TWI818431B

TWI818431B - 雙環壬炔衍生物及其製備方法和用途

Info

Publication number: TWI818431B
Application number: TW111104609A
Authority: TW
Inventors: 王子斌; 戴嘉言; 方柏凱; 黃芊惠
Original assignee: 高雄醫學大學
Priority date: 2022-02-08
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2023-10-11
Also published as: TW202332679A

Abstract

本發明涉及雙環壬炔衍生物及其製備方法，該雙環壬炔衍生物為通式(I)所示的化合物。本發明還涉及基於該化合物的用以確定對氧磷酶1(PON1)的內酯酶活性的化學探針、檢測套組、和檢測方法。

Description

雙環壬炔衍生物及其製備方法和用途

本發明關於雙環壬炔衍生物及其製備方法和用途，特別是關於該衍生物，在檢測對氧磷酶1(PON1)的內酯酶活性上的應用。

對氧磷酶(Paraoxonase，PON)是一種高密度脂蛋白(HDL)所運送的水解酵素，最早被發現可以代謝分解殺蟲劑巴拉松(Paraoxon)，故亦稱為「巴拉松酶」。PON目前有三種，分別是PON1、PON2與PON3，三者皆位於7號染色體上。PON1與PON3主要由肝臟及腎臟合成，會分泌到血漿中並與高密度脂蛋白(HDL)緊密結合。PON-2存在於各種組織中，是一個胞內酵素。PON1具酯解酶(esterase)與內酯酶(lactonase)活性，能水解有機磷農藥活性代謝物及內生性的脂肪酸內酯。PON2與PON3只具有內酯酶活性。

低密度脂蛋白(LDL)的過氧化，會引發動脈炎症，並最終導致動脈粥樣硬化、缺血性中風和心肌梗塞。在一些高氧壓及發炎的病理狀態下(例如粥狀動脈硬化及糖尿病)，體內PON1 活性及表現會減低，因此PON被認為是心血管的保護因子，並可作為預防心血管疾病發生的指標。目前已知這三個PON都能抑制低LDL的氧化，特別是已有明確證據顯示，PON1能保護LDL免於氧化傷害、降低泡沫細胞(foam cell)的形成，及預防粥狀動脈硬化的發展，及預防心血管疾病的發生。此外，目前臨床上用來降低高血脂症的藥物(例如HMG-CoA還原酶抑制劑、Statin類藥物等)中，已知其中有一些可誘發PON1的產生。因此，PON1活性被認為是肝臟和系統性氧化應激的臨床生物指標。特別是血清PON1活性的測量，已被提議作為評估肝功能和心血管疾病風險的檢測。

根據上述PON1活性的重要性，目前在臨床上，急切需要一種基於新型良性螢光試劑，能靈敏簡單且選擇性的檢測PON1內酯酶活性的定量方法。因此，發明人利用其之前研發利用的生物相容性和生物正交化學，來開發靈敏的螢光化學探針，能夠特異性量化人類血液樣本中的PON1內酯酶活性。

現今PON1的內酯酶活性定量，多是採用比色測定法測定。少數用於PON1活性分析的螢光方法，至少有以下缺點其中一項：使用劇毒反應物、靈敏度低、以及皆無法測量PON1內酯酶活性。生物正交合成的螢光探針正逐步發展為一種生物檢測的理想工具，其較傳統UV或可見光比色測定法具有更高的靈敏度。然而，本領域尚且沒有可用於有效偵測PON1的內酯酶活性的螢光探針。

本案申請人鑑於習知技術中的不足，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨的精神，終構思出本案「雙環壬炔衍生物及其製備方法和用途」，能夠克服先前技術的不足，以下為本案的簡要說明。

為了解決前述問題而發展出雙環壬炔衍生物、其製備方法、檢測方法和檢測套組。該雙環壬炔衍生物可作為檢測PON1的內酯酶活性的探針，此探針不但具有選擇性、高靈敏度和高準確性，且檢測方式操作簡單，故在生物醫學領域有很大的應用優勢。具體而言，本發明的化學探針，為高靈敏度和高準確性的生物正交反應“開-關”型螢光探針，它結構完整存在時，因接觸淬滅(contact quenching)效應，而有很低的螢光強度(螢光猝滅)，但是在量測目標分子(即，PON1)在生物樣品(例如血清)中的活性的生化檢測過程中，參與反應之後，因探針的結構改變，而造成螢光強度大幅增強，由此可得到目標分子在生物樣品中的活性。

本案之目的之一為提供一種製備探針的方法，該方法包含：

提供具有下式的一架橋分子：

；以及

於該架橋分子上架接，NHS酯化的一螢光基團以及NHS酯化的一淬滅子的其中之一，以得到式(I)化合物：

，其中R1為該螢光基團以及該淬滅子的其中一者。

根據某些實施例，該方法還包括以下步驟：對一螢光基團以及一淬滅子的其中一者進行NHS酯化，以及對該螢光基團以及該淬滅子的其中另一者進行疊氮化。

根據某些實施例，該方法還包括於該式(1)化合物上架接，疊氮化的該螢光基團以及疊氮化的該淬滅子的其中之一，以得到式(II)化合物：

，其中R2為該螢光基團以及該淬滅子的其中另一者。

本案的另一目的為提供一種式(III)的化合物：

其中X1和X2形成一雙鍵以及

的其中之一，R1為一螢光基團以及一淬滅子的其中一者，以及R2為該螢光基團以及該淬滅子的其中另一者。

本案之再一目的，為提供一種用於檢測對氧磷酶1(PON1)的一內酯酶活性之檢測套組，包括如上所述的探針以及對氧磷酶1(PON1)的基質。

本案之再一目的，為提供一種用以檢測生物樣品中之對氧磷酶(PON1)的內酯酶活性之方法，該方法包括以下步驟：提供包含PON1的生物樣品；以及使該生物樣品與前述探針反應，以得到反應產物，藉由偵測該反應產物所釋放之螢光訊號，以得出該內酯酶活性。

本發明的上述目的及優點，在參閱以下詳細說明及附隨圖式之後，對那些所屬技術領域中具有通常知識者，將更顯而易見。

圖1示出，當與硫醇反應時，化學探針16a和16b的螢光性質，以及接觸淬滅效應。圖1A示出5(6)-FAM、羅丹明B和化學探針16的紫外-可見光(UV-Vis)光譜。圖1B示出化合物16a與L-半胱胺酸反應的時間與螢光強度變化圖。圖1C示出化合物16b與L-半胱胺酸反應的時間與螢光強度變化圖。

圖2示出，化合物16b的螢光產生需要有PON1的基質5-(丁硫基)丁內酯(TBBL)和PON1的參與。

圖3示出，PON1-TBBL-探針16b反應隨反應時間增加的螢光變化曲線。

圖4示出，以探針16b檢測不同活性的PON1催化與相對應初始速度v _i值關係的檢量線。

圖5示出，3個健康男性血清樣品內的PON1內酯酶活性。

圖6示出，以探針16b檢測PON1內酯酶活性的原理概念示意圖。

本案所提出的發明，將可由以下的實施例說明而得到充分瞭解，使得所屬技術領域中，具有通常知識者可以據以完成；然而本案的實施，並非可由下列實施例，而被限制其實施型態，所屬技術領域中具有通常知識者，仍可依據除既揭露的實施例的精神推演出其他實施例，該等實施例，皆當屬於本發明的範圍。

除非在特定範例中另外限制或說明，下列定義適用於整份說明書中所使用的用語。

本文所使用之用語「包含」或「包括」，意謂著除了所描述的組成、步驟、及/或元素以外，不排除存在一或多個其他組成、步驟、及/或元素。

本文所使用之用語「大約或約」，意指具有接近或可允許的誤差範圍，用於避免本發明局限於所揭示之準確或絕對的數值。本文所使用之用語「一」意指該冠詞之語法對象為一或一個以上。

本文所使用之用語「立體異構物」，是指具有相同原子連接順序，但原子在空間上排列不相同的同分異構物，包括順反異構物(幾何異構物)、對映異構物和構象異構物。

本文所使用之用語「幾何異構物」，亦稱為「順反異構物」，是指由分子中由於存在雙鍵或環，而致使原子在空間上排列方式不同所產生的兩個物理性質或化學性質均不相同的同分異構物，可分別稱為順式(cis)和反式(trans)異構物。

本文所使用之用語「螢光基團」，是指可產生螢光的分子。特定的螢光基團，可被一或多種特定波長的光、或一範圍的最大波長所激發，此即為激發波長。在螢光基團被激發後，其回到基態，並以比激發波長更長的波長發射，此即為發射波長。

本文所使用之用語「淬滅子」，是指對螢光基團的螢光進行淬滅的分子，其可具有與螢光基團的發射光譜相符或重疊的吸收光譜。「螢光淬滅」可藉由螢光基團和淬滅子間的直接接觸(亦稱為接觸淬滅)、或當螢光基團和淬滅子二者彼此在佛斯特半徑(Förster radius)內時，藉由螢光基團和淬滅子間的螢光共振能量轉移(FRET)而發生。在FRET或接觸淬滅期間，淬滅子吸收了激發螢光基團所發射的光，藉此淬滅或降低螢光基團所發射的螢光。當螢光基團和淬滅子在螢光基團基態時形成三元複合物時，則產生接觸或靜態淬滅。此三元複合物為非螢光的，亦即基本上不可激發的，且因此在預期的發射波長下，不會發射光。「淬滅子」包含「螢光淬滅子」以及「暗淬滅子」。螢光淬滅子是指可產生螢光的分子，其可為與前述「螢光基團」相同或不同的基團。暗淬滅子是指無法發出螢光的分子，亦稱為非螢光淬滅子。

本文所使用之用語「生物樣品」是指人或動物的血液、血漿或血清。

本文中化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)及/或高解析質譜(HRMS)來確定的。

架橋分子(化合物exo-6)的合成

方案S1：

參考習知的方法(Dommerholt,J.,Schmidt,S,,Temrning,R.,Hendriks,L.J.A.,Rutjes,F.P.J.T.,van Hest,J.C.M.,Lefeber,D.J.,Friedl,P.,van Delft,F.L.,2010.Angew.Chem.,Int.Ed.49,9422-9425；Gong,M.-M.,C.-Y.Dai,S.Severance,C.-C.Hwang,B.-K.Fang,H.-B.Lin,C.-H.Huang,C.-W.Ong,J.-J.Wang,P.-L.Lee and T.-P.Wang*.2020.Catalysts,10(10),1169.)根據方案S1，從化合物1依序合成化合物2(exo/endo-2)至化合物6(exo/endo-6)。前述化合物exo-6，是一種含二硫化物的雙環壬炔(bicyclononyne，BCN)衍生物，其能夠進行重要的生物正交和生物相容性無銅疊氮-炔基環加成反應(SPAAC)，是以提供了適於製備探針的分子平台，故在本發明中，被採用作為探針的架橋分子。透過在此架橋分子的兩端上，架接各種螢光基團及/或淬滅子，可衍生開發出多種螢光探針。

請參考方案S2，其示出使用本發明的架橋分子製備探針，的示意流程圖。

方案S2：

首先，提供架橋分子(即化合物exo-6)，例如使用上述方案S1的方式製備架橋分子。接著，於該架橋分子上架接NHS 酯化的螢光基團，或NHS酯化的淬滅子，以獲得式(I)化合物，式(I)化合物中R1為螢光基團以及淬滅子的其中一者。在架接步驟前，先對欲進行架接的螢光基團或淬滅子進行修飾，亦即先將螢光基團或淬滅子進行NHS酯化，以在螢光基團或淬滅子中併入NHS酯基團。

接著，於該式(I)化合物上，架接疊氮化的螢光基團或是疊氮化的淬滅子(R2-N₃)，以得到式(II)化合物，式(II)化合物中R2為該螢光基團以及該淬滅子的其中另一者。在架接步驟前，可先對螢光基團或淬滅子進行修飾，亦即先將螢光基團或淬滅子進行疊氮化，以在螢光基團或淬滅子中併入疊氮基團。

在式(II)化合物中，淬滅子可為螢光淬滅子或暗淬滅子，例如淬滅子可為與前述螢光基團相同或不同的另一螢光基團、染劑、鑭系元素分子或其類似物。在式(II)化合物中，R1以及R2組成螢光基團-淬滅子對，因淬滅子十分貼近螢光基團，若螢光基團被激發，則此淬滅子吸收此發射光並防止此光被偵測到(藉由FRET淬滅或接觸淬滅)。因此，式(II)化合物為基本上非螢光的，亦即基本上不可激發的，且因此在預期的發射波長下不會發射光或具有大幅減弱的發射光。

在式(II)化合物中，組成螢光基團-淬滅子對的R1以及R2的至少其中之一會發出螢光。換言之，式(II)化合物可包含以下化合物：(1)R1為螢光基團且R2為淬滅子(螢光淬滅子或暗淬滅子)；以及(2)R1為淬滅子(螢光淬滅子或暗淬滅子)且R2為螢光基團。

目前已知的或之後所發現的任何螢光基團-淬滅子對，皆可用於本發明。在某些實施例中，該螢光基團具有495nm至680nm之激發波長，及515nm至710nm之發射波長。在某些實施例中，該螢光基團分別具有495nm、538nm或646nm之激發波長，及525nm、554nm或669nm之發射波長。在某些實施例中，該淬滅子為具有430nm至672nm吸收波峰之染劑。在某些實施例中，該螢光基團以及該螢光淬滅子可選自包含5-羧基螢光素(5-FAM)、6-羧基螢光素(6-FAM)、羅丹明B(rhodamine B)、HEX、VIC、TET、NED、CY3、CY5、ALEXA594、ALEXA643、TAMRA及VIC群組。在某些實施例中，該暗淬滅子選自包含Dabcyl、BHQ(BHQ-1、DHQ-2或DHQ-3)及NFQ的群組。在一實施例中，此螢光基團具有495nm之激發波長及525nm之發射波長，例如5-FAM或6-FAM，且該淬滅子為羅丹明B。

根據方案1和2所示的方法，可以製備出具有式(III)的化合物：

其中X1和X2形成雙鍵以及

式(III)化合物，包含式(I)化合物(當X1和X2 形成雙鍵)以及式(II)化合物(當X1和X2形成

)。此外，式(III)化合物中R1和R2的定義與式(I)化合物或式(II)化合物中R1和R2的定義相同。換言之，式(III)化合物，包含本發明的探針，以及製成探針之前的中間產物。

下文以FAM-羅丹明B，作為式(II)化合物中的螢光基團-淬滅子對，示例詳細說明，但本發明並不以此為限。作為示例，羅丹明B架接在式(II)化合物中的R2位置，而FAM架接在式(II)化合物中的R1位置，故在架接前，先進行羅丹明B的疊氮化步驟，以及FAM的NHS酯化步驟。同理類推，若將羅丹明B架接在式(II)化合物中的R1位置，而FAM架接在式(II)化合物中的R2位置，則在架接前，須先進行羅丹明B的NHS酯化步驟，以及FAM的疊氮化步驟。

疊氮羅丹明B(azido-rhodamine B)(化合物9)的合成

方案S3：

羅丹明B的疊氮衍生物(化合物9)，是由羅丹明B與化合物8的醯胺化反應合成。將149.2mg(1當量，0.337毫莫耳)的羅丹明B溶於4ml CH₃CN及1ml CH₃Cl中，加入372.6mg(2.5當量，0.842毫莫耳)BOP試劑、101.9mg(3當量，1.011毫莫耳)3-疊氮基丙胺、以及600μl N,N-二異丙基乙基胺(DIPEA)，反應過夜後，以二氯甲烷/甲醇溶液(DCM：甲醇=40：1)，進行管柱層析純化，即獲得108.6mg(0.207毫莫耳)的疊氮羅丹明B(化合物9)。產率：61.4%。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：7.93-7.88(m,1H),7.46-7.42(m,2H),7.11-7.07(m,1H),6.44-6.39(m,4H),6.29-6.26(m,2H),3.33(quint,8H),3.17(t,2H),3.06(t,2H),1.43(quint,2H),1.17(t,12H)。¹³C NMR(100.67MHz,CDCl₃)δ：168.1,153.3,148.8,132.4,131.2,128.7,128.0,123.8,122.7,108.1,105.5,97.7,64.9,49.3,44.3,37.5,27.7,12.5。HRMS(ESI)計算為C₃₁H₃₇N₆O₂，[M+H]⁺ 525.29725(計算值)、525.29749(發現值)。

NHS酯化的5(6)-FAM(化合物14a和14b)的合成

方案S4：

化合物11、12a和12b的合成

根據上述方案S4，利用本領域已知的方法(參考Horatscheck et.al.,2012.Angew.Chem.,Int.Ed.51,9441-9447.)從5(6)-羧基螢光素[5(6)-FAM，化合物10]合成3',6'-雙(異丁醯氧基)-5(6)-羧基螢光素(化合物11)，將化合物11分離以得到3',6'-雙(異丁醯氧基)-5-羧基螢光素(化合物12a)和3',6'-雙(異丁醯氧基)-6-羧基螢光素(化合物12b)。

化合物13a的合成

將228.3mg(1當量，0.441毫莫耳)的化合物12a溶於5ml之TFA，加熱迴流4小時，減壓濃縮後以乙醚再沉澱。移除上清液，以MeOH回收沉澱產物，減壓濃縮後，即獲得159.2mg(0.422毫莫耳)的5-FAM(即化合物13a)。產率：95%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：8.41(s,1H),8.30(d,1H),7.39(d,1H),6.70(s,2H),6.62(d,2H),6.55(d,2H)。¹³C NMR(100.67MHz,C₂D₆OS)δ：167.9,166.1,159.7,156.1,151.9,136.2,132.9,129.3,126.9,125.6,124.6,112.8,109.0,102.4,83.7。HRMS(ESI)計算為C₂₅H₁₃O₇，[M+H]⁺ 377.06558(計算值)、377.06560(發現值)。

化合物13b的合成

將184mg(1當量，0.356毫莫耳)的化合物12b溶於5ml之TFA，加熱迴流4小時，減壓濃縮後以乙醚/已烷溶液(乙醚：已烷=2：3)再沉澱。移除上清液，以MeOH回收沉澱產物，減壓濃縮後，即獲得108mg(0.286毫莫耳)的6-FAM(即化合物13b)。產率：80%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：10.18(brs,1H),8.22(d,1H),8.11(d,1H),7.66(s,1H),6.70(s,2H),6.61(d,2H),6.55(d,2H)。¹³C NMR(100.67MHz,C₂D₆OS)δ：167.9,166.0,159.6,156.1,152.7,151.8,137.3,136.1,130.9,125.5,129.2,126.8,125.2,124.6,124.4,112.7,108.9,102.3。HRMS(ESI)計算為C₂₅H₁₃O₇，[M+H]⁺377.06558(計算值)、377.06562(發現值)。

化合物14a的合成

將176mg(1當量，0.467毫莫耳)的化合物13a加人2ml的二甲基甲醯胺(DMF)中，加人134mg(2.5當量，1.164毫莫耳)的NHS以及134mg(1.5當量，0.699毫莫耳)的EDC，於氮氣下反應隔夜(16小時)。其後，加人1ml的DMF、5.5ml的丙酮及10ml的0.05M的NaH₂PO₄水溶液，以18ml之EA/乙醚溶液(EA：乙醚為1：2)萃取3次，收集有機層，再以20ml之ddH₂O萃取3次。其後，以20ml之飽和食鹽水萃取一次後，經無水硫酸鎂乾燥、過濾、減壓濃縮，即獲得189mg(0.399毫莫耳)的NHS酯化的5-FAM(5-FAM-NHS酯，即化合物14a)。產率：85%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：10.19(brs,2H),8.55(s,1H),8.43(d,1H),7.56(d,1H),6.72-6.69(m,4H),6.61-6.54(m,2H),2.93(s,4H)。¹³C NMR(100.67MHz,C₂D₆OS)δ：206.4,170.1,167.1,162.3,160.8,159.8,158.1,151.9,136.5,129.5,127.6,126.7,126.4,125.7,112.7,108.5,102.3,83.8,35.8,30.6,25.6,18.5。HRMS(ESI)計算為C₂₅H₁₆NO₉，[M+H]⁺ 474.08196(計算值)、474.08166(發現值)。

化合物14b的合成

將100mg(1當量，0.265毫莫耳)的化合物13b加人2ml的DMF中，加人76mg(2.5當量，0.66毫莫耳)的NHS以及76mg(1.5當量，0.396毫莫耳)的EDC，於氮氣下反應隔夜(16小時)。其後，加人1ml的DMF、5.5ml的丙酮及10ml的0.05M的NaH₂PO₄水溶液，以18ml之EA/乙醚溶液(EA：乙醚為1：2)萃取3次，收集有機層，再以20ml之ddH₂O萃取3次。其後，以20ml之飽和食鹽水萃取一次後，經無水硫酸鎂乾燥、過濾、減壓濃縮，即獲得97.4mg(0.205毫莫耳)的NHS酯化的6-FAM(6-FAM-NHS酯，即化合物14b)。產率：77.4%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：10.25(brs,2H),8.40-8.38(m,1H),8.27-8.25(m,1H),7.94-7.93(m,1H),6.73-6.66(m,4H),6.59-6.56(m,2H),2.88(s,4H)。¹³C NMR (100.67MHz,C₂D₆OS)δ：206.5,172.8,170.1,170.0,167.7,167.3,167.2,162.3,160.9,159.9,152.7,152.0,151.9,131.8,131.6,130.9,129.4,126.4,125.5,112.8,108.7,102.4,35.8,30.8,30.7,25.6,25.2。HRMS(ESI)計算為C₂₅H₁₆NO₉，[M+H]⁺ 474.08196(計算值)、474.08178(發現值)。

發明人開發出一種有效的方法(方案S4)來有效地從5(6)-FAM(化合物10)混合物中分離和純化出5-FAM(化合物13a)及其幾何異構物6-FAM(化合物13b)，並NHS酯化每種幾何異構物(純FAM)為相應的FAM-NHS酯(化合物14a和化合物14b)。獲得幾何異構物純FAM和FAM衍生物，對於能更好地控制探針的螢光特性，和開發更靈敏的螢光檢測法來量化PON1內酯酶活性，至關重要，這將在下文詳細描述。

包含羅丹明B-FAM對的探針(化合物16a和16b)的合成

方案S5：

化合物15a的合成

將31.9mg(1當量，0.0971毫莫耳)的架橋分子(exo-BCN-5，即化合物6)溶於2ml之DMF，加人55.2mg(1.2當量，0.117毫莫耳)的5-FAM-NHS(化合物14a)以及102μl(6當量，0.583毫莫耳)的DIPEA，於氮氣下隔夜反應，減壓濃縮，以DCM/MeOH/AcOH溶液(DCM：MeOH：AcOH為75：25：1)進行管柱層析純化，即獲得53.4mg(0.078毫莫耳)的5-FAM-exo-BCN-5(化合物15a)。產率80.2%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：8.45(s,1H),8.23(d,1H),7.37(d,1H),6.68(d,2H),6.56(q,4H),3.85(d,2H),3.61(q,2H),3.28(q,2H),2.95(t,2H),2.81(t,2H),2.29-2.02(m,7H),1.33-1.21(m,3H),0.67-0.60(m, 3H)。¹³C NMR(100.67MHz,C₂D₆OS)δ：172.4,168.3,164.9,162.5,160.0,156.5,154.5,152.0,136.1,134.6,129.2,126.9,124.5,123.5,113.0,109.2,102.4,99.0,68.0,54.9,37.7,37.1,35.9,32.9,30.9,23.4,22.3,21.4,20.9。HRMS(ESI)計算為C₃₆H₃₃N₂O₈S₂，[M-H]^- 685.16838(計算值)、685.16824(發現值)。

化合物15b的合成

將40.6mg(1當量，0.124毫莫耳)的架橋分子(exo-BCN-5，即化合物6)溶於2ml之DMF，加人70.2mg(1.2當量，0.148毫莫耳)的6-FAM-NHS(化合物14b)以及129.5μl(6當量，0.742毫莫耳)的DIPEA，於氮氣下隔夜反應，減壓濃縮，以DCM/MeOH/AcOH溶液(DCM：MeOH：AcOH為75：25：1)進行管柱層析純化，即獲得52.2mg(0.761毫莫耳)的6-FAM-exo-BCN-5(化合物15b)。產率61.6%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：8.17(d,1H),8.08(d,1H),7.67(s,1H),6.70(d,2H),6.58(q,4H),3.83(d,2H),3.49(q,2H),3.22(q,2H),2,74(t,2H),2.29-2.03(m,7H),1.29-1.22(m,3H),0.67-0.58(m,3H)。¹³C NMR(100.67MHz,C₂D₆OS)δ：168.0,164.6,162.3,159.8,156.4,152.5,151.9,140.4,129.3,128.5,125.0,122.3,112.8,109.2,102.3,98.9,67.8,55.8,38.9,37.5,36.7,35.8,32.8,30.8,29.6,23.4,22.2,20.8。HRMS(ESI)計算為C₃₆H₃₃N₂O₈S₂，[M-H]^- 685.16838(計算值)、685.16818(發現值)。

化合物16a的合成

將47.7mg(1當量，0.070毫莫耳)的 5-FAM-exo-BCN-5(化合物15a)及37mg(1當量，0.070毫莫耳)的疊氮羅丹明B(化合物9)溶於2ml之1,4-二噁烷，加熱迴流反應5小時。反應混合物經減壓濃縮，以EA/已烷/AcOH溶液(EA：已烷：AcOH為100：10：1)，進行管柱層析純化，即獲得80.5mg(0.066毫莫耳)的5-FAM-羅丹明B-exo-BCN-5(化合物16a)。產率95%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：9.01(t,1H),8.50(s,1H),8.12(d,1H),7.78-7.63(m,1H),7.49-7.48(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.00-6.99(m,1H),6.64-6.43(m,6H),6.35-6.29(m,6H),4.02(t,2H),3.59(t,2H),3.31-3.28(m,12H),2.98-2.96(m,4H),2.86-2.72(m,6H),2.60-2.55(m,4H),2.35-2.11(m,7H),1.80-1.73(m,10H),1.50(quint,2H),1.21-1.11(m,3H),1.07(t,12H),0.76-0.67(m,3H)。¹³C NMR(100.67MHz,C₂D₆OS)δ：174.4,168.5,167.0,165.4,162.4,156.4,153.9,153.4,152.7,148.4,143.9,139.2,135.4,132.8,130.4,129.5,128.3,124.9,123.6,122.3,116.5,109.8,108.2,104.8,102.5,97.2,67.4,67.0,65.7,64.1,45.5,43.7,37.6,37.2,37.1,35.8,34.4,30.8,30.4,28.5,126.9,26.1,25.2,23.8,23.0,22.1,21.6,12.4。HRMS(ESI)計算為C₆₇H₇₁N₈O₁₀S₂，[M-H]^- 1211.47291(計算值)、1211.47273(發現值)。

化合物16b的合成

將40mg(1當量，0.583毫莫耳)的6-FAM-exo-BCN-5(化合物15b)及30.6mg(1當量，0.0583毫莫耳)的疊氮羅丹明B(化合物9)溶於2ml之1,4-二噁烷，加熱迴流反應5小時。反應混合物經減壓濃縮，以EA/已烷/AcOH溶液(EA：已烷：AcOH為100：10：1)，進行管柱層析純化，即獲得63.1mg(0.0521毫莫耳)的 6-FAM-羅丹明B-exo-BCN-5(化合物16b)。產率89.4%。¹H NMR(400MHz,C₂D₆OS)δ：8.85(t,1H),8.10-8.02(m,2H),7.78-7.76(m,1H),7.61(s,1H),7.51-7.46(m,2H),7.29(t,1H),7.01-6.99(m,1H),6.61(d,2H),6.34-6.24(m,10H),4.01(t,2H),3.54-3.51(m,2H),3.33-3.23(m,12H),2.96(m,3H),2.88(t,4H),2.77(t,2H),2.62-2.55(m,H),2.33-1.99(m,7H),1.49(quint,2H),1.27-1.12(m,3H),1.09-1.02(m,12H),0.78-0.66(m,4H)。¹³C NMR(100.67MHz,C₂D₆OS)δ：175.8,175.6,169.0,167.0,165.3,156.4,153.4,152.7,148.4,143.9,132.8,130.4,130.1,128.3,123.6,122.3,120.8,110.3,108.2,104.8,102.7,97.2,78.7,69.2,64.1,45.4,43.7,38.5,37.5,37.2,36.9,33.7,33.4,29.0,28.7,27.6,26.8,26.1,25.2,23.8,23.0,22.1,21.6,21.3,20.8,19.0,18.9,18.7,17.7,12.4。HRMS(ESI)計算為C₆₇H₆₉N₈O₁₀S₂，[M-H]^- 1209.45836(計算值)、1209.45827(發現值)。

透過方案S4和S5，本發明經由具有生物正交性的SPAAC反應，合成含有雙硫鍵之新穎接觸淬滅化學探針(化合物16a和16b)。用於合成BChE化學探針的一鍋反應(Gong,M.-M.,C.-Y.Dai,S.Severance,C.-C.Hwang,B.-K.Fang,H.-B.Lin,C.-H.Huang,C.-W.Ong,J.-J.Wang,P.-L.Lee and T.-P.Wang*.2020.Catalysts,10(10),1169)，僅能提供低於50%的低產率。本發明方案S5中，化合物16a和16b的合成採用了完全與BChE化學探針合成不同的方法；亦即，以雙反應策略取代一鍋反應，以大幅提高化學探針合成的產率。前述雙反應策略，是藉由更優化的醯胺化反應，將化合物6與化合物14a/14b耦接，以得到化合物15a/15b，然後將化合物15a/15b與化合物9進行高產率SPAAC反應，以得到目標化學探針(化合物16a/16b)，故以本發明的探針製備方法製備探針，可克服低反應產率問題。

此外，化合物16a和化合物16b之間的產率差異，說明化合物14b和化合物15b中有較嚴重的空間位阻和分子擁擠，其顯然降低了分子中6-羧酸酯和6-羧基NHS酯基團的反應性，從而影響了化合物15b的產率(61.6%)和化合物16b的產率(89.4%)。然而，雖然6-FAM的幾何限制，會降低化合物16b的合成產率，但卻賦予化合物16b獨特的螢光特性，其可用於開發PON1內酯酶活性的靈敏檢測方式，這將在下文詳細描述。

除了化合物16a和16b以外，參考上述方案S3至S5，可選取相應的原料、螢光基團及/或淬滅子，而製備得到架接在化合物6上的其他探針。以下僅以化合物16a和16b作為探針(因此於下文，亦稱之為探針16a和探針16b)的示例，以驗證其具有檢測PON1內酯酶活性的能力，然本發明並不僅限於此示例。

測試例1：化學探針16a和16b的螢光性質

圖1示出，當與硫醇反應時的探針16a和16b的螢光性質以及接觸淬滅(conatct quenching)效應。圖1A示出在磷酸鹽緩衝液(PB；10% DMF，pH 7.4)中50μM的5(6)-FAM(藍色曲線)、羅丹明B(紅色曲線)和化學探針16(16a是淺綠色曲線；16b是紫色曲線)的紫外-可見光(UV-Vis)光譜。由UV-Vis光譜中羅丹明B(λ_max，~550nm)吸收帶的完全消失和FAM(λ_max，~550nm)吸收帶的顯著降低可知，探針16中的FAM螢光猝滅與接觸淬滅效應相關聯，這是由於螢光基團與淬滅子相靠近，而導致非螢光分子內異二聚體的形成所致。化合物16a(1μM)與L-半胱胺酸(50mM)在磷酸鹽緩衝液(PB；10% DMF，pH 7.4)中反應，圖1B示出，探針16a中5-FAM螢光的強度，隨時間延長而增加的螢光光譜。圖1C示出，探針16b中6-FAM螢光的強度，隨時間進展而增加的螢光光譜。化合物16b中FAM螢光的contact淬滅，在15-30分鐘內迅速完全消失，表明化合物16b，迅速與含硫醇的L-半胱胺酸反應。由圖1B及1C可知，化合物16b可提供優於化合物16a的螢光特性，故化合物16b無疑是較靈敏且反應性更好的化學探針。另一方面，羅丹明B-FAM對具有執行FRET並淬滅探針16中FAM螢光的潛力。然而，FRET猝滅可能只是在探針16中觀察到的FAM螢光猝滅的次要因素(圖6)。

測試例2：探針16b與硫醇類化合物的專一性測試

利用裸視觀測探針16b與12個不同試劑個別在樣品瓶中產生螢光的結果。配置反應溶液，其中包含對照組(樣品序號1)及實驗組(樣品序號2~12)。總體積3ml的對照組中包含Tris緩衝液(50mM Tris、1mM Ca²⁺，pH 8.0)、探針(最終濃度25μM)；總體積3ml的實驗組中包含Tris緩衝液(50mM Tris、1mM Ca²⁺，pH 8.0)、探針16b(最終濃度28μM)、反應物[依照樣品序號2~12分別為L-谷胺酸、甘胺酸、L-甲硫胺酸、L-離胺酸、L-絲胺酸、麩胱甘肽、L-半胱胺酸(樣品序號8)、2-巰基乙醇、2-氨基乙硫醇(2-AET)、DTT、丁硫醇(nBuSH)，最終濃度50mM]。12個反應溶液置於玻璃樣品瓶中，室溫下避光反應90分鐘，以365nm之UV燈照射瓶身並以肉眼觀察結果，結果如下表所示。

發明人測試多種含有或不含硫醇基團的化合物，其中包括麩胱甘肽、L-半胱胺酸、2-巰基乙醇、2-氨基乙硫醇、DTT、nBuSH(1-丁硫醇，其為TBBL的PON1水解產物之一)等，其中多種含有硫醇的反應物，都能夠迅速與化合物16b反應，並增加FAM的螢光強度。由前述可知，化合物16b可作為螢光檢測的探針，而硫醇基團可作為開啟探針16b的螢光開關，當目標檢測物含有硫醇基團時，可利用探針16b專一性地檢測目標物的活性。

測試例3：開發利用化合物16b的螢光開啟檢測方法(fluorescence turn-on assay)用於測量PON1內酯酶活性

測試例3是為了要證明，分析探針16b能更準確地定量TBBL及PON1反應所產生的螢光，達成定量PON1內酯酶活性的目標。配置4個反應溶液，包含對照組及實驗組。總體積1.5ml的對照組中包含Tris緩衝液(起始濃度100mM Tris、1mM Ca²⁺，pH 8.0，加人體積750μl)、探針16b(溶於DMSO，起始濃度500μM，加人體積7.5μl，最終濃度2.5μM)、742.5μl ddH₂O。總體積1.5ml的實驗組：Tris緩衝液(起始濃度100mM Tris、1mM Ca²⁺，pH 5.0，加人體積750μl)、探針16b(溶於DMSO，起始濃度500μM，加人體積7.5μl，最終濃度2.5μM)。實驗組中額外加入總體積1.5ml的(1)TBBL(溶於乙腈，起始濃度0.5M，加人體積3μl，最終濃度0.001M)、739.5μl ddH₂O；(2)75μl的PON1(最終濃度109.5nM)、668.5μl ddH₂O；或(3)與前述相同濃度之TBBL及PON1、 665.5μl ddH₂O。反應溶液於室溫下避光反應30分鐘，之後個別加人石英螢光比色管內，並將比色管放進螢光光譜儀(LS-55)內，立即測定螢光發射。藉由儀器配置FL WinLab軟體的掃描模式，設定激發波長為325nm，發射波長為525nm，起始波長為390nm，終止波長為590nm，掃描速度為100nm/min；量測過程中，皆維持恆溫25℃。儀器偵測完畢後，取出樣品，並將個別扣除背景值的FL₅₀₅數據。每個反應分析3次以獲得平均螢光值和標準偏差(誤差線)，最後結果如圖2所示。

圖2的結果證明，僅有在探針16b、TBBL和PON1同時存在下，藉由催化反應產生的產物nBuSH與探針16b反應，可釋放6-FAM螢光，且PON1-TBBL-探針16b催化系統的定量分析，也證明了使用探針16b可準確檢測PON1內酯酶活性。換言之，探針16b在接觸淬滅狀態，淬滅子吸收了激發螢光基團所發射的光，藉此淬滅或降低螢光基團發出的螢光，此時探針16b的螢光呈現「關閉」狀態。但是當探針16b與TBBL和PON1的反應產物nBuSH進行反應後，因探針16b的結構改變導致接觸淬滅效應消除，此時探針16b的螢光呈現「開啟」狀態，即探針16b的螢光基團，可發出顯著提昇的螢光強度，其可用於得知PON1內酯酶的活性。

測試例4：PON1-TBBL-探針16b反應的時間與相對應螢光變化曲線

將探針16b(最終減度為0.8μM)、PON1(最終活性為232.1U/L)與TBBL(最終濃度為1mM)混合於Tris緩衝液，獲得反應總體積為1.5mL，並且加入石英螢光比色管內，之後放進螢光光譜儀內(LS-55)，最後結果以儀器配置的FL WinLab軟體的 Time Drive模式檢測，偵測總時間為90分鐘以確保反應完全。量測過程中，皆維持恆溫25℃。待檢測完成後，將檢測結果轉成Excel檔，進而確定酵素催化的起始速度vi。如圖3所示，PON1-TBBL-探針16b反應的時間與相對應螢光變化曲線，展示了酵素動力學的經典Michaelis-Menten模型，其有助於隨後根據初始速度v _i，決定PON1內酯酶活性。因此，探針16b具有對PON1內酯酶活性進行靈敏和特異性定量所必需的關鍵特性。

測試例5：透過探針16b的螢光產生來建立定量PON1內酯酶活性的方法

rePON1標準品是得自大腸桿菌，且已知其具有與人類PON1相似的催化活性。在石英比色管內加入探針16b(溶於DMSO，起始濃度50μM，加人體積24μl，最終濃度800nM)、Tris緩衝液(起始濃度100mM Tris、1mM Ca²⁺，pH 8.0，加人體積750μl)、TBBL(溶於乙腈，起始濃度1M，加人體積15μl，最終濃度0.01M)、636-696μl ddH₂O以及75-15μl rePON1(最終活性8.6、15.6、25.9、92.8、154.7、232.1U/L)，總體積1.5ml。將石英比色管放人螢光光譜儀(LS-55)內，以Time drive模式，在25℃下，以激發波長325nm、發射波長525nm及分析時間為30min，使螢光強度最終達飽和，重複3次，獲得個別催化反應的起始速度v _i，並建立v _i對PON1內酯酶活性之檢量線，結果如圖4所示。在具有不同活性的rePON1標準品存在下，針對探針16b隨時間增加的螢光變化，開啟進行酵素動力學分析，以獲得相應的v _i值。PON1內酯酶活性與v _i的線性回歸分析表明，以探針16b為基礎的檢測方法，提供線性校正曲線，其斜率為0.033，良好的線性檢測範圍，為 10.8-232.1U/L(圖4)。由前述可知，本發明螢光探針的PON1內酯酶線性活性偵測範圍，為10.8-232.1U/L，此外，該探針用於檢測PON1內酯酶活性的最低檢測極限(LOD)為10.8U/L。

測試例6：檢測最三個血清樣品中PON1之內酯酶活性

三個血清樣品來自三位健康男性。圖4中的校準曲線用於決定，來自三名健康男性的血清樣品中，的PON1內酯酶活性。在石英比色管內加入探針16b(溶於DMSO，起始濃度50μM，加人體積24μl，最終濃度800nM)、Tris緩衝液(起始濃度100mM Tris、1mM Ca²⁺，pH 8.0，加人體積750μl)、696μl ddH₂O、以及15μl健康男性血清(最終稀釋100倍)，在25℃下，靜置30分鐘待血清中GSH與探針16b完全反應後，最後加人TBBL(溶於乙腈，起始濃度1M，加人體積15μl，最終濃度0.01M)，總體積1.5ml。將石英比色管放人螢光光譜儀(LS-55)內，以Time drive模式，在25℃下，以激發波長325nm、發射波長525nm、及分析時間為30min，使最終螢光強度達飽和，該實驗重複3次，獲得3個血清樣品中PON1催化反應的起始速度v _i，帶入圖4中v _i對PON1活性之檢量線，以獲得血清樣品中PON1之活性。此處生物樣品為血清樣品，然本領域技術人員可知，亦可取代為其他生物樣品。

探針16b的檢測，成功地量化了血清樣品中PON1的內酯酶活性，如圖5所示，3個血清樣品被檢測出17,804-19,469U/L範圍內PON1的內酯酶活性。習知用於檢測PON1內酯酶活性的Ellman測定法，其靈敏度較低，故舊方法檢測出來的PON1內酯酶活性數值，僅有本發明方法所測出數值的五分之一左右，這表明本發明的探針16b的螢光檢測，比傳統方式更靈敏、準確地確定血清樣品中PON1的內酯酶活性。

請參考圖6，其示出以探針16b檢測PON1內酯酶活性，的原理概念示意圖。圖中「a」代表以下反應條件：基質TBBL、Tris、Ca²⁺，pH 8.0；圖中R¹和R²代表H或nBuSH的硫醇鹽。當此獨特檢測探針16b尚未進行任何反應時，淬滅子仍極為貼近螢光基團，若螢光基團被激發，則此淬滅子吸收此發射光，並防止此光被偵測到(藉由FRET或接觸淬滅)。當探針16b加入反應時(亦即當此探針與樣品接觸時)，nBuSH的硫醇鹽，是PON1催化反應的產物之一，硫醇鹽親核攻擊探針16b中的二硫鍵，使螢光基團和淬滅子在空間上分開，藉以消除探針16b中螢光基團和淬滅子之間的螢光猝滅效應。在此情況下，當螢光基團被激發，此淬滅子距離夠遠，使其無法有效地淬滅發射光，故螢光基團(6-FAM)釋放的螢光可被偵測到。6-FAM螢光(525nm)的增加，與PON1內酯酶活性的增加成正比。

綜合上述可知，本發明成功合成能夠準確量化PON1內酯酶活性的新螢光開啟化學探針16(包含化合物16a和化合物16b，但由於化合物16b的光學性質優於化合物16a，因此本專利申請的範例探針，為化合物16b)，且採用探針16的螢光檢測方法，是第一個能夠直接量化樣品中PON1內酯酶活性的方法。本發明的PON1內酯酶活性的檢測方法，提供了PON1內酯酶活性的廣泛線性檢測範圍和最低檢測極限(LOD)，且確保了比UV或比色測定法更高的靈敏度，並且無需使用危險的有毒基質。本發明的新穎探針16可製成試劑，以滿足臨床環境中，對血清中PON1內酯酶活性的靈敏、快速定量、且操作簡便的迫切需要。因此，本發明的探針、方法和應用，在臨床環境和基礎研究中，可具有廣泛的應用。

根據本發明的前述示例，本領域技術人員可以理解參照方案S1~S5的流程，可製備出如式(II)化合物所示的多種雙環壬炔衍生物，以作為檢測PON1內酯酶活性的螢光探針。此外，本發明還提供一種用於檢測PON1內酯酶活性的檢測套組，其包含至少一個前述探針，以及PON1的基質(TBBL)。此外，該套組還可包括檢測緩衝液，及/或陽性對照組。

透過本發明的前述探針、方法及套組，可知本發明所提供的，是一種使用新穎螢光探針，簡單且具有選擇性的PON1內酯酶檢測方法，其至少具有高通量、高靈敏度、高準確度、以及特異性量化樣本中PON1內酯酶活性等優點。人體中PON1內酯酶活性的測量可作為多種人類疾病的關鍵指標，例如用於評估肝功能，及用於評估粥狀動脈硬化和心血管疾病風險等。經由測量人體血液內PON1內酯酶活性的變化，亦可應用於早期或即時的疾病或症狀檢測與治療。前述疾病或症狀包含發病時會導致PON1活性異常的疾病或症狀，例如微生物感染、急慢性肝疾病、癌症、糖尿病、心血管疾病等之代謝症候群、克隆氏症、老化、以及神經退化性等。

本發明實屬難能的創新發明，深具產業價值，援依法提出申請。此外，本發明可以由所屬技術領域中具有通常知識者做任何修改，但不脫離如所附申請專利範圍所要保護的範圍。

Claims

一種製備一探針的方法，包含：提供具有下式的一架橋分子：
對一螢光基團以及一淬滅子的其中一者進行NHS酯化；於該架橋分子上架接NHS酯化的該螢光基團以及NHS酯化的該淬滅子的其中之一，以得到式(I)化合物：
，其中R1為該螢光基團以及該淬滅子的其中一者；對該螢光基團以及該淬滅子的其中另一者進行疊氮化；於該式(I)化合物上架接疊氮化的該螢光基團以及疊氮化的該淬滅子的其中另一者，以得到式(II)化合物：
，其中R2為該螢光基團以及該淬滅子的其中另一者，其中該淬滅子為一接觸淬滅的淬滅子，以及該淬滅子是一螢光淬滅子以及一暗淬滅子的其中之一。
如請求項1所述的方法，其中該螢光基團，為5-羧基螢光素(5-FAM)或6-羧基螢光素(6-FAM)，以及該淬滅子為羅丹明B。
如請求項2所述的方法，還包括：將5(6)-羧基螢光素[5(6)-FAM]、NHS以及N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亞胺鹽酸鹽，溶解在二甲基甲醯胺(DMF)中反應，以得到一反應混合物；以一萃取溶劑萃取該反應混合物，以得到一有機相；以及將該有機相乾燥，以分離出NHS酯化的該5-FAM和該6-FAM。
一種具有式(III)的化合物：
其中X1和X2形成
R1為一螢光基團以及一淬滅子的其中一者，以及R2為該螢光基團以及該淬滅子的其中另一者，其中該淬滅子為一接觸淬滅的淬滅子，以及該淬滅子是一螢光淬滅子以及一暗淬滅子的其中之一。
如請求項4所述的化合物，其中該螢光基團以及該螢光淬滅子選自由5-羧基螢光素(5-FAM)、6-羧基螢光素(6-FAM)、羅丹明B(rhodamine B)、HEX、VIC、TET、NED、CY3、CY5、ALEXA594、ALEXA643、TAMRA及VIC所組成的群組，以及該暗淬滅子選自由Dabcyl、BHQ及NFQ所組成的群組。
如請求項4所述的化合物，係作為一探針。
如請求項6所述的化合物，其中該探針為
以及
的其中之一。
一種用於檢測對氧磷酶1(PON1)的一內酯酶活性之檢測套組，包括：如請求項6或7所述的探針；以及對氧磷酶1(PON1)的基質5-(丁硫基)丁內酯(TBBL)。
一種用以檢測一生物樣品中，之對氧磷酶(PON1)的一內酯酶活性之方法，包括：提供包含該PON1的該生物樣品；以及使該生物樣品與如請求項6或7所述的探針反應，以得到一反應產物；藉由偵測該反應產物所釋放之一螢光訊號，以得出該內酯酶活性。