之間的關係，如藉由對準及比較該等序列而測定。「一致性百分比」意謂所比較之分子中之胺基酸或核苷酸之間的相同殘基之百分比且係基於所比較之最小分子之尺寸計算。對於該等計算，必須藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)解決對準中之間隙(若存在)。可用於計算對準之核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中描述之方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，1988,New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，1988,SIAM J.Applied Math.48：1073。
在計算一致性百分比時，以使得序列之間的匹配最大化之方式將所比較之序列對準。用於測定一致性百分比之電腦程式為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res.12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。用電腦演算法GAP將待測定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸對準。對準序列以實現其各別胺基酸或核苷酸之最佳匹配(「匹配跨度」，如由演算法測定)。空位開放罰分(其計算為3倍平均對角線，其中「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線之平均值；「對角線」為由特定比較矩陣指派至各理想胺基酸匹配之分數或編號)及空位延伸罰分(其通常為空位開放罰分的1/10)以及比較矩陣(諸如PAM 250或BLOSUM 62)與演算法結合使用。在某些具體實例中，演算法亦使用標準比較矩陣(參見Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352(PAM 250比較矩陣)；Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：10915-10919(BLOSUM 62比較矩陣))。
推薦用於使用GAP程式測定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的參數如下：演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol.48：443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，Henikoff等人，1992，見上文；空位罰分：12(但末端空位不罰分)，空位長度罰分：4，相似性臨限值：0。某些用於將兩個胺基酸序列對準之對準方案可能僅引起兩個序列中之較短區域匹配且此較小對準區域可在兩個全長序列之間不存在顯著關係的情況下仍具有極高序列一 致性。因此，可視需要調節所選對準方法(GAP程式)以使對準跨越目標多肽之至少50個相連胺基酸。
互補決定區
互補決定區或「CDR」嵌入重鏈及輕鏈可變區中之構架內，其在該構架內構造負責抗原結合及識別之區域。相同物種之免疫球蛋白鏈之可變域例如通常呈現類似整體結構；包含由高變CDR區接合之相對保守構架區(FR)。抗原結合蛋白質可具有1、2、3、4、5、6個或6個以上CDR。以上論述之可變區例如通常包含3個CDR。來自重鏈可變區及輕鏈可變區之CDR通常由構架區對準以形成特異性結合於目標抗原(例如CD30L)之結構。自N端至C端，天然存在之輕鏈及重鏈可變區通常符合該等元件之以下次序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。例示性輕鏈可變域及重鏈可變域之CDR及FR區域於表1及2中突出表示。自該等突出表示之CDR及FR區域認識到其邊界可變化。已設計編號系統以指定佔據每一該等結構域中之位置的胺基酸之編號。可使用該等系統鑑別既定抗原結合蛋白質之互補決定區及構架區。編號系統定義於Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH公開案第91-3242號，1991或Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342：878-883中。其他用於免疫球蛋白鏈中之胺基酸的編號系統包括IMGT®(國際免疫遺傳學資訊系統(international ImMunoGeneTics information system)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.2005,29：185-203)；及AHo(Honegger及Pluckthun,J.Mol.Biol.2001,309(3)：657-670)。本文中提供之CDR不僅可用於定義傳統抗體結構之抗原結合域，且亦可如本文中所描述嵌入多種其他多肽結構中。
本文中揭示之抗原結合蛋白質為多肽，可將一或多個CDR移植、插入、嵌入及/或接合至其中。抗原結合蛋白質可具有例如1個重鏈 CDR1(「CDRH1」)及/或1個重鏈CDR2(「CDRH2」)及/或1個重鏈CDR3(「CDRH3」)及/或1個輕鏈CDR1(「CDRL1」)及/或1個輕鏈CDR2(「CDRL2」)及/或1個輕鏈CDR3(「CDRL3」)。一些抗原結合蛋白質包括CDRH3及CDRL3。特定具體實例通常利用非重複CDR之組合，例如通常不使用一個重鏈可變區中的兩個CDRH2區域製造抗原結合蛋白質等。抗原結合蛋白質可包含一或多個僅在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個或16個以上胺基酸殘基處與表3中呈現之CDR中之一或多者之胺基酸序列相同或不同的胺基酸序列，其中各該序列差異獨立地為一個胺基酸缺失、插入或取代。一些抗原結合蛋白質中之CDR包含與表3中列舉之CDR序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些抗原結合蛋白質中，將CDR嵌入「構架」區中，其將CDR位向從而獲得合適的CDR之抗原結合性質。
本文中提供CDR1區域，其包含SEQ ID NO：36、38、40、42及44之胺基酸殘基23-36；SEQ ID NO：46之胺基酸殘基25-36及SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70及72之胺基酸殘基31-35。提供CDR2區域，其包含SEQ ID NO：36、38、40、42、44及46之胺基酸殘基52-58及SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70及72之胺基酸殘基50-65。CDR3區域包含SEQ ID NO：36、38、40、42、44及46之胺基酸殘基91-100及SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70及72之胺基酸殘基98-113。
本文中揭示之CDR包括來源於相關序列群之一致序列。CDRL1一致序列由TGX1SSDX2GX3YX4YVS(SEQ ID NO：30)組成，其中X1為蘇胺酸或絲胺酸，X2為纈胺酸或異白胺酸，X3為纈胺酸、蘇胺酸或白胺酸且X4為天冬胺酸或天冬醯胺。
CDRL2一致序列由EVX1X2RPS(SEQ ID NO：31)組成，其中X1為絲胺酸、天冬醯胺或異白胺酸且X2為天冬醯胺或離胺酸。
CDRL3一致序列包括SSYX1SX2STWV(SEQ IDN NO：32)，其中X1為蘇胺酸或絲胺酸且X2為精胺酸或絲胺酸。
CDRH1一致序列由X1X2X3WX4(SEQ ID NO：33)組成，其中X1為絲胺酸或天冬醯胺，X2為酪胺酸或天冬醯胺，X3為異白胺酸、酪 胺酸或絲胺酸且X4為蘇胺酸或絲胺酸。在一個不同具體實例中，CDRH1一致序列由SYX3WX5(SEQ ID NO：75)組成，其中X3為I、S或Y且X5為T或S。
CDRH2一致序列由RX1X2X3SGX4X5NYX6PSLX7S(SEQ ID NO：34)組成，其中X1為異白胺酸、纈胺酸或蘇胺酸，X2為酪胺酸、苯丙胺酸或絲胺酸，X3為蘇胺酸、絲胺酸或丙胺酸，X4為異白胺酸、白胺酸、天冬醯胺、絲胺酸、精胺酸或麩醯胺酸，X5為蘇胺酸或天冬醯胺，X6為天冬醯胺或離胺酸且X7為離胺酸或精胺酸。
CDRH3一致序列由X1X2X3X4X5X6X7X8YX9YX10GX11DV(SEQ ID NO：35)組成，其中X1為麩胺酸或天冬胺酸，X2為精胺酸、酪胺酸或苯內胺酸，X3為纈胺酸、丙胺酸、精胺酸或蘇胺酸，X4為纈胺酸、蘇胺酸、甘胺酸或異白胺酸，X5為纈胺酸、丙胺酸或甘胺酸，X6為丙胺酸、蘇胺酸、甘胺酸或麩醯胺酸，X7為蘇胺酸、天冬胺酸、精胺酸或絲胺酸，X8為精胺酸或酪胺酸，X9為酪胺酸或組胺酸，X10為酪胺酸、天冬胺酸或絲胺酸且X11為甲硫胺酸、白胺酸或纈胺酸。
單株抗體
所提供之抗原結合蛋白質包括結合於CD30L之單株抗體。可使用此項技術中已知的任何技術製備單株抗體，例如藉由在完成免疫程式後使自轉殖基因動物獲得之脾細胞永生化。可使用此項技術中已知的任何技術使脾細胞永生化，例如藉由使其與骨髓瘤細胞融合以製備融合瘤。製備融合瘤之融合程序中所用骨髓瘤細胞較佳為非抗體產生、具有高融合效率及酶缺乏(使其不會在僅支援所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長)。用於小鼠融合之合適細胞株之實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用於大鼠融合之細胞株之 實例包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。其他適用於細胞融合之細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情況下，藉由以下方法製備融合瘤細胞株：用CD30L免疫原使動物(例如具有人免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)免疫；自免疫之動物獲得脾細胞；使所得脾細胞與骨髓瘤細胞株融合，從而產生融合瘤細胞；自融合瘤細胞製備融合瘤細胞株，及鑑別產生與CD30L多肽結合之抗體的融合瘤細胞株。該等融合瘤細胞株及由其產生之抗CD30L單株抗體為本申請案之態樣。
可使用此項技術中已知的任何技術純化由融合瘤細胞株分泌之單株抗體。可進一步篩選融合瘤或mAb以鑑別具有特定性質(諸如降低、抑制、阻礙或調節CD30L與CD30之相互作用的能力)之mAb。
嵌合及人類化抗體
亦提供基於前述序列之嵌合及人類化抗體。用作治療劑之單株抗體可在使用前以多種方式修飾。一個實例為嵌合抗體，其為由來自不同抗體之蛋白質區段構成之抗體，該等蛋白質區段共價接合以產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能部分。通常，重鏈及/或輕鏈之一部分與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該(等)鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源。關於與嵌合抗體有關之方法，參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855。CDR移植描述於例如美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
一種有效嵌合抗體為「人類化」抗體。通常，人類化抗體係自最初於非人類動物中產生之單株抗體製備。此單株抗體中之某些胺基酸殘基(通常來自該抗體之非抗原識別部分)經修飾以與相應同型之人類抗 體中之相應殘基同源。可例如使用多種方法藉由用齧齒動物可變區之至少一部分取代人類抗體之相應區域來進行人類化(參見例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，1986,Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332：323-27；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-1536)。
在某些具體實例中，來自除人類以外的物種之恆定區可與人類可變區一起使用以製備雜交抗體。
完全人類抗體
亦提供完全人類抗體。可利用無需使人類暴露於既定抗原即可產生對抗原具有特異性之完全人類抗體的方法(「完全人類抗體」)。一種所提供之用於製備完全人類抗體的特定手段為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源Ig基因不活化之小鼠中為一種在小鼠(其為可使用任何所需抗原免疫化之動物)中製備完全人類單株抗體(mAb)之方法。使用完全人類抗體可最小化免疫原性及過敏性反應，該等免疫原性及過敏性反應有時可由向人類投予小鼠mAb或小鼠來源mAb作為治療劑引起。
可藉由使能夠在不產生內源免疫球蛋白情況下產生人類抗體之譜系的轉殖基因動物(通常為小鼠)免疫來製備完全人類抗體。用於此目的之抗原通常具有6個或6個以上相連胺基酸，且視情況與載體(諸如半抗原)結合。參見例如Jakobovits等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，1993,Nature 362：255-258；及Bruggermann等人，1993,Year in Immunol.7：33。在該方法之一個實施例中，藉由使編碼小鼠重鏈及輕鏈免疫球蛋白鏈之內源小鼠免疫球蛋白基因座無能力，且將含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座的人類基因組DNA插入小鼠基因組大片段中來產生轉殖基因動物。接著使經部分修飾之動物(其具有少於人免疫球蛋白基因座之全部補體者)雜交以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動 物。當投予免疫原時，該等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫特異性但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於該等方法之其他細節參見例如WIPO專利公開案WO96/33735及WO94/02602。其他關於轉殖基因小鼠之用於製備人類抗體之方法描述於美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號；WIPO專利公開案WO91/10741、WO90/04036以及EP 546073B1及EP 546073A1中。
上述轉殖基因小鼠含有人免疫球蛋白基因微型基因座，其編碼未經重組之人類重鏈([μ]及[γ])及[κ]輕鏈免疫球蛋白序列，以及使內源[μ]及[κ]鏈基因座不活化之目標突變(Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859)。因此，小鼠呈現小鼠IgM或[κ]表現降低且對免疫起反應，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgG[κ]單株抗體(Lonberg等人，見上文；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546)。該等小鼠之製備方法詳細描述於Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen等人，1993,International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1994,J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology 113：49-101；Taylor等人，1994,International Immunology 6：579-591；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology 14：845-85中。亦參見美國專利第5,545,806號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；WIPO公開案第WO 93/1227號；第WO 92/22646號；及第WO 92/03918號。用於在該等轉殖基 因小鼠中產生人類抗體之技術亦揭示於WIPO公開案第WO 98/24893號及Mendez等人，1997,Nature Genetics 15：146-156中。舉例而言，HCo7及HCo12轉殖基因小鼠品系可用於產生抗CD30L抗體。
使用融合瘤技術，可自轉殖基因小鼠(諸如上述轉殖基因小鼠)產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類mAb。該等抗體可使用合適載體及宿主細胞選殖及表現，或可自培養之融合瘤細胞收集抗體。
完全人類抗體亦可來源於噬菌體呈現文庫(諸如Hoogenboom等人，1991,J.Mol.Biol.227：381；Marks等人，1991,J.Mol.Biol.222：581；WIPO公開案第WO 99/10494號中所揭示)。噬菌體呈現技術經由在絲狀噬菌體表面上呈現抗體譜系且隨後藉由抗體譜系與所選抗原之結合選擇噬菌體來模仿免疫選擇。
雙特異性或雙功能性抗原結合蛋白質
「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能性」抗原結合蛋白質或抗體分別為雜交抗原結合蛋白質或抗體，其具有兩個不同抗原結合位點，諸如一或多個CDR或一或多個可變區(如上文所描述)。在一些情況下，其為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人工雜交抗體。多特異性抗原結合蛋白質或「多特異性抗體」為靶向一個以上抗原或抗原決定基者。雙特異性抗原結合蛋白質及抗體為多特異性抗原結合蛋白質抗體中的一種且可由多種方法製備，包括(但不限於)融合瘤之融合或Fab'片段之連接。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547-1553。
免疫片段
抗原結合蛋白質亦包括抗體之免疫片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。「Fab片段」包含一個輕鏈(輕鏈可變區(VL)及其相應恆定域(CL))及一個重鏈(重鏈可變區(VH)及第一恆定域(CH1))。Fab分 子之重鏈無法與另一個重鏈分子形成雙硫鍵。「Fab'片段」含有一個輕鏈及一個重鏈之一部分，該重鏈之一部分亦含有CH1與CH2結構域之間的區域，使得可在兩個Fab'片段之兩個重鏈之間形成鏈間雙硫鍵以形成F(ab')2分子。因此「F(ab')2片段」係由兩個Fab'片段構成，該兩個Fab'片段由兩個重鏈之間的雙硫鍵結合在一起。「Fv片段」由抗體之單臂之可變輕鏈區及可變重鏈區組成。單鏈抗體「scFv」為Fv分子，其中重鏈及輕鏈可變區由可撓性連接子連接以形成單一多肽鏈，該單一多肽鏈形成抗原結合區。單鏈抗體詳細論述於WIPO公開案第WO 88/01649號、美國專利第4,946,778號及第5,260,203號；Bird,1988,Science 242：423；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879；Ward等人，1989,Nature 334：544；de Graaf等人，2002,Methods Mol Biol.178：379-387；Kortt等人，1997,Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001,Biomol.Eng.18：95-108及Kriangkum等人，2001,Biomol.Eng.18：31-40中。「Fc」區域含有兩個重鏈片段，包含抗體之CH2及CH3結構域。該兩個重鏈片段由兩個或兩個以上雙硫鍵及由CH3結構域之疏水性相互作用結合在一起。
亦包括結構域抗體，其為僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區域藉由肽連接子共價接合以產生二價結構域抗體。二價結構域抗體之兩個VH區域可靶向相同或不同抗原。雙功能抗體為包含兩個多肽鏈之二價抗體，其中各多肽鏈包含由連接子接合之VH及VL結構域，該連接子過短從而無法實現同一鏈上兩個結構域之間的配對，因此使各結構域與另一多肽鏈上之互補結構域配對(參見例如Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48,1993及Poljak等人，Structure 2：1121-23,1994)。類似地，三功能抗體及四功能抗體分別為包含三個及四個多肽鏈且分別形成三個及四個抗原結合位點之抗體，該等抗原結合位點可相同或不同。最大抗體包含共價連接至IgG1之Fc區域的二價scFv(參見例如Fredericks等人，2004,Protein Engineering, Design & Selection,17：95-106；Powers等人，2001,Journal of Immunological Methods,251：123-135；Shu等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7995-7999；Hayden等人，1994,Therapeutic Immunology 1：3-15)。
各種其他形式
亦提供以上揭示之抗原結合蛋白質之變異形式，一些抗原結合蛋白質在一或多個列舉於表1及2中之重鏈或輕鏈、可變區或CDR中具有例如一或多個保守胺基酸取代。
天然存在之胺基酸可基於普通側鏈性質分類：疏水性(正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile)；中性親水性(Cys、Ser、Thr、Asn、Gln)；酸性(Asp、Glu)；鹼性(His、Lys、Arg)；影響鏈位向之殘基(Gly、Pro)；及芳族(Trp、Tyr、Phe)。
保守胺基酸取代可涉及該等類別中之一者之成員與同一類別中之另一成員之交換。保守胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非生物系統中之合成併入。該等非天然存在之胺基酸殘基包括肽模擬劑及胺基酸部分之其他反向或反轉形式。可藉由在維持(a)取代區域中分子主鏈之結構，例如片狀或螺旋狀構形，(b)目標位點處分子之電荷或疏水性或(c)側鏈之膨脹度的作用方面顯著不同之重鏈及輕鏈之胺基酸序列中進行取代來實現本文中所描述之抗原結合蛋白質之功能及/或生物化學特性之該等實質改良。
非保守性取代可涉及上述類別中之一者之成員與來自另一類別之成員之交換。可將該等經取代之殘基引入與人類抗體同源之抗體區域或分子之非同源區域中。
在產生該等變化時，根據某些具體實例，可考慮胺基酸之親水指數。藉由將各胺基酸指定一個數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈重複計算該等值之平均值來計算蛋白質之親水概況。已基於各胺基酸之疏水性 及電荷特性指定其親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸鹽(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
此項技術中已理解親水概況對賦予蛋白質相互作用生物功能之重要性(參見例如Kyte等人，1982,J.Mol.Biol.157：105-131)。已知某些胺基酸可取代其他具有類似親水指數或分數之胺基酸且仍保留類似生物活性。在某些具體實例中，當基於親水指數進行變化時，包括親水指數在±2範圍內之胺基酸之取代。在一些態樣中，包括親水指數在±1範圍內之胺基酸之取代，且在其他態樣中，包括親水指數在±0.5範圍內之胺基酸之取代。
此項技術中亦理解，可基於親水性有效地進行類似胺基酸之取代，尤其當由此產生之生物學功能蛋白質或肽意欲用於免疫學具體實例(如本發明之情況)時。在某些具體實例中，蛋白質之最大局部平均親水性(如取決於其相連胺基酸之親水性)與其免疫原性及抗原結合或免疫原性有關，亦即與蛋白質之生物學性質有關。
已指定該等胺基酸殘基具有以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸(-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。當基於類似親水性值進行變化時，在某些具體實例中，包括親水性值在±2範圍內之胺基酸之取代，在其他具體實例中，包括親水性值在±1範圍內之胺基酸之取代且在其他具體實例中，包括親水性值在±0.5範圍內之胺基酸之取代。在一些情況下，亦可基於親水性鑑別來自一級胺 基酸序列(primary amino acid sequence)之抗原決定基。該等區域亦稱為「抗原決定基核心區域」。
例示性保守胺基酸取代闡述於表4中。
熟習此項技術者將能夠使用熟知技術確定如本文中闡述之多肽之合適變異體。熟習此項技術者可鑑別可由靶向咸信對活性不重要之區域在不損害活性情況下改變之合適分子區域。熟習此項技術者亦能夠鑑別類似多肽中保留之殘基及分子部分。在其他具體實例中，即使可能對生物活性或結構重要的區域亦可在不損害生物活性或對多肽結構無不利影響之情況下經歷保守胺基酸取代。
此外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似的對活性或結構重要的多肽中之殘基之結構-功能研究。鑒於該比較，可預測蛋白質中胺基酸殘基(對應於類似蛋白質中對活性或結構重要的胺基酸殘基)之重要性。熟習此項技術者可選擇化學上類似的胺基酸取代以用於該等預測重要的胺基酸殘基。
熟習此項技術者亦可分析與類似多肽中之該結構有關的三維結構及胺基酸序列。鑒於該資訊，熟習此項技術者可關於抗體之三維結構預測其胺基酸殘基之對準。熟習此項技術者可選擇對預計位於蛋白質表面上之胺基酸殘基不造成根本變化，因為該等殘基可能涉及重要的與其他 分子之相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用分析法篩選該等變異體之CD30L活性(參見以下實施例部分)，從而產生關於哪些胺基酸可變化且哪些胺基酸不可變化之資訊。換言之，基於由該等常規實驗收集到之資訊，熟習此項技術者可容易地確定應避免進行進一步取代(單獨或與其他突變組合)之胺基酸位置。
許多科技出版物致力於預測二級結構。參見Moult,1996,Curr.Op.in Biotech.7：422-427；Chou等人，1974,Biochem.13：222-245；Chou等人，1974,Biochemistry 113：211-222；Chou等人，1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47：45-148；Chou等人，1979,Ann.Rev.Biochem.47：251-276；及Chou等人，1979,Biophys.J.26：367-384。此外，當前可使用電腦程式幫助預測二級結構。一種預測二級結構之方法係基於同源性模型化。舉例而言，序列一致性大於30%或相似性大於40%之兩個多肽或蛋白質通常具有類似結構拓撲。近來蛋白質結構資料庫(PDB)之發展使二級結構(包括多肽或蛋白質結構內之可能摺疊數)之可預測性增強。參見Holm等人，1999,Nucl.Acid.Res.27：244-247。已提出(Brenner等人，1997,Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)既定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一旦已解析臨界數目之結構，則結構預測將變得顯著更加精確。
其他預測二級結構之方法包括「線緒法(threading)」(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-387；Sippl等人，1996,Structure 4：15-19)、「概況分析」(Bowie等人，1991,Science 253：164-170；Gribskov等人，1990,Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，1987,Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)及「進化連鎖(evolutionary linkage)」(參見Holm,1999，見上文；及Brenner,1997，見上文)。
在一些具體實例中，進行具有以下作用之胺基酸取代：(1) 降低對蛋白水解作用之敏感性，(2)降低對氧化之敏感性，(3)改變用於形成蛋白質複合物之結合親和力，(4)改變配位子或抗原結合親和力及/或(4)賦予該等多肽其他物理化學或功能性質或改良該等多肽之性質，諸如保持取代區內分子主鏈之結構，例如保持片狀或螺旋狀構形；保持或改變目標位點處分子之電荷或疏水性，或保持或改變側鏈之膨脹度。
舉例而言，可在天然存在之序列中進行單個或多個胺基酸取代(在某些具體實例中，保守胺基酸取代)。取代可在抗體位於形成分子間接觸之結構域外部的部分中進行。在該等具體實例中，可使用不實質上改變親本序列之結構特性的保守胺基酸取代(例如一或多個不破壞特性化親本或天然抗原結合蛋白質之二級結構的置換胺基酸)。技術上認可之多肽二級及三級結構之實例描述於Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編)，1984,W.H.New York：Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編)，1991,New York：Garland Publishing；及Thornton等人，1991,Nature 354：105中。
其他變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。半胱胺酸變異體係有用的，尤其當抗體(例如)必須再摺疊為生物學活性構形時。半胱胺酸變異體之半胱胺酸殘基可少於原生蛋白質，且通常具有偶數個半胱胺酸殘基以最小化由未配對半胱胺酸引起之相互作用。
所揭示之重鏈及輕鏈可變區以及CDR可用於製備抗原結合蛋白質，其含有可特異性結合於CD30L多肽之抗原結合區。「抗原結合區」意謂特異性結合於指定抗原之蛋白質或蛋白質之一部分，諸如含有與抗原相互作用且賦予抗原結合蛋白質對目標抗原之特異性及親和力之胺基酸殘基的區域。抗原結合區可包括一或多個CDR且某些抗原結合區亦包括一或多個「構架」區。舉例而言，表3中列舉之CDR中之一或多者可以共價或 非共價方式併入分子(例如多肽)中以產生免疫黏附。免疫黏附可合併有CDR作為較大多肽鏈之一部分、可將CDR共價連接至另一多肽鏈或可以非共價方式合併有CDR。CDR使免疫黏附能夠特異性結合於相關特定抗原(例如CD30L多肽)。
其他抗原結合蛋白質包括基於本文中所描述之可變區及CDR之模擬劑(例如「肽模擬劑(peptide mimetics/peptidomimetics)」)。該等類似物可為肽、非肽或肽與非肽區之組合。Fauchere,1986,Adv.Drug Res.15：29；Veber及Freidinger,1985,TINS第392頁；及Evans等人，1987,J.Med.Chem.30：1229。結構上類似於治療學上有效肽之肽模擬劑可用於產生類似治療性或預防性作用。通常借助於電腦化分子模型化研發該等化合物。通常，肽模擬劑為結構上類似於顯示所需生物活性(諸如抑制或阻斷CD30與CD30L之相互作用的能力)之抗原結合蛋白質的蛋白質，但肽模擬劑具有一或多個視情況藉由此項技術中熟知的方法由選自例如以下之鍵置換的肽鍵：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。本發明之某些具體實例中可使用相同類型D-胺基酸對一致序列之一或多個胺基酸進行系統取代(例如D-離胺酸代替L-離胺酸)以產生更穩定的蛋白質。此外，可藉由此項技術中已知的方法產生包含一致序列或實質上相同的一致序列變化之限制性肽(Rizo及Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem.61：387)，例如藉由添加能夠形成分子內二硫鍵(其使肽環化)之內部半胱胺酸殘基。
亦提供本文中所描述之抗原結合蛋白質之衍生物。衍生化抗原結合蛋白質可包含任何賦予抗原結合蛋白質或片段所需性質(諸如在特定用途中半衰期延長)的分子或物質。衍生化抗原結合蛋白質可包含(例如)可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色性、抗原性或酶性分子，可偵測珠粒(諸如磁性或電子緻密(例如金)珠粒)或結合於另一分子之 分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素))、治療性或診斷性部分(例如放射性、細胞毒性或醫藥學上活性部分)或增加抗原結合蛋白質用於特定用途(例如投予個體(諸如人類個體)或其他活體內或活體外用途)之適宜性的分子。可用於衍生抗原結合蛋白質之分子之實例包括白蛋白(例如人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。可使用此項技術中熟知的技術製備抗原結合蛋白質之白蛋白連接及聚乙二醇化衍生物。在一個具體實例中，抗原結合蛋白質結合於或以其他方式連接於運甲狀腺素蛋白(TTR)或TTR變異體。可用例如選自由以下組成之群的化學品對TTR或TTR變異體進行化學修飾：聚葡萄糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括抗CD30L抗原結合蛋白質與其他蛋白質或多肽之共價或聚集結合物(諸如藉由包含與CD30L抗原結合蛋白質之N端或C端融合之異源多肽之重組融合蛋白質之表現)。舉例而言，結合肽可為異源信號(或前導)多肽，例如酵母α-因子前導序列，或諸如抗原決定基標籤之肽。含有CD30L抗原結合蛋白質之融合蛋白質可包含所添加之肽以促進CD30L抗原結合蛋白質之純化或鑑別(例如聚His)。CD30L抗原結合蛋白質亦可連接於FLAG肽，如Hopp等人，1988,Bio/Technology 6：1204；及美國專利第5,011,912號中所描述。FLAG肽為高抗原性且提供由特異性單株抗體(mAb)可逆結合之抗原決定基，從而使得可快速分析及易於純化經表現之重組蛋白質。適用於製備其中FLAG肽與既定多肽融合之融合蛋白質的試劑係可商購的(Sigma,St.Louis,MO)。
含有一或多種CD30L抗原結合蛋白質之寡聚物可用作CD30L拮抗劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接二聚體、三聚體或更高級寡聚物形式。預期使用包含兩種或兩種以上CD30L抗原結合蛋白質之寡聚物，其中一個實例為同質二聚體。其他寡聚物包括異質二聚體、同質三 聚體、異質三聚體、同質四聚體、異質四聚體等。亦包括包含多個經與CD30L抗原結合蛋白質融合之肽部分之間的共價或非共價相互作用接合之CD30L結合蛋白質的寡聚物。該等肽可為肽連接子(間隔基)，或具有寡聚作用促進性之肽。美國專利第4,751,180號及第4,935,233號中所描述者在合適肽連接子之中。白胺酸拉鏈及某些來源於抗體之多肽在可促進所連接之CD30L抗原結合蛋白質之寡聚作用的肽之中。適用於製備可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈結構域之實例描述於WIPO公開案第WO 94/10308號；Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191；及Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-278中。在一種方法中，包含與白胺酸拉鏈肽融合之CD30L抗原結合蛋白質片段或衍生物之重組融合蛋白質表現於合適宿主細胞中，且自培養物上清液回收所形成之可溶性寡聚CD30L抗原結合蛋白質片段或衍生物。
該等寡聚物可包含2至4個CD30L抗原結合蛋白質。寡聚物之CD30L抗原結合蛋白質部分可呈任一種上述形式，例如變異體或片段。寡聚物較佳包含具有CD30L結合活性之CD30L抗原結合蛋白質。可使用來源於免疫球蛋白之多肽製備寡聚物。包含某些與抗體衍生之多肽之各個部分(包括Fc結構域)融合之異源多肽的融合蛋白質之製備方法已例如由Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Byrn等人，1990,Nature 344：677；及Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁描述。
亦包括二聚體，其包含兩個由CD30L抗原結合蛋白質與抗體之Fc區域融合產生之融合蛋白質。可例如藉由以下方式製備二聚體：將編碼融合蛋白質之基因融合物插入合適表現載體中，在經重組表現系統轉型之宿主細胞中表現基因融合物及使經表現之融合蛋白質組合更類似的抗體分子，由此在Fc部分之間形成鏈間雙硫鍵以產生二聚體。該等Fc多肽包 括來源於抗體之Fc區域之多肽之原生及突變蛋白質形式。亦包括該等多肽之截短形式，其含有促進二聚作用之絞鏈區。包含Fc部分之融合蛋白質(及由其形成之寡聚物)提供易於在蛋白質A或蛋白質G管柱上藉由親和層析純化之優點。一種合適Fc多肽(描述於WIPO公開案第WO 93/10151號及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中)為自人類IgG1抗體之Fc區域之N端絞鏈區延伸至原生C端之單鏈多肽。另一種有效Fc多肽為美國專利第5,457,035號及Baum等人，1994,EMBO J.13：3992-4001中所描述之Fc突變蛋白質。除胺基酸19由Leu變為Ala、胺基酸20由Leu變為Glu且胺基酸22由Gly變為Ala外，此突變蛋白質之胺基酸序列與WIPO公開案第WO 93/10151號中呈現之原生Fc序列之胺基酸序列相同。突變蛋白質對Fc受體之親和力降低。
糖基化作用
抗原結合蛋白質可具有與原生物種中不同或由原生物種中改變之糖基化作用模式。如此項技術中已知，糖基化作用模式可視蛋白質序列(例如存在或不存在特定糖基化作用胺基酸殘基，下文中論述)或產生蛋白質之宿主細胞或有機物而定。特定表現系統論述於下文中。
多肽之糖基化作用通常為N-連接型或O-連接型。N-連接型係指碳水化物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外的任何胺基酸)為碳水化物部分與天冬醯胺側鏈之酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在該等三肽序列中之任一種均可產生潛在糖基化作用位點。O-連接型糖基化作用係指糖類N-乙醯基半乳糖胺、半乳糖或木糖中之一者連接至羥胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，但亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
藉由改變胺基酸序列使得其含有一或多個上述三肽序列來便利地向抗原結合蛋白質中添加糖基化作用位點(對於N-連接型糖基化作 用位點)。亦可藉由向起始序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基進行取代來進行改變(對於O-連接型糖基化作用位點)。為方便起見，可經由DNA含量變化來改變抗原結合蛋白質胺基酸序列，尤其藉由使編碼目標多肽之DNA中預先選擇之鹼基突變使得產生將翻譯為所需胺基酸的密碼子來改變。
另一種增加抗原結合蛋白質上碳水化合物部分數目之手段為藉由醣苷與蛋白質之化學或酶促偶合。該等程序之有利之處在於其無需在具有進行N-連接型及O-連接型糖基化作用之糖基化作用能力的宿主細胞中產生蛋白質。視所用偶合模式而定，糖可連接至(a)精胺酸及組胺酸，(b)自由羧基，(c)自由硫氫基，諸如半胱胺酸之自由硫氫基，(d)自由羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之自由羥基，(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基或(f)麩醯胺酸之醯胺基。該等方法描述於PCT公開案第WO 87/05330號及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev,Biochem.，第259-306頁中。
可由化學或酶促方式移除起始抗原結合蛋白質上存在之碳水化合物部分。化學去糖基化作用需要使蛋白質暴露於化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此處理過程引起除連接糖(N-乙醯基葡萄糖胺或N-乙醯基半乳糖胺)以外的大部分或所有糖裂解而使多肽完整。化學去糖基化作用由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem.118：131描述。多肽上之碳水化合物部分之酶促裂解可使用多種內醣苷酶及外醣苷酶實現，如由Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350描述。可使用化合物衣黴素(tunicamycin)阻止潛在糖基化作用位點處之糖基化作用，如由Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105描述。衣黴素阻斷蛋白質-N-醣苷鍵之形成。
因此，態樣包括抗原結合蛋白質之糖基化作用變異體，其中 與親本多肽之胺基酸序列相比，糖基化作用位點之數目及/或類型改變。在某些具體實例中，抗原結合蛋白質變異體之N-連接型糖基化作用位點數目大於或小於親本多肽。進行消除或改變此序列之取代可阻止添加親本多肽中存在之N-連接型碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由Asn缺失或藉由用不同胺基酸取代Asn來降低糖基化作用。抗體通常在Fc區域中具有N-連接型糖基化作用位點。
標記及效應子基團
抗原結合蛋白質可包含一或多個標記。術語「標記」或「標記基團」係指任何可偵測標記。通常，視偵測標記之分析法而定，其分為多種類別：a)同位素標記，其可為放射性或重同位素；b)磁性標記(例如磁性粒子)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素化基團；及f)由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、用於二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些具體實例中，標記基團經各種長度之間隔臂(spacer arm)與抗原結合蛋白質偶合以降低潛在位阻。此項技術中已知多種用於標記蛋白質之方法。合適標記基團之實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素、磷光體)、酶基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學螢光基團、生物素基團或由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、用於二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些具體實例中，標記基團經各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白質偶合以降低潛在位阻。此項技術中已知多種用於標記蛋白質之方法且可在適當時使用。
術語「效應子基團」意謂任何與充當細胞毒性劑之抗原結合 蛋白質偶合之基團。合適效應子基團之實例為放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其他合適基團包括毒素、治療基團或化學治療基團。合適基團之實例包括卡爾奇黴素(calicheamicin)、奧瑞斯達汀(auristatins)、格爾德黴素(geldanamycin)及美登素(maytansine)。在一些具體實例中，效應子基團經各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白質偶合以降低潛在位阻。
編碼CD30L抗原結合蛋白質之聚核苷酸
亦提供編碼本文中所描述之抗原結合蛋白質或其部分之聚核苷酸，包括編碼抗體中之一個或兩個鏈或其片段、衍生物、突變蛋白質或變異體之聚核苷酸；編碼重鏈可變區或僅編碼CDR之聚核苷酸；足以用作用於鑑別、分析編碼多肽之聚核苷酸、使其突變或對其擴增之雜交探針、PCR引子或定序引子之聚核苷酸；用於抑制聚核苷酸之表現之反義核酸；及以上各者之互補序列。聚核苷酸可具有任何長度。其長度可為例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、85、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000個或5,000個以上核苷酸(包括所有介於其間的值)及/或可包含一或多個其他序列(例如調節序列)及/或為更大聚核苷酸(例如載體)之一部分。聚核苷酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核酸及其人工變異體(例如肽核酸)。
可自已使用CD30L或其免疫原片段進行免疫之小鼠之B細胞分離編碼某些抗原結合蛋白質或其部分(例如全長抗體、重鏈或輕鏈、可變域、或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3)之聚核苷酸。可藉由習知程序(諸如聚合酶鏈反應(PCR))分離聚核苷酸。噬菌體呈現為可用於製備抗體及其他抗原結合蛋白質之衍生物之已知技術的另一實例。在一種方法中，作為相關抗原結合蛋白質之組分之多肽表現於任何合適重組表現系統中，且可組合表現之多肽以形成抗原結合蛋白質分 子。亦使用噬菌體呈現經鏈改組衍生具有不同性質(亦即對其結合之抗原之親和力不同)之抗原結合蛋白質，參見Marks等人，1992,BioTechnology 10：779。
由於遺傳密碼簡併，本文中描繪之多肽序列中之每一者亦由除所提供之聚核苷酸以外的許多其他聚核苷酸序列編碼。舉例而言，本文中提供之重鏈可變域可由聚核苷酸序列SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71及73編碼。輕鏈可變域可由聚核苷酸序列SEQ ID NO：37、39、41、43、45及47編碼。因此一般熟習此項技術者應瞭解，本申請案提供編碼每一種抗原結合蛋白質之每一種簡併核苷酸序列之充分書面說明及實現方法。
一個態樣進一步提供在特定雜交條件下與其他聚核苷酸分子雜交之聚核苷酸。核酸雜交方法、影響雜交條件選擇之基本參數及設計合適條件之指導已在此項技術中熟知。參見例如Sambrook,Fritsch及Maniatis(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.and Current Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel等人編，John Wiley & Sons公司)。如本文中定義，中等嚴格性雜交條件使用含有5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、約50%甲醯胺之雜交緩衝劑、6×SSC之預洗溶液及55℃雜交溫度(或其他類似雜交溶液，諸如含有約50%甲醯胺之雜交溶液及42℃雜交溫度)，且洗滌條件為60℃下於0.5×SSC、0.1% SDS中。嚴格雜交條件在45℃下於6×SSC中雜交，接著在68℃下於0.1×SSC、0.2% SDS中洗滌一或多次。此外，熟習此項技術者可操縱雜交及/或洗滌條件以增加或降低雜交嚴格性使得包含核酸序列之聚核苷酸通常保持彼此雜交，該等核酸序列彼此具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性。
可藉由突變將變化引入聚核苷酸中，從而引起其編碼之多肽(例如抗原結合蛋白質或抗原結合蛋白質衍生物)之胺基酸序列之變化。可使用此項技術中已知的任何技術引入突變，諸如定點突變誘發及隨機突變誘發。可針對所需性質表現及選擇突變型多肽。可在不顯著改變聚核苷酸編碼之多肽之生物活性的情況下將突變引入聚核苷酸中。舉例而言，非必需胺基酸殘基處之取代。或者，可將選擇性改變聚核苷酸編碼之多肽之生物活性的一或多個突變引入聚核苷酸中。舉例而言，突變可以定量或定性方式改變生物活性，諸如增加、降低或消除活性及改變抗原結合蛋白質之抗原特異性。
另一態樣提供適用作用於偵測核酸序列之引子或雜交探針之聚核苷酸。聚核苷酸可僅包含編碼全長多肽之核酸序列之一部分，例如可用作探針或引子之片段或編碼多肽之活性部分(例如CD30L結合部分)之片段。基於核酸序列之探針可用於偵測核酸或類似核酸，例如編碼多肽之轉錄物。探針可包含標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔助因子。該等探針可用於鑑別表現多肽之細胞。
表現抗原結合蛋白質之方法
本文中提供之抗原結合蛋白質可由多種習知技術中之任一種製備。舉例而言，可使用此項技術中已知的任何技術藉由重組表現系統製備CD30L抗原結合蛋白質。參見例如Monoclonal Antibodies,Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編)Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。
本文中亦提供呈質體、表現載體、轉錄或表現卡匣形式之表現系統及構築體，其包含至少一個如上文所描述之聚核苷酸，以及包含該等表現系統或構築體之宿主細胞。如本文中所用，「載體」意謂任何適用於 將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中的分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。載體之實例包括(但不限於)質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。表現載體(諸如重組表現系統)適用於宿主細胞之轉型且含有核酸序列，該等核酸序列引導及/或控制(與宿主細胞結合)一或多個與其可操作地連接之異源編碼區之表現。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制轉錄、翻譯及(若存在內含子)影響與其可操作地連接之編碼區之RNA剪接的序列。「可操作地連接」意謂該術語所適用之組分處於允許其執行其固有功能的關係。舉例而言，排列載體中與蛋白質編碼序列「可操作地連接」之控制序列(例如啟動子)使得控制序列之正常活性引起蛋白質編碼序列之轉錄，從而引起所編碼蛋白質之重組表現。
另一態樣提供宿主細胞，可將表現載體(諸如重組表現系統)引入該等宿主細胞中。宿主細胞可為任何原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞(例如CHO細胞))。可經習知轉型或轉染技術將載體DNA引入原核或真核細胞中。對於哺乳動物細胞之穩定轉染，已知視所用表現載體及轉染技術而定，僅小部分細胞可將外部DNA整合至其基因組中。為鑑別及選擇該等整合物，通常將編碼可選擇標記(例如用於抗生素抗性)之基因引入宿主細胞以及相關基因中。較佳可選擇標記包括賦予抗藥性之標記(諸如G418、潮黴素(hygromycin)及甲胺喋呤)。可藉由藥物選擇鑑別經所引入之聚核苷酸穩定轉染之細胞(例如已併入可選擇標記基因之細胞將存活而其他細胞死亡)，亦可使用其他方法。
抗原結合蛋白質可表現於融合瘤細胞株中(例如尤其抗體可表現於融合瘤中)或除融合瘤以外的細胞株中。編碼抗原結合蛋白質之表現構築體可用於轉型哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。可使用任何已知 的用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之方法進行轉型，包括例如將聚核苷酸封裝於病毒或噬菌體中且用構築體藉由此項技術中已知的轉染程序對宿主細胞進行轉導，如由美國專利第4,399,216號；第4,912,040號；第4,740,461號及第4,959,455號所例示。所用最佳轉型程序將視所轉型之宿主細胞之類型而定。用於將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法在此項技術中已為吾人所熟知且包括(但不限於)聚葡萄糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、聚凝胺介導之轉染、原生質體融合、電致孔、脂質體中聚核苷酸之封裝、將核酸與帶正電荷之脂質混合及將DNA直接顯微注射至細胞核中。
重組表現構築體通常包含編碼多肽之聚核苷酸。多肽可包含以下中之一或多者：一或多個諸如本文中提供之CDR；輕鏈可變區；重鏈可變區；輕鏈恆定區；重鏈恆定區(例如CH1、CH2及/或CH3)；及/或CD30L抗原結合蛋白質之另一骨架部分。使用標準接合技術將該等核酸序列插入合適表現載體中。在一個具體實例中，將重鏈或輕鏈恆定區附接至本文中提供之重鏈或輕鏈可變區之C端且接合至表現載體中。通常選擇在所用特定宿主細胞中具有功能性之載體(亦即載體與宿主細胞機器相容、允許發生基因之擴增及/或表現)。在一些具體實例中，使用可使用蛋白質報導體進行蛋白質-片段互補分析法之載體，諸如二氫葉酸還原酶(參見例如美國專利第6,270,964號)。合適表現載體可例如自Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA)或BD Biosciences(San Jose,CA)購得。其他適用於抗體及片段之選殖及表現的載體包括Bianchi及McGrew,2003,Biotech.Biotechnol.Bioeng.84：439-44中描述之載體。其他合適表現載體論述於例如Methods Enzymol.，第185卷(D.V.Goeddel編)，1990,New York：Academic Press中。
通常，用於任一種宿主細胞中之表現載體均將含有用於質體保持及用於外源核苷酸序列之選殖及表現的序列。在某些具體實例中，該等序列(統稱為「側接序列」)將通常包括以下核苷酸序列中之一或多者： 啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供體及受體剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列之序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現多肽之聚核苷酸的多酶切點接頭(polylinker)區域及可選擇之標記元件。可由起始載體(諸如市售載體)構築所提供之表現載體。該等載體可能含有或可能不含有所有所需側接序列。當載體中不存在一或多個本文中所描述之側接序列時，可個別地獲得該一或多個側接序列且將其接合至載體中。用於獲得各側接序列之方法已為熟習此項技術者所熟知。
載體可視情況含有「標籤」編碼序列(亦即位於CD30L抗原結合蛋白質編碼序列之5'端或3'端處之寡核苷酸分子)；編碼polyHis(諸如hexaHis)之寡核苷酸序列或市售抗體為之存在之另一「標籤」(諸如FLAG®、HA(血球凝集素流感病毒)或myc)。此標籤通常在多肽表現時與多肽融合，且可充當用於自宿主細胞親和純化或偵測CD30L抗原結合蛋白質之手段。親和純化可例如藉由使用針對標籤之抗體作為親和基質進行管柱層析來完成。接著可視情況藉由多種手段(諸如使用某些用於裂解之肽酶)自純化之CD30L抗原結合蛋白質移除標籤。
側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同之物種及/或品系)、異源(亦即來自除宿主細胞物種或品系以外的物種)、雜交(亦即來自一種以上來源之側接序列之組合)、合成或天然的。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體或任何植物，限制條件為側接序列在宿主細胞機器中發揮功能且可由宿主細胞機器活化。
適用於載體中之側接序列可由此項技術中熟知的若干種方法中之任一種獲得。通常，本文中之有效側接序列已藉由定位及/或限制酶消化預先鑑別且因此可使用合適的限制核酸內切酶自合適組織來源分離。 在一些情況下，側接序列之完全核苷酸序列可為已知的。此處，可使用本文中所描述用於核酸合成或選殖之方法合成側接序列。
無論已知所有側接序列或僅已知一部分側接序列，其均可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由用來自相同或另一物種之合適探針(諸如寡核苷酸及/或側接序列片段)篩選基因組文庫來獲得。當側接序列為未知時，可自較大片的可能含有例如編碼序列或甚至另一基因或其他基因之DNA分離含有側接序列之DNA片段。分離可藉由進行限制酶消化以產生合適DNA片段，接著使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®管柱層析(Qiagen,Chatsworth,CA)或熟習此項技術者已知的其他方法進行分離來實現。一般熟習此項技術者顯然可容易地選擇達成此目的之合適酶。
複製起點通常為市售原核表現載體之一部分，且複製起點有助於宿主細胞中載體之擴增。若所選載體不含複製起點位點，則可基於已知序列化學合成且接合至載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適用於大部分革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacteria)且多種病毒起點(例如SV40、多瘤、腺病毒、水泡性口膜炎病毒(VSV)或乳突狀瘤病毒(諸如HPV或BPV))適用於選殖哺乳動物細胞中之載體。通常，哺乳動物表現載體無需複製起點組分(例如通常僅使用SV40起點，因為其亦含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區之末端3'位且用於終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列通常為富含G-C之片段後接聚T序列。序列易於自文庫選殖或甚至以載體之部分形式商購，但其亦可使用核酸合成方法(諸如本文中所描述之核酸合成方法)容易地合成。
可選擇標記基因編碼生長於選擇性培養基中之宿主細胞之存活及生長所必需的蛋白質。典型選擇標記基因編碼起以下作用之蛋白質：(a)賦予原核宿主細胞對抗生素或其他毒素(例如安比西林(ampicillin)、 四環素(tetracycline)或卡那黴素(kanamycin))之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷型缺失；或(c)提供無法自複合或合成培養基獲得之關鍵營養物。特定可選擇標記為卡那黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。有利的是，新黴素(neomycin)抗性基因亦可能用於原核宿主細胞及真核宿主細胞中之選擇。
其他可選擇基因可用於擴增待表現基因。擴增為產生對生長或細胞存活較關鍵之蛋白質所需之基因在逐代重組細胞之染色體內依序重複之過程。適用於哺乳動物細胞之可選擇標記之實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉化子置放於選擇壓力下，其中借助於存在於載體中之可選擇基因使得僅轉化子為適於存活。藉由在培養基中之選擇試劑之濃度連續增加(從而引起可選擇基因及編碼另一基因(諸如結合於CD30L之抗原結合蛋白質)之DNA之擴增)條件下培養轉型之細胞來施加選擇壓力。因此，自擴增之DNA合成之多肽(諸如抗原結合蛋白質)量增加。
核糖體結合位點通常為rnRNA之翻譯起始所必需且由夏因-達爾加諾(Shine-Dalgarno)序列(原核生物)或克紮克(Kozak)序列(真核生物)特性化。該元件通常位於啟動子之3'位及待表現多肽之編碼序列之5'位。
在一些情況下，諸如當真核生物宿主細胞表現系統中需要糖基化作用時，可操縱多個前序列或原序列以改良糖基化作用或產率。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加亦可影響糖基化作用之原序列。最終蛋白質產物可能在-1位(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個易於表現之額外胺基酸(其可能尚未完全移除)。舉例而言，最終蛋白質產物可具有一個或兩個在肽酶裂解位點中可見之胺基酸殘基，其連接至胺基端。或者，使用一些酶裂解位點可產生所需多肽之輕微截短 形式(若酶在成熟多肽內該區域處切割)。
表現及選殖將通常含有啟動子，其由宿主有機物識別且與編碼CD30L抗原結合蛋白質之分子可操作地連接。啟動子為位於結構基因之起始密碼子上游(亦即5'位)的未轉錄序列(通常在約100bp至1000bp內)，其控制結構基因之轉錄。啟動子習知分為兩種類型：可誘導型啟動子及組成性啟動子。可誘導型啟動子回應於培養條件之一些變化(諸如存在或不存在營養物或溫度變化)起始在其控制下之DNA之轉錄量增加。另一方面，組成性啟動子均勻地轉錄與其可操作地連接之基因，亦即對基因表現控制極小或無控制。許多啟動子(由多種潛在宿主細胞識別)已為吾人所熟知的。藉由限制酶消化自來源DNA移除啟動子且將所需啟動子序列插入載體中來使合適啟動子與編碼CD30L抗原結合蛋白質之重鏈可變區或輕鏈可變區之DNA可操作地連接。
適於與酵母宿主一起使用之啟動子亦在此項技術中熟知。酵母強化子宜與酵母啟動子一起使用。適於與哺乳動物宿主細胞一起使用之啟動子已為吾人所熟知且包括(但不限於)自病毒(諸如多形瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、鳥類肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40))之基因組獲得之啟動子。其他合適哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
其他相關啟動子可包括(但不限於)：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,1981,Nature 290：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複中所含啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22：787-797)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因之啟動子及調節序列(Prinster等人，1982, Nature 296：39-42)；及原核啟動子，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。亦關注以下動物轉錄控制區，其呈現組織特異性及已用於轉殖基因動物中：彈性蛋白酶I基因控制區，其在胰臟腺泡細胞中具有活性(Swift等人，1984,Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7：425-515)；胰島素基因控制區，其在胰臟β-細胞中具有活性(Hanahan,1985,Nature 315：115-122)；免疫球蛋白基因控制區，其在淋巴樣細胞中具有活性(Grosschedl等人，1984,Cell 38：647-658；Adames等人，1985,Nature 318：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；小鼠乳腺瘤病毒控制區，其在睾丸、乳房、淋巴樣及肥大細胞中具有活性(Leder等人，1986,Cell 45：485-495)；白蛋白基因控制區，其在肝臟中具有活性(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.1：268-276)；α-胎兒蛋白基因控制區，其在肝臟中具有活性(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987,Science 253：53-58)；α 1-抗胰蛋白酶基因控制區，其在肝臟中具有活性(Kelsey等人，1987,Genes and Devel.1：161-171)；β-球蛋白基因控制區，其在骨髓細胞中具有活性(Mogram等人，1985,Nature 315：338-340；Kollias等人，1986,Cell 46：89-94)；髓磷脂鹼性蛋白基因控制區，其在腦中之少樹突神經膠細胞中具有活性(Readhead等人，1987,Cell 48：703-712)；肌球蛋白輕鏈-2基因控制區，其在骨骼肌中具有活性(Sani,1985,Nature 314：283-286)；及促性腺釋放激素基因控制區，其在丘腦下部中具有活性(Mason等人，1986,Science 234：1372-1378)。
可將強化子序列插入載體中以增加高級真核細胞轉錄。強化子為DNA之順式作用元件(長度通常為約10bp-300bp)，其對啟動子起作用以增強轉錄。已在轉錄單元之5'位及3'位處發現，強化子在位向及位置上 相對獨立。已知若干種可自哺乳動物基因獲得之強化子序列(例如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎兒蛋白及胰島素)。然而通常使用來自病毒之強化子。此項技術中已知的SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤強化子及腺病毒強化子為用於真核啟動子之活化之例示性增強元件。儘管強化子可位於載體中編碼序列之5'或3'位處，但其通常位於啟動子之5'位處。可將編碼合適原生或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導序列之選擇視將產生抗體之宿主細胞之類型而定，且異源信號序列可置換原生信號序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能性之信號肽之實例包括以下：美國專利第4,965,195號中描述之介白素-7之信號序列；Cosman等人，1984,Nature 312：768中描述之介白素-2受體之信號序列；EP專利第0367 566號中描述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中描述之I型介白素-1受體信號肽；EP專利第0 460 846號中描述之II型介白素-1受體信號肽。
在構築載體後，可將完成之載體插入合適宿主細胞中以用於擴增及/或多肽表現。可藉由熟知方法使抗原結合蛋白質之表現載體轉型至所選宿主細胞中，包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電致孔、顯微注射、脂質體轉染、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染或其他已知技術。所選擇方法將部分隨待使用之宿主細胞類型而變。該等方法及其他合適方法已為熟習此項技術者所熟知且闡述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)中。
當在適當條件下培養時，宿主細胞合成蛋白質，接著可自培養基收集(若宿主細胞將其分泌入培養基中)或直接自產生其之宿主細胞收集(若未分泌)。合適宿主細胞之選擇將視多種因素而定，諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化作用或磷酸化作用)及摺疊 成生物學活性分子之易操作性。
可用作用於表現之宿主之哺乳動物細胞株在此項技術中已為吾人所熟知且包括(但不限於)可自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)獲得之永生化細胞株，包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、仔倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及多種其他細胞株。在某些具體實例中，可經由確定哪些細胞株具有高表現量及組成性產生具有CD30L結合性質之抗原結合蛋白質來選擇細胞株。在另一具體實例中，亦選擇來自B細胞譜系之細胞株，其不產生其自有抗體但具有產生及分泌異源抗體之能力。在另一具體實例中，海藻糖基轉移酶剔除產生完全或部分海藻糖基化抗體之細胞株(美國專利6,946,292、US 7,425,446、US 7,846,725、US 8,067,232、Potelligent®細胞，BioWa,Princeton,NJ)。
CD30L活體外生物分析法
亦提供鑑別抑制CD30/CD30L相互作用之拮抗劑之方法。該等方法利用CD30+細胞回應於CD30L產生之標記細胞激素之誘導作用。該方法包含以下步驟：組合相關測試化合物與CD30L來源；向能夠回應於CD30與CD30L之相互作用表現標記細胞激素之CD30+細胞中添加測試化合物/CD30L組合；收集細胞上清液；及藉由量測細胞上清液中產生及/或釋放之標記細胞激素之量來確定測試化合物是否抑制CD30/CD30L相互作用。舉例而言，該CD30L依賴性活體外生物分析法可使用人類間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞株、內源CD30之Karpas-299(K299)表現及該等細胞回應於CD30與CD30L之相互作用而釋放IL-8。該等方法進一步例示於本文中提供之實施例中。
測試化合物包括CD30L抗原結合蛋白質，包括(但不限於)抗體、其抗原結合片段及其衍生物。測試化合物亦可包括重組可溶性CD30 化合物(諸如與Fc標籤、聚HIS標籤、FLAG®標籤及其類似物融合之CD30胞外域)以及小分子。合適CD30+細胞株回應於CD30與CD30L之相互作用表現標記細胞激素；該等細胞株包括人類CD30+間變性大細胞淋巴瘤細胞株K299(Karpas-299，DSMZ,Germany)。
CD30L來源包括可溶性CD30L構築體及細胞膜相關CD30L。可溶性CD30L包括嵌合組成物，其包含CD30L片段，較佳為CD30L之胞外區之片段。該等可溶性構築體包括多聚白胺酸或異白胺酸拉鏈構築體。該等構築體包含一個連接至人類或獼猴CD30L之胞外域N端之33個胺基酸之白胺酸拉鏈主結構。可溶性重組CD30L構築體亦可商購(R&D Systems,Minneapolis,MN)。其他可溶性CD30L亦包括與FLAG®標籤(Axxora LLC,San Diego,CA)融合之CD30L胞外域。細胞膜相關CD30L包括原生及經轉染之CD30L表現細胞及細胞株。該等細胞株包括(但不限於)人類細胞，諸如CD30L+人類B細胞株Ramos(ATCC,Manassas,VA)。亦涵蓋獼猴血液T細胞及小鼠樹突狀細胞株。
本文中提供確定CD30L誘導CD30+細胞產生IL-8之誘導作用的方法，其包含以下步驟：組合測試化合物與CD30L來源；向經照射之CD30+細胞中添加測試化合物-CD30L組合；收集細胞上清液；及確定釋放入細胞上清液中之IL-8量。此CD30L依賴性活體外生物分析法使用人類間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞株、內源CD30之Karpas-299(K299)表現及該等細胞回應於CD30與CD30L之相互作用而釋放IL-8。可例如藉由IL-8ELISA對所釋放之IL-8進行定量。CD30L拮抗劑(諸如本文中所描述之抗原結合蛋白質)與可溶性CD30L(單細胞分析法)或細胞膜相關CD30L(雙細胞分析法)一起培育且接著與K299細胞一起培養。接著收集細胞上清液且使用IL-8夾心ELISA測定回應於CD30L拮抗劑(諸如本文中所描述之抗原結合蛋白質)之阻斷而抑制K299細胞釋放IL8之作用。
對於單細胞分析法，在96孔微量滴定盤(諸如Costar® 96孔盤(Corning；Acton,MA))中滴定CD30L拮抗劑以得到所需最終濃度範圍，例如1μg/ml至10pg/ml。CD30L抗原結合蛋白質(諸如本文中所描述之抗原結合蛋白質)可用作陽性對照。滴定盤在室溫下培育約45分鐘。接著向各孔中添加CD30+細胞來源。滴定盤在37℃及5% CO2下培育24小時。
對於雙細胞分析法，CD30L來源經細胞膜結合及照射。CD30L表現細胞包括(但不限於)諸如人類CD30L+人類B細胞株Ramos(ATCC,Manassas,VA)、活性獼猴血液T細胞或小鼠DC細胞株之細胞。在用於選擇具有最高細胞表面CD30L表現量之細胞前，CD30L表現細胞可經FACS分選。CD30L表現細胞與CD30L拮抗劑組合且培育45分鐘，隨後添加至CD30+細胞來源中。又，滴定盤在37℃、5% CO2下培育24小時。
對於兩種分析法，可藉由任何用於偵測IL-8之方法(例如IL-8夾心ELISA)測定釋放之IL8及對其進行定量。該等分析法可商購，諸如由R&D Systems(Minneapolis,MN)提供之分析法。可由ELISA標準曲線及使用市售軟體(諸如DeltaSoft(DeltaSoft公司，Hillsborough,NJ)及GraphPad PRISM(GraphPad Software公司，San Diego,CA))所測定之IC50值藉由內插法獲得IL-8含量。
人類CD30L抗原結合蛋白質用於診斷性及治療性目的之用途
本文中提供之抗原結合蛋白質適用於偵測生物樣品中之CD30L及鑑別產生CD30L之細胞或組織。特異性結合於CD30L之抗原結合蛋白質可用於診斷及/或治療有需要之患者中與CD30L有關之疾病，例如CD30L抗原結合蛋白質可用於診斷分析法，例如誘導CD30+細胞釋放IL-8。結合於CD30L之抗原結合蛋白質在改善與CD30L有關之疾病中可具有治療性用途。
適應症
本發明亦係關於CD30L抗原結合蛋白質之用途，其係用於醫學病症(諸如本文中揭示之醫學病症)之預防或治療性處理。CD30L抗原結合蛋白質適用於治療多種與CD30L有關或CD30L在促進潛在疾病或病症中起作用或以其他方式促進不良症狀之病狀。
提供藉由投予有需要之患者有效量之包含一或多種本文中所描述之CD30L抗原結合蛋白質之組成物來治療多種疾病(諸如自體免疫及慢性發炎疾病及癌症)之方法。該等組成物適用於藉由阻斷CD30+與CD30L+細胞之間的相互作用；消耗CD30L+細胞；或藉由CD30L+細胞上之促效活性來活體內調節免疫反應。
CD30L可呈現「反向信號傳導(reverse signaling)」，表現於嗜中性白血球及末梢血液T細胞上之CD30L可由交聯活化以刺激該等細胞中之代謝活性(Wiley等人，J Immunol 157：3235-39,1996；Cerutti等人，J.Immunol.165：786,2000；Cerutti等人，Nat.Immunol.2：150,2001)。因此，本文中所描述之與CD30L結合之抗原結合蛋白質可用於阻斷反向CD30L信號傳導或刺激CD30L+細胞。
CD30+細胞與霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)具有強相關性且CD30為廣泛用於多種血液惡性腫瘤之臨床標記(關於評述，參見Horie及Watanabe,Immuno.10：457-470,1998)。包含一或多種本文中所描述之CD30L抗原結合蛋白質(單獨或與其他療法之組合)之組成物可用於治療該等病狀。
CD30L係於活性T細胞及某些B細胞以及樹突狀細胞群體上表現。CD30於一部分活性T細胞及B細胞上表現。此表現模式表明靶向CD30L可有效調節T細胞、B細胞與樹突狀細胞之間的相互作用。已證實CD30L可影響體液免疫。本文中所描述之抗原結合蛋白質可用於與發炎疾病(尤其由T細胞依賴性B細胞反應引起之疾病)有關之治療方案。
可由本文中揭示之方法及組成物治療關節炎。如本文中所用，術語「關節炎」係指慢性發炎病狀，其主要影響關節或關節周圍之結締組織，但亦可能變為影響各種身體器官。關節炎可由自體免疫或創傷引起，或其可由暴露於外部抗原，隨後引起不再依賴於引發抗原持續存在之慢性病狀而引起。如本文中所用之術語「關節炎」包括：變形性關節炎；骨關節炎；類風濕性關節炎(成年人及青少年)；萊姆病關節炎(Lyme disease arthritis)；反應性關節炎，包括萊特爾氏病(Reiter's disease)；牛皮癬關節炎；變形性關節炎；血清陰性脊椎關節病，包括(但不限於)僵直性脊椎炎。
本文中所描述之抗原結合蛋白質適用於治療多種風濕病，其在本文中係定義為任何與疼痛有關之慢性病症且通常為關節、肌肉、神經、肌腱、皮膚、眼睛、結締組織或各種其他器官系統中之多局部炎症。該等病症包括(但不限於)：關節炎；硬皮病；痛風；全身性紅斑狼瘡；風濕性多肌痛；斯蒂爾氏病(Still's disease)；慢性葡萄膜炎；引起隨意肌炎症之病症，包括皮肌炎及多肌炎，包括偶發性包涵體肌炎。全身性紅斑狼瘡可引起關節、皮膚、腎、心臟、肺、血管及腦部炎症。在其晚期形式中，全身性紅斑狼瘡這種症狀可引起腎衰竭。
亦提供在療法中使用本文中所描述之抗原結合蛋白質治療內分泌系統之各種病症之方法，該等病症包括(但不限於)：青少年或成年發病型糖尿病(包括自體免疫、胰島素依賴性糖尿病；非胰島素依賴性糖尿病及肥胖症介導之糖尿病)；特發性腎上腺萎縮；艾迪森氏病(Addison's disease)；甲狀腺功能低下；格雷氏病(Grave's disease)；自體免疫甲狀腺炎，諸如橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)；及多腺體自體免疫症候群(I型及II型)。
本文中所描述之抗原結合蛋白質亦適用於治療胃腸系統病狀之療法，該等病狀包括(但不限於)：自體免疫硬化性膽管炎；腹腔病； 發炎性腸疾病，包括克羅恩氏病(Crohn's disease)及潰瘍性結腸炎；自體免疫胰臟炎，包括慢性胰腺炎；特發性胃輕癱；及特發性潰瘍，包括胃及十二指腸潰瘍。
亦包括在療法中使用本文中所描述之抗原結合蛋白質治療生殖泌尿系統病症(諸如自體免疫及特發性絲球體腎炎；及慢性特發性前列腺炎(非細菌性)，包括良性前列腺肥大)之方法。
本文中亦提供在療法中使用本文中所描述之結合蛋白質治療各種血液病症之方法，該等病症包括(但不限於)：貧血及血液病症，包括惡性貧血及再生障礙性貧血，及范康尼氏再生不能性貧血(Fanconi's aplastic anemia)；自身免疫性溶血性貧血；特發性血小板減少性紫癜(ITP)；脊髓發育不良症候群(包括難治性貧血、伴有環狀含鐵胚血球之難治性貧血、伴有胚細胞過量之難治性貧血、伴有轉型中胚細胞過量之難治性貧血)；及自體免疫淋巴組織增生症候群(ALPS)。
所揭示之抗原結合蛋白質亦適用於治療影響肝臟之病狀，諸如自體免疫或慢性發炎性肝炎。
此外，所揭示之抗原結合蛋白質及組合可用於治療各種與聽力損失有關之自體免疫或慢性發炎性病症。一種該類病症為內耳或蝸神經相關聽力損失，認為其係由自體免疫過程引起，亦即自體免疫聽力損失。當前用類固醇、甲胺喋呤及/或環磷醯胺治療此病狀，其可與CD30/CD30L相互作用抑制劑或阻斷劑同時投予。
所揭示之抗原結合蛋白質亦可用於治療多種發炎性肺病，包括：特發性淋巴管平滑肌增生症；與慢性非傳染性支氣管炎或肺氣腫有關之慢性阻塞性肺病(COPD)；及纖維變性肺疾，諸如囊腫性纖維化及特發性肺纖維化。
所揭示之抗原結合蛋白質亦可用於治療與移植有關之病 症，包括移植物抗宿主疾病。為預防或改善移植物抗宿主疾病，可在骨髓或固體器官移植(包括心臟、肝臟、肺、皮膚、腎或其他器官移植)之前、移植同時或移植之後投予包含一或多種所揭示之抗原結合蛋白質的組成物。
所揭示之抗原結合蛋白質亦適用於治療慢性發炎性眼病，包括自體免疫葡萄膜炎。
該等化合物亦適用於治療與呼吸道發炎有關之疾病，諸如哮喘。
本文中所描述之抗原結合蛋白質亦適用於治療影響雌性生殖系統之發炎病症，包括：多次植入失敗/不育症；流產症候群或IV胚胎損失(自發性流產)；及子宮內膜異位。
可使用本文中所描述之抗原結合蛋白質治療之其他醫學病症包括中樞神經系統之慢性炎症及/或退化性疾病。此病症包括例如與脫髓鞘有關之疾病，諸如多發性硬化、全身性硬化症及格-巴二氏症候群(Guillain-Barre syndromes)(包括急性發炎性脫髓鞘多發性神經病變、急性運動軸突神經病變、急性運動感覺軸突神經病變及費歇爾症候群(Fisher syndrome))。中樞神經系統之慢性退化性疾病之代表為多發性硬化，其可由能夠抑制或阻斷CD30與CD30L.之相互作用的藥劑治療。參見例如美國專利第6,652,854號。
其他可用所揭示之抗原結合蛋白質治療之慢性發炎病狀包括冷凝集素病；貝塞特氏症候群(Behcet's syndrome)；休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)；及特發性腱鞘炎，以及各種與遺傳缺陷有關之慢性發炎性病症。目標抑制劑、組成物及組合療法亦適用於治療貝爾氏麻痹(Bell's palsy)(特發性面部神經麻痹)；慢性疲勞症候群(與進行性感染無關)；慢性退化性椎間盤疾病；海灣戰爭症候群(Gulf war syndrome)；及重症肌無力， 其可同時用皮質類固醇治療。
本文中所描述之抗原結合蛋白質亦可用於治療與皮膚或黏膜有關之病症。該等病症包括：皮膚棘層松角疾病，包括盤狀狼瘡、亞急性皮膚紅斑性狼瘡、皮膚血管炎、達里埃氏病(Darier's disease)、毛囊角化症、尋常天疱瘡及副腫瘤天疱瘡；紅斑痤瘡；斑脫；大皰性類天疱瘡；濕疹；紅斑，包括多形性紅斑及大皰性多形紅斑(史蒂芬-瓊森(Stevens-Johnson)症候群)；發炎性皮膚病；扁平苔癬；線狀IgA大皰皮病(兒童慢性大皰皮病)；皮膚彈性損失；嗜中性皮炎(斯威特氏症候群(Sweet's syndrome))；毛髮紅糠疹；牛皮癬；壞疽性膿皮病；皮膚彈性損失；及中毒性表皮壞死溶解。
其他可使用所揭示之抗原結合蛋白質治療之疾病包括：自體免疫相關慢性皮膚黏膜念珠菌病；變應性疾病；類肉瘤病；多中心網狀組織細胞增生症；韋格納氏肉芽腫病(Wegener's granulomatosis)；動脈炎，包括巨細胞性動脈炎；血管炎及慢性自體免疫心肌炎。
為使用本文中所描述之抗原結合蛋白質治療醫學病症，向有需要之哺乳動物投予治療有效量之治療劑。根據足以誘導至少一個反映病症嚴重性之指標之持續改良的劑量及投藥頻率方案投予藥劑。若患者至少在間隔至少1天(但較佳間隔1週、2週、3週或4週或4週以上)的兩個時刻呈現改良，則認為改良為「持續的」。病症嚴重性係基於病症或症狀確定，或可藉由投予患者之問卷調查確定，諸如醫師通常用於評估慢性病狀之狀態的生活品質問卷調查。
可評估一或多個反映患者疾病嚴重性之指標以確定藥物療法之頻率及持續時間是否足夠。藉由在投予第一劑量之治療劑之前對患者進行檢查來建立所選指標之基線值。基線檢查較佳在投予第一劑量前約60天內進行。
若所治療之病狀為全身性紅斑狼瘡，則用於確定治療充分性之指標可由觀測以下症狀中之一者之改良組成：疲勞；發燒；口腔及鼻端潰瘍；面部皮疹(「蝶形疹」)；光敏感性(SLE通常在暴露於陽光後發作)；胸膜炎；心包炎；雷諾氏現象(Raynaud's phenomenon)(暴露於風寒後手指及腳趾血液循環不良)；腎功能；及白血球數(SLE患者之白血球數通常降低)。
提供醫藥組成物，其包含與醫藥學上可接受之載劑調配之本文中揭示之抗原結合蛋白質。在一些具體實例中，醫藥學上可接受之載劑適用於投予人類個體。
診斷方法
所描述之抗原結合蛋白質可用於診斷目的以偵測、診斷或監測與CD30/CD30L相互作用有關之疾病及/或病狀。適用於偵測是否存在CD30L之方法之實例包括免疫分析法，諸如酶結合免疫吸附分析法(ELISA)及放射免疫分析法(RIA)。
對於診斷應用，通常用可偵測標記基團標記抗原結合蛋白質。合適標記基團包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學螢光基團、生物素基團或由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、用於二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些具體實例中，標記基團經各種長度之間隔臂與抗原結合蛋白質偶合以降低潛在位阻。此項技術中已知且可使用多種用於標記蛋白質之方法。
提供其他用於鑑別表現CD30L之細胞的診斷方法。在特定具體實例中，用標記基團標記抗原結合蛋白質且偵測所標記之抗原結合蛋 白質與CD30L之結合。在另一特定具體實例中，活體內偵測抗原結合蛋白質與CD30L之結合。在另一特定具體實例中，分離CD30L抗原結合蛋白質且使用此項技術中已知的技術進行量測。參見例如Harlow and Lane,1988,Antibodies：A Laboratory Manual,New York：Cold Spring Harbor(1991版及定期增刊)；John E.Coligan編，1993,Current Protocols In Immunology New York：John Wiley & Sons。
提供其他用於偵測測試分子存在之方法，該測試分子與所提供之抗原結合蛋白質針對與CD30L之結合進行競爭。一種該類分析法之實施例將涉及在存在或不存在測試分子情況下偵測含有一定量CD30L之溶液中自由抗原結合蛋白質之量。自由抗原結合蛋白質(亦即未結合於CD30L之抗原結合蛋白質)之量增加將表明測試分子能夠與抗原結合蛋白質針對與CD30L之結合進行競爭。在一個具體實例中，用標記基團標記抗原結合蛋白質。或者，標記測試分子且在存在及不存在抗原結合蛋白質情況下監測自由測試分子之量。
治療方法：醫藥調配物、投藥途徑
提供醫藥組成物，其包含治療有效量之一種或複數種抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑。此外，包括藉由投予該醫藥組成物來治療患者之方法。術語「患者」包括人類患者。術語「治療」涵蓋減輕或預防病症之至少一種症狀或其他的態樣，或降低疾病嚴重性及其類似作用。術語「治療有效量」或「有效量」係指經測定在哺乳動物中產生任何治療反應之CD30L抗原結合蛋白質之量。該等治療有效量可由一般熟習此項技術者容易地確定。為本發明之目的，術語「病」、「疾病」、「醫學病狀」、「異常病狀」、「疾患」、「醫學病症」、「病症」及其類似術語可互換使用。
抗原結合蛋白質構成有價值的治療劑無需實現完全治癒或 根除疾病之每一種症狀或表現。如相關領域中認可，只要用作治療劑之藥物可降低既定疾病病況之嚴重性，但無需根除疾病之每一種表現即可視為有效治療劑。類似地，預防性投藥治療構成有價值的預防劑無需完全有效性預防病狀發作。僅降低疾病影響(例如藉由降低其症狀數目或嚴重性，或藉由增加另一種療法之有效性，或藉由產生另一種有益作用)或降低個體中疾病發作或惡化之可能性便足夠。本文中提供之某些方法包含以足以誘導與反映特定病症之嚴重性之指標之基線相比產生持續改良之量及時間投予患者CD30L拮抗劑(諸如本文中揭示之抗原結合蛋白質)。
如相關領域中所理解，以適用於適應症之方式將包含本發明分子之醫藥組成物投予患者。可藉由任何合適技術(包括(但不限於)非經腸、局部或吸入方式)投予醫藥組成物。若進行注射，則可例如經由關節內、靜脈內、肌肉內、病灶內、腹膜內或皮下途徑藉由快速注射或連續輸注投予醫藥組成物。涵蓋例如在疾病或損傷部位處之局部投予為經皮遞送及自植入劑持續釋放。吸入遞送包括例如鼻或口腔吸入，使用噴霧器、以氣溶膠形式吸入拮抗劑及其類似方式。其他替代方式包括眼藥水；口服製劑，包括丸劑、糖漿、口含錠或口嚼錠；及局部製劑，諸如洗劑、凝膠、噴霧劑及軟膏劑。
亦涵蓋在離體程序中使用抗原結合蛋白質。舉例而言，可使患者血液或其他體液與抗原結合蛋白質(其離體結合CD30L)接觸。抗原結合蛋白質可結合於合適不可溶基質或固體載體物質。
有利的是，抗原結合蛋白質係以包含一或多種其他組分(諸如生理學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑)之組成物形式投予。組成物視情況額外包含一或多種用於組合療法之生理學活性劑。醫藥組成物可包含CD30L抗原結合蛋白質以及一或多種選自由以下組成之群之物質：緩衝劑、抗氧化劑(諸如抗壞血酸)、低分子量多肽(諸如具有小於10個胺基 酸之多肽)、蛋白質、胺基酸、碳水化合物(諸如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合劑(諸如EDTA)、麩胱甘肽、穩定劑及賦形劑。與同種血清白蛋白混合之中性緩衝鹽水或鹽水為合適稀釋劑之實例。根據適當工業標準，亦可添加防腐劑，諸如苯甲醇。可使用合適賦形劑溶液(例如蔗糖)作為稀釋劑將組成物調配為凍乾產物。合適組分在所用劑量及濃度下對接受者無毒。可用於醫藥調配物中之組分之其他實例呈現於任一Remington's Pharmaceutical Sciences中，包括第21版(2005),Mack Publishing Company,Easton,PA。
供醫師使用之套組包括用於治療本文中論述之任一種病狀之CD30L抗原結合蛋白質及標籤或其他說明。在一個具體實例中，套組包括一或多種CD30L結合型抗原結合蛋白質之無菌製劑，其可呈上文揭示之組成物形式且可處於一或多種小瓶中。
劑量及投藥頻率可根據諸如投藥途徑、所用特定抗原結合蛋白質、所治療之疾病之性質及嚴重性、病狀為急性或慢性及個體之體型及一般狀況之因素而變化。合適劑量可藉由相關技術中已知的程序確定，例如在可涉及劑量遞增研究之臨床試驗中。
視上述因素而定，典型劑量可在約0.1μg/kg至多達約30μg/kg或30μg/kg以上範圍內。在特定具體實例中，劑量可在0.1μg/kg至約30mg/kg範圍內，視情況為1μg/kg至約30mg/kg，視情況為10μg/kg至約10mg/kg，視情況為約0.1mg/kg至5mg/kg或視情況為約0.3mg/kg至3mg/kg。
給藥頻率將視所用調配物中特定CD30L抗原結合蛋白質之藥物動力學參數而定。通常，臨床醫師將投予組成物直至達到實現所需作用之劑量。因此，組成物可隨時間以單次劑量或以兩次或兩次以上劑量(其可能含有或可能不含相同量之所需分子)投予，或經由植入裝置或導管以 連續輸注形式投予。可使用合適劑量-反應資料確定合適劑量。本發明之CD30L抗原結合蛋白質可例如一次性或不止一次投予，例如在一段時間內每隔一定時間投予。在特定具體實例中，在至少1個月或1個月以上時間內(例如1、2或3個月或甚至無限期)投予CD30L抗原結合蛋白質。對於治療慢性病狀，長期治療通常最有效。然而，對於治療急性病狀，短期投藥(例如1至6週)即足以。通常，投予抗原結合蛋白質直至患者與所選指標之基線相比呈現醫學相關之改良程度。
預期以足以誘導至少一個反映所治療之病症之嚴重性之指目標改良(較佳持續改良)的量及時間投予患者CD30L抗原結合蛋白質。可評估多種反映患者病患、疾病或病狀程度之指標以確定治療量及時間是否足夠。該等指標包括例如疾病嚴重性之臨床識別指標、所述病症之症狀或表現。在一個具體實例中，若個體在至少兩個間隔2至4週的時刻呈現改良，則認為改良為持續的。改良程度通常由醫師確定，醫師可基於病徵、症狀、活組織檢驗或其他測試結果來確定且亦可使用投予個體之調查問卷(諸如針對既定疾病研製之生活品質調查問卷)。本發明之方法及組成物之特定具體實例涉及使用CD30L抗原結合蛋白質及一或多種其他CD30L拮抗劑，例如兩種或兩種以上本發明之抗原結合蛋白質，或本發明之抗原結合蛋白質與一或多種其他CD30L拮抗劑。亦提供CD30L抗原結合蛋白質，其可單獨投予或與其他適用於治療患者所罹患之病狀之藥劑組合投予。該等藥劑之實例包括蛋白質類藥物及非蛋白質類藥物。該等藥劑包括例如TNF α、IL-1、IL-2、RANK或其他可促進自體免疫或慢性炎症之細胞激素之拮抗劑。細胞激素拮抗劑包括靶向細胞激素及/或其受體之拮抗劑。靶向細胞激素之拮抗劑可包含針對細胞激素之可溶性受體且通常包括細胞激素之受體之部分或所有胞外域。可溶性細胞激素可以單體或二聚體或更高級多聚體(例如融合分子，其中可溶性受體連接至人免疫球蛋白之二聚體促 進型Fc部分)形式使用。在其他具體實例中，可溶性細胞激素受體經聚乙二醇化以延長其血清半衰期。在一些具體實例中，可溶性細胞激素拮抗劑包含可溶性TNF受體(I型或II型)。抑制發炎性細胞激素之小型有機分子亦可與目標治療劑組合使用。可同時投予一種以上CD30配位子抗原結合蛋白質及/或其抗原結合區以治療自體免疫或慢性發炎疾病，且可單獨投予或與其他對相同自體免疫或慢性發炎病狀有效或經投予以治療同一患者中之不同病狀的藥物一起投予。
當共同投予多種治療劑時，如相關技術中公認或已知，可相應調節劑量。該等藥劑可同時、依序、交替或根據任何其他使全部療程有效之方案投予。
除人類患者外，CD30L抗原結合蛋白質亦適用於治療非人類動物，諸如家養寵物(犬、貓、鳥、靈長類動物等)、家養農畜(馬、牛、羊、豬、鳥等)。在該等實施例中，可根據動物體重確定合適劑量。舉例而言，可使用0.2mg/kg至1mg/kg之劑量。或者，可根據動物表面積確定劑量，例示性劑量範圍為0.1mg/m2至20mg/m2，或更佳為5mg/m2至12mg/m2。對於小型動物(諸如犬或貓)，合適劑量為0.4mg/kg。藉由注射或其他合適途徑每週一或多次投予CD30L抗原結合蛋白質(較佳由來源於接受者物種之基因構築)直至動物之病狀得到改善，或其可無限期投予。
以下具體實例及實施例(包括所進行之實驗及所得結果)係僅出於說明目的而提供且不應視為限制隨附申請專利範圍之範疇。
圖1A展示Ramos細胞及NK效應子，空心正方形：美羅華(Rituxan) (IgG1)，實心菱形：抗體A1 IgG1f，實心正方形：抗體A1 IgG1，空心圓形：抗體A1 IgG2。
圖1B展示JD38細胞及NK效應子，空心正方形：美羅華(IgG1)，實心菱形：抗體A1 IgG1f，實心正方形：抗體A1 IgG1，空心圓形：抗體A1 IgG2。
圖1C展示DS179細胞及NK效應子，空心正方形：美羅華(IgG1)，實心菱形：抗體A1 IgG1f，實心正方形：抗體A1 IgG1，空心圓形：抗體A1 IgG2。
圖1D展示EW36細胞及NK效應子，空心正方形：美羅華(IgG1)，實心菱形：抗體A1 IgG1f，實心正方形：抗體A1 IgG1，空心圓形：抗體A1 IgG2。
1.一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含至少一個包含選自由以下組成之群之CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區：a)與如表3中所示之CDRH1相差不超過4個胺基酸取代、插入或缺失之CDRH1； b)與如表3中所示之CDRH2相差不超過7個胺基酸取代、插入及/或缺失之CDRH2；c)與如表3中所示之CDRH3相差不超過11個胺基酸取代、插入及/或缺失之CDRH3；及包含至少一個包含選自由以下組成之群的CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區：d)與如表3中所示之CDRL1相差不超過4個胺基酸取代、插入及/或缺失之CDRL1；e)與如表3中所示之CDRL2相差不超過2個胺基酸取代、插入及/或缺失之CDRL2；f)與如表3中所示之CDRL3相差不超過2個胺基酸取代、插入及/或缺失之CDRL3。
2.如具體實例1之分離之抗原結合蛋白質，其包含：選自由SEQ ID NO：14、15、16、17、18及33組成之群之CDRH1；選自由SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24及34組成之群之CDRH2；選自由SEQ ID NO：25、26、27、28、29及35組成之群之CDRH3；選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6及30組成之群之CDRL1；選自由SEQ ID NO：7、8、9、10及31組成之群之CDRL2；及選自由SEQ ID NO：11、12、13及32組成之群之CDRL3。
3.一種結合人類CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含至少一個選自由以下組成之群之輕鏈可變區：a)包含CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中CDR1包含SEQ ID NO：36、28、40、42或44之胺基酸殘基23至36，CDR2包含SEQ ID NO：36、28、40、42或44之胺基酸殘基52至58且CDR3包含SEQ ID NO：36、28、40、42或44之胺基酸殘基91至100；或 b)包含CDR1、CDR2及CDR3之輕鏈可變區，其中CDR1包含SEQ ID NO：46之胺基酸殘基25至36，CDR2包含SEQ ID NO：46之胺基酸殘基52至58且CDR3包含SEQ ID NO：46之胺基酸殘基91至100；及至少一個包含CDR1、CDR2及CDR3之重鏈可變區，其中CDR1包含SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72之胺基酸殘基31至35，CDR2包含SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72之胺基酸殘基50至65且CDR3包含SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70或72之胺基酸殘基98至113。
4.如技術方案1之分離之抗原結合蛋白質，其包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區。
5.如具體實例1之分離之抗原結合蛋白質，其包含至少兩個重鏈可變區及至少兩個輕鏈可變區。
6.一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中重鏈可變區序列與如表2中所示之重鏈可變區序列相差不超過31個胺基酸取代、添加及/或缺失；且其中輕鏈可變區序列與如表1中所示之輕鏈可變區序列相差不超過30個胺基酸取代、添加及/或缺失。
7.一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70及72具有至少80%序列一致性之胺基酸序列；及輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：36、38、40、42、44及46具有至少88%序列一致性之胺基酸序列。
8.一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其係選自由以下組成之群a)分離之抗原結合蛋白質，其包含選自由SEQ ID NO：48、50、52、54、 56、58、60及62組成之群之重鏈可變區及SEQ ID NO：36之輕鏈可變區；b)分離之抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：64之重鏈可變區及SEQ ID NO：38之輕鏈可變區；b)分離之抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：66之重鏈可變區及SEQ ID NO：40之輕鏈可變區；d)分離之抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：68之重鏈可變區及SEQ ID NO：42之輕鏈可變區；e)分離之抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：70之重鏈可變區及SEQ ID NO：44之輕鏈可變區；及f)分離之抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：72之重鏈可變區及SEQ ID NO：46之輕鏈可變區。
9.如前述具體實例1至8中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為抗體。
10.如具體實例9之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗體為單株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。
11.如具體實例10之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗體片段為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體或單鏈抗體分子。
12.如具體實例10之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為人類抗體。
13.如具體實例10之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為單株抗體。
14.如具體實例9之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
15.如具體實例14之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為IgG1型或IgG2型。
16.如前述具體實例中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質具有至少一種選自由以下組成之群之性質：a)抑制CD30/CD30L相互作用；b)抑制CD30L誘導之IL-8誘導作用；c)與抗體A至F中之一者針對與人類CD30L之結合進行交叉競爭；d)解離常數70pM；及e)以與抗體A至F中之一者實質上相同的Kd結合於人類CD30L。
17.一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質結合CD30L中由AA 201至234(諸如AA 205至230)界定之C端區域。
18.一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質結合CD30L中由AA 211至226界定之C端區域。
19.如具體實例17或18之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質結合CD30L中由AA 75至95(諸如AA 80至90)界定之另一區域。
20.如具體實例17或18之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質結合CD30L中由AA 82至88界定之另一區域。
21.如具體實例17或18之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質具有至少一種選自由以下組成之群的性質：a)抑制CD30/CD30L相互作用；b)抑制CD30L誘導之IL-8誘導作用；c)與抗體A至F中之一者針對與人類CD30L之結合進行交叉競爭；d)對人類CD30L之解離常數為至多70pM；及 e)以與抗體A至F中之一者實質上相同或低於抗體A至F中之一者之Kd結合於人類CD30L。
22.如前述具體實例中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質對人類CD30L之解離常數(KD)為至多75pM。
23.如前述具體實例中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質對人類CD30L之解離常數(KD)為至多諸如50pM，諸如40pM。
24.如前述具體實例17至23中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其包含CDRH1、CDRH2及CDRH3以及CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中CDRL1為SEQ ID NO：30之CDRL1一致序列，其中CDRL2為SEQ ID NO：31之CDRL2一致序列，其中CDRL3為SEQ ID NO：32之CDRL3一致序列，其中CDRH1為SEQ ID NO：33之CDRH1一致序列，其中CDRH2為SEQ ID NO：34之CDRH2一致序列；及其中CDRH3為SEQ ID NO：35之CDRH3一致序列。
25.如前述具體實例17至23中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其包含CDRH1、CDRH2及CDRH3以及CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中CDRL1為SEQ ID NO：30之CDRL1一致序列，其中CDRL2為SEQ ID NO：31之CDRL2一致序列，其中CDRL3為SEQ ID NO：32之CDRL3一致序列，其中CDRH1為SEQ ID NO：17之序列或SEQ ID NO：75之CDRH1一致序列，其中CDRH2為SEQ ID NO：34之CDRH2一致序列；及其中CDRH3為SEQ ID NO：35之CDRH3一致序列。
26.如前述具體實例17至23中任一項之分離之抗原結合蛋 白質，其包含CDRH1、CDRH2及CDRH3其中CDRL1為SEQ ID NO：30之CDRL1一致序列，其中CDRL2為SEQ ID NO：31之CDRL2一致序列，其中CDRL3為SEQ ID NO：32之CDRL3一致序列，以及CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中CDRH1為SEQ ID NO：17之序列或SEQ ID NO：75之CDRH1一致序列，其中CDRH2係選自SEQ ID NO：19、20、21、22、23及24之序列；及其中CDRH3為SEQ ID NO：35之CDRH3一致序列。
27.如前述具體實例17至23中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其包含CDRH1、CDRH2及CDRH3其中CDRL1為SEQ ID NO：30之CDRL1一致序列，其中CDRL2為SEQ ID NO：31之CDRL2一致序列，其中CDRL3為SEQ ID NO：32之CDRL3一致序列，以及CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中CDRH1為SEQ ID NO：17之序列或SEQ ID NO：75之CDRH1一致序列，其中CDRH2係選自由SEQ ID NO：19、20、21、22、23及24組成之群；及其中CDRH3係選自由SEQ ID NO：25、26、27、28及29組成之群。
28.如前述具體實例17至23中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其包含：選自由SEQ ID NO：14、15、16、17及18組成之群之CDRH1；選自由SEQ ID NO：19、20、21、22、23及24組成之群之CDRH2；選自由SEQ ID NO：25、26、27、28及29組成之群之CDRH3； 選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5及6組成之群之CDRL1；選自由SEQ ID NO：7、8、9及10組成之群之CDRL2；及選自由SEQ ID NO：11、12及13組成之群之CDRL3。
如前述具體實例17至23中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其包含：a)由SEQ ID NO：14、19、25鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：1、7及11鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，b)由SEQ ID NO：15、21、26鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：2、8及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，c)由SEQ ID NO：15、21、26鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：3、8及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，d)由SEQ ID NO：16、22、27鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：4、9及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，e)由SEQ ID NO：17、23、28鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：5、8及13鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，或f)由SEQ ID NO：18、24、29鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：6、10及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3。
30.一種抗原結合蛋白質，其與至少一種如具體實例1至29中任一項之抗原結合蛋白質競爭。
31.如具體實例1至29中任一項之抗原結合蛋白質，其經完全或部分岩藻糖基化。
32.一種分離之核酸分子，其編碼如前述具體實例中任一項之抗原結合蛋白質。
33.如具體實例32之分離之核酸分子，其中至少一個重鏈可變區係由選自由SEQ ID NO：49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、 69、71及73組成之群的分離之核酸分子編碼且至少一個輕鏈可變區係由選自由SEQ ID NO：37、39、41、43、45及47組成之群的分離之核酸分子編碼。
34.如具體實例33之核酸分子，其中該核酸分子與控制序列可操作地連接。
35.一種載體，前包含如具體實例32之核酸分子。
36.一種宿主細胞，前包含如具體實例32之核酸分子。
37.一種宿主細胞，前包含如具體實例35之載體。
38.一種分離之聚核苷酸，其足以用作雜交探針、PCR引子或定序引子，其為如具體實例33或34之核酸分子之片段或其補體。
39.一種製備如具體實例1至31中任一項之抗原結合蛋白質之方法，其包含由分泌該抗原結合蛋白質之宿主細胞製備該抗原結合蛋白質之步驟。
40.一種醫藥組成物，其包含至少一種如具體實例1至31中任一項之抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之賦形劑。
41.如具體實例40之醫藥組成物，其進一步包含標記基團或效應子基團。
42.如具體實例41之醫藥組成物，其中該標記基團係選自由同位素標記、磁性標記、氧化還原活性部分、光學染料、生物素化基團及由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基組成之群。
43.如具體實例42之醫藥組成物，其中該效應子基團係選自由放射性同位素、放射性核種、毒素、治療基團及化學治療基團組成之群。
44.一種治療或預防患者與CD30L相關之病狀之方法，其包含投予有需要之患者有效量之至少一種如具體實例1至31中任一項之分離之抗原結合蛋白質。
45.如具體實例44之方法，其中該分離之抗原結合蛋白質係單獨投予或以組合療法形式投予。
46.一種降低患者CD30L活性之方法，其包含投予有效量之至少一種如具體實例1至31中任一項之抗原結合蛋白質。
47.如前述具體實例1至31中任一項之抗原結合蛋白質，其係用於治療方法。
48.如前述具體實例1至31中任一項之抗原結合蛋白質，其係用於治療發炎疾病。
49.如前述具體實例1至31中任一項之抗原結合蛋白質，其係用於治療自體免疫疾病，諸如關節炎(包括類風濕性關節炎(RA))及全身性紅斑狼瘡(SLE)、發炎性腸疾病(IBD)，包括克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎。
實施例 實施例1 產生人類CD30L抗體
使用XenoMouseTM技術(Amgen,Thousand Oaks,CA)研製識別及抑制重組人類CD30L活性之人類單株抗體。所選抗體與人類及獼猴CD30L交叉反應，但不與小鼠CD30L交叉反應。
藉由螢光微量分析法技術(FMAT)關於與表現於293T細胞上之重組人類CD30L之結合篩選融合瘤上清液以及藉由螢光活化細胞分選(FACs)分析針對與Ramos細胞上原生人類CD30L之結合篩選融合瘤上清液。在FMAT分析法中，用表現CD30L之293T細胞塗佈板，添加融合瘤上清液且接著添加二級抗人類Ig抗體以經由標準ELISA技術進行偵測。陰性對照為相應未經轉染之293T細胞，其不表現CD30L。
純化上清液且重組抗體可表現為IgG1及IgG2構築體。再次 關於與原生人類及獼猴CD30L之結合篩選抗體。簡言之，人類伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)Ramos細胞(3×105個/孔)在圓底96孔微量滴定板(Costar® 96孔板(Corning；Acton,MA))中與滴定量(最終濃度為10μg/mL至3.2ng/mL)之抗CD30L IgG抗體一起於阻斷緩衝液(含有0.02%疊氮化鈉、2%正常山羊血清及1%正常家兔血清之PBS)中培育。包括人類CD30.Fc融合蛋白質作為結合之陽性對照。細胞在4℃下培育30分鐘接著用PBS洗滌2次且再在4℃下與每孔30μL抗hu IgG生物素(1：50於阻斷緩衝液中；Jackson Immunoresearch,West Grove,PA)一起培育30分鐘。在用PBS洗滌2次後，細胞與每孔30μL(PBS中之1：50稀釋物)抗生蛋白鏈菌素-藻紅素(PE；Molecular Probes,Eugene,OR)一起在4℃下培育30分鐘。細胞用PBS洗滌2次且準備用於FACs分析。結果可見於表5中。
藉由用Isolymph進行密度離心(2000rpm，20分鐘)自肝素化獼猴血液分離末梢血液單核細胞(PBMC)來製備獼猴活性T細胞。PBMC再懸浮於25mL PBS中，添加至300μl 50%經2-胺基乙基異硫脲溴化物(AET)處理之羊紅血球溶液中且在4℃下於約700rpm下離心10分鐘。粒化細胞在4℃下再培育20分鐘，溫和再懸浮且用Isolymph離心。上清液下移至T細胞/紅血球丸粒中。接著將丸粒再懸浮於25mL溶解緩衝液(含0.85%氯化銨之水)中且在37℃下培育10分鐘。將所得T細胞粒化且在培養基(RPMI-1640培養基+10%熱不活化胎牛血清)中洗滌2次且接著在37℃下於10ng/mL佛波醇十四酸酯乙酸酯(Phorbol Myristate Acetate)(PMA；Sigma Chemicals,St Louis,MO)及500ng/mL離子黴素(Ionomycin)(Calbiochem,San Francisco,CA)存在下培養(1×106個/毫升)18小時。在培養期結束時，對獼猴T細胞進行計數且用PBS洗滌1次且與2%山羊血清、1%兔血清及0.1%人類血清一起於PBS中在4℃下培育30分鐘。接著細胞用如上文關於人類Ramos細胞所描述之抗huCD30L抗體染色。結果可見於表5中。
亦針對阻斷人類CD30L與可溶性人類CD30.Fc分子之結合的能力篩選抗體。簡言之，人類Ramos細胞或活性獼猴T細胞與50μg/mL抗CD30L IgG一起在阻斷緩衝液中於4℃下培育30分鐘。接著添加可溶性huCD30.Fc-His達到最終濃度為2.5μg/mL(30微升/孔)且在4℃下培育30分鐘。細胞用PBS洗滌2次且與5μg/mL小鼠抗His單株抗體(30微升/孔於阻斷緩衝液中)一起培育且在4℃下培育30分鐘。在用PBS洗滌2次後，細胞與抗小鼠IgG-PE(1：50於PBS中；BD Pharmingen,San Diego,CA)一起在4℃下再培育30分鐘。接著細胞用PBS洗滌2次且準備用於FACs分析。結果可見於表5中。
實施例2 CD30L抗體功能性篩選
使用兩種IL-8釋放分析法針對阻斷CD30L/CD30相互作用之能力特性化抗體。該等分析法使用人類間變性大細胞淋巴瘤(ALCL)細胞株Karpas-299(K299)，其表現內源CD30且回應於CD30L而釋放IL-8。簡言之，經純化之抗人類CD30L IgG抗體與重組CD30L(單細胞分析法)或表現原生CD30L之Ramos細胞(雙細胞分析法)一起培育且與K299細胞一起培養。在預定培育期後，收集細胞上清液且使用夾心ELISA分析IL-8含量以確定抗體候選物抑制K299細胞回應於CD30L釋放IL-8之作用。
單細胞分析法
將抗CD30L IgG抗體滴定至培養物稀釋物(RPMI-1640培養基+10%熱不活化胎牛血清)中且置放於圓底96孔微量滴定板(Costar® 96孔板(Corning；Acton,MA))中使最終濃度範圍為1μg/ml至10pg/ml。如美國專利第5,480,981號中所描述製備小鼠抗人類CD30L單株抗體作為陽性對照。稀釋物及CD30L IgG之最終體積為100微升/孔。接著向各孔中添加50μl重組人類CD30L異白胺酸拉鏈(huCD30L LZ)。huCD30L LZ構築體 由人類CD30L之胞外域(參見美國專利第5,480,981號)組成，該人類CD30L之胞外域在其N端連接至藉由用異白胺酸殘基置換白胺酸殘基而修飾之異白胺酸拉鏈主結構。使用犬CD30L LZ替代huCD30L LZ，亦使用單細胞分析法確定犬交叉反應性。如關於人類LZ分子所描述製備犬CD30L LZ。
板在室溫下培育45分鐘。向各孔中添加50μl K299細胞(4×105個細胞/毫升)。接著板在37℃及5% CO2下培育24小時。
根據製造商說明書(R&D Systems,Minneapolis,MN)使用CDCL8/IL-8 ELISA DuoSet套組藉由夾心ELISA測定細胞上清液中IL-8之含量。使用DeltaSoft 3軟體(版本2.2)(DeltaSoft公司，Hillsborough,NJ)自ELISA標準曲線由內插法獲得IL-8含量。所有結果及IC50值均可表示為3份複製培養物之由GraphPad PRISM軟體v.4.01(GraphPad Software公司，San Diego,CA)計算之平均值±平均標準誤差(SEM)。使用huCD30L LZ獲得之抗體A1之IC50值為2700pM。使用犬CD30L LZ之結果可見於表5中。
雙細胞分析法
如上文所描述，將抗CD30L IgG抗體滴定至培養物稀釋物中且置放於圓底96孔微量滴定板中使最終濃度範圍為1μg/ml至10pg/ml。稀釋物及CD30L IgG之最終體積為100微升/孔。向各孔中添加50μl經照射(5000RADS)之CD30L+ Ramos細胞(4×106個/毫升，ATCC)。使Ramos細胞經FACS分選以選擇具有最高細胞表面CD30L表現量之細胞。
板在室溫下培育45分鐘。向各孔中添加50μl K299細胞(4×105個細胞/毫升)。板在37℃及5% CO2下培育24小時。
根據製造商說明書(R&D Systems,Minneapolis,MN)使用CDCL8/IL-8 ELISA DuoSet套組藉由夾心ELISA測定培養物上清液中IL-8之含量。IL-8含量及IC50值係如上文所描述計算，參見表5。
基於與小鼠抗人類CD30L單株抗體對照物相比抑制CD30L 誘導之IL-8誘導作用之能力選擇抗體前導物。
實施例3 藉由結合競爭對CD30L抗體進行重新分級
使用結合競爭分析法進行重新分級，其中1個經標記之CD30L抗體與過量的其他未經標記之CD30L抗體針對與rhCD30L之結合進行競爭。彼此競爭之抗體分類為相同等級。抗體A至F彼此針對與rhCD30L之結合進行競爭。
實施例4 測定CD30L抗體之細胞上平衡解離常數(Kd)
藉由FACS Kd方法測定CD30L抗體與表現於Ramos細胞上 之CD30L之結合親和力。Ramos細胞於RMPI1640培養基+10% FBS+L-glut+0.05%疊氮化合物中培養。建立兩個平衡反應，其中使用細胞培養基以1：3將抗體自60nM滴定至338fM且在兩種不同恆定細胞濃度(25000個及250000個細胞)下培育。板用Parafilm密封且在37℃下於搖動下培育20小時。將平衡板離心且細胞小球用冰冷的FACS緩衝液(1×D-PBS+2% FBS)洗滌兩次。接著細胞與二級抗體山羊抗人類Fc Cy5(Jackson Immuno Research,West Grove,PA)一起及與7AAD(BD-Biosciences,Rockville,MD)一起在黑暗中於冰上培育1小時。在培育後，細胞用冰冷的FACS緩衝液洗滌兩次，隨後進行流動式細胞測量術分析。閘控於活細胞群體上FL4位移之幾何平均值量測結合[Ab]。接著計算幾何平均值之倒數，其反映平衡溶液中之理論自由[Ag]。在KinExA軟體中使用幾何平均讀數之倒數值進行各抗體之分析及Kd計算。標繪自由[Ag]量測值與滴定組分之起始濃度之關係曲線且使用KinExATM Pro軟體中之n-曲線分析藉由曲線擬合自該等在兩種不同細胞濃度下之曲線獲得Kd。提供95%信賴區間作為Kd下限值及Kd上限值。
如表6所示，抗體對表現於Ramos細胞上之CD30L具有高親和力。所有抗體均具有低pM範圍內之Kd值。
實施例5 ADCC分析法
A1之可變域連接至人類IgG1恆定域(A1 IgG1)。於Fut-8剔除型CHO細胞株中表現此抗體，產生岩藻糖基化抗體A1 IgG1f。
在抗體依賴性細胞毒性(ADCC)分析法中評估CD30L抗體介導之目標細胞之殺死作用。收集目標細胞Ramos(高CD30L表現量)、JD38(中等CD30L表現量)、DS179(低CD30L表現量)及EW36(無CD30L表現)且以2×106個細胞/毫升再懸浮於cRPMI-10培養基(RPMI(Life Technologies,Carlsberg,CA)+10%胎牛血清)中。添加Calcein-AM(4MM於無水DMSO中)(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)使最終濃度達到10μM(1：400稀釋物)。細胞在37℃下培育30分鐘，接著在PBS中洗滌兩次(每次均為1500rpm，5分鐘，4℃)。丸粒再懸浮於cRPMI-10中且將濃度調節為0.2×106個細胞/毫升，置放於冰上以供用於下一步驟。
首先向U型底96孔板(BD,Franklin Lakes,NJ)中自10μg/ml開始以10倍連續滴定添加抗體A1 IgG1及抗體A1 IgG1f。使用利妥昔單抗(Rituximab)(Genentech,South San Francisco,CA)作為陽性抗體對照。添加抗體A1(IgG2)作為陰性對照。接著向各孔中添加如上文所述之Calcein-AM標記之目標細胞(10,000個細胞/孔)且與抗體一起在37℃下培育20分鐘。在培育後，向各孔中添加50μl NK細胞(濃度為4×106個細胞/毫升)且在37℃下培育4小時。將NK細胞粒化(1500rpm，5分鐘，4℃)且再懸浮於cRPMI-10中，將細胞濃度調節至4×106個細胞/毫升。
在培育後，藉由每孔添加20μl 9% NP-40(IGEPAL CA 630，Sigma-Aldrich)以刺激100%溶解來製備對照孔。所有其他孔僅接收每孔20μl cRPMI-10培養基。板在4℃下於800RPM下旋轉4分鐘。移除上清液(150μl)且轉移至透明底部黑色96孔板(Corning,Lowell,MA)中且在板讀取 器(Molecular Devices,Spectra max GEMINI)上讀取螢光讀數(激發485，發射535)。
最大溶解百分比計算為(樣本值-自發性溶解)/(100%溶解-自發性溶解)×100。
CD30L抗體介導之4種目標細胞之殺死作用之結果展示於圖1(A-D)中。抗體A1 IgG1在任一種CD30L表現細胞上均不介導細胞殺死作用(參見圖1A-D)。抗體A1 IgG1f在具有高CD30L表現之目標細胞(參見圖1A)及具有中等CD30L表現(參見圖1B)之目標細胞上誘導細胞死亡。與具有中等CD30L含量之目標細胞相比，抗體A1 IgG1f在具有較高CD30L表現之目標細胞上介導更大程度消耗(參見圖1A及1B)。抗體A1 IgG1f未殺死具有低(C)CD30L表現或無(D)CD30L表現之目標細胞。
實施例6 由抗CD30L mAb之HX-MS進行抗原決定基定位
藉由HX-MS評估抗CD30L抗體之CD30L結合區以鑑別人類CD30L中涉及與本文中所描述之抗體A至F之分子相互作用的區域。
材料
hCD30L：使用hCD30L之胞外域之兩個不同版本，His-hCD30L-EC含有hCD30L之殘基63-234(如由SEQ ID NO：74鑑別及如名稱所示)，產生具有N端His標籤(RnD Systems)之蛋白質。FLAG-hCD30L-EC含有SEQ ID NO：74之殘基66-234且係自具有N端FLAG-His標籤之哺乳動物細胞獲得。
人類CD30L之胞外域之cDNA係自Origene購得。藉由兩步驟型擴展PCR使FLAG-His6標籤及TEV蛋白酶裂解位點與胺基酸66-234之編碼序列之N端融合且在具有CD33信號肽之框中在pJSV001質體之EcoRI與BamHI位點之間經選殖。
下文中所用FLAG-hCD30L-EC包括N153Q點突變，其消除N-糖基化作用。用Qiagen快速變化點突變誘發套組(QIAGEN)產生N153Q突變體。
使用HEK293 6E細胞進行蛋白質生產。細胞與補充有25μg/ml遺傳黴素418(Geneticin 418)(Gibco)及0.1% F-68(Gibco)之FreeStyleTM培養基(Gibco)一起培養。在轉染當天，保持細胞密度為1×106個細胞/毫升且根據製造商說明書用293 Fectin(Invitrogen)轉染。在轉染後24小時，向培養物中添加蛋白腖(Promega)使最終濃度為0.5%。細胞繼續生長5天，隨後收集上清液。
藉由離心(15,000rpm×20min，4℃)收集培養物上清液且接著藉由用0.22μm硝酸纖維素薄膜過濾來使其澄清。澄清上清液施用於Ni-螯合瓊脂糖凝膠XK60管柱(20ml)(GE healthcare)，接著施用具有20mM NaH2PO4(pH7.4)、0.5M NaCl之10倍管柱體積洗滌液。接著蛋白質用5倍管柱體積之20mM NaH2PO4(pH7.4)、0.5M NaCl、0.5M咪唑洗提。收集洗提之蛋白質，藉由Amicon ultra 15離心單元(10,000Da MWCO，Millipore)濃縮至約5ml且裝載於Hiload 26/60 Superdex 200318ml管柱(GE Healthcare)上以移除聚集體且將緩衝液更換為PBS。在濃縮後，藉由用NANODROP UV光譜儀量測280nm吸光度來確定最終蛋白質濃度。藉由SDS-PAGE評估蛋白質純度。
每5μg hCD30L使用1U PNGaseF(Roche)在37℃下進行去糖基化作用約16小時。去糖基化蛋白質在4℃下儲存且在1週內用於實驗。在進行HX-MS實驗前，將所有蛋白質之緩衝液均更換為PBS(pH 7.4)。
HX-MS實驗 儀器及資料記錄
用具有耦接至Synapt G2質譜儀(Waters公司)之HDX Technology(Waters公司)之nanoACQUITY UPLC系統進行HX實驗。Waters HDX系統含有由LeapShell軟體(Leap Technologies公司/Waters公司)操作之Leap機器人(H/D-x PAL；Waters公司)，其起始氘交換反應、進行反應時間控制、中止反應、對UPLC系統之注射及消化時間控制。Leap機器人配備有兩個溫度控制型堆疊，其分別保持於20℃以用於緩衝液儲存及HX反應且保持於2℃以用於儲存蛋白質及中止溶液。Waters HDX系統此外含有溫度控制腔室，其將前置管柱及分析管柱以及LC管道及開關閥保持為1℃。獨立溫度控制腔室將胃蛋白酶管柱保持為25℃。對於管線內胃蛋白酶消化，裝載100μL含有300pmol hCD30L之中止樣品且使用100μL/min(0.1%甲酸：CH3CN95：5)之等度流動速率使其通過置放於25℃下之Poroszyme®固定之胃蛋白酶濾筒(2.1×30mm(Applied Biosystems))。截流所得肽且在VanGuard前置管柱BEH C18 1.7μm(2.1×5mm(Waters公司))上脫鹽。接著，切換閥門以將前置管柱與分析管柱UPLC-BEH C18 1.7μm(1×100mm(Waters公司))成一直線，且使用9分鐘10%至50% B(以40μl/min自nanoAQUITY UPLC系統(Waters公司)遞送)之梯度分離肽。移動相由A：0.1%甲酸及B：含0.1%甲酸之CH3CN組成。使用Synapt G2質譜儀(Waters公司)以陽離子模式獲得ESI MS資料及進行獨立高能量(MSE)實驗。使用白胺酸-腦啡肽作為鎖定物質(lock mass)([M+H]+離子，m/z 556.2771)且以連續模式收集資料(關於進一步描述，參見Andersen及Faber,Int.J.Mass Spec.,302,139-148(2011))。
資料分析
在獨立實驗中使用標準MSE方法鑑別胃蛋白酶肽，其中利用Synapt G2(Waters公司)之離子遷移性將肽及片段進一步對準。使用ProteinLynx Global Server(2.5版本)(Waters公司)處理MSE資料。用DynamX 2.0軟體(Waters公司)處理HX-MS原始資料檔案。DynamX自動進行鎖定 物質校正及氘併入確定，亦即確定氘化肽之質心。此外，人工檢查所有肽以確保由軟體產生之正確峰值及氘化作用分配。
抗原決定基定位實驗
在存在或不存在mAb A、B、C、D、E或F情況下藉由hCD30L之6倍稀釋物起始醯胺氫/氘交換(HX)，交換至相應氘化緩衝液(亦即於D2O中製備之PBS，最終96% D2O，pH 7.4(未校正值))中。所有HX反應均在不存在或存在6.6μM mAb情況下在20℃下進行且含有6μMhCD30L(所用單體Mw)，因此使mAb莫耳過量2.2倍。在0.25、0.5、1、3及10分鐘時間間隔，藉由50μl冰冷的中止緩衝液(1.35M TCEP)中止HX反應之50μl等分試樣，使得最終pH值為2.5(未校正值)。
結果 hCD30L蛋白質
hCD30L中存在糖基化作用將阻礙HXMS分析。由於未知物質及蛋白質糖基化作用之常見非均勻性，無法在MS中鑑別及分析所得胃蛋白酶肽。然而，消除hCD30L之糖基化作用可產生適用於HXMS之定義良好之胺基酸序列，因為其可於MS中鑑別及分析。
hCD30L胞外域含有5個潛在N-糖基化作用位點，如以下表7之第一行中所列舉。嘗試藉由用PNGaseF處理及藉由點突變消除糖基化作用以獲得更適用於HXMS分析之蛋白質。
His-hCD30L-EC之MS及SEC-MALS分析表明5個潛在N-糖基化作用位點中的4個位點實際上糖基化(表7；資料未示)。在原生條件下用PNGaseF處理此蛋白質後，僅兩個糖基化作用可由PNGaseF以酶促方式消除且因此兩個N-糖基化作用留存於蛋白質上。
在原生條件下用PNGaseF處理FLAG-hCD30L-EC後，MS及SEC-MALS均表明此蛋白質可完全去糖基化。總而言之，N153Q突變消除 無法以酶促方式自His-hCD30L-EC移除之N-糖基化作用位點且認為此蛋白質對HXMS而言最佳。表7中包括糖基化作用位點評估之概述。
HX-MS分析
在氘交換反應後，用胃蛋白酶消化hCD30L-EC產生表8中描述之胃蛋白酶肽區域。hCD30L殘基之數目與SEQ ID NO：74一致，然而N端FLAG-His標籤DYKDDDDKHHHHHHENLYFQG並非hCD30L序列之一部分。在不存在或存在mAb A、B、C、D、E或F情況下監測40個胃蛋白酶肽(覆蓋FLAG-hCD30L-EC之一級結構之83%)之HX時程且資料包括於表8中。
本研究中未分析之剩餘序列由胃蛋白酶肽覆蓋；然而信號強度不足以進行資料分析。在存在或不存在mAb A1、B、C、D、E或F情況下於早期時間點(<10分鐘)觀測到之交換模式可分為兩個不同群組：一組hCD30L-EC胃蛋白酶肽顯示不受mAb結合影響之交換模式。相反，另一組hCD30L中之肽展示mAb結合後經保護免於交換(表8)。在重疊胃蛋白酶肽情況下，嘗試將交換保護資訊子定位至肽內之特定殘基或延伸子，假設該肽發生肽N端及第一肽鍵之完全回換(back-exchange)。肽中之交換保護表示此區域與mAb結合有關。因此，在由特定肽界定之區域內部分或完全 定位抗原決定基。然而，因為HX-MS之解析度係基於氘化蛋白質之胃蛋白酶消化，因此既定區域內之交換保護並非暗示由胃蛋白酶肽界定之區域內之每一殘基均必然與mAb結合有關。
mAb A1之抗原決定基定位
在4個不同實驗中(三次使用FLAG-hCD30L-EC及一次使用His-hCD30L-EC)定位mAb A1之抗原決定基。在HX-MS實驗前，兩種蛋白質均用PNGaseF處理。該等研究之結果均與所用hCD30L蛋白質高度獨立且均產生相同抗原決定基資訊。然而，由於糖基化區域中缺乏可偵測肽，His-hCD30L-EC實驗中之序列覆蓋率明顯較低。
在hCD30L之N端區域(表8)中觀測到mAb A1之抗原決定基信號直至殘基Cys88。肽自起點(殘基45、62或66)延伸之長度越長，則交換保護變得越強，由此表明肽之更C端區域及殘基88中亦存在交換保護。相反，肽45-65、45-81及66-81未展示交換保護。此外，殘基D81為糖基化作用位點，其中糖基化N在PNGaseF作用後變為D。因此，N/D81可能與mAb結合無關。因此，抗原決定基信號似乎由區域82-88 CSEDLLC內之殘基產生。
亦可在覆蓋區域F211至S226的六個不同肽中之hCD30L之C端區域(表8)中觀測到mAb A1之抗原決定基信號。基於所觀測到之交換保護程度，該區域之所有部分似乎均或多或少地與mAb A之結合有關或受mAb A之結合影響。表8中由抗體結合之區域標記為粗體。
總而言之，偵測到hCD30L中與結合mAb A有關之區域為區域82-88 CSEDLLC及區域211-226 FQYIDTSTFPLENVLS。
mAb B、C、D、E及F之抗原決定基定位
在HX-MS實驗，用經PNGaseF處理之FLAG-hCD30L-EC定位mAb B、C、D、E及F之抗原決定基。該等研究之抗原決定基結果與mAb A高度類似(表8)(亦就交換保護之量值而言)。mAb E上之抗原決定基定位進行兩次，而mAb A、B、C及D各進行一次定位。
N：抗體結合後無交換保護(<0.2Da)。
na：各別實驗中不可分析。
總而言之，hCD30L中與結合mAb B、C、D、E及F有關之區域與涉及mAb A1之結合之區域類似且偵測為區域82-88 CSEDLLC及區域211-226 FQYIDTSTFPLENVLS。
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<400> 24
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
<210> 29
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (3)..(3)
<223> XAA可為THR或SER
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (7)..(7)
<223> XAA可為VAL或ILE
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (9)..(9)
<223> XAA可為VAL、THR或LEU
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (11)..(11)
<223> XAA可為ASP或ASN
<400> 30
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (3)..(3)
<223> XAA可為SER、ASN或ILE
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (4)..(4)
<223> XAA可為ASN或LYS
<400> 31
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (4)..(4)
<223> XAA可為THR或SER
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> XAA可為ARG或SER
<400> 32
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> XAA可為SER或ASN
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> XAA可為TYR或ASN
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (3)..(3)
<223> XAA可為ILE、TYR或SER
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> XAA可為THR或SER
<400> 33
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> XAA可為ILE、VAL或THR
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (3)..(3)
<223> XAA可為TYR、PHE或SER
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (4)..(4)
<223> XAA可為THR、SER或ALA
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (7)..(7)
<223> XAA可為ILE、LEU、ASN、SER、ARG或GLN
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> XAA可為THR或ASN
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (11)..(11)
<223> XAA可為ASN或LYS
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (15)..(15)
<223> XAA可為LYS或ARG
<400> 34
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> XAA可為GLU或ASP
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> XAA可為ARG、THR或PHE
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (3)..(3)
<223> XAA可為VAL、ALA、ARG或THR
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (4)..(4)
<223> XAA可為VAL、THR、GLY或ILE
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> XAA可為VAL、ALA或GLY
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> XAA可為ALA、THR、GLY或GLN
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (7)..(7)
<223> XAA可為THR、ASP、ARG或SER
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> XAA可為ARG或TYR
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (10)..(10)
<223> XAA可為THR或HIS
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (12)..(12)
<223> XAA可為THR ASP或SER
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (14)..(14)
<223> XAA可為MET、LEU或VAL
<400> 35
<210> 36
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
<210> 37
<211> 326
<212> DNA
<213> 智人
<400> 37
<210> 38
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
<210> 39
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 39
<210> 40
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
<210> 41
<211> 326
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
<210> 42
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
<210> 43
<211> 330
<212> DNA
<213> 智人
<400> 43
<210> 44
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
<210> 45
<211> 326
<212> DNA
<213> 智人
<400> 45
<210> 46
<211> 110
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
<210> 47
<211> 322
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
<210> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
<210> 49
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
<210> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
<210> 51
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
<210> 52
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
<210> 53
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 53
<210> 54
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
<210> 55
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 55
<210> 56
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
<210> 57
<211> 366
<212> DNA
<213> 智人
<400> 57
<210> 58
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 58
<210> 59
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 59
<210> 60
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
<210> 61
<211> 379
<212> DNA
<213> 智人
<400> 61
<210> 62
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
<210> 63
<211> 379
<212> DNA
<213> 智人
<400> 63
<210> 64
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
<210> 65
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 65
<210> 66
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 66
<210> 67
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 67
<210> 68
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 68
<210> 69
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 69
<210> 70
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 70
<210> 71
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 71
<210> 72
<211> 124
<212> PRT
<213> 智人
<400> 72
<210> 73
<211> 372
<212> DNA
<213> 智人
<400> 73
<210> 74
<211> 234
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (1)..(37)
<223> 細胞質的
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (38)..(62)
<223> 跨膜
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (63)..(234)
<223> 細胞外的
<400> 74
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 合成序列
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (3)..(3)
<223> 其中X係I、S或Y。
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> 其中X係T或S。
<400> 75

Claims (15)

  1. 一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質結合CD30L中包括AA 201至234之C端區域。
  2. 如申請專利範圍第1項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質結合CD30L中由AA 75至95界定之另一區域。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質具有至少一種選自由以下組成之群的性質：a)抑制CD30/CD30L相互作用；b)抑制CD30L誘導之IL-8誘導作用；c)與抗體A至F中之一者針對與人類CD30L之結合進行交叉競爭；d)對人類CD30L之解離常數為至多70pM；及e)以與抗體A至F中之一者實質上相同或低於抗體A至F中之一者之Kd結合於人類CD30L。
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其中該人類CD30之KD為至多50pM。
  5. 一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其包含CDRH1、CDRH2及CDRH3以及CDRL1、CDRL2及CDRL3，其中CDRL1為SEQ ID NO：30之CDRL1一致序列，其中CDRL2為SEQ ID NO：31之CDRL2一致序列，其中CDRL3為SEQ ID NO：32之CDRL3一致序列，其中CDRH1為SEQ ID NO：33之CDRH1一致序列，其中CDRH2為SEQ ID NO：34之CDRH2一致序列；及其中CDRH3為SEQ ID NO：35之CDRH3一致序列。
  6. 如前述申請專利範圍中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其包含：選自由SEQ ID NO：14、15、16、17及18組成之群之CDRH1； 選自由SEQ ID NO：19、20、21、22、23及24組成之群之CDRH2；選自由SEQ ID NO：25、26、27、28及29組成之群之CDRH3；選自由SEQ ID NO：1、2、3、4、5及6組成之群之CDRL1；選自由SEQ ID NO：7、8、9及10組成之群之CDRL2；及選自由SEQ ID NO：11、12及13組成之群之CDRL3。
  7. 如前述申請專利範圍中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其包含：a)由SEQ ID NO：14、19、25鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：1、7及11鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，b)由SEQ ID NO：15、21、26鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：2、8及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，c)由SEQ ID NO：15、21、26鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：3、8及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，d)由SEQ ID NO：16、22、27鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：4、9及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，e)由SEQ ID NO：17、23、28鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：5、8及13鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3，或f)由SEQ ID NO：18、24、29鑑別之CDRH1、CDRH2及CDRH3以及由SEQ ID NO：6、10及12鑑別之CDRL1、CDRL2及CDRL3。
  8. 一種結合CD30L之分離之抗原結合蛋白質，其係選自由以下組成之群a)分離之抗原結合蛋白質，其包含選自由SEQ ID NO：48、50、52、54、56、58、60及62組成之群之重鏈可變區及SEQ ID NO：36之輕鏈可變區；b)分離之抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：64之重鏈可變區及SEQ ID NO：38之輕鏈可變區；c)分離之抗原結合蛋白質，其包SEQ ID NO：66之重鏈可變區及SEQ ID NO：40之輕鏈可變區； d)分離之抗原結合蛋白質，其包SEQ ID NO：68之重鏈可變區及SEQ ID NO：42之輕鏈可變區；e)分離之抗原結合蛋白質，其包SEQ ID NO：70之重鏈可變區及SEQ ID NO：44之輕鏈可變區；及f)分離之抗原結合蛋白質，其包含SEQ ID NO：72之重鏈可變區及SEQ ID NO：46之輕鏈可變區。
  9. 如前述申請專利範圍中任一項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為抗體。
  10. 如申請專利範圍第9項之分離之抗原結合蛋白質，其中該抗原結合蛋白質為IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型。
  11. 一種醫藥組成物，其包含至少一種如前述申請專利範圍中任一項之抗原結合蛋白質及醫藥學上可接受之賦形劑。
  12. 一種治療或預防患者與CD30L相關之病狀之方法，其包含投予有需要之患者有效量之至少一種如前述申請專利範圍中任一項之分離之抗原結合蛋白質。
  13. 一種降低患者CD30L活性之方法，其包含投予有效量之至少一種如前述申請專利範圍中任一項之抗原結合蛋白質。
  14. 一種分離之核酸分子，其編碼如前述申請專利範圍第1項至第10項中任一項之抗原結合蛋白質。
  15. 一種宿主細胞，其包含如具體實例30之核酸分子或如具體實例33之載體。
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