TW201319249A - 具修飾側鏈之ｒｎａ病毒衍生胜肽及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽，其能藉由調整側鏈長短或電性而修飾胜肽側鏈，而使此胜肽對RNA病毒具高親和力並有優異的細胞穿越能力。本發明亦提供一種以抑制RNA病毒之醫藥組合物，利用前述RNA病毒衍生胜肽的高親和力，抑制病毒自我複製，以有效治療RNA病毒相關疾病。本發明另提供一種藥物傳輸之載體，利用前述RNA病毒衍生胜肽的細胞穿越能力，有效地攜帶藥物至欲治療標的，以提高藥物的傳輸及治療效率。

Description

具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽及其用途
本發明關於一種具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽及其用途，更具體地說，是指一種能藉由調整胜肽側鏈的性質(例如：側鏈長短或電性)來調控此胜肽與RNA病毒的結合力和細胞穿透能力者。
Tat(47-57)為HIV Tat蛋白(人類免疫缺陷病毒活化子的轉錄蛋白，第47-57個殘基)具11個胺基酸的鹼性區域，Tat(47-57)可與反式活化反應單元(transactivator response element(TAR))RNA交互作用，並負責細胞穿透作用。Tat-TAR交互作用對HIV增生極為重要，而Tat的細胞穿透能力對在被感染的鄰近細胞中誘導病毒增生而言也相當重要。由於Tat此一短鹼性區域的六個精胺酸對TAR RNA辨識與細胞穿透都極為重要，故Tat(47-57)在研發抗RNA病毒藥物上為一極具吸引力的系統。
例如，美國專利號第US 7056656號專利案揭示的Tat衍生寡聚脲(oligourea)，其係以寡聚脲(oligourea)與針對HIV-1中TAR RNA的Tat分子競爭專一性以抑制蛋白與核酸的交互作用。
而美國專利申請號第US2009/0047272 A1號申請案則揭示一種抗病毒組合物，此組合物包含一核酸酶，此核酸酶共價性連接至一目標配體(Tb)r，藉由切割病毒的核酸以抑制病毒的作用，其中，此目標配體(Tb)r可以是一膜滲透胜肽，其包括富含精胺酸/離胺酸(Arg/Lys-rich)之胜肽，此精胺酸/離胺酸(Arg/Lys-rich)的胜肽可為YGRKKRPQRRR(HIV TAT47-57)。
然而，在前述習知技術中，Tat胜肽的兩種生物活性-即TAR RNA辨識與細胞穿透的活性並無法調控，導致對RNA具高專一性結合的Tat胜肽，其穿透性可能不佳，反之亦然，因此，現階段市面上尚無能有效抑制RNA病毒(如：HIV病毒)複製的Tat(47-57)相關藥物。
有鑒於習知技術的不足，有必要加以研發改良。因此，本發明之一目的在於提供一種具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽，藉由調整側鏈長短或電性而修飾胜肽，藉此調控此胜肽鏈與RNA病毒的結合力，俾能對有效與各種RNA病毒結合。
本發明之另一目的在於提供一種前述RNA病毒衍生胜肽之用途，以此RNA病毒衍生胜肽製備抑制RNA病毒之醫藥組合物，藉由前述RNA病毒衍生胜肽和RNA病毒間的高親和力，有效地抑制病毒自我複製。
本發明之又一目的在於提供一種具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽及其用途，藉由調整側鏈的性質(例如：側鏈長短或電性)調控此胜肽鏈進入細胞的能力，俾能用作藥物載體。
為達上述目的，本發明提供一種具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽，其包含下列結構式(I)：
(I)其中，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為≦8之正整數；X為NH或O；Y、Y'、Y"為任意胺基酸；以及當X為NH時，n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
於一較佳實施樣態中，前述之RNA病毒衍生胜肽，其中當X為O時，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為3。
於另一較佳實施樣態中，前述之RNA病毒衍生胜肽係指HIV病毒衍生胜肽。較佳地，HIV病毒衍生胜肽係指Tat(47-57)衍生胜肽。
於一較佳實施樣態中，前述之RNA病毒衍生胜肽為如下之序列：Tyr-Gly-Agb-Lys-Lys-Agb-Agb-Gln-Agb-Agb-Agb-NH2(SEQ ID NO: 1)，其中Agb為(S)-2-胺基-3-胍基丁酸。
於另一較佳實施樣態中，前述之RNA病毒衍生胜肽為如下之序列：Tyr-Gly-Agh-Lys-Lys-Agh-Agh-Gln-Agh-Agh-Agh-NH2(SEQ ID NO: 2)，其中Agh為(S)-2-胺基-3-胍基己酸。
於一較佳實施樣態中，前述之RNA病毒衍生胜肽，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為2。
於另一較佳實施樣態中，前述之RNA病毒衍生胜肽，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為4。
本發明亦提供一種將具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽用於製備抑制RNA病毒之醫藥組合物之用途，其中該RNA病毒衍生胜肽包含前述結構式(I)。
於一較佳實施樣態中，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為1~4，但n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
本發明又一種將具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽用於製備藥物傳輸之載體之用途，其中該RNA病毒衍生胜肽包含上述結構式(I)。
於一較佳實施樣態中，前述之用途中，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為1~8，但n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
本發明另提供一種抑制RNA病毒之醫藥組合物，係包含：前述的具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽；及一醫藥上可接受之佐劑。
於一較佳實施樣態中，前述醫藥組合物可以單獨使用，利用前述具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽的高親和力，抑制病毒自我複製，以有效治療RNA病毒相關疾病。於另一較佳實施樣態中，前述醫藥組合物可以進一步包含一藥物，而與前述RNA病毒衍生胜肽合併用藥。
本發明又提供一種藥物載體，其係以前述結構式(I)之具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽而製得。
在本發明中，使用下列的名詞定義，但應當理解，此定義僅用於幫助說明並解釋本發明之內容，並非將本發明之內容僅限於此。
本發明所使用的名詞「胜肽」為指兩個或兩個以上胺基酸或胺基酸類似物(包括非天然產生腔基酸)之鏈，相鄰胺基酸藉由胜肽(-NHCO-)鍵連接。因此，本發明之胜肽包括寡胜肽、多胜肽、蛋白質、擬態胜肽(mimetope)及擬胜肽。
本發明所使用的名詞「胺基酸」一詞係指α-胺基酸。在本發明之胜肽中所含胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。此外，用於本發明之胜肽的胺基酸可為天然胺基酸及非天然胺基酸。如此一來，本發明之胜肽可由遺傳編碼胺基酸、天然非遺傳編碼胺基酸、或合成胺基酸製造。
本發明所使用的名詞「醫藥組合物」包括至少一種RNA病毒衍生胜肽之活性成分以及一或多種其醫藥上可接受之佐劑以及視情況之其他治療劑。此醫藥組合物可進一步結合其他藥物，以與活性成分合併用藥，增進療效。
此處「佐劑」指因應醫藥組合物生產需求所加入的任何藥學可接受成份，佐劑需與該組合物中之其他成分可相容且對需治療的標的無害，包含，如：酸化劑、添加劑、吸附劑、推噴劑、空氣置換劑、鹼化試劑、防結塊劑、抗凝聚劑著色劑、抗菌防腐劑、抗氧化劑、防腐劑、鹼、黏合劑、緩衝劑、螯合劑、塗佈劑、乾燥劑、清潔劑、稀釋劑、消毒劑、崩解佐劑、分散劑、助溶劑、染料、潤滑劑、乳化劑、乳化穩定劑、填充劑、膜形成劑、風味增強劑、助流劑、膠凝劑、粒化劑、保濕劑、潤滑劑、黏膜黏著劑、軟膏基、軟膏、油性賦形劑、有機鹼、片狀鹼(pastille bases)、色素、可塑劑、磨光劑、防腐劑、多價螯合劑、皮膚滲透劑、增溶劑、溶劑、安定劑、栓劑基體、表面活性劑、界面活性劑、懸浮劑、甜味劑、治療劑、增稠劑、張力劑、增黏劑、吸水劑、水相互共溶劑、軟水劑或濕潤劑。
本發明所指藥物傳輸之「載體」是指能傳送治療或診斷劑至目標細胞的傳輸物質。於本發明中，治療或診斷試劑可與本發明具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽結合形成一複合物後，利用該具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽能穿透細胞的特性，將治療或診斷試劑傳送至細胞。
接著，本發明之實施例依下列例子詳細描述，但不限於此。本發明之上述及其他目的、特徵及優點將因以下敘述及後附圖式而變得更加清楚。
實施例1：修飾Tat(47-57)衍生胜肽中所有精胺酸的側鏈長短以觀察其對RNA結合的專一性以及穿透性影響
材料及方法
除非另有說明，所有化學藥劑均購自Aldrich。二異丙基乙胺(DIEA)、哌啶、三氟乙酸(TFA)、醋酸酐、N-甲基-N-(三甲矽烷基)三氟乙醯胺、Tween-20及醋酸酐來自Acros。胍鹽酸鹽來自Fluka。二甲基甲醯胺(DMF)、乙酸乙酯、二氯甲烷(DCM)及己烷來自Mallinckrodt。甲醇及乙腈來自Merck。過硫酸銨及1,4-二氧陸圜(1,4-Dioxane)來自J.T.Baker。甘油、硼酸、雙-丙烯醯胺、Tris-HCl、三(羥甲基)胺基甲烷(Tris)來自Bioshop。有機和高效液相層析法(HPLC)溶劑來自Merck Taiwan。N-9-茀基甲氧基羰基(Fluorenylmethoxycarbonyl,Fmoc)-胺基酸、1-羥基苯并三唑(1-hydroxybenzotrazole,HOBt)以及O-1H-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(O-1H-benzotriazol-1-yl-1,1,3,3-tetra-methyl uronium hexafluorophosphate,HBTU)來自Novabiochem，而Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂來自Applied Biosystems。使用反應劑和溶劑不需進一步純化。在Agilent 1200系列層析系統進行分析型逆相層析(RP)-HPLC，使用Vydac C18管柱(直徑4.6 mm，長250 mm)。在Waters Breeze層析系統進行製備型逆相層析(RP)-HPLC，使用Vydac C4和C18管柱(直徑22 mm，長250 mm)。胜肽的質譜分析在基質輔助雷射脫附游離/飛行時間式(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight,MALDI-TOF)質譜儀(Bruker Daltonics Biflex IV)上進行，使用α-氰基-4-羥桂皮酸為基質。在UV-Vis分光光度計(Jasco V-650)上進行胜肽濃度的測定。以使用1 mm光徑試樣管的J815光譜儀收集圓偏光二色性(Circular dichroism,CD)光譜。以平均殘餘莫耳橢圓率(deg.cm2.dmol-1)表示CD數據。使用設定在526 nm發射波長的Typhoon TRIO+膠體成像器將膠體位移結果顯像。在Varian Cary Eclipse螢光分光光度計取得螢光強度。使用CO2培養箱(Thermo Scientific,Forma steri-cycle CO2 incubaor)培養細胞。使用血球計(Reichert Bright-Line,hemacytometer 1490)計數細胞。在流式細胞儀(Becton Dickinson,FACS CantoTM II)上測量經6-羧基螢光素標誌的Tat胜肽之螢光強度，並使用倒立螢光顯微鏡(Olympus,IX71)觀察經胜肽處理的Jurkat細胞影像。
N,N-雙(第三丁氧羰基)-胍(N,N-Bis(tert-butoxycarbonyl)-guanidine)之製備
依據習知實驗程序進行合成。在含胍鹽酸鹽(2.8727 g,30.049 mmol)及氫氧化鈉(4.9573 g,123.9 mmol)的水(30 mL)中加入1,4-二氧陸圜(30 mL)，使用冰浴槽冷卻前述混合物至0℃。接著將二-第三丁基重碳酸鹽(Di-tert-butyl-dicarbonate)(14.5296 g,66.1302 mmol)加入反應混合物中，並以額外的30 mL1,4-二氧陸圜將殘餘物清洗進反應混合物中。接著，使反應混合物回溫至室溫並攪拌3天。然後減壓濃縮反應混合物至乾燥。以水(60 mL)稀釋所產生的白色乳化物並以乙酸乙酯(3 X 60 mL)萃取。接著以10%檸檬酸(60 mL)、水(60 mL)及鹽水(brine)(60 mL)萃取，並以無水硫酸鈉乾燥。最後，減壓濃縮經乾燥的有機溶液以獲得所需的白色粉末產物(5.4 g,產率69.2%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3)3.46(s,1H),1.46(s,18H)；計算對C11H21N3O4[MH+]的ESI-MS=260.3，觀察值為[MH+]=260.1。
N,N’-雙-Boc-N”-三氟甲磺醯基-胍(N,N’-Di-Boc-N”-trifluoromethanesulfonyl-guanidine)之製備
依據習知實驗程序進行合成。將溶解於無水二氯甲烷(60 mL)含N,N-雙(第三丁氧羰基)-胍(3.0414 g,12.035 mmol)及三乙胺(2.0 mL)之溶液，在氮氣環境使用乾冰/丙酮浴(dry ice/acetone bath)冷卻至-68℃。以滴下式(dropwise)(2.1 mL/30分)添加三氟甲烷磺酐(Triflic anhydride)(2.1 mL,12.590 mmole)。加入半量三氟甲烷磺酐後，反應混合物的顏色變成淺棕色並回溫至室溫且攪拌隔夜。以2 M硫酸氫鈉(20 mL)及水(20 mL)清洗反應物，接著以無水硫酸鈉乾燥。減壓濃縮經乾燥的有機溶液並以矽膠作為基材以CH2Cl2沖提進行層析法以獲得所需產物(3.1 g,產率64.8%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3) 1.51(s,18H)；計算對C12H20F3N3O6S[MNa+]的ESI-MS=414.4,[MNa+]觀察值=414.2。
N α -Fmoc-(S)-2-胺基-N ω,ω’ -雙(Boc)-3-胍基己酸(N α -Fmoc-(S)-2-amino-N ω,ω’ -di(Boc)-3-guanidinohexanoic acid(Fmoc-Agh(Boc) 2 -OH))之製備
進行下列習知實驗程序合成。在氮氣環境下將Fmoc-Lys-OH(1.100 g,2.98 mmol)懸浮於無水二氯甲烷(6mL)。加入N-甲基-N-(三甲矽烷基)三氟乙醯胺(1.2 mL,6.60 mmol)，接著加熱反應物並迴流直到形成澄清溶液。溶液冷卻至室溫，加入N,N’-雙-Boc-N”-三氟甲磺醯基-胍(1.410 g,3.60 mmol)隨後加入三乙胺(504 μL,3.60 mmol)。反應混合物在室溫攪拌，接著以TLC監測此反應。一旦反應完成，以二氯甲烷(6 mL)稀釋反應混合物，並以2 M硫酸氫鈉及水清洗反應混合物，接著以硫酸鈉將其乾燥。減壓濃縮經乾燥的有機溶液並以矽膠作為基材進行快速層析法(flash chromatography)(CH2Cl2 to 95:5 CH2Cl2/甲醇)以獲得為白色粉末的所需產物(1.347g,產率73.8%)。Rf=0.17(95:5 CH2Cl2/甲醇);m.p. 85-88℃;[α]25 D=16.9(0.0099 g mL-1 CHCl3);1H NMR(500 MHz,CDCl3/TMS):δ=8.439(s,1H),7.749-7.257(m,8H),5.638(d,J(H,H)=7.324 Hz,1H),4.505(br s,1H),4.371(d,J(H,H)=5.798 Hz,1H),4.204(t,J(H,H)=6.867 Hz,1H),3.406(m,1H),3.310(m,1H),1.918(m,1H),1779(m,1H),1.479(s,9H),1.471(s,9H),1.647-1.277 ppm(m,6H);13C NMR(75 MHz,CDCl3/TMS):δ=175.416,163.388,156.764,156.604,153.759,144.425,144.289,141.830,128.217,127.602,125.659,120.477,83.924,80.395,67.609,54.064,47.713,41.187,32.172,29.008,28.719,28.567,22.755 ppm;IR(液態):v bar=3226,2983,1720,1617,1512,1450,1416,1368,1335,1137,1054 cm-1；經計算C32H42N4O8[MH+]之ESI-MS為：611.3075,觀察值為：611.1；經計算C32H42N4O8[MH+]的HRMS為：611.3075,觀察值為：611.3063。
胜肽合成
Fmoc-PAL-PEG-PS(0.05 mmol)在N,N-二甲基甲醯胺(DMF,5 mL)膨脹30分鐘。接著以20%哌啶/DMF(3x8 min)將樹脂去保護並以DMF(5x1 min)清洗該樹脂。三等份適當保護的Fmoc胺基酸、HOBt及HBTU混合物溶於DMF(1 mL)。將二異丙基乙胺(DIEA,8等份)添加至溶液並徹底混合。將此溶液用於樹脂。以DMF(1 mL)清洗含此溶液的小瓶，並將小瓶中的溶液添加至反應物中。經8小時完成首次耦合(first coupling)。將第8及第14個殘基耦合1.5小時，再將其他殘基耦合45分鐘。每一次耦合作用後，以DMF(5x1 min)清洗該樹脂。接著，以DMF(5x1 min)及甲醇清洗該樹脂，並進行冷凍乾燥。
進行固相胍基化(Solid phase guanidinylation)合成含Agb-及Agp胜肽。要合成含Agb胜肽，需先合成對應的含Dab(ivDde)胜肽。以三苯氯甲烷(trityl chloride)處理樹脂以保護螢光素基團。接著，在含2%胼之DMF(4 mL,5 x 8 min)懸浮該樹脂以移除ivDde保護基並在室溫下搖晃。以DMF(4 mL,5 x 1.5 min)清洗該樹脂，並進行冷凍乾燥。要合成含Agp胜肽，需先合成對應的含Dap(Mtt)胜肽。接著，在含1% CF3COOH之CH2Cl2(4 mL,15 x 3 min)懸浮該樹脂以移除Mtt保護基並在室溫下搖晃。去保護作用持續進行直到過濾物不再呈現黃色。以CH2Cl2(4 mL,5 x 1.5 min)清洗該樹脂，並進行冷凍乾燥。由結合樹脂的保護胜肽移除相互獨立的保護基後，在含N,N’-雙-Boc-N”-三氟甲磺醯-胍(820.9 mg,2 mmol)及Et3N(480 μL,6.5 mmol)的CH2Cl2溶液中將此樹脂再懸浮。在室溫下搖晃反應物。以3 x 7 sec,30%功率的微波，每小時微波反應物一次。切割小量(約5 mg的胜肽結合樹脂並以RP-HPLC分析進行反應監測。
以95:5三氟乙酸(950 μL)/三異丙基矽烷(50 μL)處理樹脂並搖晃2小時將胜肽去保護並切割樹脂。以玻璃棉過濾溶液，並以TFA(3x1 mL)清洗樹脂。將過濾物一起以微氣流N2去除水份。將所產生的物質以己烷清洗、溶解於水中，並冷凍乾燥。使用分析型RP-HPLC分析胜肽(水溶液中濃度為1 mg mL-1)。分析型RP-HPLC是在C18管柱，流速為1 mL min-1，溫度為25℃，由100% A至0% A線性1% min-1(溶劑A: 99.9%水，0.1% TFA；溶劑B: 90%乙腈，10%水，0.1% TFA)梯度條件下進行。將適當的線性溶劑A/溶劑B梯度用於C4及C18管柱的製備型RP-HPLC進行純化作用。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。
胜肽製備例1：
AghTat(Ac-Tyr-Gly-Agh-Lys-Lys-Agh-Agh-Gln-Agh-Agh-Agh-NH2)(即結構式(I)中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為4的情形；SEQ ID NO.: 2)
使用242.4 mg(0.05090 mmol)的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂合成胜肽。此合成獲得349.1 mg(產率66.6%)的產物。進行切割獲得119.4 mg的粗產物(>99%)。使用C4及C18管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至98.5%的純度，分別使用線性梯度PLG00_06及PLG01_11。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為17.0分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算C72H133N33O14[MH]+為：1684.07，觀察m/z值為：1684.938。
胜肽製備例2：
ArgTat(Ac-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)(天然Tat衍生胜肽，即結構式(I)中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為3的情形；SEQ ID NO.: 3)
此天然Tat衍生胜肽是將天然的Tat(47-57)胜肽(-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-(SEQ ID NO.: 4))的兩端均加帽(cap)而獲得。並以下列方式進行合成：使用234.9 mg(0.0433 mmol)的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂合成胜肽。此合成獲得334.0 mg(產率59.6%)的產物。進行切割獲得116.8 mg的粗產物(>99%)。使用C4及C18管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至98.7%的純度，分別使用線性梯度PLG00_05及PLG04_16。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為15.4分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算C72H133N33O14[MH]+為：1599.98,觀察m/z值為：1600.34。
胜肽製備例3：
AgbTat(Ac-Tyr-Gly-Agb-Lys-Lys-Agb-Agb-Gln-Agb-Agb-Agb-NH2)(即結構式(I)中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為2的情形；SEQ ID NO.: 1)
使用245.3 mg(0.05151 mmol)的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂合成胜肽。此合成獲得327.5 mg(產率53.6%)的產物。進行切割獲得87.0 mg的粗產物(>99%)。使用C4及C18管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至99.0%的純度，分別使用線性梯度PLG00_05及PLG03_14。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為15.0分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算C60H110N33O14[MH]+為：1516.89，觀察m/z值為：1516.72。
胜肽製備例4：
Flu-AghTat(6-羧基螢光素-βAla-Tyr-Gly-Agh-Lys-Lys-Agh-Agh-Gln-Agh-Agh-Agh-NH2；SEQ ID NO.: 4)
使用245.8 mg(0.0516 mmol)的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂合成胜肽。此合成獲得340.6 mg(產率52.0%)的產物。進行切割獲得122.1 mg的粗產物(>99%)。使用C4及C18管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至98.6%的純度，分別使用線性梯度PLG04_13及PLG16_26。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為26.2分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算C94H146N34O20[MH]+為：2072.15，觀察m/z值為：2071.98。
胜肽製備例5：
Flu-ArgTat(6-羧基螢光素-βAla-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-N H2；SEQ ID NO.: 5)
使用144.6 mg(0.0305 mmol)的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂合成胜肽。此合成獲得200.1 mg(產率48.3%)的產物。進行切割獲得47.5 mg的粗產物(>99%)。使用C4及C18管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至99.2%的純度，分別使用線性梯度PLG06_13及PLG13_26。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為25.7分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算C88H134N34O20[MH]+為：1987.051，觀察m/z值為：1987.114。
胜肽製備例6：
Flu-AgbTat(6-羧基螢光素-βAla-Tyr-Gly-Agb-Lys-Lys-Agb-Agb-Gln-Agb-Agb-Agb-NH2；SEQ ID NO.: 6).
使用247.8 mg(0.05203 mmol)的Fmoc-PAL-PEG-PS樹脂合成胜肽。此合成獲得329.7 mg(產率46.5%)的產物。進行切割獲得136.2 mg的粗產物(>99%)。使用C4及C18管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至96.1%的純度，分別使用線性梯度PLG03_12及PLG14_25。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為27.5分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算C82H123N34O20[MH]+為：1903.96，觀察m/z值為：1902.39。
以UV-vis光譜進行胜肽濃度測定
使用Edelhoch法測定XaaTat(其中Xaa分別為Agh,Arg或Agb)胜肽儲存溶液的濃度。各XaaTat胜肽依據重量製備10 mM溶液。使用1 mm光徑試樣管收集UV數據。以6 M胍鹽酸鹽中的酪胺酸吸光值(ε282=1220,ε280=1285,ε278=1395,ε276=1455)測定XaaTat胜肽儲存溶液的濃度。在1分鐘內收集波長276、278、280及282 nm的UV吸光值以準確地測定樣品濃度。使用Kaleidagraph 3.52(Synergy Software,CA)推導出胜肽溶液的濃度。
各Flu-XaaTat胜肽(其中Xaa分別為Agh,Arg或Agb)依據重量製備7 mM溶液。使用1 mm光徑試樣管收集UV數據。依據6-羧基螢光素吸光值(ε492=81000)，在pH 9的緩衝液(1 mM磷酸鈉,1 mM檸檬酸鈉以及1 mM硼酸鈉)中測定Flu-XaaTat胜肽儲存溶液的濃度。在1分鐘內收集波長492 nm的UV吸光值以準確地測定樣品濃度。依據Beer-Lambert定律，使用Kaleidagraph 3.52(Synergy Software,CA)推導出胜肽溶液的濃度。
螢光各向異性度(Fluorescence Anisotropy)XaaTat胜肽(其中Xaa分別為Agh,Arg或Agb)對TAR RNA的結合親和力以螢光各向異性度(使用Varian Cary Eclipse螢光分光光度計)測量。使用下列公式計算各向異性度(anisotropy(r))：
此處Ivv、Ivh、Ihh、Ihv為以激發偏極器(excitation polarizer)產生的螢光強度，而發射偏極器(emission polarizer)以垂直(Ivh及Ihv)方向排列(或)平行(Ivv及Ihh)於極化激發之方向。經螢光素標誌的TAR RNA(F-TAR-RNA)在490 nm激發並於512 nm監測得其偏極化發射。激發及發射兩者的狹縫(slit)設為10 nm。數據收集時間(integration time)為20秒。在起始體積為160 μL的Sub-Micro比色管(Starna Cell,Inc.)中測量所有數據。每次加入(1 μL)的XaaTat先平衡兩分鐘後再紀錄螢光信號。所有實驗在室溫下TKT緩衝液中(TKT: 50 mM Tris-HCl,pH 7.4,20 mM KCl及0.02% Tween20)進行。F-TAR-RNA的起始濃度為25 nM。TKT溶液以及胜肽儲存溶液兩者在室溫下回溫達平衡超過20分鐘。實驗分別重複三次。針對每個單一點，進行三次測量並使用平均各向異性度值導出表觀解離常數(表觀KD)。擬合(fitting)以化學計量上1:1胜肽-RNA結合比例之各向異性度數據，導出胜肽-RNA複合物的表觀解離常數。使用Kaleidagraph 3.52(Synergy Software,CA)進行擬合。
膠體位移測試
經螢光素標誌的TAR RNA(F-TAR-RNA)購自Sigma。將F-TAR-RNA溶於經H2O處理的焦碳酸二乙酯得50 μM溶液。在室溫下進行結合測試。在含Tris-HCl (50 mM),KCl(50 mM)、poly-dIdC(10 μg/mL)、2%甘油以及Triton X-100(0.05%)的pH 7.4緩衝液中培養胜肽與RNA。F-TAR-RNA的濃度為100 nM。載入含12%天然聚丙烯醯胺膠體的0.5%TB緩衝液分析樣品並在室溫以140 V進行電泳。以Typhoon TRIO+Variable Mode Imager掃描經乾燥的膠體。使用ImageQuant軟體量化對應游離及結合RNA的條帶。由化學計量上1:1結合比例及以整體擬合(globalfited)導出表觀解離常數。
存活Jurkat細胞的螢光顯微觀察
在37℃具胎牛血清的RPMI培養基中以7 μM Flu-XaaTat胜肽培養存活Jurkat細胞15分鐘。培養後，以2200 rpm離心懸浮液。以磷酸緩衝鹽(137 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM磷酸氫二鈉,2 mM磷酸一鉀,pH 7.4)清洗細胞兩次移除細胞外的胜肽。為確保能移除任何表面結合胜肽，接著將細胞在37℃以0.05%胰蛋白酶培養5分鐘，以PBS清洗兩次。最後，在含1μg/mL碘化丙啶的500 μL PBS中將細胞再懸浮。將著以螢光顯微鏡(Olympus IX71)(激發波長為492nm/觀察波長為517nm)觀察細胞。
細胞進入測試
所有儀器設備以高壓蒸汽滅菌法滅菌，且實驗用具表面以70%乙醇擦拭。所有實驗操作在層流操作台(laminar flow hood)進行。細胞數目以血球計測定。在血球計中有9個1.0 mm2面積及0.1 mm深度的區塊。計算並平均四個角落區塊的細胞數目。此平均數乘以104以獲得1 mL懸浮液中的細胞數目。細胞進入實驗使用8 x 105個細胞進行。在37℃，5% CO2條件以不同濃度胜肽培養Jurkat細胞培養15分鐘。接著細胞以PBS(2g/L KCl,2g/L KH2PO4,80g/L NaCl,11.5g/L Na2PO4)(2 x 400 μL)清洗移除可能干擾胰蛋白酶蛋白分解活性的胎牛血清。細胞以含0.05%胰蛋白酶/EDTA的PBS培養5分鐘移除黏附在細胞表面而非細胞入口的胜肽。接著，細胞以PBS(2 x 400 μL)清洗。在500 λ PBS中將細胞再懸浮並移至流管(flow tube)。添加Triton-X 100使細胞死亡以提供細胞死亡的控制組。將碘化丙啶加入所有樣品使死亡細胞染色，但存活細胞不需染色。Jurkat細胞的螢光分析以流式細胞儀進行(FACScan,Becton Dickinson Bioscience)。用於前向角散射光(forward scatter)、側向角散射光(side scatter)及碘化丙啶的光倍增器電壓分別設定為270、470及350。選擇具適當前向角散射光值及側向角散射光值圈選(gated)為P1區域將其視為存活控制組中的正常和存活細胞。將經碘化丙啶處理死亡細胞的最小碘化丙啶螢光強度設為對死亡細胞的閥值。意即，低於閥值且具碘化丙啶螢光的細胞視為存活細胞。當細胞型態是在P1區域時，且碘化丙啶螢光強度小於閥值，需考慮6-羧基螢光素的螢光。在室溫下獲得出現次數(event)為10,000次的6-羧基螢光素螢光強度。此數據表示對10,000個細胞的平均螢光強度。各實驗分別重複至少三次。
測定細胞存活的MTT測試法
細胞生長至適當細胞密度(大約2x106 cells/mL)並在進行此實驗前移至新培養基一天。對各項測試，將以血球計測定的8x105個細胞加入一eppendorf管中。以2200 rpm離心5分鐘。用真空移除上清液。接著，添加200 μL 7μM或30μM XaaTat胜肽。在37℃培養細胞4小時，接著以2200 rpm離心5分鐘。以RPMI培養基清洗細胞兩次，接著加入含200μ L 0.5 mg/mL MTT的無血清RPMI緩衝液並在37℃培養3.5小時。接著以4000 rpm離心細胞5分鐘。接著將上清液移至一96孔盤的兩個盤孔中(各為100 μL)。然後添加400 μL DMSO至含前述細胞的測試eppendorf管中。將eppendorf管劇烈震盪5分鐘以溶解MTT結晶紫，以2200離心rpm5分鐘。接著將上清液移至一96孔盤的四個盤孔中(各為100 μL)以待分析。使用具655 nm吸光值以進行背景值校正的微量盤式分析儀(microplate reader)測定各盤孔在570 nm的吸光值。使用不同數目細胞(8x105,4x105及2x105)產生標準曲線。接著，基於此標準曲線找出各樣本對各胜肽在各濃度的吸光值與存活細胞數目的相互關連性。
實驗結果
1.與RNA專一性結合能力之測試結果
將天然的Tat(47-57)的兩端均加帽(cap)獲得胜肽ArgTat。6個殘基分別均取代為Agh(比Arg多一個甲烯基)以及Agb(比Arg少一個甲烯基)以分別獲得AghTat及AgbTat。為了能偵測細胞穿透，在胜肽的N端以螢光素加帽。所有胜肽使用Fmoc系化學的固相胜肽合成法加以合成，使用逆相高效液相層析法純化至大於95%的純度，並以基質輔助雷射脫附離子化加以確認。
參見表1，在有poly(dI-dC)存在和無poly(dI-dC)存在的條件下，將螢光素標誌在HIV TAR RNA的3’端，分別以螢光各向異性度和電泳位移測試(electrophoretic mobility shift assays(EMSA))，以進行XaaTat(Xaa=Agh,Arg及Agb)與HIV TAR RNA結合的表觀解離常數KD的實驗結果，其中KD越小結合力越強。
由表1可知無poly(dI-dC)存在的條件下AghTat及AgbTat與TAR-RNA結合力與天然衍生ArgTat與TAR-RNA結合力差距不大，證實經具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽(AghTat及AgbTat)對TAR-RNA亦具有極佳的結合力。
另外，為了測定專一性的強弱，加入帶有負電荷的競爭者poly(dI-dC)後測量結合力強弱，由表1可知在poly(dI-dC)存在的條件下，AghTat的結合力會顯著降低，因此聚陰離子性的poly(dI-dC)存在對ArgTat對TAR RNA的結合力有影響。而poly(dI-dC)的存在則不會影響AgbTat的結合力，亦即AgbTat對TAR-RNA具有較佳的專一性結合力，因此改變精胺酸側鏈長度不會影響Tat及TAR-RNA間的結合力，但可以藉此調控Tat及TAR-RNA間的專一性。
表1.在poly(dI-dC)存在以及poly(dI-dC)不存在條件下，XaaTat(Xaa=Agh,Arg及Agb)與HIV TAR RNA結合的表觀解離常數KD
a 表觀解離常數(apparent dissociation constants,KD)由化學計量上預設為1:1結合的實驗數據導出。
b 以螢光各向異性度實驗測定數值。將胜肽滴定進25 nM的經螢光素標誌HIV TAR RNA進行實驗。
c 以電泳位移測試(EMSA)測定數值。以100 nM的經螢光素標誌HIV TAR RNA及不同量的胜肽在10 μg/mL poly(dI-dC)存在下進行此測試。
2.細胞穿透性測試結果
由於Jurkat細胞為CD4+輔助性T細胞的癌症細胞株，且CD4+輔助性T細胞為HIV的標的，故在Jurkat細胞進行細胞穿透實驗。在37℃胎牛血清存在下，分別以不同濃度(7、30、60、120 μM)的Flu-XaaTat培養Jurkat細胞15分鐘，接著以胰蛋白酶處理移除結合於細胞表面的胜肽。
參見第一圖，其為Jurkat細胞的覆蓋亮區及螢光顯微影像，其係在37℃胎牛血清中培養Jurkat細胞與7 μM Flu-AghTat(圖A),Flu-ArgTat(圖B),Flu-AgbTat(圖C)15分鐘，清洗並在37℃以胰蛋白酶處理5分鐘。由第一圖可知，在三種胜肽中有顯著的細胞穿透現象。
接著使用流式細胞儀定量觀察細胞穿透現象。請參見第二圖，其為Flu-XaaTat胜肽進行細胞穿透進入37℃胎牛血清存在的Jurkat細胞的流式細胞儀觀察結果，其中圖A為以7 μM Flu-XaaTat胜肽培養15分鐘的平均細胞螢光。圖B為以各種胜肽濃度(7、30、60、120 μM)培養15分鐘的平均細胞螢光。由第二圖A可知以7 μM胜肽培養時，Flu-AgbTat顯現高於Flu-ArgTat及Flu-AghTat三倍的細胞穿透現象。由第二圖B可知，在更高胜肽濃度時，含Agb胜肽具有更佳的穿透現象。同時，相較於Flu-ArgTat，Flu-AghTat在高於7 μM的濃度顯現更強的細胞穿透性。
第三圖為Flu-XaaTat胜肽進行細胞穿透進入Jurkat細胞的細胞穿透平均百分比，其中Jurkat細胞在胎牛血清存在時，以7 μM(圖A)及30 μM(圖B)Flu-XaaTat胜肽在37℃培養15分鐘。請參見第三圖A，一旦精胺酸側鏈長度縮短一個甲烯基至Agb，有超過70%的細胞顯現穿透現象，此為天然的Tat衍生胜肽(Flu-ArgTat)穿透細胞數目的四倍。而由第三圖B可知，不管側鏈長度為何，當提昇胜肽濃度至30 μM時，幾乎所有細胞顯現胜肽穿透現象。
由前述第二圖及第三圖的實驗結果證實，經修飾的Flu-TatAgb及Flu-AghTat胜肽均有細胞穿透現象，而且改變Tat(47-57)中精胺酸側鏈長度會增加胜肽的細胞穿透，特別是當精胺酸側鏈長度縮短一個甲烯基變成Agb時，有極佳的穿透效果。
3.細胞毒性測試結果
第四圖為7 μM(圖A)及30 μM(圖B)胜肽AghTat、ArgTat以及AgbTat在37℃中4小時後以MTT法測定的細胞存活結果。由圖中可知隨著胜肽濃度升高，AghTat、ArgTat以及AgbTat均有極小的細胞毒性，以30 μM含Agb胜肽為例，其具有極佳的RNA結合專一性以及細胞穿透活性，且在37℃、4小時下有極小的細胞毒性，但仍須進一步研究來研發抗-HIV療法或藥物傳輸系統的應用。而且，這些結果證實改變精胺酸側鏈將影響Tat衍生胜肽的RNA結合專一性以及細胞穿透活性，確實為研發具生醫應用分子的有效策略。
實施例2：分別修飾Tat(47-57)衍生胜肽中各精胺酸的側鏈電荷(將精胺酸的NH 2 基團改為O原子)以觀察其對RNA結合的專一性以及穿透性之影響
胜肽製備例1：
Tat-Cit49(Ac-Tyr-Gly-Cit-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 7)
使用0.2404 g(0.0505 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit49胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Cit-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.3256 g(產率51.1%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為31.51分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1780.63]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)選擇性地將Fmoc-Tat-Cit49上的Fmoc基移除。接著，樹脂與乙酸酐(95 μL,20等份)及DIEA(125 μL,20等份)的溶液反應2小時。此合成獲得0.3205 g(產率50.6%)的樹脂。進行切割獲得102.4 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG00_04)及C18(PLG02_14)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至98.0%的純度(14.9 mg)。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為16.18分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+] C66H120N32O15為[1601.97]；觀察值為[1601.32]。
胜肽製備例2：
Tat-Cit52(Ac-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Cit-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 8)
使用0.2678 g(0.0500 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit52胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Cit-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.3713 g(產率62.6%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為31.03分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1780.96]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)選擇性地將Fmoc-Tat-Cit52上的Fmoc基移除。接著，樹脂與乙酸酐(95 μL,20等份)及DIEA(125 μL,20等份)的溶液反應2小時。此合成獲得0.3651 g(產率61.7%)的樹脂。進行切割獲得104.0 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG00_04)及C18(PLG02_14)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至98.2%(12.3 mg)的純度。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為15.77分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+] C66H120N32O15為[1601.97]；觀察值為[1601.64]。
胜肽製備例3：
Tat-Cit53(Ac-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Cit-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 9)
使用0.2987 g(0.0508 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit53胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Cit-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.4090 g(產率65.7%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為31.28分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1780.57]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)選擇性地將Fmoc-Tat-Cit53上的Fmoc基移除。接著，樹脂與乙酸酐(95 μL,20等份)及DIEA(125 μL,20等份)的溶液反應2小時。此合成獲得0.4026 g(產率64.3%)的樹脂。進行切割獲得112.9 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG00_04)及C18(PLG02_14)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至97.3%(11.7 mg)的純度。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為15.97分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF MS確認。經計算[MH+] C66H120N32O15為[1601.97]；觀察值為[1601.48]。
胜肽製備例4：
Tat-Cit55(Ac-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Cit-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 10)
使用0.2918 g(0.0496 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit55胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Cit-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.3950 g(產率63.0%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為33.99分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1782.98]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)選擇性地將Fmoc-Tat-Cit55上的Fmoc基移除。接著，樹脂與乙酸酐(95 μL,20等份)及DIEA(125 μL,20等份)的溶液反應2小時。此合成獲得0.3966 g(產率65.6%)的樹脂。進行切割獲得152.8 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG00_04)及C18(PLG02_14)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至97.1%(7.6 mg)的純度。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為16.07分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+] C66H120N32O15為[1601.97]；觀察值為[1601.80]。
胜肽製備例5：
Tat-Cit56(Ac-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Cit-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 11)
使用0.2983 g(0.0507 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit56胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Cit-Arg-NH2)。此合成獲得0.4069 g(產率64.9%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為33.82分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1783.39]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)選擇性地將Fmoc-Tat-Cit56上的Fmoc基移除。接著，樹脂與乙酸酐(95 μL,20等份)及DIEA(125 μL,20等份)的溶液反應2小時。此合成獲得0.4002 g(產率64.2%)的樹脂。進行切割獲得156.9 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG00_04)及C18(PLG02_14)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至96.2%(6.7 mg)的純度。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為15.96分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C66H120N32O15為[1601.97]；觀察值為[1601.98]。
胜肽製備例6：
Tat-Cit57(Ac-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Cit-NH2；SEQ ID NO.: 12)
使用0.2929 g(0.0498 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit57胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Cit-NH2)。此合成獲得0.4103 g(產率75.5%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為32.91分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1782.71]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)選擇性地將Fmoc-Tat-Cit57上的Fmoc基移除。接著，樹脂與乙酸酐(95 μL,20等份)及DIEA(125 μL,20等份)的溶液反應2小時。此合成獲得0.4014 g(產率65.3%)的樹脂。進行切割獲得101.5 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG00_04)及C18(PLG02_14)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至97.8%(11.8 mg)的純度。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為16.16分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+] C66H120N32O15為[1601.97]；觀察值為[1602.18]。
以前述製備的胜肽進行螢光各向異性度及電泳膠體測試之方法請參見前述實施例1之方法，於此不再贅述。
穿透細胞胜肽鏈之合成
樹脂(Fmoc-PAL-PEG-PS)在DMF膨脹並搖晃30分鐘。以DMF(5 mL,5 x 1.5 min)清洗該樹脂。接著以20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc基去保護並以DMF(5 mL,5 x 1.5 min)清洗該樹脂。適當保護的Fmoc胺基酸(三等份)、HOBt(三等份)及HBTU混合物(三等份)溶於DMF(1 mL)以及DIEA(12等份)，接著將前述混合物用於該樹脂。以DMF(2 x 1 mL)清洗小瓶，將此小瓶用於承裝樹脂並搖晃。耦合時間取決於胺基酸種類(β-分支)及位置。將精胺酸耦合三次，每次25分鐘。第一個胺基酸耦合8小時，第2-7個殘基耦合75分鐘，第8-15個殘基耦合90分鐘。耦合作用完成後，以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。6-羧基螢光素(三等份)、HOBT(三等份)及HBTU混合物(三等份)溶於DMF(1 mL)以及DIEA(12等份)，接著將前述混合物用於該樹脂。將樹脂搖晃3小時並以DMF(5 mL,5 x 1.5 min)清洗之。以DMF(5 mL,5 x 1.5 min)及甲醇(5 mL)清洗該樹脂，並進行冷凍乾燥隔夜。以TFA(5 mL)、三異丙基矽烷(250 μL)與乙基-1,2-硫醇將胜肽去保護並切割樹脂，接著搖晃2小時。以玻璃棉過濾反應物，並以TFA(3x3 mL)清洗反應物。將過濾物一起以微氣流N2去除水份。將殘餘物質以己烷(3 x 3 mL)清洗、溶解於水中，並冷凍乾燥。使用分析型HPLC分析胜肽，並利用MALDI-TOF質譜加以確認。分析型HPLC是在250 mm長C18管柱，流速為1 mL/min，100% A至0% A線性1%/min(溶劑A: 99.9%水,0.1% TFA；溶劑B: 90%乙腈,10%水,0.1% TFA)梯度條件下進行。選擇不同的線性梯度(溶劑A: 99.9%水，0.1% TFA；溶劑B: 90%乙腈，10%水，0.1% TFA)以製備型RP-HPLC(可裝設C4或C18管柱，使用10mL/min流速以及線性0.5%/min梯度)純化各胜肽。
胜肽製備例1：
6CF-Tat-Cit49(6CF-βAla-Tyr-Gly-Cit-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 13)
使用0.2218 g(0.0466 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit49胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Cit-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.3005 g(產率51.1%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為31.51分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1780.63]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc-Tat-Cit49上的Fmoc基移除。樹脂與β-丙胺酸(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應1.5小時。以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。樹脂與6-羧基螢光素(3等份),HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應3小時。此合成獲得0.2905 g(產率30.5%)的樹脂。進行切割獲得139.7 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG02_12)及C18(PLG13_25)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至97.5%的純度(7.4 mg)。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為27.2分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C88H133N33O21為[1989.04]；觀察值為[1988.76]。
胜肽製備例2：
6CF-Tat-Cit52(6CF-βAla-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Cit-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 14)
使用0.2496 g(0.0466 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit52胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Cit-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.3460 g(產率62.6%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為31.03分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1780.92]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc-Tat-Cit52上的Fmoc基移除。樹脂與β-丙胺酸(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應1.5小時。以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。樹脂與6-羧基螢光素(3等份),HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應3小時。此合成獲得0.3560 g(產率53.4%)的樹脂。進行切割獲得145.8 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG02_12)及C18(PLG13_25)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至95.5%的純度(5.3 mg)。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為27.3分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C88H133N33O21為[1989.04]；觀察值為[1988.85]。
胜肽製備例3：
6CF-Tat-Cit53(6CF-βAla-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Cit-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 15)
使用0.2776 g(0.0472 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit53胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Cit-Gln-Arg-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.3800 g(產率65.7%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為31.28分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1780.57]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc-Tat-Cit53上的Fmoc基移除。樹脂與β-丙胺酸(3等份),HOBT(3等份),以及HBTU(3等份)的混合物反應1.5小時。以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。樹脂與6-羧基螢光素(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應3小時。此合成獲得0.3777 g(產率46.6%)的樹脂。進行切割獲得76.8 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG02_12)及C18(PLG13_25)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至97.3%的純度(2.8 mg)。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為27.5分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C88H133N33O21為[1989.04]；觀察值為[1988.91]。
胜肽製備例4：
6CF-Tat-Cit55(6CF-βAla-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Cit-Arg-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 16)
使用0.2982 g(0.0507 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit55胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Cit-Arg-Arg-NH2)。此合成獲得0.4037 g(產率63.0%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為33.99分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1782.98]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc-Tat-Cit55上的Fmoc基移除。樹脂與β-丙胺酸(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應1.5小時。以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。樹脂與6-羧基螢光素(3等份),HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應3小時。此合成獲得0.3973 g(產率57.5%)的樹脂。進行切割獲得95.7 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG02_12)及C18(PLG13_25)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至95.9%的純度(4.8 mg)。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為27.2分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C88H133N33O21為[1989.04]；觀察值為[1988.91]。
胜肽製備例5：
6CF-Tat-Cit56(6CF-βAla-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Cit-Arg-NH2；SEQ ID NO.: 17)
使用0.2988 g(0.0508 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit56胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Cit-Arg-NH2)。此合成獲得0.4078 g(產率64.9%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為33.82分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1783.39]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc-Tat-Cit56上的Fmoc基移除。樹脂與β-丙胺酸(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應1.5小時。以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。樹脂與6-羧基螢光素(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應3小時。此合成獲得0.4130 g(產率64.2%)的樹脂。進行切割獲得183.1 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG02_12)及C18(PLG13_25)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至96.4%的純度(7.0 mg)。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為27.1分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C88H133N33O21為[1989.04]；觀察值為[1988.95]。
胜肽製備例6：
6CF-Tat-Cit57(6CF-βAla-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Cit-NH2；SEQ ID NO.: 18)75.5%)的樹脂。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為32.91分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C79H128N32O16為[1782.02]；觀察值為[1782.71]。使用20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc-Tat-Cit57上的Fmoc基移除。樹脂與β-丙胺酸(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應1.5小時。以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。樹脂與6-羧基螢光素(3等份)、HOBT(3等份)以及HBTU(3等份)的混合物反應3小時。此合成獲得0.4247 g(產率68.0%)的樹脂。進行切割獲得180.0 mg的粗產物(>99%產率)。使用C4(PLG02_12)及C18(PLG13_25)管柱的製備型RP-HPLC純化胜肽至96.4%的純度(7.0 mg)。在分析型RP-HPLC的滯留時間(Retention time)為27.1分鐘。胜肽的同一性(identity)以MALDI-TOF質譜確認。經計算[MH+]C88H133N33O21為[1989.04]；觀察值為[1988.88]。
使用0.3070 g(0.0522 mmol)Fmoc-PAL-PEG-PS合成對應的Fmoc-Tat-Cit57胜肽(Fmoc-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Cit-NH2)。此合成獲得0.4371 g(產率
以前述製備的胜肽進行存活Jurkat細胞的螢光顯微觀察以及細胞進入測試之方法請參見前述實施例1之方法，於此不再贅述。
實驗結果
1.與RNA專一性結合能力之測試結果
利用螢光各向異性度實驗方法測量Tat衍生胜肽與TAR-RNA的結合強弱的實驗結果請參見第五圖及表2，KD越小表示結合力越強。由第五圖可知具電荷修飾側鏈後的RNA病毒衍生胜肽(Tat-Cit49至Tat-Cit57)對TAR-RNA均具有結合力，而由表2可知自然界Tat(Tat-Arg)與TAR-RNA結合力最好，結合力強弱順序為：自然界Tat(Tat-Arg)>Cit56~Cit57>Cit49~Cit52~Cit53~Cit55，因此可藉由修飾胜肽所帶電荷而調控胜肽與RNA的結合力。
表2以螢光各向異性度測量Tat衍生胜肽與TAR-RNA的結合強弱的實驗結果
在25℃，poly(dI-dC)存在下以膠體位移測試測定Tat胜肽與TAR RNA解離常數的結果請參見表3及第六圖。由第六圖可知，在與TAR-RNA作用力的研究當中顯示，將自然界Tat(Tat-Arg)中的NH2改成O(將正電荷移除成中性)會使其與TAR-RNA的結合力變弱。
而由表3可知利用膠體位移測試且加入帶有負電荷的競爭者poly(dI-dC)後測量結合力強弱(代表專一性的強弱)排列為自然界Tat(Tat-Arg)>Cit49~Cit56~Cit57>Cit52~Cit53~Cit55。由表3及第六圖證實，藉由調控Tat所帶電荷可調整TAR-RNA間的專一性。
表3在25℃，poly-dIdC存在下以膠體位移測試測定Tat胜肽與TAR RNA解離常數的結果
2.細胞穿透性測試結果
以下利用螢光顯微影像以及流式細胞儀研究Tat中的NH2改成O(將正電荷移除成中性)對穿透細胞膜的影響。
第七圖為Jurkat細胞的螢光顯微影像在37℃,5% CO2以30 μM Tat衍生胜肽培養15分鐘並以胰蛋白酶處理10分鐘的結果。(圖A: 6CF-Tat-Cit49；圖B：6CF-Tat-Cit52；圖C：6CF-Tat-Cit53；圖D:6CF-Tat-Cit55；圖E：6CF-Tat-Cit56；圖F：6CF-Tat-Cit57)，由圖中可知此六種胜肽均有顯著的細胞穿透現象。
此外，第八圖為細胞進入測試中Jurkat細胞的劑量依存性(dose dependent)與螢光強度之關係圖(圖A表示胜肽濃度與螢光強度的關係；圖B為在30μM濃度時，各胜肽的平均螢光強度；圖C為在120μM濃度時，各胜肽的平均螢光強度)。表4為在各濃度下細胞進入測試中Jurkat細胞之具體數據(即第八圖A)。根據第八圖B顯示，在30μM濃度下自然界Tat(Tat-Arg)穿透能力最好，然而當濃度提高到120μM(參見第八圖C)穿透細胞的能力為Cit49>自然界Tat(Tat-Arg)~Cit52~Cit53~Cit55~Cit56>Cit57。
由前述第八圖及表4的實驗結果證實，經修飾的(6CF-Tat-Cit49至6CF-Tat-Cit57)胜肽均有細胞穿透現象。而且改變Tat(47-57)中精胺酸側鏈電荷可調控細胞穿透性。
表4細胞進入測試中Jurkat細胞的Tat衍生胜肽平均螢光強度。
實施例3：修飾Tat(47-57)衍生胜肽中部分精胺酸的側鏈長短以觀察其對RNA結合力的影響
胜肽製備例：
Ac-Agp57-Tat(47-57)-NH2(Ac-Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Agp-NH2)(SEQ ID NO:19)
此胜肽將天然Tat衍生胜肽(SEQ ID NO.: 3)，第57號位置的Arg改為側鏈長度n=1的Agp(其中Agb為(S)-2-胺基-3-胍基丁酸)，製備方式如下：樹脂(Fmoc-PAL-PEG-PS)在DMF膨脹並搖晃30分鐘。以DMF(5 mL,5 x 1.5 min)清洗該樹脂。接著以20%哌啶/DMF(5 mL,3 x 8 min)將Fmoc基去保護並以DMF(5 mL,5 x 1.5 min)清洗該樹脂。適當保護的Fmoc胺基酸(三等份)、HOBt(三等份)及HBTU混合物(三等份)溶於DMF(1 mL)以及DIEA(12等份)，接著將前述混合物用於該樹脂。以DMF(2 x 1 mL)清洗小瓶，將此小瓶用於承裝樹脂並搖晃。耦合時間取決於胺基酸種類(β-分支)及位置。將精胺酸耦合三次，每次25分鐘。第一個胺基酸耦合8小時，第2-7個殘基耦合75分鐘，第8-15個殘基耦合90分鐘。耦合作用完成後，以DMF清洗該樹脂並以前述方式去保護。加入乙酸酐(95 μL,20等份)及DIEA(125 μL,20等份)的混合物，並以DMF(3 x 1 mL)清洗小瓶，將此小瓶用於承裝樹脂。搖晃反應物2小時。以DMF(5 mL,5 x 1.5 min)及甲醇(5 mL)清洗該樹脂五次，並進行冷凍乾燥隔夜。要合成含Agp胜肽，需先合成對應的含Dap(Mtt)胜肽。接著，在含1% CF3COOH之CH2Cl2(4 mL,15 x 3 min)懸浮該樹脂以移除Mtt保護基並在室溫下搖晃。去保護作用持續進行直到過濾物不再呈現黃色。以CH2Cl2(4 mL,5 x 1.5 min)清洗該樹脂，並進行冷凍乾燥。由結合樹脂的保護胜肽移除相互獨立的保護基後，在含N,N’-雙-Boc-N”-三氟甲磺醯-胍(820.9 mg,2 mmol)及Et3N(480 μL,6.5 mmol)的CH2Cl2溶液中將此樹脂再懸浮。在室溫下搖晃反應物。以3 x 7 sec,30%功率的微波，每小時微波反應物一次。切割小量(約5 mg的胜肽結合樹脂並以RP-HPLC分析進行反應監測。以TFA(5 mL)與三異丙基矽烷(250 μL)將胜肽去保護並切割樹脂，接著搖晃2小時。以玻璃棉過濾反應物，並以TFA(3x3 mL)清洗反應物。將過濾物一起以微氣流N2去除水份。將殘餘物質以己烷(3 x 3 mL)清洗、溶解於水中，並冷凍乾燥。使用分析型HPLC分析胜肽，並利用MALDI-TOF質譜加以確認。分析型HPLC是在250 mm長C18管柱，流速為1 mL/min，100% A至0% A線性1%/min(溶劑A: 99.9%水，0.1% TFA；溶劑B: 90%乙腈，10%水，0.1% TFA)梯度條件下進行。選擇不同的線性梯度(溶劑A: 99.9%水，0.1% TFA；溶劑B: 90%乙腈，10%水，0.1% TFA)以製備型RP-HPLC(可裝設C4或C18管柱，使用10mL/min流速以及線性0.5%/min梯度)純化各胜肽。在Waters Breeze層析系統進行製備型RP-HPLC，使用Vydac C4和C18管柱(直徑22 mm，長250 mm)。
接著將Ac-Agp57-Tat-NH2與10μg/mL poly-dIdC一起進行膠體位移，測量Agp57與TAR-RNA作用力強弱。膠體位移之方式請參考前述實施例1，於此不再贅述。第九圖即為Ac-Agp57-Tat-NH2與10μg/mL poly(dI-dC)進行膠體位移之實驗結果。由圖中測得Ac-Agp57-Tat-NH2與TAR-RNA的KD=56±12，其結果與自然界Tat(KD=67±19)差異不大，此實驗結果證明側鏈長度n=1的非自然界Tat胜肽鏈與TAR-RNA亦具有結合的效果。
小結：本發明實施例結果顯示在Tat衍生胜肽中調整精胺酸側鏈長度(例如：縮短一個甲烯基成為Agb)以及調整精胺酸側鏈的電荷(例如：將NH2改為O)會造成RNA結合與細胞穿透兩種生物活性的改變，且對細胞的毒性極低，這顯示導入相似、但先前不存在的結構(例如：非天然胺基酸)能調控衍生胜肽的生物活性，並藉由上述各實施例結果了解各種側鏈修飾的Tat衍生胜肽對於RNA結合力與細胞穿透性之影響，進一步設計出抗-HIV療法或藥物傳輸系統。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。
<110>　國立台灣大學
<120>　具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽及其用途
<130>　11P1143
<160>　19
<170>　PatentIn version 3.5
<210>　1
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　所有位置的X均為(S)-2-胺基-3-胍基丁酸(Agb)
<400>　1
<210>　2
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　所有位置的X均為(S)-2-胺基-3-胍基己酸(Agh)
<400>　2
<210>　3
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人類免疫不全病毒
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<400>　3
<210>　4
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸；其他位置的X為Agh
<400>　4
<210>　5
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
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<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸；其他位置的X為Agb
<400>　6
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<211>　11
<212>　PRT
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<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為Cit
<400>　7
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<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為Cit
<400>　8
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<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為Cit
<400>　9
<210>　10
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為Cit
<400>　10
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<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為Cit
<400>　11
<210>　12
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為Cit
<400>　12
<210>　13
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　X in the position 1為6-carboxyfluorescein;X in the position 2為bAla;X in the other position為為Cit.
<400>　13
<210>　14
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸；其他位置的X為Cit
<400>　14
<210>　15
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸；其他位置的X為Cit
<400>　15
<210>　16
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸；其他位置的X為Cit
<400>　16
<210>　17
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸；其他位置的X為Cit
<400>　17
<210>　18
<211>　13
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(13)
<223>　在位置1的X為6-羧基螢光素；在位置2的X為β丙胺酸；其他位置的X為Cit
<400>　18
<210>　19
<211>　11
<212>　PRT
<213>　人工序列
<220>
<223>　合成胜肽
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為(S)-2-amino-3-guanidinopropionic acid
<220>
<221>　PEPTIDE
<222>　(1)..(11)
<223>　X為(S)-2-胺基-3-胍基丙酸(Agp)
<400>　19
第一圖為Jurkat細胞的覆蓋亮區及螢光顯微影像，在37℃胎牛血清中培養Jurkat細胞與7 μM Flu-AghTat(圖A),Flu-ArgTat(圖B),Flu-AgbTat(圖C)15分鐘，清洗並在37℃以胰蛋白酶處理5分鐘。
第二圖為Flu-XaaTat胜肽進行細胞穿透進入37℃胎牛血清存在的Jurkat細胞的流式細胞儀觀察結果。圖A：以7 μM Flu-XaaTat胜肽培養15分鐘的平均細胞螢光。圖B：以各種胜肽濃度(7,30,60,120 μM)培養15分鐘的平均細胞螢光。
第三圖為Flu-XaaTat胜肽進行細胞穿透進入Jurkat細胞的細胞穿透平均百分比，其中Jurkat細胞在胎牛血清存在時，以7 μM(圖A)及30 μM(圖B)Flu-XaaTat胜肽在37℃培養15分鐘。
第四圖為在37℃處於7 μM(圖A)及30 μM(圖B)胜肽AghTat、ArgTat以及AgbTat中4小時以MTT法測定的細胞存活結果。
第五圖為利用螢光各向異性度實驗方法測量Tat衍生胜肽與TAR-RNA的結合強弱的實驗結果。
第六圖為poly(dI-dC)存在下以膠體位移測試測定Tat衍生胜肽與TAR RNA解離常數的結果。
第七圖為Jurkat細胞在37℃,5% CO2以30 μM Tat衍生胜肽培養15分鐘並以胰蛋白酶處理10分鐘的螢光顯微影像結(圖A: 6CF-Tat-Cit49；圖B：6CF-Tat-Cit52；圖C：6CF-Tat-Cit53；圖D:6CF-Tat-Cit55；圖E：6CF-Tat-Cit56；圖F：6CF-Tat-Cit57)。
第八圖為細胞進入測試中Jurkat細胞的劑量依存性(dose dependent)螢光強度。(圖A表示胜肽濃度與螢光強度的關係；圖B為在30μM濃度時，各胜肽的平均螢光強度；圖C為在120μM濃度時，各胜肽的平均螢光強度)。
第九圖即為Ac-Agp57-Tat-NH2與10μg/mL poly-dIdC進行膠體位移之實驗結果。

Claims (15)

  1. 一種具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽，其包含下列結構式(I)： 其中，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為≦8之正整數；X為NH或O；Y、Y'、Y"為任意胺基酸；以及當X為NH時，n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之RNA病毒衍生胜肽，其中當X為O時，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為3。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之RNA病毒衍生胜肽，其中該RNA病毒衍生胜肽係指HIV病毒衍生胜肽。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之RNA病毒衍生胜肽，其中該HIV病毒衍生胜肽係指Tat(47-57)衍生胜肽。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之RNA病毒衍生胜肽，係為如下之序列：Tyr-Gly-Agb-Lys-Lys-Agb-Agb-Gln-Agb-Agb-Agb-NH2(SEQ ID NO: 1)，其中Agb為(S)-2-胺基-3-胍基丁酸。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之RNA病毒衍生胜肽，係為如下之序列：Tyr-GLy-Agh-Lys-Lys-Agh-Agh-GLn-Agh-Agh-Agh-NH2(SEQ ID NO: 2)，其中Agh為(S)-2-胺基-3-胍基己酸。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之RNA病毒衍生胜肽，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為2。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之RNA病毒衍生胜肽，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為4。
  9. 一種將具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽用於製備抑制RNA病毒之醫藥組合物之用途，其中該RNA病毒衍生胜肽包含下列結構式(I)： 其中，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為≦8之正整數；X為NH或O；Y、Y'、Y"為任意胺基酸；以及當X為NH時，n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為1~4，且n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
  11. 一種將具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽用於製備藥物傳輸之載體之用途，其中該RNA病毒衍生胜肽包含下列結構式(I)： 其中，n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為≦8之正整數；X為NH或O；Y、Y'、Y"為任意胺基酸；以及當X為NH時，n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之用途，其中n1、n2、n3、n4、n5、n6分別為1~8，且n1、n2、n3、n4、n5、n6不同時為3。
  13. 一種抑制RNA病毒之醫藥組合物，係包含：如申請專利範圍第1至8項中任一項之具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽；及一醫藥上可接受之佐劑。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組合物，進一步包含一藥物。
  15. 一種藥物載體，其係以如申請專利範圍第1至8項中任一項之具修飾側鏈之RNA病毒衍生胜肽而製得。
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