TW201202424A

TW201202424A - Method of engrafting cells from solid tissues

Info

Publication number: TW201202424A
Application number: TW100115984A
Authority: TW
Inventors: Rachael Turner; David Gerber; Lola M Reid; Oswaldo Lozoya
Original assignee: Univ North Carolina
Priority date: 2010-05-07
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2012-01-16
Also published as: IL222857A; WO2011140428A1; IL277184A; JP2019178155A; JP6891010B2; CA2798458C; CN102985130A; SG10201503582YA; KR20190012279A; MX2012012836A; KR102493613B1; BR112012028265B1; KR20190128754A; US20110274666A1; TWI687518B; JP2013526297A; RU2012152610A; RU2015155133A; IL245535B; EP2566567A4

Description

201202424 ' 六、發明說明： I：發明戶斤屬之技術領域3 發明領域本發明廣泛針對組織移植領域。更特別的是，本發明係關於一種用於細胞移植的組成物及方法。 L先前技術3 發明背景細胞移植治療的現行方法係經由血管途徑將供體細胞引進宿主中（一種在造血治療後的模範對策）。但是，造血細胞治療相對容易地進行，因為這些細胞已釋放出而存在於懸浮液中且具有支持其返回特定標的組織之固有特徵。因 ^ 此，數千個在造血細胞亞群之移殖上的研究皆與來自固型 - 器官（諸如，皮膚或内臟(例如，肝、肺、心）)的細胞之移殖只有少許關聯。更確切來說，當經由血管途徑移植來自固型器官的細胞時，會由於效能差的移植、差的細胞存活及形成威脅生命的血栓之傾向而有消除的效應。因此，大部分固型器官的疾病若嘗試另一種移殖方法時，其必需能和目前它們可達成般一樣成功地治療。因此，本發明係針對一種藉由植入協定，使用可獲得的多種策略移植來自固型器官之細胞的方法。【發明内容】發明概要在本發明的一個具體實例中，提供一種在具有生病或不正常狀態的内臟之患者中移植内臟組織的方法。該方法 201202424 包括：（a)從一供體獲得該内臟之分離的細胞；（b)將該等細胞置於包含細胞外基質組分的生物材料中，且選擇性混合一培養基及/或發信分子（生長因子、細胞素、荷爾蒙）；及 c)將該等細胞引進標的器官中，其中該細胞與生物材料之混合物適當地在内臟中或在其表面上或二者活體内凝膠或固化。該内臟可為肝、膽樹、胰、肺、腸、曱狀腺、前列腺、乳房、子宮或心臟◎合適的發信分子係生長因子及細胞素，及可包括例如表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子 (HGF)、基質細胞衍生出的生長因子(SGF)、類視色素類（例如，維他命A)、纖維組織母細胞生長因子（fgF，例如， FGF2、FGF10)、血管内皮細胞生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子I(IGF-I)、類胰島素生長因子、抑制瘤素 M、白血病抑制因子(LIF)、運鐵蛋白、騰島素、葡萄糖皮質素類(例如，氫化可體松）、生長激素、任何腦下腺激素(例如，促渡泡素(FSH))、雌激素、雄性激素及曱狀腺激素(例如，T3 或 T4)。對生病或不正;^益官的治療來說，細胞之供體可為除了接受者㈣城（異體雜），或村為具有生病或不正常狀態的内臟之對象（自體）’其限制條件為該正常細胞係從未生病或非不正常的_之料㈣。對建立研究疾病的模型系統來說，該供體細胞可具有疾錢被雜到在實驗宿主之正常組織上/中。該細胞可包括幹細胞、成熟細胞、企管母細胞、内皮㈣'間質幹細胞（來自任何來源）' 星狀細胞、纖維組織母 201202424 細胞或這些之混合物。此外，該生物材料可包括膠原、黏附分子（基膜素、纖連蛋白（fibronectins)、巢蛋白（nidogen))、彈力蛋白、蛋白多醣、透明質酸(1^>^11^01^113)(11八3)、葡萄糖胺聚合醣鏈、聚曱殼糖、藻酸鹽、及合成、可生物降解及可生物相容的聚合物。透明質酸係較佳的物質之一。該内臟之經分離的細胞可在將該等細胞引進宿主前，於生物材料中體外固化；或再者，可以流體物質注射及允許活體内固化。在或靠近生病或不正常組織處引進該等細胞較佳，及其可經由注射、可生物降解物覆蓋或用海綿擦拭引進。在本發明的另一個具體實例中，提供一種在内臟遭遇生病或不正常狀態之患者中修復内臟組織的方法。該方法包括（a)從一供體獲得該内臟之正常細胞；（b)結合該細胞與一或多種生物材料；（c)選擇性讓該細胞懸浮液與發信分子 (生長因子、細胞素）、額外的細胞或其組合結合；及(d)將該混合物(b)引進患者中，其中該混合物變成不溶及在該内臟上或中活體内形成植入物。在本發明的更另一個具體實例中，提供一種將内臟細胞定位到標的内臟之表面上、進入内部部分中或二者的方法，該方法包括於有效量的交聯劑存在下，將一包含内臟細胞的製劑及一或多種水凝膠形成前驅物的溶液活體内引進到標的内臟之表面上、進入内部部分中或二者，其中該製劑在標的内臟之表面上、在内部部分中或二者形成一包含内臟細胞的水凝膠。該混合物可進一步包含培養基、細 201202424 胞外基質分子及發信分子。已固化的混合物（諸如水凝膠）將植入物提供至標的内臟其表面上、内部部分中或二者。該細胞可被定位至標的内臟中/上一段時期至少12小時、至少24小時、至少約48小時或至少約72小時，其中該内臟可為肝、胰、膽樹、肺、甲狀腺、腸、乳房、前列腺、子宮、骨頭或腎臟。在患者之治療中，該内臟的供體細胞應該不為生病的細胞(例如’腫瘤或癌細胞）。但是，當嘗試建立疾病的實驗模塑系統時，該植入物可考慮生病的細胞。可形成水凝膠或相似不溶的複合物之生物材料可包括葡萄糖胺聚糖、蛋白多醣、膠原、基膜素、巢蛋白、透明質酸、經硫醇改質的玻尿酸鈉、其變性形式（例如，明膠）、或其組合。固化反應之觸發可為引起該基質組分交聯或那些可凝膠的組分凝膠化之任何因子。該交聯劑可包括聚二丙烯酸乙二醇酯或其含二硫醚衍生物。較佳的是，該細胞與生物材料的不溶複合物所擁有之黏度範圍從約〇1至約 100千巴斯卡，以約1至約10千巴斯卡為較佳，以約2至約4 千巴斯卡為更佳；及最佳的挺度係約丨丨至約35〇〇巴斯卡。在本發明的又更另一個具體實例中，提供一種極冷保藏細胞的方法，其包括：（a)獲得經分離的細胞；（b)讓該細胞與凝膠形成生物材料、及選擇性_或多種等滲壓基礎媒質、發信分子（細胞素、生長因子、荷爾蒙)及細胞外基質組刀（例如，透明質酸)結合；及冷來該細胞混合物，以便其被貯存在-90。(：或-180°C冷凍器中。該等滲壓媒質可為cS10(生物生活(biolife))或相等的等滲壓極冷保藏緩衝液。該發信分 201202424 子可為。合適的發信分子有生長因子及細胞素’及包括例如表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、基質細胞衍生出的生長因子（SGF)、類視色素類（例如’維他命A) ' 纖維組織母細胞生長因子(FGF，例如，FGF2、FGF10)、血管内皮細胞生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子I(IGF-I)、類胰島素生長因子II(IGF-II)、抑制瘤素Μ、白血病抑制因子(LIF)、運鐵蛋白、胰島素、葡萄糖皮質素類（例如可體松）、生長激素、任何腦下腺激素（例如，促濾泡素 (FSH))、雌激素、雄性激素及甲狀腺激素（例如，Τ3或Τ4)。該細胞外基質組分可為糖胺聚多糖、透明質酸、膠原、黏附分子(基膜素、纖連蛋白）、蛋白多醣、聚曱殼糖、藻酸鹽、及合成、可生物降解及可生物相容的聚合物、或其组合。對該細胞與生物材料之混合物的極冷保藏來說，該混合物它們可進一步與下列結合：（i)選自於由下列所組成之群的冷凍保護劑：二甲亞砜(DMSO)、甘油、乙-醇、 ethylenediol、ethalenediol、1,2-丙二醢、〇〇吁Z，3·丁二醇、曱醯胺、N-甲基甲醯胺、3_甲氧基义2-丙二醇，藉由它們本身及其組合；及/或(ii)選自於由下列所組成之群的添加劑：糖類（sugara)、甘胺酸、丙胺酸、聚乙烯吡疋蜩、丙酸鹽、細胞凋亡抑制劑、鈣、乳糖酸鹽、蜜三、迪皮質醇、還原的鈉離子、膽鹼、抗氧化劑、荷爾蒙

八丹組合。兮搪W 為漏蘆糖、果糖、葡萄糖或其組合；及 μ 抗氣化劑可為維他。ρΕ、維他命A、β-胡蘿蔔素或其組合。 ’’’’、圖式簡單說明 201202424 第1圖係根據本發明將細胞植入至多種標的組織的方法之圖式。迳些方法包括可植入的植入物、可注射的植入物及可貼到標的器官表面上的植入物黏膠繃帶（bandai… 植入物”）。第2圖提供以久保田（Kub〇⑷媒質製備的透明質酸 (KM-HAs)之流變測量。a)對所測試的每種調配物來說，當黏彈性阻尼丨G /G丨(在外部施力後，變形反應延遲的度量）在0.1赫茲-10赫茲強制頻率範圍内可忽略時，KM_HAs之剪切模數|G*|(機械凝膠挺度的度量）保持固定；誤差槓：在每個測試頻率處的度量之95°/。信賴區間。b)遍及實驗0.6 1/秒 -60 1/秒的剪切速率範圍[o.i赫茲_1〇赫茲強制頻率]， KM-HAs具有剪稀（即’黏度隨著強制頻率增加而減少）；上及下限：以乘冪律模型為基礎的95%信賴區間（科克斯-梅爾姿（Cox-Merz)規則假設，對全部調配物來說，在〇. 3 1 /秒-30 1/秒的剪切速率範圍[〇.〇5赫茲-5赫茲強制頻率]内， R2>0.993)。僅有在表3中顯示出之標有字母的調配物上進行流變測量。第3圖顯示出人類肝幹細胞(hHpSCs)在KM-HAs中的大小、形態及增殖資料8 hHpSCs的聚落獲得三維組態及在接種於KM-HAs中之後具有a)球形體似的團聚物(底部左）或折疊（中間、上部右）[影像框：900微米X1200微米]。在接種 hHpSC的KM-HAs之組織學切片上的共焦顯微鏡顯露出，於培養1星期後，在實質細胞[細胞核呈藍色（來自DAH對比染色），EpCAM呈紅色（對b)及c)二者來說），綠色（對b)CD44

S 8 201202424 或c)CDHl來說）；b)及c)的影像框：150微米χΐ5〇微米；在 b)及c)中強調的白色：15微米χ15微米]當中，混合的細胞形態表現型具有細胞尺寸b)約7微米，或c)最高1〇_15微米。 d)hHpSCs在KM-HAs中的生存能力（藉由阿拉瑪該 (AlamarBlue)新陳代謝減少測量）’遍及1星期的培養，在含有1.6%CMHA-S及0.4%PEGDA的KM-HA水凝膠（調配物 E，表3)中顯露出功能恢復及增殖；在24小時培養後之阿拉瑪藍減少測量已相對於在接種後2-3天的測量常態化；資料以平均±標準誤差報導。第4圖提供在接種於KM-HA的hHpSCs中之分化標記於 1星期培養後的蛋白質表現性。對在hHpSCs中的分化標記來說’ hHpSCs的聚落因為與KM-HAs性質相依之轉譯程度而具有差別的表現性程度。人類AFP之新陳代謝分泌速率遍及KM-HA調配物皆與mRNA表現程度相關聯》NCAM表現性在全部KM-HAs中皆為正，同時CD44表現性在具有 CMHA-S含量1 ·2°/〇或較少的KM-HAs(標有字母的調配物 A、B、C、D;表3)中最豐富。CDH1表現性對具有丨G*|<2〇〇巴斯卡的KM-HA水凝膠來說為正，及對|G*|>2〇〇巴斯卡來說為負。人類AFP分泌速率的資料以平均±標準誤差報導。在15-20微米切片（〜2至3 hHpSCs厚；hHpSC直徑：5-7微米）上進行EpCAM、NCAM ' CD44及CDH1之免疫組織化學染色’及藉由螢光性顯微鏡造像[影像框：1〇〇微米xl〇〇微米]。 KM-HA調配物以相關增加的挺度排序（對a來說，|G*|=25 巴斯卡；對B來說，|G*|=73巴斯卡；對丑來說，|G*hl4〇巴 201202424 斯卡；對C來說’ |G*|=165巴斯卡；對D來說，|g*|=220巴斯卡；及對F來說，|G*|=520巴斯卡）。第5圖提供在KM-HA生長的hHpSCs中之肝祖代標記在 1星期培養後的基因表現程度(藉由qRT_PCR)。在hHpSCs與其直接後代hHB s的標記之m rN a表現程度(肝特定的AF p、 EpCAM、NCAM、CD44及CDH1)間的比較顯示出，KM_ha 生長的hHpSCs在消極培養1星期中，於轉錄程度上獲得早期hHB特徵。在hHpSCs及新鮮分離的hHBs中，對CD44之表現性範圍可比較；剩餘標記的表現程度統計上可區別，其在EpCAM上減少大約2倍，在hHpSCs分化成hHBs後的 CDH1、NCAM壓制及AFP富含化上減少3倍。在全部 KM-HAs中，接種的hHpSCs對AFP、NCAM及CDH1之平均表現程度朝向hHB範圍偏移至hHpSC範圍外，同時EpCAM 表現性在1星期培養後遍及各處富含化。KM-HA調配物以相關增加的挺度排序（對A來說，|G*|=25巴斯卡；對B來說，丨G*|=73巴斯卡；對E來說，|G*卜140巴斯卡；對C來說， |G*|=165巴斯卡；對D來說，丨G*|=220巴斯卡；及對F來說， |G*|=520巴斯卡）。表現程度（平均±標準誤差）係相關於 GAIOH常態化。在標有字母的KM-HA調配物中之測量（表 3)係比較hHpSC聚落（綠色）及新鮮分離的hHBs(紅色）之顯著性(學生T檢定）。第6圖為所揭示的極冷保藏及解凍方法之一個具體實例的圖式。第7圖顯示出來自由螢光素製造細胞(與透明質酸植入 s 10 201202424 對以細胞懸浮液注射二者)所產生的榮光信號之活體内即時成像的結果。第8圖提供在健康及CC14肝損傷模型二者中，於移殖後第7天處，在植人對細胞懸浮液中的血清人類白蛋白。第9圖顯示出肝幹細胞表現型標記的基因表現。表現程度已對GAPDH表現常態化，及倍數變化已對在聚落中的初始表現常態化。*代表在實驗條件與初始聚落表現間之顯著眭p<0.05 /〇。* *代表在實驗條件與初始聚落表現間之顯著性和在二種實驗條件間之顯著表現性p<〇〇5%。第10圖提供來自肝功能之功能性試驗隨著時間的資料。每細胞在三維透明質酸培養中之A)白蛋白、B)運鐵蛋白及C)尿素隨著時間的程度已常態化。第Π圖提供來自KM-HAs的機械特徵之資料。 a)KM-HAs的挺度可控制及依cmHA-S及PEGDA含量而定。平均剪切模數|G* |隨著CMHA-S及PEGDA含量增加遵循乘冪律行為而增加’從而在初始水凝膠混合期間提供 KM-HAs之最後機械性質的直接控制；僅在顯示於表3中標有字母的調配物上進行流變測量。誤差槓：對在〇.〇5赫茲-5 赫茲強制頻率中的測量±1標準偏差。b)在KM-HAs中擴散。 FRAP(70kDa經螢光黃標記的葡萄聚糖）在KM-HAs中的擴散性之測量與單獨久保田媒質沒有明顯不同；在顯示於表3 的全部調配物上進行擴散性測量。誤差槓：測量的95%信賴區間。第12圖顯示出由接種至KM-HAs中的hHpSCs所分泌之 201202424 人類AFP '白蛋白及尿素。hHpSCs在KM-HAs中的聚落於接種後第7天具有某些肝功能，其在培養媒質（K Μ)中實測到人類AFP及白蛋白之濃度增加及尿素合成保持平衡。接種後第7天，在ΚΜ-ΗΑ調配物當中之人類AFP、人類白蛋白及尿素的新陳代謝分泌速率明顯，且在含有1.6Q/〇CMHA-S及 0.4°/〇PEGDA的KM-HAs中（調配物E，表3)之AFP、白蛋白具有最小速率及尿素合成減少。左列：在對每種標有字母的調配物（表3)培養24小時後，於每日收集的培養媒質中之代謝物濃度。右列：在24小時培養後，於培養媒質中之每個 hHpSC聚落的代謝物質分泌速率；在媒質中之總代謝物質已對在每個區間之功能性hHpSC聚落數常態化，如藉由生存能力試驗與阿拉瑪藍減少來計算（每個樣品接種的聚落大約數目：12)。全部資料皆以平均±標準誤差報導。第13圖顯示出經控制的速率冷凍程式減少液體_冰相熵防止内部冰損傷及允許可重覆的冷凍。A)曲線圖顯示出關於樣品溫度的艙溫（10°/〇DMSO)。B)使用於克萊歐美 (Cryomed) 1 〇 1 〇系統的冷;東程式速率。第14圖提供二者(A)經極冷保藏的胎兒肝細胞解凍後之細胞生存能力％;及⑺)在每種條件下培養3週後的聚落計數，已對新鮮樣品常態化。結果以平均士平均的標準誤差報導。KM=含有10%DMSO及10%FBS的久保田媒質。CS10=

克萊歐斯特(Cryostor)，CS10+sup=含有KM補充品的克萊歐斯特10。0.05%及0· 10%指為在每個樣品中所補充的ha%。第15圖顯示出已對GAPDH表現性常態化的相對mRNA

S 12 201202424 表現性。平均±平均的標準誤差。對新鮮樣品來說，顯著性 *p>0.05 ° ΚΜ=含有10%DMSO及1〇%FBS的久保田媒質。 CS10=克萊歐斯特，CS10+sup=含有KM補充品的克萊歐斯特10。0.05 /。及〇· 1 〇%指為在每個樣品中所補充的HA%。 C實施方式3 較佳實施例之詳細說明目刖，典型經由血管途徑進行包含源自於固型器官的細胞之細胞移殖，結果例行性提供壓倒性效能差的移植證據，對成熟細胞來說典型在級數約2〇_3〇%，及對幹細胞來說少於5%。差異的移植係由於其尺寸，其在肝中對幹細胞來說係小（典型在10微米下）及對成熟細胞來說較大（典型 >18微米）。我們的研究已證實此觀察。例如，在一個研究中，將人類肝幹細胞（hHpSCs)及肝母細胞 (hepat〇blaStS)(hHBS)注射進入免疫功能不足的老鼠中（藉由將細胞注射進入脾中）。因為脾直接與肝連接，細胞會流入它們預計移植的肝中但是，大部分細胞在移植或種入除了想要的標的外之組織（異位位置）前死亡。甚至當細胞確實合適地到達其目的地時，該等細胞轉換成完全功能性細胞係受A管形成缺乏、生長缺乏(當移植成熟細胞時）、及細胞的高產生免疫性質(若使用成熟細胞時) 及需要長時間免疫抑制所阻礙。其它困難包括臨床等級來源、高品質細胞及由於極冷保藏困難"要使賴鮮分離的細胞。除了所提到的無效率及困難外，經由血管途徑移殖來 13 201202424 自固型器官的細胞危險。來自固型器官的細胞具有使得細胞彼此快速結合及提高團聚之表面分子（細胞黏附分子，緊密連接蛋白質）。此聚集現象可造成威脅生命的肺血栓。為了解決這些困難及掛念的某些，本發明係有關植入技術’其包括將經移植的細胞以團聚物傳遞至可被定位至生病組織的台架上或中，以促進所需要的增殖及移植。因此’本發明不僅考慮到欲移植的細胞型式，而且亦考慮到該細胞型式與適當生物材料之組合及用於最有效率及成功的移植治療之植入方法。本發明的植入技術可在患者中轉移成治療用途，及提供另一種再生藥治療以重建生病或不正常組織。細胞來源根據本發明，想要的細胞種群可直接從具有“正常”、 “健康”的組織及/或細胞（其意謂著不受疾病或功能障礙折磨的任何組織及/或細胞)之供體獲得。當‘然，此細胞種群可從遭受疾病或功能障礙的器官之人士獲得，然而其來自不在此症狀下的器官部分。該細胞可從任何適當的哺乳動物 (不管年齡)_獲得’包括胎兒、新生兒、兒童及成年人組織。若欲建立疾病狀態的實驗模型時，則可在欲移植進適當的實驗宿主之植入物中使用生病細胞。更特別的是，細胞可因不同治療根據治療需求從“譜系分期（Hneage-staged)，，的種群獲得。例如，在對快速取得僅由晚期譜系細胞提供的功能有需求之情況中，或若接受者具有優先感染幹細胞及/或袓細胞的譜系依賴性病毒（諸 201202424 如，隨著肝炎c或乳突狀瘤病毒發生）時，較晚期的“成熟” 細胞可較佳。在任何事件中，可使用“祖代”細胞來建立其各別組織的任何譜系期。對譜系分期的肝細胞種群及其分離方法之討論，參見美國專利申請案案號11/560,049及12/213100，此二揭示其整體以參考方式併入本文。簡單來說，肝内有至少八個成熟化譜系期。下列提供那些期及關於其的簡短說明：譜系期1 :人類肝幹細胞(hHpSCs)係有多種能力的細胞，其位於胎兒及新生兒肝的導管板内及在兒童與成年人肝的郝林(Hering)管中。這些細胞的直徑範圍通常從7_1〇微米及具有咼核對細胞質比率。它們能忍受缺金，可在心縮性死亡（systolic death)後多於48小時在屍體肝中發現，及形成能分化成成熟細胞的hHpSCs聚落。這些細胞構成全部年齡供者的肝之實質的大約0.5-2%。譜系期2:肝母細胞(hHBs)係hHpSCs的直接後代及係肝很可能的過渡增殖細胞(transit ampUfying ceUs)。它們僅位於適合的幹細胞棲所(mche)外部。這些細胞較大（1〇_12微米）而含有較高量的細胞m體内可遍及胎兒及新生兒肝的實質及在接近兒童及成年人肝的赫管末端或與其被連處發現。隨著年齡增加，肝母細職量遞減至在產後肝中的實質細胞之<0細。在再生過程(特別是與某些疾病（諸如硬化)相關的那些)期間’此細胞種群已經顯示出擴展開。肝母細胞會成熟成肝細胞（H)或膽管細胞 (Ch〇langi〇Cytes)(亦稱為膽管上皮細胞(B))。 15 201202424 譜系期3H及3B:定向（committed〆單潛能）的肝細胞(3H) 及膽管細胞袓細胞(progenitors)_膽祖細胞（3B)係在肝内發現。這些單潛能前身僅引起一種成年細胞型式，及不再表現出幹細胞基因的某些（例如，CD133/1、刺蜎蛋白質 (Hedgehog proteins)(索尼克(s〇nic)/印度（Indian))的表現性程度低或無），但是表現出典型在胎兒組織中的細胞之基因。譜系期4H及4B :門靜脈周的(perip〇rtal)成年實質細胞包含相當小的肝細胞(4H)及肝内膽管上皮細胞(4B)。該肝細胞係二倍體，直徑大約18微米及表現出與糖質新生相關的多重因子/酵素（諸如PEPCK'連接蛋白（c〇nnexins)26&32)。此期的膽管細胞(4B)係二倍體，直徑大約6_7微米，勾勒出郝林管的一部分輪廓，及表現出多種基因（包括水通道蛋白1及4、MDR1、分泌激素受體），但#CL-/HC〇3-交換劑或體抑素受體。譜系期5H及5B :此期之細胞包含相對較大的肝細胞 (5H)及膽管細胞(5B) ’二者皆二倍體。該肝細胞的尺寸之直徑大約22-25微米，及它們係在中腺泡(midacinar)區域中發現。該中腺泡肝細胞表現出高程度的白蛋白及酪胺酸胺基轉移酶(TAT);特別是’特徵為它們以蛋白質表現出運鐵蛋白（相較之下，譜系期1-4僅以mRNA表現出其）。譜系期5B膽管細胞之直徑大約14微米，位於小葉内導管中及表現出CFTR、分泌激素受體、體抑素受體、MDR1 及MDR3、及CL7HC03·交換器。譜系期6H:第6期之二倍體中心周圍肝細胞可在培養中 201202424 形成聚落，但是具有有限的擴展能力及基本上沒有被次培養的能力。這些的百分比隨著年齡增加而遞減（與四倍體中心周圍細胞的百分比增加相比）。除了白蛋白、TAT及運鐵蛋白外，它們亦強烈地表現出一些P45〇s(諸如P450_3A)、麵醯胺酸合成酶(GT)、肝磷脂蛋白多醣及與尿素形成相關的基因。譜系期7H :此期包含四倍體中心周圍實質細胞，其不再能夠進行完全細胞分裂。它們可進行DNA合成，但是具有有限的胞質分裂能力。它們係更大的細胞（直徑>3〇微米）及表現出高基因程度(其在譜系期5-6中變明顯）。谱系期8:凋亡細胞：表現出多種凋亡標記及闡明dna 碎片。、了本身乾要提供生病或不正常内臟“功能，，之細胞卜β亥植入物較佳包括額外的細胞組分，其模擬包含上皮_ 間質細胞關係(全部組織的細胞基礎)之細胞類型較佳。上皮間貝細胞關係在每個絲化譜系期有區別。上皮幹細胞係與間質幹細胞搭伴，及其成Μ彼此賴，如它們在組織成…成王。Ρ多種成年細胞型式。在二種間之交互作用係由旁分泌信號(其包括可溶的㈣(例如，生㈣子)及細胞外基質組分)調和。在肝中，例如，肝幹細胞(HpSCs)產生肝細胞及膽管細 * pSCs的間質伙伴係血管母細胞。有證據指出血管母產生内皮細胞前身及肝星狀細胞前身（肝内譜系期2實負（肝母細胞(HBs))的間f細胞伙伴)二者。該内皮細胞前身 17 201202424 在隨後的譜系期中成熟成内皮（其變成肝細胞的譜系期之間質伙伴）。星狀細胞前身細胞產生星狀細胞，然後基質細胞’然後肌纖維母細胞(膽管細胞的間質細胞伙伴）。肝之形成（稱為肝細胞生成(hepatogenesis))係透過來自血管母細胞在與心臟相關的胚胎間質令的信號調節。在肝成長的初始階段期間，從心前(pre_car(JiaC)中胚層分泌出纖維母細胞生長因子（FGFS)，同時從該間質輸送出骨成形蛋白質（BMPs)。這些近來具體指為肝細胞，然後打破及漂移進入该周圍間質中及與前身交互作用成内皮及基質二者。 -亥間質細胞遍及成長各處皆保持與肝細胞接觸。人類肝幹細胞（hHpSCs)為了存活需要與間質細胞接觸匕們將自身複製，也就是說，當在血管母細胞的供給器上時保持如為hHpSCs。若在肝星狀細胞的供給器上培養時，它們譜系限制為肝母細胞。若在成熟内皮上培養時，匕們成熟成成年肝細胞；及若在成熟基質（例如，成熟星狀細胞或肌纖維母細胞）上時，則成為膽管細胞。幹細胞的命運由供給器控制已經顯示出係由於在譜系十於每個上皮_ 間質關係中所產生之旁分泌信號的精確組合。根據本發明的-個具體實例，該經分離的細胞種群與已知的旁分泌信號（在下列討論）及“天然，，上皮-間質伙伴 (如需要)結合，以最佳化該植人物。因此，該植人物將包含上皮幹細胞、肝幹細胞，一起與其天然的間質伙伴(血管母細胞)混合。對過渡增殖細胞棲所植人物來說，肝母細胞可與肝星狀細胞及内皮細胞前身搭伴。在某些植入物中，可 201202424 製得二組之混合：肝幹細胞、肝母細胞、总報官母細胞、内皮細胞前身、肝星狀細胞前身細胞，以A p + 以'在佰主組織中最佳化肝細胞之建立。接種該細胞的植入物之微環产將勺人旁分泌信號、基質及可溶的信號(其皆在使用於::入關谱糸期處產生）。亦可修改植入物來操縱疾病狀態。例如，為了減,ϋ 系依賴性病毒(例如，某魏炎絲，其―早期譜系期^ 後與宿主細胞同等地成熟)的影響’可製備晚後譜系期(例如’肝細胞及其天生伙伴（竇内皮細胞），其不許可病毒感染）的植入物。亦可使用植入物，藉由在植入物中使用生病的細胞，在實驗動物模型中將其移植到標的器官上來建立疾病模型。幹細胞植入物（使用肝細胞治療作為模型）的實施例將包含肝幹細胞、血管母細胞及肝星狀細胞前身。比較上，“成熟”肝細胞之植人物將包含肝細胞、成熟内皮細胞及外皮細胞（其係成熟星狀細胞）。對肝的域·間f細胞關係之討論，參見美國專利中請案案號11/753,326，其揭示全文以參考方式併入本文。血g开v成的問題對全部植入物皆重要，因此應該在對血管形Μ益㈣所(例如’肝）中植人。對大部分疾病症狀 ^兒，幹細胞植人物較佳，其提供其擴展潛力、其成熟成全部成年細胞型式的能力、其對缺血的容忍度、其來源能夠來自屍齡歧Μ小（若㈣話)致免疫性。植入物質 201202424 使用根據本發明之凝膠形成生物材料提供用於細胞支樓、協助植人及再生過程成功的信號之台架。當在有機體中的固型器官之組織進行固定的重修復時游離的細胞趨向於在適當的環境條件下再形成其天絲構。該細胞可與 -或多種培養基(例如’ RPM 164G)、發信分子(例如，騰島素、運鐵蛋白、VEGF)及一或多種細胞外基質組分(例如，透明質酸、膠原、巢蛋白、蛋白多醣）結合。在全部組織中，該旁分泌發信包含可溶(無數生長因子及荷爾蒙）及不溶（細胞外基質（ECM)信號）二者。在可溶與 (不》谷的）基質因子間之協同效應可由移植的細胞來支配生長及分化反應。基質組分係附著、存活、細胞形狀(和細胞台架的組織）、及需要的細胞表面受體（其讓該細胞接觸抗原以對特定的細胞外信號反應）之穩定性的主要決定因素。已知ECM調節細胞形態、生長及細胞基因表現。可藉由使用已純化的ECM組分體外達成類似於活體内之組織特定的化學。這些之許多可商業購得及對模仿活體内的細胞行為有益。合適的基質組分包括膠原、黏附分子(例如，細胞黏附分子(CAMs)、緊密接合劑（鈣黏素）、基礎黏附分子（基膜素、纖連蛋白）、間隙接合蛋白質（連接蛋白））、彈力蛋白及硫酸化的碳水化合物（其形成蛋白多醣(PGs)及葡萄糖胺聚糖(GAGs)) 〇這些類型每種定義出一類的分子。例如，存在有至少25種膠原質型式，每種由可區別的基因譯出且具有獨特的調節及功能。額外的生物材料包括無機、天然物質

S 20 201202424 (如聚曱殼糖及藻酸鹽）和許多合成、可生物降解及可生物相容的聚合物。這些物質經常透過一些方法“固化、例如，製成凝膠或不溶的物質），包括熱凝膠化'光交聯、或化學交聯、或曝露至引起該等物質不溶的微環境(例如，高鹽）。但是’每種方m要對細胞損傷負貴(例如，來自過度的溫度範圍、UV曝光）。對生物材料的更詳細討論(特別是使用透明質酸水凝膠），參見美國專利申請案案號12/073,420，此揭示其全文以參考方式併入本文。此基質組分的特別選擇可由活體内梯度(例如，從在與幹細胞腔隙結合中所發現的組分過渡至在與晚期譜系期細胞結合中所發現者)指導。該植入物生物材料模仿該植入物想要的特別譜系期之基質化學較佳。所選擇的基質組分之混合物的效力可使用經純化的基質組分及可溶的信號（其許多可根據優良藥A製造規範(GMP)協定從商業購得)在體外研究中分析。對成功移殖來說，對該植入物所選擇的生物材料引起該細胞所需要的適當生長及分化反應較佳。關於肝器官，與肝實質細胞相關且在幹細胞及過渡增殖細胞棲所外的基質化學存在於狄氏腔（Spaee Gf Disse) 中，該區域位於實質與时或„細胞的其它形式間。除了在肝之不同區域中的細胞成熟度變化外，亦觀察在某質化學中的變化。門靜脈周地在區域i中的基質化學類㈣在胎兒肝中所發現者，及由型式m及型式Iv膠原、透明質酸 (HA)、基膜素及硫酸軟骨素蛋白多酿之形式組成。此區域轉變成在中心周IS區域3中的不同基質化學，其包含型式【 21 201202424 膠原質、纖維結合素、及肝麟脂、及硫酸乙酿肝素(heparan sulfate)蛋白多醣的獨特形式。肝的幹細胞棲所已經部分地被標出特徵，且已發現包含透明質酸、黏合至α6-β4整合素(integrin)的板素形式（例如’板素5)、型式冚膠原質及最低限度硫酸化的碳酸軟骨素蛋白多醣(CS-PGs)之獨特形式。在此棲所中有有限量的型式IV膠原質及無型式!膠原質。此棲所基質化學轉變成與過渡增殖細胞腔隙相關及包含型式IV膠原質、黏合至其它整合素(αβ1)的板素卅式及GAGs及PGS形式（其包括具有較高硫酸化的Cs ^ ♦ 式、硫酸皮膚素(dermatan sulfate)-PGs、及特定的碎分肝素-PGs(HS-PGs)形式）。 L次乙酿該過渡增殖細胞雜_成更晚後㈣“，且隨著母個相繼的期，s玄基質化學變成更穩定(例如，更言十膠原），較少更新，及包含GAGs及PGs的更高^疋的大部分成熟細胞與肝磷脂-PGs(HP-PGs)形式相關形式著無數蛋白質(例如，生長因子及荷爾蒙、凝固蛋白，意謂種酵素）可黏合至基質，及於此經由黏合至在質、多立及特定的硫酸化形態而保持穩定。因此，該基質中之刀其在幹細胞棲所中的開始點（其具有與高更新及匕子從化相關(因此信號以靠近至細胞的穩定方式黏合最小硫酸穩定基質化學），轉變成穩定、具有增加的硫酸化之不來愈高的信號黏合程度及保持靠近至細胞)之基此愈因此，本發明考慮到基質分子的化學隨著^化階 22 201202424 段、隨著宿主年齡及隨著疾病狀態改變。與適當物質植入應該最佳化移植的細胞在組織中之移植、防止細胞擴散至異位位置、減少栓塞形成問題、及提高該細胞在組織内儘可能快速地整合的能力。再者，亦可選擇在該植入物中的因子，以減少致免疫性問題。在人類肝的情況中，細胞可在無血清狀態下培養。人類肝幹細胞或肝母細胞（hHpSC或hHB)可以它們本身植入，或與血管母細胞/内皮細胞前身及星狀細胞前身細胞組合植入。可將細胞懸浮在包含媒質之經硫醇化及化學改質的HA(CMHA-S，或葛萊可西爾（Glycosil)，UT鹽湖市（Salt Lake City)的葛萊可山生物系統（Glycosan Biosystems))(HA-M)及在KM(久保田媒質）中，及負載至成對注射器組的注射器之一中。其它注射器可負載交聯劑（例如’聚二丙烯酸（乙二醇）酯或PEGDA)，其在KM中製備（或使用引起生物材料的不溶性所需要之條件）。二個注射器藉由向外展開進入二個魯爾（Luer)鎖接頭中的針耦合。因此，在水凝膠及交聯劑中的細胞可經由一根針喷出，以允許 CMHA-S在注射後快速交聯成凝膠（或藉由另一種方法改變生物材料的不溶性）。在CMHA-S及交聯劑中的細胞懸浮液可直接注射或植入至肝’使用該繫膜組織以形成袋。再者，該等細胞可裝入葛萊可西爾中沒有使用PEGDA交聯劑，藉由允許該懸浮液在空氣中靜置過夜導致二硫醚鍵交聯成軟的、黏的水凝膠。此外，可加入其它經硫醇改質的大單體（例如，明膠 23 201202424 -DTPH、肝磷脂-DTPH、硫酸軟骨素-DTPH)來提供模仿活體内特別棲所的基質化學之共價網狀物。在另一個表示中，可在將PEGDA加入至葛萊可西爾前將包含半胱胺酸或硫醇殘基的多胜肽轉合至PEGDA，允許特定的多胜肽信號併入該水凝膠中。再者，可在交聯前將任何多胜肽、生長因子或基質組分(諸如膠原質之異構型、板素、玻璃體結合蛋白（vitronectin)、纖維結合素等等）加入至葛萊可西爾及細胞溶液’允許在水凝膠中惰性捕獲重要的多胜肽組分。透明質酸.透明質酸(HAs)係碳水化合物的6大葡萄糖胺聚合醣(GAG)家族之一的成員，其全部係糖醛酸及胺基糖[1-3]的聚合物。其它家族包括硫酸軟骨素類（cs，[葡萄糖醛酸·半乳糖胺]x)、硫酸皮膚素類(DS，更高硫酸化的[葡萄糖醛酸-半乳糖胺]x)、硫酸乙醯肝素類(HS，[葡萄糖醛酸 -葡萄糖胺]x)、肝素類(HP，更高硫酸化的[葡萄糖醛酸-葡萄糖胺]X)及硫酸角質素(keratan sulfate)類(KS，[半乳糖-N-乙醯葡糖胺]x)。 HAs係由一藉由βΐ-4、β1-3鍵連結的葡萄糖胺及葡萄糖酸酸之雙醣單元組成。該聚合的聚糖係生物學地由數百至多如20,000或更多個雙醣單元之線性重覆單元組成。該has 具有分子量範圍典型從在血清中的100,000Da至多如在滑液中的2,000,000，至多如在臍帶及玻璃體中的8,〇〇〇,〇〇〇。因為其高負電荷密度，HA吸引正離子(在水中獲取）。此水合允許HA支撐非常壓縮的負載。HAs係位於全部組織及體液中，且在軟的結締組織中最豐富’及天然水攜帶能力適

S 24 201202424 x、匕角色（包括影響組織形成及功能）。其在細胞外基質中、在細始主工包表面上及在細胞内發現。化予的天然形式多樣化。最常見的變數係鏈長。某 Ί系高/V 了窃一刀直，此由於具有長的碳水化合物鏈(例如，在鹑 =類鳥的雞冠中及在臍帶中的那些）；及其它為低分子量，；豆鏈(例如，來自細菌的培養物）。HAs的鏈長度在斤引4起之生物功能中扮演關鍵角色。低分子量HA(低於表2 kDa)可引起與基質更新相關及顯示出與在組織中 &人相關之細胞素活性。高分子量（大於2xl〇5 kDa)可抑制細胞辦殆曰。小的HA碎片（在卜处以間）已經顯示出增加血管生成。 HA的天然形式已經改質，以引進想要的性質（例如，改貝具有硫醇基團，允許硫醇使用於其它基質組分或何爾蒙的黏合或用於交聯的新穎形式）。同樣地，有本質發 =交聯的^^例如’藉由氧調節）：及更其它已經藉由以某式齊丨（例如，規基化試劑）處理天然及經改質的HAs而人工引進者，或如上述提到，建立經改質的HAs使得其許可以獨特的形式交聯(例如，在經硫醇改質的HAs中形成二硫醚橋）。根據本發明，經硫醇改質的HAs及使用於其的就地聚合技術較佳。這些技術包括經硫醇化羧甲基化的HA(已知為 CMHA-S或葛萊可西爾）之二硫醚交聯。對活體内研究來說，可使用具有較低分子量（例如，70-250 kDa)的HA，因為該交聯（二硫醚或PEGDA)產生非常高分子尺寸的水凝膠。硫醇反應性連結劑（聚二丙烯酸乙二醇酯（PEGDA)交聯 25 201202424 劑）合適於細胞膠囊及活體内注射二者。此結合的葛萊可西爾-PEGDA物質透過共價反應及在幾分鐘内交聯，其具生物相容性及允許細胞生長及增殖。該水凝膠物質（葛萊可西爾）考慮到對幹細胞活體内組織工程有益之凝膠性質。葛萊可西爾為可從UT鹽湖市的葛萊可山生物科學購得之半合成細胞外基質（sECM)技術的部分。在艾曲西爾（Extracel)及亥斯頓(HyStem)商標線中的多種產物可商業購得。這些物質具可生物相容性、可生物降解性及無致免疫性。再者，葛萊可西爾及艾曲林克(Extralink)可容易地與其它ECM物質結合用於組織工程應用。HA可從許多商業來源獲得’且較佳物為使用鏈絲菌（Streptomyces)株的細菌發酵 (例如’健臻（Genzyme)、來福可（LifeCore)、諾伐美曲 (NovaMatrix)及其它），或在IS〇 9〇〇1 : 2〇〇〇方法（諾維信 (N〇v〇Zymes)獨有）中使用括草桿菌（Baeilius如如丨⑷作為宿主的細菌發酵方法。細胞種群的理想比率應該複製活體内及在組織之細胞懸斤液中所發現的_。細胞的混合物允許袓代細胞成熟及/或維持成年細胞型式伴隨著所需要的血管形成發展。在此方法中’對包含多重基質組分及可溶的發信因子之複合物達成;-❹透日為基礎的合絲魏，及該微環 X十以模仿包含由上皮細胞及間質細胞在特定成熟化 -W不期所產生之特定旁分泌信號組的特定微環境棲所。下列係實施例：

S 26 201202424 表1 :祖細胞的典型棲所植入物幹細胞棲所植入物過渡增殖細胞棲所植入物細胞組分 hHpSCs，jk管母細胞肝母細胞、肝星狀細胞前身、内皮細胞前身（或間質幹細胞）基礎媒質久保田媒質（對内胚層祖細胞最理想）或經修改用於特定的幹細胞種類之媒質久保田媒質或對特定内胚層祖細胞最理想之媒質，其經修改用於過渡增殖細胞' 額外可溶的1^子 [經修改用 LIF，VEGF EGF，HGF，VEGF 基礎台架 HA或經化學改質的HA作為 sECM ΗΑ或經化學改質的ΗΑ作為 sECM 其它基質組分型式III膠原質，板素的胚胎形式 (例如’板素5，其與36/β4整合素結合）；硫酸軟骨素-PG(在棲所中所發現的新穎形式）型式IV膠原質，一定數量之任何基膜素、CS-PGs、 HS-PGs形式表2 :成熟實質細胞的典型棲所植入物譜系期4肝細胞譜系期5，肝内的膽管細胞細胞組分門靜脈周的肝細胞（直徑〜18微米）；門靜脈扃的&皮細胞肝内的膽管細胞(直徑〜15微杀）；i質細胞基礎媒質久保田媒質（或經修改用於成年叶細胞的媒質）：加入‘ (I0E-10M)，鈣（0.6 mM)， EGF(10奈克/毫升）久保田媒質（或經修改用於成年膽管細胞的媒質）：加入銅(10E-10M)，鈣(0.6 mM)， egf(io奈克/毫升）額外可溶的因子 [經修改用於肝] VEGF(1G奈兑/毫升），EGF(l〇奈克/毫升），Τ3(1〇Ε-9Μ)，葡萄糖皮質素類(H)E_8M) PDGF(l〇奈克/毫升）， EGF(10奈克/毫升），HGF(10 奈克/毫升），T3(10E-9M)，葡萄糖皮質素類(10E-8M) 基礎台架 HA或經化學改質的HA作為 ECM HA或經化學改質的HA作為 ECM 其它基質組分型式III膠原質，板素的胚胎形式 (例如，板素5，其與α6/β4整合素苎今};硫酸軟骨素-PG(在棲所中發現的新穎形式）型式IV膠原質，任何數目與 α/β 卜 CS-PGs、HS-PGs結合的板素形式幹細胞棲所在肝中的微環境由在肝幹細胞與血管母細肊間之旁分泌信號組成。其包含透明質酸、型式III膠原質、特疋的板素形式(例如’板素5)、獨特的硫酸軟骨素蛋白糖 (CS PG)形式（其幾乎無硫酸化及具有接近或精確地為“久保田媒質種用於肝袓細胞成長的媒質）之可溶的信號/ 媒質且成物）。無嚴格需要其它因子’然而可藉由以幹細胞 27 201202424 因子、白血病抑制因子（LIF)及/或某些白細胞介素（例如，1L 6、IL 11及TGF-βΐ)補充而觀察到效應。CS-PG的幹細胞棲所形式尚未獲得。過渡增殖細胞在肝中的微環境形態學上係在肝母細胞

與肝星狀細胞間。此微環境的組分包括透明質酸、型式IV 膠原質、結合至0丨整合素的基膜素之特定形式、更硫酸化的CS-PGs、硫酸乙醯肝素-蛋白多醣(Hs_PGs)形式、及可溶的信號（其包括進一步以表皮生長因子(EGF)、肝細胞生長因子(HGF)、基質細胞衍生出的生長因子(SGF)、及類視色素類（例如’維他命A)補充的久保田媒質）。植入方法叮依、’’且織型式來選擇適當的植入方法。對植入物將置換生病或遺漏的輯(例如，骨頭)之域來說，可植入的植入物合適。然後’可依所選擇的方法來選擇適當的生物材料來襯托財*。《衫时法。·，在骨頭實施例中，固態基質允許細胞與需要的生長因子接種進該基質中培養，然後植入患者中。第丨圖。 ° 的植人物具有它們可填絲何㈣形狀或 (=如彳貝傷的器官或組織）之優點。根據此方法細胞 : 射在置於可凝膠的生物材料（其使用多種交中之細胞懸浮液中。該混合物可直接注射 Η或例如，肝）中；注射在器官被膜、包住号自且^任何薄膜下；注射進藉由將該繫膜之部分折疊自身上及點著装考其场成&卿成㈣巾；或藉由使用

S 28 201202424 用膠將另一種物質（似& ., 如’缺。蛛絲）固定至器官表面形成一袋，及將該混合物注射進入其中。直接％可由在多重位 (W㈣f及^實質中組成，但是儘可能小地避免來自水凝膠的靜切力（其可造成肝_損傷）。使用如於此上述所彳叫11完成將肝幹細胞棲職人物注射進入肝中Pi早地⑨，將細胞·基質媒質混合物負載進注射，的邊巾將針連接至包含交聯劑的其它注射为可透過25標準規格針直接注射進入肝中及立即交聯以形成水凝膠。

使用在pH 7.4處的CMHA-S與PEGDA I膠囊和活體内注射，因為依交聯劑濃度而定，該乂聯反應在數分鐘或最高1G · 2 G分鐘時間範ϋ内發生。

無、夭鈔H 質（如聚甲殼糖、藻酸鹽、透明質酸、纖隹蛋白月膠和_多合成的聚合物)可足夠作為用於注射之生物材料。這此ϋ并風六二物資經常透過包括熱凝膠化、光交聯或化予乂聯之方去固化。該細胞懸浮液亦可以可溶的信號或特定的基質組分補* 用兄。因為這些植入物可相當容易地注射進入目標區域中，料對k入性手術無（或最小）需求，此減低成本^、患者'不、备 ·、、感染危險及疤形成。CMHA亦由於其長持、、效應同時維持生物相容性而可使用於可注射物質而用於組織工程。交哪方法亦維持該物質的生物相容性，及其存在於再生轉/袓代棲所的廣大區域中，使得其為一種有吸引力的可注射物質。在某些昱脚盘，體貫例中’在該植入物將以生物相容及可生 29 201202424 物降解的覆蓋物(“轉編帶’，)固定之情況中，可將植入物設十成放置到器宫或組織之表面上。對某些腹部器官來*兒，此覆蓋物可來自自體組織。例如’可藉由使用宿主繫膜形成左射k來元成將肝細胞（例如，肝祖細胞)植入到肝之矛面上。該繫膜係從其在腹腔内的場所移出及使用外科用膠(例如纖維蛋白膠、得美棒(dermabond))黏著到肝上以形成用於该移植物質的袋。可再次使用雙筒注射器將該基質物質注射在肝的外部上之袋内。同樣地，可在繫膜袋（與標的組織各自獨立）中形成植入物。例如，取代將移植物植入到標的組織中或上，可對異位位置使用該植入方法。該植入物可在繫膜袋中建立此袋將由纖維蛋白膠（或同等物)形成。當宿主肝確實地結疤或具有某些其它參數（其將阻礙植入物成功進入組織其自身中）時，此方法可特別合適於肝植入物。另一個實施例為内分泌細胞(例如，胰島），其具有能夠進入血管供應的主要需求。内分泌細胞(諸如，胰島）的植入物可被製成繫膜袋。本發明家已學習到KM-HA水凝膠的挺度、黏彈性性質及黏度可依CMHA-S及PEGDA含量而定。例如，尺河七八水凝膠遍及寬廣的強制頻率範圍維持固定的挺度，同時具有完美的彈性行為（第2ag])及剪稀，其中其黏度隨著強制頻率增加而減少（第2b圖）。這些km-HA水凝膠可隨著不同的 PEGDA及CMHA-S濃度（當在經緩衝的蒸餾水中混合時）產生範圍從11至3500巴斯卡之剪切模量，但是這些值可藉由使用多種基礎媒質（如久保田媒質）調節（第2圖及第〖丨圖）。

S 201202424 接種欲移植的細胞之ECM的機械性質可在發信、運輸上，及在細胞對機械力量的反應（使用共同已知為力學傳導 (mechanotransduction)的機制）之能力上具有深遠的效應。例如’人類肝祖細胞(諸如’肝幹細胞）當接種在機械上堅硬的植入物（諸如，在具有降伏剪切模量(yield shear moduli)範圍從11至3500巴斯卡與不同PEGDA及CMHA-S濃度的硬HA 水凝膠（當在經緩衝的蒸館水中混合時）内）中時，其可分化 (第2圖）。根據讓其當宿主的KM-HA水凝膠之組成物，肝幹細胞聚落具有明顯的新陳代謝活性。對遍及培養的肝功能指示劑（AFP、白蛋白及尿素）來說，可貫穿KM-HA調配物比較絕對分泌；但是’與新陳代謝效率結合之絕對分泌則描出與HA含量相依的選擇方法（第12圖）。在此方法中，對具有 CMHA-S含量低於1.2%的KM-HA水凝膠來說，分泌速率在新陳代謝脅迫下增加；比較上，在具有更多CMHA-S(1.60/〇) 及較高的新陳代謝功能或甚至增加的生存能力之KM-HA 水凝膠中（如在調配物E中般），分泌速率比較差（第3d圖）。因為hHpSCs及hHBs具有不同的新陳代謝能力，可對肝祖細胞之擴展或分化選擇KM-HA水凝膠。分化標記在肝祖細胞中的表現性分析證實在KM-HA 水凝膠内發生分化，如由EpCAM的整體基因表現增加超過對在塑膠板上的hHpSC聚落所建立之程度（第5圖），和異質性NCAM表現性遍及聚落朝向外界限及在外部細胞的頂面 (apical surface)上（第4圖）明瞭。已發現CD44以mRNA表現程 31 201202424 度表現在hHpSCs及hHBs二者上（第5圖）。不像NCAM，在 1.2%或較少CMHA-S含量的KM-HA水凝膠中觀察到較大的 CD44表現性(第4圖）。 mRNA表現程度依KM-HA水凝膠的挺度而定（第5 圖），此在挺度上的依賴性定義出二種工作狀態（一種在低植入剛性處，其中基因表現隨著挺度增加而減少，及其之一為在具有|G*|>200巴斯卡的高植入剛性處，其基因表現恢復）。該效應對E-弼黏附素（cadherin)甚至更激烈：經過 |G*|=200巴斯卡附近的分叉缺乏蛋白質表現性，雖然強的 mRNA表現程度與較軟的水凝膠那些相配，其中有£_鈣黏附素的蛋白質表現性。（第4圖）。因此，已認為直接曝露至外部機械力量的細胞能夠在聚落的外部表面處將信號連通至眺連細胞。在此方法中’藉由顯示出E-鈣黏附素表現性的轉變控制與環境挺度相依’在hHpSCs中的發信機制可與其共同適應於其基材的挺度之能力連結。因此，在hHpSCs中的基因 -至•蛋白質轉換方法接受挺度依賴性分叉準則。在KM-HA水凝膠中培養的hHpSC聚落之基因表現性變化建議在這些3D環境中逐步分化。最顯著的是，在本培養模型中的分化可在缺乏生化補充時發生。這些結果指示出置於多種KM-HA水凝膠中的hHpSCs在靜置培養1星期内顯示出分化成中間hHB譜系。極冷保藏在本發明的另一個具體實例中，可使用HA凝膠與習知

S 32 201202424 的極冷保藏方法來產生優異的保藏及在解凍後之生存能力。該方法的綜述顯示在第6圖中。不由理論佔據或限制，咸信内含HA藉由刺激黏附機制（例如，整合素@丨的表現性）改善保藏，其使細胞之培養及解凍後保存功能容易。HA濃度範圍以0.01至1重量百分比為較佳，及以〇_5至0.10%為更佳。除非其它方面有定義，否則於本文中所使用的全部工藝及科學用語皆具有與通常由一般技藝人士所了解者相同且本發明適用之意義。於本文中所提到的全部公告、專利申請案、專利及其它參考資料其全文以參考方式併入本文。在衝突的情況中，本專利說明書（包括定義）將控制。此外’物質、方法及實施例僅有闡明用及不想要限制。現在，將以下列闡明性實施例詳細描述本發明；但是，本發明的範圍不想要及應該不限於下列所例示之具體實例。實施例1 根據所報導的協定，從宿主C57/BL6老鼠(4-5週）分離出老鼠肝祖代細胞。對“植入，，研究來說，將GFp報導子引進該肝祖代細胞中。然後，將細胞與透明質酸(HA)水凝膠混合，及在引進實驗老鼠中之前，該HA與聚二丙烯酸（乙二醇）酯 (PEG-DA)父聯。對引進/移殖來說，以氣胺酮(9〇_12〇毫克/ 公斤）及甲苯噻畊(1〇毫克/公斤）麻醉老鼠及打開其腹部。然後，將細胞(含或不含HA)慢慢注射進前肝葉中。閉合切口位置及每12小時對動物提供〇 ·丨毫克/公斤的丁基原啡因 (bUpren〇rphine)48小時。在48小時後，讓動物安樂死，及移出組織、固定及切片用於組織學。 33 201202424 為了測里在老鼠模型中的細胞定位，在3rc下以表現出％光酶之腺病毒載體在％⑽下感染‘，照”肝祖代細肊4 J寺如上所述進行存活手術，及將細胞（Μ π6)直接主射進肝f巾（含或不知八）。僅在祕前，以料素皮下庄射老鼠’由移植的細胞產生勞光信號。使用IVIS動力學光學成像器測量細胞在老鼠内的定位。結果在24小時處’在肝及肺二者中發現經注射不含HA植入的對,、，、、細胞。但是，在72小時處，大部分細胞無法被固定而僅有少數可辨認的細胞殘餘在肝中。相較之下，根據本發明所m細胞經觀察在24及72小時二者處皆為成功整合進入肝中的細胞群’甚至在二週後仍然存在。亦看見經由此幹細胞棲所植人物移植的細誠乎專門局限在肝組織中且未在其它組織中發現（藉由在隨機化組織樣品上試驗)(第7圖）。實施例2 根據所報導的協定，從胎兒肝組織（16-20週）中分離出人類肝祖代細胞。將表現出發光酶的腺病毒載體引進肝袓代細胞中。然後，在引進實驗老鼠中之前，於交聯劑聚二丙稀酸（乙二醇）S旨(PEG-DA)存在下，將細胞與經硫醇改質的羧曱基HA(CMHA-S)混合。更特別的是，水凝膠係藉由下列方式建構：將HA乾試劑溶解在1〇4中以提供2.0%溶液 (重量/體積）’及將交聯劑溶解在KM中以提供4.0%重量/體積溶液。然後，允許在37°C水槽中培養樣品以完全溶解。

S 34 201202424 在農度i.g毫克/讀下製備膠原質⑴及板素，且與比率i: 4 的交聯劑/水凝膠摻合。對引進/移殖來說’以氯胺_(9G-12G毫克/公斤）及曱苯售義毫克/公;m醉以及打開其腹部。然後，將該細 3或不3 HA) If慢注射進前肝葉中。閉合切口位置及每 12小時對動物提供W毫克/公斤的丁基原啡因48小時。對肝損傷模型來說，在〇.6微升/克下ιρ給藥―次劑量的四氣化碳 (CC14)在48小時後’讓動物安樂死及移出組織固定及切片用於組織學。為了測量細胞在老鼠模型中的定位，在抓下以表現出發光酶⑽財絲在5() p町‘對照，，肝祖代細心Μ 4上所料行存活手術，及將細胞（M 5E6)直接注射進肝葉中（含或不含HA)。僅在成像前，以螢光素K鹽 (150毫克"A斤奶主射老鼠，由移植的細胞產生螢光信號。使用IVIS動力學的光學成像器之後測量在老鼠内的細胞定位10-15分鐘。（第7圖）。 ;第天寺°平估在老鼠也清中所分泌的人類白蛋白之濃度程度’以測量所移植的人麟祖代細胞之功能。藉由、、、’。&肆菜過氣化酶的螢光探針(nU〇r〇pr〇beS)及比色法在45G奈米處的吸收度來測量白蛋白產物。（第8圖在第7天時，從老鼠移出組織樣品及在4%PFA中固定2天，並貝了存於70/〇乙醇中。染色5微米厚切片用於組織學檢驗。結果在第7天時’採取血液樣品及移出組織及固定用於組織 35 201202424 ^在損傷模型對健康模型中，於a清白蛋自巾觀察到稱曰加及HA植入方法亦顯示出增加（當與來自缺乏的細胞懸浮液之結果比較時)（第8圖）。來自經CC14處理的老鼠之組織對人類白蛋白染色。已發現經由植人方法，制HA移植的細胞在宿主細胞内聚集及維持移植的細胞之大細胞主體。但是，經由細胞懸浮液移植的細胞產生小的團聚而遍及肝分散。實施例3 從胰組織中分離出人類胰袓代細胞。將表現出發光酶的腺病毒載體引進祖代細胞中。，然後，於交聯劑聚二丙稀酸（乙二醇）醋(PEG_DA)存在下，讓該細胞與經硫醇改質的羧甲基HA(CMHA-S)混合(如在實施例2中所描述）。對引進/移殖來說，以氣胺酮(9〇_i2〇毫克/公斤）及曱苯„塞丼(1〇毫克/公斤）麻醉老鼠及打開其腹部。然後，將該細胞(含或不含HA)慢慢注射進胰臟中。閉合切口位置及每12小時對動物提供0.1毫克/公斤的丁基原啡因48小時。在48小時後，讓動物安樂死，及移出組織、固定及切片用於組織學。為了測量在老鼠模型中的細胞定位，在37。匚下，以表現出發光％的腺病毒載體在5〇 ρ〇ι下感染“對照，，祖代細胞 4小時。如上所述進行存活手術，及將細胞（I·〗.5E6)直接注射進胰臟中（含或不含HA)。僅在成像前，以螢光素κ鹽（15〇毫克/么斤）IP注射老鼠，由移植的細胞產生營光信號。使用 IVIS動力學的光學成像器，之後測量細胞在老鼠内的定位 10-15分鐘。

S 36 201202424 結果在24小時處’除了別的器官以外，在騰臟中發現注射不含HA植入的“對照，，細胞。但是，在72小時處，大部分細胞會不ϋ定且僅有少數可辨認的細胞殘餘⑽臟中。相較之下’根據本發明之移植的細胞經觀察在24及72小時二者處皆為成功整合進騰臟中之細胞群，及甚至在二週後仍然存在。實施例4 進行研究以評估接種在水凝膠中的肝幹細胞之生存能力及功能。使用分子探針鈣黃綠素（M〇lecular Pr〇bes Calcein)AM活細胞生存能力配套元件（分子探針(M〇iecuiar Probes) ’尤金奥勒岗（Eugene 〇reg〇n))評估在培養物中的生存能力。薄膜滲透物鈣黃綠素八]^在活細胞中被酯酶切割而產生細胞質的綠色螢光性。測量在丨星期培養期間所分泌的白蛋白、運鐵蛋白及尿素在培養媒質中之濃度程度。簡單地說，收集媒質上層液及冷凍貯存在_2〇°c下直到分析。藉由ELISA，使用人類白蛋白ELISA定量組來測量白蛋白產物。使用血液尿素氮比色試劑來分析尿素產物。以赛脫弗史貝錯馬克斯(cytofluor Spectramax)250多井讀盤器各別地測量全部分析物。結果提供在第9及10圖中。在3週培養後，分析細胞其基因表現性。將mRNA表現性的程度對GAPDH常態化。全部測量皆以倍數變化（與在透明質酸水凝膠中三維培養前 37 201202424 的初始肝幹細胞聚落比較)表現出。在二實驗透明質酸培養條件（HA及HA+膠原質III+板素）中，在EpCAM(7 72±1 42 , 9.04士1.82)及白蛋白（5.57±0.73,4.84±0.84)上有明顯增力口（當與初始聚落表現性比較時）。在二條件下，在肝母細胞分化標記AFP上亦有明顯減少（〇.55±0.11，〇.17±〇.〇3)。此外， HA+CIII+Lam條件顯示出在AFP表現性上明顯減少（當與基本HA培養比較）。實施例5 評估含有多種HA及PEGDA濃度的HA水凝膠在無血清媒質中培養之埋置的hHpSCs上之機械性質的效應。所使用的調配物總整理在下列表3中：最後含量 (4 :丨分配） PEGDA初始溶液含量(1份） 2.0%(w/v) 4.0%(w/v) 6.0%(w/v) 8.0%(w/v) CMHA-S 初始溶液含量 (4份） 1.0% (w/v) 調配物A CMHA-S 0.8%(w/v) PEGDA 0.4%(w/v) CMHA-S 0.8%(w/v) PEGDA 0.8%(w/v) CMHA-S 0.8%(w/v) PEGDA 1.2%(w/v) 調配物B CMHA-S 0.8%(w/v) PEGDA 1.6%(w/v) 1.5% (w/v) CMHA-S 1.2%(w/v) PEGDA 0.4%(w/v) 調配物c CMHA-S 1.2%(w/v) PEGDA 0.8%(w/v) 調配物D CMHA-S 1,2%(w/v) PEGDA 1.2%(w/v) CMHA-S 1 _2%(w/v) PEGDA 1.6%(w/v) 2.0% (w/v) 調配物E CMHA-S 1.6%(w/v) PEGDA 0.4%(w/v) CMHA-S 1,6%(w/v) PEGDA 0.8%(w/v) CMHA-S 1.6%(w/v) PEGDA 1.2%(w/v) 調配物F CMHA-S 1.6%(w/v) PEGDA 1.6%(w/v) 藉由以4 : 1比率混合經硫醇改質的羧甲基HA(CMHA-S) 與聚二丙烯酸（乙二醇）酯（PEGDA)溶液達成用於每種調配物的最後KM-HA水凝膠組成物。在特定的CMHA-S及 PEGDA濃度下，於pH 7.4下，分別在KM中混合特定濃度的 CMHA-S及PEGDA乾試劑，及在37°C下加溫30分鐘以提高

S 38 201202424 乾試劑之溶解。在無菌條件下，於培養器中，在5%C02/ 空氣混合物中及37°C下發生最大水凝膠交聯（沒有額外的媒質）1小時。之後，以2.5毫升HK媒質補充水凝膠及在測試前培養過夜。對擴散性試驗來說，藉由渦動均質化水凝膠調配物及將其鋪平成〜1毫米厚。在無菌條件下，於培養器中，在 5%C02/空氣混合物中及37°C下培養該水凝膠（沒有額外的媒質）1小時，以允許在混合後最大交聯。然後，以相等體積的額外KM(以2.5毫克/毫升（0.036 mM)結合螢光黃的 70-kDa葡萄聚糖分子補充)補充樣品，允許在測試前，於培養過夜期間擴散進入樣品中。使用在光漂白（FRAP)系統後的螢光性恢復來測量HA 水凝膠之擴散係數。為了成像目的，在平衡至室溫後，於樣品上進行“在井内（in-well)”測試，沒有先前抽吸以D70補充的KM。每個樣品測試總共5個光漂白斑點各別3〇秒（13.5 毫瓦，458/488奈米激發氬雷射，漂白的幾何形狀：直徑35 微米圓形）’及早一早向掃描漂白前的影像，立即在光漂白結束後單一單向掃描影像，及之後，透過單一管道(Lp 505 奈米，綠色發射管道）’於處理後以4.0秒延遲區間獲得28 個單向掃描時間系列影像(256x256畫素框尺寸，0.9微米/ 畫素解析度）。結果 KM-HA水凝膠的挺度、黏彈性性質及黏度依cmhA-S 及PEGDA含量而定。KM-HA水凝膠貫穿寬廣的強制頻率範 39 201202424 圍維持固定的挺度，同時具有完美的彈性行為及具有剪稀 (如其黏度隨著強制頻率增加而減少）。CMHA-S及PEGDA 的含量控制KM-HA水凝膠之機械性質（第11a圖）。比較上， KM-HA水凝膠的擴散性質最理想，因為它們可與單獨的久保田媒質比較（第lib圖）。將肝幹細胞聚落與KM-HA水凝膠混合，及其開始拋棄平面組態而偏愛團聚成球形體似的結構或折疊成複雜的3D 結構(二者皆為分化的跡象）。在培養1星期後，細胞形態變成多樣化及某些細胞尺寸擴大至約15微米（其為hHBs的特徵）。以抗體對hHpSCs及hHBs之細胞表面標記（如EpCAM、 CD44及CDH1)進行免疫染色來證實分化。遍及培養，在全部KM-HA水凝膠的測試組成物中， hHpSCs所分泌的AFP及白蛋白濃度增加，同時第7天時，在全部KM-HA水凝膠中之尿素合成平衡至可比較的程度（第 12圖）。在培養1星期後’在接種於KM-HA水凝膠内的hHpSC 聚落細胞中，EpCAM之mRNA表現性程度明顯高於2D生長的hHpSC聚落或新鮮分離的hHBs那些。對在KM-HA水凝膠中的hHpSCs來說，NCAM、AFP及E-鈣黏附素（CDH1)之 mRNA表現性程度亦與2D生長的hHpSC聚落那些明顯不同。（第5圖）。 hHpSCs的分化標記(Ncam、AFP、CDH1)及hHpSCs 與hHBs的常見標記(CD44、EpCAM)之基因表現性的定量測量顯示出’隨著KM-HA水凝膠挺度增加而逐漸減少（對 |G*丨<200巴斯卡來說)及之後恢復（第5圖）。來自全部水凝膠

S 40 201202424 3周配物的細胞皆表現出EpCAM、NCAM及CD44蛋白質；但疋’在含有1 _2%CMHA-S或較少的km-HA調配物中，CD44 顯露出萄含化，然而NCAM在全部km-HA水凝膠中仍然富含。（第4圖）。實施例6 评估Η A改善黏附機制的保存（其可使培養細胞容易及解凍後保存功能）之效應。從胎兒肝中分離出新鮮分離的 hHpSCs及肝母細胞，且將其極冷保藏在一些不同極冷保藏緩衝液(含或不含0.5或0.10〇/。透明質酸(HA)補充)之一中。更特別的是，在2xl06細胞/毫升下，在包含以1〇%DMS〇或克萊歐斯特TM-CS10(生物生活溶液）補充且含有〇、〇〇5或〇·1〇%ΗΑ水凝膠（以重量計）的培養媒質之極冷保藏溶液中冷凍該樣品。在冷凍前，於未交聯的HAt，以經控制的方式允許該等細胞在4。(：下於極冷保藏溶液中平衡1〇分鐘，如顯示在第13圖中。在解凍後，將該等細胞鋪平到以膠原質见塗佈（以丨微克/平方公分)之組織培養板上，以促進幹細胞附著。結果全部測試的緩衝液皆在解凍時產生高生存能力 (80-90%)(第14圖）。但是，以HA補充顯示出在被保藏的細胞附著至組織培養表面及被培養之能力上相當大地改良。在以小量透明質酸(0.05或〇.丨〇%)補充的cs丨〇等滲壓媒質中極冷保藏之細胞觀察到最好結果。研究結果顯露出在無血 /月條件下極冷保藏新鮮分離的人類肝袓細胞之經改良的方 201202424 法’對幹細胞銀行業來說，在研究及潛在的治療應用二者上提供更有效率的方法。 /則量細胞-細胞及細胞_基質黏附因子的表現性。可在第 15圖中看見在極冷保藏的樣品中之細胞黏附分子的基因表現性曲線圖之總整理。在cs丨〇+〇〇5%HA中冷凍之樣品中看見整合素W的最高表現性(0·130±0·028，n=28)。當與在新鮮樣品中看見的表現性（〇〇69±〇〇〇7，n=24，p<〇〇1)比較時’此明顯不同。同樣地，在〇31〇+〇.1%似(0.049±0.0〇6, !1=20)及〇810+0.05%以(0.064±0.003，11=16)中冷凍的細胞中之CDH-1(E-鈣黏附素）表現性顯示出在表現性上明顯增加（虽與新鮮樣品（0.037±.005，n=36，p<〇.〇5)比較時）。雖然本發明已經與其特定具體實例銜接來描述，將要了解其能進一步改質且本申請案想要涵蓋遵循本發明之任何變化、用途或改變。通常來說，本發明的原理及包括來自本揭示之此偏差落入本發明所涉及的技藝之已知或常用的實施中，及可應用至在上文中提出的基本特徵及如下在附加的申請專利範圍之範圍中。 C圖式簡單説明3 第1圖係根據本發明將細胞植入至多種標的組織的方法之圖式。這些方法包括可植入的植入物、可注射的植入物及可貼到標的器官表面上的植入物（“黏膠繃帶（bandaid) 植入物”）。第2圖提供以久保田（Kubota)媒質製備的透明質酸 (KM-HAs)之流變測量。a)對所測試的每種調配物來說，當

S 42 201202424 黏彈性阻尼|G”/G’|(在外部施力後，變形反應延遲的度量) 在〇·ι赫茲-ίο赫茲強制頻率範圍内可忽略時，km他之剪切模數|G*|(機械凝膠挺度的度量)保持固定；誤差槓：在每個測試頻率處的度量之95%信賴區間。b)遍及實驗〇.6 p秒 -60 1/秒的剪切速率範圍[〇1赫兹_1〇赫茲強制頻率]， KM-HAs具有剪稀(即’黏度隨著強制頻率增加而減少广上及下限：以乘冪律模型為基礎的95%信賴區間（科克斯-梅爾姿（Cox-Merz)規則假設，對全部調配物來說，在〇 3丨/秒_3〇 1/秒的剪切速率範圍[0.05赫茲_5赫茲強制頻率]内， R2>0.993)。僅有在表3中顯示出之標有字母的調配物上進行流變測量。第3圖顯示出人類肝幹細胞(hHpSCs)在KM_HAs中的大小、形態及增殖資料。hHpSCs的聚落獲得三維組態及在接種於KM-HAs中之後具有a)球形體似的團聚物（底部左）或折疊（中間、上部右）[影像框：9〇〇微米χΐ200微米]。在接種 hHpSC的KM-HAs之組織學切片上的共焦顯微鏡顯露出，於培養1星期後’在實質細胞[細胞核呈藍色（來自DAPI對比染色）’ EpCAM呈紅色（對b)及c)二者來說），綠色（對b)CD44 或c)CDHl來說）；b)及c)的影像框：15〇微米xi5〇微米；在 b)及c)中強調的白色：15微米xi5微米]當中，混合的細胞形態表現型具有細胞尺寸b)約7微米，或c)最高10-15微米。 d)hHpSCs在KM-HAs中的生存能力（藉由阿拉瑪藍 (AlamarBlue)新陳代謝減少測量），遍及1星期的培養，在含有1 _6%CMHA-S及〇.4%PEGDA的KM-HA水凝膠（調配物 43 201202424 E，表3)中顯露出功能恢復及增殖；在24小時培養後之阿拉瑪藍減少測量已相對於在接種後2-3天的測量常態化；資料以平均土標準誤差報導。第4圖提供在接種於KM-HA的hHpSCs中之分化標記於 1星期培養後的蛋白質表現性。對在hHpSCs中的分化標記來說，hHpSCs的聚落因為與KM-HAs性質相依之轉譯程度而具有差別的表現性程度。人類AFP之新陳代謝分泌速率遍及KM-HA調配物皆與mRNA表現程度相關聯。NCAM表現性在全部KM-HAs中皆為正，同時CD44表現性在具有 CMHA-S含量1.2%或較少的KM-HAs(標有字母的調配物 A、B、C'D，表3)中最豐富。CDH1表現性對具有|G*|<2〇〇巴斯卡的KM-HA水凝膠來說為正，及對|G*|>200巴斯卡來說為負。人類AFP分泌速率的資料以平均士標準誤差報導。在15-20微米切片（〜2至3 hHpSCs厚；hHpSC直徑：5-7微米）上進行EpCAM、NCAM、CD44及CDH1之免疫組織化學染色’及藉由螢光性顯微鏡造像[影像框：1〇〇微米xl〇〇微米]。KM-HA調配物以相關增加的挺度排序（對a來說， |G*卜25巴斯卡·’對B來說，|G*卜73巴斯卡；對e來說， |G*|=140巴斯卡；對C來說，|G*|=165巴斯卡；對!>來說， |G*|=220巴斯卡；及對F來說，|G*丨=520巴斯卡）。第5圖提供在KM-HA生長的hHpSCs中之肝祖代標記在 1星期培養後的基因表現程度(藉由qRT-PCR)。在hHpSCs與其直接後代hHBs的標記之mRNA表現程度（肝特定的afp、

EpCAM ' NCAM、CD44及CDH1)間的比較顯示出，km-HA

S 44 201202424 生長的hHpSCs在消極培養1星期中，於轉錄程度上獲得早期hHB特徵。在hHpSCs及新鮮分離的hHBs中，對CD44之表現性範圍可比較；剩餘標記的表現程度統計上可區別，其在EpCAM上減少大約2倍，在hHpSCs分化成hHBs後的 CDH1、NCAM壓制及AFP富含化上減少3倍。在全部 KM-HAs中，接種的hHpSCs對AFP、NCAM及CDH1之平均表現程度朝向hHB範圍偏移至hHpSC範圍外，同時EpCAM 表現性在1星期培養後遍及各處富含化。KM-HA調配物以相關增加的挺度排序（對A來說，|G*|=25巴斯卡；對B來說， |G*|=73巴斯卡；對E來說，|G*|=140巴斯卡；對c來說， |G*|=165巴斯卡；對D來說，|G*|=220巴斯卡；及對ρ來說， |G*|=520巴斯卡）。表現程度（平均土標準誤差）係相關於 GAPDH常態化。在標有字母的KM-HA調配物中之測量（表 3)係比較hHpSC聚落（綠色）及新鮮分離的hHBs(紅色）之顯著性(學生T檢定）。第6圖為所揭不的極冷保藏及解;東方法之一個且體實例的圖式。第7圖顯示出來自由螢光素製造細胞（與透明質酸植入對以細胞懸浮液注射二者）所產生的螢光信號之活體内即時成像的結果。第8圖提供在健康及CC14肝損傷模型二者中，於移殖後第7天處，在植入對細胞懸浮液中的血清人類白蛋白。第9圖顯示出肝幹細胞表現型標記的基因表現。表現程度已對GAPDH表現常態化，及倍數變化已對在聚落中的初 45 201202424 表見常t、化。*代表在貫驗條件與初始聚落表現間之顯著 !·生ρ<0·05 /〇。“代表在貫驗條件與初始聚絲現間之顯著性和在二種實驗條件間之顯著表現性ρ<〇〇5%。第10圖提供來自肝功能之功能性試驗隨著時間的資料。每細胞在三維透明質酸培養中之Α)白蛋白、Β)運鐵蛋白及C)尿素隨著時間的程度已常態化。第11圖提供來自KM-HAs的機械特徵之資料。 a)KM-HAs的挺度可控制及依cmhA-S及PEGDA含量而定。平均剪切模數|G*丨隨著CMHA-S及PEGDA含量增加遵循乘冪律行為而增加，從而在初始水凝膠混合期間提供 KM-HAs之最後機械性質的直接控制；僅在顯示於表3中標有字母的調配物上進行流變測量。誤差槓：對在〇〇5赫茲_5 赫茲強制頻率中的測量±1標準偏差。b)在KM-HAs中擴散。 FRAP(70kDa經螢光黃標記的葡萄聚糖）在KM-HAs中的擴散性之測量與單獨久保田媒質沒有明顯不同；在顯示於表3 的全部調配物上進行擴散性測量。誤差槓：測量的95%信賴區間。第12圖顯示出由接種至KM-HAs中的hHpSCs所分泌之人類AFP、白蛋白及尿素。hHpSCs在KM-HAs中的聚落於接種後第7天具有某些肝功能，其在培養媒質(KM)中實測到人類AFP及白蛋白之濃度增加及尿素合成保持平衡。接種後第7天，在KM-HA調配物當中之人類AFP、人類白蛋白及尿素的新陳代謝分泌速率明顯，且在含有1.6%CMHA-S及 0.4%PEGDA的KM-HAs中（調配物E，表3)之AFP、白蛋白具

S 46 201202424 有最小速率及尿素合成減少。左列：在對每種標有字母的調配物（表3)培養24小時後，於每日收集的培養媒質中之代謝物濃度。右歹:在24小時培養後，於培養媒質中之每個 hHpSC聚㈣代謝物質分泌速率；在媒f中之總代謝物質已對在每個區間之功能性hHpSC聚落數常態化，如藉由生存能力試驗與阿拉瑪藍減少來計算（每個樣品接種的聚落大約數目：12)。全部資料皆以平均±標準誤差報導。第13圖顯示出經控制的速率冷凍程式減少液體-冰相熵防止内部冰損傷及允許可重覆的冷凍。A)曲線圖顯示出關於樣品溫度的艙溫（1〇%DMSO)。B)使用於克萊歐美 (Cryomed)lOlO系統的冷凍程式速率。第14圖提供二者(a )經極冷保藏的胎兒肝細胞解凍後之細胞生存能力％ ;及㊉)在每種條件下培養3週後的聚落計數，已對新鮮樣品常態化。結果以平均士平均的標準誤差報導。KM=含有1〇%DMSO及10%FBS的久保田媒質。CS10= 克萊歐斯特(Cryostor)，CS10+sup=含有KM補充品的克萊歐斯特10。0.05%及〇. 1 〇%指為在每個樣品中所補充的HA%。第15圖顯示出已對GApdh表現性常態化的相對mRNA 表現性。平均±平均的標準誤差。對新鮮樣品來說，顯著性 *p>0.05。KM=含有1〇%DMSO及10%FBS的久保田媒質。 CS10=克萊歐斯特，csi0+sup=含有KM補充品的克萊歐斯特10。0.05。/。及0.10%指為在每個樣品中所補充的ha%。【主要元件符號說明】 (無） 47

Claims

201202424 七、申請專利範圍： 1. 一種將内臟之細胞移植在具有内臟呈生病或不正常狀態的患者中之方法，其包括： a·從一供體獲得正常的内臟細胞； b. 結合該等細胞與一或多種形成凝膠之生物材料，以形成一混合物； c. 選擇性結合該混合物與培養基、發信分子、細胞外基質蛋白質或其組合； d_將步驟(b)的混合物引進患者中；其中在步驟(d)中所引進的細胞之實質部分活體内定居在内臟的至少一部分中或上。 2. 如申請專利範圍第旧之方法，其中該正常細胞係幹細胞、定向袓細胞或成熟細胞。 3. 如申請專利範圍第丨項之方法，其中該内臟係肝、肺、消化道、腸、心、腎、膽樹、曱狀腺、胸腺、曱狀腺、腦或騰臟。 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該内臟係肝。 5. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該細胞的懸浮液係肝幹細胞、肝母細胞、膽管上皮細胞或肝細胞的定向祖細胞、或成熟肝細胞或膽管細胞。 6. 如申請專利範圍第！項之方法，其中該供體係具有内臟呈生病或不正常狀態的患者，及該正常細胞係從非生病或非不正常的内臟之一部分獲得。如申清專利fclS第1項之方法，其中該供體係非自體供體。 S 48 201202424 8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該供體係胎兒、新生兒、兒童或成年人。 9. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該額外的細胞包括血管母細胞、内皮細胞、星狀細胞前身、星狀細胞、基質細胞、上皮幹細胞、成熟實質細胞或其組合。 10. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該一或多種生物材料包括膠原、基膜素、黏附分子、蛋白多醣、透明質酸、葡萄糖胺聚合醣鏈、聚曱殼糖、藻酸鹽、及合成、可生物降解及可生物相容的聚合物、或其組合。 11. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該發信分子包括纖維組織母細胞生長因子、肝細胞生長因子、表皮生長因子、血管内皮細胞生長因子(VEGF)、類胰島素生長因子 I、類胰島素生長因子II(IGF-II)、抑制瘤素-M、白血病抑制因子(LIF)、白細胞介素、轉化生長因子-P(TGF-P)、 HGF、運鐵蛋白、胰島素、運鐵蛋白/fe、三碘甲狀腺素、 T3、升血糖素、葡萄糖皮質素類、生長激素、雌激素、雄性激素、曱狀腺激素及其組合。 12. 如申請專利範圍第11項之方法，其中該白細胞介素係 IL-6、IL-11、IL-13或其組合。 13. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞係在無血清媒質中培養。 14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該媒質包含胰島素、運鐵蛋白、脂質、妈、辞及石西。 15. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該内臟的細胞之懸 49 201202424 浮液在將細胞引進患者前，於該生物材料中體外固化。 16. 如申請專利範圍第1項之方法，其中將該細胞的懸浮液引進至生病或不正常組織或鄰近。 17. 如申請專利範圍第16項之方法，其中該細胞的懸浮液直接引進組織中。 18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該組織係繫膜或肝。 19. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞的懸浮液係經由注射、可生物降解的覆蓋物或用海綿引進。 20. —種修復患者中内臟組織的方法，其中該内臟呈生病或不正常狀態，該方法包括： a. 從一供體獲得内臟的正常細胞之懸浮液； b. 結合該細胞懸浮液與一或多種生物材料； c. 選擇性結合該細胞懸浮液與生長因子、細胞素、額外的細胞或其組合；及 d. 將步驟(b)或(c)的懸浮液引進該患者中；其中在步驟(d)中所引進的細胞之實質部分活體内定居在該内臟之至少一部分中或上。 21. —種極冷保藏細胞的方法，其包括： a. 獲得欲移植的細胞； b. 結合該細胞與形成凝膠之生物材料，以形成一混合物； c. 選擇性結合該混合物與一或多種等滲壓培養基、發信分子及細胞外基質組分； d. 冷;東該混合物。 S 50 201202424 22.如申請專利範第1項之方法，其巾1一志夕 & # 料包括膠原、— *〒忒或夕種生物材试让土、素、黏附分子、蛋白多醣、锈日日辦酷、葡萄糖胺聚合^ 物降解及可生物，喿ι及合成、可生 23 合的聚合物、或其組合。 z j.如甲清專利範圍第）明質酸。 2項之方法，其中該生物材料包含透 24. 如申請專利範園第步與選自於由下、，，其中該細胞懸浮液進〆亞石風_犯）、^組成之群的冷凌保護劑結合：二甲 '由、乙二醇、ethaediol、1，2_丙二醇、 J _ \ 甲納 1其塞太a 胺、Ν_甲基曱醯胺、3_甲氧基-1，2-兩一醇其專本身及其組合。 25. 如申請專利範園步與下列結合:：方法’其中該細胞懸浮液進〆丙酮酸鹽、細胞胺酸、丙胺酸、聚乙埽抑定嗣、 L/周亡抑制劑、鈣、乳糖酸鹽、蜜三糖、迪皮吳酵、還原的备稼的鈉離子、膽鹼、抗氧化劑蒙或其組合。項之方法，其中該搪係漏蘆糖、果 26·如申凊專利範圍第25 糖、葡萄糖或其組合 27.如申請專利範圍第25項之方法，其中該抗氡化劑係維他命E、維他命Α、β _胡蘿蔔素或其組合。 28· 一種包含與—或多種生物材料混合以形成—植入物的細胞之組織植人物’其中該植人物的組分具有剪切模量範圍從25至520巴斯卡。 29.-種將内臟細歧位到標的内臟之表面上、進入内部部 51 201202424 分中或一者之方法，其包括於有效量的交聯劑存在下，將一包含内臟細胞與一或多種形成水凝膠的前驅物之溶液的製劑引進到活體内標的内臟之表面上、進入内部部分中或二者，其中該製劑在標的内臟之表面上、内部部分中或二者形成一包含内臟細胞的水凝膠。 3 0 ·如申請專利範圍第2 9項之方法，其中該内臟細胞定位到標的内臟之表面上、進入内部部分中或二者一段時期至少12 小時、至少24小時、或至少約48小時、或至少72小時。 31.如申請專利範圍第29項之方法，其中該内臟細胞非為腫瘤或癌細胞或生病的細胞。 32·如申請專利範圍第29項之方法，其中該内臟細胞係正常細胞、腫瘤或癌細胞、或受選自於由病毒、細菌、瘧疾所組成之群的病原體感染之細胞。 33_如申請專利範圍第29項之方法，其中該一或多種形成水凝膠的前驅物包括葡萄糖胺聚糖、透明質酸、蛋白多酿 (proteoglycand)、明膠、膠原、基膜素、其它附著蛋白質、植物衍生的基質組分、其變性形式或其組合。 34. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該一或多種形成水凝膠的前驅物包含經硫醇改質的玻尿酸鈉及經硫醇改質的明膠。 35. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該交聯劑包含聚二丙烯酸乙二醇酯或其含二硫之衍生物。 36. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該水凝膠擁有黏度範圍從約0.1至約1〇〇千巴斯卡，以約〖至約1〇千巴斯卡為 S 52 201202424 較佳，以約2至約4千巴斯卡為更佳。 37. 如申請專利範圍第29項之方法，其中於有效量的交聯劑存在下，將該製劑引進至形成在標的内臟之表面上的囊中。 38. 如申請專利範圍第37項之方法，其中該囊係由繫膜、蜘蛛絲及/或昆蟲絲製備。 39. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該標的内臟係選自於由下列所組成之群：肝、胰、膽樹、曱狀腺、腸、肺、前列腺、乳房、腦、子宮、骨頭或腎臟。 40. 如申請專利範圍第29項之方法，其中該水凝膠就地形成。 53