TW201309303A - 用於治療狼瘡的蛋白酶體抑制劑 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種治療個體中之狼瘡的方法，其包含向該個體投予化合物A之步驟：□

Description

用於治療狼瘡的蛋白酶體抑制劑
狼瘡療法。
狼瘡(全身性紅斑狼瘡，SLE)為慢性自體免疫疾病，其特徵為存在經活化之T細胞及B細胞、自體抗體及攻擊身體多個部位(包括關節、皮膚、腎臟、CNS、心臟組織及血管)之慢性炎症。在嚴重情況下，抗體沈積於腎臟細胞(腎小球)中，從而造成炎症及可能的腎衰竭(一種稱作狼瘡性腎炎之病狀)。
儘管狼瘡之病因仍然未知，但該疾病之表現與遺傳多型性、環境毒素及病原體相關(Morel 2010；Fairhurst,Wandstrat等人，2006)。另外，性別、激素影響及細胞激素失調與狼瘡發展緊密相關(Aringer及Smolen 2004；Smith-Bouvier,Divekar等人，2008)。受狼瘡影響之女性為男性之九倍。其可能在任何年齡發生，但最常在10歲至50歲人中出現。非裔美國人及亞洲人相較於其他種族的人更常受影響。
狼瘡尚無治癒方法。狼瘡之當前療法旨在控制症狀，且限於具有嚴重副作用之毒性劑及免疫抑制劑(諸如高劑量糖皮質激素及/或羥基氯奎)。嚴重疾病(例如具有腎臟受損病徵之患者)需要更具侵襲性的藥物，包括黴酚酸嗎啉乙酯(MMF)、硫唑嘌呤(AZA)及/或環磷醯胺(CTX)(Bertsias及Boumpas 2008)。CTX、AZA及MMF極具毒性 及免疫抑制性，且僅50%經治療患者得到完全好轉，且2年時間內之復發率高達30%。
蛋白酶體抑制劑展示作為狼瘡療法的一定潛力。在近期研究中，硼替佐米(bortezomib)-FDA批准之唯一蛋白酶體抑制劑(由Millennium Pharmaceuticals以商標名Velcade®銷售以用於多發性骨髓瘤)-相較於媒劑顯著提高易患狼瘡之NZB/W F1小鼠的存活率，且亦明顯減少蛋白尿且改良腎臟病變(Neubert,Kirsten等人，2008；Lee,S.W.及Kim,B.S.,2010)。在一更受限研究(6個對照動物，5個使用藥物)中，硼替佐米亦顯著改良MRL/lpr小鼠之存活率(p=0.03)(Neubert,Kirsten等人，2008)。在患有多發性骨髓瘤與狼瘡之女性的個案研究中，硼替佐米與潑尼松龍(prednisolone)組合改良患者之狼瘡症狀(Fröhlich,Karen等人，2010)。硼替佐米用作狼瘡療法之障礙為硼替佐米伴有嚴重副作用(諸如多發性神經病、血小板減少及胃腸併發症)(Lee,S.W.及Kim,B.S.,2010；Fröhlich,Karen等人，2010)。
需要針對狼瘡(包括狼瘡性腎炎)之新穎療法。
提供治療個體中之狼瘡的方法，其包含向個體投予化合物A之步驟：
在一個具體實例中，個體為人類。在一個具體實例中，化合物A以前藥形式投予。在一個具體實例中，前藥為化合物A之硼酸酯。在一個具體實例中，前藥為化合物B：
在一個具體實例中，化合物A每週投予一次。在一個具體實例中，化合物A以約0.5 mg/m2至約5 mg/m2之劑量投予。在一個具體實例中，化合物A以約1 mg/m2至約3 mg/m2之劑量投予。在一個具體實例中，化合物A以約2 mg/m2之劑量投予。
在一個具體實例中，在治療期間個體之一或多種血清細胞激素減少。在一個具體實例中，在治療期間個體之IL-12減少。在一個具體實例中，在治療期間個體之一或多種血清抗核抗體減少。在一個具體實例中，在治療期間個體之血清抗染色質IgG減少。在一個具體實例中，在治療期間 個體之血清抗Smith Ag IgG減少。在一個具體實例中，在治療期間個體之血清抗dsDNA IgG減少。在一個具體實例中，在治療期間個體之蛋白尿減少。在一個具體實例中，在治療期間個體之血清C3增多。
如本文所用之術語「約(about)」在涉及可量測值(諸如量、時距(temporal duration)及其類似可量測值)時意欲包涵該值之合理偏差，諸如規定值±10%。舉例而言，片語「約50%(about 50%)」包涵50%之合理偏差，諸如數值50±10%，或45%至55%。
如本文所用之術語「個體(subject)」包括溫血動物，較佳哺乳動物，包括人類。在一較佳具體實例中，個體為靈長類動物。在一甚至更佳具體實例中，個體為人類。
提供藉由向個體投予化合物A治療個體中之狼瘡的方法。化合物A為化學名稱[(1R)-1-[[(2S,3R)-3-羥基-2-[6-苯基-吡啶-2-羰基)胺基]-1-側氧基丁基]胺基]-3-甲基丁基硼酸之蛋白酶體抑制劑(參見Bernardini等人，美國專利第7,576,206號)。化合物A具有如下結構：
已發現化合物A在治療狼瘡方面優於硼替佐米。此發 現令人驚訝，因為化合物A與硼替佐米均為可逆的硼酸蛋白酶體抑制劑，其經由活化外源性及內源性凋亡信號傳導路徑而誘導細胞死亡(Chauhan D,Anderson K.C.2003；Piva R,Ruggeri B等人，2008)。此外，兩種藥劑均主要以蛋白酶體之胰凝乳蛋白酶樣催化活性為目標，較少抑制卡斯蛋白酶樣活性且幾乎不抑制胰蛋白酶樣活性(Piva R,Ruggeri B等人，2008；Demo SD,Kirk CJ等人，2007)。因此，化合物A與硼替佐米似乎具有類似的作用機制。另外，該等化合物具有極類似之化學結構。因此，化合物A相較於硼替佐米對抗狼瘡之功效提高的機制尚未知曉。
本發明中所用之化合物A可以任何適合化學形式(包括前藥形式)投予。適合前藥包括母化合物之醫藥學上可接受之酯形式。前藥較佳在投予後轉化為母化合物(亦即化合物A)。如本文所用之「醫藥學上可接受之酯(pharmaceutically acceptable ester)」指母化合物之衍生物，其中硼酸殘基藉由製成其酯而修飾。前藥較佳為硼酸酯。前藥更佳為環狀硼酸酯。環狀硼酸酯之實例包括(但不限於)二乙醇胺硼酸酯、二異丙醇胺硼酸酯、胺基二乙酸硼酸酯、松節烷二醇硼酸酯、頻哪醇硼酸酯、1,2-乙二醇硼酸酯、1,3-丙二醇硼酸酯、1,2-丙二醇硼酸酯、2,3-丁二醇硼酸酯、1,1,2,2-四甲基乙二醇硼酸酯、1,2-二異丙基乙二醇硼酸酯、5,6-癸二醇硼酸酯、1,2-二環己基乙二醇硼酸酯、雙環己基-1,1'-二醇及1,2-二苯基-1,2-乙二醇硼酸酯。前藥較佳為二乙醇胺硼酸酯、二異丙醇胺硼酸酯或胺基二乙酸 硼酸酯。前藥更佳為二乙醇胺硼酸酯或二異丙醇胺硼酸酯。前藥更佳為二乙醇胺硼酸酯-亦即化合物B：
因此，在某些具體實例中，化合物A以前藥形式投予。在一個具體實例中，化合物A以化合物A之硼酸酯衍生物形式投予。在一個具體實例中，化合物A以化合物A之環狀硼酸酯衍生物形式投予。在一個具體實例中，化合物A以環狀硼酸酯化合物B之形式投予：
可使用任何適合投藥方法。實例包括注射(皮下、靜脈內、非經腸、腹膜內、鞘內等)、經口、經直腸、經黏膜、吸入及經皮。當藉由注射投藥時，注射可為快速或連續輸注。化合物A較佳藉由靜脈內(IV)注射、皮下(SQ)注射或經口(諸如以錠劑或膠囊)投予。化合物A更佳藉由靜脈內(IV)注射或皮下(SQ)注射投予。舉例而言，化 合物A可以無菌凍乾粉末形式提供，其可在注射前用例如無菌注射用水、生理食鹽水溶液(NaCl)或甘露糖醇水溶液復原。因此，在一個具體實例中，化合物A藉由注射投予。在另一具體實例中，化合物A藉由IV注射投予。在另一具體實例中，化合物A藉由SQ注射投予。在另一具體實例中，化合物A經口投予。在一個具體實例中，化合物A以錠劑經口投予。在另一具體實例中，化合物A以膠囊經口投予。
本發明中所用之化合物A典型地以醫藥組成物形式投予個體。除化合物A及/或其前藥以外，化合物A之醫藥組成物典型地含有至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。該等賦形劑可製備溶液、錠劑、丸劑、糖衣藥丸、粉末、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液、乳液及其類似物。
經口使用之醫藥製劑可藉由組合化合物A及/或其前藥與固體賦形劑、視情況研磨所得混合物且必要時在添加適合助劑後加工顆粒之混合物以獲得錠劑或糖衣藥丸核心而獲得。適合賦形劑包括填充劑或稀釋劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、抗黏著劑、滑動劑、濕潤劑及表面活性劑、著色劑及顏料、調味劑、甜味劑、吸附劑及味道遮蔽劑。
典型地，將稀釋劑添加至少量活性藥物中以增大錠劑之尺寸。最常用稀釋劑為乳糖，其以兩種異構形式(α-乳糖或β-乳糖)存在，且可為晶形或非晶形。各種類型之乳糖包括噴霧乾燥乳糖單水合物(諸如Super-TabTM)、α-乳糖單水合物(諸如Fast Flo®)、無水α-乳糖、無水β-乳糖及聚結 乳糖。其他稀釋劑包括糖，諸如可壓縮糖NF、右旋糖賦形劑NF及葡萄糖結合劑(dextrate)NF。較佳稀釋劑為乳糖單水合物(諸如Fast Flo®)。其他較佳稀釋劑包括微晶纖維素(諸如Avicel® PH及CeolusTM)及微細纖維素(諸如Elcema®)。稀釋劑可包括澱粉及澱粉衍生物。澱粉包括獲自小麥、玉米、稻穀及馬鈴薯之天然澱粉。其他澱粉包括預膠凝化澱粉NF及羥乙酸澱粉鈉NF。澱粉及澱粉衍生物亦可充當崩解劑。其他稀釋劑包括無機鹽，諸如磷酸氫鈣USP(諸如Di-Tab®及Emcompress®)、磷酸三鈣NF(諸如Tri-Tab®及Tri-Cafos®)及硫酸鈣NF(諸如Compactrol®)。諸如甘露糖醇USP、山梨糖醇NF及木糖醇NF之多元醇亦可充當稀釋劑。許多稀釋劑亦充當崩解劑及黏合劑，且在開發調配物時必須考慮此等額外特性。
錠劑調配物中包括崩解劑以使錠劑分解成活性醫藥成分及賦形劑之粒子，從而有利於溶解活性成分且提高活性成分之生體可用率。澱粉及澱粉衍生物(包括澱粉之羧甲基醚的交聯鈉鹽(諸如羥乙酸澱粉鈉NF：Explotab®及Primogel®))為有用崩解劑。較佳崩解劑為預膠凝化澱粉，諸如澱粉1500®。另一較佳崩解劑為交聯羧甲基纖維素鈉(諸如交聯羧甲基纖維素鈉NF：Ac-Di-Sol®)。其他崩解劑包括交聯聚乙烯吡咯啶酮(諸如交聯普維酮(Crospovidone)NF)、微晶纖維素(諸如Avicel® PH)。
黏合劑用作濕式造粒賦形劑以使活性醫藥成分及其他賦形劑聚結。黏合劑經選擇以改良粉末流動性及改良壓塑 性。黏合劑包括纖維素衍生物，諸如微晶纖維素NF、甲基纖維素USP、羧甲基纖維素鈉USP、羥丙基甲基纖維素USP、羥乙基纖維素NF及羥丙基纖維素NF。其他黏合劑包括聚維酮、聚乙烯吡咯啶酮、明膠NF、天然膠(諸如阿拉伯膠、黃蓍膠、瓜爾膠及果膠)、澱粉糊、預膠凝化澱粉NF、蔗糖NF、玉米糖漿、聚乙二醇及褐藻酸鈉、褐藻酸銨鈣、矽酸鎂鋁、聚乙二醇。較佳黏合劑為聚乙烯吡咯啶酮，尤其聚普維酮(Povidone)USP，且較佳為聚普維酮K-29/32。
錠劑調配物中可使用潤滑劑以防止錠劑黏附於衝壓面及減少壓縮階段中之摩擦力。潤滑劑典型地包括植物油(諸如玉米油)、礦物油、聚乙二醇(諸如PEG-4000及PEG-6000)、硬脂酸鹽(諸如硬脂酸鈣及硬脂醯基反丁烯二酸鈉)、無機鹽(諸如滑石)、無機鹽(諸如氯化鈉)、有機鹽(諸如苯甲酸鈉、乙酸鈉及油酸鈉)及聚乙烯醇。較佳潤滑劑為硬脂酸鎂。
糖衣藥丸核心可具有適合包衣。出於此目的，可使用濃糖溶液，其可視情況含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯啶酮、卡波莫凝膠(carbopol gel)、聚乙二醇及/或二氧化鈦、漆液及適合有機溶劑或溶劑混合物。可向錠劑或糖衣藥丸包衣中添加染料或顏料以鑑別或特性化活性化合物劑量之不同組合。
可經口使用之醫藥製劑包括由明膠製成之推入適配膠囊(push-fit capsule)以及由明膠及增塑劑(諸如甘油或山梨糖醇)製成之軟密封膠囊。推入適配膠囊可含有化合物A 及/或其前藥與填充劑(諸如乳糖)、黏合劑(諸如澱粉)及/或潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)及視情況選用之穩定劑的混合物。在軟膠囊中，化合物A及/或其前藥可溶解或懸浮於適合液體(諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇)中。另外，可添加穩定劑。經口投予之所有調配物應呈適於該投予之劑量。
化合物A及/或其前藥可調配成用於藉由注射(例如藉由快速注射或連續輸注)非經腸投予。用於注射之調配物可以單位劑型提供，例如在安瓿中或多劑量容器中，視情況添加有防腐劑。組成物可採用諸如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液之形式且可含有賦形劑(諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑)。
用於非經腸投予之醫藥調配物包括水溶形式之化合物A及/或其前藥之水溶液。另外，化合物A及/或其前藥之懸浮液可製備成適當油性注射懸浮液。適合親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油，諸如芝麻油；或合成脂肪酸酯，諸如油酸乙酯或三甘油酯；或脂質體。水性注射懸浮液可含有提高懸浮液黏度之物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或聚葡萄糖。視情況，懸浮液亦可含有提高化合物A之溶解性以使得可製備高濃度溶液之適合穩定劑或試劑。
化合物A及/或其前藥可為粉末形式以在使用前用適合媒劑(例如無菌注射用水)構成。舉例而言，醫藥組成物可為凍乾粉末。凍乾粉末較佳例如使用0.9% NaCl復原且藉由注射投予。WO 2010/114982中揭示適用於本發明之凍乾 粉末。
凍乾粉末之賦形劑包括具有美國食品與藥品管理署(Food and Drug Administration，FDA)認可的「普遍認為安全」(GRAS)級別的增積劑。該等增積劑為醫藥凍乾技術中所熟知，趨向於強化所得凍乾餅塊之結構且可用於本發明中。較佳增積劑包括醣(較佳單醣或寡醣)、胺基酸、糖醇及其混合物。更佳增積劑包括醣(更佳單醣或寡醣)、糖醇及其混合物。本發明中所用之增積劑更佳包括蔗糖、右旋糖、麥芽糖、乳糖、山梨糖醇、甘胺酸及聚葡萄糖。最佳增積劑為甘露糖醇。
環糊精亦可用於凍乾粉末醫藥組成物中。較佳環糊精包括天然存在之環糊精、甲基-β-環糊精、二甲基-β-環糊精、三甲基-β-環糊精、2-羥基甲基-β-環糊精、羥乙基-β-環糊精、2-羥丙基-β-環糊精、3-羥丙基-β-環糊精、β-環糊精硫酸鹽、β-環糊精磺酸鹽或β-環糊精磺基丁基醚。其中大多數可購自諸如Aldrich Chemical公司，Milwaukee Wisconsin及Wacker Chemicals,New Canaan,Connecticut之供應商。較佳環糊精包括β-環糊精、羥丙基-β-環糊精及β-環糊精磺基丁基醚。環糊精較佳為羥丙基β環糊精、羥丙基γ環糊精、磺基丁基醚β-環糊精或其混合物。較佳環糊精包括羥丙基-β-環糊精及β-環糊精磺基丁基醚。在一個具體實例中，環糊精為β-環糊精磺基丁基醚。在另一具體實例中，環糊精為羥丙基-β-環糊精。尤其較佳之環糊精為KLEPTOSE® HPB，購自Roquette Frères,France。
醫藥組成物較佳含有1%至95%(w/w)活性化合物(亦即本發明化合物)。醫藥組成物更佳含有5%至70%(w/w)活性化合物。
醫藥組成物較佳含有至少一單位劑量之活性化合物。一般而言，對於典型個體，化合物A及/或其前藥之單位劑量為約0.1 mg/m2至約10 mg/m2。化合物A及/或其前藥之單位劑量更佳為約0.5 mg/m2至約5 mg/m2。單位劑量更佳為約1 mg/m2至約5 mg/m2。單位劑量更佳為約2 mg/m2至約4 mg/m2。單位劑量更佳為約1 mg/m2至約3 mg/m2。單位劑量更佳為約2 mg/m2至約3 mg/m2。單位劑量更佳為約2 mg/m2至約2.5 mg/m2。單位劑量更佳為約2 mg/m2。
化合物A以有效治療狼瘡之量，亦即有效預防、減輕或改善該疾病之症狀，延長所治療個體之存活及/或有利地影響個體中之狼瘡相關生物標記物的量投予。根據本文所提供之詳細揭示內容及實施例確定化合物A之有效量完全在熟習此項技術者能力範疇內。有效量可視諸如以下因素而變化：個體之體型、狼瘡病之嚴重性、投藥頻率、化合物之生體可用率、個體之健康狀況及併發症，及任何共同療法(例如糖皮質激素)之量及性質。舉例而言，單一療法中化合物A之有效量可為相較於化合物A與其他狼瘡療法一起組合使用時化合物A之有效量較高的劑量。有效劑量可自來源於試管內或動物模型測試系統之劑量-反應曲線外推，且可基於個體之表面積或體重。
治療可以小於化合物之最佳劑量的較小劑量開始。之 後，可以小幅增量提高劑量直至在該等情況下達到最佳作用。總日劑量可在一日內分成數份且逐份投予。為最佳化給藥方案，化合物A之有效性可藉由監測治療對進行治療之個體之各種生物標記物的作用來監測。有用生物標記物包括本文實施例部分中所列之生物標記物(例如抗核抗體、細胞激素(諸如IL-12)、蛋白尿、血清補體等)。監測狼瘡治療有效性之兩種尤其適宜的生物標記物為蛋白尿及抗核抗體。有效劑量之化合物A較佳以適宜方式使生物標記物相較於治療前之生物標記物含量改變(例如蛋白尿減少、抗核抗體減少、血清C3增加等)。因此，化合物A之有效劑量可藉由以低劑量開始，隨後上調同時監測一或多種此等生物標記物而最佳化。一般而言，較佳在開始治療前初始評定患者之生物標記物(例如蛋白尿或抗核抗體)，且在治療期間在不同時間點再進行一或多次評定。在該使用方式中，在治療前測定基線測定值，隨後在治療過程中測定生物標記物(例如蛋白尿或抗核抗體)之變化且視需要調節劑量。或者，可在治療期間進行兩次或兩次以上連續測定而無需治療前基線量測。在該使用方式中，應對個體進行生物標記物(例如蛋白尿或抗核抗體)之第一評定作為基線含量以判定該含量增加或減少且因此調節或維持劑量。
在較佳具體實例中，用化合物A進行治療之個體與狼瘡病有關之一或多種生物標記物發生適宜變化。與狼瘡有關之適合生物標記物包括淋巴腫大、脾腫大、血清IL-12、 血清C3、血清抗核抗體、抗染色質IgG、抗Smith Ag IgG、血清抗dsDNA抗核抗體、血清IFNα、蛋白尿、血清IL-17A、血清IL-6、血清CCL3/MIP-1α、血清CXCL10/IP-10、血清CXCL9/MIG、血清IL-4、血清IL-13、血清IL-1β、血清TNFα、血清KC/IL-8及血清CTx。因此，在一個具體實例中，個體在用化合物A治療期間淋巴腫大減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間脾腫大減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清IL-12減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清C3增多。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清抗核抗體減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間抗染色質IgG減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間抗Smith Ag IgG減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清抗dsDNA抗核抗體減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清IFNα減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間蛋白尿減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清IL-17A減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清IL-6減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清CCL3/MIP-1α減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清CXCL10/IP-10減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清CXCL9/MIG減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清IL-4減少。在另一具體實例 中，個體在用化合物A治療期間血清IL-13減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清IL-1β減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清TNFα減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清KC/IL-8減少。在另一具體實例中，個體在用化合物A治療期間血清CTx減少。
化合物A可以任何適合劑量投予個體。在一個具體實例中，化合物A劑量在約0.1 mg/m2至約10 mg/m2範圍內。在另一具體實例中，化合物A劑量為約0.5 mg/m2至約5 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約1 mg/m2至約5 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約0.5 mg/m2至約3 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約1 mg/m2至約4 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約2 mg/m2至約4 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約1 mg/m2至約3 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約1.5 mg/m2至約3 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約2 mg/m2至約3 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約2 mg/m2至約2.5 mg/m2。在另一具體實例中，化合物A劑量為約2 mg/m2。較佳化合物A劑量包括(但不限於)1.1 mg/m2、1.5 mg/m2、1.8 mg/m2、2.1 mg/m2、2.4 mg/m2、2.7 mg/m2及3.0 mg/m2。化合物A劑量更佳為1.8 mg/m2、2.1 mg/m2、2.4 mg/m2或2.7 mg/m2。化合物A劑量更佳為2.1 mg/m2或2.4 mg/m2。前述劑量適用於投予化合物A之任何方法，且尤其適用於皮下或靜脈 內給藥。化合物A之口服劑量典型地為前述範圍之上限，諸如約1 mg/m2至約7 mg/m2。在一個具體實例中，化合物A之口服劑量為約2 mg/m2至約6 mg/m2，諸如約3 mg/m2至約5 mg/m2。例示性口服化合物A劑量包括(但不限於)2 mg/m2、3 mg/m2、4 mg/m2、5 mg/m2及6 mg/m2。
各化合物A劑量之投予方案可視諸如以下因素而變化：劑型之藥物動力學、所治療或抑制之狼瘡症狀的類型、個體之體型及狼瘡病之嚴重性。化合物A之投予時間可由治療醫師根據上述考慮因素及本發明之詳細揭示內容而容易地改變以最佳化功效及使副作用最小。根據本發明，化合物A之給藥時程存在較大靈活性。
化合物A可以上述劑量根據任何適合時程投予。在該給藥時程內，化合物A劑量可為恆定或變化的。化合物A劑量在該時程期間較佳維持在恆定水準，除非觀察到顯著藥物相關毒性，在該情況下可降低後續劑量，例如降低約20-30%。適合化合物A時程典型地在每天給予一次至每週給予一次或甚至每月給予一次的範圍內。化合物A之投予頻率較佳小於每天一次，諸如每2-14天給予一次。化合物A較佳每3至28天、諸如每3至14天投予。舉例而言，化合物A可每週投予兩次。在另一實施例中，化合物A可每週投予一次。在另一實施例中，化合物A可每兩週投予一次。該時程可包括在用化合物A治療一或多週(諸如2、3或4週)後，不投予化合物A至少5天之時段，諸如約7至21天之時段。在一個具體實例中，休止期為約10至17 天，諸如約10天或約17天。舉例而言，化合物A可在21天週期之第1天、第4天、第8天及第11天投予，其中第12-21天為休止期。在另一具體實例中，化合物A可在28天週期之第1天、第4天、第8天及第11天投予，其中第12-28天為休止期。在另一具體實例中，化合物A可在28天週期之第1天、第8天及第15天投予，其中第16-28天為休止期。在另一具體實例中，化合物A可在21天週期之第1天及第8天投予，其中第12-21天為休止期。在另一具體實例中，化合物A可在28天週期之第1天及第8天投予，其中第12-28天為休止期。在另一具體實例中，化合物A可在21天週期之第1天及第15天投予。在另一具體實例中，化合物A可在28天週期之第1天及第15天投予。預定給藥週期可重複一或多次。舉例而言，預定週期可重複直至觀察到最大反應，再加一或兩個週期。作為另一實例，預定週期可重複6至12個週期。視情況，在完成初始週期後，可使用「維持時程(maintenance schedule)」，其中化合物A之投予頻率及/或劑量小於初始時程，諸如每週一次、每兩週一次、每三週一次或每四週一次。維持時程可持續固定時段，一般為1-2年，或無限期，只要患者繼續不展示進行性疾病之病徵且耐受治療而無顯著毒性即可。在某些具體實例中，給藥時程可自適用於治療其他疾病(諸如多發性骨髓瘤)之化合物A給藥時程修改。舉例而言，當前正研究化合物A用於治療多發性骨髓瘤，藉由在重複28天週期之第1天、第8天及第15天投予化合物A(約2 mg/m2)。
一或多個其他狼瘡療法可與投予化合物A組合使用。該等療法包括(但不限於)糖皮質激素、羥基氯奎、黴酚酸嗎啉乙酯(MMF)、硫唑嘌呤(AZA)及環磷醯胺(CTX)。此等藥劑之適當劑量為此項技術中所熟知。
材料及方法 化合物
可藉由類似於本文所報導之程式獲得呈固體灰白色粉末狀之化合物A。硼替佐米可藉由類似於本文所報導之程式獲得。地塞米松(Dexamethasone)(DEX，10 mg/mL，液體，批號089016)可購自Hanna's Pharmaceuticals(Wilmington,DE)。環磷醯胺(CTX；Hanna's Pharmaceuticals,Wilmington,DE)以50 mg/kg使用，每週腹膜內注射一次。用於化合物A及硼替佐米之懸浮液之媒劑為87% PBS、3% DMSO、10% Solutol(Mutchler公司，Solutol HS 15)。
化合物A及硼替佐米在-80℃下以單次使用等分試樣儲存於75 μL DMSO中。經由添加87% PBS加上10% Solutol稀釋此等等分試樣至最終濃度以使最終濃度等於每份調配物3% DMSO。
合成
製備1. (1R)-1-[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁胺鹽酸鹽。
向裝配有頂置式攪拌、氮氣吹掃、讀取溫度之熱電偶、1公升加料漏斗、表面下氣體分散管及輔助加熱器/致冷器 之20公升Chemglass®夾套反應器中饋入8.0公升無水甲基第三丁基醚。致冷器設定為-40℃。在攪拌下冷卻溶劑至-31.3℃。隨後，在維持溫度在-25.7℃至-10.0℃下，經1.75小時在表面下添加714.4 g(19.71 mol，5.0 eq)HCl(g)。接著，將1.6235 kg(3.964 mol)N,N-雙(三甲基矽烷基)-(1R)-1-[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁胺(藉由類似於美國專利公開案第2005/0240047號(Pickersgill等人)中所揭示之方法獲得)溶解於2.1公升甲基第三丁基醚中。隨後，在維持反應溫度在-25℃至-10℃下，經40分鐘將溶液添加至HCl溶液中。完成添加後，使反應物升溫至環境溫度且關閉致冷器。使反應物升溫至環境溫度且攪拌隔夜。隨後，於旋轉蒸發儀上濃縮反應物至1-2公升之體積。將3公升庚烷添加至混合物中且繼續蒸餾以再移除3公升餾出物。接著，再逐份添加6公升庚烷，同時再移除1公升餾出物。將產物混合物轉移至如先前所述裝配之20公升Chemglass®夾套反應器中且在環境溫度下緩慢攪拌隔夜。次日早晨，冷卻混合物至約-15℃至-10℃且攪拌1小時。經由裝配有1號Whatman®濾紙之中號玻璃燒結過濾漏斗過濾產物。用2公升冷(0℃)庚烷洗滌產物餅塊，於烘箱中在真空(29 mmHg)下在35℃下乾燥且用氮氣吹洗。產量為996.0 g(84%)，純度為93.9A%，且非對映異構體比率為98.75：1.25(d.e.=97.5%)。
製備2. 6-(2S,3R)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼 (borocan)-2-基)-3-甲基丁基}-3-羥基-2-{(6-苯基吡啶-2-基)甲醯胺基]丁醯胺(亦即化合物B)
步驟A.製備6-苯基-吡啶-2-甲醯氯。向裝配有頂置式攪拌器、熱電偶、具有數位溫度控制器之加熱套、冷凝器及氮氣進口/出口之2-L三頸圓底燒瓶中饋入100.0 g(0.502 mol)6-苯基-2-吡啶甲酸及1500 mL甲苯(Kf<0.02 wt%)，隨後升溫至40℃。隨後經由加料漏斗經20分鐘將亞硫醯氯(110 mL；1.51 mol，3 eq)添加至稀漿液中。加熱稀漿液至75℃且攪拌隔夜(約10-16小時)，直至其變為透明溶液。冷卻反應混合物至室溫後，如下在真空中移除溶劑及過量亞硫醯氯：在40℃(浴溫)下在全真空下汽提反應混合物至約1/3其初始體積(約500 mL)，隨後添加1000 mL新鮮甲苯。繼續濃縮，再次汽提至1/3初始體積(約500 ml)，繼而再用1000 mL新鮮甲苯稀釋。所移除甲苯之總量為約2000 mL。
步驟B.製備(2S,3R)-3-羥基-2-[側氧基-2-(6-苯基-吡啶-2-基)-乙基}-丁酸。在3-L三頸圓底燒瓶上裝配頂置式攪拌器、熱電偶、均壓滴液漏斗、氮氣進口/出口及冰/水冷卻浴。依序添加62.8 g(0.53 mol)L-蘇胺酸、117 g(1.1 mol)碳酸鈉及1500 mL去離子水。冷卻水溶液至10.0℃。在此期間向加料漏斗中饋入步驟A中所製備之醯氯/甲苯溶液。在約10℃下經約10分鐘向水性反應物中逐滴添加此甲苯溶液。完成添加後，使反應物升溫至室溫(約22-25℃)且劇烈攪拌直至藉由HPLC分析展示反應完成(典型地為約3 小時)。隨後將反應混合物轉移至分液漏斗且分離兩層。隨後將下方之水相再饋入反應燒瓶中。隨後將甲醇(800 mL)添加至混合物中，繼而用2.5 M HCl(約850 mL)調節pH值(目標pH值=1-2)，同時保持溫度在15-20℃下。典型地，在pH值為約5時釋放一些氣體，繼而在pH值=3時產物沈澱。調節pH值後在室溫下攪拌漿液30分鐘。藉由真空過濾(母液損耗小於2 mg/mL)收集白色固體，用去離子水(2×500 ml)洗滌，隨後在真空烘箱中在40℃下在氮氣吹掃下乾燥至恆重，得到141 g(0.471 mol，94%)標題化合物，HPLC純度為99A%(95 wt%)。1H NMR(d6-DMSO,400MHz)δ 12.9(s,1H,b),8.71(d,1H,J=9.16 Hz),8.23(d,1H,J=7.24 Hz),8.1(m,3H),8.03(d,1H,J=7.0 Hz),7.55(m,3H),5.34(s,1H,b),4.46(dd,1H,J=2.52,9.16 Hz),4.34(dd,1H,J=1.92,6.24 Hz),1.15(d,3H,J=6.4 Hz)。
步驟C.製備N-[(1S,2R)-1[[[(1R)-1-1[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基]胺基]羰基]2-羥丙基]-6-苯基-2-吡啶甲醯胺。向裝配有熱電偶、具有葉輪之攪拌軸、加料漏斗及低溫再迴圈浴之10公升夾套反應容器中饋入156.1 g(0.52 mol，1.0 eq)(2S,3R)-3-羥基-2-[側氧基-2-(6-苯基-吡啶-2-基)-乙基]-丁酸、218.8 g(0.575 mol，1.1 eq)O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N'N'-四甲基六氟磷酸鹽(HATU)、157.7 g(0.522 mol，1.0 eq)(1R)-1-[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3- 甲基丁胺鹽酸鹽(異丁基非對映異構體之98.8：1.2混合物(R：S))及2355 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。開始攪拌以溶解固體，隨後冷卻反應混合物至低於-25.0℃。向加料漏斗中饋入二異丙基乙胺(218.6 mL，162.2 g，1.25 mol，2.4 eq)，隨後在-25℃至-30℃下經約30分鐘逐滴添加至反應混合物中。添加完成後，在-30℃下攪拌反應物六小時。向另一裝配有頂置式攪拌器及熱電偶之22公升四頸反應燒瓶中饋入3925 mL DI水及3925 mL乙酸乙酯。在室溫下經5分鐘將反應混合物轉移至此燒瓶中。分離下方之水層且丟棄。製備393 g磷酸二氫鈉單水合物於3925 mL DI水中之溶液且用此溶液洗滌有機相。再次移除下方之水相且丟棄。製備376.9 g碳酸氫鈉於4710 mL DI水中之溶液且在分成兩部分後用此溶液洗滌有機相。再一次分離下方之水相且丟棄。使用481.4 g氯化鈉於3140 mL DI水中製備飽和氯化鈉溶液且用此溶液洗滌有機相，分離各層且丟棄下方之水相。將Norit GAC 1240+碳(157 g)添加至有機相中且在室溫下攪拌懸浮液隔夜(13.8小時)。藉由經由Whatman GF/C玻璃纖維濾紙真空過濾移除碳，隨後用350 mL乙酸乙酯洗滌。在真空下在33-44℃之浴溫下在旋轉蒸發儀上濃縮濾液成泡沫狀物，得到231.5 g(0.422 mol，80.9%)呈泡沫狀之標題化合物，化學純度為96.4%。蘇胺酸異構體之含量為1.16A%。1H NMR(d6-DMSO,400 MHZ)δ 8.98(d,b,1H,J=2.99 Hz),8.76(d,1H,J=8.55 Hz),8.2(m,3H),8.11(t,1H,J=7.71 Hz),8.02(d,1H,J=7.54 Hz),7.54(m,3H),5.26 (d,1H,J=4.95 Hz),4.49(dd,1H,J=4.22,8.52 Hz),4.13(m,2H),2.6(m,b,1H),2.19(m,b,1H),2.02(m,b,1H),1.83(t,1H,J=5.38 Hz),1.75(s,b,1H),1.68(m,b,1H),1.62(d,1H,J=13.9 Hz),1.36(d,1H,J=10.05 Hz),1.3(m,b,3H),1.22(d,6H,J=11.65 Hz),1.12(d,3H,J=6.26 Hz),0.84(d,6H,J=6.57 Hz),0.79(s,3H)。
步驟D.製備6-(2S,3R)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基}-3-羥基-2-{(6-苯基吡啶-2-基)甲醯胺基]丁醯胺(亦即化合物B)
選擇1-兩步程式：在12公升四頸圓底燒瓶上裝配頂置式攪拌器、熱電偶及氮氣出口，隨後饋入229.8 g(0.42 mol，1 eq)N-[(1S,2R)-1[[[(1R)-1-1[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基]胺基]羰基]2-羥丙基]-6-苯基-2-吡啶甲醯胺於2310 mL甲醇中之溶液。向其中添加3465 mL正庚烷、108 g(1.06 mol，2.5 eq)(2-甲基丙基)硼酸及70 mL(84 g，0.85 mol，2.0 eq)37%鹽酸於353 mL DI水中之溶液。開始攪拌且在室溫下攪拌兩相混合物16小時。將反應混合物逐份轉移至4公升分液漏斗中，分離下方之甲醇相且放回反應燒瓶中。丟棄上方之庚烷層。將新鮮饋料3465 mL正庚烷添加至反應物中且在室溫下再攪拌反應物2小時。停止攪拌，分離各相且用正庚烷(2×4600 mL)萃取下方甲醇層。丟棄庚烷相且在真空中在40℃之浴溫下濃縮甲醇相。將乙酸乙酯(4620 mL)饋入蒸發燒瓶中且溶解黏性黃色殘餘物，隨後轉移至12公 升反應燒瓶中。製備665.4 g碳酸氫鈉於7650 mL DI水中之溶液且用於以兩份(1×4000 mL及1×3850 mL)洗滌乙酸乙酯層。製備1059.7 g氯化鈉於2700 mL DI水中之溶液，隨後用於洗滌乙酸乙酯相。
分離各層後，用47.3 g(0.45 mol，1.1 eq)二乙醇胺處理乙酸乙酯層。在室溫下攪拌混合物隔夜。藉由真空過濾使用密閉之過濾燒瓶收集沈澱之固體，且用500 mL乙酸乙酯洗滌濕濾餅。將密封之過濾漏斗轉移至手套箱中，在手套箱中將其打開且將481.8 g濕濾餅轉移至兩個派熱司(pyrex)乾燥盤中，隨後將乾燥盤置於真空烘箱中。在23.5 in汞下且在50℃下經27小時乾燥產物至恆重，得到179.7 g(0.372 mol，88.8%)標題化合物，化學純度為98.6%且手性純度為98.8% de。1H NMR(d6-DMSO,400 MHz)δ 8.8(d,1H,J=8.52 Hz),8.2(m,3H),8.1(t,1H,J=7.68Hz),8.0(dd,1H,J=6.7,0.9 Hz),7.5(m,3H),7.2(d,1H),6.5(t,b,1H),5.1(d,1H,J=4.92 Hz),4.5(dd,1H),4.2(m,1H),3.6(m,2H),3.5(m,2H),3.1(m,1H),3.0(m,2H),2.7(m,2H),1.6(m,1H),1.3(m,1H),1.2(m,1H),1.1(d,3H,J=6.32 Hz),0.8(2d,6H,J=6.68,6.52 Hz)。
選擇2-一步程式：在50 mL三頸圓底燒瓶上裝配熱電偶、攪拌棒、氮氣進口/出口、加熱套及溫度控制器。向燒瓶中饋入2.0 g(3.65 mmol，1.0 eq)N-[(1S,2R)-1[[[(1R)-1-1[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基]胺基] 羰基]2-羥丙基]-6-苯基-2-吡啶甲醯胺及20 mL MTBE。攪拌反應混合物約10分鐘直至所有固體均溶解。經由注射器向淡黃色溶液中饋入二乙醇胺(0.44 mL，0.48 g，4.57 mmol，1.25 eq)以及2滴甲烷磺酸且加熱混合物至50℃。約30分鐘後，開始形成白色沈澱物。繼續攪拌隔夜，隨後冷卻至室溫。藉由真空過濾收集固體，用MTBE(1×20 mL)洗滌，隨後在60℃下在真空下乾燥隔夜，得到0.92 g(1.9 mmol，52%)呈白色固體狀之標題化合物，化學純度為91.9%且手性純度大於99.5% de。
步驟E(視情況選用).純化6-(2S,3R)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基}-3-羥基-2-{(6-苯基吡啶-2-基)甲醯胺基]丁醯胺(化合物B)。在2公升四頸圓底燒瓶上裝配頂置式攪拌器、熱電偶、冷凝器、加熱套、溫度控制器及氮氣出口，隨後饋入175 g(0.363 mol)6-(2S,3R)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基}-3-羥基-2-{(6-苯基吡啶-2-基)甲醯胺基]丁醯胺及1400 mL(8體積)95%乙醇。開始攪拌且經21分鐘加熱所得懸浮液至75.7℃。到達該溫度後，在74.9-75.8℃下攪拌溶液80分鐘，隨後經80分鐘冷卻至2.7℃。隨後在2.2-6.0℃下攪拌反應漿液隔夜(17小時)以使產物完全結晶。藉由真空過濾使用密閉之過濾燒瓶收集沈澱之固體，且用350 mL 95%乙醇洗滌濕濾餅。將密封之過濾漏斗轉移至手套箱中，在手套箱中將其打開且將203.8 g濕濾餅轉移至兩個派熱司乾燥盤中，隨後將乾燥盤置於真 空烘箱中。在23.5 in汞下且在50℃下經19小時乾燥產物至恆重，得到147.3 g(0.306 mol，84.2%)標題化合物，化學純度為99.76%且光學純度大於99.8%de。
製備3.[(1R)-1-[[(2S,3R)-3-羥基-2-[[(6-苯基吡啶-2-基)羰基]胺基]-1-側氧基丁基]胺基]-3-甲基丁基]硼酸(亦即化合物A)。向裝配有熱電偶、攪拌棒及氮氣出口之50 mL三頸圓底燒瓶中饋入1.65 g(3.4 mmol)6-(2S,3R)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基}-3-羥基-2-{(6-苯基吡啶-2-基)甲醯胺基]丁醯胺(化學純度=99.5%，手性純度>99.5% de)、17 mL甲基異丁基酮及1.7 mL 2 N鹽酸。攪拌混合物隔夜。分離反應物各層且有機層經硫酸鎂脫水，過濾且在真空中蒸發至乾燥。於戊烷中濕磨殘餘物且藉由真空過濾收集所得白色固體，隨後在真空烘箱中在60℃下乾燥隔夜，得到1.26 g(3.1 mmol，90%)標題化合物。HPLC表明純度為99.6A%。手性純度大於99.5% de。1H NMR(d4-MeOD,400 MHz)δ 8.17(m,2H),8.13(m,1H),8.05(m,2H),7.5(m,3H),4.75(d,1H,J=3.04 Hz),4.42(dq,1H,J=2.92,6.4),2.7(t,b,1H),1.61(m,1H),1.35(t,2H,J=7.48 Hz),1.29(d,3H,J=6.36 Hz),0.89(d,6H,J=6.52 Hz)。
製備4. (2S)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基]-3-苯基-2-(吡-2-基甲醯胺基)丙醯胺(亦即硼替佐米之二乙醇胺酯)：
步驟A.製備吡-2-甲醯氯。向裝配有攪拌棒、熱電偶、 具有數位溫度控制器之加熱套、冷凝器及氮氣進口/出口之500 ml三頸圓底燒瓶中饋入15 g(0.12 mol)吡甲酸、225 mL甲苯(Kf<0.02 wt%)及26.4 ml(43 g，0.36 mol)亞硫醯氯。加熱稀漿液至75℃且攪拌隔夜(10-16小時)。冷卻反應混合物至室溫後，如下在真空中移除溶劑及過量亞硫醯氯：在60℃(浴溫)下在全真空下汽提反應混合物至約其1/3初始體積，隨後添加175 ml新鮮甲苯。繼續濃縮，再次汽提至1/3初始體積，繼而再用225 mL新鮮甲苯稀釋，得到含吡醯氯之甲苯溶液。
步驟B.製備(S)-3-苯基-2-[(吡-2-羰基)-胺基]-丙酸。在第二500 ml三頸圓底燒瓶上裝配攪拌棒、熱電偶、均壓滴液漏斗、氮氣進口/出口及冰水冷卻浴。依序添加20.2 g(0.122 mol)L-苯丙胺酸、28.2 g(0.266 mol)碳酸鈉及225 mL去離子水。冷卻水溶液至10.0℃。在此期間向加料漏斗中饋入步驟A中所製備之醯氯/甲苯溶液(約125 mL)。在約10℃下經約10分鐘向水性反應物中逐滴添加此甲苯溶液。完成添加後，使反應物升溫至室溫(約22-25℃)且劇烈攪拌3小時。隨後將反應混合物轉移至分液漏斗中且分離兩層。隨後將下方之水相再饋入反應燒瓶中。隨後將甲醇(125 mL)添加至紅色溶液中，繼而用3.0 M HCl(約175 mL)調節pH值(目標pH值=1-2)，同時保持溫度在15-20℃下。在pH值為約5時釋放一些氣體，繼而在pH值=3時產物沈澱。調節pH值後在室溫下攪拌漿液30分鐘。藉由真空過濾(母液損耗小於2 mg/mL)收集所得粉紅色固體 沈澱物，用去離子水(1×50 ml)洗滌，隨後在真空烘箱中在40℃下在氮氣吹掃下乾燥至恆重，得到11.92 g(0.43.9 mmol，36%)標題化合物，HPLC純度為99A%。1H NMR(d6-DMSO,400MHz)δ 13.04(s,1H),9.14(d,1H,J=1.44 Hz),8.88(dd,2H,J=2.48,6.16 Hz),8.75(dd,1H,J=1.52,2.4 Hz),7.25(m,4H),7.18(m,1H),4.75(dt,1H,J=5.48,8.08 Hz),3.2(dd,2H,J=1.79,5.32 Hz)。
步驟C.製備N-[(1S)-1[[[(1R)-1-[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基]胺基]羰基]-2-苯甲基]2-吡甲醯胺。向裝配有攪拌棒、加料漏斗、熱電偶、氮氣進口/出口及冷卻浴之500 ml三頸圓底燒瓶中饋入11 g(99.9 mmol)(S)-3-苯基-2-[(吡-2-羰基)-胺基]-丙酸、15.5.0 g(40.6 mmol)O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N'N'-四甲基六氟磷酸鹽(HATU)、12.2 g(40.6 mmol)(1R)-1-[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基胺鹽酸鹽(異丁基非對映異構體之87：13混合物(R：S))及165 mL N,N-二甲基甲醯胺(DMF)。冷卻淺黃色反應溶液至-35℃，在-34℃至-35℃下經6分鐘向其中逐滴添加12.6 g(17 mL，97.3 mmol)N,N-二異丙基乙胺。隨後在-40至-11℃下攪拌所得溶液隔夜。於600 ml 1：1冷水/乙酸乙酯混合物中淬滅反應混合物。轉移至分液漏斗中後，分離各層。隨後依次用10%磷酸氫二鈉水溶液(1×200 mL)、8%碳酸氫鈉水溶液(2×200 mL)及飽和氯化鈉(1×200 mL)洗滌有機相。產物 溶液經硫酸鎂脫水，隨後過濾。在真空中蒸發濾液至乾燥，得到19.57 g(37.7 mmol，93%)呈淺棕色泡沫狀之標題化合物，HPLC純度為92A%。1H NMR(d6-DMSO,400 MHz)δ 9.15(d,1H,J=1.44 Hz),8.87(d,1H,J=2.48Hz),8.7(m,3H),7.25(m,4H),7.18(m,1H),4.89(q,1H,J=6.88,15.4 Hz),4.13(dd,1H,J=1.8,8.56 Hz),3.15(d,2H,J=6.88 Hz),2.7(m,b,1H),2.22(m,b,1H),2.05(m,b,1H),1.87(t,1H,J=5.40 Hz),1.81(s,b,1H),1.67(d,b,1H),1.52(m,b,1H),1.13-1.33(m,9H),0.83(dd,6H,J=2.48,6.56 Hz),0.80(s,3H)。
步驟D.製備(2S)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基]-3-苯基-2-(吡-2-基甲醯胺基)丙醯胺(亦即硼替佐米之二乙醇胺酯)。在1公升四頸圓底燒瓶上裝配頂置式攪拌器、熱電偶及氮氣進口/出口，隨後饋入19.0 g(36.6 mmol)N-[(1S)-1[[[(1R)-1-[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基]胺基]羰基]-2-苯甲基]2-吡甲醯胺、9.32 g(91.5 mmol)異丁基硼酸、190 mL甲醇、34.7 mL(69.4 mmol)2 M鹽酸水溶液及285 mL庚烷。在室溫下攪拌兩相反應物隔夜，直至IPC展示以面積計少於2%起始物質剩餘。將反應混合物轉移至分液漏斗中且分離各層。用庚烷(2×250 mL)洗滌下方之甲醇層，隨後移至1公升圓底燒瓶中且在真空中蒸發至乾燥。將所得殘餘物溶解於300 mL乙酸乙酯中，用8%碳酸氫鈉水溶液(2×200 mL)及鹽水(1×300 mL)洗 滌，隨後轉移至1公升如上裝配之潔淨三頸圓底燒瓶中。
向乙酸乙酯溶液中添加4.1 g(38.4 mmol)二乙醇胺且在室溫下攪拌混合物約10至100小時。藉由真空過濾收集所得固體，用乙酸乙酯(1×30 mL)洗滌，隨後在真空烘箱中在50℃下乾燥隔夜，得到呈白色固體狀之標題化合物(15.8 g，34.9 mmol，95.2%)，藉由HPLC展示為非對映異構體之91：9混合物(亦即82% de)。
步驟E(視情況選用).純化(2S)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基]-3-苯基-2-(吡-2-基甲醯胺基)丙醯胺(亦即硼替佐米之二乙醇胺酯)。將(2S)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基]-3-苯基-2-(吡-2-基甲醯胺基)丙醯胺饋入裝配有攪拌棒、熱電偶、加熱套、控制器、冷凝器及氮氣進口/出口之250 ml三頸圓底燒瓶中。隨後將乙醇(絕對，128 mL)饋入燒瓶中且加熱至回流。藉由真空過濾移除未溶解之固體(其富含約2：8非所要異構體)。將濾液放回圓底燒瓶中且冷卻至室溫以使產物結晶，藉由真空過濾分離，用冷絕對乙醇(1×50 ml)洗滌且在真空烘箱中在50℃下乾燥隔夜，得到11.6 g(25.6 mmol，70%)呈非對映異構體之94：6混合物(亦即88% de)形式之標題化合物。化學純度為大於99.9A%。1H NMR(d6-DMSO,400 MHz)δ 9.10(d,1H,J=1.4 Hz),8.88(d,1H,J=2.48 Hz),8.83(d,1H,J=8.84 Hz),8.75(dd,1H,J=1.52,2.32 Hz),7.3(m,5H),6.55(s,b,1H),4.75(m,1H),3.65(m,2H),3.55(m,1H),3.45(m,1H),2.9-3.2(m, 4H),2.8(m,1H),2.7(m,2H),1.56(m,1H),1.33(dt,1H,J=4.04,13.80 Hz),1.18(dt,1H,J=3.48,9.88 Hz),0.8(dd,6H,J=6.64,12.56 Hz)。
製備5. 硼替佐米。在100 mL三頸圓底燒瓶上裝配攪拌棒、熱電偶及氮氣進口/出口，隨後饋入5.0 g(10.4 mmol)(2S)-N-[(1R)-1-(1,3,6,2-二氧氮雜硼-2-基)-3-甲基丁基]-3-苯基-2-(吡-2-基甲醯胺基)丙醯胺(亦即硼替佐米之二乙醇胺酯)、50 ml甲醇及10.4 ml 2 N鹽酸水溶液。在室溫下攪拌反應物隔夜，隨後在真空中在40℃下移除溶劑。將所得殘餘物溶解於50 ml乙酸乙酯中且用飽和碳酸氫鈉(1×50 mL)洗滌，隨後在真空中再次濃縮有機層至乾燥。隨後在室溫下在氮氣下用50 mL戊烷濕磨殘餘物隔夜。藉由真空過濾收集所得自由流動固體，用戊烷(1×20 mL)洗滌，隨後在真空烘箱中在30℃下乾燥隔夜，得到3.29 g(8.56 mmol，82.3%)呈白色固體狀之標題化合物，化學純度大於99.8A%且非對映異構體比率為93.5：6.5(亦即87% de)。1H NMR(d4-MeOH,400 MHz)δ 9.15(d,1H,J=1.36 Hz),8.77(d,1H,J=2.48 Hz),8.68(dd,1H,J=1.52,2.44 Hz),7.27(m,4H),7.21(m,1H),5.05(t,1H,J=7.68 Hz),3.2(m,2H),2.66(t,1H,J=7.56 Hz),1.39(m,1H),1.17(t,2H,J=7.12 Hz),0.83(dd,6H,J=5.32,6.40 Hz)。
製備6. 6-苯基-吡啶-2-甲酸{(1S,2R)-1-[(R)-1-(4,8-二甲基-[1,3,6,2-二氧硼-2-基)-3-甲基丁基胺甲醯基}-2-2-羥丙基}醯胺(亦即化合物A之二異丙醇胺酯)
在50 mL四頸圓底燒瓶上裝配攪拌棒、熱電偶、具有溫度控制器之加熱套、冷凝器及氮氣進口，隨後饋入2.0 g(3.65 mmol)N-[(1S,2R)-1[[[(1R)-1-1[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基]胺基]羰基]2-羥丙基]-6-苯基-2-吡啶甲醯胺(化學純度=95.7%，手性純度為約97.5% de(基於用於製備N-[(1S,2R)-1[[[(1R)-1-1[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁基]胺基]羰基]2-羥丙基]-6-苯基-2-吡啶甲醯胺之(1R)-1-[(3aS,4S,6S,7aR)-六氫-3a,5,5-三甲基-4,6-亞甲基-1,3,2-苯并二氧硼-2-基]-3-甲基丁胺具有97.5% de))、30 mL第三丁基甲基醚(MTBE)及0.61 g(94.56 mmol，1.25 eq)二異丙醇胺。在20-25℃下攪拌所得黃色溶液16小時。再饋入1.2 g(9 mmol，2.5 eq)二異丙醇胺且在40℃下加熱混合物16小時，隨後冷卻至室溫。藉由真空過濾收集白色固體，用15 mL MTBE洗滌，隨後在33℃下在真空下乾燥隔夜，根據1H NMR得到1.31 g(2.55 mmol，70%)所要產物。化學純度為96.8A%且HPLC未偵測到非對映異構體(大於99.8% de)。
急性全身性紅斑狼瘡(SLE)模型 動物
自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)獲得六週齡易患狼瘡之雌性MRL/lpr(Jackson Labs，第000485號)及六週齡不易患狼瘡之對照MRL/MpJ(Jackson Labs，第000486號)小鼠。在24小時明/暗迴圈下飼養所有小鼠， 食物及水可隨意獲得。所有實驗動物程式均經Cephalon公司之研究所實驗動物使用與管理委員會(Institutional Animal Care and Use Committee，IACUC)批准且遵循其規定；批准之IACUC協定為第03-040號及第03-03-041號。
MRL/lpr小鼠由於無活性Fas分子阻止初級及次級淋巴組織中之自身反應性T細胞及B細胞適當凋亡而產生快速淋巴細胞增殖病(中心與周邊耐受機制均有缺陷)。由於此減弱之耐受機制，進入外周之所有T細胞及B細胞中有一定百分比之細胞極可能對自身蛋白質/組織作出回應，由此在生命早期引發自體免疫。MRL/lpr模型小鼠產生數種作為早期及晚期狼瘡之特徵的慢性發炎疾病樣症狀，包括產生抗核抗體、關節炎、皮膚學表現、免疫複合物介導之腎小球腎炎，從而造成蛋白尿及最終死亡。較低特徵性現象為CNS及心臟表現，兩者在人類中更常見。先前最佳化及驗證研究明確展示疾病僅在患病之MRL/lpr動物中表現而在對照小鼠MRL/Mp中不表現，且在4-12週快速形成抗核抗體(ANA)，導致約18-25週狼瘡性腎炎發作，同時出現蛋白尿。雌性死亡率較高且發生在約25週齡，腎病包括腎小球腎炎、腎小球浸潤、硬化症及血管炎。亦可觀察到與皮膚炎有關之脾腫大與淋巴腫大。
抗核抗體(ANA)ELISA分析
藉由內部產生之定製ELISA分析量測血清抗dsDNA及抗Smith抗原抗體。塗佈染色質之盤購自Inova Diagnostics 公司。經純化牛胸腺dsDNA(Sigma,St.Louis,MI)或經純化牛Smith抗原(GenWay,San Diego,CA)用作塗佈抗原以分別用於偵測抗dsDNA及抗Smith Ag抗體。用硼酸鹽硫酸鹽生理食鹽水(BSS)洗滌經塗佈盤且用含有1%牛血清白蛋白(BSA)及0.1% Tween-20清潔劑之BSS阻斷。使用小鼠抗染色質抗體(Sigma，2B1)或25週齡MRL/lpr血清產生標準曲線。小鼠抗dsDNA抗體(Abcam,Cambridge,MA)或小鼠抗Smith抗原抗體(Abcam)用作各分析之標準物。二次抗體購自Abcam(山羊抗小鼠pAb-HRP)，受質購自Rockland(Gilbertsville,PA)(TMB)，且中止反應緩衝液使用1 mL濃硫酸至20 mL dH2O中產生。使用Victor-X4分光光度計讀取顯影之盤，在450 nM下讀取且參考波長為570 nM。對於所有ANA ELISA分析，低於由標準物之最低點所設定或製造商所設定的偵測極限之值被認為在範圍之外且不能估算，但假定為該特定分析之標準曲線的最低點。
抗體分泌型B細胞Elispot分析
B細胞Elispot組分購自MabTech(Nacka Strand,Sweden)且硝基纖維素IP過濾盤購自Millipore(Billerica,MA)。用10 μg/mL的經純化牛胸腺dsDNA(Sigma)、經純化牛Smith抗原(GenWay)或經煮沸、過濾且純化的來自經溶解雞紅血球之雞染色質(Rockland,Gilbertsville,PA)塗佈Elispot孔。使用玻璃均質化來處理脾，經由60 μm無菌細胞濾網(cell strainer)過濾且使用BioLegend(San Diego,CA)溶解緩衝液溶解紅血球(RBC)。將經處理脾細胞於培 養基中添加至各孔中。為避免偏離抗體分泌型細胞類型(ASC)之真實活體外頻率，不用多株細胞分裂促進劑(如LPS)刺激細胞，而是單獨在培養基中培育以監測真實活體外抗體釋放。抗小鼠泛IgG用作產生總IgG之ASC的陽性對照組，且用於校正結果。在初始測試階段鑑別各模型之各抗原的頻率。對於僅染色質及總IgG，將30,000個脾細胞添加至各孔中；對於Smith抗原及dsDNA，將500,000個細胞添加至各孔中。對於不同抗原，由於每孔斑點頻率之飽和極限而添加不同數目之脾細胞。此等極限預先建立。在37℃下培育B細胞Elispot隔夜。為使各分析顯影，向各孔中添加二次抗體，培育，洗滌且使用鹼性磷酸酶鏈黴親和素(strepavidin)作為結合物；所用受質為BCIP-NBT。使盤顯影直至斑點可見。所有Elispot分析均使用Immunospot C.T.L.掃描器及Biospot軟體(Cellular Technology有限公司，Shaker Heights,OH)執行。結果展示為減去僅培養基及細胞之孔的值。一些值由於高背景值而為負數。
流式細胞測量術
將經洗滌且RBC溶解之脾細胞染色以分析已公開報導中先前使用之漿細胞標記物(Neubert,Meister等人，2008)。如本文所用之術語「漿細胞(plasma cell)」指如下免疫表型定義：漿細胞定義為活CD19陰性、CD138陽性、細胞內輕鏈陽性事件。每管/樣品總共收集200,000-500,000個事件。流式染色方案如下，簡言之，將 細胞懸浮於完全培養基(如下文所定義)及2.5 μg抗CD16/CD32(FcBlock)以及抗CD19-FITC及抗CD138-APC抗體中。在冰上染色20分鐘後，洗滌樣品，隨後固定且使用BD細胞內染色套組滲透。用抗 Ig輕鏈-PE於滲透緩衝液中將樣品染色至少1小時，用滲透緩衝液洗滌兩次，隨後用培養基最後一次洗滌且準備在冰上進行流式分析。所有樣品均用下述適當匹配同型重複。
所有基於流式細胞測量術之計數均使用BD Trucount管(Beckman Dickson,San Diego,CA，目錄號340334，批號63050，珠粒計數=50,979)。用於流式細胞測量術之抗體由以下組成：抗小鼠CD138-APC(eBioscience,San Diego,CA)、抗小鼠CD19-FITC(eBioscience,San Diego,CA)、抗小鼠輕鏈-PE(eBioscience,San Diego,CA)、大鼠IgG1-APC同型對照(eBioscience,San Diego,CA)、大鼠IgG2a-PE同型對照(eBioscience,San Diego,CA)。所有樣品均使用Accuri C6流式細胞儀(Accuri Cytometers,Ann Arbor,MI)分析。涉及活體外培養脾細胞以進行所有Elispot實驗的所有實驗均使用完全培養基(R10)。完全培養基由以下組成：RPMI1640(Cellgro,Manassas,VA)，加上1% Pen-Strep(Cellgro,Manassas,VA)、1% L-Gln(Cellgro,Manassas,VA)、1% NEAA(Cellgro,Manassas,VA)、β-ME(Cellgro,Manassas,VA)，加上10%胎牛血清(FBS)(Cellgro,Manassas,VA)。
血清細胞激素樣品之Luminex分析
為處理血清樣品以進行細胞激素分析，在冰上融化-80℃下之冷凍血漿，渦旋且離心10分鐘以移除碎屑及凝集物。根據製造商之說明，總共使用25-50 μL血清進行Luminex®分析。使用小鼠細胞激素10-plex珠粒套組(Invitrogen,Carlsbad,CA，第LMC0001號)量測十種不同小鼠細胞激素。簡言之，用200 μL洗滌溶液(套組組分)預先濕潤過濾盤(Millipore,Billerica,MA，第MAIPSWU10號)且每孔添加25 μL珠粒。稀釋血清樣品且每孔添加50 μL之總體積(亦即25 μL樣品血清加上25 μL製造商提供之分析稀釋劑)。在室溫(RT)下，在迴轉震盪器上，在黑暗中培育具有珠粒之盤2小時。在培育結束時，用套組緩衝液洗滌盤兩次，添加用隨套組提供之生物素稀釋劑1：10稀釋之二次經生物素標記抗體(100 μL)。在室溫下在黑暗中培育盤1小時，隨後用套組緩衝液洗滌兩次。每孔添加100 μL含鏈黴親和素之分析稀釋劑，隨後在室溫下在黑暗中培育30分鐘。洗滌盤3次，隨後添加100 μL套組洗滌溶液，且在室溫下在黑暗中攪拌2-3分鐘。此培育期後立即在Luminex xMAP 200單元上用資料獲取及分析軟體(Invitrogen,San Diego,CA，第MAP0200號)對盤進行操作。使用真空歧管單元(Pall,Ann Arbor,MI第5017號)執行所有珠粒洗滌。對於所有細胞激素Luminex分析，低於由標準物之最低點所設定或製造商所設定的偵測極限之值被認為在範圍之外且不能估算，但假定為該特定分析之標準曲線的最低點。
尿分析
對尿樣品酸沈澱以回收總蛋白且分析。剩餘足夠尿之樣品用於Uristix®白血球尿(leukouria)分析。簡言之，由正常小鼠血清製備標準蛋白質溶液且用作藉由濁度分析小鼠尿蛋白之標準物。標準製法如下：一式兩份分兩行添加0、5、10、15、20、30、40及50 μL套組中所提供之4 mg/mL小鼠血清標準蛋白質溶液。向個別孔中添加PBS以將最終體積調節至50 μL。為製備尿樣品，使用台式微型離心機將尿樣品在9880×g下離心3分鐘。一式兩份添加尿上清液(1-50 μL)。添加PBS以將總體積調節至50 μL。為進行濁度分析：將25 μL 0.1 N HCl添加至空白行中且將250 μL 3%磺基水楊酸添加至測試行中。在室溫下培育微盤10分鐘且使用ELISA讀取器用單光束在450 nm下讀取盤。為進行Uristix®試紙分析，將試紙排列且作標記。將二十微升尿置放於各試紙正方形區且培育至少30秒，隨後記錄結果。對於所有基於總尿分析盤之分析，低於由標準物之最低點所設定或製造商所設定的偵測極限之值被認為在範圍之外且不能估算，但假定為該特定分析之標準曲線的最低點。
組織學
為進行組織學分析，移出各動物之左腎，且在25℃下於迴轉搖擺器上固定於10%經緩衝中性10%福馬林(formalin)(EMD)中48小時，隨後用流動之dH2O洗滌隔夜且儲存於4℃下70%乙醇中直至準備處理。用於組織學分析之腎臟染色劑包括蘇木精及伊紅(H及E)、過碘酸雪夫 氏(PAS)及三色染色劑(Wistar Institute,Philadelphia,PA)。所有3個染色切片均由病理學家用於評分目的。所有組織學評分均由獨立委員會認證之獸醫病理學家(Julie Engiles,VMD,DACVP)盲式執行。使用多種染色劑確定分值。圖17中之影像展示由病理學家盲選之切片的受影響最嚴重的區域。
腎臟IC-GN評分方法(Smith,Dong等人，2007)：
1.腎小球細胞性(glomerular cellularity)-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
2.腎小球壞死-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
3.腎小球硬化-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
4.間質性浸潤-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
5.腎小管萎縮-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
6.間質性纖維化-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
7.血管炎-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
特定病理學家定義：
．壞死定義為腎小球叢內出現指示「壞死」之核碎屑/核凝縮。在許多樣品中，其為僅在極少數腎小球叢區內的極輕微的罕見發現。亦可藉由PAS陽性、三色陰性物質壞死認為腎小球叢消失。
．腎小球硬化定義為腎小球叢或腎小球囊內纖維組織增生或纖維化增加。有時腎小球硬化被認為是「晚期」腎小球變化，但本文中將展現「活性」進行性纖維化之腎小球變化歸類為腎小球「硬化」。
．腎小管萎縮由管腔直徑增大及/或腎小管上皮變平或腎小管塌陷歸類。
．間質性浸潤被認為是發炎性浸潤。
．血管炎-血管炎之較寬鬆定義考慮非發炎性(退化性/增生性)血管病變。大多數血管變化輕微的且可被認為是「動脈硬化」，其特徵為平滑肌細胞增殖及細胞外基質玻璃質化。此變化可反映腎小球病變繼發之高血壓。在極少數動物中存在明顯「血管炎」。大多數發炎性變化在血管壁內，對內皮存在極小破壞至無破壞，且無明顯出血/纖維蛋白洩漏。諸多變化亦具有纖維母細胞之血管周邊緣。
藥效學(PD)分析
在第118天在最終劑量投予後3小時收集脾及腎臟，且與經冷卻異戊烯一起於乾冰上迅速冷凍且儲存在-80℃下。使用如下方案處理經溶解之脾及腎臟。向各樣品中添加700微升藉由於組織提取試劑I(Invitrogen，第FNN0071號)中組合蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem，第539136號)與Halt磷酸酶抑制劑混合物(Thermo scientific，第78420號)或Roche磷酸酶抑制劑混合物(Roche，第04906837001號)產生的「組織提取緩衝液(tissue extraction buffer)」。使用PT 10-35 Polytron均質機(VWR，第97036-082號)將樣品均質冷凍。均質化後，在4℃下以2000×g離心樣品10分鐘，在4℃下以最大速度14,000×g再離心上清液15分鐘。小心移出上清液以避免採集到脂質/脂肪碎屑上層。使用BCA蛋白質分析(Pierce，第83228號)調節蛋白質 濃度至3 mg/ml。使用20S螢光分析(Cayman Chemical公司，目錄號10008041，批號0414698-1)分析脾蛋白酶體活性，且使用IBα積聚ELISA分析(Cell Signaling，目錄號7355，批號17)分析對腎臟中蛋白酶體活性之調節。兩種分析均根據製造商之說明執行。
自發性進行性狼瘡性腎炎模型 動物
自Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)獲得6週齡之易患自發性SLE之NZBWF1/J(NZM)(目錄號100008)雌性小鼠及不易患狼瘡(自實驗開始之時間內)之NZW/LacJ(目錄號001058)雌性小鼠。在24小時明/暗迴圈下飼養所有小鼠，食物及水可隨意獲得。所有實驗動物程式均經Cephalon公司之研究所實驗動物使用與管理委員會(IACUC)批准且遵循其規定；批准之IACUC協定為第03-040號及第03-03-041號。
NZM品係充當遺傳促使之進行性全身性紅斑狼瘡(SLE)之小鼠模型。NZM小鼠中疾病進展之特徵為異常多株B細胞活化，同時大量產生各種自體抗體，包括針對DNA及其他核抗原及針對細胞骨架蛋白之抗體。年長小鼠中迴圈免疫複合物增多會導致致命性腎小球腎炎。為進行實驗，將動物進行年齡匹配，在28週齡時開始研究且處理小鼠直至40週齡。
流式細胞測量術及抗體
用於流式細胞測量術之抗體由以下組成：抗小鼠 CD138-APC(eBioscience,San Diego,CA)、抗小鼠CD19-FITC(eBioscience,San Diego,CA)、抗小鼠CD38-PE(eBioscience,San Diego,CA)及抗小鼠CD45R/B220-Cyc(eBioscience,San Diego,CA)、大鼠IgG1-APC同型對照(eBioscience,San Diego,CA)、大鼠IgG2a-PE同型對照(eBioscience,San Diego,CA)。所有樣品均使用Accuri C6流式細胞儀(Accuri Cytometers,Ann Arbor,MI)分析。涉及活體外培養脾細胞以進行所有Elispot實驗的所有實驗均使用完全培養基。完全培養基由以下組成：RPMI1640(Cellgro,Manassas,VA)，加上1% Pen-Strep(Cellgro,Manassas,VA)、1% L-Gln(Cellgro,Manassas,VA)、1% NEAA(Cellgro,Manassas,VA)、β-ME(Cellgro,Manassas,VA)，加上10%胎牛血清(FBS)(Cellgro,Manassas,VA)。
抗核抗體(ANA)ELISA分析
藉由內部產生之定製ELISA分析量測血清抗dsDNA及抗Smith抗原抗體。塗佈染色質之盤購自Inova Diagnostics公司。經純化牛胸腺dsDNA(Sigma,St.Louis,MI)或經純化牛Smith抗原(GenWay,San Diego,CA)用作塗佈抗原以分別用於偵測抗dsDNA及抗Smith Ag抗體。用硼酸鹽硫酸鹽生理食鹽水(BSS)洗滌經塗佈盤且用含有1%牛血清白蛋白(BSA)及0.1% Tween-20清潔劑之BSS阻斷。使用小鼠抗染色質抗體(Sigma，2B1)或25週齡MRL/lpr血清產生標準曲線。小鼠抗dsDNA抗體(Abcam,Cambridge,MA)或小鼠抗Smith抗原抗體(Abcam)用作各分析之標 準物。二次抗體購自Abcam(山羊抗小鼠pAb-HRP)，受質購自Rockland(Gilbertsville,PA)(TMB)，且中止反應緩衝液使用1 mL濃硫酸至20 mL dH2O中產生。使用Victor-X4分光光度計讀取顯影之盤，在450 nM下讀取且參考波長為570 nM。
抗體分泌型B細胞Elispot分析
B細胞Elispot組分購自MabTech(Nacka Strand,Sweden)且硝基纖維素IP過濾盤購自Millipore(Billerica,MA)。用10 μg/mL的經純化牛胸腺dsDNA(Sigma)、經純化牛Smith抗原(GenWay)或經煮沸、過濾且純化的來自經溶解雞紅血球之雞染色質(Rockland,Gilbertsville,PA)塗佈Elispot孔。使用玻璃均質化(磨砂載片)處理脾。用無菌HBSS洗滌經分散之細胞內含物且使用1×RBC溶解緩衝液(BioLegend，目錄號420301)溶解RBC。向各孔中添加經處理脾細胞且不用脂多醣(LPS)刺激以避免偏離抗體分泌型細胞類型(ASC)之真實活體外頻率。抗小鼠泛IgG用作產生總IgG之ASC的陽性對照組，且用於校正結果。在初始測試階段鑑別各模型之各抗原頻率。對於僅染色質及總IgG，將30,000個脾細胞添加至各孔中；對於Smith抗原及dsDNA，將500,000個細胞添加至各孔中。對於不同抗原，由於每孔斑點頻率之飽和極限而添加不同數目之脾細胞。在37℃下培育B細胞Elispot隔夜。為使各分析顯影，向各孔中添加二次抗體，培育，洗滌且使用鹼性磷酸酶鏈黴親和素(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA) 作為結合物；所用受質為BCIP-NBT(MabTech,Cincinnati,OH)。使盤顯影直至斑點可見。所有Elispot分析均使用Immunospot C.T.L.掃描器及Biospot軟體(Cellular Technology有限公司，Shaker Heights,OH)執行。結果展示為減去僅培養基及細胞之孔的值。一些值由於高背景值而為負數。
血清細胞激素樣品之Luminex分析
為處理血清樣品以進行細胞激素分析，在冰上融化-80℃下之冷凍血漿，渦旋且離心10分鐘(10,000×g)以移除碎屑及凝集物。根據製造商之說明，總共使用25-50 μL血清進行Luminex®分析。使用小鼠細胞激素20-plex珠粒套組(Invitrogen,Carlsbad,CA，第LMC0006號)量測十種不同小鼠細胞激素。簡言之，用200 μL洗滌溶液(套組組分)預先濕潤過濾盤(Millipore,Billerica,MA，第MAIPSWU10號)且每孔添加25 μL珠粒。稀釋血清樣品且每孔添加50 μL之總體積(亦即25 μL樣品血清加上25 μL製造商提供之分析稀釋劑)。在室溫(RT)下，在迴轉震盪器上，在黑暗中培育具有珠粒之盤2小時。在培育結束時，用套組緩衝液洗滌盤兩次，添加用隨套組提供之生物素稀釋劑1：10稀釋之二次經生物素標記抗體(100 μL)。在室溫下在黑暗中培育盤1小時，隨後用套組緩衝液洗滌兩次。每孔添加100 μL含鏈黴親和素之分析稀釋劑，隨後在室溫下在黑暗中培育30分鐘。洗滌盤3次，隨後添加100 μL套組洗滌溶液，且在室溫下在黑暗中攪拌2-3分鐘。此培育期後立即在 Luminex xMAP 200單元上用資料獲取及分析軟體(Invitrogen,San Diego,CA，第MAP0200號)對盤進行操作。使用真空歧管單元(Pall,Ann Arbor,MI第5017號)執行所有珠粒洗滌。對於所有細胞激素Luminex分析，低於由標準物之最低點所設定或製造商所設定的偵測極限之值被認為在範圍之外且不能估算，但假定為該特定分析之標準曲線的最低點。
尿分析
對尿樣品酸沈澱以進行總蛋白分析。為製備尿樣品，使用台式微型離心機將尿樣品在10,000 rpm下離心3分鐘。一式兩份添加1-50 μL尿上清液。添加PBS以將總體積調節至50 μL。為進行濁度分析：將25 μL 0.1 N HCl添加至空白行中且將250 μL 3%磺基水楊酸添加至測試行中。在室溫下培育微盤10分鐘且使用ELISA讀取器用單光束在450 nm下讀取盤。由正常小鼠血清製備標準蛋白質溶液且用作藉由濁度分析小鼠尿蛋白質之標準物。標準製法如下：一式兩份分兩行添加0、5、10、15、20、30、40及50 μL套組中所提供之4 mg/mL小鼠血清標準蛋白質溶液。向個別孔中添加PBS以將最終體積調節至50 μL。剩餘足夠尿之樣品用於Uristix®白血球尿分析。為進行Uristix®試紙分析，將試紙排列且作標記。將二十微升尿置放於各試紙正方形區且培育至少30秒，隨後記錄結果。對於所有基於總尿分析盤之分析，低於由標準物之最低點所設定或製造商所設定的偵測極限之值被認為在範圍之外且不能估算，但 假定為該特定分析之標準曲線的最低點。
組織學
為進行組織學分析，移出各動物之左腎，且在25℃下於迴轉搖擺器上固定於10%經緩衝中性10%福馬林(EMD)中48小時，隨後用流動之dH2O洗滌隔夜且儲存於4℃下70%乙醇中直至準備處理。用於組織學分析之腎臟染色劑包括蘇木精及伊紅(H及E)、過碘酸雪夫氏(PAS)及三色染色劑(Wistar Institute,Philadelphia,PA)。所有3個染色切片均由病理學家用於評分目的。所有組織學評分均由獨立委員會認證之獸醫病理學家(Julie Engiles,VMD,DACVP)盲式執行。使用多種染色劑確定分值。圖39中之影像展示由病理學家盲選之切片的受影響最嚴重的區域。
腎臟IC-GN評分方法(Smith,Dong等人，2007)：
1.腎小球細胞性-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
2.腎小球壞死-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
3.腎小球硬化-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
4.間質性浸潤-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
5.腎小管萎縮-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
6.間質性纖維化-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
7.血管炎-分值1-5：不存在、低、中、高、嚴重
特定病理學家定義：
．壞死定義為腎小球叢內出現表明存在「壞死」之核碎屑/核凝縮。在許多樣品中，其為僅在極少數腎小球叢區內的極輕微的罕見發現。亦可藉由PAS陽性、三色陰性物質 壞死認為腎小球叢消失。
．腎小球硬化定義為腎小球叢或腎小球囊內纖維組織增生或纖維化增加。有時腎小球硬化被認為是「晚期」腎小球變化，但本文中將展現「活性」進行性纖維化之腎小球變化歸類為腎小球「硬化」。
．腎小管萎縮由管腔直徑增大及/或腎小管上皮變平或腎小管塌陷歸類。
．間質性浸潤被認為是發炎性浸潤。
．血管炎-血管炎之較寬鬆定義考慮非發炎性(退化性/增生性)血管病變。大多數血管變化為輕微的且可被認為是「動脈硬化」，其特徵為平滑肌細胞增殖及細胞外基質玻璃質化。此變化可反映腎小球病變繼發之高血壓。在極少數動物中存在明顯「血管炎」。大多數發炎性變化在血管壁內，對內皮存在極小破壞至無破壞，且無明顯出血/纖維蛋白洩漏。諸多變化亦具有纖維母細胞之血管周邊緣。
膠原蛋白I型交聯子(CTx)骨吸收生物標記物ELISA
使用市售套組(RatLaps EIA，目錄號AC-06F1，批號4538 IDS，Scottsdale,AZ)分析血清樣品。如製造商所說明執行分析。簡言之，首先將經生物素標記之ratlaps抗原添加於96孔ELISA盤之各孔中。覆蓋此盤且在室溫下培育30分鐘。用洗滌溶液洗滌盤五次且在適當孔中與標準物或未知樣品一起培育，繼而添加一次Ab。在4℃下培育隔夜，繼而用緩衝液洗滌。二次培育包括添加至各孔中之過氧化酶結合之山羊抗兔IgG且在室溫下培育1小時。在室溫下 在黑暗中與發色受質溶液一起培育15分鐘使盤顯影以進行分析。中止溶液使反應停止，在2小時內在450 nm下量測吸光度。
血清C3補體ELISA
使用市售套組(GenWay，目錄號40-374-130047，批號10E)分析血清樣品。如製造商所說明執行分析。用稀釋緩衝液1比50,000倍稀釋血清樣品。向各孔中添加標準物或未知血清樣品且在室溫下培育盤20分鐘。用洗滌溶液緩衝液洗滌盤四次。向各孔中添加經稀釋之酶-抗體結合物且在室溫下培育20分鐘。用洗滌溶液洗滌盤4次。向各孔中添加TMB受質溶液且在室溫下在黑暗中培育10分鐘。中止溶液使反應停止。在450 nm下讀取盤吸光度。
血清IFNα ELISA
使用市售套組(Interferon Source，目錄號42100-1，批號LF1318051 PBL，Piscataway,NJ)分析血清樣品。如製造商所說明執行分析。向各孔中添加標準物或未知樣品且在室溫下培育1小時。洗滌盤一次，向各孔中添加抗體溶液且在室溫下培育24小時。洗滌孔3次且吸至半乾。向各孔中添加HRP結合溶液且在室溫下培育1小時。隨後洗滌盤且在室溫下在黑暗中與TMB受質溶液一起培育15分鐘。添加中止溶液後5分鐘，在450 nm下測定光學密度。
資料分析
使用Microsoft Excel或Prism GraphPad 5.0(其亦用於繪製曲線圖)對資料進行計算。使用單因數、兩因數ANOVA 測試或曼尼-惠特尼氏雙尾配對史都登氏t-檢驗(Mann-Whitney two-tailed paired student t-test)執行統計分析。
藥效學(PD)分析
收集脾及腎臟，且與經冷卻異戊烯一起於乾冰上迅速冷凍且儲存在-80℃下。使用如下方案進行脾及腎臟溶解：向各樣品中添加700微升藉由於組織提取試劑I(Invitrogen，第FNN0071號)中組合蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem，第539136號)與Halt磷酸酶抑制劑混合物(Thermo scientific，第78420號)或Roche磷酸酶抑制劑混合物(Roche，第04906837001號)產生的「組織提取緩衝液」。使用PT 10-35 Polytron均質機(VWR，第97036-082號)將樣品均質冷凍。均質化後，在4℃下以2000×g離心樣品10分鐘，在4℃下以最大速度14,000×g再離心上清液15分鐘。小心移出上清液以避免採集到脂質/脂肪碎屑上層。使用BCA蛋白質分析(Pierce，第83228號)調節蛋白質濃度至3 mg/ml。使用20S螢光分析(Cayman Chemical公司，目錄號10008041，批號0414698-1)分析脾蛋白酶體活性，且使用IBα積聚ELISA分析(Cell Signaling，目錄號7355，批號17)分析對腎臟中蛋白酶體活性之調節。兩種分析均根據製造商之說明執行。
實施例 實施例1.化合物A有效治療MRL/lpr小鼠之狼瘡 方案
首先將MRL/lpr小鼠隨機化，收集初始血液且記錄體重以用於基線量測(圖1)。對所有小鼠個別地作耳部標記且在整個實驗中加以監測(例如「組號-籠字母-小鼠編號」，故「3B5」=第3組(G3)，B籠，5號小鼠)。對小鼠進行年齡匹配且在6-8週齡時開始處理。在整個實驗過程中持續每週收集面頰血及尿。個別地追蹤小鼠之數個參數，包括細胞激素及ANA含量、蛋白尿、身體品質、淋巴腫大、一般健康狀況及死亡。所有參數均每兩月進行一次評估，死亡除外，其應每天監測。對於所有組，每組均由最少至少10-12隻小鼠組成。活體外實驗包括針對漿細胞之流式細胞測量術分析、血清補體C3及ANA含量；尿蛋白及白血球、血清細胞激素分佈、腎臟組織病變，及測定脾、腎臟及血漿中之化合物含量(藥物動力學(PK))。對小鼠進行個別追蹤。對於所有資料，將小鼠分成群，且以平均值±SEM對資料繪製曲線圖。如材料及方法部分(上文)及圖1中所述分析結束階段之讀出結果。
如圖1所示，小鼠用化合物A或硼替佐米靜脈內或腹膜內處理或用化合物A經口處理。所用標準護理劑為地塞米松之生理食鹽水溶液。每週兩次經口(p.o)提供單獨媒劑。將兩種蛋白酶體抑制劑懸浮於媒劑溶液中。兩月一次收集血液及尿且冷凍於80℃下直至分析。結束時之分析包括腎臟組織學、脾細胞B細胞Elispot、針對B細胞及T細胞群體之流式細胞測量術、PD標記物、血清細胞激素、抗體及補體含量。另外，測定所有動物之尿蛋白尿。
最初，化合物A之第1組(G1)劑量為每週一次靜脈內給予4 mg/kg。由於此組中動物死亡(在第71天總共15隻小鼠中有4隻死亡)，故劑量改為每週一次靜脈內給予3 mg/kg。該等分析中不包括在4 mg/kg化合物A劑量下死亡之動物。在第二組(G2)中，每週兩次靜脈內投予3 mg/kg劑量的化合物A。在第三組(G3)中，每週兩次經口投予10 mg/kg劑量的化合物A。在第四組(G4)中，最初每週兩次靜脈內投予0.5 mg/kg劑量的硼替佐米。然而，由於此組中動物死亡，故將該組分成兩組G4及G5，且在新的G4組中，每週一次靜脈內投予0.5 mg/kg劑量的硼替佐米。在新的第5組(G5)中，每週兩次靜脈內投予0.3 mg/kg劑量的硼替佐米。每兩天(M、W、F)腹膜內投予1.5 mg/kg劑量的地塞米松。媒劑為3% DMSO/10% Solutol/87% PBS。在小鼠不能經由靜脈內途徑注射之情況下，腹膜內投予藥劑，如表1中所示。
體重及存活率
相較於媒劑，處理組中MRL/lpr小鼠的體重減輕(參見圖2及表2及表20)。在所有處理動物中體重減輕相等，硼替佐米(每週一次靜脈內給予0.5 mg/kg)及化合物A(每週一次靜脈內給予3 mg/kg)組除外，其相較於媒劑組身體品質減輕(分別減輕17%及15%；p<0.05)。
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
相較於媒劑，每週一次給予0.3 mg/kg方案之化合物A處理使存活率提高5%，且每週兩次靜脈內給予0.3 mg/kg及經口給予10 mg/kg方案之化合物A處理使存活率提高8.4%(參見圖3及表3及表20)。基於初始劑量範圍找尋研究，硼替佐米處理伴有意外毒性，且在研究結束(EOS，end of study)時存活率相較於媒劑降低2%(每週一次靜脈內給予0.5 mg/kg)及降低19%(每週兩次靜脈內給予0.3 mg/kg)。觀察到相對於兩種硼替佐米處理組，化合物A處理組之存活率提高(p<0.05)(參見圖3及表3及表20)。較低劑量之硼替佐米的較高死亡率以及化合物A處理所提供的提高存活率表明：相較於化合物A，硼替佐米在阻止疾病相關死亡方面之有效性較低且耐受性較差。
用於比較之統計方法為曼尼-惠特尼氏雙尾配對t-檢驗；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
淋巴腫大及脾腫大
相較於媒劑，用化合物A靜脈內處理之MRL/lpr小鼠展現之淋巴腫大(亦即出現腫脹之頸部淋巴結)減小(減小71%及34%；p<0.05)(參見圖4及表4及表20)。硼替佐米處理不會顯著減小淋巴腫大。相較於媒劑處理組，所 有處理組均觀察到脾腫大(脾腫脹)減小(直至EOS，568 mg減至150-300 mg)(p<0.01)(參見圖5及表5)。在研究結束時，相較於媒劑處理組，每週兩次靜脈內給予3 mg/kg化合物A之處理組觀察到最大幅度的減小(減小74%，p<0.001)(參見表20)。
用於比較之統計方法為曼尼-惠特尼氏雙尾配對t-檢驗；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
用於比較之統計方法為雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用。
此等結果很重要，因為脾腫大及淋巴腫大表明MRL/lpr小鼠中存在狼瘡病。因此，脾及淋巴結尺寸減小表明在處理期間化合物A部分控制全身性自體免疫反應。顯而易見，在減小淋巴腫大方面化合物A優於硼替佐米，且在減小脾腫大方面優於每週兩次給予硼替佐米。
血清細胞激素
相較於媒劑處理之MRL/lpr小鼠，用化合物A處理之小鼠展現數種血清細胞激素(IL-12p40/p70、TNFα及IL-1β)含量減少(參見表20)。所有三種化合物A處理方案均顯著影響血清IL-12含量，而僅每週一次靜脈內給予0.5 mg/kg之最高劑量的硼替佐米使IL-12含量顯著減少至低於媒劑處理動物(p<0.05，參見圖6及表6)。相較於媒劑，所有處理組均減少血清IL-1β，但僅每週兩次給予3 mg/kg劑量之化合物A提供顯著減少(直至EOS，16.8 pg/mL減至5.7 pg/mL)(p<0.05)(參見圖7及表7)。相較於媒劑，所有處理組之血清TNFα均減少(參見圖8及表8及表20)。
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
此資料很重要，因為在狼瘡患者中IL-12及IL-10升高且可用作疾病進展之預後標記物(Chun等人，2007，Tucci等人，2008)。在狼瘡病病程中數種常見促炎性細胞激素亦升高，諸如IL-1β及TNFα(Aringer等人，2004)。化合物A優於硼替佐米，因為用化合物A處理顯著減少IL-12，但每週兩次用硼替佐米處理無效。另外，每週兩次給予化合物A為顯著減少IL-1β之唯一處理。
C3
相對於媒劑，用化合物A經口處理之MRL/lpr小鼠展現血清C3濃度顯著增加(在第99天相較於媒劑增加128%；p<0.001)。在此方面，化合物A優於硼替佐米，因為相對於媒劑，硼替佐米處理組不展現血清C3顯著增加。
此資料很重要，因為血清中C3之含量與炎症之幅度(magnitude)或程度間接相關。SLE患者展示C3及C4含量隨時間減少，此表明全身炎症增加，從而造成組織器官損傷。但隨著處理，此等因數回升，表明處理在減少全身炎症，由此有效治療疾病。因此，血清C3增加表明狼瘡病 消退及治療(Boumpas,Furie等人，2003)。
抗體分泌型細胞
相較於媒劑，用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現產生抗Smith Ag及抗dsDNA IgG之抗體分泌型細胞(ASC)的頻率降低(在第1-3組中，對於Smith Ag，分別降低97%、100%及86%；對於dsDNA ASC，分別降低80%、84%、82%)(參見圖9及表9及表20；p<0.01-p<0.05)。相較於硼替佐米，用化合物A靜脈內處理之MRL/lpr小鼠展現抗Smith Ag ASC之頻率降低(參見圖9及表9；p<0.01-p<0.05)。相較於每週兩次靜脈內給予0.3 mg/kg硼替佐米與地塞米松兩者，用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現產生抗Smith Ag及抗dsDNA IgG之ASC的頻率降低(參見圖9及表9；p<0.01-p<0.05)。用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現產生抗染色質IgG之脾ASC的頻率降低至低於每週兩次靜脈內給予0.3 mg/kg硼替佐米、地塞米松及媒劑的情況(參見圖10及表10；p<0.01-p<0.05)。
用於比較之統計方法包括雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗。在第7組(媒劑組)中，單個離群值大於2.5×標準偏差，針對dsDNA與Smith抗原之分析中不包括該離群值。
用於比較之統計方法包括雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗。
此資料很重要，因為迴圈自體抗體分泌型細胞類型與不良SLE預後直接有關(Neubert等人，2008，Sanz等人，2010，Muller等人，2008)。顯而易見，在減少抗Smith Ag ASC方面，化合物A優於硼替佐米，且在減少產生抗dsDNA IgG之ASC與產生抗染色質IgG之脾ASC方面，每週一次 與每週兩次靜脈內給予化合物A劑量均優於每週兩次給予硼替佐米。
抗核抗體(ANA)
相較於媒劑，用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現抗染色質IgG之含量減少(在第1-3組中分別減少89%、98%及79%)(參見圖11及表11及表20；p<0.001)。僅每週一次給予硼替佐米相較於媒劑減少抗染色質IgG含量(減少64%)(參見圖11及表11；p<0.001及表20)。對於抗Smith Ag IgG ANA含量觀察到類似反應(在EOS時，相較於媒劑處理動物，在第1-4組中減少97%、100%、86%及74%)(參見圖12及表12及表20)。相較於媒劑，靜脈內給予化合物A與硼替佐米均減少抗dsDNA IgG ANA(在第1、2、4及5組中分別減少80%、84%、82%及58%)(參見圖13及表13及表20)。
執行之統計方法為單因數ANOVA。
執行之統計方法為單因數ANOVA。
執行之統計方法為單因數ANOVA。
此資料很重要，因為存在抗dsDNA抗體與狼瘡之不良預後有關且與產生可能致命之腎炎密切相關(Egner 2000；Kiss,Lakos等人，2009)。化合物A優於硼替佐米，因為用 化合物A處理顯著減少抗染色質IgG與抗Smith Ag IgG兩種ANA之含量，但每週兩次用硼替佐米處理未能顯著減少任一ANA之血清含量。
漿細胞
相較於媒劑，用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現脾漿細胞(定義為CD19-CD138+細胞內IgL輕鏈+細胞)減少(在第1-3組中減少67%；p<0.05)(參見圖14及表14及表20)。對於硼替佐米獲得類似結果(在第4組中減少66%且在第5組中減少33%)。用化合物A處理相較於地塞米松顯著改良總脾漿細胞，類似於每週一次用硼替佐米處理(p<0.05)。
單尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗用作統計檢驗方法。
此資料很重要，因為漿細胞負責產生自體抗體，且存活期長的漿細胞被認為是人類之持續狼瘡發病機制之根源 性傳播者之一(Espeli,Bokers等人，2011；Neubert,Meister等人，2008)。存活期長的漿細胞(LL-PC)主要在骨髓(BM)繁殖，但亦可見於脾之發炎位點，且已知對環磷醯胺具抗性，環磷醯胺為狼瘡性腎炎之少數可接受療法之一(Chevrier,Genton等人，2009)。化合物A優於硼替佐米，因為相較於地塞米松，用化合物A處理顯著減少脾漿細胞，但每週兩次用硼替佐米處理不能。
蛋白尿及白血球尿
對於所有三個處理組，相對於媒劑，用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現在研究過程中總尿蛋白顯著減少(在第1-3組中分別為60%、70%及71%；p<0.01)(圖15及表15及表20)。然而，僅每週一次用硼替佐米處理之MRL/lpr小鼠展現蛋白尿顯著減少(減少55%；p<0.05)(圖15及表15及表20)。化合物A與硼替佐米處理均使白血球尿含量減少至低於媒劑之情況(在第1-5組中減少69-96%；p<0.001)(圖16及表16及表20)。
所用統計檢驗方法為單因數ANOVA。
所用統計檢驗方法為單因數ANOVA。
此等結果很重要，因為尿蛋白(蛋白尿)及尿白血球(白血球尿)增加為與狼瘡性腎炎有關之腎損傷的直接結果。化合物A優於硼替佐米，因為相較於媒劑，用化合物A處理顯著減少蛋白尿，但每週兩次用硼替佐米處理未能顯著減少尿蛋白。
組織病理學分析
藉由組織病理學評估晚期狼瘡性腎炎且由委員會認證之病理學家評分以評定患病動物之總體腎損傷。相較於媒劑，用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現各種腎臟病變之嚴重性顯著降低(平均分降低1.55-1.86倍)(參見圖17及 表17及表20)。然而，僅每週用硼替佐米處理之MRL/lpr小鼠展現腎臟病變嚴重性顯著降低(相較於媒劑，平均分降低1.68倍)(圖17及表17及表20)。重要的是，相較於媒劑，所有3個化合物A處理組均展現腎臟間質性浸潤減少(減少高達61%)，而由硼替佐米達成之最大減少為47%(參見表20)。
此等結果很重要，因為其展示用化合物A處理MRL/lpr小鼠可減慢及/或預防易患狼瘡之小鼠中狼瘡性腎炎之產生。化合物A優於硼替佐米，因為用化合物A處理顯著減少MRL/lpr小鼠之腎損傷，但每週兩次用硼替佐米處理未能提供顯著減少。
藥效學
使用20S蛋白酶體分析與IBα積聚ELISA兩者來量測化合物A在經處理小鼠之脾及腎臟中之藥效學活性。相較於媒劑，用化合物A處理之MRL/lpr小鼠展現脾中20S蛋白酶體之功能降低(在第1-3組中分別降低40%、45%及 41%；p<0.01)(參見圖18及表18及表20)。對於硼替佐米處理組觀察到類似發現(相對於媒劑處理組，在第4組及第5組中分別降低40%及41%)。對於突發活動性且通常致命性疾病的腎臟，如由IBα積聚分析所量測，蛋白酶體抑制之幅度較大：化合物A與硼替佐米處理均產生為媒劑處理組3-6倍的細胞質IBα積聚(相較於媒劑增加266-537%；p<0.001)(參見圖19及表19及表20)。
所用統計檢驗方法為雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗。
所用統計檢驗方法為雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗。
注意：a存活率資料展示各組真實EOS小鼠占起始數量之百分比；呈粗體之值相對於媒劑處理為顯著的(p0.05)。ANA=抗核抗體；AUC=曲線下面積；EOS=研究結束；淋巴腫大值表示未增大的淋巴結相對於媒劑處理組之百分比。G1=化合物A，3 mg/kg iv，1×wk；G2=化合物A，3 mg/kg iv，2×wk；G3=化合物A，10 mg/kg po，2×wk； G4=硼替佐米，0.5 mg/kg iv，1×wk；G5=硼替佐米，0.3 mg/kg iv，2×wk；G6=地塞米松，1.5 mg/kg ip，3×wk；G7=媒劑，po，2×wk
概述
相較於地塞米松與硼替佐米，用化合物A處理易患狼瘡之MRL/lpr小鼠使得數個狼瘡相關免疫參數減小。化合物A證實在諸多方面優於硼替佐米。舉例而言，相較於每週兩次給予0.3 mg/kg硼替佐米之組，化合物A之所有三個給予方案均使得腎臟病變之發生率及嚴重性顯著減少，此等減少與MRL/lpr小鼠之蛋白尿及SLE相關之死亡減少直接有關。
實施例2.化合物A有效治療NZM小鼠之狼瘡 方案
使經年齡配合之雌性NZM或NZW/LacJ小鼠成熟以進行歷經總共7個月或210天的狼瘡性腎炎研究，此時收集尿以進行蛋白尿偵測。如基於光學密度之總蛋白沈澱分析所測定具有0.5-1.0 mg/ml尿蛋白或如黏附分析所測定具有30-300 mg/dl蛋白質之小鼠視為蛋白尿陽性且被選入研究。校正各組以含有呈高斯分佈(Gaussian distribution)的蛋白尿陽性動物(亦即1/3低蛋白尿，1/3中等蛋白尿，1/3高蛋白尿)，隨後在各組之間隨機化，接著進行耳部標記且進行基線量測(包括體重、尿及血清收集)。自整個群體中隨機選擇總共五隻小鼠進行基線腎臟組織學評估。
對各組之處理及測試如圖20所述。簡言之，在第一組(G1)中，每週一次腹膜內投予3 mg/kg劑量的化合物A。在第二組(G2)中，每週兩次腹膜內投予3 mg/kg劑量的化合物A。在第三組(G3)中，每週一次腹膜內投予0.3 mg/kg劑量的硼替佐米。在第四組(G4)中，每週兩次腹膜內投予0.3 mg/kg之劑量的硼替佐米。第五組及第六組(G5及G6)為標準護理劑環磷醯胺(CTX)及地塞米松。在G5中，每週一次腹膜內投予50 mg/kg之CTX於生理食鹽水中之溶液。環磷醯胺與MMF及硫唑嘌呤一起為罹患狼瘡性腎炎之患者的當前治療選擇，因為其充當有效免疫抑制劑，然而由於其嚴重副作用，故其僅用於最嚴重情況。在G6中，每週三次腹膜內投予1.5 mg/kg之地塞米松於生理食鹽水中之溶液。在第七組(G7)中，腹膜內提供媒劑，其中Solutol作為防腐劑懸浮於生理食鹽水及1% DMSO中。將化合物A及硼替佐米懸浮於媒劑溶液中。在212天齡開始處理，一些小鼠在處理後不久死亡，自給藥之時開始，相對於組內總數量對所有動物進行計數，不管健康狀況如何。兩月一次收集血液及尿且將血清及尿冷凍於-80℃下直至分析。最終分析包括腎臟組織學、脾細胞B細胞Elispot、針對B細胞及T細胞群體之流式細胞測量術、藥效學標記物、血清細胞激素、抗體及補體含量。相關圖式中所示之所有圖展示第0天為「處理開始時(start of treatment)」且由此表示212天齡。第98天或「處理/研究結束時(end of treatment/study)」表示NZM動物之310天齡。所有圖均以 「研究天數(day on study)」展示時間，其中研究天數開始於212天齡且結束於310天齡。
體重及存活率
相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現顯著體重增加(分別增加9%及10%；p<0.001)，類似於硼替佐米及標準護理劑(參見圖22及表22及表41)。
相對於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現顯著存活率增加(分別增加55%及46%；p<0.001)，且相對於兩種標準護理劑(CTX及地塞米松)及兩個硼替佐米組存活率顯著提高(p<0.01)(參見圖21及表21及表41)。在第56天，兩個化合物A處理組中100%小鼠仍存活，且兩個硼替佐米處理組中僅75%小鼠仍存活。在研究結束時(第310天)，媒劑處理組中僅45%小鼠存活，而化合物A處理組中100%動物存活。
用於比較之統計方法為雙尾配對史都登氏t-檢驗；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
此資料很重要，因為其展示在此狼瘡性腎炎之小鼠模型中，化合物A相較於硼替佐米提供顯著存活率利益。
脾腫大
相較於媒劑對照組，用化合物A處理之NZM小鼠展現脾腫大減小(在EOS時減小37%及34%)(參見圖23及表 23及表41)。相較於每週一次硼替佐米，用化合物A或CTX處理亦顯著降低脾品質(p<0.05)(參見圖23及表23及表41)。將脾品質變化與媒劑處理組脾品質比較，且不針對EOS時(第98天)之身體品質進行校正，因為在EOS時(第98天)，所有組之身體品質並不顯著不同，如使用兩因數ANOVA測試分析(p>0.05)。
用於比較之統計方法為雙尾曼尼-惠特尼氏檢驗；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用。
此資料很重要，因為脾腫大(脾腫脹)表明NZM小鼠患有狼瘡病。化合物A優於硼替佐米，因為相較於每週一次給予硼替佐米，用化合物A處理之動物的脾腫大顯著減 小。
蛋白尿
相較於每週一次給予硼替佐米、DEX或媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現蛋白尿減少(相較於媒劑，在第1組及第2組中減少61%及72%)(p<0.01)(參見圖24及表24及表41)。
所用統計檢驗方法為單因數ANOVA。NS=不顯著；NA=不適用；ND=未測定
此等結果很重要，因為尿蛋白(蛋白尿)增加為與狼瘡性腎炎有關之腎損傷的直接結果。化合物A優於硼替佐米，因為相較於每週一次給予硼替佐米，用化合物A處理 之動物的蛋白尿顯著減少。
抗核抗體(ANA)
相較於媒劑，每週一次或每週兩次用化合物A處理之NZM小鼠展現血清抗染色質Ab顯著減少(分別減少63%及79%；p<0.05)(參見表25及表41及圖25)。此等由化合物A達成之抗染色質Ab減少大於對於硼替佐米、Dex或CTX處理組所觀察到之減少，該等組相對於媒劑處理組均不顯著。相較於每週兩次給予硼替佐米(相較於媒劑減少22%)，每週兩次用化合物A處理之NZM小鼠展現血清抗染色質Ab減少(相較於媒劑減少79%)(參見圖25及表25及表41)。相較於每週一次給予硼替佐米，每週一次或兩次用化合物A處理之NZM小鼠展現血清抗染色質Ab減少(p<0.001)(參見圖25及表25及表41)。相較於每週一次給予硼替佐米，每週一次投予化合物A可減少血清抗Smith Ag Ab(相較於媒劑減少22%相對於88%)(參見圖26及表26及表41)。每週一次與兩次投予化合物A均使血清抗dsDNA Ab含量減少至低於每週一次及兩次給予硼替佐米之情況(相較於媒劑對照組減少21%及68%相對於增加95%及減少2%)(參見圖27及表27及表41)。
藉由單因數ANOVA執行統計分析；NS=不顯著；NA=不適用
藉由單因數ANOVA分析執行統計。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
使用單因數ANOVA分析執行統計。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
此資料很重要，因為存在抗dsDNA抗體與狼瘡之不良預後有關且與發展中且通常致命之狼瘡性腎炎密切相關(Egner 2000；Kiss,Lakos等人，2009)。化合物A優於硼替佐米，因為相較於媒劑僅化合物A顯著減少血清抗染色質Ab，且相較於媒劑僅每週一次給予化合物A顯著減少血清抗Smith Ag Ab。另外，每週一次與兩次投予化合物A均使血清抗dsDNA Ab含量減少至低於每週一次及兩次給予硼替佐米之情況。
血清細胞激素
相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現血清 IL-12p40/p70顯著減少(分別減少83%及67%；p<0.01)(參見圖28及表28及表41)。相較於媒劑，化合物A所引起之血清IL-12含量減少大於硼替佐米(對於化合物A減少67-83%相對於對於硼替佐米減少32-55%)(參見圖28及表28及表41)。相較於CTX，在用化合物A或硼替佐米處理後，血清單核細胞趨化因數(亦即單核球激素)CXCL9/MIG減少(p<0.001)，但相較於DEX並非如此(參見圖29及表29及表41)。相較於媒劑，在用化合物A每週兩次給予處理後血清IFN-γ誘導性趨化因數CXCL10/IP-10減少(減少30%)，但顯著變化僅在與CTX比較時可見(參見圖30及表30及表41)。相較於媒劑，化合物A或硼替佐米處理組中未觀察到IL-13血清含量顯著變化(參見圖31及表31及表41)。相較於Dex，每週一次與兩次給予化合物A均減少血清TNFα(p<0.001)(參見圖32及表32及表41)。相較於媒劑，化合物A或硼替佐米處理組中未觀察到IL-17A血清含量顯著變化(參見圖33及表33及表41)。
使用單因數ANOVA分析執行統計；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；ND=未測定；NA=不適用
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；ND=未測定；NA=不適用
表32.組群比較之統計：NZM小鼠之血清TNFα濃度
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；ND=未測定；NA=不適用
用於比較之統計方法為單因數ANOVA；NS=不顯著(p>0.05)；NA=不適用
此等結果很重要，因為此等細胞激素在狼瘡患者中會升高，且參與增大狼瘡熱紅及對維持該疾病之自體抗原的進行中的免疫反應(Chun,Chung等人，2007；Tucci,Lombardi等人，2008)。此等細胞激素分佈(profile)之減少或調節可向患者提供有利益處且提供疾病消退之間接指示。(Morimoto,Tokano等人，2001；Aringer及Smolen 2004；Chun,Chung等人，2007；Niewold,Hua等人，2007；Fu,Chen等人，2008；Tucci,Lombardi等人，2008)。化合物A優於硼替佐米，因為化合物A所引起之相較於媒劑之血清IL-12含量減少大於硼替佐米。
抗體分泌型細胞
用化合物A處理之NZM小鼠展現抗染色質ASC頻率降低至低於硼替佐米、DEX及媒劑之情況(相較於媒劑，對於化合物A，抗染色質ASC減少96-100%；p<0.01)(參見圖34及表34及表41)。在經處理小鼠之脾中，對於產生總IgG之ASC觀察到類似結果。化合物A使產生總IgG之ASC減少至低於每週一次給予硼替佐米、DEX、CTX及媒劑之情況(相較於媒劑，對於CEP-1870，減少62-67%)(參見圖35及表35及表41)。
用於比較之統計方法包括雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗或必要時在不可能進行曼尼-惠特尼氏檢驗時進行威爾卡遜配對檢驗(Wilcoxon matched pairs test)。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
用於比較之統計方法包括雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗或 必要時在不可能進行曼尼-惠特尼氏檢驗時進行威爾卡遜配對檢驗。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
此資料很重要，因為迴圈自體抗體分泌型細胞類型與不良SLE預後直接有關(Neubert等人，2008，Sanz等人，2010，Muller等人，2008)。化合物A優於硼替佐米，因為化合物A比硼替佐米更顯著地減少抗染色質ASC，且相較於媒劑，僅化合物A(而非硼替佐米)顯著減少產生總IgG之ASC。
血清補體
用化合物A處理之NZM小鼠展現補體C3血清濃度增加至高於CTX之情況(對於每週一次給予化合物A，p<0.001；對於每週兩次給予化合物A，p<0.05)(參見圖36及表36及表41)。僅每週一次給予化合物A使C3增加至高於媒劑之情況(增加45%；p<0.05)(參見圖36及表36及表41)。每週一次給予化合物A之組(G1)亦使C3含量顯著增加至高於每週兩次給予硼替佐米之情況(p<0.01)(參見圖36及表36及表41)。
使用單因數-ANOVA執行統計。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
此資料很重要，因為血清中C3之含量與炎症之幅度或程度間接相關。SLE患者展示C3及C4含量隨時間減少，此表明全身炎症增加，從而造成組織器官損傷。但隨著處理，此等因數回升，表明處理減少全身炎症，由此有效治療疾病。因此，血清C3增加表明狼瘡病消退及治療(Boumpas,Furie等人，2003)。化合物A優於硼替佐米，因為僅化合物A(而非硼替佐米)可使C3相較於媒劑增加。
血清膠原蛋白I型交聯子(CTx)骨吸收生物標記物
相較於媒劑，用化合物A或硼替佐米處理之NZM小鼠未展現CTx含量變化(參見圖37及表37及表41)。
使用單因數-ANOVA執行統計。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
組織病理學分析
藉由組織病理學評估晚期狼瘡性腎炎且藉由委員會認證之病理學家評分以評定患病動物之總體腎損傷。相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現數個腎臟組織病理學之發生率及嚴重性減少，包括腎小球細胞性(減少約50%)、腎小球硬化(減少約53%)、間質性浸潤(減少43-46%)、腎小管萎縮(減少55-59%)、間質性纖維化(減少約55%)及血管炎(減少約51-55%)(參見圖38及表38及表41)。每週一次與兩次化合物A處理所引起的各種腎臟組織病理學減少幅度類似。在硼替佐米處理組中，此模型不發生此等腎臟組織病理學顯著減少，間質性浸潤減少(44%)除外(參見圖38及表38及表41)。每週一次與兩次投予化合物A均使數個腎臟病變降低至低於硼替佐米、DEX及媒劑處理組(腎小球細胞性、腎小球壞死、腎小球硬化、間質性浸潤、腎小管萎縮、間質性纖維化、血管炎)。一般而言，化合物A處理對腎臟組織損傷及炎症之積極影 響大於硼替佐米處理(例如相較於媒劑，對於化合物A，數個參數之分值減少約45-55%相對於對於硼替佐米，數個參數之分值減少約6-14%)(參見圖38及表38及表41)。在媒劑處理之小鼠中觀察到腎臟與肺浸潤(參見圖39)。
此等結果很重要，因為其展示用化合物A處理NZM小鼠可減慢及/或預防易患狼瘡之中狼瘡性腎炎之產生。化合物A優於硼替佐米，因為相較於媒劑，用化合物A處理顯著減少NZM小鼠之腎損傷(七項組織病理學中有六項顯著減少)，但用硼替佐米處理未能提供顯著減少(在七項組織病理學中僅間質性浸潤顯著減少，且僅對於每週兩次給予而言)(參見圖38及表38及表41)。相較於每週一次硼替佐米，化合物A使與狼瘡性腎炎有關之七項腎臟病變中之五項顯著減少(參見圖38及表38及表41)。
藥效學
使用20S蛋白酶體活性與IBα積聚兩者作為經處理小鼠之脾及腎臟中化合物A介導之蛋白酶體抑制的藥效學指示。相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現脾20S 蛋白酶體之功能降低(p<0.05)(相對於媒劑約40%抑制)(參見圖40及表39及表41)。每週兩次投予化合物A使腎臟IBα含量之積聚增加至高於媒劑處理之情況(增加約40%，p<0.05)(參見圖41及表40及表41)。
使用雙尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗執行統計。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
使用單尾曼尼-惠特尼氏t-檢驗執行統計。NS=不顯著；ND=未測定；NA=不適用
注意：各組之活小鼠百分比之研究結束時之值係相對於初始數量；呈粗體之值相對於媒劑處理為顯著的(p0.05)。差值百分比基於所列出之AUC或EOS值計算。淋巴腫大值表示未增大的淋巴結之百分比。
ANA=抗核抗體；ASC=抗體分泌型細胞；AUC=曲線下面積；EOS=研究結束；PD=藥效學；CTx=I型膠原蛋白之羧基端端肽。G1=化合物A，3 mg/kg ip，1×wk；G2=化合物A，3 mg/kg ip，2×wk；G3=硼替佐米，0.3 mg/kg ip，1×wk；G4=硼替佐米，0.3 mg/kg ip，2×wk；G5=Dex，1.5 mg/kg ip，3×wk；G6=CTX，50 mg/kg ip，1×wk； G7=媒劑PBS+3% DMSO+10% Solutol，ip，1×wk；G8=NZW/LacJ未患病小鼠；G9=7月齡NZM基線，第0天
概述
用化合物A處理易患狼瘡之NZM小鼠使狼瘡性腎炎之疾病症狀減少且提高存活率。相較於地塞米松、環磷醯胺及硼替佐米，化合物A產生較大存活率、耐受性及數個狼瘡相關免疫參數減小。舉例而言，相較於硼替佐米，化合物A使抗染色質自體抗體分泌型細胞(ASC)更顯著減少，相較於媒劑，僅化合物A(而非硼替佐米)增加血清補體C3，相較於媒劑，化合物A(而非硼替佐米)使多個腎臟病變之發生率及嚴重性顯著減少。
實施例3.皮下投予之化合物A有效治療NZM小鼠之狼瘡 方案
圖42及表42中對處理進行概述。研究持續時間為91天，在212天齡開始且在303天齡結束。
體重及存活率
在研究結束時(第91天)所有處理組中之體重相對類似(參見圖43)。相對於媒劑，第1組、第2組及第4組中用化合物A處理之NZM小鼠展現存活率顯著提高(參見圖44)。
蛋白尿
相較於腹膜內投予媒劑(第10組)及硼替佐米(第7組)，第1組、第2組、第4組及第5組中用化合物A處理之NZM小鼠展現蛋白尿減少(參見圖45)。
抗核抗體(ANA)
相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現血清抗smith ANA顯著減少(在第1組、第2組、第4組及第5組中分別減少93.8%、85.0%、94.5%及92.4%)(參見圖46)。此等由化合物A達成之抗smith ANA減少大於對於腹膜內硼替佐米處理組(第7組)所觀察到之減少，該腹膜內硼 替佐米處理組展現僅為66.7%之不顯著減少。相對於媒劑處理組，皮下硼替佐米組(第8組)展現減少85.7%。相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現血清抗dsDNA ANA減少(在第1組、第2組、第4組及第5組中分別減少79.6%、69.2%、84.1%及81.0%)(參見圖47)。此等由化合物A達成之抗dsDNA ANA減少大於對於腹膜內硼替佐米處理組(第7組)所觀察到之減少，該腹膜內硼替佐米處理組展現僅為25.8%之不顯著減少。相對於媒劑處理組，皮下硼替佐米組(第8組)展現減少55.4%。
血清細胞激素
相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現血清IL-12細胞激素含量減少(在第1組、第2組、第4組及第5組中分別減少92.8%、76.6%、75.7%及70.8%)(參見圖48)。此等由化合物A達成之血清IL-12細胞激素含量減少大於對於腹膜內硼替佐米處理組(第7組)所觀察到之減少，該腹膜內硼替佐米處理組展現僅為65.8%之不顯著減少。相對於媒劑處理組，皮下硼替佐米組(第8組)展現減少75.6%。
抗體分泌型細胞
相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現抗smith ASC減少(在第1組、第2組、第4組及第5組中分別減少98.7%、96.6%、98.6%及97.6%)(參見圖49)。此等由化合物A達成之抗smith ASC減少大於對於硼替佐米處理組所觀察到之減少，該硼替佐米處理組展現在第7組及第8 組中分別減少46.3%及82.4%。相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現抗sdDNA ASC減少(在第1組、第2組、第4組及第5組中分別減少97.9%、96.4%、100.7%及95.9%)(參見圖50)。此等由化合物A達成之抗dsDNA ASC減少大於對於硼替佐米處理組所觀察到之減少，該硼替佐米處理組展現在第7組及第8組中分別減少64.7%及88.9%。
脾CD38/CD138+漿細胞
相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現脾CD19/CD45R雙陰性CD138/CD38雙陽性血漿B細胞之比例減少(在第1組、第2組、第4組、第5組及第6組中分別減少56.6%、38.1%、49.8%、24.3%及47.8%)(參見圖51)。硼替佐米處理組展現在第7組及第8組中分別減少35.4%及57.8%。
組織病理學分析
相較於媒劑，用化合物A處理之NZM小鼠展現組合平均腎臟組織病理學盲式分值減少(在第1-5組中分別減少53%、43.6%、18.9%、48.7%及40.5%)(參見圖52)。此等由化合物A達成之組合平均腎臟組織病理學盲式分值減少大於對於腹膜內硼替佐米處理組(第7組)所觀察到之減少，該腹膜內硼替佐米處理組展現僅為19.4%之不顯著減少。相對於媒劑處理組，皮下硼替佐米組(第8組)展現減少43.6%。
藥效學
使用IBα積聚ELISA作為量測經處理小鼠之脾及腎臟 中蛋白酶體抑制活性的標準藥效學(PD)分析(參見圖53)。
概述
用化合物A腹膜內或皮下處理易患狼瘡之NZM小鼠使狼瘡性腎炎之疾病症狀減少且提高存活率。所觀察到之結果一般優於硼替佐米，尤相較於腹膜內處理組。
較佳具體實例
本發明之較佳具體實例包括：具體實例1：一種治療個體中之狼瘡的方法，其包含向該個體投予化合物A之步驟：
具體實例2：一種治療個體中之狼瘡的方法，其包含向該個體投予有效量之化合物A之步驟。
具體實例3：一種化合物A之用途，其用於製造治療個體中之狼瘡的醫藥品。
具體實例4：一種化合物A，其用於治療個體中之狼瘡。
具體實例5：如具體實例1至4中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A經靜脈內投予。
具體實例6：如具體實例1至4中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A經皮下投予。
具體實例7：如具體實例1至4中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A經口投予。
具體實例8：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約0.5 mg/m2至約5 mg/m2之劑量投予。
具體實例9：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約1 mg/m2至約5 mg/m2之劑量投予。
具體實例10：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約0.5 mg/m2至約3 mg/m2之劑量投予。
具體實例11：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約1 mg/m2至約4 mg/m2之劑量投予。
具體實例12：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約1 mg/m2至約3 mg/m2之劑量投予。
具體實例13：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約1.5 mg/m2至約3 mg/m2之劑量投予。
具體實例14：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約2 mg/m2之劑量投予。
具體實例15：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約2 mg/m2至約2.5 mg/m2 之劑量投予。
具體實例16：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約1.5 mg/m2之劑量投予。
具體實例17：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約2.5 mg/m2之劑量投予。
具體實例18：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約0.1 mg/m2至約10 mg/m2之劑量投予。
具體實例19：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約1 mg/m2至約7 mg/m2之劑量投予。
具體實例20：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約2 mg/m2至約6 mg/m2之劑量投予。
具體實例21：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約3 mg/m2至約5 mg/m2之劑量投予。
具體實例22：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約3 mg/m2之劑量投予。
具體實例23：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約4 mg/m2之劑量投予。
具體實例24：如具體實例1至7中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約5 mg/m2之劑量投予。
具體實例25：如具體實例1至7中任一項之方法、用 途或化合物，其中該化合物A以約6 mg/m2之劑量投予。
具體實例26：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A每週投予兩次。
具體實例27：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A每週投予一次。
具體實例28：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A每兩週投予一次。
具體實例29：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在21天週期之第1天、第4天、第8天及第11天投予。
具體實例30：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在28天週期之第1天、第4天、第8天及第11天投予。
具體實例31：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在28天週期之第1天、第8天及第15天投予。
具體實例32：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在21天週期之第1天及第8天投予。
具體實例33：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在28天週期之第1天及第8天投予。
具體實例34：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在21天週期之第1天及第15 天投予。
具體實例35：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在28天週期之第1天及第15天投予。
具體實例36：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在28天週期之第1天、第6天、第11天及第17天投予。
具體實例37：如具體實例1至25中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A在21天週期之第1天、第6天及第11天投予。
具體實例38：如具體實例29至37中任一項之方法、用途或化合物，其中該週期重複至少一次。
具體實例39：如具體實例1至38中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之淋巴腫大減小。
具體實例40：如具體實例1至39中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之脾腫大減小。
具體實例41：如具體實例1至40中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之一或多種血清抗核抗體減少。
具體實例42：如具體實例1至41中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之一或多種血清細胞激素減少。
具體實例43：如具體實例1至42中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IFNα減少。
具體實例44：如具體實例1至43中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之蛋白尿減少。
具體實例45：如具體實例1至44中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IL-12減少。
具體實例46：如具體實例1至45中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IL-17A減少。
具體實例47：如具體實例1至46中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IL-6減少。
具體實例48：如具體實例1至47中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清CCL3/MIP-1α減少。
具體實例49：如具體實例1至48中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清CXCL10/IP-10減少。
具體實例50：如具體實例1至49中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清CXCL9/MIG減少。
具體實例51：如具體實例1至50中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IL-4減少。
具體實例52：如具體實例1至51中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IL-13減少。
具體實例53：如具體實例1至52中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清TNFα減少。
具體實例54：如具體實例1至53中任一項之方法、用 途或化合物，其中在治療期間該個體之血清KC/IL-8減少。
具體實例55：如具體實例1至54中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清CTx減少。
具體實例56：如具體實例1至55中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清C3增多。
具體實例57：如具體實例1至56中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清抗染色質IgG減少。
具體實例58：如具體實例1至57中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清抗Smith Ag IgG減少。
具體實例59：如具體實例1至58中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IL-1β減少。
具體實例60：如具體實例1至59中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清抗dsDNA抗核抗體減少。
具體實例61：如具體實例1至60中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以前藥形式投予。
具體實例62：如具體實例61之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物A之硼酸酯衍生物。
具體實例63：如具體實例62之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物A之環狀硼酸酯衍生物。
具體實例64：如具體實例63之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物B：
具體實例65：如具體實例1至64中任一項之方法、用途或化合物，其中該個體為人類。
具體實例66：如具體實例1至56中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清抗染色質ANA減少。
具體實例67：如具體實例1至56或66中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清抗Smith Ag ANA減少。
具體實例68：如具體實例1至56、66或67中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清IL-1β減少。
具體實例69：如具體實例1至56或66-68中任一項之方法、用途或化合物，其中在治療期間該個體之血清抗dsDNA ANA減少。
具體實例70：如具體實例1-56或66-69中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以前藥形式投予。
具體實例71：如具體實例70之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物A之硼酸酯衍生物。
具體實例72：如具體實例71之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物A之環狀硼酸酯衍生物。
具體實例73：如具體實例72之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物B：
具體實例74：如具體實例1-56或66-73中任一項之方法、用途或化合物，其中該個體為人類。
其他較佳具體實例包括：
1.一種治療個體中之狼瘡的方法，其包含向該個體投予化合物A之步驟：
2.如較佳具體實例1之方法，其中該個體為人類。
3.如較佳具體實例2之方法，其中該化合物A以前藥形式投予。
4.如較佳具體實例3之方法，其中該前藥為化合物A 之硼酸酯。
5.如較佳具體實例4之方法，其中該前藥為化合物B：
6.如較佳具體實例2之方法，其中該化合物A每週投予一次。
7.如較佳具體實例2之方法，其中該化合物A以約0.5 mg/m2至約5 mg/m2之劑量投予。
8.如較佳具體實例2之方法，其中該化合物A以約1 mg/m2至約3 mg/m2之劑量投予。
9.如較佳具體實例2之方法，其中該化合物A以約2 mg/m2之劑量投予。
10.如較佳具體實例5之方法，其中該化合物A以約0.5 mg/m2至約5 mg/m2之劑量投予。
11.如較佳具體實例5之方法，其中該化合物A以約1 mg/m2至約3 mg/m2之劑量投予。
12.如較佳具體實例5之方法，其中該化合物A以約2 mg/m2之劑量投予。
13.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之一或多種血清細胞激素減少。
14.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之IL-12減少。
15.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之一或多種血清抗核抗體減少。
16.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之血清抗染色質IgG減少。
17.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之血清抗Smith Ag IgG減少。
18.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之血清抗dsDNA IgG減少。
19.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之蛋白尿減少。
20.如較佳具體實例1至12中任一項之方法，其中在治療期間該個體之血清C3增多。
熟習此項技術者應瞭解根據上述教示可進行本發明之多種修改及變化。因此，應瞭解，在隨附申請專利範圍之範疇內，本發明可以與本文特別描述不同之方式實踐，且本發明之範疇意欲涵蓋所有該等變化形式。
本文所提及之所有公開案出於所有目的以全文引用的方式併入本文中。
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圖1描述在急性狼瘡MRL/lpr小鼠模型中測試化合物A及硼替佐米之實驗設計的概述。
圖2描述各處理組MRL/lpr小鼠在研究持續時間內之體重進展。如圖例中所概述處理MRL/lpr小鼠。曲線圖展示在研究持續時間內各組之平均值±SEM身體品質。
圖3描述各處理組MRL/lpr小鼠在研究持續時間內之存活率。如圖例中所概述處理MRL/lpr小鼠。曲線圖展示實驗各週活小鼠之百分比。
圖4描述處理組MRL/lpr小鼠在研究持續時間內之淋巴腫大。如圖例中所概述處理MRL/lpr小鼠。每週一次觀察且記錄淋巴腫大或增大之淋巴結的存在。曲線圖展示淋巴結(LN)未增大之小鼠的百分比。
圖5描述處理組MRL/lpr小鼠在研究持續時間內之脾腫大。如圖例中所概述處理MRL/lpr小鼠。對直至實驗結束仍存活之所有小鼠的脾品質繪製曲線圖。各符號表示25週齡之一隻小鼠的脾重量。
圖6描述MRL/lpr小鼠在疾病治療過程中之血清IL-12p40/p70濃度。如圖例中所概述處理MRL/lpr小鼠。曲 線圖展示經處理MRL/lpr小鼠之小鼠血清IL-12p40/p70之濃度的平均值±SEM。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖7描述MRL/lpr小鼠在疾病治療過程中之血清IL-1β濃度。如圖例中所概述處理MRL/lpr小鼠。曲線圖展示經處理MRL/lpr小鼠之小鼠血清IL-1b之濃度的平均值±SEM。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖8描述MRL/lpr小鼠在疾病治療過程中之血清TNFα濃度。如圖例中所概述處理MRL/lpr小鼠。曲線圖展示經處理MRL/lpr小鼠之小鼠血清TNFα之濃度的平均值±SEM。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖9描述MRL/lpr小鼠之脾中抗smith抗原及抗dsDNA抗體分泌型細胞之頻率。處理MRL/lpr經處理小鼠之脾以獲得脾細胞從而進行活體外Elispot分析。用10 μg/mL smith抗原、dsDNA或卵白蛋白塗佈Elispot孔L。以每孔500,000個細胞於細胞培養基中向各孔中添加新鮮完整脾細胞。在37℃下培育細胞隔夜。顯影之孔提供斑點，計數作為1百萬個脾細胞中ASC之頻率。曲線圖展示平均值±SEM。
圖10描述MRL/lpr小鼠之脾中抗染色質抗體分泌型細胞之頻率。處理MRL/lpr經處理小鼠之脾以獲得脾細胞從而進行活體外Elispot分析。用10 μg/mL經煮沸的雞染色質或卵白蛋白塗佈Elispot孔。以每孔50,000個細胞於細胞培養基中向各孔中添加新鮮完整脾細胞。在37℃下培育細胞隔夜。顯影之孔提供斑點，計數作為1百萬個脾細胞中ASC之頻率。曲線圖展示平均值±SEM。
圖11描述MRL/lpr小鼠隨時間變化的抗染色質抗核抗體濃度。經由ELISA分析(參見材料及方法)分析經處理MRL/lpr小鼠血清樣品中抗染色質IgG迴圈ANA之存在。曲線圖展示抗染色質ANA濃度之平均值±SEM(ng/ml)，自初始儲備液2000倍稀釋。
圖12描述MRL/lpr小鼠隨時間變化的抗Smith抗原抗核抗體濃度。經由ELISA分析(參見材料及方法)分析經處理MRL/lpr小鼠血清樣品中抗smith抗原IgG迴圈ANA之存在。曲線圖展示抗smith抗原ANA濃度之平均值±SEM(ng/mL)，自初始儲備液100倍稀釋。
圖13描述MRL/lpr小鼠隨時間變化的抗dsDNA抗核抗體濃度。經由ELISA分析(參見材料及方法)分析經處理MRL/lpr小鼠血清樣品中抗dsDNA IgG迴圈ANA之存在。曲線圖展示抗dsDNA ANA濃度之平均值±SEM(ng/mL)，自初始儲備液100倍稀釋。
圖14描述MRL/lpr小鼠之CD138hi脾漿細胞之比例。移出MRL/lpr脾且進行處理以獲得白血球(RBC溶解)。用抗CD19-FITC、抗細胞內IgL輕鏈-PE及抗CD138-APC對總脾白血球染色以分析漿細胞免疫表型。將漿細胞染色劑與適當同型對照組配對。在Accuri C6取樣器流式細胞儀上操作細胞，收集200,000個事件且分析SSCmid、FSCmid(活尺寸閘)、表現CD138且細胞內IgL輕鏈陽性之CD19陰性細胞。漿細胞頻率展示為活尺寸閘選之淋巴細胞的百分比，曲線圖中展示平均值±SEM。
圖15描述MRL/lpr小鼠隨時間變化的總尿蛋白(蛋白尿)。使用大鼠尿分析套組分析自經處理MRL/lpr小鼠收集之尿的總蛋白含量。曲線圖展示蛋白質濃度之平均值±SEM(mg/mL)。
圖16描述MRL/lpr小鼠中尿白血球(白血球尿)之存在。使用Uristix分析測試經處理MRL/lpr小鼠之尿中白血球或白血球尿之存在。曲線圖展示對於研究之最後4個時間點根據製造商之說明對各試紙評分。繪製成曲線圖的結果為平均值±SEM。
圖17描述MRL/lpr小鼠之腎臟組織病理學結果(25週齡小鼠的經H及E染色且經石蠟包埋之腎臟組織切片)。影像展示由病理學家盲選之組織切片的受影響最嚴重的區域。
圖18描述MRL/lpr小鼠之脾中20S蛋白酶體之活性。將經處理MRL/lpr小鼠之脾溶解且使用功能性活體外測試分析20S蛋白酶體。
圖19描述MRL/lpr小鼠之腎臟中藥物處理後3小時的磷酸化IBα細胞積聚。將腎臟溶解且使用量測隨蛋白酶體活性變化之細胞IBα積聚的市售ELISA套組分析。
圖20描述測試化合物A及硼替佐米治療NZM狼瘡性腎炎小鼠模型之進行性狼瘡的實驗設計的概述。
圖21描述各處理組NZM小鼠在研究持續時間內之存活率。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示研究各週活小鼠之百分比。
圖22描述處理組NZM小鼠在研究持續時間內之體重進展。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示在研究持續時間內各組之平均值±SEM身體品質。
圖23描述處理組NZM小鼠在研究持續時間內之脾腫大。如圖例中所概述處理NZM小鼠。對直至研究結束仍存活之所有小鼠的脾重量繪製曲線圖。值表示25週齡之平均值±SEM脾重量。
圖24描述NZM小鼠之總尿蛋白(蛋白尿)。使用大鼠尿分析套組分析自NZM小鼠收集之尿的總蛋白含量。曲線圖展示蛋白質濃度之平均值±SEM(mg/mL)。
圖25描述NZM小鼠血清中之抗染色質抗核抗體濃度。經由ELISA分析法分析NZM小鼠血清樣品中抗染色質IgG迴圈ANA之存在。曲線圖展示抗染色質ANA濃度之平均值±SEM(ng/mL)，自初始儲備液2000倍稀釋。
圖26描述NZM小鼠之抗Smith抗原抗核抗體濃度。經由ELISA分析法分析NZM小鼠血清樣品中抗smith抗原IgG迴圈ANA之存在。展示抗Smith Ag ANA濃度之平均值±SEM值(ng/mL)，自初始儲備液100倍稀釋。
圖27描述NZM小鼠之抗dsDNA抗核抗體濃度。經由ELISA分析法分析NZM小鼠血清樣品中抗dsDNA IgG迴圈ANA之存在。展示抗dsDNA ANA濃度之平均值±SEM值(ng/mL)，自初始儲備液100倍稀釋。
圖28描述NZM小鼠在疾病治療過程中之血清IL-12p40/p70濃度。如圖例中所概述處理NZM小鼠。展示 經處理NZM小鼠之小鼠血清IL-12p40/p70之濃度的平均值±SEM值。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖29描述NZM小鼠之血清MIG濃度。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示經處理NZM小鼠之小鼠血清單核球激素MIG之濃度的平均值±SEM值。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖30描述NZM小鼠之血清IP-10濃度。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示經處理NZM小鼠之小鼠血清IFN-γ誘導性蛋白IP-10之濃度的平均值±SEM值。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖31描述NZM小鼠之血清IL-13濃度。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示經處理NZM小鼠之小鼠血清Th2細胞激素IL-13之濃度的平均值±SEM值。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖32描述NZM小鼠之血清TNFα濃度。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示經處理NZM小鼠之小鼠血清促炎性細胞激素TNFα之濃度的平均值±SEM值。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖33描述NZM小鼠之血清IL-17A濃度。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示經處理NZM小鼠之小鼠血清Th17細胞激素IL-17A之濃度的平均值±SEM值。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。
圖34描述NZM小鼠之脾中抗染色質抗體分泌型細胞之頻率。處理NZM經處理小鼠之脾以獲得脾細胞從而進行 活體外Elispot分析。用10 μg/mL經煮沸的雞染色質或卵白蛋白塗佈Elispot孔。以每孔50,000個細胞於細胞培養基中向各孔中添加新鮮完整脾細胞。在37℃下培育細胞隔夜。顯影之孔提供斑點，計數作為1百萬個脾細胞中ASC之頻率。曲線圖展示平均值±SEM值。
圖35描述NZM小鼠之脾中總IgG抗體分泌型細胞之頻率。處理NZM經處理小鼠之脾以獲得脾細胞從而進行活體外Elispot分析。用10 μg/mL抗小鼠IgG、IgH及IgL鏈塗佈Elispot孔。以每孔50,000個細胞於細胞培養基中向各孔中添加新鮮完整脾細胞。在37℃下培育細胞隔夜。顯影之孔提供斑點，計數作為1百萬個脾細胞中ASC之頻率。曲線圖展示平均值±SEM值。
圖36描述NZM小鼠之血清C3補體含量。如對於ANA分析所述處理NZM血清樣品。使用市售套組測試血清之總補體因數3(C3)濃度。曲線圖展示用生理食鹽水1比50,000稀釋之血清樣品的平均值±SEM值。
圖37描述NZM小鼠之膠原蛋白I型交聯子端肽(CTx)的血清濃度。如對於ANA分析所述處理NZM血清樣品。使用市售套組測試血清之總膠原蛋白I型交聯子(CTx)濃度(全身性骨吸收之生物標記物)。曲線圖展示用生理食鹽水1比6稀釋之血清樣品的平均值±SEM值。
圖38描述NZM小鼠之腎臟組織病理學分值。
圖39描述40週齡NZM小鼠之腎臟及肺部組織病理學結果(25週齡小鼠的經H及E染色且經石蠟包埋之腎臟組 織切片)。影像展示由病理學家盲選之切片的受影響最嚴重的區域。
圖40描述NZM小鼠之脾中20S蛋白酶體之抑制。將經處理NZM小鼠之脾溶解且使用功能性活體外測試分析20S蛋白酶體。曲線圖表示處理組相對於對照組之平均值±SEM百分比。
圖41描述NZM小鼠給藥後3小時的腎臟IBα積聚。將腎臟溶解且使用量測隨蛋白酶體活性變化之細胞IBα積聚的市售ELISA套組分析。曲線圖表示處理組相對於對照組之平均值±SEM百分比。
圖42描述測試在NZM狼瘡性腎炎小鼠模型中皮下投予化合物A及硼替佐米之實驗設計的概述。
圖43描述各處理組NZM小鼠在研究持續時間內之體重進展。曲線圖展示在研究結束時各組之平均值±SEM身體品質。
圖44描述各處理組NZM小鼠在研究持續時間內之存活率。如圖例中所概述處理NZM小鼠。曲線圖展示研究各週活小鼠之百分比。第91天終點之存活小鼠的總百分比列於圖例內之括弧中。＊表明p0.05。
圖45描述NZM小鼠之總尿蛋白(蛋白尿)。使用大鼠尿分析套組分析自NZM小鼠收集之尿的總蛋白含量。曲線圖展示蛋白質濃度之平均值±SEM(mg/mL)。＊表明p0.05。
圖46描述NZM小鼠之抗Smith抗原抗核抗體濃度。經由ELISA分析法分析NZM小鼠血清樣品中抗smith抗原 IgG迴圈ANA之存在。抗Smith Ag ANA濃度之平均值±SEM值(ng/mL)以自初始儲備液100倍稀釋之形式列出。＊表明相較於媒劑對照組G10，p0.05。
圖47描述NZM小鼠之抗dsDNA抗核抗體濃度。經由ELISA分析法分析NZM小鼠血清樣品中抗dsDNA IgG迴圈ANA之存在。抗dsDNA ANA濃度之平均值±SEM值(ng/mL)以自初始儲備液100倍稀釋之形式列出。＊表明相較於媒劑對照組G10，p0.05。
圖48描述NZM小鼠之血清IL-12濃度。展示在研究結束時經處理NZM小鼠之小鼠血清IL-12之濃度的平均值±SEM值。使用Luminex珠粒套組分析細胞激素。＊表明相較於媒劑對照組G10，p0.05。
圖49描述NZM小鼠之脾中抗Smith抗體分泌型細胞之頻率。處理NZM經處理小鼠之脾以獲得脾細胞從而進行活體外Elispot分析。用10 μg/mL經純化smith抗原或卵白蛋白作為第三方背景對照抗原塗佈Elispot孔。以每孔500,000個細胞於細胞培養基中向各孔中添加新鮮完整脾細胞。在37℃下培育細胞隔夜。顯影之孔提供斑點，計數作為1百萬個脾細胞中ASC之頻率。曲線圖展示平均值±SEM值。＊表明相較於媒劑對照組G10，p0.05。
圖50描述NZM小鼠之脾中抗dsDNA抗體分泌型細胞之頻率。處理NZM經處理小鼠之脾以獲得脾細胞從而進行活體外Elispot分析。用10 μg/mL牛dsDNA或卵白蛋白作為第三方背景對照抗原塗佈Elispot孔。以每孔500,000個 細胞於細胞培養基中向各孔中添加新鮮完整脾細胞。在37℃下培育細胞隔夜。顯影之孔提供斑點，計數作為1百萬個脾細胞中ASC之頻率。曲線圖展示平均值±SEM值。＊表明相較於媒劑對照組G10，p0.05。
圖51描述NZM小鼠之脾CD38/CD138+漿細胞之頻率。在Accuri流式細胞儀上每管用抗CD19-FITC、抗CD38-PE及抗CD138-APC染色之脾細胞總共收集100,000至200,000個事件，獲取且分析。基於淋巴細胞Fsc及Ssc散射儀執行活尺寸閘選。根據CD 138及CD38，如所示對CD19陰性直方圖閘選事件繪圖。所示代表性資料來自總共三隻隨機分析之小鼠。未展示T細胞及B細胞子群分析。圖展示經處理NZM小鼠之脾漿細胞。圖表展示平均值±SEM。＊表明相較於媒劑對照組G10，p0.05。
圖52描述NZM小鼠之腎臟組織病理學分值(25週齡小鼠的經H及E染色且經石蠟包埋之腎臟組織切片)。曲線圖展示平均值±SEM。＊表明相較於媒劑對照組G10，p0.05。
圖53描述NZM小鼠給藥後3小時的脾及腎臟IBα積聚。將脾及腎臟溶解且使用量測隨蛋白酶體活性變化之細胞IBα積聚的市售ELISA套組分析。曲線圖表示處理組相對於對照組之平均值±SEM百分比。

Claims (12)

  1. 一種治療個體中之狼瘡的方法，其包含向該個體投予化合物A之步驟：
  2. 一種化合物A之用途，其用於製造治療個體中之狼瘡的醫藥品：
  3. 一種化合物A，其適用於治療個體中之狼瘡：
  4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以前藥形式投予。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物A之硼酸酯。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法、用途或化合物，其中該前藥為化合物B：
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A每週投予一次。
  8. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A每週投予兩次。
  9. 如申請專利範圍第1項至第8項中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A經皮下投予。
  10. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約0.5 mg/m2至約5 mg/m2之劑量投予。
  11. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約1 mg/m2至約3 mg/m2之劑量投予。
  12. 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之方法、用途或化合物，其中該化合物A以約2 mg/m2之劑量投予。
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