TW201229027A - Salicylic acid derivates with fluorophores and method of making and using the same - Google Patents

Description

201229027 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種可藉由生化反應而釋放出勞光之物 質，特別係關於一種化學結構中同時含有鄰羥基笨甲酸部 分與螢光基團之物質。 【先前技術】 於一種黃 水楊酸進

水楊酸髮化酶(saliCylate hydroxylase, SHL)屬 素蛋白，其可於有氧環境及NAD(P)H之存在下對 行催化而產生兒茶酚。 —目刖已有人將SHL與NAD(p)+依賴型去氫酶共同膠 固定在克拉克電極上，以形成一種利用電化學方式> 生物感測器，其可藉由不同酵素的使用進行各種1作的 之感測。 化分子 然而，由於前述電化學型之生物感剛器於實 丄 困難，同時製成之電極不易保存，故有需要提出一上較為 的解決方案。 一種不同 【發明内容】 有感於習知技術之缺憾，發明人遂蝎其心知糸 究，憑其從事該項產業多年所累積之經殮’進而日aw研 種可供使用者藉由螢光方式進行生化分柯之隱藏 (latent fluorophore 或 pro-fluorophore)、其製造方去 其進行生化分析之方法以及含有該隱藏型螢光團 利用 之生化分 201229027 析用套組。 本發明之目的之一，在於提供一種隱藏型螢光團，其 係衍生自鄰羥基苯曱酸，且結構中具有一螢光基團與一式I 所示之部分（moiety):

C0.H

.0H

、〇’式I 其中該螢光基團係直接與式I所示之部分連接，或透 過一連接結構間接與式I所示之部分連接。 於較佳實施例中，可使用各種化學合成之手段，將螢 光基團與式I所示之部分直接連接或透過一連接結構間接 連接，以提供以下例示之各種隱藏型螢光團： co2h γΛ^〇η

I

螢光基團 式II ; 螢光基團 式III ;以及 201229027

OH

γ0—螢光基團

式IV 其中R!係選自Η及CrC6之烷基。

此外，可使用之螢光基團較佳係選自於由以下所列者 所組成之群組：

，其中R2係選自Η及CN，R3

係選自

其中各R4係獨立選自Crc6之烷 基、苯曱基、CN及鹵素。 本發明之再一目的，在於提供一種製備隱藏型螢光團 之方法，包括： 201229027 提供一經保護之鄰羥基苯甲酸衍生物； 將一具有螢光基團之分子連接至該經保護之鄰羥基苯 曱酸衍生物；以及 去除鄰羥基苯甲酸部分之保護基，以獲得該隱藏型螢 光團。 於一實施例中，經保護之鄰羥基苯甲酸衍生物具有式 v所示之結構：

、 式V 其中L係一離去基。 本發明之又一目的，在於提供一種可量測鄰羥基苯甲 酸之存在量之生化分析方法，包括： 提供一含有水楊酸羥化酶、可為水楊酸羥化酶催化之 隱藏型螢光團以及NADH或NADPH之試劑； 於有氧條件下，將一待測物加入該試劑中；以及 量測該試劑之螢光，以判斷該試劑中鄰羥基苯甲酸之 存在量。 除此之外，本發明亦提供一種藉由螢光方式與複數酵 素之使用，以進行生化分析之方法，包括以下步驟： 提供一含有水楊酸羥化酶、可為水楊酸羥化酶催化之 隱藏型螢光團、NAD(P)+以及NAD(P)+依賴型去氫酶之試 201229027 於有氧條件下，將一待測物加入該試劑中；以及 量測該試劑之螢光，以判斷該試劑中一生化分子之存 在量。 於一實施例中，該NAD(P)+依賴型去氫酶係選自3-羥 基丁酸去氫酶、膽固醇去氳酶、葡萄糖去氫酶以及葡萄糖 -6-磷酸去氳酶。 本發明之另一目的，在於提供一種生化分析用套組， 包括：水楊酸羥化酶、NAD(P)+、NAD(P)+依賴型去氫酶以 及隱藏型螢光團。此外，該生化分析用套組可包含或不包 含一第三酵素，用以催化而產生該NAD(P)+依賴型去氫酶 之受質。 【實施方式】 為充分說明本發明之目的、特徵及功效，使本發明所 屬技術領域中具有通常知識者能瞭解本發明之内容並可據 以實施，茲藉由下述具體之實施例配合所附之圖式，對本 發明做一詳細說明如後。 於本發明一實施例中，係提供一種衍生自鄰羥基苯曱 酸之化合物，且其結構中具有一螢光基團與一式I所示之 201229027 於前述結構中，螢光基團可直接與式i所示之部分連 接，故其結構可為如式II所示者：

若以香豆素（coumarin)作為螢光基團之主要結構為 例’欲製備式11所示之結構，可以如下所示之程序進行化 學合成：

0^0 化合物A

1)_C〇3. Kl. DMF. 80°C.42% <^U2n 2) TFA. CH2CI2. RT. 94%

化合物C ； 程序中，化合物A係一經保護之鄰羥基苯甲酸 β u 、I 锴方式可參見 Kang,S. W.; Gothard, C. M.; Mai1 S.;職啦 A.; L s」 1486-1487，其內办尸 m' 1 用其他本領域具有通作參考。無庸置疑地，亦可 護方式，轉備-有觀^合物形下可知^ 生物。此外，於化合物A之結==基笨甲酸 :離去基’且可利用不同種類之離去基代反 素、OTS或0Ms，且不以此為限。㈣他種類之 於此程序中，化合物B係一可發出替 物，且其製備可參見一;Ting^ 9 201229027 如，2008,似U20-126，其内容係全部併入本文作參考。 無庸置疑地’於本領域具有通常知識者在無須過度實驗之情形 下’亦可使用與化合物B類似的其他香豆素衍生物與化合物 A進行反應’以製備化合物C之類似物。舉例而言，於化 合物B中，CN可藉Η代替，而 (Χ[ 或(X (X卜’且不以此為限；若欲 合成此類化合物，亦可參見 Wolfbeis, 〇· s.; Koller，E ; H(Jehmuth>

P. ^^//· C7^m_ 1985,兄，731，其内容係全部併入本文作參’ 如上所示，前述程序係以兩步驟之方式進行。於第—步驟中， 化合物Β之羥基部分係於鹼性條件下藉由化合物Α而笨甲基化 (benzylate)以產生-苯甲驗之結構（未示）。於此例中係以叫叫 作為驗’用財和反應中產生的酸，然:而亦可使用其他不影響反3 應進行之驗’如K0H。於第二步驟中，係將第—步驟產生的^ 謎中的保護基去除。於此例巾係使訂FA進行去保護，

使用其他強酴。 、 J 不會之程序，可將原來會釋放螢光之化合物_變成較 不會釋放縣之化合物作為_型 用後產生，放螢光之化合物，W生倾 =酵素作 除此之外，螢光基團亦可透過一連接結構間接盘式1 所不之部分連接，以形成如下所示之隱藏型螢光團厂 10 201229027

OH Ό 〇 螢光基團 R, 式 ΙΠ， 其中R!係選自Η及CrC6之烷基；或

OH 〇 | 。人N/\^N〇一螢光基團

1 0 式 IV

欲合成式III所示之隱藏型螢光團，則除了使用經保護 之鄰羥基苯曱酸衍生物與螢光團（fluorophore)外，尚需使用 二氯化羰(phosgene)。若以香豆素作為螢光基團之主要結構 為例，欲製備式III所示之結構，可參考如下所示者，同樣 以兩步驟之方式（即先形成苯甲醚，之後再去保護）進行 化學合成： 201229027

及 其中R2係選自Η及CN，R3係選自αν〇

、

欲合成式IV所示之隱藏型螢光團，可參見Huang, S. Τ.; Peng, Y. X.; Wang, K.L. Biosensor & Bioelectronic 2008, 23, 1793-1798中所揭露之方法，且其内容係全部併入本文作參 考。 於本發明中，隱藏型螢光團分子中的螢光基團並不特 別受限。舉例而言，於某些實施例中，螢光基團可以是香 豆素或其衍生物。於其他實施例中，螢光基團可以是香豆 素或其衍生物以外者。 於較佳實施例中，螢光基團係選自於由以下所列者所 組成之群組： 12 201229027

其中R2係選自Η及CN，R3 係選自

，其中各r4係獨立選自crc6之 烷基、笨甲基、CN及鹵素。

於較佳實施例中，螢光基團於SHL作用後可放射具有 500 nm以上波長之螢光。由於許多生化分子本身也具有榮 光特性，且其螢光波長大部分落在500 nm以下之藍光區 域，故若使用可釋放500 nm以上波長之螢光基團’將可避 免生化分析時受到其他生化分子之干擾。於一較佳實施例 中，隱藏型螢光團分子中的螢光基團所放射之螢光具有約 550-650 nm 之尖峰放射（peak emission)波長。 除此之外’欲合成隱藏型螢光團，亦可使用除1:1以 外的當量比提供起始材料之鄰羥基苯甲酸衍生物與螢光基 團。舉例而5 ’若使用若丹明類（rh〇damine)的螢光團製備 隱藏型勞光團’則必須提供螢光團兩倍當量的鄰羥基苯甲 酸衍生物，如下所示： κ 201229027

易言之，本發明所提供之隱藏型榮光圏結構中，可 只有-個_基苯甲酸部分，也可以包含兩個以 基苯甲酸部分。 &

藉由本發財施例所提供之各種_㈣光團，即可 進行各種不同生化分析。舉例而言可提供—套組 其包含SHL溶液、任—種前述之隱藏㈣光團溶液以及含 有NADH或NADPH之㈣，讀於錢環境下將-待測 樣品與前述溶液混合，此時，若待測樣品中存在鄰經基苯 曱酸 為阿斯匹靈之代謝物），則螢光量會減少，故二藉 由螢光！_之變化來判斷待測物中之鄰經基苯甲酸存在量。 此外，藉由本發明實施例所提供之各種隱藏型螢光 團’亦可進行多酵素之生化分析。舉例而言，可提供一套 、、且其，3 SHL·溶液、任一種前述之隱藏型螢光團溶液、 二AD(P)+溶液以及NAD(p)+依賴型*氯酶溶液，之後於有氧 環圭兄下將待測樣品與前述溶液混合，此時，若待測樣品 中存在該NAD(P)+依賴型去氫酶之受質，則螢光量會增 加’故可藉由勞光量之變化來判斷待測物中之鄰羥基苯甲 酸存在量。 此外’亦可提供一套組，其包含SHL溶液、任一種前 述之藏型螢光團溶液、NAD(P)+溶液、NAD(P)+依賴^f*s] 201229027 量測:二::產素:二其_三酵素可將-欲 =时氧核境下將一待剛樣品與前述溶液混合，此 t,r 中存在該生化分子，則勞光量會增加，故 可猎由螢光量之變化來_待測物中特定生化分子之存在 量。於較佳實施例中，該NAD(P)+依賴型去氣酶係選自3_

經基丁酸去氫酶、膽固醇錢酶、㈣糖去氫酶以及葡萄 糖-6-磷酸去氫酶。 ，據此，本發明-實施例係提供一種藉由榮光方式量測 鄰沒基苯甲Si存在ϊ之單酵素（即SHL)生化分析方法。本 發明一實施例係提供一種藉由螢光方式量測特定生化分子 存在量之雙酵素（即SHL及NAD(P疒依賴型去氫酶）生化 分析方法。本發明一實施例係提供一種藉由螢光方式量測 特定生化分子存在量之三酵素（即SHL、NAD(p)+依賴型 去氫酶及一第三酵素）生化分析方法。於較佳實施例中， 該nad(p)+依賴变去氮S#為葡萄糖_6_碟酸去氫酶，而該第 三酵素為己_激酶。 此外，本發明其他實施例係提供一種多酵素（即SHL、 NAD(P)+依賴蜜去氫酶及一或多種其他酵素）生化分析方 法，且其中NAD(P)+依賴塑去氫酶與其他酵素係可依欲分 析之生化分子特性，由本領域具有通常知識者在無須過度 實驗之情形下進行選擇。 實例 材料與儀器說明 201229027 4與13C NMR係以Bruker AMX-500光譜儀進行量 測；化學位移以相對於四甲基矽烷（δ單位）之ppm表示； 螢光之量測係使用螢光等級之石英比色管及Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4螢光光譜儀進行。其他化學品係購自 Acros、Aldrich、TCI 或 Sigma Chemical，且於使用前並不 特別純化。起始材料之鄰羥基苯曱酸衍生物與螢光基團係 根據 Cham，Β· E·; John，D.; Bochner，F.; Imhoff，D. M.;

Rowland, M. Clin. Chem. 1979, 25, 1420 ' Fuman, F.; Firberg, ® L. J. Pediatr. 1976, 70, 287. c) Grahm, G.; Rowland, J. J. Pharm. Sci. 1972, 61, 1219. d) Trinder, P. Biochem. J. 1954, 57，301 以及 Wolfbeis, O. S.; Koller，E.; Hochmuth, P. _gw//. CT^m. Soc.办· 1985, 731等論文製備，其係全部併入本 文作參考。SHL 係得自 GDS Technology Ine. (USA)。D-3_ 羥基丁酸去氳酶（III)係購自TOYOBO (產品編號為 HBD-301)。膽固醇去氫酶係購自Genzyme。所有量測均於 • 50 mM 之 (TRIZMA Base，Tris, PH 8)中進行。所合 成之隱藏型螢光團係於DMSO中製備，且於使用前先加至 Tris-HCl緩衝液，其中DMSO之濃度均不超過〇 1% (v/v)。 主要反應流程說明 本發明一實施例之主要反應流程係如下所示：

16 201229027

1)Na2C03lKI. DMF, 80PC, 42% 2>TFA, C^C^RT, 94% 化合物B

化合物C Ο水揚酸 羥化酶

待測物 經氧化之待測物)去氫酶

產物λ 產物Β

推論之中間體 」 隱藏型螢光團之螢光特性分析 、，於有氧環境下及SHL、NADH存在下分析化合物c之 螢光特性。當化合物C (20 μΜ)單獨於SHL·存在下、單獨於 NADH存在下或存在於ΡΗ8之Tris-HCl緩衝液下數個月， 光放射均維持於基線附近。然而，若將化合物c置於 1早位之SHL與lmM之NADH溶液中，可發現於坑下 八5物B之螢光特性於90分鐘增加57倍，如第1圖所 1虛線為基線）。將1單位之SHL與1福之NADH加 έ有化δ物C之Tris-HCl緩衝液後，於幾秒内即可偵測 到螢光，但若只有化合物C與SHL存在下，即使於10分 鐘後螢光值仍維持於基線附近。 鄰經基苯甲酸對於螢光強度之影響 若將鄰經基笨曱酸於有氧條件下加入含有SHL、化合 物C及NADH之溶液中，則化合物c之螢光轉換將受到抑 制’且螢光強度會隨著鄰經基苯甲酸之激度增加而減少， 如第2圖所不（虛線為添加前之螢光強度）。若以螢光強氧 17 201229027 對鄰羥基苯曱酸濃度進 濃度範圍内二者係呈線二x現在200至700 —之 匹靈之代謝物，且由於鄰祕苯甲酸為阿斯 高於4.3福時可能會致：^度南於2.2福時具有毒性，而 卜致〒，因此偵測鄰羥基笨甲酸在臨床 上具有其重要性。而由★ ^ 測鄰經基苯甲酸之濃度财知，化合物C係可用於偵 利用隱藏型螢光圏進行雙酵素分析一

刀另J使用3經基丁酸去氫酶與膽固醇去氮酶配合狐 進行雙酵素^，其巾前者可將3_錄了酸（與糖尿病有 關）與NAD氧化而產生乙酿乙酸醋與後者則可將 膽固醇（與〜血f疾病有關）氧化並以nadh作為電子接 受者。如第3圖及第4圖所示，於加入受質之前，化合物 C (10 μΜ)之螢光係維持於基線附近。當加入受質後則會 有顯著的螢光強度增加。若將螢光強度與受質濃度進行繪 圖，可知在3-羥基丁酸濃度為60 ηΜ至280 ηΜ之間以及 在膽固醇濃度為100 riM至800 ηΜ之間存在線性關係，故 化合物C可於ηΜ範圍下偵測3-羥基丁酸或膽固醇。 利用隱藏型螢光團進行雙酵素分析二 使用葡萄糖去氫酶配合SHL進行雙酵素分析，其結果 係如第5圖所示。由第5圖可知化合物C之螢光強度與葡 萄糖之濃度在一定範圍内呈現線性關係。 利用隱藏型螢光團進行三酵素分析 於葡萄糖-6-碳酸去氫酶、SHL與己醣激酶三種酵素存 在下，配合NAD+、葡萄糖與化合物C之使用，即可如以 [S3 201229027 =示之方式進行ATPU酵素分析’其結㈣如第6圖

將化合物 A(0.43 mmole)、化合物 B(〇 31 mm〇le)、幻 (0.042 k2C〇3 (0.37 mm〇le)於乾燥 DMp (2 此)之溶

製備經保護之隱藏型螢光團 液於室溫與氬氣下攪拌過夜。將所形成之混合物以水（5〇 mL)過濾。以CH^b (3 X 50 mL)萃取有機層，並以MgS〇4乾燥 且於真空中濃縮，之後再以快速層析法進行純化 (CH2Cl2/toluene= 1 /4) ’以獲得經保護之隱藏型螢光團（42 〇/〇, 7〇 mg)，其為橙色固體，且分析數據如下： m.p. 187-190 °C. ]ΗΝΜΚ (DMSO-d6, 500 MHZ,) δ = 1.71 (s, 6H); 5.42 (s, 2H); 7.22 (s, 1H); 7.32 (m, 3H); 7.56 (t, J= 7.5 Hz, 1H); 7.62 (t, J= 7.5 Hz, 1H); 7.91 (d,J= 8.0 Hz, 1H); 7.96 (d,J= 8.0 Hz, 1H); 8.13 (d, J = 8.1 Hz, 1H); 8.21 (d, J = 8.1Hz, 1H). MS(EI) C28Hi8N206S calc. 510.5 m/z = 510.0. FT-IR: v/cm'1 =3075, 2941, 2868, 2371, 1742, 1724, 1615, 1587, 1536, 1502, 1440, 1378, 1288, 1268, 1191, 1144, 1042, 953, 902, 867, 842, 772, 693, 672 cm'1 將經保護之隱藏型螢光團進行去保護 19 201229027 將經保護之隱藏型螢光團（0.38 mmole)與三氟乙酸 (TFA)-H20 (1.75 mL，9A，v/v)加入設有磁性攪拌棒之50 mL圓 底燒瓶中並將溶液進行擾拌12小時。將水(50 mL)加入混 合物中，並將所形成之混合物攪拌30分鐘。過濾沉澱物並 以冷水沖洗以獲得純化合物C (0.08 mg，0.17 mmol, 94%) ’其 為橙色固體，且分析數據如下： m.p. 176-178 °C. lUNMR (DMSO-d6j 500 MHZ) δ = 5.37 (s, 2H); 7.02 (d, 8.1 Hz, 1H); 7.06 (s, 1H); 7.30 (d,J= 8.1 Hz, 1H); 7.33 (s, 1H)； 7.56 (t, J = 7.5 Hz, 1H); 7.62 (t, J = 7.5 Hz, 1H); 7.81 (d, 7= 8.1 Hz, 1H); 7.93 (d, J= 8.1 Hz, 1H), 8.12 (d, J= 8.0 Hz, 1H); 8.23(d, 7= 8.1 Hz, 1H) MS (ESI) C25H14N206S m/z = 469 (M-l); MS (HESI): calc. 470.0573, m/z = 469.470. FT-IR: v/cm'^ 3447, 2924, 2852, 2224, 1724, 1672, 1619, 1536, 1507, 1452, 1433, 1379, 1312, 1288, 1255, 1208, 1187, 1142, 1041, 1015, 948 cm'1 雙酵素待測物濃度分析 於激發波長λ6χ = 500 nm與放射波長xem = 595 nm下進行螢光 1測。於25°C下，將總體積為1 mL、内含化合物c (4〇 μΜ)、SHL (0.2單位）、3_羥基丁酸去氫酶(2單位)或膽固醇去氫酶（ι單 4 ) NAD (1〇 μΜ)以及3-經基丁酸(〇至〇 5 μΜ)或膽固醇(〇至 〇.5 μΜ)之Tris_Hcl緩衝液放置3〇分鐘。將各溶液之勞光強度減去 基線(待測物魏度為·度後，對躺物質濃度進行繪圖。 本毛明在上文中已以較佳實施例揭露，然本領域具有 通常知識者應理解的是，該實_僅用於描述本發明:、而 不應解讀為限制本發明之·。應注意的是，舉凡與該t I S1 20 201229027 施例等效之變化與置換，均應視為涵蓋於本發明之範· 内口此、本發明之保護範圍當以下文之申請專利範圍所 界定者為準。 【圖式簡單說明】 f1圖說明本發明—實施例之隱藏型螢光團之榮光特 性； 第2圖說明鄰备基笨甲酸對於本發明一實施例之隱藏 型螢光團之影響； 第S說月3 |二基丁酸對於本發明一實施例之隱藏型 螢光團之影響； 第4圖說明膽固醇對於本發明-實施例之隱藏型螢光 團之影響； 第5圖說明葡萄糖對於本發明一實施例之隱藏型螢光 團之影響； 第6圖說明ATP對於本發明一實施例之隱藏型螢光團 之影響。 【主要元件符號說明】 M. 〇 *\\\ 21

Claims (1)

1. 201229027 七、申請專利範圍： 1. 一種鄰羥基苯曱酸衍生物，其結構中具有一螢光基團與一 式I所示之部分：

   其中該螢光基團係直接與式I所示之部分連接，或透 過一連接結構間接與式I所示之部分連接。 2.如申請專利範圍第1項所述之鄰羥基苯曱酸衍生物，其結 構係如以下通式中之任一者所示：

   OH 螢光基團

   式II ;

   螢光基團 式III ;以及 [S] 22 201229027

   〇 I ◦人〇一螢光基團 1 〇 式 IV 其中R!係選自Η及CrC6之烷基。 3.如申請專利範圍第2項所述之鄰羥基苯曱酸衍生物，其中 該螢光基團係選自於由以下所列者所組成之群組：

   /^^0^0，其中r2係選自Η及CN，R3 係選自α、〇及α:[;

   r4 :以及 H.C CH3^ 4 ，其中各r4係獨立選自CVQ 之炫基、笨甲基、CN及鹵素。 4. 如申請專利範圍第1項所述之鄰羥基苯甲酸衍生物，其中 該螢光基團係選自香豆素及其衍生物。 5. 如申請專利範圍第1項所述之鄰羥基苯曱酸衍生物，其可 於水楊酸羥化酶作用後釋放出一螢光團。 23 201229027 6. 如申請專利範圍第5項所述之鄰羥基苯甲酸衍生物，其中 該螢光團所放射之螢光具有500 nm以上之波長。 7. 如申請專利範圍第6項所述之鄰羥基苯甲酸衍生物，其中 該螢光團所放射之螢光具有550-650 nm之尖峰放射波長。 8. —種製備一隱藏型螢光團之方法，包括： (1) 提供一經保護之鄰羥基苯曱酸衍生物； (2) 將一具有螢光基團之分子連接至該經保護之鄰羥基苯 甲酸衍生物；以及 (3) 去除步驟(2)產物中鄰羥基苯曱酸部分之保護基，以獲 得該隱藏型螢光團。 9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中於步驟（1)中該經 保護之鄰羥基苯曱酸衍生物具有式V所示之結構：

   、 式V 其中L係一離去基。 10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中L係選自鹵素、 OTs 及 OMs。 11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該隱藏型螢光 團之結構係如以下通式中之任一者所示： 24 201229027 c〇2h .OH 螢光基團 '0' 式II ;

   〇 人 螢光基團 式III ;以及 〇 N .丫— .團 式IV 其中Ri係選自Η及CrC6之烷基。 12.如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該螢光基團係 選自於由以下所列者所組成之群組：

   ，其中R2係選自Η及CN，R3 係選自Cl、0：:[及d S] 25 201229027 ;以及 ,R4 Ό ，其中各R4係獨立選自C「c6 之烷基、苯甲基、CN及鹵素。

   13. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中於步驟(3)中係 使用強酸進行去保護。 14. 如申請專利範圍第13項所述之方法，其中該強酸為三氟 乙酸。 15. —種生化分析方法，包括： (1) 提供一試劑，包括： 水楊酸羥化酶；

   如申請專利範圍第3項所述之鄰羥基苯曱酸衍生 物；以及 NADH 或 NADPH ; (2) 於有氧條件下，將一待測物加入該試劑中；以及 (3) 量測該試劑之螢光，以判斷該試劑中鄰羥基苯甲酸之 存在量。 16. —種生化分析方法，包括： (1)提供一試劑，包括： 水楊酸羥化酶； 如申請專利範圍第1項所述之鄰羥基苯曱酸衍^ 26 201229027 物； NAD+或 NADP+ ;以及 NAD+或NADP+依賴型去氫酶； (2) 於有氧條件下，將一待測物加入該試劑中；以及 (3) 量測該試劑之螢光，以判斷該試劑中一生化分子之存 在量。 17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該生化分子為 該NAD+或NADP+依賴型去氫酶之受質。 18. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該試劑更包括 一第三酵素，用以催化該生化分子而產生該NAD+或 NADP+依賴型去氫酶之受質。 19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該第三酵素為 己_激酶。 20. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該NAD+或 NADP+依賴型去氫酶係選自3-羥基丁酸去氫酶、膽固醇 去氫酶、葡萄糖去氫酶以及葡萄糖-6-構酸去氫酶。 21. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該鄰羥基苯曱 酸衍生物之結構係如以下通式中之任一者所示：

   、〇 式II ; 27 201229027 CO,Η .OH 〇 [I 螢光基團 R, 式III ;以及 co2h .OH 〇人 Ο" N —螢光基團Y 式IV 其中係選自Η及CrC6之烷基。 22.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該螢光基團係 選自於由以下所列者所組成之群組：

   、〇，其中R2係選自Η及CN，R: 係選'α Ό：:〆 〇>; • Ν Ό ;以及

   R, 〇，其中各r4係獨立選自 28 201229027 之烷基、苯甲基、CN及鹵素。 23. —種生化分析用套組，包括： 水楊酸羥化酶； NAD+或NADP+依賴型去氫酶； NAD+或 NADP+ ;以及 如申請專利範圍第3項所述之鄰羥基苯甲酸衍生物。 24. 如申請專利範圍第23項所述之生化分析用套組，更包括 一第三酵素，用以催化而產生該NAD+或NADP+依賴型 去氳酶之受質。 29