ES2857900T3 - Proteínas de unión a antígeno de ligando CD30 humano - Google Patents

Proteínas de unión a antígeno de ligando CD30 humano Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo aislado que se une a CD30L que comprende una CDRH1, una CDRH2 y una CDRH3 y una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3, en el que CDRL1 es la secuencia consenso CDRL1 de SEQ ID NO:30, en el que CDRL2 es la secuencia consenso CDRL2 de SEQ ID NO:31, en el que CDRL3 es la secuencia consenso CDRL3 de SEQ ID NO:32, en el que CDRH1 es la secuencia consenso CDRH1 de SEQ ID NO:33, en el que CDRH2 es la secuencia consenso CDRH2 de SEQ ID NO:34 y en el que CDRH3 es la secuencia consenso CDRH3 de SEQ ID NO:35.

Description

DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión a antígeno de ligando CD30 humano
ANTECEDENTES
El ligando CD30 (CD30L, CD153), el ligando que se produce de manera natural para CD30, es una glicoproteína de membrana de tipo II que se une específicamente a CD30, haciendo que CD30 transmita una señal a través de su dominio citoplásmico. CD30 y CD30L son glicoproteínas de la superficie celular que interaccionan, que son miembros de las superfamilias TNFR y TNF, respectivamente (Durkop et al, Cell, 68:421, 1992; Smith et al, Cell, 73:1349, 1993; patentes estadounidenses n.os: 5.480.981; 5.677.430; 6.143.869 y 6.652.854). La expresión de CD30 y CD30L está restringida a células del sistema inmunitario y está regulada estrechamente. CD30 se expresa principalmente en células B activadas y subconjuntos de células T con un fenotipo activado/de memoria (Ellis et al., J. Immun., 151:2380, 1993; Falini et al., Blood, 85:1, 1995). CD30L se expresa a altos niveles en células T de ratón y humanas activadas (Shimozato et al, Biochem. & Biophys. Res. Comm., 256:519, 1999; Armitage, J. Biological Regulators & Homeostatic Agents, 14:142, 2000). Se producen cambios drásticos en la expresión génica relativa de CD30L a medida que las células B transitan a través de centros germinales (Klein et al, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 100:2639, 2003). Por tanto, la expresión de CD30L en células B puede ser específica de la fase y del contexto. CD30L también parece ser un marcador de una población única de células accesorias similares a células dendríticas de ratón que están presentes en los folículos esplénicos, interaccionando las células T con las células B (Kim et al., Immunity, 18:643, 2003).
Las interacciones entre células que expresan CD30/CD30L parecen ser importantes para la generación de respuestas de anticuerpo conmutadas por clase o secundarias dependientes de células T fuertes. La evidencia de un papel de este tipo incluye datos de estudios in vitro (Shanebeck et al., Eur. J. Immunol., 25:2147-53, 1995) e in vivo (Gaspal et al., J. Immunol., 174:3891-6, 2005) en sistemas de ratón. Además, se ha mostrado que el tratamiento in vivo de ratones con un Acm de rata bloqueante, pero no de agotamiento, frente a CD30L de ratón inhibe el desarrollo o la progresión de enfermedad en varios modelos de enfermedades autoinmunes dependientes de células T y/o B (patente estadounidense n ° 6.667.039). En modelos con una fuerte componente inmune humoral, la inhibición de enfermedad se correlaciona con la inhibición de la respuesta de anticuerpo asociada a enfermedad.
Se han descrito los anticuerpos que se unen a CD30L de ratones/rata (Blazar et al., J Immunol. 1 de septiembre de 2004;173(5):2933-41; Chakrabarty et al., Clin Exp Immunol. Septiembre de 2003;133(3):318-25; Saraiva et al., J Exp Med. 16 de septiembre de 2002;196(6):829-39; Kennedy et al., Immunology. Junio de 2006;118(2):143-52). También se han descrito anticuerpos que se unen a CD30L humano (publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 02/11767; Franke et al., Hybridoma. Febrero de 2000;19(1):43-8; Smith et al., Cell. 2 de julio de 1993;73(7):1349-60). Sin embargo, tales anticuerpos carecen de alta afinidad.
Por tanto, sería útil tener composiciones que comprendan anticuerpos humanos y/o regiones de unión a antígeno que se unan a CD30L para su uso en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a CD30L humano tal como se define en las reivindicaciones adjuntadas al presente documento.
En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo de la invención.
En un tercer aspecto, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un anticuerpo de la invención.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo de la invención.
DESCRIPCIÓN GENERAL
Tal como se describe en el presente documento, las proteínas de unión a antígeno de CD30L humano pueden reducir, inhibir, interferir con y/o modular al menos una de las respuestas biológicas relacionadas con una interacción CD30L/CD30, y como tales, son útiles para mejorar los efectos de enfermedades o trastornos relacionados con CD30L. Las proteínas de unión a antígeno de CD30L pueden usarse, por ejemplo, para reducir, inhibir, interferir con y/o modular interacciones CD30L/CD30.
Se describe una proteína de unión a antígeno aislada que se une a una región C-terminal de CD30L que incluye AA 201-234. También se describe una proteína de unión a antígeno que se une a una región C-terminal de CD30L que incluye AA 201-234 y una región adicional de CD30L ubicada en la parte N-terminal de la región extracelular, que se define mediante AA 75-95. También se describe una proteína de unión a antígeno que tiene al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en: a) inhibir la interacción CD30/CD30L; b) inhibir la inducción de IL-8 inducida por CD30L; c) competir de manera cruzada con uno de los anticuerpos A-F por la unión a CD30L humano; d) una constante de disociación para CD30L humano es de como máximo 70 pM y e) unirse a CD30L humano con sustancialmente la misma o mayor afinidad (menor Kd) que uno de los anticuerpos A-F. La afinidad (o Kd) puede determinarse tal como conoce el experto en la técnica, tal como mediante SPR o mediante FACS tal como se describe en el ejemplo 4 en el presente documento.
También se describe una proteína de unión a antígeno que se une a CD30L y compite con un Fab de uno o más de los anticuerpos A, B, C, D, E y F por la unión a CD30L. Alternativamente, dicha proteína de unión a antígeno se caracteriza como una proteína de unión a antígeno cuya unión a hCD30L se inhibe mediante la unión de un Fab de uno o más de los anticuerpos A, B, C, D, E y F. En este caso, el Fab puede ser un Fab de anticuerpo A que incluye cada uno de A1, A2, A3, A4, A5 y A6.
También se describe una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CD30L, que comprende al menos una región variable de cadena pesada que comprende una CDRH1, una CDRH2 y una CDRH3 seleccionadas del grupo que consiste en: a) una CDRH1 que difiere en no más de cuatro, tres, dos o una sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácido de una CDRH1 tal como se muestra en la tabla 3; b) una CDRH2 que difiere en no más de siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácido de una CDRH2 tal como se muestra en la tabla 3; c) una CDRH3 que difiere en no más de once, diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos o una sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácido de una CDRH3 tal como se muestra en la tabla 3; y que comprende al menos una región variable de cadena ligera que comprende una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3 seleccionadas del grupo que consiste en: d) una CDRL1 que difiere en no más de cuatro, tres, dos o una sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácido de una CDRL1 tal como se muestra en la tabla 3; e) una CDRL2 que difiere en no más de dos o una sustitución, inserción o deleción de aminoácido de una CDRL2 tal como se muestra en la tabla 3; f) una CDRL3 que difiere en no más de dos o una sustitución, inserción o deleción de aminoácido de una CDRL3 tal como se muestra en la tabla 3. También se describe una CDRH1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:14, 15, 16, 17, 18 y 33; una CDRH2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 19, 20, 21,22, 23, 24 y 34; una CDRH3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29 y 35; una c Dr L1 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1,2, 3, 4, 5, 6 y 30; una CDRL2 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 8 ,9, 10 y 31; y una CDRL3 seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11, 12, 13 y 32.
También se describe una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CD30L humano que comprende al menos una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3, comprendiendo la CDR1 los residuos de aminoácido 23-36, comprendiendo la CDR252-58 y comprendiendo la CDR391-100 de las SEQ ID NO:36, 28, 40, 42 o 44; o b) una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3, comprendiendo la CDR1 los residuos de aminoácido 25-36, comprendiendo la CDR2 los residuos de aminoácido 52-58 y comprendiendo la CDR3 los residuos de aminoácido 91-100 de SEQ ID NO:46; y al menos una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1, CDR2 y CDR3, comprendiendo la CDR1 los residuos de aminoácido 31 -35, comprendiendo la CDR2 los residuos de aminoácido 50-65 y comprendiendo la CDR3 los residuos de aminoácido 98-113 de las SEQ ID NO:48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 o 72. También se describe una proteína de unión a antígeno que comprende al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera. También se describe una proteína de unión a antígeno que comprende al menos dos regiones variables de cadena pesada y al menos dos regiones variables de cadena ligera.
En el presente documento se describe una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CD30L que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en la que la secuencia de la región variable de cadena pesada difiere en no más de 31,30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9 ,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácido de una región variable de cadena pesada secuencia tal como se muestra en la tabla 2; y en la que la secuencia de la región variable de cadena ligera difiere en no más de 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9 ,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácido de una región variable de cadena ligera secuencia tal como se muestra en la tabla 1.
También se describe una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CD30L que comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72; y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 88% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:36, 38, 40, 42, 44 y 46.
También se describe una proteína de unión a antígeno aislada que se une a CD30L seleccionada del grupo que consiste en a) una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en en las SEQ ID NO:48, 50, 52, 54, 56, 58, 60 y 62 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:36; b) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:64 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:38; c) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:66 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:40; d) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:68 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:42; e) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:70 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:44; y f) una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:72 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:46. La proteína de unión a antígeno aislada puede ser un anticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo multiespecífico o un fragmento de anticuerpo de los mismos. También se describe un anticuerpo fragmento que es un fragmento Fab, un fragmento Fab’, un fragmento F(ab’)2, un fragmento Fv, un diacuerpo o una molécula de anticuerpo monocatenario. También se describe una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo humano. La proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo monoclonal. La proteína de unión a antígeno puede ser del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a antígeno puede ser del tipo IgG 1 o IgG2.
También se describen moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para una proteína de unión a antígeno tal como se describió anteriormente. Al menos una región variable de cadena pesada puede codificarse por una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 y 73 y al menos una región variable de cadena ligera puede codificarse por una molécula de ácido nucleico aislada seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:37, 39, 41,43, 45 y 47. La molécula de ácido nucleico puede estar ligada operativamente a una secuencia control. También se describen vectores que comprenden un ácido nucleico descrito anteriormente y células huésped que comprenden tales vectores. También se describe un polinucleótido aislado suficiente para su uso como sonda de hibridación, cebador de PCR o cebador de secuenciación que es un fragmento de la molécula de ácido nucleico tal como se describió anteriormente o su complemento.
También se describe un método de elaboración de la proteína de unión a antígeno tal como se describió anteriormente que comprende la etapa de preparar la proteína de unión a antígeno a partir de una célula huésped que secreta la proteína de unión a antígeno.
También se describe una proteína de unión a antígeno aislada tal como se describió anteriormente, teniendo la proteína de unión a antígeno al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en: a) inhibir la interacción CD30/CD30L; b) inhibir la inducción de IL-8 inducida por CD30L; c) competir de manera cruzada con uno de los anticuerpos A-F por la unión a CD30L humano; d) una constante de disociación < 70 pM y e) unirse a CD30L humano con sustancialmente la misma Kd que uno de los anticuerpos A-F.
También se describe una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de unión a antígeno tal como se describió anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable. También se describen composiciones farmacéuticas tales que comprenden además un grupo de etiquetado o un grupo efector. El grupo de etiquetado puede seleccionarse del grupo que consiste en etiquetas isotópicas, etiquetas magnéticas, restos con actividad redox, tintes ópticos, grupos biotinilados y epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario. El grupo efector puede seleccionarse del grupo que consiste en un radioisótopo, radionúclido, una toxina, un grupo terapéutico y un grupo quimioterapéutico. Tal como se describe en el presente documento, la proteína de unión a antígeno puede acoplarse a un grupo de etiquetado.
También se describe un método para tratar o prevenir un estado asociado con CD30L en un paciente, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno aislada tal como se describió anteriormente. En este caso, la proteína de unión a antígeno aislada puede administrarse sola o como terapia de combinación.
También se describe un método de reducción de la actividad de CD30L en un paciente que comprende administrar una cantidad efectiva de al menos una proteína de unión a antígeno tal como se describió anteriormente.
También se describe una proteína de unión a antígeno que compite con al menos una proteína de unión a antígeno tal como se describió anteriormente.
También se describe una proteína de unión a antígeno tal como se describió anteriormente que está completa o parcialmente afucosilada.
FIGURAS
Figura 1A. Células Ramos y efectores NK, cuadrados vacíos: Rituxan (IgG1), rombos rellenos: anticuerpo A1 IgG1f, cuadrados rellenos: anticuerpo A1 IgG 1, círculos vacíos: anticuerpo A1 IgG2.
Figura 1B. Células JD38 y efectores NK, cuadrados vacíos: Rituxan (IgG1), rombos rellenos: anticuerpo A1 IgG1f, cuadrados rellenos: anticuerpo A1 IgG 1, círculos vacíos: anticuerpo A1 IgG2.
Figura 1C. Células DS179 y efectores NK, cuadrados vacíos: Rituxan (IgG1), rombos rellenos: anticuerpo A1 IgG1f, cuadrados rellenos: anticuerpo A1 IgG 1, círculos vacíos: anticuerpo A1 IgG2.
Figura 1D. Células EW36 y efectores NK, cuadrados vacíos: Rituxan (IgG1), rombos rellenos: anticuerpo A1 IgG1f, cuadrados rellenos: anticuerpo A1 IgG 1, círculos vacíos: anticuerpo A1 IgG2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
En el presente documento se describen composiciones, kits y métodos relacionados con proteínas de unión a antígeno de CD30L, incluyendo proteínas de unión a antígeno que bloquean la interacción entre CD30L y CD30, tal como anticuerpos anti-CD30L, fragmentos de anticuerpo y derivados de anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos anti-CD30L, fragmentos de anticuerpo o derivados de anticuerpo neutralizantes. También se describen polinucleótidos, y derivados y fragmentos de los mismos, que comprenden una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para todo o una porción de un polipéptido que se une a CD30L, por ejemplo, un polinucleótido que codifica para todo o parte de un anticuerpo anti-CD30L, fragmento de anticuerpo o derivado de anticuerpo, plásmidos y vectores que comprenden tales ácidos nucleicos, y células o líneas celulares que comprenden tales polinucleótidos y/o vectores y plásmidos. Los métodos descritos incluyen, por ejemplo, métodos de elaboración, identificación o aislamiento de proteínas de unión a antígeno de CD30L, tales como anticuerpos anti-CD30L, métodos de determinación de si una molécula bloquea la interacción entre CD30L y CD30, métodos de determinación de si una molécula antagoniza CD30L, métodos de elaboración de composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden una proteína de unión a antígeno de CD30L, y métodos para administrar una proteína de unión a antígeno de CD30L a un sujeto, por ejemplo, métodos para tratar un estado mediado por CD30L, y para bloquear la interacción entre CD30L y CD30, in vivo o in vitro.
A menos que se defina lo contrario en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que se entienden comúnmente por los expertos habituales en la técnica. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en el presente documento son aquellas ampliamente conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los métodos y las técnicas de la presente invención se realizan generalmente según los métodos convencionales ampliamente conocidos en la técnica y tal como se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y se comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva a menos que se indique lo contrario. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, tal como se llevan a cabo comúnmente en la técnica o tal como se describe en el presente documento. La terminología usada en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica descritos en el presente documento son aquellos ampliamente conocidos y usados comúnmente en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación, formulación y administración farmacéutica, y tratamiento de pacientes.
El término “ligando CD30” (CD30L) se refiere a un género de polipéptidos que son capaces de unirse a CD30, tal como se da a conocer en Smith et al., Cell 73:1349-1360, 1993 y la patente estadounidense n.° 5.480.981, incluyendo muteínas de unión a CD30 de los mismos; tales polipéptidos incluyen proteínas unidas a membrana (que comprenden un dominio citoplásmico, una región transmembrana y un dominio extracelular) así como proteínas truncadas que conservan la propiedad de unión a CD30. Tales proteínas truncadas incluyen, por ejemplo, CD30L soluble que comprende solo el dominio (de unión a receptor) extracelular. También se incluyen fragmentos de CD30L, incluyendo porciones de un polipéptido CD30L de longitud completa que conserva la capacidad de unirse a CD30, o que son capaces de provocar un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido de CD30 o a una porción de CD30 de longitud completa que es capaz de transmitir una señal biológica tal como activación de NF-kB.
El término “CD30” se refiere a un receptor que es un miembro de la superfamilia de receptores TNF/NGF, cuya clonación se describe en Durkop et al. (Cell 68:421, 1992). La frase “CD30 soluble” (sCD30) se refiere a moléculas solubles que comprenden todo o parte del domino extracelular de la proteína CD30, y que conservan la capacidad de unirse específicamente con CD30L. Los polipéptidos de CD30 soluble abarcan sCD30 recombinante y proteínas sCD30 que se producen de manera natural en forma altamente purificada.
Tal como se usa en el presente documento, la frase “fragmento de CD30” se refiere a una porción de un polipéptido de CD30 de longitud completa que conserva la capacidad de unirse a CD30L o que es capaz de provocar un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido de CD30 o a una porción de CD30 de longitud completa que es capaz de transmitir una señal biológica tal como activación de NF-kB.
La frase “interacción CD30/CD30L” tal como se usa en el presente documento se refiere a la unión específica de CD30 a CD30L, dando como resultado la transducción de señales mediante CD30. Esto incluye casos en los que al menos una pareja de unión es un fragmento de o bien CD30 o bien CD30L, es decir, el término puede hacer referencia a la interacción de unión de un fragmento de CD30 con CD30L, CD30 con un fragmento de CD30L, o un fragmento de CD30 con un fragmento de CD30L. Además, una interacción CD30/CD30L puede implicar un análogo de CD30 (tal como una variante alélica o muteína) que es capaz de unirse específicamente a CD30L, o puede implicar un análogo de CD30L (tal como una variante alélica o muteína) que puede unirse específicamente con CD30. Además, una interacción CD30/CD30L puede implicar proteínas o bien CD30 o bien CD30L endógenas o puede implicar CD30 o CD30L recombinante expresada por una célula transfectada con un ácido nucleico que codifica para la proteína recombinante.
El término “polinucleótido” incluye ácidos nucleicos tanto monocatenarios como bicatenarios e incluye ADN genómico, ARN, ARNm, ADNc, u origen sintético o alguna combinación de los mismos que no esté asociada con secuencias que se encuentran normalmente en la naturaleza. Los polinucleótidos aislados que comprenden secuencias especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias codificantes para hasta diez o incluso hasta veinte otras proteínas o porciones de las mismas, o pueden incluir secuencias reguladoras ligadas operativamente que controlan la expresión de la región codificante de las secuencias de ácido nucleico citadas, y/o pueden incluir secuencias de vector. Los nucleótidos que comprende el polinucleótido pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Las modificaciones incluyen modificaciones de base tales como derivados de bromouridina e inosina, modificaciones de ribosa tales como 2’,3’-didesoxirribosa, y modificaciones de ligamiento internucleotídico tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato.
El término “oligonucleótido” significa un polinucleótido que comprende 100 o menos nucleótidos. En algunos casos, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud. En otros casos, los oligonucleótidos son de 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o de 20 a 40 nucleótidos de longitud. Los oligonucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios, por ejemplo, para su uso en la construcción de un gen mutante. Los oligonucleótidos pueden ser oligonucleótidos sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta detectable, tal como una radioetiqueta, una etiqueta fluorescente, un hapteno o una etiqueta antigénica, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden usarse, por ejemplo, como cebadores de PCR, cebadores de clonación o sondas de hibridación.
Los términos “polipéptido” o “proteína” significan una macromolécula que tiene la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa, es decir, una proteína producida por una célula que se produce de manera natural y no recombinante; o se produce por una célula modificada mediante ingeniería genética o recombinante, y comprenden moléculas que tienen la secuencia de aminoácidos de la proteína nativa, o moléculas que tienen una o más deleciones de, inserciones a y/o sustituciones de los residuos de aminoácido de la secuencia nativa. El término incluye también polímeros de aminoácidos en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos de un aminoácido y polímeros que se producen de manera natural correspondientes. Los términos “polipéptido” y “proteína” abarcan proteínas de unión a antígeno de CD30L (tal como anticuerpos) y secuencias que tienen una o más deleciones de, adiciones a y/o sustituciones de los residuos de aminoácido de la secuencia proteica de unión a antígeno. El término “fragmento de polipéptido” se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal, una deleción carboxilo-terminal y/o una deleción interna en comparación con la proteína nativa de longitud completa. Tales fragmentos también pueden contener aminoácidos modificados en comparación con la proteína nativa. En ciertos casos, los fragmentos son de aproximadamente cinco a 500 aminoácidos de longitud. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 o 450 aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptido útiles incluyen fragmentos inmunológicamente funcionales de anticuerpos, incluyendo dominios de unión. En el caso de una proteína de unión a antígeno de CD30L, tal como un anticuerpo, los fragmentos útiles incluyen, pero no se limitan a, una o más regiones CDR, un dominio variable de una cadena pesada o ligera, una porción de una cadena de anticuerpo, una porción de una región variable que incluye menos de tres CDR, y similares.
“Aminoácido” incluye su significado normal en la técnica. Los veinte aminoácidos que se producen de manera natural y su abreviaturas siguen la utilización convencional. Véase, Immunology-A Synthesis, 2a edición, (E. S. Golub y D. R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como [alfa]-aminoácidos, [alfa]-aminoácidos disustituidos, N-alquil-aminoácidos, y otros aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes adecuados para polipéptidos. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, [gamma]-carboxiglutamato, [epsilon]-N,N,N-trimetil-lisina, [epsilon]-N-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, [sigma]-N-metilarginina y otros aminoácidos e iminoácidos similares (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, el sentido izquierdo es el sentido amino-terminal y el sentido derecho es el sentido carboxilo-terminal, según la convención y la utilización estándar.
El término “proteína aislada” se refiere a una proteína, tal como una proteína de unión a antígeno (un ejemplo de la cual podría ser un anticuerpo), que se purifica a partir de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que interferirían con su uso terapéutico, de diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro. Tal como se usa en el presente documento, “sustancialmente pura” significa que la especie de molécula descrita es la especie predominante presente, es decir, en una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En ciertos casos, una molécula sustancialmente pura es una composición en la que la especie objeto comprende al menos el 50% (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. En otros casos, una composición sustancialmente pura comprenderá al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En ciertos casos, una sustancia esencialmente homogénea se ha purificado en un grado tal, que no pueden detectarse especies contaminantes en la composición mediante métodos de detección convencionales y por tanto la composición consiste en una única especie macromolecular detectable.
Una “variante” de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno tal como un anticuerpo) comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más residuos de aminoácido están insertados en, delecionados de y/o sustituidos en la secuencia de aminoácidos en relación con otra secuencia de polipéptido. Los variantes incluyen proteínas de fusión. Un “derivado” de un polipéptido es un polipéptido que se ha modificado químicamente de alguna manera distinta de variantes de inserción, deleción o sustitución, por ejemplo, por medio de conjugación con otro resto químico.
Los términos “que se produce de manera natural” o “nativo” tal como se usan por toda la memoria descriptiva en relación con materiales biológicos tales como polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped y similares, se refieren a materiales que se encuentran en la naturaleza. En este contexto, una “proteína recombinante” es una proteína elaborada usando técnicas recombinantes, es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante tal como se describe en el presente documento. Métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes se conocen ampliamente en la técnica.
El término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina intacta de cualquier isotipo, o un fragmento de la misma, que puede competir con el anticuerpo intacto por la unión específica al antígeno diana, e incluye, por ejemplo, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y biespecíficos. Un anticuerpo como tal es una especie de una proteína de unión a antígeno. A menos que se indique lo contrario, el término “anticuerpo” incluye, además de anticuerpos que comprenden dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, derivados, variantes, fragmentos y muteínas de los mismos, ejemplos de los cuales se describen más adelante. Un anticuerpo intacto comprenderá generalmente al menos dos cadenas pesadas de longitud completa y dos cadenas ligeras de longitud completa, pero en algunos casos puede incluir menos cadenas, tal como anticuerpos que se producen de manera natural en camélidos que pueden comprender solo cadenas pesadas. Los anticuerpos pueden derivarse únicamente de una única fuente, o pueden ser “quiméricos”, es decir, diferentes porciones del anticuerpo pueden derivarse de dos anticuerpos diferentes tal como se describe más adelante. Las proteínas de unión a antígeno, anticuerpos o fragmentos de unión pueden producirse en hibridomas, mediante técnicas de ADN recombinantes, o mediante la escisión enzimática o química de anticuerpos intactos.
El término “fragmento funcional” (o simplemente “fragmento”) de una cadena de anticuerpo o inmunoglobulina (cadena pesada o ligera), tal como se usa en el presente documento, es una proteína de unión a antígeno que comprende una porción (independientemente de cómo se obtuvo o sintetizó esa porción) de un anticuerpo que carece de al menos algunos de los aminoácidos presentes en una cadena de longitud completa, pero que es capaz de unirse específicamente a un antígeno. Tales fragmentos son biológicamente activos, porque se unen específicamente al antígeno diana y pueden competir con otras proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos, por la unión específica a un epítopo dado. En un caso, un fragmento de este tipo conservará al menos una CDR presente en la cadena ligera o pesada de longitud completa, y en algunos casos comprenderá una única cadena pesada y/o cadena ligera o una porción de la misma. Estos fragmentos biológicamente activos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinantes, o pueden producirse mediante la escisión enzimática o química de proteínas de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos intactos. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, fragmentos inmunológicamente funcionales tales como Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, anticuerpos de dominio y anticuerpos monocatenarios, y pueden derivarse de cualquier fuente de mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, humano, ratón, rata, camélido o conejo. Se contempla adicionalmente que una porción funcional de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento, por ejemplo, una o más CDR, pueda unirse covalentemente a una segunda proteína o a una molécula pequeña para crear un agente terapéutico dirigido hacia una diana particular en el cuerpo, presentando propiedades terapéuticas bifuncionales, o teniendo una semivida en suero prolongada.
El término “competir”, cuando se usa en el contexto de proteínas de unión a antígeno (por ejemplo, proteínas de unión a antígeno neutralizantes o anticuerpos neutralizantes) significa la competición entre proteínas de unión a antígeno tal como se determina mediante un ensayo en el que la proteína de unión a antígeno (por ejemplo, anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional del mismo) a prueba impide o inhibe la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia (por ejemplo, un ligando o un anticuerpo de referencia) a un antígeno común (por ejemplo, una proteína CD30L o un fragmento de la misma). Pueden usarse numerosos tipos de ensayos de unión competitivos, por ejemplo: radioinmunoensayo (RIA) directo o indirecto en fase sólida, inmunoensayo enzimático (EIA) directo o indirecto en fase sólida, ensayo de competición de tipo sándwich (véase, por ejemplo, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 92:242-253); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Kirkland et al., 1986, J. Immunol.
137:3614-3619); ensayo etiquetado directo en fase sólida, ensayo de tipo sándwich etiquetado directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA con etiqueta directo en fase sólida usando la etiqueta 1-125 (véase, por ejemplo, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase, por ejemplo, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); y RIA etiquetado directo (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Normalmente, un ensayo de este tipo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquier de estos, una proteína de unión a antígeno de prueba no etiquetada y una proteína de unión a antígeno de referencia etiquetada. Pueden tomarse diferentes enfoques como conoce el experto en la técnica. Una opción alternativa incluye tener la proteína de unión a antígeno de referencia unida a la placa, opcionalmente por medio de una matriz flexible. Una variación adicional puede basarse en el orden de adición, es decir, si el antígeno se mezcla en primer lugar con proteína de unión a antígeno de referencia unida a placa o proteína de unión a antígeno de prueba. En todos los escenarios es necesaria la saturación de antígeno por la proteína de unión a antígeno para evitar un resultado no competitivo falso.
La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de etiqueta unida a la superficie sólida o células en presencia de la proteína de unión a antígeno de prueba. Habitualmente, la proteína de unión a antígeno de prueba está presente en exceso. Las proteínas de unión a antígeno identificadas mediante el ensayo de competición (proteínas de unión a antígeno competidoras) incluyen proteínas de unión a antígeno que se unen al mismo epítopo que las proteínas de unión a antígeno de referencia y proteínas de unión a antígeno que se unen a un epítopo adyacente suficientemente próximo al epítopo unido mediante la proteína de unión a antígeno de referencia para que se produzca impedimento estérico. Habitualmente, cuando una proteína de unión a antígeno competidora está presente en exceso, inhibirá la unión específica de una proteína de unión a antígeno de referencia a un antígeno común en al menos el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70% o el 75%. En algún ejemplo, la unión se inhibe en al menos el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más.
Los experimentos de competición pueden hacerse con diferentes tipos de moléculas que pueden tener diferente sensibilidad. Si la proteína de unión a antígeno es un anticuerpo, la molécula será bivalente. Si la molécula de unión a antígeno es un Fab, es monovalente y sustancialmente más pequeña que un anticuerpo de longitud completa dando como resultado menos impedimento estérico. En experimentos de competiciones esto puede Para cierta proteína de unión a antígeno, la unión a hCD30L se inhibe mediante la unión de un Fab de una proteína de unión a antígeno de anticuerpo tal como se define en el presente documento, tal como uno cualquiera de los anticuerpos A, B, C, D, E y F.
El término “epítopo” o “determinante antigénico” se refiere a un sitio en un antígeno al que se une una proteína de unión a antígeno. Los epítopos pueden formarse a partir de tanto aminoácidos contiguos como aminoácidos no contiguos yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se conservan normalmente tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegamiento terciario se pierden normalmente tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Los determinantes de epítopos pueden incluir agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o sulfonilo, y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, y/o características de carga específicas. Un epítopo incluye normalmente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35 aminoácidos en una conformación espacial única. Los epítopos pueden determinarse usando métodos conocidos en la técnica.
La unión de una proteína de unión a antígeno también puede describirse mediante la región o regiones del antígeno con las que interacciona la proteína de unión a antígeno. Tal(es) región/regiones de interacción pueden determinarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica, tal como realizando ensayos de unión usando moléculas de antígeno variantes o mediante HX-MS tal como se muestra a modo de ejemplo en el presente documento (véase el ejemplo 6), con lo que se determina la(s) región/regiones de interacción del antígeno con las proteínas de unión a antígeno.
La tecnología HX-MS aprovecha que el intercambio de hidrógeno (HX) de una proteína puede seguirse fácilmente mediante espectrometría de masas (MS). Reemplazando el disolvente acuoso que contiene hidrógeno por disolvente acuoso que contiene deuterio, la incorporación de un átomo de deuterio en un sitio dado en una proteína dará lugar a un aumento en la masa de 1 Da. Este aumento de masa puede monitorizarse en función del tiempo mediante espectrometría de masas en muestras extinguidas de la reacción de intercambio. La información de etiquetado de deuterio puede sublocalizarse en regiones en la proteína mediante digestión con pepsina en condiciones de extinción y seguirse el aumento de masa de los péptidos resultantes. HX-MS puede usarse rastrear sitios implicados en interacciones moleculares identificando regiones de intercambio de hidrógeno reducido tras la formación del complejo proteína-proteína, incluyendo interacciones anticuerpo-antígeno. Habitualmente, las interfaces de unión se revelarán mediante reducciones marcadas en el intercambio de hidrógeno debido a la exclusión estérica de disolvente. La formación del complejo proteína-proteína puede detectarse mediante HX-MS simplemente midiendo la cantidad total de deuterio incorporado en cualquier miembro de la proteína en presencia y ausencia de la respectiva pareja de unión en función del tiempo. La técnica HX-MS usa los componentes nativos, es decir proteína y anticuerpo o fragmento Fab, y se realiza en disolución. Por tanto, HX-MS proporciona la posibilidad de imitar las condiciones in vivo (para un revisión sobre la tecnología HX-MS, véase por ejemplo, Wales y Engen, Mass Spectrom. Rev. 25, 158 (2006)).
Ciertas proteínas de unión a antígeno tal como se describen en el presente documento interaccionan con o se unen a CD30L por medio de una región C-terminal de CD30L humano definida mediante AA201-234. Puede ser que la proteína de unión a antígeno se una a una región C-terminal de CD30L humano definida mediante AA 201 -234, o una región más pequeña tal como AA 205-230 o AA 211-226. Tal como se describió anteriormente, un epítopo puede ser no contiguo al igual que la región de interacción. En un caso, una proteína de unión a antígeno según la invención se une a al menos dos regiones de CD30L. Tales proteínas de unión a antígeno adicionales según la invención pueden interaccionar con una región C-terminal tal como se definió anteriormente y una región adicional de CD30L humano ubicada en la parte N-terminal del dominio extracelular, tal como una región definida mediante AA70-100 de hCD30L de longitud completa. Tales proteínas de unión a antígeno pueden unirse a AA 75-95 o una región más corta, tal como AA 80-90 o AA 82-88 además de la región C-terminal definida mediante AA 201-234, AA 205-230 o AA 211-226.
Proteínas de unión a antígeno de CD30L
Una “proteína de unión a antígeno” tal como se usa en el presente documento significa una proteína que se une específicamente a un antígeno diana especificado; el antígeno tal como se describe en el presente documento es CD30L, particularmente CD30L humano. Las proteínas de unión a antígeno incluyen, por ejemplo, aquellas que bloquean o inhiben la interacción de CD30L y CD30. Tales proteínas de unión a antígeno “bloqueantes” pueden desarrollarse hacia CD30L, o un fragmento, variante o derivado del mismo, y examinarse en ensayos convencionales para la capacidad de interferir con la interacción de CD30L y CD30. Ejemplos de ensayos adecuados son ensayos que someten a prueba la capacidad de las proteínas de unión a antígeno de inhibir la interacción de CD30L y CD30 se describen en el presente documento. Las proteínas de unión a antígeno también incluyen aquellas que inhiben CD30L o activan CD30L. Tal inhibición o neutralización altera una respuesta biológica en presencia de la proteína de unión a antígeno en comparación con la respuesta en ausencia de la proteína de unión a antígeno y puede determinarse usando ensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento, por ejemplo, inducen la producción de IL-8 a partir de células CD30+. Las proteínas de unión a antígeno tal como se dan a conocer en el presente documento tampoco se unen a otros miembros de la superfamilia TNF, particularmente 4-1BBL, OX-40L, TNFa, TNFp, RANKL, Trail, CD40L o CD27L.
Diferentes proteínas de unión a antígeno de CD30L pueden unirse a diferentes dominios o epítopos de CD30L o actúan mediante diferentes mecanismos de acción. No es necesario que una proteína de unión a antígeno de CD30L inhiba completamente una actividad inducida por CD30L para encontrar uso tal como se describe en el presente documento; más bien, también se contemplan para su uso las proteínas de unión a antígeno que reduce una actividad particular de CD30L. Las proteínas de unión a antígeno también incluyen aquellas que compiten de manera cruzada por unirse con CD30L humano; unirse al mismo epítopo de CD30L humano; unirse a CD30L humano con sustancialmente la misma Kd; unirse a CD30L con sustancialmente la misma tasa de disociación; como cualquiera de las proteínas de unión a antígeno de referencia descritas en el presente documento. Diversos métodos para medir tales características se conocen en la técnica y se describen en el presente documento.
También se describen proteínas de unión a antígeno de CD30L que agotan las células CD30L+. Con tales proteínas de unión a antígeno de CD30L de agotamiento, la unión de la proteína de unión a antígeno a una célula que comprende su diana antigénica da como resultado una inhibición de la función de antígeno o celular o da como resultado la muerte de la célula. En un caso, un anticuerpo de agotamiento de la invención se une a CD30L y puede bloquear o no la unión de un ligando CD30L a CD30. Por tanto, las proteínas de unión a antígeno de agotamiento incluyen específicamente proteínas de unión a antígeno bloqueantes y no bloqueantes. En un caso, proteínas de unión a antígeno de CD30L que agotan células CD30L+ pueden inducir apoptosis o muerte celular programada, tal como se determina mediante ensayos de apoptosis conocidos en la técnica. Tales proteínas de unión a antígeno de CD30L podrían tener un efecto modulador inmunitario 1) eliminando las células que interaccionan con células CD30L+ para inducir una respuesta inmunitaria y/o 2) eliminar las células en las que CD30L es un marcador de la superficie celular de un tipo de célula que participa en una cierta respuesta inmunitaria, pero que no es necesario que interaccione necesariamente con una célula CD30+ para hacerlo. En este caso, CD30L sería un marcador de un tipo de célula asociado con una enfermedad particular y la interacción CD30/CD30L puede no estar implicada en la patogenia de la propia enfermedad. Otro caso incluye proteínas de unión a antígeno de agotamiento que comprenden una toxina o agente citotóxico conjugado, induciendo la toxina o el agente citotóxico el agotamiento de una célula que se une al conjugado de proteína de unión a antígeno.
Una proteína de unión a antígeno puede comprender una porción que se une a un antígeno y, opcionalmente, una porción de armazón o entramado que permite que la porción de unión a antígeno adopte una conformación que promueve la unión de la proteína de unión a antígeno al antígeno. Los ejemplos de proteínas de unión a antígeno incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, una porción de unión a antígeno de un anticuerpo), derivados de anticuerpo y análogos de anticuerpo. La proteína de unión a antígeno puede comprender un armazón proteico alternativo o armazón artificial con CDR injertadas o derivados de CDR. Tales armazones incluyen, pero no se limitan a, armazones derivados de anticuerpo que comprenden mutaciones introducidas para, por ejemplo, estabiliza la estructura tridimensional de la proteína de unión a antígeno así como armazones totalmente sintéticos que comprenden, por ejemplo, un polímero biocompatible. Véase, por ejemplo, Korndorfer et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, (2003) volumen 53, número 1:121-129; Roque et al., Biotechnol. Prog., 2004, 20:639-654. Además, pueden usarse miméticos de anticuerpo peptídicos (“PAM”), así como armazones basados en miméticos de anticuerpo que utilizan componentes de fibronección como armazón.
Ciertas proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento son anticuerpos o se derivan de anticuerpos. Tales proteínas de unión a antígeno incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos, miméticos de anticuerpo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpo, conjugados de anticuerpo, anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos, respectivamente. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno es un fragmento inmunológico de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab’, un F(ab’)2 o un scFv). Las diversas estructuras se describen y definen adicionalmente en el presente documento.
Ciertas proteínas de unión a antígeno que se describen pueden comprender una o más CDR tal como se describen en el presente documento (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6 o más CDR). En algunos casos, la proteína de unión a antígeno comprende (a) una estructura polipeptídica y (b) una o más CDR que están insertadas en y/o unidas a la estructura polipeptídica. La estructura polipeptídica puede adoptar una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, puede ser, o comprender, el entramado de un anticuerpo que se produce de manera natural, o fragmento o variante del mismo, o puede ser de naturaleza completamente sintética. Ejemplos de diversas estructuras polipeptídicas se describen adicionalmente más adelante.
Ciertas de las proteínas de unión a antígeno tal como se describen en el presente documento se unen específicamente a CD30L humano. “Se unen específicamente” tal como se usa en el presente documento significa que la constante de disociación de equilibrio (Kd) es de <10-8 a <10-10 M, alternativamente de <10-9 a <10-10 M, más particularmente de <10-11M a <10-12M. En un caso, las proteínas de unión a antígeno se unen con una alta afinidad expresada al ser la constante de disociación de equilibrio (Kd) 10-8, o tal como 5,0 x10-9 o tal como 10-9 o incluso 5,0x10-10. La constante de disociación de equilibrio puede determinarse tal como se conoce en la técnica. En tales casos, la Kd se determina normalmente inmovilizando una especie a baja densidad (esta especie puede ser multivalente) e inyectando una serie de titulación de una especie monovalente (fase de asociación), y permitiendo entonces una fase de disociación en la que los complejos se descomponen. Las constantes de tasa correspondientes a la asociación y la disociación de un complejo monovalente se denominan constante de tasa de asociación ka y constante de tasa de disociación kd , respectivamente. Los datos resultantes se ajustan entonces a un modelo de unión 1:1 que ajusta 3 parámetros: constante de tasa de asociación ka, constante de tasa de disociación kd , y Rmáx, que se refiere a la estequiometría y densidad superficial. La relación de kd/ka es igual a la constante de disociación de equilibrio Kd.
Kd también puede determinarse usando análisis FACS tal como se describe en el ejemplo 4 en el presente documento, en el que anticuerpos se unen a CD30L expresado en una célula Ramos.
Un caso se refiere a una proteína de unión a antígeno aislada tal como se describe en el presente documento, en el que dicha proteína de unión a antígeno tiene una afinidad (o Kd) por CD30L humano de al menos 75 pM, tal como 50 pM, tal como 40 pM. En casos adicionales, la constante de disociación (Kd) de la proteína de unión a antígeno para CD30L humano es de como máximo 35 pM, tal como como máximo 25 pM, tal como 20 pM, tal como como máximo 15 pM. La afinidad (o Kd) puede determinarse en tal realización mediante FACS tal como se describe en el ejemplo 4 en el presente documento.
También se describe una proteína de unión a antígeno que tiene una semivida de al menos un día in vitro o in vivo (por ejemplo, cuando se administra a un sujeto humano). En un caso, la proteína de unión a antígeno tiene una semivida de al menos tres días. En otro caso, el anticuerpo o porción del mismo tiene una semivida de cuatro días o más. En otro caso, el anticuerpo o porción del mismo tiene una semivida de ocho días o más. En otro caso, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se derivatiza o modifica de modo que tenga una semivida mayor que en comparación con el anticuerpo no derivatizado o no modificado. En otro caso, la proteína de unión a antígeno contiene mutaciones puntuales para aumentar la semivida en suero, tal como se describe en la publicación WIPO n° WO 00/09560.
En casos en los que la proteína de unión a antígeno se usa para aplicaciones terapéuticas, una proteína de unión a antígeno puede reducir, inhibir, interferir con o modular una o más actividades biológicas de CD30L, tal como la inducción de la producción de IL-8 a partir de células CD30+.
Algunas de las proteínas de unión a antígeno que se describen tiene la estructura asociada normalmente con anticuerpos que se producen de manera natural. Las unidades estructurales de estos anticuerpos comprenden normalmente uno o más tetrámeros, que se componen cada uno de dos dupletes idénticos de cadenas polipeptídicas, aunque algunas especies de mamíferos también producen anticuerpos que tiene solo una única cadena pesada. En un anticuerpo típico, cada par o duplete incluye una cadena “ligera” de longitud completa (en ciertos casos, aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” de longitud completa (en ciertos casos, aproximadamente 50-70 kDa). Cada cadena de inmunoglobulina individual se compone de varios “dominios de inmunoglobulina”, que consisten cada uno en aproximadamente de 90 a 110 aminoácidos y que expresan un patrón de plegamiento característico. Estos dominios son las unidades básicas de las que se componen los polipéptidos de anticuerpo. La porción aminoterminal de cada cadena incluye normalmente una región variable que es responsable del reconocimiento de antígenos. La porción carboxi-terminal está evolutivamente más conservada que el otro extremo de la cadena y se denomina “región constante” o “región C”. Las cadenas ligeras humanas se clasifican generalmente como cadenas ligeras kappa y lambda, y cada una de estas contiene una región variable y un dominio constante. Las cadenas pesadas se clasifican normalmente como cadenas mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y estas definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varios subtipos, incluyendo, pero sin limitarse a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los subtipos IgM incluyen IgM e IgM2. Los subtipos IgA incluyen IgA1 e IgA2. En humanos, los isotipos IgA e IgD contienen cuatro cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras; los isotipos IgG e IgE contienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras; y el isotipo IgM contiene cinco cadenas pesadas y cinco cadenas ligeras. La región constante de cadena pesada (CH) comprende normalmente uno o más dominios que pueden ser responsables de la función efectora. El número de dominios de región constante de cadena pesada dependerá del isotipo. Las cadenas pesadas de IgG, por ejemplo, contienen cada una tres dominios de región CH conocidos como CH1, CH2 y CH3. Las proteínas de unión a antígeno que se describen pueden tener cualquiera de estos isotipos y subtipos, por ejemplo, la proteína de unión a antígeno de CD30L es del subtipo IgG1, IgG2 o IgG4. Si se desea un IgG4, también puede desearse introducir una mutación puntual (CPSCP->CPPCP) en la región bisagra tal como se describe en Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407) para aliviar una tendencia a formar enlaces disulfuro de cadena intra-H que puede conducir a heterogeneidad en los anticuerpos IgG4. Los anticuerpos proporcionados en el presente documento que son de un tipo pueden cambiarse a un tipo diferente usando métodos de conmutación de subclase. Véase, por ejemplo, Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316.
En las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, las regiones variable y constante se unen mediante una región “J” de aproximadamente doce o más aminoácidos, incluyendo la cadena pesada también una región “D” de aproximadamente diez aminoácidos más. Véase, por ejemplo, Fundamental Immunology, 2a ed., cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, Nueva York: Raven Press. Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman normalmente el sitio de unión a antígeno.
Regiones variables
Diversas regiones variables (o dominios) de cadena pesada y cadena ligera descritas en el presente documento se representan en las tablas 1 y 2. Cada una de estas regiones variables puede acoplarse, por ejemplo, a regiones constantes de cadena pesada y ligera descritas anteriores. Además, cada una de las secuencias de cadena pesada y ligera así generadas puede combinarse para formar una estructura de proteína de unión a antígeno completa.
Tabla 1 Secuencias de regiones de cadena ligera variantes a modo de ejemplo
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Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están en cursiva en negrita, las regiones de entramado (FR) están en tipo normal. El orden de los elementos es: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
Tabla 2 Secuencias de regiones de cadena pesada variantes a modo de ejemplo
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Las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están en cursiva en negrita, las regiones de entramado (FR) están en tipo normal. El orden de los elementos es: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
Se describen proteínas de unión a antígeno que contienen al menos una región variable de cadena pesada (VH) seleccionada del grupo que consiste en VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 y VH13 y/o al menos una región variable de cadena ligera (VL) seleccionada del grupo que consiste en VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6 tal como se muestra en las tablas 1 y 2.
Cada una de las regiones variables de cadena pesada listadas en la tabla 2 puede combinarse con cualquiera de las regiones variables de cadena ligera mostradas en la tabla 1 para formar una proteína de unión a antígeno. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera de aquellas listadas en las tablas 1 y 2. En algunos casos, la proteína de unión a antígeno incluye al menos dos regiones variables de cadena pesada y/o regiones variables de cadena ligera diferentes de aquellas listadas en las tablas 1 y 2. Las diversas combinaciones de regiones variables de cadena pesada pueden combinarse con cualquiera de las diversas combinaciones de regiones variables de cadena ligera.
En otros ejemplos, la proteína de unión a antígeno contiene dos regiones variables de cadena ligera idénticas y/o dos regiones variables de cadena pesada idénticas. Como ejemplo, la proteína de unión a antígeno puede ser un anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional que comprende dos regiones variables de cadena ligera y dos regiones variables de cadena pesada en combinaciones de pares de regiones variables de cadena ligera y pares de regiones variables de cadena pesada tal como se listan en las tablas 1 y 2. Los ejemplos de tales proteínas de unión a antígeno que comprenden dos regiones variables de cadena pesada y cadena ligera idénticas incluyen: anticuerpo A VH2/VL1; anticuerpo A1 VH1/VL1; anticuerpo A2 VH3/VL1; anticuerpo A3 VH4/VL1; anticuerpo A4 VH5/VL1; anticuerpo A5 VH6/VL1; anticuerpo A6 VH7/VL1; anticuerpo A7 VH8/VL1; anticuerpo B VH9/VL2; anticuerpo C VH10/VL3; anticuerpo D VH11/VL4; anticuerpo E VH12/VL5 y anticuerpo F VH13/VL6.
Algunas proteínas de unión a antígeno que se describen comprenden una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de una región variable de cadena pesada y/o una región variable de cadena ligera seleccionada de las tablas 1 y 2 en solo 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 31 o más residuos de aminoácido, siendo cada diferencia de secuencia de este tipo independientemente o bien una deleción, inserción o bien o sustitución de un aminoácido. Las regiones variables de cadena ligera y pesada, en algunas proteínas de unión a antígeno, comprenden secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 70%, un 75%, un 80%, un 85% un 86%, un 87%, un 88%, un 89%, un 90%, un 91%, un 92%, un 93%, un 94%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos proporcionadas en las tablas 1 y 2. Todavía otras proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos inmunológicamente funcionales, también incluyen formas de regiones de cadena pesada variantes y/o formas de regiones de cadena ligera variantes tal como se describen en el presente documento.
El término “identidad” se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más polinucleótidos, tal como se determina alineando y comparando las secuencias. “Porcentaje de identidad” significa el porcentaje de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula basándose en el tamaño de la más pequeña de las moléculas que están comparándose. Para estos cálculos, los huecos en los alineamientos (si los hay) tienen que abordarse mediante un modelo matemático o programa informático particular (es decir, un “algoritmo”). Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen aquellos descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, Nueva York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, Nueva York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds.), 1994, Nueva Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, Nueva York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J., eds.), 1991, Nueva York: M. Stockton Press; y Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.
Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que están comparándose se alinean de una manera que da la mayor coincidencia entre las secuencias. El programa informático usado para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, WI). El algoritmo informático GAP se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los que debe determinarse el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para la coincidencia óptima de su respectivo aminoácido o nucleótido (el “rango de coincidencia”, tal como se determina por el algoritmo). Una penalización por apertura de hueco (que se calcula como 3x la diagonal promedio, siendo la “diagonal promedio” el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que está usándose; la “diagonal” es la puntuación o el número asignado a cada coincidencia de aminoácido perfecta por la matriz de comparación particular) y una penalización por extensión de hueco (que es habitualmente 1/10 veces la penalización por apertura de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan junto con el algoritmo. En ciertos casos, el algoritmo también usa una matriz de comparación estándar (véase, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix).
Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótidos usando el programa GAP son los siguientes: algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, citado anteriormente; penalización por hueco: 12 (pero sin penalización para los huecos de extremo), penalización por longitud de hueco: 4, umbral de similitud: 0. Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la coincidencia de solo una región corta de las dos secuencias y esta región alineada pequeña pueden tener una identidad de secuencia muy alta aunque no haya una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineación seleccionado (programa GAP) puede ajustarse si así se desea para dar como resultado una alineación que abarque al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido diana.
Regiones determinantes de complementariedad
Las regiones determinantes de complementariedad o “CDR” están incrustadas dentro de un entramado en las regiones variables de cadena pesada y ligera, en el que constituyen las regiones responsables de la unión a y el reconocimiento de antígeno. Las cadenas de dominios de inmunoglobulina variables de la misma especie, por ejemplo, presentan generalmente una estructura global similar; que comprende regiones de entramado (FR) relativamente conservadas unidas mediante regiones CDR hipervariables. Una proteína de unión a antígeno puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más CDR. Las regiones variables comentadas anteriormente, por ejemplo, comprenden normalmente tres CDR. Las CDR de regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera se alinean normalmente por las regiones de entramado para formar una estructura que se une específicamente sobre un antígeno diana (por ejemplo, CD30L). Desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, las regiones variables de cadena ligera y pesada que se producen de manera natural conforman ambas normalmente el siguiente orden de estos elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las regiones CDR y FR de dominios variables de cadena ligera y dominios variables de cadena pesada a modo de ejemplo se destacan en las tablas 1 y 2. Se reconoce que los límites de las regiones CDR y FR pueden variar de aquellas destacadas. Los sistemas de numeración se han concebido para asignar números a aminoácidos que ocupan posiciones en cada uno de estos dominios. Las regiones determinantes de complementariedad y regiones de entramado de una proteína de unión a antígeno dada pueden identificarse usando estos sistemas. Sistemas de numeración se definen en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, publicación de los NIH n ° 91-3242, 1991, o Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883. Otros sistemas de numeración para los aminoácidos en cadenas de inmunoglobulina incluyen IMGT® (el sistema de información ImMunoGeneTics internacional; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 2005, 29:185-203); y AHo (Honegger y Pluckthun, J. Mol. Biol. 2001, 309(3):657-670). Las CDR descritas en el presente documento puede no solo usarse para definir el dominio de unión a antígeno de una estructura de anticuerpo tradicional, sino que puede incrustarse en una variedad de otras estructuras polipeptídicas, tal como se describe en el presente documento.
Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento son polipéptidos en los que pueden injertarse, insertarse, incrustarse y/o unirse una o más CDR. Una proteína de unión a antígeno puede tener, por ejemplo, una cadena pesada CDR1 (“CDRH1”) y/o una cadena pesada CDR2 (“CDRH2”) y/o una cadena pesada CDR3 (“CDRH3”) y/o una cadena ligera CDR1 (“CDRL1”) y/o una cadena ligera CDR2 (“CDRL2”) y/o una cadena ligera CDR3 (“CDRL3”). Algunas proteínas de unión a antígeno incluyen tanto una CDRH3 como una CDRL3. Los casos específicos utilizan generalmente combinaciones de CDR que son no repetitivas, por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno generalmente no están elaboradas con dos regiones CDRH2 en una región de cadena pesada variable, etc. Las proteínas de unión a antígeno pueden comprender una o más secuencias de aminoácidos que son idénticas a o que difieren de las secuencias de aminoácidos de una o más de las CDR presentadas en la tabla 3 en solo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más residuos de aminoácido, siendo cada diferencia de secuencia de este tipo independientemente o bien una deleción, inserción o bien sustitución de un aminoácido. Las CDR en algunas proteínas de unión a antígeno comprenden secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 80%, un 85%, un 90%, un 91%, un 92, un 93%, un 94%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% de identidad de secuencia con la secuencia de las CDR listada en la tabla 3. En algunas proteínas de unión a antígeno, las CDR están incrustadas en una región “de entramado”, que orienta la(s) CDR de modo que se consigan las propiedades de unión a antígeno apropiadas de la(s) CDR.
TABLA 3 Secuencias de regiones de cadena pesada variantes a modo de ejemplo
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En el presente documento se describen regiones CDR1 que comprenden los residuos de aminoácido 23-36 de las SEQ ID NO: 36, 38, 40, 42 y 44; los residuos de aminoácido 25-36 de SEQ ID NO:46 y los residuos de aminoácido 31-35 de las s Eq ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. Se describen regiones CDR2 que comprenden los residuos de aminoácido 52-58 de las SEQ ID NO: 36, 38, 40, 42, 44 y 46 y los residuos de aminoácido 50-65 de las SEQ ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72. Regiones CDR3 que comprenden los residuos de aminoácido 91 -100 de las SEQ iD n O: 36, 38, 40, 42, 44 y 46 y los residuos de aminoácido 98-113 de las SEQ ID NO: 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70 y 72.
Las CDR dadas a conocer en el presente documento incluyen secuencias consenso derivadas de grupos de secuencias relacionadas. La secuencia consenso CDRL1 consiste en TGX1SSDX2GX3YX4YVS (SEQ ID NO:30), en la que X1 es treonina o serina, X2 es valina o isoleucina, X3 es valina, treonina o leucina, y X4 es ácido aspártico o asparagina.
La secuencia consenso CDRL2 consiste en EVX1X2RPS (SEQ ID NO:31), en la que X1 es serina, asparagina o isoleucina y X2 es asparagina o lisina.
La secuencia consenso CDRL3 incluye SSYX1SX2STWV (SEQ IDN NO:32), en la que X1 es treonina o serina y X2 es arginina o serina.
La secuencia consenso CDRH1 consiste en X1X2X3WX4 (SEQ ID NO:33), en la que X1 es serina o asparagina, X2 es tirosina o asparagina, X3 es isoleucina, tirosina o serina y X4 es treonina o serina. En un caso diferente, la secuencia consenso CDRH1 consiste en SYX3WX5 (SEQ ID NO:75), en la que X3 es I, S o Y y X5 es T o S.
La secuencia consenso CDRH2 consiste en RX1X2X3SGX4X5NYX6PSLX7S (SEQ ID NO:34), en la que X1 es isoleucina, valina o treonina, X2 es tirosina, fenilanalina o serina, X3 es treonina, serina o alanina, X4 es isoleucina, leucina, asparagina, serina, arginina o glutamina, X5 es treonina o asparagina, X6 es asparagina o lisina y X7 es lisina o arginina.
La secuencia consenso CDRH3 consiste en X1X2X3X4X5X6X7X8YX9YX10GX11DV (SEQ ID NO:35), en la que X1 es ácido glutámico o ácido aspártico, X2 es arginina, tirosina o fenilalina, X3 es valina, alanina, arginina o treonina, X4 es valina, treonina, glicina o isoleucina, X5 es valina, alanina o glicina, X6 es alanina, treonina, glicina o glutamina, X7 es treonina, ácido aspártico, argina o serina, X8 es arginina o tirosina, X9 es tirosina o histidina, X10 es tirosina, ácido aspártico o serina y X11 es metionina, leucina o valina.
Anticuerpos monoclonales
Las proteínas de unión a antígeno que se describen incluyen anticuerpos monoclonales que se unen a CD30L. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, inmortalizando células de bazo recogidas del animal transgénico tras completar el calendario de inmunización. Las células de bazo pueden inmortalizarse usando cualquier técnica conocida en la técnica, por ejemplo, fusionándolas con células de mieloma para producir hibridomas. Las células de mieloma para su uso en procedimientos de fusión que producen hibridomas son preferiblemente no productoras de anticuerpo, tienen una alta eficiencia de fusión y deficiencias enzimáticas que las convierten en incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que respaldan el crecimiento de solo las células fusionadas deseadas (hibridomas). Los ejemplos de líneas celulares adecuadas para su uso en fusiones de ratón incluyen Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XXO Bul; los ejemplos de líneas celulares usadas en fusiones de rata incluyen R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983f y 4B210. Otras líneas celulares útiles para fusiones celulares son U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6.
En algunos casos, una línea celular de hibridoma se produce inmunizando un animal (por ejemplo, un animal transgénico que tiene secuencias de inmunoglobulina humana) con un inmunógeno de CD30L; recogiendo células de bazo del animal inmunizado; fusionando las células de bazo recogidas con una línea celular de mieloma, generando de ese modo células de hibridoma; estableciendo líneas celulares de hibridoma a partir de las células de hibridoma e identificando una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo que se une a un polipéptido de CD30L. Tales líneas celulares de hibridoma, y los anticuerpos anti-CD30L monoclonales producidos por las mismas, son aspectos de la presente solicitud.
Los anticuerpos monoclonales secretados por una línea celular de hibridoma pueden purificarse usando cualquier técnica conocida en la técnica. Los hibridomas o Acm pueden examinarse adicionalmente para identificar Acm con particular propiedades, tales como la capacidad de reducir, inhibir, interferir con o modular la interacción de CD30L con CD30.
Anticuerpos quiméricos y humanizados
También se proporcionan anticuerpos quiméricos y humanizados basados en las secuencias anteriores. Los anticuerpos monoclonales para su uso como agentes terapéuticos pueden modificarse de diversas maneras antes de su uso. Un ejemplo es un anticuerpo quimérico, que es un anticuerpo compuesto de segmentos de proteína de diferentes anticuerpos que se unen covalentemente para producir cadenas ligeras o pesadas de inmunoglobulina funcionales o porciones inmunológicamente funcionales de las mismas. Generalmente, una porción de la cadena pesada y/o cadena ligera es idéntica u homóloga a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son idéntica(s) u homóloga(s) a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos. Para métodos relativos a anticuerpos quiméricos, véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 4.816.567; y Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. El injerto de CDR se describe, por ejemplo, en las patentes estadounidenses n.os 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089 y 5.530.101.
Un tipo útil de anticuerpo quimérico es un anticuerpo “humanizado”. Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal que se hace crecer inicialmente en un animal no humano. Ciertos residuos de aminoácido en este anticuerpo monoclonal, normalmente de porciones que no reconocen antígeno del anticuerpo, se modifican para ser homólogos a residuos correspondientes en un anticuerpo humano de isotipo correspondiente. La humanización puede realizarse, por ejemplo, usando diversos métodos sustituyendo al menos una porción de una región variable de roedor por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, las patentes estadounidenses n ° 5.585.089 y n ° 5.693.762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536).
En ciertos casos, regiones constantes de especies distintas de la humana pueden usarse junto con la(s) región/regiones variable(s) humana(s) para producir anticuerpos híbridos.
Anticuerpos completamente humanos
También se proporcionan anticuerpos completamente humanos. Están disponibles métodos para elaborar anticuerpos completamente humanos específicos para un antígeno dado sin exponer los seres humanos al antígeno (“anticuerpos completamente humanos”). Un medio específico proporcionado para implementar la producción de anticuerpos completamente humanos es la “humanización” del sistema inmunitario humoral de ratón. La introducción de loci de inmunoglobulina humana (Ig) en ratones en los que se han inactivado los genes Ig endógenos es un medio de producción de anticuerpos completamente humanos monoclonales (Acm) en ratón, un animal que puede inmunizarse con cualquier antígeno deseable. El uso de anticuerpos completamente humanos puede minimizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas que pueden provocarse en ocasiones mediante la administración de Acm de ratón o derivatizados de ratón a humanos como agentes terapéuticos.
Los anticuerpos completamente humanos pueden producirse inmunizando animales transgénicos (habitualmente ratones) que son capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Los antígenos para este propósito tienen normalmente seis o más aminoácidos contiguos, y opcionalmente están conjugados con un portador, tal como un hapteno. Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; y Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. En un ejemplo de un método de este tipo se producen animales transgénicos incapacitando los loci de inmunoglobulina de ratón endógena que codifican para las cadenas de inmunoglobulina pesada y ligera de ratón en los mismos, e insertando en el genoma de ratón fragmentos grandes de loci que contienen ADN de genoma humano que codifican para proteínas de cadena pesada y ligera humanas. Los animales parcialmente modificados, que tienen menos que el complemento completo de loci de inmunoglobulina humana, se cruzan entonces para obtener un animal que tiene todas las modificaciones del sistema inmunitario deseadas. Cuando se administra un inmunógeno, estos animales transgénicos producen anticuerpos que son inmunoespecíficos para el inmunógeno, pero que tienen secuencias de aminoácidos humanas en vez de murinas, incluyendo las regiones variables. Para detalles adicionales de tales métodos, véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de la WIPO WO96/33735 y WO94/02602. Métodos adicionales relativos a ratones transgénicos para elaborar anticuerpos humanos se describen en las patente estadounidense n os 5.545.807; 6.713.610; 6.673.986; 6.162.963; 5.545.807; 6.300.129; 6.255.458; 5.877.397; 5.874.299 y 5.545.806; en las publicaciones de patente de la WIPO WO91/10741, WO90/04036, y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1.
Los ratones transgénicos descritos anteriormente contienen un minilocus de gen de inmunoglobulina humana que codifica para secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada ([mu] y [gamma]) y [kappa] ligera humana sin reorganizar, junto con mutaciones seleccionadas como diana que inactivan los loci de cadena [mu] y [kappa] endógenos (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida de IgM de ratón o [kappa] y en respuesta a la inmunización, y los transgenes de cadena pesada y ligera humanos introducidos experimenta conmutación de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales de IgG [kappa] humana de alta afinidad (Lonberg et al., citado anteriormente.; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). La preparación de tales ratones se describe en detalle en Taylor et al., 1992, Nucleic Acid Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacology 113:49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6:579-591; Lonberg y Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding y Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-85. Véanse además las patentes estadounidenses n o 5.545.806; n o 5.569.825; n o 5.625.126; n.° 5.633.425; n o 5.789.650; n.° 5.877.397; n o 5.661.016; n ° 5.814.318; n ° 5.874.299; y n ° 5.770.429; así como la patente estadounidense n ° 5.545.807; las publicaciones de la WIPO Publicación n.os WO 93/1227; WO 92/22646; y WO 92/03918. Las tecnologías utilizadas para producir anticuerpos humanos en estos ratones transgénicos se dan a conocer también en la publicación de la WIPO n ° WO 98/24893, y Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Por ejemplo, las cepas de ratones transgénicos HCo7 y HCo12 pueden usarse para generar anticuerpos anti-CD30L.
Usando la tecnología de hibridoma, pueden producirse Acm humanos específicos de antígeno con la especificada deseada y seleccionarse de los ratones transgénicos tal como los descritos anteriormente. Tales anticuerpos pueden clonarse y expresarse usando un vector y célula huésped adecuado, o los anticuerpos pueden recogerse de células de hibridoma cultivadas.
Los anticuerpos completamente humanos también pueden derivarse de bibliotecas de presentación en fago (tal como se da a conocer en Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; la publicación de la WIPO n° WO 99/10494). Las técnicas de presentación en fago imitan la selección inmunitaria a través de la presentación de repertorios de anticuerpos en la superficie de un bacteriófago filamentoso, y la posterior selección del fago mediante su unión a un antígeno de elección.
Proteínas de unión a antígeno biespecíficas o bifuncionales
Una proteína de unión a antígeno o anticuerpo “biespecífico,” “específico doble” o “bifuncional” es una proteína de unión a antígeno o anticuerpo híbrido, respectivamente, que tiene dos sitios de unión a antígeno diferentes, tales como una o más CDR o una o más regiones variables tal como se describió anteriormente. En algunos casos son un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadena pesada/ligera diferentes y dos sitios de unión diferentes. Una proteína de unión a antígeno multiespecífica o un “anticuerpo multiespecífico” es uno que selecciona como diana más de un antígeno o epítopo. Las proteínas de unión a antígeno y anticuerpos biespecíficos son una especie de anticuerpo de proteína de unión a antígeno multiespecífico y pueden producirse mediante una variedad de métodos incluyendo, pero sin limitarse a, fusión de hibridomas o ligado de fragmentos Fab’. Véase, por ejemplo, Songsivilai y Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.
Fragmentos inmunológicos
Las proteínas de unión a antígeno también incluyen fragmentos inmunológicos de un anticuerpo (por ejemplo, un Fab, un Fab’, un F(ab’)2 o un scFv). Un “fragmento Fab” está compuesto por una cadena ligera (la región variable de cadena ligera (Vl) y su dominio constante (Cl) correspondiente) y una cadena pesada (la región variable de cadena pesada (Vh) y el primer dominio constante (Ch1)). La cadena pesada de una molécula Fab no puede formar un enlace disulfuro con otra molécula de cadena pesada. Un “fragmento Fab’” contiene una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que también contiene la región entre los dominios Ch1 y Ch2, de modo que puede formarse un enlace disulfuro intercatenario entre las dos cadenas pesadas de dos fragmentos Fab’ para formar una molécula F(ab’)2. Por tanto, un “fragmento F(ab’)2” se compone de dos fragmentos Fab’ que se mantienen juntos mediante un enlace disulfuro entre las dos cadenas pesadas. Un “fragmento Fv” consiste en la región de cadena ligera variable y la región de cadena pesada variable de una única rama de un anticuerpo. Los anticuerpos monocatenarios “scFv” son moléculas Fv en las que las regiones variables de cadena pesada y ligera se han conectado mediante un ligador flexible para formar una única cadena polipeptídica, que forma una región de unión a antígeno. Los anticuerpos monocatenarios se comentan en detalle en la publicación de la WIPO mo WO 88/01649, las patentes estadounidenses n° 4.946.778 y n ° 5.260.203; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et a l, 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387; Kortt et a l, 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108 y Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40. Una región “Fc” contiene dos fragmentos de cadena pesada que comprenden los dominios Ch2 y Ch3 de un anticuerpo. Los dos fragmentos de cadena pesada se mantienen juntos mediante dos o más enlaces disulfuro y mediante interacciones hidrófobas de los dominios Ch3.
También se incluyen anticuerpos de dominio, fragmentos de inmunoglobulina inmunológicamente funcionales que contienen solo la región variable de una cadena pesada o la región variable de una cadena ligera. En algunos casos, dos o más regiones Vh se unen covalentemente con un ligador peptídico para crear un anticuerpo de dominio bivalente. Las dos regiones Vh de un anticuerpo de dominio bivalente pueden seleccionarse como diana los mismos antígenos o antígenos diferentes. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes que comprenden dos cadenas polipeptídicas, comprendiendo cada cadena polipeptídica dominios Vh y Vl unidos mediante un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre dos dominios en la misma cadena, permitiendo por tanto que cada dominio se empareje con un dominio complementario en otras cadena polipeptídica (véase, por ejemplo, Holliger e ta l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993 y Poljak et al., Structure 2:1121-23, 1994). De manera similar, los tricuerpos y tetracuerpos son anticuerpos que comprenden tres y cuatro cadenas polipeptídicas, respectivamente, y que forman tres y cuatro sitios de unión a antígeno, respectivamente, que pueden ser iguales o diferentes. Los maxicuerpos comprenden scFv bivalentes acoplados covalentemente a la región Fc de IgG1, (véanse, por ejemplo, Fredericks et al, 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106; Powers et al., 2001, Journal of Immunological Methods, 251:123-135; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; Hayden et al., 1994, Therapeutic Immunology 1:3-15).
Otras formas diversas
También se describen formas variantes de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer anteriormente, teniendo algunas de las proteínas de unión a antígeno, por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácido conservativas en una o más de las cadenas pesadas o ligeras, regiones variables o CDR listadas en las tablas 1 y 2.
Los aminoácidos que se producen de manera natural pueden dividirse en clases basándose en propiedades de cadena lateral comunes: hidrófobos (norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile); hidrófilos neutros (Cys, Ser, Thr, Asn, Gln); ácidos (Asp, Glu); básicos (His, Lys, Arg); residuos que influyen en la orientación de la cadena (Gly, Pro); y aromáticos (Trp, Tyr, Phe).
Las sustituciones de aminoácido conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. Las sustituciones de aminoácido conservativas pueden abarcar residuos de aminoácido que no se producen de manera natural, que se incorporan normalmente mediante la síntesis de péptidos química en vez de mediante síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas inversas o invertidas de restos de aminoácido. Tales modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o bioquímicas de las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden conseguirse creando sustituciones en la secuencia de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura del esqueleto molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación laminar o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la voluminosidad de la cadena lateral.
Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de las clases anteriores por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo que son homólogas con anticuerpos humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.
Al hacer tales cambios, puede considerarse el índice hidropático de los aminoácidos. El perfil hidropático de una proteína se calcula asignando a cada aminoácido un valor numérico (“índice hidropático”) y entonces promediando de manera repetitiva estos valores a lo largo de la cadena peptídica. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de carga e hidrofobicidad. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
La importancia del perfil hidropático al conferir una función biológica interactiva a una proteína se entiende en la técnica (véase, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen una puntuación o índice hidropático similar y todavía conservan una actividad biológica similar. Al hacer cambios basándose en el índice hidropático, en ciertos casos, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ±2. En algunos casos se incluyen aquellas que están dentro de ±1, y en otros casos se incluyen aquellos dentro de ±0,5.
También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede hacerse de manera efectiva basándose en la hidrofilicidad, particularmente cuando se pretende que la proteína o péptido biológicamente funcional creado de este modo sea para su uso en realizaciones inmunológicas, tal como en el presente caso. En ciertos casos, la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, regida por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y la unión a antígeno o inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.
Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoácido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5±1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptófano (-3,4). Al hacer cambios basándose en valores de hidrofilicidad similares, en ciertos casos, se incluye la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de ±2 , en otros casos se incluyen aquellas que están dentro de ± 1, y en todavía otros casos se incluyen aquellas que están dentro de ±0,5. En algunos casos, también pueden identificarse epítopos de secuencias de aminoácidos primarias basándose en la hidrofilicidad. Estas regiones también se denominan “regiones de núcleo epitópicas.”
Sustituciones de aminoácido conservativas a modo de ejemplo se exponen en la tabla 4.
TABLA 4
Sustituciones de aminoácido conservativas
Residuo Sust. Residuo Sust. Residuo
Figure imgf000019_0001
Sust. Resi Sust. Ala Ser Gln Asn Leu Ile, V Thr Ser Arg Lys Glu Asp Lys Arg, Trp Tyr Asn Gln, Gly Pro Met Leu, Tyr Trp, Phe Asp
Figure imgf000019_0003
Glu
Figure imgf000019_0007
His
Figure imgf000019_0004
Asn,
Figure imgf000019_0002
Phe
Figure imgf000019_0008
Met, Val Ile, Leu
Cys Ser Ile Leu, Ser Thr
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Thr
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Ser Residuo = Residuo original Sust. = Sustitución a modo de ejemplo
Un experto en la técnica será capaz de determinar variantes adecuadas de polipéptidos tal como se exponen en el presente documento usando técnicas ampliamente conocidas. Un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad por regiones de selección como diana que no se cree que sean importantes para la actividad. El experto en la técnica también será capaz de identificar residuos y porciones de las moléculas que se conservan entre polipéptidos similares. En casos adicionales, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácido conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de manera adversa a la estructura polipeptídica.
Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de una comparación de este tipo, puede predecirse la importancia de los residuos de aminoácido en una proteína que corresponden a residuos de aminoácido importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para tales residuos de aminoácido importantes predichos.
Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. En vista de tal información, un experto en la técnica puede predecir la alineación de residuos de aminoácido de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la técnica puede elegir no hacer cambios radicales en los residuos de aminoácido que se predice que están en la superficie de la proteína, dado que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una única sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Estas variantes pueden examinarse entonces usando ensayos para la actividad de CD30L, (véase la sección de ejemplos más adelante), proporcionando así información relativa a qué aminoácidos pueden cambiarse y cuáles no tienen que cambiarse. En otras palabras, basándose en información recopilada de tales experimentos rutinarios, un experto en la técnica puede determinar fácilmente las posiciones de aminoácido en las que deben evitarse sustituciones adicionales, ya sean solas o en combinación con otras mutaciones.
Varias publicaciones científicas se han dedicado a la predicción de la estructura secundaria. Véanse, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113:211-222 ; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol.47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; y Chou et al., 1979, Biophys. J. 26:367-384. Además, actualmente están disponibles programas informáticos para ayudar en la predicción de la estructura secundaria. Un método de predicción de la estructura secundaria se basa en el modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia de más del 30%, o una similitud de más del 40%, tienen a menudo topologías similares. El crecimiento reciente de la base de datos estructura de proteínas (PDB) ha proporcionado una predictibilidad mejorada de la estructura secundaria, incluyen el número potencial de pliegues dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Se ha sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dada y que una vez que se ha resuelto un número crítico de estructuras, la predicción estructural se volverá drásticamente más precisa.
Los métodos adicionales de predicción de la estructura secundaria incluyen “roscado” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4:15-19), “análisis de perfiles” (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), y “ligado evolutivo” (véanse, Holm, 1999, citado anteriormente; y Brenner, 1997, citado anteriormente).
En algunos casos se hacen sustituciones de aminoácido que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) alteran las afinidades de unión a ligando o antígeno, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en tales polipéptidos, tal como mantener la estructura del esqueleto molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, tal como una conformación laminar o helicoidal; mantener o alterar la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o mantener o alterar la voluminosidad de una cadena lateral.
Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones de aminoácido individuales o múltiples (en determinadas realizaciones, sustituciones de aminoácido conservativas) en la secuencia que se produce de manera natural. Las sustituciones pueden hacerse en esta porción del anticuerpo que se encuentra fuera del/de los dominio(s) formando contactos intermoleculares). En tales casos, pueden usarse sustituciones de aminoácido conservativas que no cambian sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, uno o más aminoácidos de reemplazo que no alteran la estructura secundaria que caracteriza la proteína de unión a antígeno parental o nativa). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias polipeptídicas reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. Nueva York: Freeman y Company; Introduction to Protein Structure (Branden y Tooze, eds.), 1991, Nueva York: Garland Publishing; y Thornton et al., 1991, Nature 354:105.
Las variantes adicionales incluyen variantes de cisteína, en las que uno o más residuos cisteína en la secuencia de aminoácidos parental o nativa se delecionan de o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina). Las variantes de cisteína son útiles, entre otros, cuando los anticuerpos (por ejemplo) tienen que replegarse en una conformación biológicamente activa. Las variantes de cisteína pueden tener menos residuos cisteína que la proteína nativa, y normalmente tienen un número par para minimizar interacciones que resultan de cisteínas desparejadas.
La región variable de cadena pesada y ligera y las CDR que se dan a conocer pueden usarse para preparar proteínas de unión a antígeno que contienen una región de unión a antígeno que puede unirse específicamente a un polipéptido de CD30L. “Región de unión a antígeno” significa una proteína, o una porción de una proteína, que se une específicamente a un antígeno especificado, tal como la región que contiene los residuos de aminoácido que interaccionan con un antígeno y confieren a la proteína de unión a antígeno su especificidad y afinidad por el antígeno diana. Una región de unión a antígeno puede incluir una o más CDR y ciertas regiones de unión a antígeno también incluyen una o más regiones “de entramado”. Por ejemplo, una o más de las CDR listadas en la tabla 3 pueden incorporarse a una molécula (por ejemplo, un polipéptido) covalentemente o no covalentemente para hacer una inmunoadhesión. Una inmunoadhesión puede incorporar la(s) CDR como parte de una cadena polipeptídica más grande, puede ligar covalentemente la(s) CDR a otra cadena polipeptídica, o puede incorporar la(s) CDR no covalentemente. La(s) CDR posibilitan la inmunoadhesión para unirse ¡específicamente a un antígeno particular de interés (por ejemplo, un polipéptido de CD30L).
Otras proteínas de unión a antígeno incluyen miméticos (por ejemplo, “miméticos peptídicos” o “peptidomiméticos”) basándose en las regiones variables y CDR que se describen en el presente documento. Estos análogos pueden ser péptidos, no péptidos o combinaciones de regiones peptídicas y no peptídicas. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber y Freidinger, 1985, TINS pág. 392; y Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Pueden usarse miméticos peptídicos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Tales compuestos se desarrollan a menudo con la ayuda de modelado molecular computarizado. Generalmente, los peptidomiméticos son proteínas que son estructuralmente similares a una proteína de unión a antígeno que presenta una actividad biológica deseada, tal como la capacidad de inhibir o bloquear la interacción de CD30 y CD30L, pero los peptidomiméticos tienen uno o más ligamientos peptídicos reemplazados opcionalmente por un ligamiento seleccionado de, por ejemplo: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH- (cis y trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-, mediante métodos ampliamente conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consenso por un aminoácido D del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) puede usarse en determinadas realizaciones para generar proteínas más estables. Además, pueden generarse péptidos restringidos que comprenden una secuencia consenso o una variación de secuencia consenso sustancialmente idéntica mediante métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem.
61:387), por ejemplo, añadiendo residuos cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido.
También se describen derivados de las proteínas de unión a antígeno que se describen en el presente documento. Las proteínas de unión a antígeno derivatizadas pueden comprender cualquier molécula o sustancia que confiera una propiedad deseada a la proteína de unión a antígeno o fragmento, tal como una semivida aumentada en un uso particular. La proteína de unión a antígeno derivatizada puede comprender, por ejemplo, un resto detectable (o de etiquetado) (por ejemplo, una molécula radiactiva, colorimétrica, antigénica o enzimática, una perla detectable (tal como una perla magnética o electrodensa (por ejemplo, oro)), o una molécula que se une a otra molécula (por ejemplo, biotina o estreptavidina)), un resto terapéutico o de diagnóstico (por ejemplo, un resto radiactivo, citotóxico o farmacéuticamente activo), o una molécula que aumenta la idoneidad de la proteína de unión a antígeno para un uso particular (por ejemplo, administración a un sujeto, tal como un sujeto humano, u otros usos in vivo o in vitro). Los ejemplos de moléculas que pueden usarse para derivatizar una proteína de unión a antígeno incluyen albúmina (por ejemplo, albúmina sérica humana) y polietilenglicol (PEG). Los derivados de proteínas de unión a antígeno ligados a albúmina y PEGilados pueden prepararse usando técnicas ampliamente conocidas en la técnica. En un caso, la proteína de unión a antígeno está conjugada o ligada de otro modo a transtiretina (TTR) o una variante de TTR. La TTR o variante de TTR puede estar modificada químicamente con, por ejemplo, un compuesto químico seleccionado del grupo que consiste en dextrano, poli(n-vinilpirrolidona), polietilenglicoles, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados y poli(alcoholes vinílicos).
Otros derivados incluyen conjugados covalentes o agregativos de proteínas de unión a antígeno de CD30L con otras proteínas o polipéptidos, tal como mediante la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados con el extremo N-terminal o extremo C-terminal de una proteína de unión a antígeno de CD30L. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido señal (o líder) heterólogo, por ejemplo, el líder de factor alfa de levadura, o un péptido tal como una etiqueta de epítopo. Las proteínas de fusión que contiene proteína de unión a antígeno de CD30L pueden comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o identificación de la proteína de unión a antígeno de CD30L (por ejemplo, poli-His). Una proteína de unión a antígeno de CD30L también puede ligarse al péptido FLAG tal como se describe en Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6:1204; y la patente estadounidense n° 5.011.912. El péptido FLAG es altamente antigénico y proporciona un epítopo unido de manera reversible mediante un anticuerpo monoclonal (Acm) específico, posibilitando un ensayo rápido y una purificación fácil de la proteína recombinante expresada. Reactivos útiles para preparar proteínas de fusión en las que el péptido FLAG está fusionado a un polipéptido dado están disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO).
Pueden emplearse oligómeros que contienen una o más proteínas de unión a antígeno de CD30L como antagonistas de CD30L. Los oligómeros pueden estar en forma de dímeros, trímeros u oligómeros superior ligados covalentemente o no ligados covalentemente. Se contemplan oligómeros que comprenden dos o más proteínas de unión a antígeno de CD30L para su uso, siendo un ejemplo un homodímero. Otros oligómeros incluyen heterodímeros, homotrímeros, heterotrímeros, homotetrámeros, heterotetrámeros, etc. También se incluyen oligómeros que comprenden múltiples proteínas de unión a CD30L unidas por medio de interacciones covalente o no covalentes entre restos péptido fusionados con las proteínas de unión a antígeno de CD30L. Tales péptidos pueden ser ligadores peptídicos (espaciadores), o péptidos que tienen la propiedad de promover la oligomerización. Entre los ligados peptídicos adecuados están aquellos descritos en las patentes estadounidenses n ° 4.751.180 y 4.935.233. Cremalleras de leucina y ciertos polipéptidos derivados de anticuerpos están entre los péptidos que pueden promover la oligomerización de proteínas de unión a antígeno de CD30L acopladas a los mismos. Ejemplos de dominios cremallera de leucina adecuados para producir proteínas oligoméricas solubles se describen en la publicación de la WIPO n° WO 94/10308; Hoppe et al., 1994, f Eb S Letters 344:191; y Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. En un enfoque, proteínas de fusión recombinantes que comprenden un fragmento o derivado de proteína de unión a antígeno de CD30L fusionado con un péptido cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y los fragmentos o derivados de proteína de unión a antígeno de CD30L oligomérica soluble que se forman se recuperan del sobrenadante de cultivo.
Tales oligómeros pueden comprender de dos a cuatro proteínas de unión a antígeno de CD30L. Los restos de proteína de unión a antígeno de CD30L del oligómero pueden estar en cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferiblemente, los oligómeros comprenden proteínas de unión a antígeno de CD30L que tienen actividad de unión a CD30L. Pueden prepararse oligómeros usando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas. La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados con diversos polipéptidos derivados de porciones de anticuerpo (incluyendo el dominio Fc) se han descrito, por ejemplo, por Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et al., 1992 “Construction of Inmunoglobulin Fusion Proteins”, en Current Protocols in Immunology, supl.
4, páginas 10,19,1-10,19,11.
También se incluyen dímeros que comprenden dos proteínas de fusión creadas fusionando una proteína de unión a antígeno de CD30L con la región Fc de un anticuerpo. El dímero puede hacerse, por ejemplo, insertando una fusión génica que codifica para la proteína fusión en un vector de expresión apropiado, que expresa la fusión génica en células huésped transformadas con el vector de expresión recombinante, y permitiendo que la proteína de fusión expresada se ensamble casi como moléculas de anticuerpo, tras lo cual se forman enlaces disulfuro intercatenarios entre los restos Fc para proporcionar el dímero. Tales polipéptidos Fc incluyen formas nativas y de muteína de polipéptidos derivados de la región Fc de un anticuerpo. También se incluyen formas truncadas de tales polipéptidos que contienen la región bisagra que promueve dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden restos Fc (y oligómeros formados a partir de los mismos) ofrecen la ventaja de una purificación fácil mediante cromatografía de afinidad a través de columnas de proteína A o proteína G. Un polipéptido Fc adecuado, descrito en la publicación de la WIPO n ° WO 93/10151 y las patentes estadounidenses n.os 5.426.048 y 5.262.522, es un polipéptido monocatenario que se extiende desde la región bisagra N-terminal hasta el extremo C-terminal nativo de la región Fc de un anticuerpo IgG1 humano. Otro polipéptido Fc útil es la muteína Fc descrita en la patente estadounidense n° 5.457.035, y en Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta muteína es idéntica a la de la secuencia Fc nativa presentada en la publicación de la WIPO n.° WO 93/10151, excepto porque el aminoácido 19 se ha cambiado de Leu a Ala, el aminoácido 20 se ha cambiado de Leu a Glu y el aminoácido 22 se ha cambiado de Gly a Ala. La muteína presenta afinidad reducida por los receptores Fc.
Glicosilación
La proteína de unión a antígeno puede tener un patrón de glicosilación que es diferente o está alterado con respecto al encontrado en la especie nativa. Tal como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácido de glicosilación particulares, comentados más adelante), como del organismo o célula huésped en la que se produce la proteína. Sistemas de expresión particulares se comentan más adelante.
La glicosilación de polipéptidos es normalmente o bien ligada a N o bien ligada a O. Ligada a N se refiere al acoplamiento del resto carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para el acoplamiento enzimático del resto carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere al acoplamiento de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación a la proteína de unión a antígeno se lleva a cabo convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligada a N). La alteración también puede hacerse mediante la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glicosilación ligada a O). Por facilidad, la secuencia proteica de unión a antígeno de aminoácidos puede alterarse a través de cambios a nivel de ADN, particularmente mutando el ADN que codifica para el polipéptido diana en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio para aumentar el número de restos carbohidrato en la proteína de unión a antígeno es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación ligada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el/los azúcar(es) pueden acoplarse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Los métodos se describen en la publicación PCT n ° WO 87/05330, y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., págs. 259-306.
La eliminación de restos carbohidrato presentes en la proteína de unión a antígeno de partida puede llevarse a cabo química o enzimáticamente. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría de o todos los azúcares excepto el azúcar de ligamiento (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), al tiempo que se deja el polipéptido intacto. La desglicosilación química se describe por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de restos carbohidrato en polipéptidos puede conseguirse mediante el uso de una variedad de endo- y exoglicosidasas tal como se describe por Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. La glicosilación en sitios de glicosilación potenciales puede impedirse mediante el uso del compuesto tunicamicina tal como se describe por Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloque la formación de ligamientos proteína-N-glicósido.
Por tanto, se contemplan variantes de glicosilación de las proteínas de unión a antígeno en las que el número y/o tipo de sitio(s) de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos del polipéptido parental. En ciertos casos, las variantes de proteína de unión a antígeno comprenden un número mayor o uno menor de sitios de glicosilación ligada a N que el polipéptido parental. Las sustituciones que eliminan o alteran esta secuencia impedirán la adición de una cadena de carbohidrato ligada a N presente en el polipéptido parental. Por ejemplo, la glicosilación puede reducirse mediante la deleción de una Asn o sustituyendo la Asn por un aminoácido diferente. Los anticuerpos tienen normalmente un sitio de glicosilación ligada a N en la región Fc.
Etiquetas y grupos efectores
Las proteínas de unión a antígeno pueden comprender una o más etiquetas. El término “etiqueta” o “grupo de etiquetado” se refiere a cualquier etiqueta detectable. En general, las etiquetas pertenecen a una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el que deban detectarse: a) etiquetas isotópicas, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) etiquetas magnéticas (por ejemplo, partículas magnéticas); c) restos con actividad redox; d) tintes ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, p-gatactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo, etc.). En algunos casos, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína de unión a antígeno por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. En la técnica se conocen diversos métodos para etiquetar proteínas. Los ejemplos de grupos de etiquetado adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, p-gatactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo, o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunos casos, el grupo de etiquetado se acopla a la proteína de unión a antígeno por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. En la técnica se conocen diversos métodos para etiquetar proteínas y pueden usarse según se considere apropiado.
El término “grupo efector” significa cualquier grupo acopado a una proteína de unión a antígeno que actúa como agente citotóxico. Ejemplos de grupos efectores adecuados son radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I). Otros grupos adecuados incluyen toxinas, grupos terapéuticos o grupos quimioterapéuticos. Los ejemplos de grupos adecuados incluyen caliqueamicina, auristatinas, geldanamicina y maitansina. En algunos casos, el grupo efector se acopla a la proteína de unión a antígeno por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial.
Polinucleótidos que codifican para proteínas de unión a antígeno de CD30L
También se describen polinucleótidos que codifican para las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento, o porciones de las mismas, incluyendo polinucleótidos que codifican para una o ambas cadenas de un anticuerpo, o un fragmento, derivado, muteína o variante del mismo, polinucleótidos que codifican para regiones variables de cadena pesada o solo CDR, polinucleótidos suficientes para su uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica para un polipéptido, ácidos nucleicos antisentido para inhibir la expresión de un polinucleótido, y secuencias complementarias de los anteriores. Los polinucleótidos pueden ser de cualquier longitud. Pueden tener, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 85, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o más ácidos nucleicos de longitud, incluyendo todos los valores entremedias, y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o pueden formar parte de un polinucleótido más grande, por ejemplo, un vector. Los polinucleótidos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender ácidos nucleicos de ARN y/o ADN y variantes artificiales de los mismos (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).
Los polinucleótidos que codifican para ciertas proteínas de unión a antígeno, o porciones de las mismas (por ejemplo, anticuerpo de longitud completa, cadena pesada o ligera, dominio variable, o una CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 o CDRL3) pueden aislarse de células B de ratones que se han inmunizado con CD30L o un fragmento inmunogénico de los mismos. El polinucleótido puede aislarse mediante procedimientos convencionales, tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La presentación en fago es otro ejemplo de una técnica conocida con la que pueden prepararse derivados de anticuerpos y otras proteínas de unión a antígeno. En un enfoque, los polipéptidos que son componentes de una proteína de unión a antígeno de interés se expresan en cualquier sistema de expresión recombinante adecuado, y se permite que los polipéptidos expresados se ensamblen para formar moléculas de proteína de unión a antígeno. La presentación en fago también se usa para derivar proteínas de unión a antígeno que tienen propiedades diferentes (es decir, afinidades variables por el antígeno al que se unen) por medio de intercambio de cadena, véase Marks et al., 1992, BioTechnology 10:779.
Debido a la degeneración del código genético, cada una de las secuencias de polipéptido representadas en el presente documento se codifican también por un gran número de otras secuencias de polinucleótido además de las descritas. Por ejemplo, los dominios variables de cadena pesada descritos en el presente documento pueden codificarse por las secuencias de polinucleótido SEQ ID NO: 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71 y 73. Los dominios variables de cadena ligera pueden codificarse por las secuencias de polinucleótido SEQ ID NO:37, 39, 41, 43, 45 y 47. Un experto habitual en la técnica apreciará que la presente solicitud proporciona por tanto una descripción escrita adecuada y un posibilitamiento para cada secuencia de nucleótidos degenerada que codifica para cada proteína de unión a antígeno.
También se describen polinucleótidos que se hibridan con otras moléculas de polinucleótido en condiciones de hibridación particulares. Métodos para hibridar ácidos nucleicos, parámetros básicos que afectan a la elección de condiciones hibridación y una guía para concebir condiciones adecuadas se conocen ampliamente en la técnica. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. Tal como se define en el presente documento, una condición de hibridación moderadamente rigurosa usa una disolución de prelavado que contiene 5x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), SDS al 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente un 50% de formamida, 6x SSC y una temperatura de hibridación de 55°C (u otras disoluciones de hibridación similares, tal como una que contiene aproximadamente un 50% de formamida, con una temperatura de hibridación de 42°C), y condiciones de lavado de 60°C, en 0,5x SSC, SDS al 0,1%. Una condición de hibridación rigurosa hibrida en 6x SSC a 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,1xSSC, SDS al 0,2% a 68°C. Además, un experto en la técnica puede manipular las condiciones de hibridación y/o de lavado para aumentar o reducir la rigurosidad de hibridación, de modo que los polinucleótidos que comprenden secuencias de ácido nucleico que son al menos un 65%, un 70%, un 75%, un 80%, un 85%, un 90%, un 91%, un 92, un 93%, un 94%, un 95%, un 96%, un 97%, un 98% o un 99% idénticos entre sí, incluyendo todos los valores entremedias, permanezcan normalmente hibridados entre sí.
Pueden introducirse cambios mediante una mutación en un polinucleótido, conduciendo de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido (por ejemplo, una proteína de unión a antígeno o derivado de proteína de unión a antígeno) que lo codifique. Las mutaciones pueden introducirse usando cualquier técnica conocida en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis aleatoria. Los polipéptidos mutantes pueden expresarse y seleccionarse para una propiedad deseada. Las mutaciones pueden introducirse en un polinucleótido sin alterar significativamente la actividad biológica de un polipéptido que lo codifique. Por ejemplo, sustituciones en residuos de aminoácido no esenciales. Alternativamente, una o más mutaciones pueden introducirse en un polinucleótido que cambian selectivamente la actividad biológica de un polipéptido que lo codifique. Por ejemplo, la mutación puede cambiar cuantitativa o cualitativamente la actividad biológica, tal como aumentar, reducir o eliminar la actividad y cambiar la especificidad de antígeno de una proteína de unión a antígeno.
También se describen polinucleótidos que son adecuados para su uso como cebadores o sondas de hibridación para la detección de secuencias de ácido nucleico. Un polinucleótido puede comprender solo una porción de una secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido de longitud completa, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica para una porción activa (por ejemplo, una porción de unión a CD30L) de un polipéptido. Sondas basadas en la secuencia de un ácido nucleico pueden usarse para detectar el ácido nucleico o ácidos nucleicos similares, por ejemplo, transcritos que codifican para un polipéptido. La sonda puede comprender un grupo de etiquetado, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Tales sondas pueden usarse para identificar una célula que expresa el polipéptido.
Métodos de expresión de proteínas de unión a antígeno
Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento pueden prepararse mediante cualquiera de varias técnicas convencionales. Por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno de CD30L pueden producirse mediante sistemas de expresión recombinantes, usando cualquier técnica conocida en la técnica. Véanse, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et a/.(eds.) Plenum Press, Nueva York (1980); y Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
En el presente documento también se describen sistemas de expresión y constructos en forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido tal como se describió anteriormente, así como células huésped que comprenden tales sistemas de expresión o constructos. Tal como se usa en el presente documento, “vector” significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) adecuada para su uso para transferir información de codificación de proteína a una célula huésped. Los ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, vectores virales, vectores de mamífero no episómicos y vectores de expresión, por ejemplo, vectores de expresión recombinantes. Los vectores de expresión, tales como vectores de expresión recombinantes, son útiles para la transformación de una célula huésped y contienen secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (junto con la célula huésped) la expresión de una o más regiones codificantes heterólogas ligadas operativamente a las mismas. Un constructo de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan a o controlan la transcripción, traducción, y si están presentes intrones, afectan al corte y empalme de ARN de una región codificante ligada operativamente a las mismas. “Ligada operativamente” significa que los componentes a los que se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes. Por ejemplo, una secuencia control, por ejemplo, un promotor, en un vector que está “ligado operativamente” a una secuencia codificante de proteína está dispuesta de modo que la actividad normal de la secuencia control conduce a la transcripción de la secuencia codificante de proteína dando como resultado la expresión recombinante de la proteína codificada.
También se describen células huésped en las que se ha introducido un vector de expresión, tal como un vector de expresión recombinante. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota (por ejemplo, E. coli) o célula eucariota (por ejemplo, células de levadura, insecto o mamífero (por ejemplo, células CHO)). El ADN del vector puede introducirse en células procariotas o eucariotas por medio de técnicas de transformación o transfección convencionales. Para la transfección estable de células de mamífero, se conoce que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usados, solo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN foráneo en su genoma. Con el fin de identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica para un marcador seleccionable (por ejemplo, para resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células huésped junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Las células transfectadas de manera estable con el polinucleótido introducido pueden identificarse mediante la selección de fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el gen marcador seleccionable sobrevivirán, mientras que las otras células mueren), entre otros métodos.
Las proteínas de unión a antígeno pueden expresarse en líneas celulares de hibridoma (por ejemplo, en particular anticuerpos pueden expresarse en hibridomas) o en líneas celulares distintas de hibridomas. Pueden usarse constructos de expresión que codifican para las proteínas de unión a antígeno para transformar una célula huésped de mamífero, insecto o microbiana. La transformación puede realizarse usando cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, el empaquetado del polinucleótido en un virus o bacteriófago y transduciendo una célula huésped con el constructo mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, tal como se ejemplifica mediante las patentes estadounidenses n.os 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461; 4.959.455. El procedimiento de transformación óptimo usado dependerá de qué tipo de célula huésped está transformándose. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen ampliamente en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en liposomas, mezclado de ácido nucleico con lípidos cargados positivamente y microinyección directa del ADN en núcleos.
Los constructos de expresión recombinantes comprenden normalmente un polinucleótido que codifica para un polipéptido. El polipéptido puede comprender una o más de las siguientes: una o más CDR tal como se describen en el presente documento; una región variable de cadena ligera; una región variable de cadena pesada; una región constante de cadena ligera; una región constante de cadena pesada (por ejemplo, Ch1 , Ch2 y/o Ch3); y/u otra porción de armazón de una proteína de unión a antígeno de CD30L. Estas secuencias de ácido nucleico se insertan en un vector de expresión apropiado usando técnicas de ligación estándar. En un caso, la región constante de cadena pesada o ligera se adjunta al extremo C-terminal de una región variable de cadena pesada o ligera descrita en el presente documento y se liga en un vector de expresión. El vector se selecciona normalmente para ser funcional en la células huésped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de célula huésped, permitiendo que pueda producirse la amplificación y/o expresión del gen). En algunos casos se usan vectores que emplean ensayos de complementación de proteína-fragmento usando indicadores proteicos, tales como dihidrofolato reductasa (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n° 6.270.964). Vectores de expresión adecuados pueden adquirirse, por ejemplo, de Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA) o BD Biosciences (San José, CA). Otros vectores útiles para clonar y expresar los anticuerpos y fragmentos incluyen aquellos descritos en Bianchi y McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44. Vectores de expresión adecuados adicionales se comentan, por ejemplo, en Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, Nueva York: Academic Press.
Normalmente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para el mantenimiento de plásmidos y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Tales secuencias, denominadas colectivamente “secuencias flanqueantes” incluirán en ciertos casos normalmente una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias potenciadoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional, una secuencia de intrón completa que contiene un sitio de corte y empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica para una secuencia líder para la secreción de polipéptido, un sitio de unión a ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el polinucleótido que codifica para el polipéptido que debe expresarse, y un marcador seleccionable elemento. Los vectores de expresión que se describen pueden construirse a partir de un vector de partida tal como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden contener o no todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o más de las secuencias flanqueantes descritas en el presente documento no están ya presentes en el vector, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. Los métodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes son ampliamente conocidos para un experto en la técnica.
Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica para la “etiqueta”, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5’ o 3’ de la secuencia codificante de proteína de unión a antígeno de CD30L; la secuencia de oligonucléotido codifica para poliHis (tal como hexaHis), u otra “etiqueta” tal como FLAG®, HA (hemaglutinina del virus influenza), o myc, para los que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta se fusiona normalmente con el polipéptido tras la expresión del polipéptido, y puede servir como medio para la purificación o detección por afinidad de la proteína de unión a antígeno de CD30L de la célula huésped. La purificación por afinidad puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante cromatografía en columna usando anticuerpos frente a la etiqueta como matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente de la proteína de unión a antígeno de CD30L purificada mediante diversos medios, tal como usando ciertas peptidasas para la escisión.
Las secuencias flanqueantes pueden ser homólogas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heterólogas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la célula huésped), híbridas (es decir, una combinación de secuencias flanqueantes de más de una fuente), sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser un organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y puede activarse mediante, la maquinaria de célula huésped.
Las secuencias flanqueantes útiles en los vectores pueden obtenerse mediante cualquiera de varios métodos ampliamente conocidos en la técnica. Normalmente, las secuencias flanqueantes útiles en el presente documento se habrán identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestión con endonucleasas de restricción y por tanto pueden aislarse de la fuente tisular apropiada usando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia flanqueante puede conocerse. En este caso, la secuencia flanqueante puede sintetizarse usando los métodos descritos en el presente documento para clonación o síntesis de ácido nucleico.
Ya se conozca toda o solo una porción de la secuencia flanqueante, puede obtenerse usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y/o examinando una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un oligonucleótido y/o fragmento de secuencia flanqueante de la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, un fragmento de ADN que contiene una secuencia flanqueante puede aislarse de un trozo más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede llevarse a cabo mediante digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN apropiado seguido de aislamiento usando purificación en gel de agarosa, cromatografía en columna Qiagen® (Qiagen, Chatsworth, CA) u otros métodos conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para llevar a cabo este propósito resultará fácilmente evidente para un experto habitual en la técnica.
Un origen de replicación es normalmente una parte de aquellos vectores de expresión procariotas adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en una célula huésped. Si el vector de elección no contiene un sitio de origen de replicación, puede sintetizarse químicamente uno basándose en una secuencia conocida, y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas, y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV), o papilomavirus tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente de origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen SV40 se usa a menudo solo porque también contiene el promotor temprano de virus).
Una secuencia de terminación de transcripción está ubicada normalmente en 3’ con respecto al extremo de una región codificante de polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación de transcripción en células procariotas es un fragmento rico en G-C seguido de una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, también puede sintetizarse fácilmente usando métodos para la síntesis de ácido nucleico tales como los descritos en el presente documento.
Un gen marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped que se hace crecer en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para células huésped procariotas; (b) complementen las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos o definidos. Marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. Ventajosamente, también puede usarse un gen de resistencia a neomicina para la selección en células huésped tanto procariotas como eucariotas.
Otros genes seleccionables pueden usarse para amplificar el gen que se expresará. La amplificación es el proceso en el que los genes que se requieren para la producción de una proteína crítica para el crecimiento o la supervivencia celular ser reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y genes timidina cinasa sin promotor. Los transformantes de células de mamífero se ponen bajo presión de selección, estando solo los transformantes adaptados de manera única para sobrevivir en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone cultivando las células transformadas en condiciones en las que la concentración de agente de selección en el medio se aumenta sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificación de tanto el gen seleccionable como el ADN que codifica para otro gen, tal como una proteína de unión a antígeno que se une a CD30L. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de un polipéptido tal como una proteína de unión a antígeno a partir del ADN amplificado.
Un sitio de unión a ribosoma es habitualmente necesario para el inicio de la traducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas). El elemento está ubicado normalmente en 3’ con respecto al promotor y en 5’ con respecto a la secuencia codificante del polipéptido que debe expresarse.
En algunos casos, tales como en los que se desea glicosilación en un sistema de expresión de célula huésped eucariota, pueden manipularse las diversas pre- o prosecuencias para mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, puede alterarse el sitio de escisión de peptidasa de un péptido señal particular, o añadir prosecuencias, que también pueden afectar a la glicosilación. El producto de proteína final puede tener, en la posición -1 (en relación con el primer aminoácido de la proteína madura), uno o más aminoácidos adicionales que inciden sobre la expresión, que pueden no haberse eliminado totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos residuos de aminoácido encontrados en el sitio de escisión de peptidasa, acoplados al extremo amino-terminal. Alternativamente, el uso de algunos sitios de escisión de enzima puede dar como resultado una forma ligeramente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en tal área dentro del polipéptido maduro.
La expresión y la clonación contendrán normalmente un promotor que se reconoce por el organismo huésped y ligado operativamente a la molécula que codifica para una proteína de unión a antígeno de CD30L. Los promotores son secuencias no transcritas ubicas aguas arriba (es decir, en 5’) con respecto al codón de iniciación de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 a 1000 pb) que controlan la transcripción del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases: promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripción a partir de ADN bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, transcriben de manera uniforme un gen al que están ligados operativamente, es decir, con poco o nada de control sobre la expresión génica. Un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales, se conocen ampliamente. Un promotor adecuado está ligado operativamente al ADN que codifica para una región variable de cadena pesada o una región variable de cadena ligera de una proteína de unión a antígeno de CD30L eliminando el promotor de la fuente ADN mediante con enzimas de restricción e insertando la secuencia promotora deseada en el vector.
Promotores adecuados para su uso con huéspedes de levadura también se conocen ampliamente en la técnica. Los potenciadores de levadura se usan ventajosamente con promotores de levadura. Los promotores adecuados para su uso con células huésped de mamífero se conocen ampliamente e incluyen, pero no se limitan a, aquellos obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegalovirus, retrovirus, virus de la hepatitis B y virus simio 40 (SV40). Otros promotores de mamífero adecuados incluyen promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina.
Los promotores adicionales que pueden ser de interés incluyen, pero no se limitan a: promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor de CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.
81:659-663); el promotor contenido en la repetición terminal larga 3’ de virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); promotor de timidina cinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
78:1444-1445); secuencias promotoras y reguladoras del gen de metalotionina (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); y promotores procariotas tal como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). También son de interés las siguientes regiones de control transcripcional animales, que presenta especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgénicos: la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control de gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); la región de control de virus de tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de albúmina que es activa en hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276); la región de control del gen de alfa-feto-proteína que es activa en hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); la región del control del gen de alfa 1 -antitripsina que es activa en hígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); la región de control del gen de beta-globina que es activa en células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); la región de control del gen proteína básica de mielina que es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de cadena ligera de miosina-2 que es activa en músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286); y la región de control del gen de hormona de liberación gonadotrópica que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
Una secuencia potenciadora puede insertarse en el vector para aumentar la transcripción por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos que actúan en cis de ADN, habitualmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actúan sobre el promotor para aumentar la transcripción. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientación y posición, habiéndose encontrado en posiciones tanto 5’ como 3’ con respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamífero (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina). Sin embargo, normalmente se usa un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus conocidos en la técnica son elementos potenciadores a modo de ejemplo para la activación de promotores eucariotas. Aunque un potenciador puede estar situado en el vector o bien en 5’ o bien en 3’ con respecto a una secuencia codificante, normalmente está ubicado en un sitio 5’ con respecto al promotor. Una secuencia que codifica para una secuencia señal nativa o heteróloga (secuencia líder o péptido señal) puede incorporarse a un vector de expresión, para promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección de péptido señal o líder depende del tipo de células huésped en las que debe producirse el anticuerpo, y una secuencia señal heteróloga puede reemplazar la secuencia señal nativa. Los ejemplos de péptidos señal que son funcionales en células huésped de mamífero incluyen los siguientes: la secuencia señal para interleucina-7 descrita en la patente estadounidense n.° 4.965.195; la secuencia señal para receptor de interleucina-2 descrita en Cosman et al., 1984, Nature 312:768; el péptido señal de receptor de interleucina-4 descrito en la patente EP n° 0367566; el péptido señal de receptor de interleucina-1 de tipo I descrito en la patente estadounidense n.° 4,968,607; el péptido señal de receptor de interleucina-1 de tipo II descrito en la patente EP n.° 0460846.
Después de haberse construido el vector, el vector completado puede insertarse en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para una proteína de unión a antígeno en una célula huésped seleccionada puede llevarse a cabo mediante métodos ampliamente conocidos que incluyen transfección, infección, coprecipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, lipofección, transfección medida por DEAE-dextrano u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte en función del tipo de célula huésped que debe usarse. Estos métodos y otros métodos adecuados son ampliamente conocidos para el experto en la técnica y se exponen, por ejemplo, en Sambrook etal., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
Una célula huésped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza una proteína que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la célula huésped la secreta al medio) o directamente de la célula huésped que la produce (si no se secreta). La selección de una célula huésped apropiada dependerá de diversos factores, tales como los niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que son deseables o necesarias para la actividad (tal como glicosilación o fosforilación) y la facilidad de plegamiento en una molécula biológicamente activa.
Líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión se conoce ampliamente en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster bebé (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y otras varias líneas celulares. En ciertos casos, las líneas celulares pueden seleccionarse a través de la determinación de qué líneas celulares tienen altos niveles de expresión y producen de manera constitutiva proteínas de unión a antígeno con propiedades de unión a CD30L. En otro caso también puede seleccionarse una línea celular del linaje de células B que no elabora su propio anticuerpo, pero tiene capacidad para elaborar y secretar un anticuerpo heterólogo. En otro caso, líneas celulares desactivadas para fucosiltransferasa que producen anticuerpos completa o parcialmente afucosilados (patentes estadounidenses 6.946.292, US 7.425.446, US 7.846.725, US 8.067.232, células Potelligent®, BioWa, Princeton, NJ.
Bioensayos in vitro de CD30L
También se describen métodos para identificar antagonistas que inhiben la interacción CD30/CD30L. Estos métodos hacen uso de la inducción de una citocina marcadora producida a partir de células CD30+ en respuesta a CD30L. El método comprende las etapas de combinar un compuesto de prueba de interés con una fuente de CD30L; añadir la combinación de compuesto de prueba/CD30L a células CD30+ que son capaces de expresar una citocina marcadora en respuesta a la interacción de CD30 y CD30L; recoger el sobrenadante celular; y determinar si el compuesto de prueba inhibe la interacción CD30/CD30L midiendo la cantidad de una citocina marcadora producida y/o liberada en el sobrenadante celular. Por ejemplo, un bioensayo in vitro dependiente de CD30L de este tipo puede aprovechar la expresión de la línea celular de linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) humana, Karpas-299 (K299), de CD30 endógeno y la liberación de IL-8 de estas células en respuesta a la interacción de CD30 y CD30L. Estos métodos se muestran a modo de ejemplo adicionalmente en los ejemplos proporcionados en el presente documento.
Los compuestos de prueba incluyen proteínas de unión a antígeno de CD30L, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos, fragmentos de unión a antígeno de los mismos y sus derivados. Los compuestos de prueba también podrían incluir compuestos solubles de CD30 recombinante (tal como el dominio extracelular de CD30 fusionado con una etiqueta Fc, etiqueta poli-HIS, etiqueta FLAG® y similares) así como moléculas pequeñas. Las líneas de células CD30+ adecuadas expresan una citocina marcadora en respuesta a la interacción de CD30 y CD30L; tales líneas celulares incluyen la línea celular de linfoma anaplásico de células grandes de CD30+ humana K299 (Karpas-299, DSMZ, Alemania).
Las fuentes para CD30L incluyen constructos de CD30L solubles y CD30L asociado a membrana. El CD30L soluble incluye composiciones quiméricas que comprenden un fragmento de CD30L, preferiblemente un fragmento de la región extracelular de CD30L. Tales constructos solubles incluyen constructos de cremallera de leucina o isoleucina multiméricos. Tales constructos comprenden un motivo de cremallera de leucina de 33 aminoácidos acoplado al extremo N-terminal del domino extracelular de human o CD30L de Cynomolgus. También están disponibles comercialmente constructos de CD30L recombinantes solubles (R&D Systems, Minneapolis, MN). Otros CD30L solubles incluyen también un domino extracelular de CD30L fusionado con una etiqueta FLAG® (Axxora LLC, San Diego, CA). El CD30L asociado a membrana incluye células y líneas celulares que expresan CD30L nativas y transfectadas. Tales líneas celulares incluyen, pero no se limitan a, células humanas tal como la línea de células B humanas CD30L+ Ramos (ATCC, Manassas, VA). También se contemplan células T de sangre de mono Cynomologous y líneas celulares dendríticas de ratón.
En el presente documento se describe un método para determinar la inducción por CD30L de la producción de IL-8 a partir de células CD30+ que comprende las etapas de: combinar un compuesto de prueba con una fuente de CD30L; añadir la combinación de compuesto de prueba-CD30L a células CD30+ irradiadas; recoger el sobrenadante celular; y determinar la cantidad de IL-8 liberada al sobrenadante celular. Este bioensayo in vitro dependiente de CD30L aprovecha la expresión de la línea celular de linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) humano, Karpas-299 (K299), de CD30 endógeno y la liberación de IL-8 a partir de estas células en respuesta a la interacción de CD30 y CD30L. La IL-8 liberada puede cuantificarse, por ejemplo, mediante un ELISA de IL-8. Los antagonistas de CD30L, tales como proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento, se incuban o bien con CD30L soluble (ensayo celular individual) o bien con un CD30L asociado a membrana (ensayo celular doble) y entonces se cultivan con células K299. Entonces se recogen los sobrenadantes celulares y se determina la inhibición de la liberación de IL8 a partir de células K299 en respuesta al bloqueo mediante antagonistas de CD30L, tales como las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento, usando un ELISA de tipo sándwich de IL-8.
Para el ensayo celular individual, los antagonistas de CD30L se titulan en placas de microtitulación de 96 pocillos, tales como placas de 96 pocillos Costar® (Corning; Acton, MA) para dar un intervalo deseado de concentraciones finales, por ejemplo, desde 1pg/ml hasta 10 pg/ml. Proteínas de unión a antígeno de CD30L, tales como las descritas en el presente documento, pueden usarse como controles positivos. Las placas se incubaron durante aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente. A cada pocillo se le añadió entonces la fuente de células CD30+. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C, con el 5% de CO2.
Para el ensayo celular doble, la fuente de CD30L se une a membrana y se irradia. Las células que expresan CD30L incluyen, pero no se limitan a, células tales como la línea de células B humanas CD30L+ humanas Ramos (ATCC, Manassas, VA), células T de sangre de mono Cynomologous activadas o líneas de células DC murinas de ratón. Las células que expresan CD30L pueden someterse a clasificación FACS antes de su uso para seleccionar aquellas células con el mayor nivel de expresión de CD30L en la superficie celular. Las células que expresan CD30L se combinan con el antagonista de CD30L y se incuban durante 45 minutos antes de añadirlas a la fuente de células CD30+. De nuevo, las placas se incuban durante 24 horas a 37°C, con el 5% de CO2.
Para ambos ensayos, la IL8 liberada puede determinarse y cuantificarse mediante cualquier método para detectar IL-8, tal como, por ejemplo, una ELISA de tipo sándwich de IL-8. Tales ensayos están disponibles comercialmente, tal como aquellos proporcionados por R&D Systems (Minneapolis, MN). Los niveles de IL-8 pueden interpolarse a partir de la curva patrón de ELISA y los niveles de CI50 determinarse usando software disponible comercialmente, tal como DeltaSoft (DeltaSoft, Inc., Hillsborough, NJ) y GraphPad PRISM (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).
Uso de proteínas de unión a antígeno de CD30L humanas con fines de diagnóstico y terapéuticos
Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento son útiles para detectar CD30L en muestras biológicas y la identificación de células o tejidos que producen CD30L. Las proteínas de unión a antígeno que se unen específicamente a CD30L pueden usarse en el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades relacionadas con CD30L en un paciente que lo necesite, por ejemplo, proteínas de unión a antígeno de CD30L pueden usarse en ensayos de diagnóstico, por ejemplo, la inducción de IL-8 a partir de células CD30+. Las proteínas de unión a antígeno que se unen a CD30L pueden tener un uso terapéutico en la mejora de enfermedades relacionadas con CD30L.
Indicaciones
La presente invención también se refiere al uso de proteínas de unión a antígeno de CD30L para su uso en la prevención o el tratamiento terapéutico de trastornos médicos, tales como los dados a conocer en el presente documento. Las proteínas de unión a antígeno de CD30L son útiles para tratar una variedad de condiciones en las que el CD30L está asociado con o desempeña un papel en la contribución a la enfermedad o el trastorno subyacente o contribuye de otro modo a un síntoma negativo.
Se describen métodos para tratar una variedad de enfermedades, tales como enfermedades autoinmunes e inflamatorias crónicas y cáncer administrando a un paciente que lo necesite una cantidad efectiva de una composición que comprende una o más de las proteínas de unión a antígeno de CD30L descritas en el presente documento. Tales composiciones son útiles para modular respuestas inmunitarias in vivo bloqueando interacciones entre células CD30+ y CD30L+; agotando las células CD30L+; o mediante actividad agonística sobre células CD30L+.
El CD30L puede presentar “señalización inversa”, el CD30L expresado en neutrófilos y células T de sangre periférica puede activarse mediante reticulación para estimular actividades metabólicas en aquellas células (Wiley et al., J Immunol 157: 3235-39, 1996; Cerutti et al., J. Immunol. 165: 786, 2000; Cerutti et al., Nat. Immunol. 2: 150, 2001). Como tales, las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento que se unen a CD30L podrían usarse para bloquear la señalización de CD30L inversa o estimular células CD30L+.
Las células CD30+ están fuertemente asociadas con la enfermedad de Hodgkin y CD30 es un marcador clínico usado ampliamente para varias malignidades hematológicas (para un resumen, véase Horie y Watanabe, Immuno. 10:457-470, 1998). Las composiciones que comprenden una o más de las proteínas de unión a antígeno de CD30L descritas en el presente documento, ya sea solas o en combinación con otras terapias, pueden ser útiles en el tratamiento de tales estados.
CD30L se expresa en células T activadas y ciertas poblaciones de células B y células dendríticas. CD30 se expresa en una proporción de células T y B activadas. Este patrón de expresión sugiere que la selección como diana de CD30L sería útil para modular la interacción entre células T, células B y células dendríticas. Se ha mostrado que CD30L afecta a la inmunidad humoral. Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento serían útiles en regímenes terapéuticos relacionados con enfermedades inflamatorias, particularmente aquellas accionadas por respuestas de células B dependientes de células T.
La artritis puede tratarse mediante los métodos y las composiciones dados a conocer en el presente documento. Tal como se usa en este caso, el término “artritis” se refiere a estados inflamatorios crónicos que afectan principalmente a las articulaciones, o el tejido conjuntivo que rodea las articulaciones, aunque también pueden verse afectados diversos órganos del cuerpo. La artritis puede ser de origen autoinmune o traumático, o puede desencadenarse por la exposición a un antígeno foráneo, conduciendo después a un estado crónico que ya no depende de la presencia continuada del antígeno desencadenante. El término “artritis”, tal como se usa en el presente documento, incluye: artritis deformante; osteoartritis; artritis reumatoide (adulta y juvenil); artritis por enfermedad de Lyme; artritis reactiva incluyendo la enfermedad de Reiter; artritis psoriásica; artritis nodosa; espondiloartropatías seronegativas, incluyendo, pero sin limitarse a, espondilitis anquilosante.
Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento son útiles en el tratamiento de una variedad de trastornos reumáticos, que se definen en el presente documento como cualquier trastorno crónico que implique dolor y a menudo múltiples inflamaciones localizadas de las articulaciones, músculos, nervios, tendones, piel, ojos, tejidos conjuntivos u otros diversos sistemas de órganos. Estos incluyen, pero no se limitan a: artritis; esclerodermia; gota; lupus eritematoso sistémico; polimialgia reumática; enfermedad de Still; uveítis crónica; trastornos que dan como resultado la inflamación del músculo voluntario, incluyendo dermatomiositis y polimiositis, incluyendo la miositis por cuerpos de inclusión esporádica. El lupus eritematoso sistémico puede provocar la inflamación de las articulaciones, piel, riñones, corazón, pulmones, vasos sanguíneos y cerebro. En sus formas avanzadas, lupus eritematoso sistémico, este estado puede dar como resultado fallo renal.
También se describen métodos para usar las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento en terapias para tratar diversos trastornos del sistema endocrino, incluyendo, pero sin limitarse a: diabetes de aparición juvenil o en la madurez (incluyendo tipos de diabetes autoinmunes, insulinodependientes; tipos no insulinodependientes y diabetes mediada por obesidad); atrofia adrenal idiopática; enfermedad de Addison; hipotiroidismo; enfermedad de Grave; tiroiditis autoinmune, tal como tiroiditis de Hashimoto; y síndromes autoinmunes poliglandulares (tipos I y II).
Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento también son útiles en terapias para tratar estados del sistema gastrointestinal, incluyendo, pero sin limitarse a: colangitis esclerosante autoinmune; celiaquía; enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; pancreatitis autoinmune, incluyendo pancreatitis crónica; gastroparesia idiopática; y úlceras idiopáticas, incluyendo úlceras gástricas y duodenales.
También se incluyen métodos para usar las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento en terapias para tratar trastornos del sistema genitourinario, tal como glomerulonefritis autoinmune e idiopática; y prostatitis idiopática crónica (no bacteriana), incluyendo hipertrofia prostática benigna.
También se describen en el presente documento métodos para usar las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento en terapias para tratar diversos trastornos hematológicos, incluyendo, pero sin limitarse a: anemias y trastornos hematológicos, incluyendo anemia perniciosa y anemia aplásica, y anemia aplásica de Fanconi; anemia hemolítica autoinmune; púrpura trombocitopénica idiopática (ITP); síndromes mielodisplásicos (incluyendo anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación); y síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS).
Las proteínas de unión a antígeno dadas conocer son además útiles para tratar estados que afectan al hígado, tal como hepatitis inflamatoria crónica o autoinmune.
Además, las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer y su combinación se usan para tratar diversos trastornos inflamatorios crónicos o autoinmunes que implican pérdida de audición. Uno de estos es la pérdida de audición asociada a nervios cocleares o del oído interno, que se cree que resulta de un proceso autoinmune, es decir, pérdida de audición autoinmune. Este estado se trata actualmente con esteroides, metotrexato y/o ciclofosfamida, que pueden administrarse de manera concurrente con un inhibidor o bloqueador de la interacción CD30/CD30L.
Varios trastornos pulmonares inflamatorios también pueden tratarse con las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer, incluyendo: linfangioleiomiomatosis idiopática; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) asociada con bronquitis no infecciosa crónica o con enfisema; y enfermedades pulmonares fibróticas, tales como fibrosis quística y fibrosis pulmonar idiopática.
Trastornos asociados con trasplante también pueden tratarse con las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer, incluyendo enfermedad de injerto contra huésped. Para prevenir o mejorar la enfermedad de injerto contra huésped, las composiciones que comprenden una o más de las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer pueden administrarse antes de, de manera concomitante con, o tras trasplante de médula ósea o de órganos sólidos, incluyendo trasplante de corazón, hígado, pulmón, piel, riñón u otros órganos.
Las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer también son útiles para tratar enfermedades oculares inflamatorias crónicas, incluyendo uveítis autoinmune.
Tales compuestos también serían útiles para tratar enfermedades asociadas con inflamación de las vías respiratorias, tal como asma.
Las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento también son útiles para tratar trastornos inflamatorios que afectan al sistema reproductor femenino, incluyendo: fallo por implantes múltiples/infertilidad; síndrome de pérdida de fetos o pérdida de embriones IV (aborto espontáneo); y endometriosis.
Otros trastornos médicos que pueden tratarse con las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento incluyen inflamación crónica y/o enfermedades degenerativas del sistema nervioso central. Esto incluye, por ejemplo, enfermedades asociadas con desmielinización, tal como esclerosis múltiple, esclerosis sistémica y los síndromes de Guillain-Barre (incluyendo polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, neuropatía axonal motora aguda, neuropatía axonal motora-sensitiva aguda y síndrome de Fisher). La esclerosis múltiple es representativa de una enfermedad degenerativa, crónica, del sistema nervioso central que puede tratarse con un agente capaz de inhibir o bloquear la interacción de CD30 y CD30L. Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.652.854.
Otros estados inflamatorios crónicos que pueden tratarse con las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer incluyen enfermedad de aglutininas frías; síndrome de Behcet; síndrome de Sjogren; y tenosinovitis idiopática, así como diversos trastornos inflamatorios crónicos asociados con deficiencias hereditarias. Los inhibidores, las composiciones y las terapias de combinación objeto son además útiles para tratar parálisis de Bell (parálisis facial idiopática); síndrome de fatiga crónica (no asociada con infección en curso); enfermedad de los discos vertebrales degenerativa crónica; síndrome de la guerra del Golfo; y miastenia grave, que pueden tratarse de manera concurrente con corticosteroides.
Los trastornos que implican la piel o membranas mucosas también pueden tratarse usando las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento. Estos incluyen: enfermedades acantolíticas, incluyendo lupus discoide, lupus eritematosos cutáneo subagudo, vasculitis cutánea, enfermedad de Darier, queratosis folicular, pénfigo vulgar y pénfigo paraneoplásico; acné rosácea; alopecia areata; penfigoide bulloso; eczema; eritema, incluyendo eritema multiforme y eritema multiforme bulloso (síndrome de Stevens-Johnson); enfermedad de la piel inflamatoria; liquen plano; enfermedad bullosa por IgA lineal (dermatosis bullosa crónica de la infancia); pérdida de la elasticidad de la piel; dermatitis neutrofílica (síndrome de Sweet); pitiriasis rubra pilaris; psoriasis; piodermia gangrenosa; pérdida de la elasticidad de la piel; y necrólisis epidérmica tóxica.
Otras enfermedades que pueden tratarse con las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer incluyen: candidiasis mucocutánea crónica asociada autoinmunidad; alergias; sarcoidosis; reticulohistiocitosis multicéntrica; granulomatosis de Wegener; arteritis, incluyendo arteritis de células gigantes; vasculitis y miocarditis autoinmune crónica.
Para tratar un trastorno médico usando las proteínas de unión a antígeno descritas en el presente documento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente terapéutico se administra a un mamífero que lo necesite. El agente se administra según un régimen de dosis y frecuencia de administración que sea adecuado para inducir una mejora sostenida en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno. Una mejora se considera “sostenida” si el paciente presenta la mejora en al menos dos ocasiones separadas por al menos un día, pero preferiblemente que están separadas por una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro o más semanas. La gravedad del trastorno se determina basándose en signos o síntomas, o puede determinarse mediante cuestionarios que se administran al paciente, tal como los cuestionarios de calidad de vida usados a menudo por médicos para evaluar la situación de estados patológicos crónicos.
Uno o más indicadores que reflejan la gravedad del padecimiento de un paciente pueden evaluarse para determinar si la frecuencia y duración del tratamiento farmacológico es suficiente. El valor de referencia para un indicador elegido se establece mediante el examen del paciente antes de la administración de la primera dosis del agente terapéutico. Preferiblemente, el examen de referencia se realiza en el plazo de aproximadamente 60 días de la administración de la primera dosis.
Si el estado que está tratándose es lupus eritematoso sistémico, el indicador para determinar la suficiencia del tratamiento puede consistir en una mejora observada en uno de los siguientes: fatiga; fiebre; úlceras de la boca y nariz; sarpullido facial (“sarpullido en forma de mariposa”); fotosensibilidad (el SLE brota a menudo tras la exposición a la luz solar); pleuritis; pericarditis; fenómeno de Raynaud (circulación reducida a los dedos y los dedos de los pies con la exposición a frío); función renal; y recuento de glóbulos blancos (los pacientes con SLE a menudo tiene números disminuidos de glóbulos blancos).
Se describen composiciones farmacéuticas que comprenden proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento formuladas con un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración en sujetos humanos.
Métodos de diagnóstico
Las proteínas de unión a antígeno de las descritas pueden usarse con fines de diagnóstico para detectar, diagnosticar o monitorizar enfermedades y/o estados asociados con la interacción CD30/CD30L. Los ejemplos de métodos útiles en la detección de la presencia de CD30L incluyen inmunoensayos, tales como el ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA).
Para aplicaciones de diagnóstico, la proteína de unión a antígeno se etiquetará normalmente con un grupo de etiquetado detectable. Los grupos de etiquetado adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), grupos enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa del rábano, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo o epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias del par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metal, etiquetas de epítopo). En algunos casos, el grupo de etiquetado está acoplado a la proteína de unión a antígeno por medio de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. En la técnica se conocen y pueden usarse diversos métodos para el etiquetado de proteínas.
Se describen otros métodos de diagnóstico para identificar una célula o células que expresan CD30L. En un caso específico, la proteína de unión a antígeno está etiquetada con un grupo de etiquetado y se detecta la unión de la proteína de unión a antígeno etiquetada a CD30L. En un caso específico adicional, la unión de la proteína de unión a antígeno a CD30L se detecta in vivo. En un caso específico adicional, la proteína de unión a antígeno de CD30L se aísla y se mide usando técnicas conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor (ed. de 1991 y suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology Nueva York: John Wiley & Sons.
Otros métodos proporcionan la detección de la presencia de una molécula de prueba que compite por la unión a CD30L con las proteínas de unión a antígeno descritas. Un ejemplo de un ensayo de este tipo implicaría detectar la cantidad de proteína de unión a antígeno libre en una disolución que contiene una cantidad de CD30L en presencia o ausencia de la molécula de prueba. Un aumento en la cantidad de proteína de unión a antígeno libre (es decir, la proteína de unión a antígeno no unida a CD30L) indicaría que la molécula de prueba es capaz de competir por la unión a CD30L con la proteína de unión a antígeno. En un caso, la proteína de unión a antígeno está etiquetada con un grupo de etiquetado. Alternativamente, la molécula de prueba está etiquetada y la cantidad de molécula de prueba libre se monitoriza en presencia y ausencia de una proteína de unión a antígeno.
Métodos de tratamiento: formulaciones farmacéuticas, vías de administración
Se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una o una pluralidad de las proteínas de unión a antígeno y un excipiente, diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Además se incluyen métodos de tratamiento de un paciente administrando tal composición farmacéutica. El término “paciente” incluye pacientes humanos. Los términos “tratar” y “tratamiento” abarcan el alivio o la prevención de al menos un síntoma u otro aspecto de un trastorno, o la reducción de la gravedad de la enfermedad, y similares. El término “cantidad terapéuticamente efectiva” o “cantidad efectiva” se refiere a la cantidad de una proteína de unión a antígeno de CD30L determinada para producir cualquier respuesta terapéutica en un mamífero. Tales cantidades terapéuticamente efectivas se establecen fácilmente por un experto habitual en la técnica. Para los propósitos de esta divulgación, los términos “padecimiento”, “enfermedad”, “estado médico”, “estado anómalo”, “mal”, “trastorno médico”, “trastorno” y similares se usan de manera intercambiable.
No es necesario que una proteína de unión a antígeno efectúe una cura completa, o erradique cada síntoma o manifestación de una enfermedad, para constituir un agente terapéutico viable. Como se reconoce en el campo pertinente, los fármacos empleados como agentes terapéuticos pueden reducir la gravedad de un estado patológico dado, pero no es necesario que acaben con cada manifestación de la enfermedad para considerarse agentes terapéuticos útiles. De manera similar, no es necesario que un tratamiento administrado de manera profiláctica sea completamente efectivo en la prevención de la aparición de un estado con el fin de constituir un agente profiláctico viable. Simplemente reducir el impacto de una enfermedad (por ejemplo, reduciendo el número o la gravedad de su síntomas, o aumentado la efectividad de otro tratamiento, o produciendo otro efecto beneficioso) o reducir la probabilidad de que la enfermedad se produzca o empeore en un sujeto, es suficiente. Ciertos métodos descritos en el presente documento comprenden administrar a un paciente un antagonista de CD30L (tal como las proteínas de unión a antígeno dadas a conocer en el presente documento) en una cantidad y durante un tiempo suficientes para inducir una mejora sostenida con respecto a la referencia de un indicador que refleja la gravedad del trastorno particular.
Como se entiende en el campo pertinente, las composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de la invención se administran a un paciente de una manera apropiada con respecto a la indicación. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo, pero sin limitarse a, por vía parenteral, por vía tópica o mediante inhalación. Si se inyecta, la composición farmacéutica puede administrarse, por ejemplo, por medio de las vías intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea, mediante inyección en bolo o infusión continua. Se contempla la administración localizada, por ejemplo, en un sitio de enfermedad o lesión, así como la administración transdérmica y la liberación sostenida desde implantes. La administración mediante inhalación incluye, por ejemplo, inhalación nasal u oral, el uso de un nebulizador, la inhalación del antagonista en forma de aerosol, y similares. Otras alternativas incluyen colirios; preparaciones orales incluyendo pastillas, jarabes, pastillas para chupar o chicle; y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, pulverizaciones y pomadas.
También se contempla el uso de proteínas de unión a antígeno en procedimientos ex vivo. Por ejemplo, la sangre de un paciente u otro fluido corporal puede ponerse en contacto con una proteína de unión a antígeno que se une a CD30L ex vivo. La proteína de unión a antígeno puede unirse a una matriz insoluble o material de soporte sólido adecuado.
Ventajosamente, las proteínas de unión a antígeno se administran en forma de una composición que comprende uno o más componentes adicionales tales como un portador, excipiente o diluyente fisiológicamente aceptable. Opcionalmente, la composición comprende adicionalmente uno o más agentes fisiológicamente activos para terapia de combinación. Una composición farmacéutica puede comprender una proteína de unión a antígeno de CD30L junto con una o más sustancias seleccionadas del grupo que consiste en un tampón, un antioxidante tal como ácido ascórbico, un polipéptido de bajo peso molecular (tal como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos), una proteína, un aminoácido, un carbohidrato tal como glucosa, sacarosa o dextrinas, un agente quelante tal como EDTA, glutatión, un estabilizador y un excipiente. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica conespecífica son ejemplos de diluyentes apropiados. Según estándares de la industria apropiados, también pueden añadirse conservantes tal como alcohol bencílico. La composición puede formularse como liofilizado usando disoluciones de excipiente apropiadas (por ejemplo, sacarosa) como diluyentes. Los componentes adecuados no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Ejemplos adicionales de componentes que pueden emplearse en formulaciones farmacéuticas se presentan en cualquier Remington’s Pharmaceutical Sciences incluyendo la 21a ed. (2005), Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los kits para su uso por profesionales médicos incluyen una proteína de unión a antígeno de CD30L y una etiqueta u otras instrucciones para su uso en el tratamiento de cualquiera de los estados comentados en el presente documento. En un caso, el kit incluye una preparación estéril de una o más proteínas de unión a antígeno que se unen a CD30L, que puede estar en forma de una composición tal como se da a conocer anteriormente, y puede estar en uno o más viales.
Las dosificaciones y la frecuencia de administración pueden variar según factores tales como la vía de administración, las proteínas de unión a antígeno particulares empleadas, la naturaleza y la gravedad de la enfermedad que debe tratarse, si el estado es agudo o crónico, y el tamaño y estado general del sujeto. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse mediante procedimientos conocidos en la técnica pertinente, por ejemplo, en ensayos clínicos que pueden implicar estudios de escalación de dosis.
Una dosificación típica puede oscilar entre aproximadamente 0,1 pg/kg y aproximadamente 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En casos específicos, la dosificación puede oscilar entre 0,1 pg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente entre 1 pg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, opcionalmente entre 10 pg/kg y aproximadamente 10 mg/kg, opcionalmente entre aproximadamente 0,1 mg/kg y 5 mg/kg, u opcionalmente entre aproximadamente 0,3 mg/kg y 3 mg/kg.
La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de unión a antígeno de CD30L particular en la formulación usada. Normalmente, un médico administra la composición hasta que se alcanza una dosificación que consigue el efecto deseado. Por tanto, la composición puede administrarse como única dosis, o como dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molécula deseada) a lo largo del tiempo, o como infusión continua a través de un dispositivo de implantación o catéter. Las dosificaciones apropiadas pueden establecerse a través del uso de datos de dosis-respuesta apropiados. Una proteína de unión a antígeno de CD30L de la invención puede administrarse, por ejemplo, una vez o más de una vez, por ejemplo, a intervalos regulares a lo largo de un periodo de tiempo. En casos particulares, una proteína de unión a antígeno de CD30L se administra a lo largo de un periodo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos, o tres meses o incluso de manera indefinida. Para tratar estados crónicos, el tratamiento a largo plazo es generalmente el más efectivo. Sin embargo, para tratar estados agudos, una administración durante periodos más cortos, por ejemplo, desde una hasta seis semanas, puede ser suficiente. En general, la proteína de unión a antígeno se administra hasta que el paciente manifiesta un grado médicamente relevante de mejora con respecto a una referencia para el indicador o indicadores elegidos.
Se contempla que una proteína de unión a antígeno de CD30L pueda administrarse al paciente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para inducir una mejora, preferiblemente una mejora sostenida, en al menos un indicador que refleje la gravedad del trastorno que esté tratándose. Pueden evaluarse diversos indicadores que reflejan el grado de la enfermedad, la enfermedad o el estado del paciente para determinar si la cantidad y el tiempo del tratamiento es suficiente. Tales indicadores incluyen, por ejemplo, indicadores reconocidos clínicamente de gravedad de la enfermedad, síntomas o manifestaciones del trastorno en cuestión. En un caso, se considera que una mejora es sostenida si el sujeto presenta la mejora en al menos dos ocasiones separadas por de dos a cuatro semanas. El grado de mejora se determina generalmente por un médico, que puede hacer esta determinación basándose en signos, síntomas, biopsias u otros resultados de prueba, y que también puede emplear cuestionarios que se administran al sujeto, tal como cuestionarios de calidad de vida desarrollados para una enfermedad dada. Casos particular de métodos y composiciones de la invención implican el uso de una proteína de unión a antígeno de CD30L y uno o más antagonistas de CD30L adicionales, por ejemplo, dos o más proteínas de unión a antígeno de la invención, o una proteína de unión a antígeno de la invención y uno o más de otros antagonistas de CD30L. También se describen proteínas de unión a antígeno de CD30L administradas solas o en combinación con otros agentes útiles para tratar el estado con el que está afectado el paciente. Los ejemplos de tales agentes incluyen fármacos tanto proteináceos como no proteináceos. Tales agentes incluyen, por ejemplo, antagonistas de TNFa, IL-1, IL-2, RANK u otras citocinas que pueden contribuir a la autoinmunidad o inflamación crónica. Los antagonistas de citocina incluyen aquellos que seleccionan como diana la citocina y/o su receptor. Un antagonista que selecciona como diana una citocina puede comprender un receptor soluble frente a la citocina e incluye habitualmente parte o todo el domino extracelular de un receptor para la citocina. El receptor de citocina soluble puede usarse como monómero, o como dímero o multímero superior (por ejemplo, como molécula de fusión en la que el receptor soluble está acoplado a la porción Fc que promueve el dímero de inmunoglobulina humana). En otros casos, el receptor de citocina soluble se PEGila para aumentar su semivida en suero. En algunos casos, el antagonista de citocina soluble comprende un receptor de TNF soluble (tipo I o II). También pueden usarse moléculas orgánicas pequeñas que inhiben citocinas inflamatorias en combinación con los agentes terapéuticos objeto. Más de una proteína de unión a antígeno de ligando CD30 y/o regiones de unión a antígeno de las mismas pueden administrarse de manera concurrente para tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias crónicas, y pueden administrarse solas o junto con otros fármacos que son efectivos frente al mismo estado autoinmunitario o inflamatorio crónico o que se administran para tratar un estado diferente en el mismo paciente.
Cuando se administran conjuntamente múltiples terapéuticos, las dosificaciones pueden ajustarse en consecuencia, tal como se reconoce o se conoce en la técnica pertinente. Tales agentes pueden administrarse simultánea, consecutiva, alternativamente o según cualquier otro régimen que permita que el curso total de terapia sea efectivo.
Además de pacientes humanos, las proteínas de unión a antígeno de CD30L son útiles en el tratamiento de animales no humanos, tales como animales domésticos (perros, gatos, pájaros, primates, etc.), animales de granja domésticos (caballos, ganado vacuno, oveja, cerdos, aves, etc.). En tales ejemplos, una dosis apropiada puede determinarse según el peso corporal del animal. Por ejemplo, puede usarse una dosis de 0,2-1 mg/kg. Alternativamente, la dosis se determina según el área superficial del animal, oscilando una dosis a modo de ejemplo entre 0,1-20 mg/m2, o más preferiblemente, entre 5-12 mg/m2. Para animales pequeños, tales como perros o gatos, una dosis adecuada es 0,4 mg/kg. La proteína de unión a antígeno de CD30L (construida preferiblemente a partir de genes derivados de la especie receptora) se administra mediante inyección u otra vía adecuada una o más veces por semana hasta que se mejora el estado del animal, o puede administrarse de manera indefinida.
Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos llevados a cabo y los resultados conseguidos, se proporcionan solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como que limitan el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Generación de anticuerpos CD30L humanos
Se usó la tecnología XenoMouse™ (Amgen, Thousand Oaks, CA) para desarrollar anticuerpos humanos monoclonales que reconocen e inhiben la actividad de CD30L humano recombinante. Los anticuerpos seleccionados presentaban reactividad cruzada con CD30L humano y de Cynomologous, pero no con CD30L de ratón.
Se examinaron sobrenadantes de hibridoma mediante tecnología de ensayo de microvolumen fluorométrico (FMAT) para la unión a CD30L humano recombinante expresados en células 293T así como se examinaron mediante análisis de clasificación celular actividad por fluorescencia (FAC) para la unión a CD30L humano nativo en células Ramos. En los ensayos FMAT, las placas se recubren con células 293T que expresan CD30L, se añadió sobrenadante de hibridoma y entonces se añadió un anticuerpo anti-Ig humana secundario para la detección por medio de técnicas de ELISA estándar. Los controles negativos eran las células 293T no transfectadas correspondientes que no expresaban CD30L.
Se purificaron los sobrenadantes y se expresaron los anticuerpos recombinantes como constructos IgG1 e IgG2. Los anticuerpos volvieron a examinarse para la unión a CD30L de mono Cynomologous y humano nativo. Brevemente, se incubaron células Ramos de linfoma de Burkitt humano (3x105/pocillo) en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (placas de 96 pocillos Costar® 96 (Corning; Acton, MA) con una titulación (de 10 pg/ml a 3,2 ng/ml de concentración final) de anticuerpos anti-IgG de CD30L en tampón de bloqueo (PBS que contiene azida de sodio al 0,02%, suero de cabra normal al 2% y suero de conejo normal al 1%). Se incluyó la proteína de fusión CD30.Fc humana como control positivo para la unión. Las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C, entonces se lavaron X2 con PBS y se incubaron durante 30 minutos más a 4°C con 30 pl/pocillo de anti-hu IgG-biotina (1:50 en tampón de bloqueo; Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Tras lavar X2 con PBS, las células se incubaron durante 30 minutos a 4°C con 30 pl/pocillo (dilución 1:50 en PBS) de estreptavidina-ficoeritrina (PE; Molecular Probes, Eugene, OR). Las células se lavaron 2X con PBS y se prepararon para el análisis FAC. Los resultados pueden encontrarse en la tabla 5.
Se prepararon células T activadas de Cynomologous aislando células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre de mono Cynomolgus heparinizad mediante centrifugación por densidad sobre Isolymph (2000 rpm durante 20 minutos). Las PBMC se resuspendieron en 25 ml de PBS, se añadieron a 300 pl de una disolución al 50% de eritrocitos de oveja tratados con bromuro de 2-aminoetilisotiouronio (AET) y se centrifugaron a ~700 rpm a 4°C durante 10 minutos. Las células sedimentadas se incubaron a 4°C durante 20 minutos más, se resuspendieron suavemente y se centrifugaron sobre Isolymph. El sobrenadante se retiró hasta el sedimento de células T/eritrocitos. El sedimento se resuspendió entonces en 25 ml de tampón de lisis (cloruro de amonio al 0,85% en agua) y se incubó a 37°C durante 10 minutos. Las células T resultantes se sedimentaron y lavaron x2 en medio de cultivo (medio RPMI-1640 suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10%) y entonces se cultivaron (1x106/ml) a 37°C durante 18 h en presencia de 10 ng/ml de miristato-acetato de forbol (PMA; Sigma Chemicals, St Louis, MO) y 500 ng/ml de ionomicina (Calbiochem, San Francisco, CA). Al final del periodo de cultivo, se contaron las células T de Cynomolgus y se lavaron 1x con PBS y se incubaron con suero de cabra al 2%, suero de conejo al 1% y suero humano al 0,1% en PBS durante 30 minutos a 4°C. Las células se tiñeron entonces con anticuerpos anti-huCD30L tal como se describió anteriormente para células Ramos humanas. Los resultados pueden encontrarse en la tabla 5.
Los anticuerpos también se examinaron para la capacidad de bloquear la unión de CD30L humano a una molécula de CD30.Fc humana soluble. Brevemente, se incubaron células Ramos humanas o células T de mono Cynomolgus activadas, con anti-CD30L IgG a 50 pg/ml en tampón de bloqueo durante 30 minutos a 4°C. Entonces se añadió huCD30.Fc-His soluble a una concentración final de 2,5 ug/ml (30 pl/pocillo) y se incubó durante 30 minutos a 4°C. Las células se lavaron X2 con PBS y se incubaron con 5 pg/ml de un anticuerpo monoclonal anti-His de ratón (30 pl/pocillo en tampón de bloqueo) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Tras lavar X2 con PBS, las células se incubaron con anti-IgG-PE de ratón (1:50 en PBS; BD Pharmingen, San Diego, CA) durante 30 minutos más a 4°C. Las células se lavaron entonces X2 con PBS y se prepararon para el análisis FAC. Los resultados pueden encontrarse en la tabla 5.
Ejemplo 2
Examen funcional de anticuerpo CD30L
Los anticuerpos se caracterizaron para su capacidad de bloquear las interacciones CD30L/CD30 usando dos ensayos de liberación de IL-8. Esto ensayos aprovechan la línea celular de linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) humano Karpas-299 (K299), que expresa CD30 endógeno y libera IL-8 en respuesta a CD30L. Brevemente, se incubaron anticuerpos anti-IgG de CD30L humano purificados con o bien CD30L recombinante (ensayo celular individual) o bien células Ramos que expresan CD30L nativo (ensayo celular doble) y se cultivaron con células K299. Tras un tiempo de incubación definido, los sobrenadantes celulares se recogieron y se analizaron para el contenido de IL-8 usando un ELISA de tipo sándwich para determinar la inhibición de la liberación de IL-8 a partir de células K299 en respuesta a CD30L mediante candidatos de anticuerpo.
Ensayo celular individual
Se titularon anticuerpos anti-IgG de CD30L en diluyen de cultivo (medio RPMI-1640 suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10%) y se pusieron en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo (placa de 96 pocillos Costar® (Corning; Acton, MA) para dar un intervalo de concentraciones finales de desde 1 pg/ml hasta 10 pg/ml. Como control positivo se preparó un anticuerpo monoclonal anti-CD30L humano de ratón tal como se describe en la patente estadounidense n ° 5.480.981. El volumen final de diluyente e IgG de CD30L era de 100 pl/pocillo. A cada pocillo se le añadieron entonces 50 pl de cremallera de isoleucina de CD30L humano recombinante (huCD30L LZ). El constructo huCD30L LZ consiste en el domino extracelular de CD30L humano (véase la patente estadounidense n° 5.480.981) ligado en su extremo N-terminal a un motivo de cremallera de isoleucina modificado reemplazando los residuos leucina por residuos isoleucina. El ensayo celular individual se usó también para determinar la reactividad cruzada con cyno usando un cyno CD30L LZ en lugar del huCD30L LZ. CynoCD30L LZ se preparó tal como se describe para la molécula LZ humana.
Las placas se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. A cada pocillo se le añadieron 50 gl de células K299 (4x105 células/ml). Las placas se incubaron entonces durante 24 horas a 37°C, con el 5% de CO2.
La cantidad de IL-8 en los sobrenadantes celulares se determinó mediante ELISA de tipo sándwich, usando un kit CDCL8/IL-8 ELISA DuoSet según las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Los niveles de IL-8 se interpolaron de la curva patrón de ELISA usando el software DeltaSoft 3 versión 2.2 (DeltaSoft, Inc. Hillsborough, NJ). Todos los resultados se expresan como la media ± error estándar de la media (SEM) para 3 cultivos replicados calculada mediante el software GraphPad PRISM v. 4.01 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) al igual que los valores de CI50. El valor de CI50 derivado usando el huCD30L LZ para el anticuerpo A1 era de 2700 pM. Los resultados usando el cynoCD30L LZ pueden encontrarse en la tabla 5.
Ensayo celular doble
Tal como se describió anteriormente, se titularon anticuerpos anti-IgG de CD30L en diluyente de cultivo y se pusieron en placas de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo para dar un intervalo de concentraciones finales de desde 1 gg/ml hasta 10 pg/ml. El volumen final de diluyente e IgG de CD30L era de 100 gl/pocillo. A cada pocillo se le añadieron 50 gl de células Ramos CD30L+ irradiadas (5000 RADS) (4x106/ml, ATCC). Las células Ramos se sometieron a clasificación FACS para seleccionar aquellas células con el mayor nivel de expresión de CD30L en la superficie celular.
Las placas se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente. A cada pocillo se le añadieron 50 gl de células K299 (4x105 células/ml). Las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C, con el 5% de CO2.
La cantidad de IL-8 en los sobrenadantes de cultivo se determinó mediante un ELISA de tipo sándwich, usando un kit CDCL8/IL-8 ELISA DuoSet según las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). La cantidad de IL-8 y los valores de CI50 se calcularon tal como se describió anteriormente, véase la tabla 5.
Se seleccionaron candidatos de anticuerpo basándose en su capacidad de inhibir la inducción de IL-8 inducida por CD30L en comparación con el control de anticuerpo monoclonal anti-CD30L humano de ratón.
Tabla 5 Tabla de CI50 media (pM) y % de inhibición para anticuerpos CD30L en diversos ensayos funcionales
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Ejemplo 3
Categorización de anticuerpos CD30L mediante competición de unión
La categorización se realizó usando un ensayo de competición de unión en el que un anticuerpo CD30L etiquetado competía con cantidades en exceso de otros anticuerpos CD30L no etiquetados por la unión a rhCD30L. Los anticuerpos que competían entre sí se asignaron a la misma categoría. Los anticuerpos A-F competían entre sí por la unión a rhCD30L.
Ejemplo 4
Determinación de la constante de disociación de equilibrio de las células on (Kd) para anticuerpos CD30L
Se determinó la afinidad de unión de anticuerpos CD30L a CD30L expresado en células Ramos mediante el método FACS Kd. Las células Ramos se cultivaron en medios RMPI1640 FBS al 10% L-glut azida al 0,05%. Se establecieron dos reacciones de equilibrio, en las que los anticuerpos se titularon 1:3 desde 60 nM hasta 338 fM usando medios de cultivo celular y se incubaron con dos concentraciones celulares constantes diferentes (25000 y 250000 células). Las placas se sellaron con parafilm y se incubaron a 37°C, 20 h, agitación. Las placas en equilibrio se centrifugaron y los sedimentos celulares se lavaron dos veces con tampón FACS helado (1X D-PBS+FBS al 2%). Las células se incubaron entonces con un anticuerpo secundario de cabra anti-Fc Cy5 humano (Jackson Immuno Research, West Grove, PA,) y con 7AAD (BD-Biosciences, Rockville, MD) durante 1 h sobre hielo en la oscuridad. Tras la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón FACS helado antes del análisis de citometría de flujo. Los valores GeoMean de FL4 regulados por desplazamiento en la población de células vivas miden el [Ac] unido. Entonces se calculó la inversa de los valores GeoMean que refleja el [Ag] libre teórico en la disolución de equilibrio. Los valores inversos de la lectura GeoMean se usaron en software KinExA para el análisis y el cálculo de Kd para cada anticuerpo. La medida de [Ag] libre se representó gráficamente frente a la concentración de partida del componente de titulación y a partir de estas representaciones gráficas a dos concentraciones celulares diferentes se obtuvo la Kd a partir de ajuste de curva usando el análisis de curva n en software KinExATM Pro. El intervalo de confianza del 95% viene dado como Kd baja y Kd alta.
Como se ve en la tabla 6, los anticuerpos tienen alta afinidad por CD30L expresado en células Ramos. Todos tenían valores de Kd en el intervalo de pM bajo.
Tabla 6 Tabla de tasas de Kd (pM)
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Ejemplo 5
Ensayo de ADCC
Los dominios variables de A1 se acoplaron a un dominio constante de IgG 1 humano (A1 IgG 1). Este anticuerpo se expresó en una línea de células CHO inactivada por Fut-8 dando como resultado un anticuerpo afucosilado, A1 IgG1f.
Se evaluó la destrucción mediada por anticuerpo CD30L de células diana en un ensayo de citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC). La célula Ramos (nivel de expresión de CD30L alto), JD38 (nivel de expresión de CD30L moderado), DS179 (nivel de expresión de CD30L bajo) y EW36 (sin expresión de CD30L) diana, se recogieron y resuspendieron a 2X106 células/ml en medios cRPMI-10 (RPMI (Life Technologies, Carlsberg, CA) suero bovino fetal al 10%). Se añadió calceína-AM, 4 MM en DMSO anhidro (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) hasta una concentración final de 10 pM (dilución 1:400). Las células se incubaron durante 30 minutos a 37°C seguido de dos lavados en PBS (1500 rpm, 5 minutos a 4°C cada uno). Los sedimentos se resuspendieron en cRPMI-10 y se ajustaron hasta una concentración de 0,2 x 106 células/ml puestos sobre hielo para el uso en la siguiente etapa.
En primer lugar se añadieron anticuerpo A1 IgG1 y anticuerpo A1 IgG1f a placas de 96 pocillos de fondo en U (BD, Franklin Lakes, NJ) a una titulación en serie de 10 veces empezando desde 10 ug/ml. Se usó rituximab (Genentech, South San Francisco, CA) como control de anticuerpo positivo. Se añadió anticuerpo A1 (IgG2) como control negativo.
Entonces se añadieron células diana etiquetadas con calceína-AM, descritas anteriormente, a cada pocilio (10.000 células/pocillo) y se incubaron con anticuerpos durante 20 minutos a 37°C. Tras la incubación, a cada pocillo se le añadieron 50 pl de células NK a una concentración de 4 x 106 células/ml y se incubaron durante 4 horas a 37°C. Las células NK se sedimentaron (1500 rpm, 5 minutos a 4°C) y se resuspendieron en cRPMI-10, ajustando la concentración celular a 4x106 células/ml.
Tras controles de incubación, los pocillos se prepararon añadiendo 20 pl/pocillo de NP-40 al 9% (IGEPAL CA 630, Sigma-Aldrich) para estimular una lisis del 100%. Todos los demás pocillos recibieron 20 pl/pocillo de medios cRPMI-10 solos. Las placas se centrifugaron a 800 rpm durante 4 minutos a 4°C. El sobrenadante (150 pl) se retiró y se transfirió a una placa de 96 pocillos negra, de fondo transparente (Corning, Lowell, MA) y se sometió a lectura por fluorescencia en una lector de placas (Molecular Devices, Spectra max GEMINI), excitación 485, emisión 535.
El porcentaje de lisis máxima se calculó como (valor de muestra-lisis espontánea)/ (lisis del 100% - lisis espontánea) * 100
Los resultados de la destrucción mediada por anticuerpo CD30L de las cuatro células diana se muestran en la Figura 1 (A-D). El anticuerpo A1 IgG1 no mediaba en la destrucción celular en ninguna de las células que expresan CD30L (véanse las Figuras 1A-D). El anticuerpo A1 IgG1f inducía la muerte celular tanto en células diana con expresión de CD30L alta (véase la Figura 1A) como en células diana con expresión de CD30L moderada (véase la Figura 1B). El anticuerpo A1 IgG 1 f mediaba con un nivel mayor de agotamiento en células diana con una expresión de CD30L mayor que en células diana con niveles moderados de CD30L (véanse las Figuras 1A y 1B). El anticuerpo A1 IgG1f no mataba las células diana con expresión de CD30L baja (C) o nula (D).
Ejemplo 6
Mapeo de epítopos mediante HX-MS de Acm anti-CD30L
Se evaluaron las regiones de unión a CD30L de anticuerpos anti-CD30L mediante HX-MS para identificar la región o regiones de CD30L humano implicadas en la interacción molecular con los anticuerpos A a F descritos en el presente documento.
Materiales
hCD30L: Se usaron dos versiones diferentes del domino extracelular de hCD30L. His-hCD30L-EC contiene los residuos 63-234 de hCD30L tal como se identifica mediante SEQ ID NO:74 y, como indica el nombre, la proteína se produce con una etiqueta His N-terminal (RnD Systems). FLAG-hCD30L-EC contiene los residuos 66-234 de SEQ ID NO:74 y se obtuvo a partir de células de mamífero con una etiqueta FLAG-His N-terminal.
El ADNc del dominio extracelular de CD30L humano se adquirió de Origene. La etiqueta FLAG-His6 y un sitio de escisión de proteasa TEV se fusionó al extremo N-terminal de la secuencia codificante para los aminoácidos 66-234 mediante una PCR de extensión de dos etapas y se clonó entre los sitios EcoRI y BamHI del plásmido pJSV001 en marco con un péptido señal CD33.
El FLAG-hCD30L-EC usado más adelante incluye una mutación puntual N153Q que elimina una N-glicosilación. El mutante N153Q se generó con el kit de mutagénesis puntual de cambio rápido Qiagen (QIAGEN).
Se usaron células HEK2936E para la producción de proteína. Las células se cultivaron con medio Freestile™ (Gibco) suplementado con 25 ug/ml de Geneticin 418 (Gibco) y F-68 al 0,1% (Gibco). El día de la transfección, las células se mantuvieron a una densidad de 1x106 células/ml y se transfectaron con 293 Fectin (Invitrogen) según la instrucción del fabricante. 24 h tras la transfección, se añadió peptona (Promega) al cultivo hasta una concentración final del 0,5%. Se continuó haciendo crecer las células durante 5 días antes de recoger el sobrenadante.
El sobrenadante de cultivo se recogió mediante centrifugación (15.000 rpmx20 min, 4°C) y entonces limpió mediante la filtración con una membrana de nitrato de celulosa de 0,22 pm. El sobrenadante limpio se aplicó a una columna XK60 de sefarosa quelada con Ni (20ml) (GE healthcare), seguido de un lavado de 10 volúmenes de columna con NaH2PO420 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M. La proteína se eluyó entonces con un volumen de 5 columnas de NaH2PO420 mM pH 7,4, NaCl 0,5 M, imidazol 0,5 M. Las proteínas eluidas se juntaron, se concentraron hasta ~5 ml mediante unidades centrífugas Amicon ultra 15 (10.000 Da MWCO, Millipore) y se cargaron en una columna Hiload 26/60 Superdex 200 de 318 ml (GE Healthcare) para eliminar los agregados y el cambio de tampón a PBS. Tras concentrar se determinaron las concentraciones de proteína final midiendo la absorbancia a 280 nm con un espectrómetro UV NANODROP. La pureza de la proteína se evaluó mediante SDS-PAGE.
Se realizaron desglicosilaciones durante aproximadamente 16 h a 37°C usando 1U PNGaseF (Roche) por 5 ug de hCD30L. La proteína desglicosilada se almacenó a 4C y se usó para experimentos en el plazo de una semana. A todas las proteínas se les cambio el tampón a PBS pH 7,4 antes de los experimentos de HX-MS.
Experimentos de HX-MS
Instrumentación y registro de datos
Los experimentos de HX se realizaron en un sistema UPLC nanoACQUITY con tecnología HDX (Waters Inc.) acoplado a un espectrómetro de masas Synapt G2 (Waters Inc.). El sistema HDX de Waters contenía un robot Leap (H/D-x PAL; Waters Inc.) operado mediante el software LeapShell (Leap Technologies Inc/Waters Inc.), que realizó un inicio de la reacción de intercambio de deuterio, el control del tiempo de reacción, la reacción de extinción, la inyección sobre el sistema UPLC y el control de tiempo de digestión. El robot Leap estaba equipado con dos pilas de temperatura controlada mantenidas a 20°C para el almacenamiento de tampón y las reacciones de HX y se mantuvieron a 2°C para el almacenamiento de proteína y la disolución de extinción, respectivamente. El sistema HDX de Waters contenía además una cámara de temperatura controlada que contenía la precolumna y la columna analítica, y los tubos de LC y válvulas de conmutación a 1°C. Una cámara de temperatura controlada por separado contiene la columna de pepsina a 25°C. Para la digestión con pepsina en línea, se cargaron 100 gl de muestra extinguida que contenía 300 pmol de hCD30L y se hicieron pasar por un cartucho de pepsina inmovilizada Poroszyme® (2,1 x 30 mm (Applied Biosystems)) situado a 25°C usando una tasa de flujo isocrático de 100 gl/min (ácido fórmico al 0,1%:CH3CN 95:5). Los péptidos resultantes se atraparon y se desalaron en una precolumna VanGuard BEH C18 de 1,7 gm (2,1 x 5 mm (Waters Inc.)). Posteriormente, las válvula se conmutaron para poner la precolumna en línea con la columna analítica, UPLC-BEH C18 de 1,7 gm (1 x 100 mm (Waters Inc.)), y los péptidos se separaron usando un gradiente de 9 min del 10-50% de B suministrado a 40 gl/min desde el sistema UPLC nanoAQUITY (Waters Inc.). Las fases móviles consistían en A: ácido fórmico al 0,1% y B: ácido fórmico al 0,1% en CH3CN. Los datos de ESI MS, y los experimentos de energía elevada separada (MSE) se adquirieron en modo de ion positivo usando un espectrómetro de masas Synapt G2 (Waters Inc.). Se usó leucina-encefalina como masa de bloqueo (ion [M+H]+ a m/z 556.2771) y los datos se recogieron en modo continuo (para una descripción adicional, véase Andersen y Faber, Int. J. Mass Spec., 302, 139-148(2011)).
Análisis de datos
Se identificaron péptidos pépticos en experimentos independientes usando métodos MSE estándar en los que los péptidos y fragmentos se alinean adicionalmente utilizando las propiedades de movilidad iónica de Synapt G2 (Waters Inc.). Los datos de MSE se procesaron usando ProteinLynx Global Server versión 2.5 (Waters Inc.). Los archivos de datos sin procesar de HX-MS se procesaron en el software DynamX 2.0 (Waters Inc.). DynamX realiza automáticamente la corrección de masa de bloqueo y la determinación de la incorporación de deuterio, es decir, la determinación de centroides de péptidos deuterados. Además, todos los péptidos se inspeccionaron manualmente para garantizar una asignación de picos y deuteración correcta por parte del software.
Experimento de mapeo de epítopos
El intercambio del hidrógeno de amida/deuterio (HX) se inició mediante una dilución de 6 veces de hCD30L en presencia o ausencia de Acm A, B, C, D, E o F en el tampón deuterado correspondiente (es decir PBS preparado en D2O, 96% de D2O final, pH 7,4 (valor no corregido)). Todas las reacciones de HX se llevaron a cabo a 20°C y contenían hCD30L 6 gM (Mw monomérico usado) en ausencia o presencia de Acm 6,6 gM dando así un exceso molar de 2,2 veces de Acm. A intervalos de tiempo de 0,25, 0,5, 1,3 y 10 minutos, se extinguieron alícuotas de 50 gl de la reacción de HX mediante 50 gl de tampón de extinción helado (TCEP 1,35 M) dando como resultado un pH final de 2,5 (valor no corregido).
Resultados
Proteínas hCD30L
La presencia de glicosilaciones en hCD30L obstaculizarían un análisis de HXMS. Debido a la masa desconocida y la naturaleza a menudo heterogénea de glicosilaciones de proteína, los péptidos pépticos resultantes no pueden identificarse y analizarse en MS. Sin embargo, la eliminación de las glicosilaciones de hCD30L podría crear una secuencia de aminoácidos bien definida adecuada para HXMS como puede identificarse y analizarse en MS.
El dominio extracelular de hCD30L contiene cinco sitos de N-glicosilación potenciales tal como se lista en la primera columna de la tabla 7 a continuación. Se intentó eliminar las glicosilaciones tanto mediante el tratamiento con PNGaseF y mediante mutación puntual para obtener una proteína más adecuada para el análisis de HXMS.
Los análisis de MS y SEC-MALS de His-hCD30L-EC mostraron que cuatro de los cinco sitios de N-glicosilación potenciales de hecho se habían glicosilado (tabla 7; datos no mostrados). Tras tratar esta proteína con PNGaseF en condiciones nativas, solo dos de las glicosilaciones pudieron eliminarse enzimáticamente mediante PNGaseF y por tanto dos N-glicosilaciones permanecieron en la proteína.
Tras tratar FLAG-hCD30L-EC con PNGaseF en condiciones nativas, tanto MS como SEC-MALS demostraron que esta proteína podía desglicosilarse completamente. En conclusión, la mutación N153Q elimina un sitio de Nglicosilación que no podía eliminarse enzimáticamente de His-hCD30L-EC y esta proteína se consideró óptima para HXMS. Un resumen de la evaluación del/de los sitio(s) de glicosilación se incluye en la tabla 7.
Tabla 7: Estados de glicosilaciones en las diferentes versiones de la proteína de hCD30L
Figure imgf000040_0001
Análisis de HX-MS
Tras la reacción de intercambio de deuterio, hCD30L-EC se digirió con pepsina produciendo las regiones de péptido péptico descritas en la tabla 8. La numeración de los residuos de hCD30L sigue la SEQ ID NO 74, sin embargo la etiqueta FLAG-His N-terminal DYKDDDDKHHHHHHENLYFQG no forma parte de la secuencia de hCD30L. El curso de tiempo de HX de 40 péptidos pépticos, que cubren el 83% de la estructura primaria de FLAG-hCD30L-EC se monitorizaron en ausencia o presencia de los Acm A, B, C, D, E o F y los datos se incluyen en la tabla 8.
La secuencia restante no analizada en el presente estudio se cubrió con péptidos pépticos; sin embargo la intensidad de señal era insuficiente para el análisis de datos. El patrón de intercambio observado en los puntos de tiempo tempranos (< 10 min) en presencia o ausencia de los Acm A1, B, C, D, E o F puede dividirse en dos grupos diferentes: un grupo de péptidos pépticos de hCD30L-EC presentan un patrón de intercambio que no se ve afectado por la unión de los Acm. Por el contrario, otro grupo de péptidos en hCD30L muestran protección por el intercambio tras la unión de Acm (tabla 8). En el caso de péptidos pépticos solapantes, se intenta sublocalizar la información de protección de intercambio en residuos o tramos específicos dentro del péptido asumiendo un intercambio de vuelta completo del extremo N-terminal del péptido y el primer enlace peptídico. La protección de intercambio en un péptido es indicativa de que esta región está implicada en la unión de Acm. Por tanto, el epítopo está parcial o completamente ubicado dentro de la región definida por los péptidos específicos. Sin embargo, dado que la resolución de HX-MS se basa en la digestión con pepsina de la proteína deuterada, la protección de intercambio dentro de una región dada no implica que cada residuo dentro de la región definida por los péptidos pépticos esté implicado necesariamente en la unión de Acm.
Mapeo de epítopo de Acm A1
El epítopo del Acm A1 se mapeó en cuatro experimentos diferentes usando FLAG-hCD30L-EC tres veces y usando His-hCD30L-EC una vez. Ambas proteínas se trataron con PNGaseF antes de los experimentos de HX-MS. Los desenlaces de estos estudios eran muy similares independientemente de la proteína de hCD30L usada y todos proporcionaron la misma información de epítopo. Sin embargo, la cobertura de secuencia era obviamente menor en el experimento de His-hCD30L-EC debido a la ausencia de péptidos detectables en las regiones glicosiladas.
La señal de epítopo para el Acm A1 se observó en la región N-terminal de hCD30L (tabla 8) hasta el residuo Cys88. La protección de intercambio se volvió más fuerte cuanto más se extendían los péptidos extended desde los puntos de partida (residuos 45, 62 o 66), indicando así protección de intercambio en la región más C-terminal de los péptidos y también en el residuo 88. Por el contrario, los péptidos 45-65, 45-81 y 66-81 no mostraron protección de intercambio. Además, el residuo D81 es el sitio de glicosilación en el que N glicosilado se vuelve D tras la acción de PNGaseF. Por tanto, N/D81 probablemente no está implicado en la unión de Acm. Por tanto, la señal de epítopo parece surge de residuos dentro de la región 82-88 CSEDLLC.
La señal de epítopo para el Acm A1 también se observó en la región C-terminal de hCD30L (tabla 8) en seis péptidos diferentes que cubren la región F211 a S226. Basándose en el nivel de protección de intercambio observado, todas las partes de la región parecen estar implicadas en la unión o verse afectadas por la unión del Acm A en mayor o menor medida. Las regiones unidas mediante el anticuerpo se marcan con fuente en negrita en la tabla 8.
En conclusión, las regiones de hCD30L implicadas en la unión del Acm A se detectan como región 82-88 CSEDLLC y región 211-226 FQYIDTSTFPLENVLS.
Mapeo de epítopos de Acm B, C, D, E y F
Los epítopos de los Acm B, C, D, E y F se mapearon usando FLAG-hCD30L-EC tratado con PNGaseF antes de los experimentos de HX-MS. Los resultados de epítopos de estos estudios eran muy similares al Acm A (tabla 8) también con respecto a la magnitud de la protección de intercambio. El mapeo de epítopo en el Acm E se realizó dos veces, mientras que A, B, C y D se mapearon una vez cada uno.
Tabla 8: Análisis de HXMS de hCD30L humano que proporciona información de epítopo para las moléculas de anticuerpo A-F
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
En conclusión, las regiones de hCD30L implicadas en la unión de los Acm B, C, D, E y F son similares a las regiones implicadas en la unión del Acm A1 y se detectan como región 82-88 CSEDLLC y región 211-226 FQYIDTSTFPLENVLS.
Ejemplo 7
Categorización de anticuerpos CD30 L usando un A-Fab anti-CD30L inmovilizado
Se categorizaron por epítopo anticuerpos monoclonales anti-CD30L humano en un Biacore T200 (GE Healthcare 28­ 9750-01) usando un enfoque de tipo sándwich clásico.
Para reducir el impedimento estérico, el anticuerpo inmovilizado se usó en formato monovalente. Para determinar si la región de unión a antígeno de los anticuerpos anti-hCD30L se unían a epítopos solapantes, se sometió a prueba la capacidad de los anticuerpos A-F de unirse a CD30L ya unido mediante el Fab de anticuerpo A1.
Pueden obtenerse fragmentos Fab digiriendo anticuerpos completos con papaína que escinde aguas arriba de las cisteínas de la región bisagra o mediante la expresión recombinante de las regiones variables de cadena pesada y ligera. El fragmento Fab de anti-hCD30L A1 (A1 -Fab) se preparó usando papaína inmovilizada en presencia de cisteína para escindir enzimáticamente la IgG completo justo por encima de la región bisagra creando dos fragmentos Fab y un fragmento Fc por molécula de anticuerpo. El Fab se separó del Fc usando cromatografía de afinidad con proteína A y entonces se cambió el tampón a PBS. El procedimiento se realizó según las instrucciones del fabricante (kit de preparación Pierce Fab n ° 44985, US).
El Fab anti-CD30L humano (Fab de anticuerpo A1) se inmovilizó y el trímero CD30L-His10 humano (R&D Systems 1028-CL) se capturó en el mismo. Posteriormente se inyectó A-F anti-hCD30L soluble. La unión del segundo anticuerpo implica que los dos anticuerpos están en diferentes categorías de epítopo.
A1 -Fab anti-hCD30L se diluyó hasta 40 pg/ml en tampón acetato 10 mM, pH 5,0 y amina acoplada a un chip CM5 (GE healthcare BR-1000-12, BR-1000-50) hasta un nivel de 3566 RU, usando procedimientos estándar. El trímero CD30L-His10 humano (R&D Systems 1028-Cl ) se diluyó hasta 10 nM en HBS-P+ (GE healthcare BR-1006-71) y se inyectó sobre la superficie de A-Fab para capturar ~175 RU de CD30L. El segundo anticuerpo se inyectó a 75 nM sobre el hCD30L capturado. Los controles incluían la captura nula (tampón solo) e inyecciones de tampón en lugar de anticuerpo soluble. Todos los experimentos se realizaron a 25°C.
El recubrimiento de hCD30L con A-FAB bloqueó la unión de un subgrupo de los anticuerpos A-F. Los controles usando A-Fab y A se bloquearon ambos tal como se esperaba. Además, también se impidió que los anticuerpos F y B se unieran al hCD30L capturado, mientras que los anticuerpos E, C y D eran capaces de unirse a hCD30L, demostrando que su epítopo de unión puede distinguirse del epítopo de unión de A, B y F. En conclusión, los anticuerpos A, F y B compiten con el Fab de anticuerpo A1 por la unión a hCD30L.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> AMGEN Inc.
Novo Nordis A/S
<120> PROTEÍNAS DE UNIÓN A ANTÍGENO DE LIGANDO CD30
<130> 8679,204-WO
<160> 75
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1
<211 > 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Thr Gly Thr Ser Ser Asp val Gly val Tyr Asp Tyr val Ser 1 5 10
<210 > 2
<211 > 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Leu Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10
<210 > 3
<211 > 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Thr Gly Thr Ser Ser Asp l i e Gly Leu Tyr Asp Tyr val Ser 1 5 10
<210 > 4
<211 > 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Thr Gly Thr Ser Ser Asp l i e Gly Leu Tyr Asn Tyr val Ser 1 5 10
<210 > 5
<211 > 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Thr Gly Ser Ser Ser Asp l i e Gly Thr Tyr Asn Tyr val Ser 1 5 10
<210 > 6
<211 > 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Thr G ly Thr Ser Ser Asp Val G ly Leu Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10
<210>7
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Glu v a l Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210 > 8
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Glu Val Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210 > 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Glu v a l l i e Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser
1 5
<210> 11
<211 > 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ser Ser Tyr Thr Ser Arg Ser Thr T rp va l
1 5 10
<210> 12
<211 > 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr T rp va l
1 5 10
<210> 13
<211 > 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Ser Thr Trp val
1 5 10
<210> 14
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ser Tyr l i e Trp Ser
1 5
<210> 15
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ser Tyr Tyr Trp Thr
1 5
<210> 16
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
S e r T y r S e r T r p S e r
1 5
<210> 17
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Asn Asn T y r T r p S e r
1 5
<210> 18
<211>5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
S e r T y r T y r T r p S e r
1 5
<210> 19
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Arg l i e Tyr Ala Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
< 210 > 20
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Arg l i e Tyr Ala Ser Gly Gln Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 21
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Arg l i e Tyr Thr Ser Gly l i e Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 22
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Arg Thr Ser Thr Ser Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 23
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Arg val Tyr Ser Ser Gly Leu Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15
<210> 24
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Arg l i e Phe Ala Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15
<210> 25
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Asp Tyr Arg val Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Leu Asp val 1 5 10 15
<210> 26
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Glu Arg Val Val Gly Ala Ser Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Val Asp Val 1 5 10 15
<210> 27
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Asp Phe Thr l i e Ala Ala Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp val 1 5 10 15
<210> 28
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Glu Arg Ala Thr Val Thr Thr Arg Tyr His Tyr Asp Gly Met Asp Val 1 5 10 15
<210> 29
<211 > 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Glu Arg val Gly val Gln Asp Tyr Tyr His Tyr Ser Gly Met Asp val 1 5 10 15
<210> 30
<211 > 14
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SECUENCIA CONSENSO
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (3)..(3)
<223> XAA PUEDE SER THR O SER
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (7)..(7)
<223> XAA PUEDE SER VAL O ILE
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (9)..(9)
<223> XAA PUEDE SER VAL, THR O LEU
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (11)..(11)
<223> XAA PUEDE SER ASP O ASN
<400> 30
Thr Gly Xaa Ser Ser Asp Xaa Gly Xaa Tyr Xaa Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SECUENCIA CONSENSO
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (3)..(3)
<223> XAA PUEDE SER SER, ASN O ILE
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (4)..(4)
<223> XAA PUEDE SER ASN O LYS
<400> 31
Glu val xaa xaa Arg Pro Ser
1 5
<210> 32
<211 > 10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SECUENCIA CONSENSO
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (4)..(4)
<223> XAA PUEDE SER THR O SER
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (6)..(6)
<223> XAA PUEDE SER ARG O SER
<400> 32
Ser Ser Tyr Xaa Ser Xaa Ser Thr Trp Val 1 5 10
<210> 33
<211>5
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SECUENCIA CONSENSO
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (1)..(1)
<223> XAA PUEDE SER SER O ASN
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (2)..(2)
<223> XAA PUEDE SER TYR O ASN
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (3)..(3)
<223> XAA PUEDE SER ILE, TYR O SER
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (5)..(5)
<223> XAA PUEDE SER THR O SER
<400> 33
Xaa Xaa Xaa Trp Xaa
1 5
<210> 34
<211 > 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> SECUENCIA CONSENSO
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (2)..(2)
<223> XAA PUEDE SER ILE, VAL O THR
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (3)..(3)
<223> XAA PUEDE SER TYR, PHE O SER
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (4)..(4)
<223> XAA PUEDE SER THR, SER O ALA
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (7)..(7)
<223> XAA PUEDE SER ILE, LEU, ASN, SER, ARG O GLN
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (8)..(8)
<223> XAA PUEDE SER THR O ASN
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (11)..(11)
<223> XAA PUEDE SER ASN O LYS
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (15) ..(15)
<223> XAA PUEDE SER LYS O ARG
<400> 34
Arg xaa xaa xaa Ser Gly xaa xaa Asn Tyr xaa Pro Ser Leu xaa Ser 1 5 10 15
<210> 35
<211 > 16
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
< 220 >
<223> SECUENCIA CONSENSO
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (1) .. (1)
<223> XAA PUEDE SER GLU O ASP
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (2)..(2)
<223> XAA PUEDE SER ARG, THR O PHE
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (3)..(3)
<223> XAA PUEDE SER VAL, ALA, ARG O THR
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (4)..(4)
<223> XAA PUEDE SER VAL, THR, GLY O ILE
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (5)..(5)
<223> XAA PUEDE SER VAL, ALA O GLY
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (6)..(6)
<223> XAA PUEDE SER ALA, THR, GLY O GLN
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (7)..(7)
<223> XAA PUEDE SER THR, ASP, ARG O SER
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (8)..(8)
<223> XAA PUEDE SER ARG O TYR
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (10)..(10)
<223> XAA PUEDE SER THR O HIS
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (12) ..(12)
<223> XAA PUEDE SER THR ASP O SER
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (14) ..(14)
<223> XAA PUEDE SER MET, LEU O VAL
<400> 35
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Tyr Xaa Gly Xaa Asp Val 1 5 10 15
<210> 36
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 36
G ln S er A l a Leu T h r G ln Pro Al a S e r V a l S e r G ly S e r Pro G ly G ln
1 5 10 15
S e r l i e T h r l i e S er Cys T h r G ly T h r S e r S e r Asp V a l G ly V a l T y r
20 25 30
Asp T y r V a l S e r T rp T y r G ln G ln Hi S Pro G ly Lys A l a Pro Lys Leu
35 40 45
Met l i e T y r G lu V a l S e r Asn A rg Pro S e r G ly V a l S e r Asn A rg Phe
50 55 60
S e r G ly S e r Lys S er G ly Asn T h r A l a S e r Leu T h r l i e S e r G ly Leu
65 70 75 80
G ln T h r G lu Asp G lu A l a Asp T y r T y r Cys S e r S e r T y r T h r S e r A rg
85 90 95
S e r T h r T rp v a l Phe G ly G ly G ly T h r Lys Leu T h r V a l Leu
100 105 110
<210> 37
<211 > 326
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 37
tgac tcagcc tg c c tc c g tg tc tg g g tc tc c tggacag tc g a tca cca tc 60 gaaccagcag tg a c g ttg g t g t t ta tg a c t a tg tc tc c tg g ta tcaacag 120 aagcccccaa a c tc a tg a t t ta tg a g g tc a g taa tcggcc c tc a g g g g tt 180 tc tc tg g c tc caag tc tggc aacacggcct ccc tg acca t c tc tg g g c tc 240 acgaggctga t ta t ta c tg c a g c tc a ta ta caagcaggag c a c ttg g g tg 300
Figure imgf000051_0001
ggaccaagct gaccgt 326 <210> 38
<211 > 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
G ln S e r A l a Leu T h r G ln P ro A l a S e r V a l S e r G ly S e r Pro G ly G ln
1 5 10 15
S e r l i e T h r l i e S e r Cys T h r G ly T h r S e r S e r Asp V a l G ly Leu T y r
20 25 30
Asn T y r V a l S e r T rp T y r G ln G ln Hi s Pro Asp Lys A l a Pro Lys Leu
35 40 45
Met l i e Phe G lu V a l Asn Asn A rg Pro S e r G ly V a l S e r Asn A rg Phe
50 55 60
S e r G ly S e r Asn S er G ly Asn T h r A l a S e r Leu T h r l i e S e r G ly Leu
65 70' 75 80
G ln A l a G lu Asp G lu A l a Asp T y r T y r Cys S e r S e r T y r T h r S e r S er
85 90 95
S e r T h r T rp V a l Phe G ly G ly G ly T h r Lys Leu T h r V a l Leu
100 105 110
<210> 39
<211 > 330
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 39
ca g tc tg ccc tg ac tcag cc tg c c tc c g tg tc tg g g tc tc c tggacag tc ga tca cca tc 60
tc c tg c a c tg gaaccagcag tg a c g ttg g t c t t t a ta a c t a tg tc tc c tg gtaccaacag 120
cacccagaca aagcccccaa a c tc a tg a t t t t tg a g g tc a a taa tcggcc c tc a g g g g tt 180
tc ta a tc g c t tc tc tg g c tc caac tc tgg c aacacggcct ccc tg a cca t c tc tg g g c tc 240
caggctgagg acgaggctga t t a t ta c tg c a g c tc a ta ta caagcagcag c a c ttg g g tg 300
ttcggcggag ggaccaagtt g a ccg tcc ta 330
<210> 40
<211 > 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
G ln S er A l a Leu T h r G ln Pro Al a S e r V a l S e r G ly S e r Pro G ly G ln
1 5 10 15
S e r l i e T h r l i e S er Cys T h r G ly T h r S e r S e r Asp l i e G ly Leu T y r
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
S e r G ly S e r Asn S er G ly Asn T h r A l a S e r Leu T h r l i e S e r G ly Leu
65 70 75 80
G ln Al a G lu Asp G lu Al a Asp T y r T y r Cys S e r S e r T y r T h r S e r S er
85 90 95
S e r T h r T rp V a l Phe G ly G ly G ly T h r Lys Leu T h r V a l Leu
100 105 110
<210> 41
<211 > 326
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 41
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<211 > 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
G ln S er A l a Leu T h r G ln Pro Al a S e r V a l S e r G ly S e r Pro G ly G ln
1 5 10 15
S e r l i e T h r l i e S er Cys T h r G ly T h r S e r S e r Asp l i e G ly Leu T y r
20 25 30
Asn T y r V a l S e r T rp T y r G ln G ln Hi S Pro G ly Lys A l a Pro Lys Leu
35 40 45
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50 55 60
S e r G ly S e r G lu S er G ly Asn T h r A l a S e r Leu T h r l i e S e r G ly Leu
65 70 75 80
G ln A l a G lu Asp G lu A l a Asn T y r T y r Cys S e r S e r T y r T h r S e r S er
85 90 95
S e r T h r T rp V a l Phe G ly G ly G ly T h r Lys Leu T h r V a l Leu
100 105 110
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<211 > 330
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 43
ca g tc tgccc tgac tcagcc tg c c tc c g tg tc tg g g tc tc c tggacag tc g a tca cca tc 60 tc c tg c a c tg gaaccagcag tg a c a ttg g t c t t t a ta a c t a tg tc tc c tg gtaccaacag 120 cacccaggca aagcccccaa a c tc a ta a t t ta tg a g g tc a tta a tc g g c c c tc a g g g g tt 180 tc ta a tc g c t tc tc tg g c tc cgag tc tggc aacacggcct ccc tg acca t c tc tg g a c tc 240 caggctgagg acgaggctaa t ta t ta c tg c a g ttc a ta ta caagcagcag c a c ttg g g tg 300 ttcggcggag ggaccaagct gaccg tcc tg 330 <210> 44
<211 > 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
< 400 > 44
G ln S er A l a Leu T h r G ln Pro Al a S e r V a l S e r G ly S e r Pro G ly G ln
1 5 10 15
S e r l i e T h r l i e S er Cys T h r G ly S e r S e r S e r Asp l i e G ly T h r T y r
20 25 30
Asn T y r V a l S e r T rp T y r G ln G ln T y r Pro G ly Lys A l a Pro G lu Leu
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Met l i e T y r G lu V a l Asn Asn A rg Pro S e r G ly V a l S e r Asp A rg Phe
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S e r G ly S e r T h r S er G ly Asn T h r A l a S e r Leu T h r l i e S e r G ly Leu
65 70 75 80
G ln A l a Asn Asp G lu A l a Asp T y r T y r Cys S e r S e r T y r S e r S e r S er
85 90 95
S e r T h r T rp V a l Phe G ly G ly G ly T h r Lys Leu T h r V a l Leu
100 105 110
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
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ca g tc tgccc tgac tcagcc tg c c tc c g tg tc tg g g tc tc c tggacag tc g a tca cca tc 60 tc c tg c a c tg gaagcagcag tg a c a ttg g t a c t ta ta a c t a tg tc tc c tg gtaccaacag 120 tacccaggca aagcccccga a c tc a tg a t t ta tg a g g tc a a taa tcggcc c tc a g g g g tt 180 tc tg a tc g c t tc tc tg g c tc ca cg tc tgg c aa tacggcct ccc tg acca t c tc tg g g c tc 240 caggctaacg acgaggctga t ta t ta c tg c a g c tc a ta t t caagcagcag c a c ttg g g tg 300 ttcggcggag ggactaagct gaccgt 326 <210> 46
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
G ln S er A l a Leu T h r G ln Pro Al a S e r V a l S e r G ly S er Pro G ly G ln
1 5 10 15
S er l i e T h r l i e S er Cys T h r G ly T h r S er S e r Asp V a l G ly Leu T y r
20 25 30
Asn T y r V a l S er T rp T y r G ln G ln G ln Pro G ly Lys Al a Pro Lys Leu
35 40 45
Met l i e T y r G lu V a l S e r Lys A rg Pro S er G ly V a l S er Asn A rg Phe
50 55 60
S er G ly S e r T h r S er G ly Asn T h r A l a S er Leu T h r l i e S e r G ly Leu
65 70 75 80
G ln Al a Asp Asp G lu A l a Asp T y r S e r Cys S e r S er T y r T h r S er S er
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S er T h r T rp V a l Phe G ly G ly G ly T h r Lys Leu T h r V a l Leu
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c a g t c t g c c c t g a c t c a g c c t g c c t c c g t g t c t g g g t c t c c t g g a c a g t c g a t c a c c a t c 60 t c c t g c a c t g g a a c ta g c a g t g a c g t t g g t c t t t a t a a c t a t g t c t c c t g g ta c c a a c a g 120 c a g c c a g g c a a a g c c c c c a a a c t c a t g a t t t a t g a g g t c a g ta a g c g g c c c t c a g g a g t t 180 t c t a a t c g c t t c t c t g g c t c c a c g t c t g g c a a c a c g g c c t c c c t g a c c a t c t c t g g g c t c 240 c a g g c tg a c g a c g a g g c tg a t t a t t c c t g c a g c t c a t a t a c a a g c a g c a g c a c t t g g g t c 300 t tc g g c g g a g g g a c c a a g c t ga 322 <210> 48
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
G ln V a l G ln Leu G ln G lu S e r G ly P ro G ly Leu V a l Lys Pro S e r G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
l i e T rp S e r T rp l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G lu T rp l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r A l a S er G ly Asn T h r Asn T y r Asn Pro S e r Leu Lys
50 55 60
S e r A rg V a l T h r l i e S er V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r Met T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys A l a
85 90 95
A rg Asp T y r A rg V a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
100 105 110
V a l T rp G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S e r S e r
115 120
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<211 > 372
5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 49
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<211 > 124
<212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400> 50
G ln V a l G ln Leu G ln G lu S e r G ly P ro G ly Leu V a l Lys Pro S e r G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
l i e T rp S e r T rp l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G lu T rp l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r A l a S er G ly Asn T h r Asn T y r Asn Pro S e r Leu Lys
50 55 60
S e r A rg V a l T h r Met S er V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r Met T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys A l a
85 90 95
A rg Asp T y r A rg V a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
100 105 110
V a l T rp G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S e r S e r
115 120
<210> 51
<211 > 372
5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 51
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<211 > 124
<212> PRT
5 <213> Homo sapiens
<400> 52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser G ly Pro G ly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
l i e T rp S e r T rp l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G lu T r p l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r A l a S er G ly Asn T h r Asn T y r Asn P ro S e r Leu Lys
50 55 60
S e r A rg V a l T h r Met S er V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r V a l T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys A l a
85 90 95
A rg Asp T y r A rg V a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
100 105 110
V a l T rp G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S e r S e r
115 120
<210> 53
<211 > 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 53
c a g g tg c a g c t g c a g g a g t c g g g c c c a g g a c t g g t g a a g c c t t c g g a g a c c c t g t c c c t c 60
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c c c t c c c t c a a g a g t c g a g t c a c c a t g t c a g t a g a c a c g t c c a a g a a c c a g t t c t c c c t g 240
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a c c g t c t c c t ca 372
<210> 54
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
G ln v a l G ln Leu G ln G lu S e r G ly P ro G ly Leu v a l Lys Pro S e r G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r v a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
l i e T rp S e r T rp l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G"lu T r p l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r Al a S e r G ly G ln T h r Asn T y r Asn Pro S e r Leu Lys
50 55 60
S er A rg V a l T h r Met S e r V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r Met T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys A l a
85 90 95
A rg Asp T y r A rg V a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
100 105 110
V a l T rp G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S e r S e r
115 120
<210> 55
<211> 366
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 55
tggtg aagccttcgg agaccc tg tc cc tc a c c tg c 60
Figure imgf000059_0001
g tta c a tc tg g a g c t ggatccggca gcccgccgga 120 a g tg ga ttg g g c g ta tc ta t gccagtgggc aaaccaacta caacccctcc 180 gag tcacca t g tcag tagac acgtccaaga a c c a g ttc tc cc tgaagctg 240 ccgccgcgga cacggccgta ta t ta c tg tg cgagagatta ta g g g tg g c t 300
Figure imgf000059_0002
a c ta c ta c ta c g g tttg g a c g tc tggggcc aagggaccac g g tcaccg tc 360 t c c t c a 366 <210> 56
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
G ln V a l G ln Leu G ln Glu S er G ly Pro G ly Leu V a l Lys Pro S er G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S er l i e S er S er T y r
20 25 30
l i e T r p S e r T rp l i e A rg Gln Pro A l a G ly Lys G ly Leu Glu T rp l i e
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G ly A rg l i e T y r A l a S er G ly G ln T h r Asn T y r Asn P ro S e r Leu Lys
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S er A rg V a l T h r l i e S er V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
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Lys Leu S e r S e r V a l T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys A l a
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A rg Asp T y r A rg v a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
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V a l T r p G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r v a l S e r S er
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<211 > 366
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 57
tgg tg aagccttcgg agaccc tg tc cc tc a c c tg c 60
Figure imgf000060_0001
g tta c a tc tg g a g c t ggatccggca gcccgccgga 120 a g tg ga ttg g g c g ta tc ta t gccagtgggc aaaccaacta caacccctcc 180 gag tcacca t a tcag tagac acgtccaaga a c c a g ttc tc cc tgaagctg 240 ccgccgcgga cacggccgta ta t ta c tg tg cgagagatta ta g g g tg g c t 300
Figure imgf000060_0002
a c ta c ta c ta c g g tttg g a c g tc tggggcc aagggaccac g g tca ccg tc 360 tc c tc a 366 <210> 58
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
G ln V a l G ln Leu G ln G lu S er G ly Pro G ly Leu V a l Lys P ro S e r G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
l i e T r p S e r T r p l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G lu T r p l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r Al a S er G ly Asn T h r Asn T y r Asn Pro S e r Leu Lys
50 55 60
S er A rg V a l T h r l i e S er V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r V a l T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys A l a
OOJ C nn nr
A rg Asp T y r A rg V a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
100 105 110
V a l T rp G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S e r S er
115 120
<210> 59
<211 > 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 59
c a g g tg c a g c t g c a g g a g t c g g g c c c a g g a c t g g t g a a g c c t t c g g a g a c c c t g t c c c t c 60 a c c t g c a c t g t c t c t g g t g g c t c c a t c a g t a g t t a c a t c t g g a g c t g g a t c c g g c a g c c c 120 g ccg g aaag g g a c t g g a g t g g a t t g g g c g t a t c t a t g c c a g tg g g a a c a c c a a c t a c a a c 180 c c c t c c c t c a a g a g t c g a g t c a c c a t a t c a g t a g a c a c g t c c a a g a a c c a g t t c t c c c t g 240 a a g c t g a g c t c t g t a a c c g c cg c g g a c a c g g c c g t a t a t t a c t g t g c g a g a g a t t a t a g g 300 g t g g c t g g c a c t t a c t a c t a c t a c t a c g g t t t g g a c g t c t ggg g ccaag g g a c c a c g g tc 360 a c c g t c t c c t ca 372 <210> 60
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
G ln V a l G ln Leu G ln G lu S er G ly Pro G ly Leu V a l Lys P ro S e r G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
l i e T rp S e r T rp l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G lu T r p l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r Al a S er G ly G ln T h r Asn T y r Asn Pro S e r Leu Lys
50 55 60
S er A rg V a l T h r l i e S er V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r Met T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys Al a
85 90 95
A rg Asp T y r A rg V a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
100 105 110
V a l T rp G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S er S er
115 120
<210> 61
<211 > 379
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 61
caga tg tcag g tgcagctgc aggagtcggg cccaggactg g tg a a g c c tt cggagaccct 60 g tccc tca cc tg c a c tg tc t c tg g tg g c tc c a tc a g ta g t ta c a tc tg g a gc tgga tccg 120 gcagcccgcc ggaaagggac tg g a g tg g a t tg g g c g ta tc ta tg c c a g tg ggcaaaccaa 180 ctacaacccc tccc tca a ga g tcgag tcac c a ta tc a g ta gacacgtcca agaaccagtt 240 c tccc tgaag c tg a g c tc ta tgaccgccgc ggacacggcc g ta ta t t a c t gtgcgagaga 300 tta ta g g g tg g c tg g c a c tt a c ta c ta c ta c ta c g g t t tg gacg tc tggg gccaagggac 360 cacggtcacc g tc tc c tc a 379 <210> 62
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
G ln V a l G ln Leu Gl n G lu S er G ly P ro G ly Leu V a l Lys Pro S e r G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
l i e T r p S e r T r p l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G lu T r p l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r A l a S e r G ly Gln T h r Asn T y r Asn P ro S e r Leu Lys
50 55 60
S er A rg V a l T h r M et S e r V a l Asp T h r S er Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r V a l T h r A l a Al a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys Al a
85 90 95
A rg Asp T y r A rg V a l A l a G ly T h r T y r T y r T y r T y r T y r G ly Leu Asp
100 105 110
V a l T rp G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S e r S e r
115 120
<210> 63
<211 > 379
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 63
c a g a t g t c a g g tgcagctgc aggagtcggg cccaggactg g tg a a g c c tt cggagaccct 60 g t c c c t c a c c tg c a c tg tc t c tg g tg g c tc c a tc a g ta g t ta c a tc tg g a gc tgga tccg 120 g c a g c c c g c c ggaaagggac tg g a g tg g a t tg g g c g ta tc ta tg c c a g tg ggcaaaccaa 180 c t a c a a c c c c tccc tca a ga g tcgag tcac c a tg tc a g ta gacacgtcca agaaccagtt 240 c t c c c t g a a g c tg a g c tc tg taaccgccgc ggacacggcc g ta ta t t a c t gtgcgagaga 300 t t a t a g g g t g g c tg g c a c tt a c ta c ta c ta c ta c g g t t tg gacg tc tggg gccaagggac 360 c a c g g tc a c c g tc tc c tc a 379 <210> 64
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
G ln V a l G ln Leu G ln G lu S e r G ly P ro G ly Leu V a l Lys Pro S e r G lu
1 5 10 15
T h r Leu S e r Leu T h r Cys T h r V a l S e r G ly G ly S e r l i e S e r S e r T y r
20 25 30
T y r T rp T h r T rp l i e A rg G ln Pro A l a G ly Lys G ly Leu G lu T rp l i e
35 40 45
G ly A rg l i e T y r T h r S er G ly l i e T h r Asn T y r Asn Pro S e r Leu Lys
50 55 60
S e r A rg V a l T h r Met S er V a l Asp T h r S e r Lys Asn G ln Phe S e r Leu
65 70 75 80
Lys Leu S e r S e r V a l T h r A l a A l a Asp T h r A l a V a l T y r T y r Cys A l a
85 90 95
A rg G lu A rg V a l V a l G ly A l a S e r A rg T y r T y r T y r T y r G ly V a l Asp
100 105 110
V a l T r p G ly G ln G ly T h r T h r V a l T h r V a l S er S e r
115 120
<210> 65
<211 > 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 65
tgcaggagtc gggcccagga ctgg tgaagc cttcggagac c c tg tc c c tc 60 ggacctggat ccggcagccc 120 gactggagtg g a ttg g g c g t a tc ta ta c c a g tggaatcac caactacaa t 180 agagtcgcgt ca cca tg tca gtagacacg t ccaagaacca g t tc tc c c tg 240
Figure imgf000064_0001
c tg tgaccgc cgcggacacg g c c g tg ta t t actg tgcgag agagcgggta 300 ggggccaagg gaccacggtc 360
Figure imgf000064_0002
372
<210> 66
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Figure imgf000064_0003
<210> 67
<211 > 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 67
tgcaggagtc gggcccagga ctgg tgaagc cttcggagac c c tg tc c c tc 60 ggacctggat ccggcagccc 120 gactggagtg g a ttg g g c g t a tc ta ta c c a g tggaatcac caactacaa t 180 agagtcgcgt ca cca tg tca gtagacacg t ccaagaacca g t tc tc c c tg 240 c tg tgaccgc cgcggacacg g c c g tg ta t t actg tgcgag agagcgggta 300 ggggccaagg gaccacggtc 360
Figure imgf000064_0004
372
< 210 > 68
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser l i e Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Trp Ser Trp l i e Arg Gln Pro A la Gly Lys Gly Leu Glu Trp l i e
35 40 45
Gly Arg Thr Ser Thr Ser Gly Arg Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Val Thr A la A la Asp Thr A la Val Tyr Tyr Cys A la
85 90 95
Arg Asp Phe Thr l i e A la A la Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211 > 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 69
caggtgcagt tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactcct ggagctggat ccggcagccc 120 gccgggaagg gactggagtg gattgggcgt accagtacca gtgggagaaa caactacaac 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agatttcact 300 atagcagctc gtcgctacta ctactacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 70
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser l i e Thr Asn Asn
20 25 30
Tyr T rp Ser T rp l i e Arg Gln Pro Al a Gly Lys Gly Leu Glu T rp l i e
35 40 45
Gly Arg Val Tyr Ser Ser Gly Leu Thr Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Asn Ser Val Thr Al a Al a Asp Thr Al a Val Tyr Tyr Cys Al a
85 90 95
Arg Glu Arg A la Thr Val Thr Thr Arg Tyr Hi s Tyr Asp Gly Met Asp
100 105 110
Val T rp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211 > 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 71
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccaaga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcact aataactact ggagctggat ccggcagccc 120 gccgggaagg ggctggagtg gattgggcgt gtctatagta gtggactcac caactacaag 180 ccctccctca agagtcgagt caccatgtca gtagacacgt ccaagaacca attctccctg 240 aggttgaact ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag agagagggca 300 acagtaacta cgaggtacca ctacgacggt atggacgtct ggggccaagg gacctcggtc 360 accgtctcct ca 372 <210> 72
<211 > 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 72
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser l i e Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr T rp Ser T rp l i e Arg Gln Pro Al a Gly Lys Gly Leu Glu T rp l i e
35 40 45
Gly Arg l i e Phe Al a Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Al a Al a Asp Thr Al a Val Tyr Tyr Cys Al a
85 90 95
Lys Glu Arg Val Gly Val Gln Asp Tyr Tyr Hi s Tyr Ser Gly Met Asp
100 105 110
Val T rp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 73
<211> 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 73
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acttgcactg tctctggtgg ctccatcagt agttactact ggagctggat ccggcagccc 120
gccgggaagg gactggagtg gattgggcgc atctttgcca gtgggagcac caactacaac 180
ccctccctca ggagtcgagt caccatgtca agagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagtt ctgtgaccgc cgcggacacg gccgtttatt actgtgcgaa agaaagggtg 300
ggagtacagg attactacca ctattccggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 74
<211 > 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (1) ..(37)
<223> Citoplásmica
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (38)..(62)
<223> Transmembrana
<220>
<221 > CARACTERÍSTICA_MISC
<222> (63)..(234)
<223> Extracelular
<400> 74
Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln A la Leu Asn Gly Met A la Pro Pro Gly 1 5 10 15
Asp Thr A la Met His Val Pro A la Gly Ser Val A la Ser His Leu Gly 20 25 30
Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr A la Thr Leu A la Leu 35 40 45
Cys Leu Val Phe Thr Val A la Thr l i e Met Val Leu Val Val Gln Arg 50 55 60
Thr Asp Ser l i e Pro Asn Ser Pro Asp Asn val Pro Leu Lys Gly Gly 65 70 75 80
Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys l i e Leu Lys Arg A la Pro Phe Lys 85 90 95
Lys Ser Trp A la Tyr Leu Gln Val A la Lys His Leu Asn Lys Thr Lys 100 105 110
Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly l i e Leu His Gly val Arg Tyr Gln Asp 115 120 125
Gly Asn Leu val l i e Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe l i e l i e Cys Gln 130 135 140
Leu Gln Phe Leu va l Gln Cys Pro Asn Asn Ser va l Asp Leu Lys Leu 145 150 155 160
Glu Leu Leu l i e Asn Lys His l i e Lys Lys Gln A la Leu va l Thr val 165 170 175
Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln 180 185 190
Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln va l Asn Thr Thr l i e Ser va l Asn val 195 200 205
Asp Thr Phe Gln Tyr l i e Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val 210 215 220
Leu Ser l i e Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp
225 230
<210> 75
<211>5
<212> PRT
<213> secuencia sintética
<220>
<221 > característica_misc
<222> (3)..(3)
<223> en la que X es I, S o Y.
<220>
<221 > característica_misc
<222> (5)..(5)
<223> en la que X es T o S.
<400> 75
Ser Tyr Xaa Trp Xaa 1 5

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1 Un anticuerpo aislado que se une a CD30L que comprende una CDRH1, una CDRH2 y una CDRH3 y una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3,
    en el que CDRL1 es la secuencia consenso CDRL1 de SEQ ID NO:30,
    en el que CDRL2 es la secuencia consenso CDRL2 de SEQ ID NO:31,
    en el que CDRL3 es la secuencia consenso CDRL3 de SEQ ID NO:32,
    en el que CDRH1 es la secuencia consenso CDRH1 de SEQ ID NO:33,
    en el que CDRH2 es la secuencia consenso CDRH2 de SEQ ID NO:34 y
    en el que CDRH3 es la secuencia consenso CDRH3 de SEQ ID NO:35.
  2. 2. - El anticuerpo aislado que se une a CD30L según la reivindicación 1, siendo dicho anticuerpo del tipo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
  3. 3. - Un anticuerpo que se une a CD30L para su uso en un método para tratar o prevenir enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias crónicas o cáncer asociados con la interacción CD30L/CD30 en un paciente, siendo el anticuerpo el anticuerpo según la reivindicación 1 o 2.
  4. 4. - Un anticuerpo para su uso según la reivindicación 3, reduciendo el anticuerpo la actividad de CD30L en el paciente.
  5. 5. - Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo según la reivindicación 1 o 2.
  6. 6. - Una célula huésped que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para el anticuerpo según la reivindicación 1 o 2.
  7. 7. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 3 o 4, comprendiendo el anticuerpo:
    a) CDRH1, CDRH2 y CDRH3 identificadas mediante las SEQ ID NO: 14, 19, 25, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 identificadas mediante las SEQ ID NO:1,7 y 11;
    b) CDRH1, CDRH2 y CDRH3 identificadas mediante las SEQ ID NO: 15, 21, 26, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 identificadas mediante las SEQ ID NO:2, 8 y 12;
    c) CDRH1, CDRH2 y CDRH3 identificadas mediante las SEQ ID NO: 15, 21, 26, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 identificadas mediante las SEQ ID NO:3, 8 y 12;
    d) CDRH1, CDRH2 y CDRH3 identificadas mediante las SEQ ID NO: 16, 22, 27, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 identificadas mediante las SEQ ID NO:4, 9 y 12;
    e) CDRH1, CDRH2 y CDRH3 identificadas mediante las SEQ ID NO: 17, 23, 28, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 identificadas mediante las SEQ ID NO:5, 8 y 13; o
    f) CDRH1, CDRH2 y CDRH3 identificadas mediante las SEQ ID NO: 18, 24, 29, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 identificadas mediante las SEQ ID NO:6, 10 y 12.
  8. 8. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 3 o 4, en el que la CDRH1, CDRH2 y CDRH3 del anticuerpo se identifican mediante las SEQ ID NO: 14, 19, 25, respectivamente, y CDRL1, CDRL2 y CDRL3 se identifican mediante las SEQ ID NO:1,7 y 11, respectivamente.
  9. 9. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 3 o 4, comprendiendo el anticuerpo una región variable de cadena pesada de SEQ ID NO:48 y una región variable de cadena ligera de SEQ ID NO:36.
  10. 10. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 3 o 4, teniendo el anticuerpo al menos una propiedad seleccionada del grupo que consiste en:
    (a) inhibir la interacción CD30/CD30L;
    (b) inhibir la inducción de IL-8 inducida por CD30L;
    (c) competir de manera cruzada con uno de los anticuerpos A-F por la unión a CD30L humano;
    (d) una constante de disociación para el CD30L humano es de como máximo 70 pM y
    (e) unirse a CD30L humano con sustancialmente la misma o menor Kd que uno de los anticuerpos A-F.
  11. 11. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 3 o 4, uniéndose el anticuerpo a una región C-terminal del CD30L humano definida mediante AA 201-234.
  12. 12. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 11, uniéndose el anticuerpo a una región adicional del CD30L humano definida mediante AA75-95.
  13. 13. - El anticuerpo para su uso según la reivindicación 3 o 4, compitiendo el anticuerpo que se une a CD30L con un anticuerpo que comprende una CDRH1, una CDRH2, una CDRH3, una CDRL1, una CDRL2 y una CDRL3, en el que la CDRH1, CDRH2 y CDRH3 se identifican mediante las SEQ ID n O: 14, 19, 25, respectivamente, y la CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 se identifican mediante las SEQ ID NO:1,7 y 11, respectivamente.
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