TW201200129A - Nicotinic receptor non-competitive modulators - Google Patents

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201200129 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於作為非競爭性調節劑（例如非競爭性拮抗 劑）調節菸鹼受體之化合物、該等化合物之合成方法、使 用方法及其醫藥組合物。 【先前技術】 菸鹼受體為異位調節其功能之大量外源及内源化合物之 目標。參見Arias，H· R·, Binding sites for exogenous and endogenous non-competitive inhibitors of the nicotinic acetylcholine receptor, Biochimica et Biophysica Acta - ⑽es 1376: 173-220 (1998)及 Arias, H. R·，Bhumireddy, P., Anesthetics as chemical tools to study the structure and function of nicotinic acetylcholine receptors, Current Protein & Peptide Science 6: 451-472 (2005)。菸鹼受體之功能可由稱為非競爭性調節劑（包括非 競爭性拮抗劑）之結構不同的化合物降低或阻斷（由Arias， H.R., Bhumireddy, P., Bouzat, C., Molecular mechanisms and binding site locations for noncompetitive antagonists of nicotinic acetylcholine receptors. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 38: 1254-1276 (2006)論 述）。 非競爭性調節劑包含多種結構不同之化合物，其藉由在 不同於正位作用結合位點之一或多個位點處起作用來抑制 受體功能。已證明受體調節極複雜。非競爭性調節劑之作 156332.doc 201200129 用機制及結合親和力在於驗受體亞型中不盡相同C等 人，.2006)。非競爭性調節劑可藉由至少兩種不同機制起作 用.異位及/或立體機制。 異位拮抗劑機制涉及非競爭性结抗劑與受體之結合及不 導電構形狀態，亦即休眠狀態或去敏狀態之穩定，及/或 受體去敏率之增加。 相反’立體機制直接表*為#錢分子以物理方式阻斷 離子通道。該等拮抗劑可稱為非競爭性通道調節劑 (麗)。當受體處於開放狀態時，一些抬抗劑會藉由在孔 隙内結合來抑制受體，由此以物理方式阻斷離子參透。一 些拮抗劑僅充當純開放通道阻斷劑，而其他拮抗劑會阻斷 放及關閉通道。該等拮抗劑經由不涉及正位作用位點之 結合的機制來抑制離子流。 巴比妥酸鹽、分離麻醉劑、抗抑鬱劑及某些類固醇已顯 不會藉由異位機制（包括開放及關閉通道阻斷）來抑制菸鹼 受體。巴比妥酸鹽之研究證實受體之開放與關閉狀態皆出 現結合，從而導致離子流阻斷之模型。參見Dilger, J. P.， Boguslavsky, R., Barann, M., Katz, T., Vidal, A. M., Mechanisms of barbiturate inhibition of acetylcholine receptor channels, Journal General Physiology l〇9： 401-4 14 (1 997)。儘官局部麻醉劑對神經傳導之抑制作用主要 藉由阻斷電壓門控鈉通道介導，但菸鹼受體亦為局部麻醉 劑之目標。參見Arias, H. R·, R〇ie of i〇cal anesthetics 〇n both cholinergic and serotonergic ionotropic receptors, 156332.doc 201200129

Neuroscience and Biobehavioral Reviews 23: 817-843 (1999)及 Arias, H. R· & Blanton, Μ. P., Molecular and physicochemical aspects of local anesthetics acting on nicotinic acetylcholine receptor-containing membranes, Μζ·«ί eevz.ewj C/zemb/rjK 2: 385-410 (2002)。 舉例而言，四卡因（tetracaine)優先結合至呈休眠狀態之 受體通道。臨床濃度範圍内之分離麻醉劑抑制若干神經元 型於驗受體，其實例諸如苯環利定（phencyclidine， PCP)(Connolly, J.5 Boulter, J., & Heinemann, S. F., Alpha 4-beta 2 and other nicotinic acetylcholine receptor subtypes as targets of psychoactive and addictive drugs, British 〇/ 105: 657-666 (1992))、氯胺酮 (ketamine)(Flood, P. & Krasowski M. D., Intravenous anesthetics differentially modulate ligand-gated ion channels, Anesthesiology 92: 1418-1425 (2000)；及 Ho, K. K. & Flood, P., Single amino acid residue in the extracellular portion of transmembrane segment 2 in the nicotinic a7 acetylcholine receptor modulates sensitivity to ketamine, Anesthesiology 100: 657-662 (2004))及地佐環平（dizocilpine)(Krasowski， M. D., & Harrison, N. L.，General anaesthetic actions on ligand-gated ion channels, Cellular and Molecular Life SWewcw 55: 1278-1303 (1999))。研究顯示分離麻醉劑結合 至休眠離子通道中之單個或重疊位點，且表明氯胺酮/PCP 基因座部分重疊受體通道中之四卡因結合位點。地佐環平 156332.doc -5- 201200129 (亦稱為MK-801)為之分離麻醉劑及抗痙攣劑，其亦充當不 同於鹼受體之非競爭性拮抗劑。據報導地佐環平為α4(32神 經元於驗受體之開放通道阻斷劑。參見Buisson，β., & Bertrand, D., Open-channel blockers at the human α4β2 neuronal nicotinic acetylcholine receptor, Molecular Pharmacology 53: 555-563 (1998) ° 抗抑鬱劑除對一元胺及血清素再吸收系統之熟知作用 外’亦顯示會s周郎於驗受體。早先研究顯示，三環抗抑鬱 劑充當非競爭性拮抗劑。參見Gumilar，F., Arias，H.R., Spitzmaul, G., Bouzat, C., Molecular mechanisms of inhibition of nicotinic acetylcholine receptors by tricyclic antidepressants. Neuropharmacology 45: 964-76 (2003) 〇 Gar0ia-Colunga等人報導氟西汀（fluoxetine)(即一種選擇性 血清素再吸收抑制劑（SSRI))以非競爭性方式，藉由增加去 敏率及/或藉由誘導通道阻斷抑制藉由活化肌肉或神經元 於驗受體引起之膜電流。參見Gar0ia-Colunga，J.，Awad，J. N., & Miledi, R., Blockage of muscle and neuronal nicotinic acetylcholine receptors by fluoxetine (Prozac), Proceedings of the National Academy of Sciences USA 94： 2041-2044 (1997);及 Gar6ia-Colunga，J.，Vazquez-Gomez, E.，& Miledi, R.，Combined actions of zinc and fluoxetine on nicotinic acetylcholine receptors, The Pharmacogenomics 4: 388-393 (2004)。先前批准用於治療高血壓之美 卡拉明（Mecamylamine)為經典的非競爭性菸鹼受體拮抗 156332.doc 201200129 劑，且亦熟知會藉由阻斷離子通道抑制受體功能。參見 Giniatullin, R.A., Sokolova, E.M., Di Angelantonio, S., Skorinkin, A., Talantova, M.V., Nistri, A. Rapid Relief of Block by Mecamylamine of Neuronal Nicotinic Acetylcholine Receptors of Rat Chromaffin Cells In Vitro: An Electrophysiological and Modeling Study. Molecular Pharmacology 58: 778-787 (2000)。 【發明内容】 本發明包括式I化合物：

其中 R及R2各個別地為H、Ci·6烷基或經芳基取代之Cw烷 基，或R1及R2連同其連接之氮原子組合形成3至8員環，該

R R、R及尺7各個別地為H、C〗.6烷基或Cw 各個別地為η、Cl·6烷基或Ci6烷氧基； R9各獨立地為H、C丨烷基或C〗.6烷氧基； 156332.doc 201200129 Τ 1 12 2 及L各個別地為選自由以下組成之群的連接基團種 類：CR丨0R丨1、CRi〇RnCRl2Rl3及 〇 ; R R R及R13各個別地為氫或Ci-6烧基；及 虛線表示視情況存在之雙鍵， 或其醫藥學上可接受之鹽。 本發明包括包含本發明之化合物或其醫藥學上可接受之 鹽的醫藥組合物◎本發明之醫藥組合物可用於治療或預防 多種病狀或病症’且尤其是彼等特徵為菸鹼性膽鹼能神經 傳遞之功能障礙或菸鹼性膽鹼能神經元退化之病症。 本發明包括一種在需要該治療之哺乳動物中治療或預防 諸如CNS病症及功能障礙之病症及功能障礙，以及治療或 預防某些病狀，例如減輕疼痛、高血壓及炎症之方法。該 等方法涉及向個體投與治療有效量之本發明化合物（包括 其鹽）或包括該等化合物之醫藥組合物。 【實施方式】 I·化合物 本發明之一實施例包括式I化合物： .

式I 其中 156332.doc 201200129 R及R各個別地為Η、c】_6烧基或經芳基取代之c貌 基，或R及R2連同其連接之氮原子組合形成3至8員環該 %可視情況經Cw烷基、芳基、烷氧基或芳氧基取代基 取代； R3為H、Cw烷基或經（：1·6烷氧基取代之Ci6烷基； R4、R5、R6及R7各個別地為H、Cl 6烷基或Ci6烷氧基； R8各個別地為H、Cw烷基或C,_6烷氧基； R9各獨立地為H、Cw烷基或CN6烷氧基； L1及L2各個別地為選自由以下組成之群的連接基團種 類：CR丨0R丨丨、CRi〇R丨丨cri2rI3及〇 ; R 、Ru、R12及R13各個別地為氫或C16烷基；及 虚線表示視情況存在之雙鍵， 或其醫藥學上可接受之鹽。 在一實施例中，化合物係選自由以下組成之群：N，7a_ 一甲基八氫-4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺及其立體異構體或其醫 藥學上可接受之鹽。 j 一實施例中，化合物為 氫4’7-甲橋-lH_”-3a-胺或其醫藥學上可接受之鹽。 在一實施例中，化合物為（3aR，4R，7S,7aR)-N，7a_:T^ 八氫'7-甲橋-1H_茚-3-胺或其醫藥學上可接受之鹽。土 ,本發明之-態樣包括包含本發明化合物及醫藥學上可接 焚之載劑的醫藥組合物。 本發明之一態樣包括一種治療或預防由神經元菸鹼受體 介導之疾病或病狀之方法，特定言之經由使用非競爭性調 156332.doc -9- 201200129 如非競爭性拮抗劑)’包括(但不通道 =預防由神經元於驗受雜介導之疾病或病狀之方法 该方法包含投與本發明化合物。在 病狀為CNS病症。在另一實 ， 以’、沩或 或發炎反廄h 貫&例中’該疾病或病狀為炎症 另發二反應。在另-實施例中，該疾病或病狀為疼痛。在 :貫施例中，該疾病或病狀為新血管生成。在 :中，該疾病或病狀為高血壓。在另一實施例中，該疾病 或病狀為本文所述之另一病症。 、 備一態樣包括本發明化合物之用途，其係用於製 肴用以治療或預防由神 、 藥劑，特定Ο μ 於驗又體介導之疾病或病狀之 %决Λ ° &使用非競爭性拮抗劑，諸如通道阻斷 W來療或預防由神經元於驗 劑# Hi導之疾病或病狀之藥 & ’該疾病或病狀為CNS病症4另—實 ^二該疾病或病狀為炎症或發炎反應。在另一實施例 、亥疾病或病狀為疼痛。在另_ 狀為新血管生成。在另 -亥疾病或病

壓。在另一〜贫施例中’該疾病或病狀為高A 症。—貫㈣中，該疾病或病狀為本文所述之另一病 明之-態樣包括一種本發明化合物，其係用作活性 於;、#因此樣包括—種本發明化合物，盆係用 」=戈預防由神經元於驗受體介導之疾病或病狀:、特定 使用非競爭性拮抗劑，諸如通道阻斷劑治療或預 ^ 元錢受體介導之疾病或病狀。在-實施例中， 病或病狀為⑽病症。在另—實施例中，該疾病或病 I56332.doc 201200129 狀為人症或發炎反應。在另—實施例中’該疾病或病狀為 疼痛。在另一實施例中，該疾病或病狀為新血管生成。在 另一實施例中’該疾病或病狀為高血壓。在另一實施例 中，該疾病或病狀為本文所述之另一病症。 •特定疾病或病狀包括抑鬱症（包括嚴重抑鬱症）、高血 屋、大腸急躁症（IBS)(包括IBS_D(以„為主））、膀脱過 動症（OAB)及成癩症（包括戒菸）。 本發明之範疇包括態樣及實施例之所有組合。 以下定義意欲闡明（但非限制）所定義之術語。若本文所 用之特疋術語未特定加以定義，則不應認為該術語不明 確。相反地，術語在其接受之含義内使用。 如本說明書通篇所使用，原子（諸如碳原子）之較佳數目 可以例如短語「C"烧基」表示，其係指含有指定數目之 碳原子的如本文所定義之烷基。類似術語亦將適用於其他 較佳術語及範圍。因此，舉例而言，c]6烷基表示含有β 6個碳原子之直鏈或分支鏈烴。 如本文所用之術語「烷基」係指可視情況經取代之直鏈 ，分支鏈烴’其中允許多重程度之取代。如本文所用之 「烧基」之實例包括（但不限於）曱基、乙基、丙基、異丙 基、異丁基、正丁基、第三丁基、異戊基及正戊基。 如本文所用之術語「亞甲基」、「伸乙基」及「伸乙烯 基」係♦曰一價形式 _CH2-、-CH2-CH2-及-CH=CH-。 如本文所用之術語「芳基」係指可視情況經取代之單個 笨環或稍合笨環系統’ 1中允許多重程度之取代。如所用 156332.doc • II · 201200129 之方基」之實例包括（但不限於）苯基、2·萘基、丨_萘 基蒽及菲。芳環較佳具有5至1〇個成員。 文所用，在術*「芳基」内所涵蓋之稠合苯環系統 包括稍合多環烴’㈣其中環烴具有小於最大數目之非累 Τ雙鍵’例如其中飽和烴環(環烷基，諸如環戊基環)與芳 5辰（方基，諸如苯環）稍合形成例如諸如節滿基及鹿基之基 團，且包括非限制性實例，諸如二氣蔡及四氣蔡之基團。土 如本文所用之術語「烷氧基」係指基團_〇Ra，並 如本文所定義之烷基。 如本文所用之術語「芳氧基」係指基團视3，其中 如本文所定義之芳基。 、 ‘ ·、

如本文所用之「胺基」係指基團_NRaRb，其m ^名 為氣b $外，，經取代之胺基」係指基團-NRaRb，其中R 及各個別為炫基、芳基烧基或芳基。如本文所用:、當尺 或R不為氫時’該基團可稱為「經取代之胺基」或例 Ra為η且Rb為烷基，則稱為「烷基胺基」。 如本文所用之術語「醫藥學上可接受」係指與調配物之 其他成分相容且對醫藥組合物之接受者無害的一或 劑、稀釋劑、賦形劑或本發明化合物之鹽形式。 如，文所用之術語「醫藥組合物」係指視情況與—或多 種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑混合的 化合物。醫藥組合物較佳展現—定程度之環境條件穩定 性，以便使其適用於製造及商業化目的。 如本文所用之術語「有效量」'「治療量」及「有效劍 -J2- 156332.doc 201200129 量」係指本發明化合物足以引發所需藥理或治療作用，由 此有效治療病症之量。病症之治療可藉由延遲或預防病症 之發作或進程以及與該病症相關之症狀的發作或進程來表 明。病症之；;台療亦可藉由減輕或消除症狀、逆轉病症進程 以及使患者保持良好狀態之任何其他措施表明。 有效劑量可視以下因素而變化：諸如患者之狀況、病症 之症狀之嚴重程度及醫藥組合物之投藥方式。通常，為達 到投與有效劑量，化合物之投與量可為每公斤患者體重小 於5 mg ^化合物之投與量可為每公斤患者體重小於約〖 至每公斤患者體重小於約100盹，及進一步每公斤患者體 重約1 Pg至小於100盹。上述有效劑量通常表示可以單次 劑量投與或經24小時時間以一或多次劑量投與之量。 本發明化合物可II由多種方法，心已充分確立之合成 方法來製備。例示性一般合成方法如下闡明且接著在工作 實例中製備本發明之特定化合物。 在下文所述實例中，必要時根據合成化學之一般原理利 用敏感性或反應性基團之保護基。根據有機合成之標準方 法操縱保護基（T. w. Green及P· G. M· Wilts (1999) ⑽吻 Groups in Organic Synthesis, M3 , John Wiley & Sons » 關於保護基以引用的方式併入本文中）。在化合物合成之 適宜階段使用對於熟習此項技術者顯而易知之方法移除此 等基團。方法以及反應條件之選擇及其執行次序應與本發 明化合物之製備一致。 本發明亦提供—種在製備本發明化合物中適用作中間物 156332.doc -13- 201200129 之化合物的合成方法以及其製備方法。 可根據下文所述方法，使用容易獲得之起始物質及試劑 製備化合物。在此等反應中’可利用本身為一般技術者所 知但本文未詳細描述之變體。 除非另外說明’否則本文所述之結構亦意欲包括僅在一 或多個同位素增濃原子存在下有差異之化合物。具有本發 明結構但由氘或氚置換氫原子或由13C或MC增濃碳置換碳 原子的化合物在本發明之範疇内。舉例而言，已廣泛使用 氖來研究生物活性化合物之藥物動力學及代謝。儘管自化 學觀點看氘與氫之表現類似，但鍵能及鍵長在氘碳鍵與氫 石厌鍵之間存在顯著差別。因此，在生物活性化合物中藉由 氣置換氫可產生與其無同位素對應物相比一般保留其生物 化學效能及選擇性但表現顯著不同之吸收、分佈、代謝及/ 或排泄（ADME)特性之化合物。因此，對於一些生物活性 化合物，氘取代可產生改良之藥物功效、安全性及/或财 受性。 本發明化合物可以一種以上形式結晶，即被稱為多形現 象之特徵，且該等多晶型形式（「多晶型物」）在本發明之 範疇内。多形現象一般可作為對溫度、壓力或二者之變化 的反應而出現。多形現象亦可由結晶過程之變化引起。多 晶型物可由各種在此項技術中已知之物理特徵（諸如X射線 繞射圖案、溶解度及熔點）區分。 本文所述之某些化合物含有一或多個對掌性中心，或可 另外能夠以多種立體異構體形式存在。本發明之範缚包括 156332.doc 201200129 立體異構體之混合物，以及純化的對映異構體或對映異構/ 非對映異構增濃之混合物。本發明之範疇内亦包括由本發 明之式表不的化合物之個別異構體以及其任何完全或部分 平衡混合物《本發明亦包括由上式所表示之化合物之個別 異構體與其一或多個對掌性t心顛倒之異構體的混合物。 §耑要呈單個對映異構體之化合物時，該化合物可藉由 立體特異性合成、藉由解析最終產物或任何適宜中間物或 藉由在此項技術中已知之對掌性層析法獲得。最終產物、 中間物或起始物質之解析可由此項技術中已知之任何適合 方法艽氙。參 I例如Stereochemistry of 〇rganic Compounch (WiIey-Interscience, 1994) ° 本發明包括本文所述化合物之鹽或溶劑合物，包括其組 合，諸如鹽之溶劑合物。本發明化合物可以溶劑合物（例 如水合物）以及非溶劑合物形式存在，且本發明涵蓋所有 S亥專形式。 本發明之鹽通常（但並非絕對）為醫藥學上可接受之鹽。 包涵於術語「醫藥學上可接受之鹽」之内的鹽係指本發明 化合物之無毒鹽。 適合的醫藥學上可接受之鹽之實例包括：無機酸加成 鹽，諸如氣化物、溴化物、硫酸鹽、磷酸鹽及硝酸鹽；有 機liL加成鹽，堵如乙酸鹽、半乳糖二酸鹽、丙酸鹽、丁二 is-鹽、乳酸鹽、經乙酸鹽、蘋果酸鹽、酒石酸鹽、棒檬酸 鹽、順丁稀一酸鹽、反丁烯二酸鹽、甲烧續酸鹽、對甲苯 磺酸鹽及抗壞血酸鹽；與酸性胺基酸形成之鹽，諸如天冬 156332.doc 15 201200129 fee S义鹽及麩胺酸鹽；鹼今 金屬I，诸如鈉鹽及卸鹽；驗 屬鹽，諸如鎂鹽及钲瞄.〜成 ^ ，錄1，有機驗性鹽，諸如三甲胺 鹽、二乙胺鹽、at(" B岛 比定鹽、甲基。比啶鹽' 二環己胺睡及 Ν，Ν，-二苄基乙二脸豳.ώ h 瓜久 一胺a，及與鹼性胺基酸形成之鹽， 離胺酸鹽及精胺酸鹽。兮楚 ^ 4 4鹽在一些情況下可為水合物友 乙醇溶劑合物》 ^ I習有機化學之技術者將瞭解，可將一個以上系統名 賦予許多有機化合物。因此， U此 表不本發明且流程丨中所千 之化合物VII可稱為N，7a·二甲其 ’、 甲基八虱-4,7-曱橋-1H-茚_3a_ 胺。化合物VII亦可稱為37 —甲基八虱-4,7-亞甲基茚滿_ 3a-胺或N，6-二甲基三環[5 2 1 〇2,6l 卜 L ·° ]癸-2_胺。不應將本發明 之範•視為因若干潛在命名規則均可用於該等化合物而缺 乏清晰性。 II·通用合成方法 熟習有機合成技術者將瞭解，存在多個產生本發明化人 物之方法，以及產生用適於各種用途之放射性同位素標記 的本發明化合物之方法。 產生本發明化合物之—方法概述於流幻中。因此，可 使用熟習有機合成技術者熟知之技術將降樟腦（2•降冰片 酮）接近幾基官能基院基化。通常，將用強驗（例如氫化 納、酵納、胺化納）處理酮形成烯醇鹽甲間物，之後用烷 基齒化物料❹旨處理用於料轉化。在某些條件下^ 用《’ω-二Μ(諸如π二滨丙炫）執行炫基化’以便形成螺 鍵聯。儘管流程1顯示形成螺環丁貌（化合物叫，但其他環 I56332.doc

S 201200129 尺寸（例如螺環戊烷）亦可藉由使用其他α，ω_二鹵烷以此方 式實現。隨後可使用維蒂希（Wittig)(或等效）化學反應使羰 基官能基轉化為環外亞曱基（化合物Η”。在稱為里特反應 (Ritter reaction)之過程中，在強酸存在下用氰化氫（或類似 試劑’諸如硫氰酸酯）處理外亞曱基化合物可得到相應三 級甲醯胺基化合物（如化合物IV)。已發現在某些反應條件 下，形成化合物IV與化合物V，且在某些其他反應條件 下，化合物V為主要產物。估計化合物V可能由碳陽離子 重排方法產生。使用諸如氫化鋰鋁或雙（甲氧基乙氧基）氫 化is納之氫化物還原劑還原呈混合物（螺與稍合）形式或個 別甲醯胺基化合物，分別得到相應二級胺，化合物VI及化 合物VII。 製造本發明化合物之另一方法利用迪爾_阿德化學反應 (Diels-Alder chemistry)。因此，如流程2中所示，環戊二 烯與環戊烯基親二浠物（例如環戊烯_丨_羧酸烷基酯）之反應 得到迪爾-阿德加合物（分別為化合物X及化合物νπι)，其 谷易轉化為本發明化合物。該迪爾_阿德化學反應報導於 文獻中；參見例如 Deleens 等人，Tetrahedr〇n Lett. 43: 4963-4968 (2002)及美國專利5,81 [“ο。化合物νιπ轉化 為化合物IX之反應可藉由連續還原烯烴（使用催化氫化條 件）及水解酯（使用鹼水溶液）來實現。類似地，化合物χ轉 化為化合物XI之反應可藉由連續還原烯烴（使用催化氫化 條件）及硝基（使用錫或鐵金屬之鹽酸水溶液）來實現。或 者，兩個還原反應可同時經由催化氫化來實現。如艮0£^及 156332.doc 17 201200129

Haaf，Liebigs Ann. Chem. 638: Π1-121 (I960)所述’化合 物IX亦可轉化為化合物XI。此參考文獻亦描述自二環戊二 烯合成化合物IX。經由相應疊氮化物之中間環節的化合物 XI之另一合成由 Zhdankin等人，J. Amer. Chem. Soc. 118: 5192-5197 (1996)描述。 熟習有機合成技術者將瞭解，上文剛剛描述及流程2中 所述之反應應能包括某些取代基。因此，經由化合物 VIII、化合物IX及化合物X之經取代型式之中間環節，可 產生經取代型式之化合物XI。最適當的取代基為與迪爾-阿德化學反應及產生化合物XI之後續化學反應相容之取代 基。熟習此項技術者將清楚該等取代基的數量及位置之重 要性’這是由於迪爾-阿德反應組分（二烯烴及親二烯物）之 反應性可極大地受該等取代基存在之影響（積極或消極）。 因此，視該等取代基位於二烯烴組分或親二烯物組分上之 位置而定，該等取代基包括烷基、烷氧基、芳氧基、烷氧 幾基（alkoxycarbonyl/carboalkoxy)、硝基及氰基。 迪爾-阿德反應亦應能使用多種環狀二烯烴及環狀親二 稀物。因此，迪爾-阿德加合物化合物χΐΙ(流程2)可藉由使 吱喃與環戊烯-1-羧酸烷基酯反應來製備（與Butler等人， Synlett 1: 98-100 (2000)所報導之化學反應類似）。化合物 ΧΙΙΙΊ*藉由使1，3 -環已二稀與1-确基環戊浠或其衍生物反 應來製備（與 Fuji 等人，Tetrahedron: Asymmetry 3: 609-612 (1992)所報導之化學反應類似），且化合物χιν可藉由使環 戊二烯與1 ·硝基環己烯或其衍生物反應來製備（與Deleens 156332.doc •18· 201200129 等人，Tetrahedron Lett. 43: 4963-4968 (2002)所報導之化學 反應類似）。化合物XII、化合物XIII及化合物XIV接著可 使用上文所述化學反應或其他類似化學反應進一步轉化為 本發.明化合物。 可經由醯胺及胺基甲酸酯之中間環節將諸如化合物XI之 一級胺轉化為二級胺。因此，用二碳酸二-第三丁酯及氫 化鋰鋁連續處理化合物XI將產生相應N-甲基衍生物。亦可 使用該等方法將二級胺轉化為三級胺。本發明包括一級 胺、二級胺及三級胺化合物。 流程1

156332.doc -19- 201200129 流程2

亦可能併入特定放射性同位素。舉例而言，用氣化裡i 或欣化軸還原劑還原醯胺及胺基甲酸醋可產生N_三氛^ ，或 氚甲基胺。或者，生成醯胺或胺基甲酸酯，其1 %基厌為c、3c或14c原子’之後用氫化鋰鋁還原將分另 產生併入有C、nc或uc原子之胺。在待用於診斷配】 (例如作為顯影劑）或功能及代謝研究中的化合物之製備中 通常需要併入特定放射性同位素。 ΠΙ·醫藥組合物 儘管可能投與呈整塊活性化學製品形式之本發明化合 物’但較佳投與呈醫藥組合物或調配物形式之化合物。因 此’本發明之一態樣包括包含一或多種式I化合物及/或其 醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載體、 稀釋劑或賦形劑的醫藥組合物。本發明之另一態樣提供— 156332.doc

S -20- 201200129 種製備醫藥組合物之方法’纟包括使-或多種式i化合物 及/或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受 之載劑、稀釋劑或賦形劑混合。 投與本發明化合物之方式可變化。本發明化合物較佳經 才又與用於口服之較佳醫藥組合物包括鍵劑、膠囊、囊 片、糖漿、溶液及縣注达 _ .θ ,. 〇 狀汉心W予液。可提供呈改質釋放劑型之本發 明之醫藥組合物，諸如定時釋放錠劑及膠囊調配物。 該等醫藥組合物亦可經由注射，亦即靜脈内、肌肉内、 皮下、腹助、動脈内U及腦室内注射投與。靜脈内 投與為較佳注射方法。搞田认 > 、用於注射之載劑為熟習此項技術 者所熟知且包括5 % 士 # g 走糖〉谷液、鹽水及磷酸鹽緩衝鹽 水。 息 該等調配物亦可使用其他方式（例如直腸投藥）投與。適 用於直腸投藥之調配物(諸如栓劑)為熟習此項技術者所孰 知。該等化合㈣可藉由吸人投與，例如以氣溶膠形式； 諸^洗劑m皮投肖，諸如使用經皮貼 片（例如藉由使用可購自NGVartisandAizac〒rati〇n之技 術)；藉由散劑注射或藉由頰内、舌下或鼻内吸收投與。 ::配呈單位劑量形式或多次或次單位劑量形式 組合物。 :文所述之醫藥組合物可間歇地或以逐步、連續、怪定 „率投與。可向溫血動物，例如嗔乳動物，諸如小 :二乳、貓、兔、犬、豬、乳牛或猴投與醫藥組合物； 且向人類投與。另外，每曰投與醫藥組合物之時刻及次 156332.doc 201200129 數可變化。 本發明化合物可用於治療多種病症及病狀，且因而可與 適用於治療或預防彼等病症或病狀之多種其他適合治療劑 組合使用。因此，本發明之一實施例包括投與本發明化合 物與其他治療化合物之組合。舉例而言，本發明化合物可 與以下其他各物組合使用：NNR配位體（諸如伐倫克林 (varenicline))、NNR之異位調節劑、抗氧化劑（諸如自由基 清除劑）、抗細菌劑（諸如青黴素抗生素）、抗病毒劑（諸如 核苦類似物’如齊多夫定（zid〇vudine)及阿昔洛韋 (acyclovir))、抗凝血劑（諸如華法林（warfarin》、消炎劑 (諸如NSAID)、退熱劑、止痛劑、麻醉劑（諸如手術中所使 用的）、乙醢膽驗S旨每抑制劑（諸如多奈π底齊（d〇nepezii)及 加蘭他敏（galantamine))、抗精神病藥（諸如氟哌啶醇 (haloperidol)、氣氮平（clozapine)、奥氮平（olanzapine)及 喹硫平（quetiapine))、免疫抑制劑（諸如環孢素（cyci〇sp〇rin) 及曱胺喋呤（methotrexate))、神經保護劑、類固醇（諸如類 固醇激素）、皮質類固醇（諸如地塞米松（dexamethasone)、 強的松（predisone)及氫皮質酮（hydrocortisone))、維生素、 礦物質、營養藥物（nutraceutical)、抗抑鬱劑（諸如丙味唤 (imipramine)、氟西汀（fluoxetine)、帕羅西汀（paroxetine)、 依地普蘭（escitalopram)、舍曲林（sertraline)、文拉法辛 (venlafaxine)及度洛西汀（duloxetine))、抗焦慮劑（諸如阿 普。坐余（alprazolam)及丁螺環酮（buspirone))、抗驚厥劑（諸 如苯妥英（phenytoin)及加巴喷丁（gabapentin))、血管舒張 •22- 156332.doc

S 201200129 劑（諸如β底唑嗪（prazosin)及西地那非（sildenafil))、情緒穩 定劑（諸如丙戊酸鹽（valproate)及阿立娘。坐（aripiprazole))、 抗癌藥（諸如抗增生劑）、抗高血壓劑（諸如阿替洛爾 (atenolol)、可樂定（cl〇nidine)、胺氣地平（aml〇pidine)、維 拉帕米（verapamil)及奥美沙坦（〇imesartan))、輕丨寫劑、翼 便权化劑、利尿劑（諸如夫喃苯胺酸（fur〇semide))、解痙劑 (anti-spasmotic)(諸如雙環胺（dicyc〖〇mine))、抗運動障礙 劑及抗潰瘍藥（諸如埃索美拉唾（eS〇mepraz〇le))。該醫藥活 性劑組合可一起或分開投與，且當分開投與時，投藥可同 時或依序，以任何順序進行。為獲得所需治療效果，選擇 化合物或藥劑之量及相對投藥時間。本發明化合物與其他 治療劑之組合投與可藉由相伴投與：⑴包括兩種化合物之 整體醫藥組合物；或⑺各包括其中一種化合物之個別醫藥 組合物來組合。或者，組合可以連續方式分別投與，其中 首先投與一種治療劑且其次投盥 八入仅興力種。该連續投藥在時 間上可接近或間隔較長。 本發明之另 L樣包括組合療法，其包含向個體投旬二 療或預防有效量之本發明化合物及_❹種其他療法^ 括化學療法、輕射療法、基因療法或免疫療法。 IV·使用醫藥組合物之方法 本發明化合物可用於预—、v 士 用於預防或治療各種病狀或病症，苴中 其他類型之她合物已提出或顯示適用作治療劑，；等 症諸如⑽病症、炎症、與細菌及/或病毒残= 發"反應、疼痛、代謝症候群、自體免疫病症：成癌 156332.doc £； •23- 201200129 症、肥胖症或本文所進一步詳述之其他病症。此化合物亦 可用作診斷劑（活體外及活體内）。該等治療劑及其他教示 描述於例如本文先前所列舉之參考文獻中，包括Williams 等人，Z)rwg iVews Perspec. 7(4): 205 (1994) ; Arneric等人， CiVS Drwg 1(1): 1·26 (1995) ; Arneric等人，£λ:/7·(9；7ζ·«· /«ve". Drwgs 5(1): 79-100 (1996) ; Bencherif 等人，《/·

Pharmacol. Exp. Ther. 279: 1413 (1996) ； Lippiello# A, J. P/zarmaco/. Ex/?· 77zer. 279: 1422 (1996); Damaj 等人，*/_ Pharmacol. Exp. 772er. 291: 390 (1999) ; Chiari 等人，

Anesthesiology 91: 1447 (1999) ; Lavand'homme 及

Eisenbach，JweW/zeho/ogj； 91: 1455 (1999) ; Holladay等人， J. Med. Chem. 40(28): 4169-94 (1997) ; Bannon等人， Science 279: 77 (1998) ； PCT WO 94/08992 ； PCT WO 96/3 1475; PCT WO 96/40682及Bencherif等人之美國專利 第5,583，140號、Dull等人之第5,597,919號、Smith等人之 第 5,604,231號及 Cosford等人之第 5,852,041號。 CNS病症 該等化合物及其醫藥組合物適用於治療或預防多種CNS 病症，包括神經退化性病症、神經精神異常、神經病症及 成瘾症。該等化合物及其醫藥組合物可用以治療或預防認 知能力缺失及認知功能障礙（年齡相關性及其他因素）；注 意力障礙及癡呆症（包括歸因於傳染物或代謝障礙之彼等 病症）；提供神經保護作用；治療抽搐及多發性腦梗塞； 治療情感障礙、強迫症及成癮行為；提供止痛；控制炎症 -24- 156332.doc

S 201200129 (諸如細胞激素及細胞核因子κΒ所介導之炎症）；治療發炎 病症，提供疼痛減輕作用；及治療感染（作為用於治療細 菌、真菌及病毒感染之抗感染劑）。本發明之化合物及醫 藥組合物可用以治療或預防之病症、疾病及病狀為：年齡 相關之記憶障礙（AAMI)、輕度認知障礙（MCI)、年齡相關 之認知能力下降（ARCD)、早老年癡呆、早發性阿茲海默 氏病（Alzheimer’s disease)、老年癡呆、阿茲海默氏型癡呆 症、阿茲海默氏病、非癡呆症性認知障礙（CIND)、路易體 性癡呆（Lewy body dementia)、HIV-癡呆症、AIDS癡呆複 合症、血管性癡呆、唐氏症候群、頭部創傷、創傷性腦損 傷（TBI)、拳擊員癡呆、亞急性海綿狀腦病（Creutzfeid_ Jacob Disease)及朊病毒病、中風、中樞性缺血、周邊缺 血、注意力不足症、注意力不足過動症、誦讀困難 '精神 分裂症、類精神分裂症精神障礙、分裂情感性精神障礙、 精神分裂症中之認知功能障礙、精神分裂症中之認知能力 缺失、帕金森病（Parkinsonism)(包括帕金森氏病 (Parkinson’s disease)、腦炎後帕金森病 '關島之帕金森癡 呆症（parkinsonism-dementia of Gaum)、帕金森型額顳葉型 療呆（FTDP))、皮克氏病（pick's disease)、尼曼-皮克氏病 (Niemann-Pick、Disease)、亨廷頓氏病（Huntingt〇n，s

Disease)、亨廷頓氏舞蹈病、運動障礙、遲發性運動困 難、痙攣性肌張力不全、痙攣、進行性核上麻痹、進行性 核上輕癱、腿不寧症候群、亞急性海綿狀腦病、多發性硬 化症、肌萎縮性側索硬化症（ALS)、運動神經性病 156332.doc •25· 201200129 (MND)、多系統萎縮症（MS A)、皮質基底核退化症、格_巴 二氏徵候群（Guillain-Barr6 Syndrome，GBS)及慢性發炎性 脫髓鞘多發性神經病（CIDP)、癲癇症、常染色體顯性遺傳 性夜間額葉癲癎、躁症、焦慮症、抑鬱症（包括嚴重抑營 症（MDD))、經前煩躁不安、恐慌症、貪食症、厭食症、 發作性睡病、白天過度嗜睡、躁鬱症、廣泛性焦慮症、強 迫症、突發大怒、品行障礙、對立性反抗症、妥瑞氏症候 群（Tourette’s syndrome)、自閉症、藥物及酒精成癮 '菸草 成癮且因此適用作戒菸、強迫性暴食及性功能障礙之藥 劑。 認知障礙或認知功能障礙可與以下疾病相關：精神病症 或病狀，諸如精神分裂症及其他精神障礙，包括（但不限 於）精神障礙、類精神分裂症精神障礙、分裂情感性精神 障礙、妄想症、短暫精神障礙、共享型精神障礙、及由一 般醫學病狀造成之精神障礙；癡呆及其他認知病症，包括 (但不限於）輕度認知障礙、早老性癡呆、阿茲海默氏症、 老年癡呆、阿茲海默氏型癡呆、年齡相關之記憶障礙、路 易體性癡呆、血管型癡呆、AIDS癡呆複合症' 誦讀困 難；帕金森病，包括帕金森氏病、帕金森氏病造成之認知 障礙及癡呆、多發性硬化症造成之認知障礙、創傷性腦損 傷造成之認知障礙、由其他一般醫學病狀造成之癡呆；焦 慮症，包括（但不限於）無畏曠症之恐慌症、有畏曠症之恐 慌症、無恐慌症史之畏曠症、特定恐懼症、社交恐懼症、 強迫症、創傷後壓力症、急性壓力症、廣泛性焦慮症及由 156332.doc

S •26- 201200129 -般醫學病狀造成之廣泛性焦慮症；情感障礙，包括"旦 不限於）嚴重抑鬱症、心境惡劣病症、躁鬱型抑鬱症、躁 鬱型躁狂]型«症、與躁症相關之抑鬱症、抑繫或混 合型發作、π型躁鬱症；循環情感性精神障礙及由一般醫 :病狀造成之情感障礙；睡眠失調，包括(但不限於)睡眠 障礙、原發性失眠症、原發性睡眠過度、發作性睡病、類 睡症、夢魔症、睡眠驚恐症及夢遊症、智力遲鈍、學習障 礙、運動技能障礙、交流障礙、廣泛性發育障礙、注意力 不足症及分裂性行為異常、注意力不^症、注意力不足過 動症、嬰兒、兒童或成人進食及飲食障礙'抽動性病症、 排泄性病症；物質相關性病症，包括（但不限於）物質依 賴、物質濫用、物質中毒、物質戒斷、酒精相關之病症， 安非他命或安非他命類似物相關之病症、咖啡因相關之病 症、大麻相關之病症、可卡因相關之病症、迷幻藥相關之 病症、吸入劑相關之病症、菸鹼相關之病症、類鴉片相關 之病症、苯環利定或苯環利定類似物相關之病症、及鎮靜 劑、催眠劑或抗焦慮劑相關之病症；人格障礙，包括（但 不限於）強迫性人格障礙及衝動控制障礙。 可用經驗證認知量表，諸如阿茲海默氏病評定量表之認 知分量表（ADAS-cog)來評估認知行為。本發明化合物改良 認知之有效性之一量度可包括根據該量表量測患者之改變 程度。 關於強迫及成癮行為’本發明化合物可用作菸鹼成瘾症 之治療劑（包括用作戒菸劑）及腦愉悅病症（brain_reward 156332.doc •27· 201200129 disorder)之治療劑，該等腦愉悅病症係諸如物質濫用，包 括/酉精成瘾、違禁及處方藥物成瘛；進食障礙’包括肥胖 症，及行為成瘾症，諸如賭博或成癩症之其他類似行為表 現。 以上病狀及病症進一步詳述於例如the American Psychiatric Association: Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，第 4版，Text Revision，Washington， DC, American Psychiatric Association, 2000 中。關於與物 質使用、濫用及依賴性相關之症狀及診斷特徵之更多細 節，亦可參考此手冊。 炎症 已知主要經由迷走神經之神經系統藉由抑制巨噬細胞腫 瘤壞死因子（TNF)之釋放來調節先天性免疫反應之大小。 此生理機制稱為「膽鹼能消炎路徑」（參見例如Tracey， 「The Inflammatory Reflex，」420: 853-9 (2002))。 過度炎症及腫瘤壞死因子合成導致多種疾病之發病及甚至 死亡。此等疾病包括（但不限於）内毒血症、類風濕性關節 炎、骨關節炎、牛皮癣 '哮喘、動脈硬化症、特發性肺纖 維化及發炎性腸病。 可藉由投與本文所述之化合物治療或預防的發炎性病狀 包括（但不限於）慢性及急性炎症、牛皮癖、内毒血症、痛 風、急性假性痛風、急性痛風性關節炎、關節炎、類風濕 性關節炎、骨關節炎、同種異體移植排斥反應、慢性移植 排斥反應、哮喘、動脈粥樣硬化、單核-吞噬細胞依賴性 156332.doc -28- 201200129 肺損傷、特發性肺纖維化、異位性皮膚炎、慢性阻塞性肺 病、成人啤吸碧迫症候群、鐮狀細胞病中之急性胸部症候 群、發炎性腸病、大腸急躁症（包括腹填為主型ibs)、克 羅恩氏病（Crohn’s disease)、潰,廣、潰瘍性結腸炎、急性膽 管炎、口瘡性π炎、惡病質、迴腸囊袋炎（p㈣hiti:) 球體腎炎、狼瘡腎炎、血栓症及移植物抗宿主反應。 與細菌及/或病毒感染相關之發炎反應 許多細菌及/或病毒感染與由形成毒素所導致之副作用 及身·體對細菌或病毒及/或毒素之天然反應相關。如以上 所。，身體對感染之反應通常包括產生大量TNF及/或其 他細胞激素。此等細胞激素之過度表現可造成顯著損傷， 諸如敗血性休克（當細菌為膿毒時）、内毒素性休克、尿膿 毒病、病毒性肺炎及中毒性休克症候群。 細胞激素表現由NNR介導，且可藉由投與此等受體之促 效劑或部分促效劑來抑制。因此，作為此等受體之促效劑 或。P刀促效劑之本文所述之彼等化合物可用以使與細菌感 染以及病毒及真菌感染有關之發炎反應減至最小。該等細 菌感染之實例包括炭疽、肉毒中毒及膿毒。此等化合物中 之些亦可具有抗微生物性。此外，該等化合物可用於治 療雷諾氏病（Raynaud’s disease)，亦即病毒誘導之疼痛性周 邊血管收縮。 此等化合物亦可用作與現有療法組合的輔助療法以控制 細菌、病毒及真菌感染，諸如抗生素、抗病毒劑及抗真菌 劑。抗毒素亦可用以結合由感染性物產生之毒素且使結合 156332.doc •29· 201200129 之毒素通過身體而不產生發炎反應。抗毒素之實例揭示於 例如Bundle等人之美國專利第6,31〇,〇43號中。有效對抗細 菌及其他毒素之其他藥劑可為有效的，且其治療效果可藉 由與本文所述之化合物共投與而實現。 疼痛 可投與該等化合物以治療及/或預防疼痛，包括急性、 神經性（neurologic)、發炎性、神經性（neur〇pathie)及慢性 疼痛化合物可與鸦片劑聯合使用以使鴉片劑成瘾之可能 性減至最小（例如嗎啡鹼保護療法）。本文所述化合物之止 痛活性可在持續發炎性疼痛及神經痛之模型中論證，如公 開之美國專利申請案第20010056084 A1號（Allgeier等人）中 所述執行（例如發炎性疼痛之完全弗氏佐劑（compile Freund’s adjuvant)大鼠模型中之機械痛覺過敏及神經痛之 小鼠。卩分坐骨神經連接反應模型中之機械痛覺過敏）。 止痛作用適用於治療各種起源或病源之疼痛，尤其適用 於…療發H疼痛及相關痛覺過敏、神經痛及相關痛覺過 敏 '慢性疼痛（例如嚴重慢性疼痛’術後耗及與包括癌 症、絞痛、腎臟或膽絞痛、月經痛、偏頭痛及痛風之各種 ::相關之疼痛）。發炎性疼痛可具有不同成0，包括關 郎炎及類風濕性疾病、腱鞘炎（teno-synovitis)及血管炎。 神經痛包括三又神經痛或㈣性神經痛、神經病（諸如糖 尿病性神經病變疼痛）、灼痛、下背痛及傳入神經阻滯症 候群（諸如臂叢撕裂）。 新血管生成 156332.doc 201200129 舉例而言，藉由投與菸鹼受體之拮抗劑（或以某些劑量 投與部分促效劑）抑制新血管生成可治療或預防特徵為不 良新血管生成或血管生成之病狀。該等病狀可包括彼等特 徵為發炎性血管生成及/或缺血誘發之血管生成之病狀。 與腫瘤生長相關之新企管生成亦可藉由投與彼等本文所述 之化合物充當菸鹼受體之拮抗劑或部分促效劑來抑制。 菸鹼受體之特定拮抗作用降低對炎症、缺血及瘤形成之 血管生成反應。關於評估本文所述化合物之適當動物模型 系統的指導可見於例如Heeschen, C.等人 「A novel angiogenic pathway mediated by non-neuronal nicotinic acetylcholine receptors」，上 11〇(4):527 36 (2002)中。 可使用本文所述之化合物治療的代表性腫瘤類型包括 SCLC、NSCLC、卵巢癌、胰腺癌、乳癌、結腸癌、直腸 癌、肺癌、口咽癌、咽下部癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、 肝癌、膽囊癌、膽管癌、小腸癌、泌尿道癌' 腎臟癌、膀 胱癌、尿道上皮癌、女性生殖道癌、子宮頸癌、子宮癌、 卵巢癌、絨膜癌、妊娠滋養層疾病、男性生殖道癌、前列 腺癌、精囊癌、睾丸癌、生殖細胞腫瘤、内分泌腺癌、曱 狀腺癌、腎上腺癌、垂體腺癌、皮膚癌、血管瘤、黑色素 瘤、肉瘤、骨及軟组織肉瘤、卡波西氏肉瘤（Kap〇si,s sarcoma)、腦腫瘤、神經腫瘤、眼部腫瘤、腦膜腫瘤、星 形細胞瘤、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、視網膜母細胞 瘤、神經瘤、神經母細胞瘤、神經鞘瘤（Schwann〇ma)、腦 156332.doc •31 · 201200129 膜瘤、由造血性惡性病引起之實體腫瘤（諸如白血病、綠 色瘤、漿細胞瘤及蕈樣真菌病之斑塊及腫瘤及皮膚τ細胞 淋巴瘤/白血病）及由淋巴瘤引起之實體腫瘤。 該等化合物亦可與其他形式之抗癌治療聯合投與，包括 與諸如順鉑、阿黴素（adriamycin)、道諾黴素（daunomycin) 及其類似物之抗贅生性抗腫瘤劑，及/或同樣如此項技術 中已知之抗VEGF(血管内皮生長因子）劑共投與。 化合物可以使其革巴向腫瘤位點之方式投與。舉例而言， 違等化合物可以與將微粒導向腫瘤之各種抗體結合之微球 體、微粒或脂質體形式投與。另外，該等化合物可以微球 體、微粒或脂質體形式存在，其尺寸經適當調整以通過動 脈及靜脈’但停留於腫瘤周圍之毛細管床中且將該等化合 物局部投與該腫瘤。該等藥物傳遞裝置在此項技術中已 知。 其他病症 除治療CNS病症、炎症及新血管生成及疼痛之外，本發 明化合物亦可用於預防或治療其中NNR起作用之某些其他 病狀、疾病及病症。實例包括自體免疫病症（諸如狼瘡）、 與細胞激素釋放相關之病症、因感染繼發之惡病質（例如 如在AIDS、AIDS相關複合症及瘤形成中出現的）、肥胖 症 '天疱瘡、尿失禁、膀胱過動症（OAB)、腹填、便秘、 視網膜病、感染病、肌無力、伊頓·蘭伯特症候群（Eat〇n_ Lambert syndrome)、高血壓、先兆子癇、骨質疏鬆症、血 官收縮、血管舒張、心律不整、！型糖尿病、π型糖尿病、 156332.doc -32· 201200129 貪食症、厭食症及性功能障礙以及公開之PCT申請案wo 98/256 19中所述之彼等適應症。亦可投與本發明化合物來 治療抽搐’諸如作為癲癇症之症狀的彼等抽搐，及治療諸 如梅毒及亞急性海綿狀腦病之病狀。 本發明化合物可用以治療細菌感染及皮膚病狀，諸如落 葉型天疱瘡（pemphigus folliaceus)、尋常天疱瘡（pemphigus vulgaris)及諸如皮膚棘層鬆解之其他病症，其中存在具有 高神經節NNR抗體效價之自體免疫反應。在此等病症中且 在諸如重症肌無力之其他自體免疫疾病中，抗體之fab片 段結合至NNR受體（交聯2受體），由此誘導内化及降解。 診斷用途 該等化合物可用於診斷組合物（諸如探針）中，尤其當其 經修飾包括適當標記時。出於此目的，最佳用放射性同位 素部分〗標記本發明化合物。 可使用正電子發射斷層掃描術（PET)偵測所投與之化合 物。需要高比活性以在不飽和濃度下觀測所選受體亞型。 所投與之劑量通常低於毒性範圍且提供高對比度影像。預 期該等化合物能夠以無毒含量投與。劑量之測定係以熟習 放射性標記成像技術者已知之方式進行。參見例如 等人之美國專利第5,969,144號。 該等化合物可使用已知技術投與。參見例如如所示之 London等人之美國專利第5,969，144號。該等化合物可以併 入有其他成分(諸如適用於調配診斷組合物之彼等成分類 型）的調配組合物投與。適用於實施本發明之化合物最佳 156332.doc •33· 201200129 以高純度形式使用。參見Elmalch等人之美國專利第 5,853,696號 ° 在將化合物投與個體（例如人類個體）之後，可藉由適當 技術成像及定量個體内彼化合物之存在以表明存在、數量 及功能。除人類之外，亦可將化合物投與動物，諸如小 鼠、大鼠、犬及猴。SPECT及PET成像可使用任何適當技 術及設備進行。參見Villemagne等人，In: Arneric等人（編） Neuronal Nicotinic Receptors: Pharmacology and Therapeutic 及 Elmalch等人之美國專利第 5,853,696號，對於代表性成像技術之揭示内容，各文獻以 引用的方式併入本文中。 V.合成實例 實例1 : N，7a-二甲基八氫-4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺鹽酸鹽 流程3

、CH3 VII 降樟腦 向2-降冰片酮（降樟腦）（16.0 g，145 mmol)及1，3-二溴丙 烧（203 mmol，20.7 mL ; 41.1 g)於乙醚（450 mL)中之溶液 中添加胺化納（363 mmol，14.8 g)，且在回流下攪;拌混合 物24小時。將混合物傾入200 mL冰水中，且分離有機層。 用200 mL乙醚萃取水層。濃縮經合併之乙醚萃取物，且在 60°C至l〇〇°C下，在1〇至20托真空下蒸餾液態殘餘物獲得 156332.doc • 34- 201200129 14 g不純產物。將此產物溶解於150 mL己烷中且與高錳酸 鉀（12.0 g ’ 75.9 mmol)於水（150 mL)中之溶液一起攪拌5小 時。經由石夕藻土床過濾兩相混合物’接著用己烷（丨〇〇 mL) 洗滌。分離己烷層，且用600 mL己烷萃取水層。合併己烷 層’濃縮且經矽膠管柱用含10%至40。/。乙醚之己烷溶離來 純化’獲得呈油狀之螺[雙環[2.2.1]庚烷-2,1，-環丁]-3-酮 (流程 3 中之化合物II)(6_i g，產率 28〇/〇)。iH NMR (CDC13, 400 MHz): δ 2.55-2.49 (m, 2Η), 2.18-2.08 (m, 2H), 2.00- 1.58 (m，7H), 1.49-1.36 (m，3H); LCMS (m/z): 151 (M+l)。 在-78°C下向溴化（曱基）三苯基鱗（49 9 mm〇1，182 g)於 無水四氫咬喃（100 mL)中之懸浮液中添加正丁基鋰（46 5 mmol ’ 18.6 mL 2.5 Μ己烷溶液）。在-78°C下攪拌混合物30 分知。向此混合物中添加螺[雙環[2.2.1]庚烷-2,1，-環丁]-3-酉同（5.00 g ’ 33 3 mm〇1)。在周圍溫度下攪拌所得混合物2〇 小時。添加己烷（300 mL)且過濾混合物。濃縮濾液，且經 80 g石夕膠管柱用己烷溶離來純化殘餘物，獲得呈油狀之3_ 亞甲基螺[雙環[2·2·1]庚烷-2,1，-環丁烷](流程3中之化合物 111)(3.7 g ’ 75%)。iH nmr (CDC13，400 ΜΗζ): δ 4.82 (s， 2Η), 2.63 (brs, 1Η), 2.22 (brs, 1H), 2.05-1.78 (m, 6H), 163_1.52 (m，1H)，H1.34 (m, 3H)，1.21-1.12 (m，2H)。 在5〇 C下經15分鐘向3-亞甲基螺[雙環[2.2.1]庚烷-2,Γ-%丁烧](2.10 g’ 14.2 mmol)及硫氰酸鉀（14.2 mmol，1.39 g)之w浮液中緩慢添加硫酸（1.40 g; 14.3 mmol)於水（0.52 mL)中之'合液。在85°C下攪拌溶液5.5小時。冷卻溶液至周 156332.doc •35- 201200129 圍溫度，用甲苯（20 mL)稀釋，且依序用水（2〇 mL)及飽和 碳酸氫鈉水溶液（10 mL)洗滌。收集曱苯層，經無水硫酸 鈉乾燥且過濾。向濾液中添加雙（曱氧基乙氧基）氫化鋁鈉 (28 mmM’ 7.9 mL 65%至70%於甲苯中之溶液），且在85r 下搜拌所得混合物2小時。冷卻混合物至〇且以一定時間 間隔緩慢逐滴添加3N氫氧化鈉水溶液（3 mL)與5%次氯酸 鈉（15 mL)之混合物。分離曱苯層且用水（3〇 mL)洗滌。接 著用1 N鹽酸水溶液（2x10 mL)萃取甲苯層。去除曱苯層， 且藉由添加10 %氫氧化納水溶液使經合併之鹽酸萃取物呈 鹼性（至pH 10)。用乙醚（2x30 mL)萃取鹼性水混合物。收 集乙醚萃取物，濃縮且藉由矽膠管柱層析法，用含〇至 40% CMA(氣仿：曱醇：30%氨水，9:1:〇 1}之氣仿溶離來純 化’獲得N，7a-二甲基八氫_4,7_曱橋·m々_3a^ (流程3中 之化合物VII)(0_40 g，產率16%)。丨η NMR (游離驗， CDC13, 400 MHz): δ 2.27 (s, 3H), 2.13 (d5 J=1.5 Hz, 1H), 1.95-1.91 (m, 1H), 1.80 (bs, 1H), 1.65-1.58 (m, 1H), 1.54- 1-18 (m，10H), 1.08-1.05 (m，ih)，0.87 (s, 3H)。 將此油狀物溶解於5 mL二氣曱烷中，於冰浴中冷卻，且 與2 mL 6 Μ鹽酸水溶液合併。濃縮混合物且真空乾燥獲 得N，7a-二曱基八氫·4,7-甲橋-1Η-茚-3a-胺鹽酸鹽。ιΗ NMR (鹽酸鹽，D2〇, 400 MHz): δ 2.55 (s，3Η)，2.24 (d， J-3.5 Hz, 1H), 1.98-1.86 (m, 1H), 1.88 (d, J=3.5 Hz, 1H), 1.65-1.30 (m, 9H), 1.18-1.05 (m, 2H), 0.92 (s, 3H); LCMS (m/z): 180 (M+l)。 156332.doc S' -36· 201200129 實例2 : N，7a-二甲基八氫_4,7_甲橋_1H-茚_3a-胺鹽酸鹽（替 代合成） 注意：使用氰化鈉會限制運作此反應程序之規模。因 此’多次執行該程序以積累物質。本文中所報導之結果表 示典型運作。 向裝備有攪拌器及冷凝器之2L3頸圓底燒瓶中添加降樟 腦（2·降冰片酮）（25,0 g，0.227 mol)、乙醚（700 mL)、1，3-二漠丙烷（64.1 g，0.318 mol)及胺化鈉（22.0 g)。攪拌混合 物且在回流下在氮氣下加熱24小時。GCMS分析表明降樟 腦仍存在’因此再添加5.1 g胺化鈉（總計27丨g，〇 567 mol)且再回流混合物24小時。冷卻反應混合物且緩慢用水 淬滅。一旦胺化鈉失去效能，則再添加500 mL水。充分混 合各層且分離有機層。用更多乙醚（8〇〇 mL)萃取水層，且 /辰細經合併之乙_萃取物，得到油狀物。在減壓（1 〇至2 〇 mm Hg ’ 80°C至110°C )下蒸餾產生無色含油（除所需產物之 外）不反應降樟腦、過量1，3-二溴丙烷、單烯丙基降樟腦及 微量雙烯丙基降樟腦。將油狀物溶解於1 L己烷中且與} L 含有高錳酸鉀之水混合。當添加足夠固體高錳酸鉀時攪拌 此混合物5小時以產生持久穩固的紫色（總高錳酸鉀：42 〇 g，0.266 mol)。經由矽藻土過濾棕紫色溶液且用水及己烷 (各500 mL)沖洗。排除己烷層，且用己烷（5〇〇 mL)萃取水 層。（經無水硫酸鈉）乾燥經合併之有機層且接著濃縮得到 油狀物。經二氧化矽管柱，使用含〇至7%乙酸乙酯之己烷 層析油狀物，產生li.o g(產率32%)螺[雙環[221]庚烷- 156332.doc -37- 201200129 2，1’-環丁]-3-酮（藉由GCMS分析為98%至99%)。注意：此 反應之產率在20%至33%範圍内變化。 向含有螺[雙環[2.2.1]庚烷_2，Γ-環丁]-3 -酮（11.0 g， 0.733 mol)之500 mL圓底燒瓶中添加2〇〇 mL無水THF。減 壓濃縮此混合物以移除痕量乙酸乙酯。再添加2〇〇 mL無水 THF ’用氮氣替換該氛圍，且於冰浴中冷卻混合物至 <5 C。經10至15分鐘添加溴化甲基鎂之乙醚溶液（3 〇 M， 50 mL，0.1 5 mol)，同時保持溫度。在25°C下攪拌所 得溶液隔夜，接著用飽和氣化銨水溶液（丨5〇 mL)淬滅。用 乙酸乙酯（2x150 mL)萃取混合物（注意··藉由經由矽藻土 過濾移除不可溶鎂鹽以促進各層分離）。減壓濃縮有機層 得到呈無色油狀之3-甲基螺[雙環[m]庚烷_2，Γ_環丁]_3_ 醇’經層析分析與先前製備之樣品一致（115 g，產率 95%) 〇 在25°c下向含有3-甲基螺[雙環[m]庚烷_2，Γ_環丁]_3_ 醇（11.5§，0.692 111〇1)及乙酸（231^)21^圓底燒瓶中添加粉 狀氰化鈉（6.4 g，0.13 mol)。用隔墊密封燒瓶且攪拌混合 物5分鐘，之後於冰浴中冷卻至〇<t (注意：在冷卻期間乙 酸部分凍結）。經由注射器緩慢添加（經3〇分鐘時間）硫酸 (23·0 mL，0.432 mol)。在0°C下攪拌所得混合物2〇分鐘， 接著在周圍溫度下攪拌隔夜。移除隔墊且將水及二氯甲烷 (各500 mL)添加至燒瓶中，且用力攪拌混合物5分鐘。分 離各層，且用二氣曱烷（500 mL)萃取水層。用氫氧化鈉水 溶液（1.0 Μ，500 mL)洗滌經合併之有機層，接著用水（5〇〇 156332.doc

S •38· 201200129 mL)洗滌。減壓濃縮有機層，得到淺褐色固體（13 〇幻。將 固體溶解於無水THF(250 mL)中，減壓濃縮以移除任何痕 量水’接著再溶解於無水THF(250 mL)中。冷卻此溶液至 0°c，接著經10分鐘添加氫化鋰鋁溶液（1 〇 M，14〇 mL， 0.140 mol)。回流混合物8小時，冷卻且用氫氧化鈉水溶液 (1 .〇 Μ，250 mL)淬滅。經由矽藻土過濾此混合物，以移 除铭鹽且濃縮，得到11.2 g呈淺黃色油狀之^，7&_二甲基八 氫-4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺（產率85%)。 實例3 .外消旋N，7a-二甲基八氫-4,7-甲橋-in-節_3a-胺之 對掌性液相層析（LC)分離 使用含0.1%二乙胺之乙腈（v:v)，藉由在ChiralPak管柱 (AD-H，5微米，250x20 cm)上的對掌性液相層析分離外消 旋N，7a-二曱基八氫-3aH-4,7-甲橋-1H-茚-3心胺（1.0 g)。濃 縮所選溶離份（明顯高異構純度之彼等物質）得到兩種油狀 物，分別為0.18 g(化合物A，滯留時間5 3分鐘）及〇 24 g(化合物B，滯留時間6.0 min) 〇將該等油狀物各溶解於5 mL二氯曱烷中，於冰浴中冷卻，且與2 mL 6河鹽酸水溶 液合併。濃縮混合物且真空乾燥以獲得呈其鹽酸鹽形式之 異構體。 實例4 ·· Nja-二甲基八氫_4,7_甲橋_1H-茚_3a胺之對掌性 氣相層析（GC)分析 開發用於樣品常規分析之對掌性氣相層析法。該方法如 下： 儀器：GC-FID，直接注射，HP 5890/6890或等效物 156332.doc -39- 201200129 管柱.J & W Cyclosil-B ’ 長度 30 mx 内徑 0.25 mm，0.25 μπι厚薄膜，零件號1 12-6632

管柱流量：氦氣為1.1 mL/min ;分流比為50:1 氫氣流量：30 mL/min 氣流：300 mL/min 偵測器溫度：250°C 入口溫度：230°C /主射體積.1 pL ’濃度為於甲醇中約1 mg/mL 程式：在50°C下起始且保持2分鐘。烘箱溫度以1(rc/min 之速率增至220°C，且保持5分鐘。回到50。〇。 藉由此方法，具有較長LC滯留時間之異構體（參見實例 3)展現較短GC滯留時間，反之亦然。GC滞留時間為約 15.5分鐘（化合物B，滯留時間較短之異構體）及約丨5 6分鐘 (化合物A，滞留時間較長之異構體）。圖13及圖lb分別說 明GC滯留時間。 實例5 .使用樟腦烷酸及單晶χ射線分析解析外消旋N，7a_ 二甲基八氫-4,7-甲橋·1Η-茚-3a-胺 進行鹽篩檢（在0.11 mmol規模下）以確定各種對掌性酸中 之何種，即在何種溶劑中可適用於解析外消旋N，7a_二曱 基八氫-4,7-曱橋-1H-茚Ja-胺。在篩檢中的2〇種所用對掌 性酸（注意：許多其他酸均可用）中，^酒石酸、（+)_去氧 膽酸、（1R)-(内，抗）-⑴-3-演代樟腦_8_磺酸、（ls)㈠樟 腦烧酸及（+)-樟腦酸基於其在至少一個溶劑系统中在單一 結晶中實現對映異構增濃之能力顯示最有前景。在此等酸 156332.doc -40- 201200129 中’ 08)-(-)-樟腦烧酸在兩個 水）中實現顯著對映異構增濃 初始顯影。 不同溶劑系統（乙醇及丙酮/ ’且經選擇作為解析劑用於 按比例擴大實驗（自o.22mm〇1至39咖〇1游離驗）確定 (叫㈠·樟腦烧酸將N，7a.二曱基八氫_4,7甲橋 胺有效解析成為其組分對映異構體之能力，且亦顯示Π 酸遷比對於使用樟腦院酸鹽進行解析可能有利。此外， 穩定的雙-(1S)-㈠·樟腦烧酸鹽係自2當量（is)_(·)·樟腦烧酸 與1當量二甲基八氫_4,7-甲橋-1H-節七·胺之反應分 離（根據胺組分之單驗性得到意料外之結果）。使用nmr光 譜學以確定NJa-工甲基八氫_4,7·曱橋冬^胺雙（is)_ 樟腦烷酸鹽之化學計量。 典型按比例擴大程序遵循如下：將N，7a_二甲基八氫_

4,7-甲橋-1H-節-3a-胺（7.00 g ’ 39.0 mm〇l)溶解於在 2〇 mL 閃爍瓶中的10 mL丙酮/水（90/10)中。將（ls)_(_)_樟腦烷酸 (15.2 g，76.7 mmol)溶解於79 mL·丙酮/水（90/10)中且置於 250 mL夾套燒瓶中。加熱溶液至5〇。〇且在整個實驗中一直 攪拌。將鹼性溶液添加至50。(：下之酸性溶液中。在控制冷 卻速率（l〇°C/h)下，將溶液冷卻至5t：。接著加熱溶液至 20 C且在此溫度下平衡1小時。接著經25 μηι至50 μηι過據 器過濾漿料。用20 mL丙酮沖洗燒瓶，且再用5 mL丙酮洗 滌濾餅一次。固體在周圍溫度下，於過濾器上乾燥整個週 末’將固體轉移至稱量盤中且在4(TC下真空乾燥1小時， 得到6.39 g固體狀N，7a-二甲基八氫-4,7-曱橋-1H-茚_3&_胺 i56332.doc -41 - 201200129 雙（1S)_棒腦烧酸鹽。將母液轉移至25〇 mL燒瓶中且在周 圍恤度下蒸發。母液蒸發後所剩餘之固體接著在40°C下真 空乾燥1小時（13 · 1 g固體）。 接著將兩種固體之樣品（過濾之固體與蒸發之濾液）轉化 為游離鹼（藉由用1〇%氫氧化銨水溶液處理，萃取至氯仿中 且在氣氣流下蒸發氣仿）。接著將游離鹼樣品溶解於甲醇 中且藉由對掌性GC分析（關於GC方法，參見實例4)。對掌 ('生GC顯示，來自過濾固體之游離鹼為對映異構體之95/5混 合物，以滯留時間較短之異構體為主。對掌性Gc顯示， 來自蒸發濾液之游離鹼為對映異構體之2 8/72混合物，以 滯留時間較長之異構體為主。 由含增濃達95〇/〇 N，7a-二甲基八氫_4,7_甲橋_ 1H_節_3a_胺 雙-(1S)-樟腦烷酸鹽之丙酮/水之單一再結晶法更提高增濃 度（關於大規模製程可參見實例8及實例1 〇)。由增濃達95〇乂 N，7a-二甲基八氫_4,7_甲橋·1Η^33_胺雙樟腦烷酸 鹽（在0,11 mmol規模下產生）之樣品自9〇/1〇丙酮/水中再結 晶。自再結晶混合物小心收集且乾燥之單晶中發現含有在 對掌性GC偵測限度内的滯留時間較短之純對映異構體。 使用裳備有Oxford Cryosystems Cryostream冷卻裝置之

Oxford Diffraction Supernova Dual Source、〇價 Cii、Atlas CCD繞射儀收集此樣品之單晶x射線繞射資料。使用 輻射收集資料。 藉由直接方法獲得結構溶液’ F2之全矩陣最小平方修正 方法’其中稱重 w -σ (/^2)+(0.0637/^2+(0.2489/^)，其中 •42· 156332.doc

S 201200129 /^=(7^2 + 27^2)/3，即各向異性位移參數。使用球諧函數之 實驗吸收校正，以SCALE3 ABSPACK調整演算法實施。最 終所有資料 >^2={Σ|>(〜2-/^2)2]/Σ|>(&2)2]1/2} = 0.085， 5703次反射之F值的習知4=0.0323，其中對於所有資料及 566個參數而言尸。>4〇(^。），S=1.046。最終Δ/σ(最大） 0.001，Δ/σ(平均），0·000。最終差值圖介於+0.239與-0.168 e Α/3之間。 表1 N,7a-二甲基八氫-4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺雙-(1S)-樟腦烷酸 鹽（滯留時間較短之對映異構體）之單晶結構 ? 分子式、' (c12 h21 n〇+ (c,〇 h13 o4y (c,〇 h14 o4) 分芋查一 575.72 、. 晶糸， 單斜 X w ·« · av *' ' 空間群、· - .、> ： P2' a 10.78510(10)A a 90。 b 10.45490(10)A β 111.3800(10)° c 14.0435(2)人 Ί 90。 ......-<r "i ...-. ..一 v w 1474.53(3)A3 V· Z 2 ’ ^ Dc 1.297g.cm-1 ,-iv·. .V.. . ' .: »；. rS； μ 0.748 mm'1 來源，λ : Cu-K(a) > 1.54178A F(oooy 624 100(2)K 、^ 2 if- ,..晶體^ $ 無色稜鏡，〇.41x〇.14x〇.05mm 資與戴為，、 0.80A ' ' 74.03。 " ·'· y -5. · , 八- · 完整性. 99.1% 反射...... 21947 ••獨特反射'·' 5747 Riru ；： 0.0196 /?,(F0>4a(F0)) 0.0323 絕對結構參數 0.05(9) 圖2說明N-7a-二曱基八氫-4,7-曱橋-1H-茚-3a-胺雙（1S)- 156332.doc -43- 201200129 樟腦烷酸鹽(滞留時間較短之對映異構體)之分子構型。圖2 描述來自出於結晶目的使用之晶體結構及編號方案的 N，7a 一曱基八氫_4,7 -甲橋_ιΗ_節_3a_胺雙_(1S)_樟腦烷酸 鹽（滯留時間較短之對映異構體）分子之視圖。在5〇%概率 水準下’顯示非氫原子之各向異性原子位移橢球體。分子 内氫鍵以虛線展示。用任意小之半徑顯示氫原子。 圖3說明N，7a-二甲基八氫·4,7_曱橋_3a•胺雙 樟腦烷酸鹽（滞留時間較短之對映異構體）之晶體堆積。圖3 描述單位晶胞中俯視單位晶胞之大致[〇，〗，〇]方向之N，^_二 甲基八氫-4,7-甲橋-1H-節_3a_胺雙_(1S)_樟腦烷酸鹽（滞留 時間較短之對映異構體）之晶體堆積之一部分的視圖。分 子内氣鍵以虛線展示。 圖4說明N，7a-二甲基八氫_4,7_甲橋-m_節、-胺雙 樟腦烷酸鹽（滯留時間較短之對映異構體）之晶體堆積。 單晶X-射線繞射確定具有^^，^，”，、…絕對構型的 N,7a-一甲基八氫_4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺之較短滞留時間 (藉由對掌性GC)對映異構體。因此，N，7a_二曱基八氫_ 4,7-曱橋-1H-茚-3a-胺之較長滯留時間（藉由對掌性Gc)對 映異構體具有（3&8,43,711,7&3)絕對構型。 因此，化合物八為（333,43,711，7&3)-；^，7&-二甲基八氫_47· 甲橋-1H-節-3a·胺，其在對掌性LC中具有較短滞留時間（參 見實例3)，且在對掌性GC中具有較長滯留時間（參見實例 4)。化合物8為（3311，411，73,7311)-队73-二甲基八氫_47_甲 橋-1H-節-3a-胺，其在對掌性LC中具有較長滞留時間（參見 156332.doc S、 -44· 201200129 實例3)，且在對掌性GC中具有較短滯留時間（參見實例 4) 〇 實例6:(33厌，41^，78,7311)*^，73-二甲基八氫-4,7-甲橋-111-節-3a-胺（化合物B)雙_(1S)·樟腦烷酸鹽之X射線粉末繞射 藉由X射線粉末繞射（XRPD)分析（3aR,4R，7S，7aR)-N,7a-二曱基八氫-4,7-甲橋-lH-茚-3a-胺雙-(lS)-樟腦烷酸鹽之樣 品。經Bruker AXS C2 GADDS繞射儀，使用Cu Κα輻射（40 kV，4〇mA)、自動ΧΥΖ平台、樣品自動定位之雷射視訊顯 微鏡及HiStar 2維區域偵測器收集圖案。χ射線光學系統係 由與〇_3 mm針孔視準儀耦合之單— G0bei多層鏡組成。 射束發散（亦即樣品上χ射線束之有效尺寸）為約4 。 利用㈣連續掃描模式，其中樣品㈣器距離為2G em，由 ==至29·7。之有效_圍。用於資料收集之軟體為 .•之GADDS，且使用 Diffrac pius EVa 川 〇 刀析及王現高強度特徵峰列於表2中。 表2 ^，极，78,7叫^二甲基八氣_4,7_甲橋_ 雙-叫樟滕貌酸鹽XRPD之特徵峰列表 •胺 2Θ(。） 強度％ _____6.68 56.6 100 83.2 __16.23 77.3 茚

I叱叨N，7a-二甲基八 ^胺大規模解析為化合物錢化合物B 156332.doc •45- 201200129 實例7 :經由鹽酸肄 3a胺 ，a-二甲基八氫-4,7-甲橋·1H_茚_ 此程序移除微量雜 析之效率。 雜質尤其非鹼性雜質，且改良後續解 將N，7a-二甲其λΛ 土 / 显·，7_ 甲橋 _111_茚-3a_胺（350 g，1 95 mol)及丙酮（2_5 L) g 入口 MU 備有機械授摔器、熱電偶、氮氣 属+之5 L 3頸反應器中。開始攪拌，且 冷卻淺黃色溶液至約听。經。分鐘以細流向此 :=>谷液中添加濃（37%水溶液）鹽酸（i92mL 23m〇i) 酮（520 mL)巾之溶液。冷卻所得錢浮液至代且保 路Ζ溫度下3〇分鐘。接著藉由過渡收集固體，用丙酮洗 … Μ液無色（4,叫且空氣乾燥％分鐘。乾燥至 =重，得到呈白色固體狀之心_二甲基人氫_4,7_甲橋. 知-3a-胺鹽酸鹽（388 g，產率917%)。 向裝備有機械攪拌器、熱電偶、氮氣入口轉接器及加料 漏斗之5 L 3頸反應器中填充心_二甲基八氫_4,7_甲橋_ 见節如胺鹽酸鹽（442 g，2〇5叫及甲基第三丁基崎 (2·2 L)。開始攪拌且將7%氫氧化鈉水溶液（】[，3 u 叫添加至懸浮液中。在周圍溫度下經60分鐘緩慢溶解固 體’產生兩相混合物。停止攪拌，且使混合物靜置5分 鐘’以便分離各相。收集有機（頂部）相，且使水（底部）相 與新鮮甲基第三丁基醚（2.0 L)合併。攪拌此兩相混合物3〇 刀鐘，且如前所述分離各相，經無水硫酸鈉（1〇〇 乾燥經 口併之甲基第二丁基醚層3小時。藉由過濾移除乾燥劑， 156332.doc

• 46 - 201200129 且使遽液流過1 μιη GF/B過濾墊以移除精細微粒。減壓濃 縮 >慮液’溫度自30°C逐漸增至50°C。所得澄清淡黃色液體 (3 1 5 g ’產率86.0% ;鞛由GCMS得知純度>99%) —旦冷卻 即變為蠟狀固體。 實例8 :化合物6雙_(18)-樟腦烷酸II之形成及再結晶 向裝備有機械攪拌器、熱電偶、冷凝器及氮氣入口轉接 器之250 mL 3頸反應器中填充純化之N，7a-二曱基八氫-4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺（7.00 g，38.7 mmol)、90:10 丙酮/水溶液 (140 mL)及（lS)-(-)-樟腦烧酸（15.3 g，77.4 mmol)。開始授 拌’且加熱（加熱套）漿料至約5 5 °C且保持在此溫度下15至 30分鐘。經60分鐘緩慢冷卻（在約45°C下開始沈澱）溶液至 周圍溫度’接著用冰浴進一步冷卻至1 〇°C。在1 〇。〇下60分 鐘之後’過濾懸浮液，且用冷（<5°C)丙酮（2x15 mL)洗滌所 收集之固體。經過濾漏斗乾燥白色固體3 〇分鐘，得到化合 物B雙-(1S)-樟腦烷酸鹽（9.90 g，產率81.7% ;藉由對掌性 GC得知化合物B之異構純度為94.9%)。 向裝備有磁性攪拌器、熱電偶及冷凝器之1L3頸反應器 中填充化合物B雙-(1S)-樟腦烷酸鹽（20 g，0.034 mol，異 構純度95.5%)及98:2丙酮/水（558 mL)(注意：合併幾批化 合物B雙-(1 S)-樟腦烷酸鹽以產生此樣品）。開始授拌，且 加熱懸浮液至約55°C以形成溶液。溶液保持在約55°C下15 分鐘，之後緩慢冷卻（經60分鐘）至周圍溫度。接著用冰浴 使懸浮液進一步冷卻至<5°C且保持在彼溫度下30分鐘。藉 由過濾收集固體，且用冷（<5°C )丙酮/水（98:2)(2xl〇 mL)洗 156332.doc -47- 201200129 滌。將分離之固體空氣乾燥30分鐘，得到N，7a-二甲基八 氫-4,7-甲橋-1H-節-3a-胺雙_(is)_樟腦烷酸鹽（13·7 g，產率 71.7% ;藉由對掌性GC得知異構純度為99.5%) 〇在50。(：至 55°C下減壓濃縮濾液得到白色固體（6.50 g)，根據相同程 序自110 mL 9 8:2丙_/水再結晶。藉由過遽收集固體且用 冷（<5°C)丙酮/水（98:2)(2><5 mL)洗滌。空氣乾燥固體3〇分 鐘’得到另一份樣品N，7a-二甲基八氫-4,7-甲橋-1H-茚-3 a-胺雙-(IS)-樟腦烷酸鹽（3.7〇 g，19.4% ;藉由對掌性gc得 知異構純度為99.9%)。化合物B雙樟腦烷酸鹽之總回 收率為 91%。NMR (D2〇, 400 ΜΗζ): δ 2.51 (s，3H)，2.29 (dt, J=2.0 Hz, 2H), 2.22 (bs, 1H), 2.15 (m, 1H), 1.86 (m, 3H), 1.72 (m, 4H), 1.41 (m, 10H), 1.14 (d} J=2.7 Hz, 1H), 1.06 (s，3H), 0.98 (s，6H)，0.94 (s，6H), 0.79 (s，6H)。 實例9 :化合物B雙-(1S)_樟腦烷酸鹽轉化為化合物B鹽酸鹽 向裝備有磁性攪拌器、熱電偶、加料漏斗及氮氣入口轉 接器之500 mL 3頸反應器中填充N，7a•二曱基八氫_4,7-甲 橋-1H-節-3a-胺雙-(1S)·樟腦烧酸鹽（23 8 g，4ι 3 _〇1 ; 藉由對掌性GC得知異構純度為99 6〇/。；表示若干批）及曱基 第二丁基醚（3GG mL)。開始騎，且將5%氫氧化納水溶液 (170 mL)添加至懸浮液中。固體溶解形成兩相溶液。攪拌 10分鐘之後，使各層分離且收集有機層（頂層）。將水層與 另-份甲基第三丁基醚(2〇〇 mL)一起攪拌，此後分離各相 且收集有機層。經無水硫酸鈉（2G g)乾燥經合併之有機層i 小時。藉由過渡移除乾燥劑，且在价至贼下減壓濃縮 156332.doc

S -48· 201200129 濾液，產生澄清淡褐色油狀物（7 00 g，產率94 8%)，其一 旦冷卻即固化成為蠟狀固體。將游離鹼（7.00 g，39.1 mmol)溶解於裝備有磁性攪拌器、熱電偶、加料漏斗及氛 氣入口轉接器之250 mL 3頸反應器中的丙酮（7〇 mL)中。 開始搜拌’且冷卻溶液至15t或低於饥。經由加料漏斗 添加艰鹽酸（37%，4.55 mL，55 mmol)於21 mL丙酮中之溶 液。立即形成沈澱。攪拌所得懸浮液3〇分鐘且過濾以收集 固體。用丙酮（2x30 mL)洗滌固體，空氣乾燥1〇分鐘，接 著在60 (:下經真空烘箱乾燥i 2小時。由此得到化合物b鹽 酸鹽(7.80 g ’產率92 〇% ;藉由對掌性Gc得知化合物b之 異構純度為 99.6%)。熔點為 207.6。(： ； A NMR (D2〇，400 MHz), δ 2.70 (s, 3Η), 2.39 (d, J=3.6 Hz, 1H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.04 (d, J=3.6 Hz, 1H), 1.82-1.47 (m, 9H), 1.33-1.19 (m，2H)，1.06 (s，3H); LCMS (m/z): l8〇 (m+i)。 實例l〇 :化合物八雙_(叫樟腦烧酸鹽之形成及再結晶 濃縮自分離若干批化合物B雙-(1S)-樟腦烷酸鹽所剩餘之 渡液且真空乾燥，得到樣品N，7a-二曱基八氫-4,7-甲橋.1H_ 知七·胺雙樟腦烷酸鹽（22.4 g，38.9 mmol ;藉由對 掌性GC仔知化合物A之異構純度為78 3%)。將此樣品置於 裝備有磁㈣拌H、熱電偶及氣氣人口轉接器之则肌3 頦反應器中。添加曱基第三丁基醚（3〇〇 且開始攪拌。 接著將5 /q氫氧化鈉水溶液（丨7〇 mL)添加至懸浮液中，且 使固體溶解形成兩相料。在總㈣拌約10分鐘之後，停 止攪拌且使各層相分離。收集有機層（頂層）且藉由攪拌用 156332.doc -49- 201200129 第一伤甲基第二丁基峻（200 mL)萃取水層，且分離各相。 經無水硫酸鈉（20 g)乾燥經合併之甲基第三丁基醚萃取物i 小時。藉由過濾移除乾燥劑，且在約5〇t>c下減壓濃縮濾 液。所彳于/且清淡褐色黏性油狀物（7 〇〇 g，產率94 8%) 一旦 冷卻即變為蠟狀固體。使此游離鹼樣品與化合物A游離鹼 之另一類似衍生之樣品合併，得到7 7〇 g(43 〇 mm〇l ;藉 由對掌性GC得知化合物A之異構純度為79 1%)。將其與丙 酮/水 90:10(146 mL)及（1尺）_(+)_樟腦烷酸（17〇 g, 858 mmol)—起置於裝備有磁性攪拌器、熱電偶及冷凝器之25〇 mL 3頸反應器中。開始攪拌且加熱懸浮液（加熱套）至約 55 C以產生溶液。使溶液保持在55它下丨5分鐘，接著經6〇 分鐘時間冷卻至周圍溫度（約2 5艽）。濾出固體且用冷 (<5〇）丙酮/水98:2(1〇1111^)洗務，得到化合物八雙_(1尺)_樟 腦烷酸鹽（13.65 g ;藉由對掌性（；}(：得知化合物八之異構純 度為97.0%)。冷卻來自初始結晶之濾液至5。〇且保持在5艽 下30分鐘。藉由過濾收集所得固體且用冷（<5t>c)丙酮/水 98:2(2 mL)洗滌，得到另—份樣品化合物a雙_(1R)樟腦烷 酸鹽（1.64 g ;藉由對掌性Gc得知化合物a之異構純度為 95.7%)。在25°C至30°C下減壓濃縮濾液至一半體積且冷卻 至0 C維持30分鐘。過濾此懸浮液得到第三份樣品Q 63 g ;藉由對掌性GC得知異構純度為92.9%)。合併三個樣品 以便再結晶（16.92 g)。用化合物八雙_(1R)_樟腦烷酸鹽 (16.9 g，29.4 mmol ;藉由對掌性Gc得知滯留時間較長之 異構體的異構純度為95.9%)及丙酮/水98:2(493 mL)填充裝 -50- 156332.doc

S 201200129

備有磁性㈣器、熱電偶及冷凝器之1 L 3頸反應器。開始 授摔，且加熱（加熱套）懸#液至約55t。使所得溶液保持 在約55 C下15分鐘且經丨小時時間冷卻至周圍溫度。接著 使懸浮液進-步冷卻至价且保持在彼溫度下3〇分鐘。藉 由過濾收集固體，用冷（<5。〇丙酮/水98:2(2χ1〇 mL)洗滌 且空氣乾燥30分鐘’得到N，7a-二甲基八氫_4,7•甲橋_ΐΗ· 茚-3a-胺雙_(R)_樟腦烷酸鹽（113 g ;藉由對掌性gc得知異 構純度為98.6%卜在”七至“七下減壓濃縮濾液獲得白色 固體（4.00 g) ’接著自11〇 mL 98:2丙酮/水再結晶得到第 一批N，7a-一曱基八氫_4,7_曱橋-1H-茚_3a-胺雙-(R)_樟腦烷 酸鹽（2.28 g;藉由對掌性Gc得知異構純度為98 8%)(總回 收率：13.6 g或產率為82.8%)。熔點為2〇7 6它；lH (D20, 400 MHz): δ 2.51 (s，3H)，2.29 (dt，J=2.0 Hz，2H)， 2.22 (bs，1H)，2.15 (m，1H)，1.86 (m，3H)，1.72 (m, 4H)， 1-41 (m5 10H), 1.14 (d, J=2.7 Hz, 1H), 1.06 (s, 3H), 〇.98 (s, 6H)，0.94 (s，6H)，0.79 (s，6H)。 ， 實例11 :化合物A雙-(1R)·樟腦烷酸鹽轉化為化合物A鹽酸鹽 將化合物A雙-(1R)_樟腦烷酸鹽（162 g，28 ‘ i mm〇1 ;藉 由對掌性GC得知化合物a之異構純度為98 8% ;若干批之 組合）及甲基第三丁基醚（23〇 mL)置於裝備有磁性攪拌器、 熱電偶及氮氣入口轉接器之5〇〇 mL 3頸反應器中。開始授 拌，添加5%氫氧化鈉水溶液（6〇 mL)，且混合所得兩相溶 液5分鐘。停止攪拌且分離各相。收集有機層（頂層）且用另 伤甲基第二丁基醚（2〇〇 mL)萃取底部水層。經無水硫酸 156332.doc -51 - 201200129 鈉（20 g)乾燥經合併之有機萃取物6〇分鐘。藉由過濾移除 乾燥劑，且在45°C至50°C下減壓濃縮濾液，得到澄清無色 油狀物（4.70 g，回收率94.0%)。 向裝備有磁性稅拌器、熱電偶、加料漏斗及氮氣入口轉 接器之100 mL 3頸反應器中添加化合物八（4 6() g，26 7 mmol)及丙酮（47 mL)。開始攪拌，且當經由加料漏斗添加 濃（37%)鹽酸（3.0〇11^;36〇1〇1〇1)於14 1111^冷（<5。(：）丙酮中之 /谷液時冷卻，谷液至1 0 C至15 °C。所得懸浮液保持在< 15 下30分鐘，接著過濾。用丙酮（2x3〇 mL)洗滌分離之固 體。空氣乾燥固體30分鐘，接著在6〇。〇下用真空烘箱乾燥 12小時。由此得到化合物a鹽酸鹽（5·13 g，產率92·6% ;藉

由對掌性GC得知化合物Α之異構純度為99.7%)。4 NMR (D203 400 MHz): δ 2.70 (s, 3H), 2.39 (d, J=3.5 Hz, 1H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.04 (d, J=3.2 Hz, 1H), 1.82-1.47 (m, 9H), 1.33-1.19 (m, 2H), 1.06 (s, 3H); LCMS (m/z): 180 (M+l)。 VI.生物檢定 在菸鹼乙醢膽鹼受體下相互作用之表徵 材料及方法 細胞株· SH-EP1-人類 a4p2(Eaton 等人，2003)、SH-EP1-人類 a4p4(Gentry 等人，2003)及 SH-EPl-ct6P3p4a5(Grinevich 專人，2005)細胞株均獲自 Dr, Ron Lukas(Barrow Neurological Institute)。使 SH-EP1 細胞株、PC12、SH-SY5Y 及 TE67 1 /RD細胞在含有1 〇%馬也清（invitr〇gen)、5%胎牛血 156332.doc •52- 201200129 清（HyClone, Logan UT)、1 mM 丙酮酸納、4 mM L-麵胺醯 胺之達爾伯克氏改質之伊格氏培養基（Dulbecco's modified Eagle's medium)(Invitrogen，Carlsbad，California)中維持在 增殖生長階段。對於維持穩定轉染而言，用0.25 mg/mL勻 黴素及0.13 mg/mL潮黴素B補充α4β2及α4β4細胞培養基。 用 0.25 mg/mL勻黴素、0.13 mg/mL潮黴素Β、0.4 mg/mL遺 傳黴素及0.2 mg/mL滅瘟素維持對α6β3β4α5細胞之選擇。 使ΗΕΚ-人類 a7/RIC3 細胞（獲自 J. Lindstrom，U. Pennsylvania) 在含有10%胎牛血清（HyClone，Logan, UT)、1 mM丙調酸 鋼、4 mM L-麵胺醢胺、0.6 mg/mL遺傳黴素、0.5 mg/ml勻 撤素之達爾伯克氏改質之伊格氏培養基（jnvitr0gen)中維持 於增殖生長階段》GH4C1-大鼠T6，S α7細胞重組表現T6，S 犬變型大鼠α7基因（Placzek等人，2005)。pCIneo中之T6，S 突變型大鼠α7基因構築體獲自R0ger l. Papke(U·, Florida) 且次選殖至pCEP4中。將質體構築體轉染至GH4C1細胞 中’且在潮黴素選擇下分離穩定純系。使GH4C1-大鼠T6，s α7細胞在含有l-麩胺醯胺、10%馬血清、5%胎牛血清及 0.15 mg/mL潮黴素Β之漢姆氏F10(Ham，s F10)中維持在增殖 生長階段。 受體結合檢定 由大鼠組織製備膜·大鼠皮質係獲自Analytical Bi〇1〇gieal

Services，incorporated(ABS，Wilmingt〇n，Delaware)。組織 係自雌性史泊格多利大鼠（Sprague_Dawley『Μ)剝離、冷凍 且在乾冰上運輸。組織儲存於_20t下直至膜製備所需。 156332.doc -53- 201200129 彙集10隻大鼠之皮質且藉由P〇lytron(Kinematica GmbH, Switzerland)於10體積（重量：體積）冰冷製備型緩衝液（11 mM KC1 ' 6 mM KH2P〇4 ' 137 mM NaCl ' 8 mM Na2HP〇4 χ 20 mM HEPES(游離酸）、5 mM碘乙醯胺、1.5 mM EDTA、 0.1 mM PMSF pH 7.4)中均質化。在4°C下以40,000 g離心 所得勻漿20分鐘，且使所得離心塊再懸浮於20體積之冰冷 水中。在4°C下培育60分鐘之後，藉由在4°C下以40,000 g 離心20分鐘收集新的離心塊。使最終離心塊再懸浮於製備 型緩衝液中且儲存於-20°C下。檢定當天，解凍組織，以 40,000 g離心20分鐘，接著再懸浮於達爾伯克氏磷酸鹽緩 衝鹽水（pH 7.4)(PBS, Invitrogen)中至最終濃度為每毫升2 至3毫克蛋白質。使用Pierce BCA蛋白質檢定套組（Pierce Biotechnology, Rockford，1L)測定蛋白質濃度，其中以牛 血清白蛋白作為標準。 自純系細胞株製備膜•將細胞收集於冰冷PBS(pH 7.4) 中，接著用 P〇lytron(Kinematica GmbH，Switzerland)均質 化。以40,000 g離心勻漿20分鐘（4。〇。使離心塊再懸浮於 PBS中且使用Pierce BCA蛋白質檢定套組（Pierce Biotechnology，Rockford，IL)測定蛋白質濃度。 在膜製備中對受體之競爭結合.使用由公開程序改編之 標準方法（Lippiello 及 Fernandes 1986; Davies 等人，1999) 在膜上分析菸鹼受體之結合^簡言之，自冷凍原料復原膜 且在冰上在競爭性化合物（0.001 nM至100 μΜ)及放射性配 位體存在下在150 μΐ檢定緩衝液（PBS)中培育2小時^ [3η]- •54· 156332.doc

S 201200129 於驗（L-(-)-[N-曱基-3H]-於驗，69.5(1^/111111〇1，？€4111-Elmer Life Sciences, Waltham，ΜΑ)用於人類 α4β2結合研 究。[3Η]-地棘娃素（52 Ci/mmol，Perkin-Elmer Life Sciences) 用於其他菸鹼受體亞型之結合研究。L-[二苯基乙醇-4,4· 3Η]琨啶基二苯乙醇酸酯（[3H]QNB)用於簟毒鹼受體結合研 究。各受體目標之膜來源、放射性配位體及放射性配位體 濃度列於表3中。使用預浸於0.33%聚伸乙基亞胺（w/v)中 之GF/B過渡器，經多歧管組織收集器（Brandel，Gaithersburg， MD)藉由快速過濾來結束培育以減少非特異性結合。用冰 冷PBS洗滌過濾器3次，且藉由液體閃爍計數測定所剩餘之 放射性。 表3.結合參數 結合目標 膜來源 放射性配位想 放射性配位逋 濃度(nM) 菸鹼，大鼠α4β2 大鼠皮質 [3Η]地棘蛙素 0.1 菸鹼，人類α4β2 SH-EP1-人類 α4β2 細胞 [3Η]菸鹼 2 菸鹼，人類α4β4 SH-EP1-人類 α4β4 細胞 [3Η]地棘蛙素 0.25 菸鹼，人類α6β3β4α5 SH-EP1-人類 α6β3β4α5 細胞 [3Η]地棘蛙素 0.5 菸鹼，人類α7 ^ ΗΕΚ 人類 a7/RIC3 [3Η]地棘蛙素 10 菸鹼，人類α3β4α5 SH-SY5Y細胞 [3Η]地棘蛙素 1 菸鹼，人類αΐβίγδ TE671/RD 細胞 [3Η]地棘蛙素 10 菸鹼，大鼠α3β4 PC12細胞 [3Η]地棘蛙素 0.6 簟毒鹼，Ml，M2 大鼠皮質 卩 H1QNB 2 簟毒鹼，M3 TE671/RD 細胞 γ3ηι〇νβ 1 結合數據分析•結合數據表示為總對照結合之百分比。 計算各點之複本的平均值且對藥物濃度之對數繪圖。使用 156332.doc -55· 201200129

GraphPad Prism 軟體（GraphPAD，San Diego，CA)，藉由最 小二乘非線性回歸測定IC5G(產生50%結合抑制作用之化合 物濃度）。使用程-普魯索夫方程式（Cheng-Prusoff equation) (Cheng及 Prusoff, 1973)計算 Ki。 鈣通量功能檢定 在各實驗之前24至48小時，將細胞以60至100,000個細 胞/孔塗於96孔黑壁底部透明之培養盤（Corning，Corning， NY)中。實驗當天，輕輕移除生長培養基，將含200 kL 1χ FLIPR!弓 4檢定試劑（Molecular Devices, Sunnyvale, CA)之 檢定緩衝液（對於SH-EP1 -人類α4β2細胞而言為20 mM HEPES、7 mM TRIS驗、4 mM CaCl2、5 mM D-葡萄糖、 0.8 mM MgS04、5 mM Κα、0.8 mM MgCl2、120 mM N-曱基D-葡糖胺、20mMNaCl(pH7.4)或對於所有其他細胞 株而言為 10 mM HEPES、2.5 mM CaCl2、5.6 mM D-葡萄 糖、0.8 mM MgS04、5.3 mM KC卜 138 mM NaCl(pH 7.4)) 添加至各孔中且在37°C下培育培養盤1小時（對於29°C處理 之SH-EP1-人類α4β2細胞而言為29°C )。對於抑制作用研 究，在添加染料時添加競爭性化合物（10 pM至10 μΜ)。自 培育箱移出培養盤，且使得平衡至室溫。將培養盤轉移至 FLIPR Tetra螢光成像板讀取器（Molecular Devices)中以便 添加化合物及監測螢光（激發：485 nm，發射：525 nm)。 將約通量之量與陽性（於驗）及陰性對照（單獨緩衝液）相比 較。將陽性對照定義為100%反應，且將測試化合物之結 果表示為陽性對照之百分比。在抑制作用研究中，對於 156332.doc -56-

S 201200129 SH-EP1-人類α4β2及SH-EP1-人類α4β4細胞，促效劑菸鹼以 1 μΜ之濃度使用，對於PC12及SH-SY5Y細胞，促效劑濃 度為10 μΜ且對於TE671/RD細胞，促效劑濃度為1〇〇 μΜ。 神經傳遞質釋放 如先前所述（8611(：1161>丨£等人，1998)使用獲自大鼠腦之紋 狀突觸體進行多巴胺釋放研究。彙集來自兩隻大鼠（雌 性’史泊格多利’重量150至250 g)之紋狀組織且使用玻璃/ 玻璃均質機於含有5mMHEPES(pH7.4)之冰冷0.32M嚴糖 (8 mL)中均質化。接著以uooxg離心組織1〇分鐘。去除離 心塊且以12,500xg離心上清液20分鐘。使所得離心塊再懸 浮於含有單胺氧化酶抑制劑之冰冷灌注緩衝液（丨28 mM NaCl ' 1.2 mM KH2P〇4 ^ 2.4 mM KC1 ' 3.2 mM CaCl2 ' 1.2 mM MgS04、25 mM HEPES、1 mM抗壞血酸、0.02 mM鹽 酸巴吉林（pargylineHCl)及10mM葡萄糖（ρH7.4))中且以 23，000xg離心15分鐘。使最終離心塊再懸浮於灌注緩衝液 (2 mL)中以供立即使用。 在37°C震盪培育箱中培育突觸懸浮液10分鐘以恢復代謝 活性。以0.1 μΜ之最終濃度添加[3H]多巴胺（[3h]da，比活 性—28.0 Ci/mmol，NEN Research Products)且在 37°C 下再 培育懸浮液10分鐘。將灌注緩衝液（100 μί)及組織（丨〇〇 pL)之等分試樣裝載於Brandei超灌流系統（25〇〇系列， Gaithersburg，MD)之超灌流腔室中。將灌注緩衝液（室溫） 以約0.6 mL/min之速率泵入腔室中歷時8分鐘之洗滌時 間。將競爭性化合物（1 〇 pM至1 〇〇 nM)施用於灌注流中歷 156332.doc -57- 201200129 時8分鐘。接著將菸鹼（10 μΜ)施用於灌注流中歷時48秒。 在整個實驗中自各腔室連續收集溶離份（各12秒）以捕捉基 本釋放及促效劑誘導之峰釋放且在促效劑施用之後重建基 線。將灌注液直接收集至閃爍瓶中，向其中添加閃爍流 體。藉由閃爍計數定量釋放之[3H]DA。對於各腔室而言， 針對其基線校正峰之積分面積。 釋放表示為在競爭劑不存在下在對照菸鹼下所獲得釋放 之百分比。在各檢定内，使用2個腔室複製各測試化合物 濃度，汁算複本之平均值。界定產生特定離子流之半數最 大抑制作用（IC50)之化合物濃度。 膜片鉗電生理學 細胞處理.自培育箱移出GH4C1-大鼠T6，S α7細胞之 後’抽吸培養基’以胰蛋白酶處理細胞3分鐘，輕輕濕磨 以自培養盤分離細胞，用記錄介質洗滌兩次且再懸浮於2 ml外部溶液（關於組成參見下文）中。將細胞置於倒立Zeiss 顯微鏡（Carl Zeiss Inc.，Thornwood，NY)載物 a 上之

Dynaflow晶片安裝台中。在確定全細胞記錄構型之前平均 需要5分鐘。為避免細胞條件改變，記錄每單次裝載之單 細胞。為引起短反應，使用Dynaflow系統（Cellectdc〇n Inc·，Gaithersburg，MD)施用化合物〇·5秒，其中各通道在 50或150 psi下傳遞壓力驅動之溶液。 電生理學.使用習知全細胞電流記錄。用玻璃微電極（5 至10 ΜΩ電阻）在細胞表面上形成密封件（> 1 gjq)直至應用 抽吸轉換為習知全細胞記錄。接著在-60 mv之保持電位下 -58· 156332.doc

S 201200129 電壓夾持細胞，且量測響應於配位體應用之離子電流。在 1 kHz下過濾用Axon 700A放大器記錄之全細胞電流，且在 5 kHz下藉由 ADC板 1440(Molecular Devices)取樣。全細胞 接入電阻小於 20 ΜΩ。使用 Clampex 10(Molecular Devices, Sunnyvale，CA)獲取全細胞電流之數據且使用Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)將結果繪圖。實 驗數據以平均值土S.E.M.形式呈現，且使用史都登氏t測試 (Student、t test)及二因子變異數測試分析不同條件之比較 的統計顯著性。所有實驗均在室溫下（22±1°C )進行。濃度-反應概況符合希爾方程式（Hill equation)且使用Prism 5.0分 析。 溶液及藥物施用•標準外部溶液含有：120 mM NaC卜3 mM KC1、2 mM MgCl2、2 mM CaCh、25 mM D-葡萄糖及 10 mM HEPES且用Tris鹼調節pH值至7.4。用於全細胞記錄 之内部溶液由以下組成：110 mM Tris填酸氫二鹽、28 mM Tris鹼、11 mM EGTA、2 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2及 4 mM Mg-ATP(pH 7.3)(Liu等人，2008)。為起始全細胞電流 反應，藉由將細胞自對照溶液移至含有促效劑之溶液中且 返回以便溶液交換在約50 ms内出現（基於峰值電流上升時 間之10%至90%)來傳遞化合物。特定調整化合物施用之間 的時間間隔（0.5至1分鐘）以確保受體反應之穩定性（無功能 下降），且在相同目標下選擇用於大部分本文所述研究之 吸液管溶液。（-)-終驗及乙醯膽驗（ACh)係購自3丨径111&-Aldrich(St. Louis，MO)。所有藥物每天由儲備溶液來製 156332.doc -59- 201200129 備0 為測定本發明化合物對ACh感應電流之抑制作用，吾人 確定施用70 μΜ ACh(通常穩定的5至10次連續施用）之穩定 基線記錄。接著ACh(70 μΜ)與在1 nM至10 μΜ濃度範圍内 之測試化合物共同施用。因為尾電流（在〇5&ACh施用結 束時所量測之電流）經歷最完全之變化，所以抑制及回收 圖表表示尾電流之振幅。 列表概述

如表4中所示，對於人類α4β2、α7及神經節受體亞型， 表示本發明之化合物通常展現在1至1〇〇 範圍内的抑制 常數（Ki值）’表明此等受體亞型之正位作用結合位點（亦即 競爭性促效劑之結合位點）之低親和力。然而，表4中之數 據亦說明對於此等受體亞型，表示本發明之化合物有效抑 制離子流，其中典型1〇：5〇值小於約2 mM且血 P ’、土 值 >95%»總結而言，此數據表明表示本發明之化合物在麫 由不涉及在正位作用位點結合之機制抑制由此等受體亞= 介導之離子流方面有效。表5呈現化合物A及化合之藥 理學概述。表6呈現化合物A及化合在大鼠中的ρκ評估 之概述。 ° 表4

156332.doc -60· 201200129 表5 :藥理學概述 檢定 化合物A 化合物B Αα4β2 Ki(nM) >10,000 nM >10,000 nM Λα3β4 Ki(nM) >10,000 nM >10,000 nM hal Ki(nM) >10,000 nM >10,000 nM Αα4β2 IC50 [HS](nM) ; Imax(抑制 340 nM(99%) 340(98%) Λα4β2 IC50 [LS](nM) ; Imax(抑制％) 95 nM(98°/〇) 99 nM(98%) Αα3β4 IC50(nM) ; Imax(抑制 ％). 36 nM(l ⑻ ％) 28 nM(100°/〇) Αα4β4 IC50(nM) ; Imax(抑制％) 340 nM(100%) 380 nMilOO%) 電生理學 Αα4β2 IC50「HS1 非活性 正向調節劑 Αα4β2 IC5〇 [LS] 非競爭性抑制劑 非競爭性抑制劑 (抑制50%) (抑制75%) 抑鬱症模型： 小鼠強制游泳測試(mFTS) 3-10 mg/kg 1 & 10 mg/kg 懸尾實驗(TS) 1-3 mg/kg 1-10 me/kg 高血壓(SHR) 3-10mg/kg l-lOme/ke 成瘾症 於驗藥物辨別 1 mg/kg 1 mg/kg 菸鹼自投與 3 mg/kg 1-3 mg/kg 主要酶清除 無 無 血聚t ι/2 5小時 4小時 腦曝露(Br:P) 5 4 表6 :化合物A及化合物B在大鼠中之PK評估 在大鼠中比較PK 化合物A 化合物B 靜脈内(2.5 mg/kg) tmax(hf) 0 0 ti/2(hr) 4.84±1.25 4.08±0.09 CL(L/hr/kg) 1.18 士 0.11 1.17±0.09 Vss(L/kg) 6.64±0.71 6.17±0.45 AUC*tt-*(hr*ng/mL) 2070±156 2121±155 AUC〇〇(hr*ng/mL) 2129±194 2152±157 尿(未變‘物之％) 28 41 _ 口服(5 mg/kg) Cmaving/mL) 271 士 15.3 451±185 156332.doc •61 · 201200129 tmaxihr) 2.83±2·02 1.17±0.7 ti/2(hr) 7.38±3.35 5.12±1.54 AUC*後-次(hr.ng/mL) 3086±303 2657±492 AUC〇〇(hr»ng/mL) 3538士757 2772±429 生物可用性(％) 83±18 64±10 尿(未變藥物之。/〇) 25±3.4 41±10.7 腦/血漿比(@lh) 5 4 交叉比較，電生理學 次純系人類上皮-ha4p2細胞•使用已確立之技術引入人 類 a4(S452)及 β2次單元（由 Dr. Ortrud Steinlein, Institute of Human Genetics, University Hospital, Ludwig-Maximilians-UniversitSt，Munich，德國友情提供）且分別次選殖至 pcDNA3.1-勻黴素及pcDNA3.1-潮黴素載體中，至天然無 效NNR SHEP1細胞中以產生異源表現人類α4β2受體之穩定 轉染之單株次純系人類上皮（SH-EPl)-ha4p2細胞株。使細 胞培養物在低繼代數量下（自冷凍原料之1至26代，以確保 表型穩定表現）維持於用0.5 mg/ml勻黴素及0.4 mg/ml潮黴 素增強之完全培養基中（提供轉染物之正選擇）且藉由分裂 剛匯合之培養物1:20每週繼代一次以維持細胞增殖性生 長。循環進行反轉錄酶-聚合酶鏈反應、免疫螢光、放射 性配位體結合檢定及同位素離子流檢定以確定α4β2 NNR 之穩定表現為訊息、蛋白質、配位體結合位點及功能受 體。 細胞處理.與上文所述類似，在自培育箱移出之後，抽 吸培養基，且以胰蛋白酶處理細胞3分鐘，用記錄介質充 分洗滌兩次且再懸浮於2 ml外部溶液（關於組成參見下文） 156332.doc -62-

S 201200129 中。輕輕濕磨細胞以將其自培養盤中分離且轉移至4 ml試 管中，將來自試管之細胞置於倒立Zeiss顯微鏡（Carl Zeiss Inc·，Thornwood，NY)載物台上之Dynafl〇w晶片安裝台中。 在確定全細胞記錄構型之前平均需要5 min。為避免細胞 條件改變，記錄每單次裝載之單細胞。為引起短反應，使 用 Dynaflow 系統（Cellectricon，Inc.，Gaithersburg, MD)施用 促效劑，其中各通道在50或150 psi下傳遞壓力驅動之溶 液。 電生理學•與上文所述類似，習知全細胞電流記錄連同 用於快速施用及移除促效劑之電腦控制Dynafl〇w系統 (Cellectricon，Inc.)—起用於此等研究中。簡言之，將細胞 置於倒立顯微鏡（Carl Zeiss Inc·)上之石夕晶片浴安裝台中。 用標準外部溶液（60 μΐ/min)連續灌注經選擇用於分析之細 胞。用玻璃微電極（3至5 ΜΩ電阻，在吸液管與細胞外溶液 之間）在細胞表面上形成密封件〇 GO)直至應用抽吸以轉 換為習知全細胞記錄。接著在_6〇 mV之保持電位下電壓夾 持細胞’且量測響應於配位體應用之離子電流。在1 kHz 下過濾用Axon 700A放大器記錄之全細胞電流，且在5 kHz 下藉由ADC板1440(Molecular Devices)取樣且儲存於PC電 腦之硬碟上。全細胞接入電阻小於2〇 ΜΩ。使用Clampex l〇(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)獲取全細胞電流之 數據且使用 Prism 5.0(GraphPad Software Inc” San Diego, CA)將結果繪圖。實驗數據以平均值土S.E.M.形式呈現，且 使用史都登氏t測試分析不同條件之比較之統計顯著性。 156332.doc -63- 201200129 所有貫驗均在室溫（22±leC )下執行。濃度-反應概況符合希 爾方程式且使用Prism 5.〇分析。在實驗條件下，在反應細 胞之部分中偵測不到差別。9〇%以上之細胞對乙醯膽鹼 (ACh)有反應，且將考量呈現可量測電流之每一細胞。在 整個實驗中將細胞保持於_60 mV。所有藥物每天由儲備溶 液來製備。 神經元α4β2受體劑量反應曲線可藉由與先前所述之方法 (C〇Vernton及ConnoUy，2〇〇〇)相當之兩個實驗希爾方程式 之總和描述： y - L·, [al /(l + (EC50// / χ)"Η')+ (ι _ αι)/^ + (ecj〇^ / xy^ j (!) 其中/max為最大電流振幅，且x為促效劑濃度。EC5…、 福及fll為在HS狀態τ半數有效濃度、希爾係數及受體之 百刀比。ECsoZ及《Η2為在LS狀態下之半數有效濃度及希 爾係數。在一些情況下，使用單個希爾方程式， •V = 4，Ml-(EC50/;c)1 來比較與方程式丨之擬合〜x、EC5。及紐具有相同含義。 使用以下形式之單指數方程式分析對Μ%促效劑之反應 的開放通道阻斷之時程： Y = A^xp(-t/T)-B (2) 其中少為電流（以皮安計）’ j為對照最大峰值電流（以皮安 計）’ τ為時間常數（以毫秒計），及為平衡下之電流（以皮安 計）且纟為時間（以毫秒計）。 溶液及藥物施用•標準外部溶液含有：12〇福就卜3 福 κα、2 mM MgCi2、2 mM CaCi2、25 mM D葡萄糖及 156332.doc -64- 201200129 1〇111]\4 1^?£8且用1'1^鹼調節？11值至7.4。在實驗中，在無 阿托品（atropine)之情況下將ACh用作促效劑，此係因為實 驗資料顯示1 μΜ硫酸阿托品不會影響ACh感應之電流（未 圖示）且因為已報導阿托品本身會鎖定菸鹼受體（Liu等人， 2008)。對於所有習知全細胞記錄而言，使用Tris電極且填 充含有以下之溶液：110 mM Tris磷酸氫二鹽、28 mM Tris

鹼、11 mM EGTA、2 mM MgCl2、0.1 mM CaCl2及 4 mM

Mg-ATP(pH 7.3)。為起始全細胞電流反應，藉由將細胞自 對照溶液移至含有促效劑之溶液中且返回以便溶液交換在 約50 ms内出現（基於峰值電流上升時間之丨〇%至9〇%)來傳 遞菸鹼促效劑。特定調整藥物施用之間的時間間隔（〇·5至j 分鐘）以確保受體反應之穩定性（無功能降低），且在相同目 才示下選擇用於大部分本文所述研究之吸液管溶液。本發明 之研究中所用之藥物（包括（-)-菸鹼及ACh)係購自8丨8〇13_ Aldrich(St. Louis, MO)。 圖5表示化合物A及化合物B對由比較性選擇性α4β2 受體促效劑、TC-2559、[(Ε)-Ν-曱基_4·[3_(5_乙氧基吧咬）_ 基]-3-丁烯-1-胺](0.1 μΜ)誘導之反應的不同作用。來見

Bencherif等人，Eur J Pharmacol 2000 Dec 1; 409 (1). 45 55。可觀測到由1 μΜ化合物A促進〇.丨μΜ比較性化合物之 反應（最大值之115%，η=4個細胞）且缺少化合物3對比較性 化合物（0·1 μΜ)反應（η=3)之作用。化合物a對基線之作用 顯著’然而在施用化合物B之後無顯著作用。二因子變異 數分析及邦弗朗尼氏多重比較測試顯示化合物A與化合物 156332.doc •65- 201200129 B之作用之間的顯著差別。 圖6表不化合物a與化合物8對1〇 μΜ菸鹼誘導之反應之 使用依賴性抑制的差g。如所觀察，在1〇個於驗後續脈衝 (10 μΜ)之後，兩種化合物在丨之濃度下產生對丨〇 ^…^菸 鹼反應之較大使用依賴性抑制。化合物Α(75%，η=4個細 胞）及化合物Β(50%，η=4個細胞;)不同地阻斷反應。與化合 物Β之10個脈衝相比，由化合物Α誘導之半數反應抑制由5 個脈衝組成。此情況說明化合物A與化合物B相比為ls α4β2受體之更有效開放通道阻斷劑，且可能展現對ls α4β2受體與HS α4β2受體相比之選擇性的增加。 自發性高血壓大鼠（SHR)中之遙測技術： SHR為用以研究心血管疾病之原發性高血壓之動物模 型。高血壓之充分研究模型如許多公開案所量測，在196〇 年代由Okamoto及同事獲得SHR品種，其開始養育患有高 血壓之WiStar-Ky〇t〇(WKY)大鼠；一種WKY品系之子品 種。下文所述的遙測模型中所用個體為15週齡雄性（分娩 後）；總計n=6。用於研究之特定模型如下。 將遙測裝置（DSI TA11PA-C40 4DSITL11M2-C50- PXT; Data Sciences International)以手術方式植入麻醉下 的個體之腹膜腔中。將該裝置之導管面向上游插入腎動脈 之下的降主動脈中。投與抗生素以防感染。將植入之遙測 裝置用於此研究使在無任何約束存在的情況下自個體獲取 量測值，由此減少應力對讀數之影響。 自手術恢復之後（約1週），將動物個別地置於位於遙測 -66 - 156332.doc

S 201200129 接收器（Data Sciences International)之上的家用籠中。將遙 測裝置程式化以記錄平均的收縮及舒張動脈血壓 以及心率（跳動次數/分鐘），其係源自脈衝血壓。 使用 Data Sciences internati〇nal軟體（Dataquest A r ttm 2.0版或2.3版）獲取及分析所有產生的資料。在測試化合物 投與之前每隔5分鐘記錄2〇秒之區段持續3〇分鐘且在測試 化合物投與之後持續24小時。報導投與之後i、1〇、2〇、 3〇、40、50、60分鐘及2、4、8、12及24小時之時間點的 作用各動物接党媒劑且接著接受一劑量之測試物質，其 中指定物質之各處理之間有至少48小時之沖洗時間。在不 同測試物質之間提供一週之沖洗時間。 使用一因子變異數分析（組，時間點）分別對各測試物質 進行組間崎，每次進行重複量測，之後❹單因子變異 數分析（組），每次用以偵測顯著的組乂時間相互作用。在注 意到顯著組差異之情況下’進行㈣特Μ測試事後分 使用以與遙測技術評估所述相同之方式給藥的 (無遙測植入物）來測定2小時時間點的血聚含量濃度。 總之’已選擇性地繁殖多代展現高血壓之自發：高血壓 大鼠（SHR)植人有遙測裝置以記錄/傳輸平均的收縮及舒張 壓(_Hg)以及，動次數/分鐘)，其係源自脈 t 動物個別地圈養於置於遙測接收器之上的籠 :’㈣遙測接收器說明且定量以下程式 料:投與之後1、1〇、2〇、3。、4。'5。、6。分鐘及2'4身 156332.doc -67- 201200129 8、12及24小時。將相同的6隻動物用於在研究過程（在處 理之間併入有適當沖洗時間）中的多次劑量/化合物評估。 使用以與植入有遙測裝置之彼等組相同之方式給藥的附屬 SHR組測定測試化合物之血漿含量濃度。 圖7及圖8呈現化合物A及化合物3與參考化合物美卡拉 明（mecamylamine)相比的抗高血壓潛力。 小鼠強制游泳測試

Porsolt游泳測試（PST)(亦稱為強制游泳測試（FST》係由

Roger Porsolt在 1977年提出（Porsolt等人，1977)。強制游泳 測試廣泛用作抗抑鬱化合物之臨床前篩檢模型（B〇rsini及 Meli，1988)且依用於測試之動物之物種及品種而定，已顯 示對於菸鹼化合物具有良好敏感性（Caldar〇ne等人，2〇〇4 ;

Rabenstein 等人，2006 ; Gatto 等人，2004 ; Mineur 等人， 2007)。此檢測法通常使用成年雄性Baib/c小鼠（其中每處 理組n=12)。 簡吕之，對於各測試動物，游泳測試由以下組成：在含 有12 cm深度之新鮮23t： ±2自來水（約8〇〇如）之個別 Plexiglas™缸中游泳一段6分鐘。在6分鐘試驗過程中，經 由即時視訊分析獲取動物用於r掙扎」、「游泳」或「飄 浮」之時間’使用講自Bioserve GmbH(Bonn,德國）之FST 分析系統及軟體計算及呈現數據。游泳測試之後，使各動 物返回用加熱墊預熱之籠中。使動物乾燥至少10分鐘，之 後返回飼養籠中。 使用單因子變異數分析（AN〇VA)分析所有正態分佈之 156332.doc -68- 201200129 pst數據’其中以齊,j量作為主要效應。可使用二因子變異 數刀析以確疋掙扎、游泳或漂浮之時程，纟中以處理及時 1乍為主要效應。將化合物效應與媒劑處理組相比。使用 都内特氏測試法（Nete作人，1985)進行事後分析。可使用 等效非參數測試法評估不遵循正態分佈之任何數據。當 P<0·05時，認為結果具統計顯著性。 較佳係選擇可以評估與行為活動之顯著變化具相關性的 血液及腦中測試化合物含量之方法。亦可自各psT處理組 之子組（每處理組5隻動物）收集腦及血液樣品，以確保兩個 ί、應商扣種之間的藥物敏感性之潛在差異與藥物分配或代 謝無關。 在「游泳測試」之後自游泳槽移除動物之後，可在含 70% C02之空氣麻醉下，藉由心臟穿刺法抽取血液樣品。 隨後對個體施行安樂死。移出腦且轉移至小瓶中，以便 於·2〇。。下儲存。處理血液樣品且冷凍血漿樣品，直至進 一步完成行為數據之評估。 總之’藉由將小鼠置於深度為動物尾巴不能觸及底部之 圓柱槽中進行游泳測試。小鼠接受測試化合物或媒劑之急 性注射’帛著置於充滿水之游泳槽中。在6分鐘試驗過程 中，經由即時視訊分析獲取動物用於「掙扎」、「游泳」 或「漂浮」之時間，使用購自Bi〇serve GmbH(B〇nn，德 國）之FST分析系統及軟體計算及呈現數據。游泳測試之 後，使各動物返回用加熱墊預熱之籠中。使動物乾燥至少 10刀鐘’之後返回飼養籠中。圖u說明化合物A、化合物 156332.doc -69- 201200129 B及參考化合物之作用。參考化合物（外_s•美卡拉明）之數 據已於2008年提出。 小鼠之尾懸測試 尾懸測試（TST)首先由Steru(Steru等人，1985)提出作為— 種在小鼠中篩檢抗抑鬱劑之方法。該模型係基於觀測：尾 巴經懸吊而不可能逃脫之小鼠最終停止掙扎，屈服於對實 驗條件之絕望或無助狀態。將此不活動或絕望行為視為抑 營症模型且抗抑鬱藥已顯示確實會減少不活動時間β τ s τ 廣泛用作新穎抗抑鬱化合物之筛檢方法（Kulkarni等人， 2007 ; Mineur等人，2009 ; Poliak等人，2010 ; Turner等人， 201 〇)。在TST中用諸如美卡拉明之於驗括抗劑急性處理產 生抗抑鬱作用（Popik等人，2003 ; Caldarone等人，2004 ; Rabenstein 等人，2006 ; Andreasen 及 Redrobe 2009a ; Andreasen 及 Redrobe 2009b; Andreasen 等人，2009)。本發 明之研究使用 Jackson Laboratories, Bar Harbor，ME所提供 之雄性A/J小鼠（每處理組n=12)。 在開始測試之前使小鼠適應測試室至少1小時。在用媒 劑、測試化合物或地昔帕明（desipramine)預處理之後，將 各動物置於計數器上且將一塊透明（Scotch)膠帶附著至尾 巴上，膠帶自尾中部開始超過尾末端2 cm。接著將動物升 至尾懸腔室中且用吊鉤刺穿尾巴膠帶之末端且將動物懸 吊。觀測期在動物懸吊之後即刻開始，且運作最長10分 鐘0 經由電腦用1分鐘接收器自動收集數據。不動時間、挣 156332.doc -70- 201200129 扎強度及掙扎頻率 獲取。 之量測藉由尾懸軟體（Biobserve， 德國） 、/里作為主要效果之單因子變異數分析（ANOVA)基 於以下-平刀里表分析所有正態分佈之psT數據。將化合物 作用與媒劑處理組相比。使用都内特氏測試⑽如等人， 1985)進仃事後分析。使料效非參數測試評估顯示不均 勻分佈之任何數據。tp<GG5時，認為結果統計上顯著。 ㈣之II由投與測試化合物，接著放置尾巴附著膠帶之 小鼠且用圍入專門腔室之鉤懸吊動物進行尾懸測試。自動 收集來自小鼠之資料且經1G分鐘試驗進行評估。不動時 間、掙扎強度及掙扎頻率之量測藉由尾懸軟體⑻如㈣， 德國）獲取。游泳測試之後，使各動物返回用加熱塾預熱 之籠中。使動物乾燥至少10分鐘，之後返回家用籠中。圖 12說明化合物a、化合物B及參考化合物之作用。參考化 合物（外-S-美卡拉明）之資料於2008年提出。 大鼠中之辂驗藥物辨別 精神作用藥劑作為辨別刺激之作用與其在人類中之「主 觀J作用緊密相關（Bigelow及Preston，1989)。就此而+ 動物中藥物之辨別特性的分析在預測何種特定藥物可能易 於濫用方面具有重要價值。然而，普及藥物辨別程序之另 一主要原因為化合物之辨別刺激特性之顯著藥理學特異 性。因此’範例亦可用以視新穎化合物與具有已知藥理學 之指定訓練藥物相比的辨別刺激相似性而定，閣明新♦員化 合物之藥理學機制（Goudie及Leathley，1993)。 156332.doc • 71· 201200129 在最簡辨別範例中，動物經訓練會根據其接受訓練化合 物抑或媒劑而產生不同反應。訓練化合物通常可為菸鹼。 動物經訓練以在接受菸鹼之後按壓兩個桿中之一者且在接 受媒劑之後按壓另-者。當動物輕易辨別於驗與媒劑時， 可投與新穎化合物。若在接受新穎化合物後，動物對與訓 練化合物（菸鹼）相關之桿有反應，則推斷新穎化合物具有 與於驗類似之辨別職特性（亦即新賴化合物為訓練^合 物之「替代物」P若動物對與媒劑相關之桿產生大部分 或所有反應，則新穎化合物不具有與菸鹼類似之「主觀」 作用(亦即其不為「替代物」）。經由訓練，動物可將各種 精神作用化合物與其媒劑區別開。具有共同藥理學機制且 在人類中產生類似辨別刺激特性概況之化合物通常在此範 例中能彼此替代。或者，具有不同辨別刺激特性概況及實 質上不同藥理學之化合物通常不能彼此替代 1990) 〇 此方案之主要目的為在經訓練以辨別指定劑量之（·）_菸 驗的大鼠中確定新額終驗乙酿膽驗受體促效劑是否被視為 於驗類似物。特定言之，本發明之研究經設相在經㈠_ 菸鹼訓練之大鼠中確定測試化合物是否產生與㈠_於鹼類 似之辨別刺激提示。此方案内之其他實驗將確定當在()_ 於驗投與之前投與時，此等新賴化合物若無任何終驗樣作 用，則是否展現任何於驗刺激減弱特性（㈣「阻斷」）。 成年雄!生史泊格夕利大鼠維持於年齡匹配對照物之體重之 約85%，直至其達到350 ggp在實驗室中用於藥物辨別範 156332.doc -72· 201200129 例。在研究之其餘部分中維持35〇±1〇 g之目標體重以在操 作任務中在食慾上刺激動物。 在位於通風靜音箱中之操作腔室（Med Associates， Georgia，VT)中進行訓練及測試。腔室之前面板含有2個可 收起之桿及位於中心之食物槽’其位於兩桿中央。室光位 於後面板之中心。腔室之操作及資料獲取將由電腦系統實 現（Med Associates Inc.，Georgia，VT)。 最初訓練大鼠按壓一個桿以獲得45 mgi糖小球（Βι〇_ SERV)。在此等階段中，僅單個桿可用於反應^反應要求 由固定比率UFR-1)逐漸增加至固定比率20(FR-20)，且在 腔至中之放置與該階段開始之間施加1〇分鐘間歇期（等同 於預處理時間）。各階段在20個強化物或20分鐘之後結 束。每天（通常一週5天）進行各階段。 在桿獲取之後，兩個桿皆可用於反應。一 個稈分配用於 訓練化合物（CL)且另一桿用於媒劑（VL) 一旦大鼠確實會辨別（_)_菸鹼與生理食鹽水且維持準 則’則在插入階段所呈現之訓練條件下每週兩次進行測試 P皆段。測試條件與訓練條件相同，但在任_桿上的2〇個連 續反應使得食物傳遞。制職階段在放置於自動測試腔 室中之後U)分鐘開始，且持續直至提供2〇次食物強化物或 2〇㈣之後，以首先達成之條件為準。測試特定化合物之 給藥次序偽隨機地進行。藉由5 w 猎由至v 一天在注射藥物媒劑或 訓練劑量之㈠韻之後的準則反應將所有測試階段彼此 分離。若大鼠未能滿足準則反應，則使其回到訓練條件下 156332.doc •73· 201200129 直至在準則出現下的三個連續階段。為 對測試條件期間反應選擇之作 "、、束條件 评<1卞用/則疋各劑量之測試化合 物兩次’―次根據訓練化合物且—次根據媒劑訓練階段。 了測4對於驗提示並不f遍之化合物之拮抗劑特性。杏 測試藥劑是否削弱訓練化合物之辨別刺激作用日夺，在訓： 樂物(菸鹼)之前或與其組合給予潛在结抗劑。此外，若需 要’則將雙重敎各劑量之阻斷作用；—次根據訓練化合 物且一次根據媒劑訓練階段。 =應選擇㈣藉由測定在錢適#桿上&狀總反應之 百分比來計算(’鹼桿反應之數量除以兩桿上之反應總 ]°)且计算整個階段之反應速率（兩桿上之反應除以 完成階段所需秒數）。測試階段之前的訓練階段之反應選 擇之組平均值及反應速率將表示對照效能。 用針對為了替代所測試之各藥物的單因子重複量測變異 數刀析（ANOVA)評估組反應選擇及速率數據之顯著差異。 在各大鼠内計算源自指定劑量下雙重測定之數據的平均 值，且將此平均值用於變異數分析中。辨別刺激及反應率 作用之劑量-作用測定之ED”值亦可基於平均_作用曲線之 線性部分經對數變換數據計算。使用程式劑量_作用分析 以及微型計算機（Biosoft，Cambridge，υκ)或類似軟體執行 計算。 總之’認為中柩活性化合物之辨別（提示）刺激特性在介 導尋求藥物行為及渴望中起主要作用。共享辨別刺激作用 之藥物亦具有共同的中樞藥理學，且確實表明在人類中可 l56332d〇c -74-

S 201200129 月b存在類似濫用風險。因此，藥物辨別任務可用以表徵各 種化合物之菸鹼樣作用。雄性史泊格多利大鼠經訓練以食 慾刺激之雙選擇操作程序來辨別〇·3 mg/kg菸鹼與生理食鹽 水。一旦大鼠確實會辨別（_)_菸鹼（0·3 mg/kg ;腹膜内）與 生理食鹽水，則在中間階段所呈現之訓練條件下每週兩次 實施測試階段。測試條件與訓練條件相同，但在任一桿上 的20個連續反應使得食物傳遞。在建立（-)-菸鹼（〇.03至1 mg/jg ;皮下）劑量-反應測定之後，在各測試個體内在個別 測試階段期間，以單次皮下劑量測試化合物。使用自動活 性監測系統（Med Associates，Inc.，Georgia，VT)以兩個操作 桿中之每一者上所獲得的反應數量及速率記錄各動物之定 量行為量測。在測試階段中，為任一桿上之反應獎賞動 物。在此評估時間期間亦記錄任何重大臨床觀測。組合各 治療條件内之行為量測且繪圖以確定劑量反應曲線，該劑 量反應曲線可與自用媒劑及菸鹼（通常劑量範圍為〇 〇3至i mg/kg ;皮下）處理之後的相同動物所收集之數據相比。圖 9提供與若干參考化合物之公開數據相比的化合物a及化合 物B之數據，顯示化合物A及化合物B阻斷菸鹼之辨別刺激 作用且證明化合物A及化合物B在治療物質濫用及依賴中 之潛在有效性。以下公開案關於所提供之數據以引用的方 式併入本文中·美卡拉明：Schechter MD Rosecrans JA. ffsct of Mecamylamine on discrimination between nicotine-and arecoline-produced cues. Eur J Pharmacol 1972;17:179-182 ’ 美卡拉明及六煙季銨（Hexameth〇nium) : stolerman 156332.doc -75- 201200129 IP, Garchia HS, Pratt JA, Kumar R. Role of training dose in discrimination of nicotine and related compounds by rats.

Psychopharmacology 1984; 84:413-419 ;及參考化合物 1(伐 倫克林）：LeSage MG, Shelley D, Ross JT，Carroll FI，

Corrigall WA. Effects of the nicotinic receptor partial agonists varenicline and cytisine on discriminative stimulus effects 〇f nicotine in rats. Pharmacol Biochem Behav 2009;91:461-467。 菸鹼自投與 動物的靜脈内（i.v.)藥物自投與（SA)為量測藥物之增強 (亦即有益/不利）作用之程序。此熟知動物模型廣泛用於治 療物質溢用及依賴之候選藥物之臨床前評估（Mell〇及 Negus，1 996)以及充當評估治療CNS相關病症之潛在藥物 療法之工具。基礎研究表明動物中介導藥物強化特性之潛 在藥理學機制及神經電路與人類中介導藥物之濫用相關作 用的藥理學機制及神經電路大部分重疊（K〇〇b，1992 ; Volkow等人，1999)。有趣的是，人類所濫用之2〇餘種精神 作用藥物充當大鼠中之強化物的發現支持以下設想：在動 物中藥物SA可為人類種濫用傾向之可靠預測因子（c〇iiins 等人，1984)。 菸鹼之強化特性已使用齧齒動物（C〇rngal及c〇en， 1989)、非人類靈長類動物（Le F〇u等人，2〇〇7)及人類 (S〇fu〇glu等人，2007)使用靜脈内自投與範例在實驗室動物 中證明。菸鹼經由位於活化腹側被蓋區（VTA)中的多巴胺 -76- 156332.doc

S 201200129 激導性細胞體上之高親和力含B2次單元之菸鹼膽鹼能受體 及藉由改變伏核中的細胞外多巴胺之麵胺酸含量產生SA行 為（Pontieri等人，1996)。菸鹼SA模型對用於評估戒菸之潛 在治療極有價值，且此已藉由使用該模型預測作為戒菸治 療的伐倫克林（varenicline)之臨床功效來論證（R〇Uema等 人，2007)。 已使用多種藥物療法提高戒於效果。然而，復發率仍舊 很咼，表明需要替代物來治療菸草依賴，除使用s A模型作 為可具有抗吸菸潛能之藥理學藥劑之篩檢測試之外，菸鹼 SA模型可用以評估新穎nAchR之濫用傾向。 所有動物最初經訓練以對操作桿作出反應而得到45 mg 蔗糖食物小球強化物（桿獲取階段）。在食物訓練之後，使 動物經歷手術導管植入。在恢復之後返回SA程序，用菸鹼 注射（每次輸注0.01 mg/kg)替代食物強化物。在1至2週期 間，桿反應要求將增加且菸鹼劑量將增至每次輸注0 mg/kg。一旦大鼠達到8八訓練準則（參見第5 6節”將使用 個體内裝置產生劑量反應曲線。各測試動物之典型劑量反 應曲線應耗時3至5週。nAChR藥理學在保祕驗自投與中 之作用將藉由在置放於實驗腔室中之前投與測試化合物來 :估。化合物將以混合投與次序進行研究。動物在專利導 B之哥命内通常將接受若干種化合物，導管壽命可長達6 個月或6個月以上之時間。此研究將自動物到達設施之日 起3年内完成。通常在週一至週五進行6〇分鐘階段。 總之’動物經訓練以對操作桿作出反應而得到薦糖食物 156332.doc •77· 201200129 桿要求由固定比率

強化物之反應。生理食鹽水給藥包括在各藥物反應曲線 小球強化物（桿獲取階段）。在3週期間， 1(FR1)增至固定比率5(fr3)。一旦大窗 内。圖10說明化合物A、化合物B及比較物美卡拉明對菸 鹼自投與之作用。 人類α4β2及α3β4通道之使用依賴性抑制 此研究之目標為研究化合物對穩定表現於SH-EP1細胞 中之α4β2通道及穩定表現於CHO細胞中之α3β4通道的使用 依賴性作用。已使用自動平行膜片甜系統（patchXpress(g) 7000A)執行所有實驗。在各實驗期間進行以下添加：乙醯 膽驗-10 μΜ ;乙醯膽驗-1 0 μΜ ;乙酿膽驗_ 1 〇 μΜ ;乙醯膽 鹼-10 μΜ;乙醯膽鹼-10 μΜ;(乙醯膽鹼-ίο μΜ)+(測試化 合物-XX μΜ);(乙醯膽鹼-10 μΜ)+(測試化合物-XX μΜ); (乙醯膽鹼-1 0 μΜ)+(測試化合物-XX μΜ);(乙醯膽驗-1 〇 μΜ)+(測試化合物-XX μΜ);(乙醯膽鹼_ι〇 μΜ)+(測試化合 物-XX μΜ);(乙醯膽鹼-10 μΜ)+(測試化合物-XX μΜ); (乙醯膽鹼-10 μΜ) + (測試化合物·ΧΧ μΜ);(乙醯膽鹼-10 μΜ)+(測試化合物-XX μΜ);(乙醯膽鹼-10 μΜ) + (測試化合 •78· 156332.doc

S 201200129 物 X PM) ’（乙醯膽驗_ 1 〇 μΜ)+(測試化合物pM);乙 醯膽鹼-Η) μΜ;乙醯膽鹼_10 μΜ;乙醯膽鹼_1〇 μΜ;乙醞 膽鹼-10 μΜ ;及乙醯膽鹼_} 〇 μΜ。 在各施用（單獨乙醯膽鹼或乙醯膽鹼加測試化合物）之 後用對照無藥物培養基沖洗1分鐘。對於所有計算值而 言，針對由第5次施用乙醯膽鹼所引起之峰值電流振幅校 正峰值電流振幅。 評估〇·1、1及10 μΜ之化合物Α對人類α4(32通道之作用。 圖13概述實驗結果。在與乙醯膽鹼共同施用1 〇次之後，化 合物Α在（Μ μΜ下抑制η 54%乙醯膽鹼引起之電流 (η=11)、在1 μΜ下抑制61·86%(η=10)及在10 μΜ下抑制 87·27%(η= 1 〇) 〇 «平估0· 1、1及1 〇 μΜ化合物a對人類α3β4通道之作用。圖 14概述實驗結果。在與乙醯膽鹼共同施用1〇次之後，化合 物Α在0.1 μΜ下抑制39 〇1%乙醯膽鹼引起之電流至 1〇)、在14厘下抑制66.85%(11=4至11)及在1〇4]^下抑制 91 ·66%(η=5至 6)。 評估0.1、1及1〇 μΜ化合物Β對人類α4β2通道之作用。圖 15概述實驗結果。在與乙醯膽鹼共同施用1〇次之後，化合 物8在0.14]^下抑制1〇.65%乙醯膽鹼引起之電流（11=9)、在 1 μΜ下抑制 51.59%(η=7)及在 10 μΜ下抑制 86.02%(η=7至 8)。 評估〇.1、1及10 μΜ化合物Β對人類α3β4通道之作用。圖 1 6概述實驗結果。在與乙醯膽鹼共同施用丨〇次之後，化合 156332.doc -79- 201200129 物B在0.1 μΜ下抑制39.79%乙醯膽鹼引起之電流（n=8至 1〇)、在1 μΜ下抑制56·20%(η=7至u)及在1〇 下抑制 94.78%(η=9) ° 所觀測到的特定藥理學反應可根據且視所選擇之特定活 性化合物或是否存在本發明之醫藥學載劑、以及調配物類 型及所用投藥方式而變化，且根據本發明之實務涵蓋結果 中之該等預期變化或差異。 儘官本文已說明本發明之特定實施例且進行詳細描述， 但本發明不限於此。上述實施方式僅作為本發明之示例提 供且不應將其視為對本發明構成任何限制。彼等熟習此項 技術者將顯而易知各種修改，且所有不背離本發明精神之 修改意欲包括於隨附申請專利範圍之範疇内。 【圖式簡單說明】 圖1a及圖1b描述化合物Α及化合物Β之對掌性氣相層析 滯留時間。 圖2說明N-7a-二甲基八氫-4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺雙（1S)-樟腦烷酸鹽（滯留時間較短之對映異構體）之分子構型。 圖3說明N_7a_二曱基八氫-4,7-甲橋-1H-茚-3a-胺雙（1S)- 才早細烷酸鹽（滯留時間較短之對映異構體）之晶體堆積。分 子内氫鍵以虛線展示。 圖4說明N-7a_二甲基八氫-4,7-甲橋-1H-節-3a-胺雙-(1S)- 樟腦烷S文鹽（滞留時間較短之對映異構體）之晶體堆積以確 定絕對構型。 圖5^田述來自Hs ha4p2*化合物a及化合物β的基於電生 I56332.doc 201200129 理學之功能拮抗劑檢定的資料。 圖6描述來自基於LS ha4p2中化合物八及化合㈣的基於 電生理學之功能拮抗劑檢定的資料。 圖7及圖8描述與參考化合物美卡拉明相&，化合物A及 - 2合物B之抗高i壓潛力，美卡拉明先前已批准用於治療 尚血壓。 圖9說明如化合物a及化合物8對辨別刺激提示之阻斷所 不，化合物A及化合物B在治療物質濫用及依賴中的潛 力。用圖表描述化合物A及化合物B之資料，其中公開若 干比較化合物之資料。 圖10說明投與化合物A、化合物B及比較化合物美卡拉 明對於鹼自身投與之作用，由此表明化合物A及化合物B 在治療物質濫用及依賴中之潛力。 圖11說明在小鼠強制游泳測試中化合物A、化合物B及 參考化合物外-S-美卡拉明之作用，由此表明化合物a及化 合物B在治療抑鬱症中之潛力。 圖12說明在尾懸測試中化合物A、化合物B及參考化合 物外-S-美卡拉明之作用’由此表明化合物a及化合物b在 • 治療抑鬱症中之潛力。 圖13、圖14、圖15及圖16說明化合物a及化合物b對在 SH-EP1細胞中表現之α4β2通道及在CHO細胞中表現之 α3 β4通道之使用依賴性作用。 156332.doc -81 ·

Claims (1)

1. 201200129 七、申請專利範圍·· 1. 一種式I化合物，

   式I 其中 R1及R2各個別地為Η、Ci 6絲或經芳基取代之C“烧 基，或R1及R2連同其連接之氮原子組合形成3至8員環， 該環可視情況經Cl.6烧基、芳基、Ci 6院氧基或芳氧基取 代基取代； R為Η ' Cu烷基或經€丨j烷氧基取代之CM烷基； R、R、R6及R7各個別地為H、Ci6烷基或Cw烷氧 基； R8各個別地為H、Cw烷基或Cl.6烷氧基； R9各個別地為H、Cw烷基或Cl-6烷氧基； 及L各個別地為選自由以下組成之群的連接基團種 類：CR10R"、cri〇r"cr12r13及 〇 ; R 〇、r"、R12及R]3各個別地為氫或ci 6烷基；及 虛線表示視情況存在之雙鍵， 或其醫藥學上可接受之鹽。 2.如请求項1之化合物，其中R1為H且R2為C,-6烷基。 156332.doc 201200129 3. 4. 如:求項1或2之化合物，其中R3為c〗6烷基。 如請求項1或2之化合物，其中r4、r5、r6 、 s 各為Η。 、R及汉9 5.如請求項1或2之化合物 Rl〇及R11各為氫。 其中L1及L2各為cri〇rii， 且 6. 8. 9. 種化合物（3aS，4S，7R，7aS)-N，7a-:f*AiL_4， 1H-節-3a-胺或其醫藥學上可接受之鹽。 ，橋 種化合物（3&11，411，78,731〇-：^，73-二曱基八氫 _4， 1H-茚-3a-胺或其醫藥學上可接受之鹽。 ，橋 一種醫藥組合物，其包含如請求項丨至7中任—項 物及醫藥學上可接受之載劑。 之化合 項之化合物的用途，其用” 元菸鹼受體介導之疾病或病狀 一種如請求項1至7中任一 備用以治療或預防由神經 的藥劑。 10. 如請求項9之用途，其中該疾病或病狀為汨81)、〇AB、 於鹼成瘸症、戒菸、抑鬱症、嚴重抑鬱症或高血壓。 11. 如請求項1或2之化合物，其係用作活性治療物質。 12. 如請求項15戈2之化合4勿，其係用於治療或預防由神經元 菸鹼受體介導之疾病或病狀。 13. 如請求項之化合物，其中該疾病或病狀為汨3_1)、 OAB、菸鹼成癮症、戒菸、抑鬱症、嚴重抑鬱症或高血 壓。 156332.doc S