TW201136596A - Lactobacillus fermentum SG-A95 for improving oral bacterial groups and health care compositions thereof - Google Patents

Description

201136596 六、發明說明·· 【發明所屬之技術領域】 發酵 物 本發明係Μ於-種抑伽腔内細長之發酵乳酸桿菌及其 【先前技術】

正常人口腔内存在著許多_、麵、甚至病毒 :數量為最大：每毫升唾液中有！ ，整個口腔中的H =600’然而這些細菌並非全都是致_，μ也^ j :正樣況下4_彼此維湘落的相對平衡科會致 =免疫力或抵抗力變差、口腔環境改變、服用藥物或有全‘ ，病等情況下，就會使致病菌過度生長而造成口腔_，輕l 侵入血管社細_、™，甚至是細菌 =齡醫師公會全„合會全年度健师舰計，台灣地 罹患牙周病比例高達9成，由此可見牙齒保健之重要性。 參 I周病1可分為兩種，亦即雅炎（又作舰炎，細神 =周炎―ntitis)。牙齦炎主要徵缺牙軸血、麵、發紅等。 ^周炎則是指支料齦_和牙義齒财（必秦^)遭到破 的狀態。 ％ 羅患牙周病’牙齒和牙齦間的溝槽會變深，形成「牙周囊 (Pen〇d她lpGeket)。通常特健康者的牙周囊躲度約在1 mm到2 _之間，輕度牙周炎患者的牙周囊袋深度約是3〜4 mm，中度患者是 4〜6^m’重度患者的牙周囊袋深度則超過G麵以上。隨著牙周囊袋 =加/木牙酿本身會變短。當牙齒外觀看起來變長，或者牙齒開始晃 動，都可能是4度牙周病的警訊。 、牙炎及牙周炎都是「牙周細菌」（peri〇d〇ntal bacteria)感染造成， 代表性細財她啊® )。 唾液中的_蛋自（glyeGpiOtein)會在牙録面碱賴，使細菌 201136596 可在此附著’細菌吸取了食物中的糖分後，薄膜會變大、增厚，進而 形成牙菌斑。再者，如果牙周囊袋中形成牙菌斑的話，牙周細菌便會 在該牙菌斑中大量繁殖。由於牙周細菌具厭氧性，所以氧氣難以到達 的牙周囊袋疋它最適合滋生的環境。牙菌斑也是變形鍵球菌 (iSireptocOccw·? mwiam·)的溫床，90%以上的成年人口腔中都攜帶這種 細菌，而此菌亦是造成齲齒的主要細菌。當變形鏈球菌分解糖分產生 的酸性物質侵蝕牙齒的琺瑯質（enamel)和象牙質（dentin)後，就會 造成鱗齒。 就牙周病而言，當牙周細菌侵入牙齦時，就會引起免疫反應。牙周 細菌會分泌酵素溶解牙齦細胞進而入侵到牙齦内部。在牙周細菌數量 尚少時，還能阻止它的入侵，一旦大量繁殖，就會無法抑制。 目刖有一些方式可以預防鑛齒或牙周病的產生，例如施用避免細菌 附著至牙齒表面的抗附著劑，以減少牙菌斑的形成避免細菌侵蝕牙質 (中華民國專利中請號094144377);使用抗_以抑制細菌孳生（美 國專利第5,368,845號；W0 92/1W5 );或是目前所廣泛使用的氟化物: 利用其能降舰瑯質對雜物質的溶解度以預賴齒^然而，目前鮮 少有研究探討乳酸菌及其治療口腔疾病之效用。 【發明内容】 本發明之目的在提供一種發酵乳酸桿菌SG-A95 (to— ’其寄存編號為BCRC91〇44〇，更進一步揭示該發酵乳酸桿 菌SG-A95 ’其包含編碼如seqdnqj所示之核普酸序列。本發明之

目的在财_發酵⑽翻SGI於培發酵後製得之發 酵產物。 X 本發明之又-目的是提供—種改善口朗細轉之保健組合物，令 sg-a95 應用於σ腔保健，可有效抑制麵口内之牙周細菌生長。 顯差ω νο :1係和已知的發酵乳酸桿菌之遺傳物質有明 ㈣此外，奶5〇 chl崎顯示出本發日月之發酵乳酸 于菌G-A95與歐洲專利號〇154549所揭露之菌株細咖（寄存號 201136596 FERMP-7539)有明顯差異，如表一所示。 表一、本發明之發酵乳酸桿菌與歐洲專利號0154549所揭露之菌株 AD0002 (寄存號 FERMP-7539)之 API 50 CHL 比對 發酵乳

ΕΡ0154549 (AD0002) (FERM P-7539) + L—阿拉伯糖 (L-Arabinose ) D-核糖（D-Ribose)

α甲基-D-甘露糖苷 (aMethyl-D-mannoside ) 21 α曱基-D-葡萄糖苷 (aMethyl-D-glucoside ) 22 N-乙醯葡萄糖胺 (N Acetyl glucosamine ) 23 苦杏仁苷（Amygdaline) 25 熊果苦（Arbutine) 七葉皆（Esculine)

201136596 26 水楊普（Salicine) — __ 27 纖維二糖（Cellobiose) — 一 28 麥芽糖（Maltose) + + 29 乳糖（Lactose) — + 30 木蜜一糖（Melibiose) + + 31 庶糖（Saccharose) + + 32 海滿糖（Trehalose) — + 33 菊糖（Inuline) — 34 落葉松糖（Melezitose) — 一 35 D·棉子糖（D-Raffinose) + + 36 搬粉（Amidon) — 37 肝糖（Glycogen) — 38 木糖醇（Xylitol) — -—--- 39 β-龍膽二糖 (β-Gentiobiose) 40 D-松二糖（D-Turanose) — 41 D-來蘇糖（D-Lyxose) 一 42 D-塔格糖（D-Tagatose) — 43 D-炭藻糖（D-Fucose) — 44 L-炭藻糖（L-Fucose) 一 45 D-阿拉伯膠醇 (D-Arabitol) — 46 L-阿拉伯膠醇 (L-Arabitol) — 47 葡萄糖酸（Gluconate) — 48 2 keto-gluconate (2-酮-葡萄糖酸） — 49 5 keto-gluconate 〇酮-葡萄糖酸） 另本發明所述之個體為哺乳動物，較佳為人。 由體外實驗或活體實驗得知，常見的牙周細菌諸如變形鏈球菌 (伽印伙沉⑽細加w)、血鏈球菌（伽、牙齦卟啉 儀（Porphyromonas gingivalis)反黏故氟锒（Actin〇myces visc〇sus)等 皆會受到發酵乳酸桿菌活菌或其發酵產物之影響而停止生長甚至死 亡。藉由發酵乳酸桿菌抑制口内細菌滋生的特性，吾人係可將發酵乳 酸桿菌應用於預防或治療如下列所示之口腔細菌性疾病： h與牙齦料菌相關之疾病：牙周疾病（P—aI disease)、骨質 201136596 疏鬆症、海綿靜脈竇血栓性靜脈炎（Cavem〇us :如耶 thrombophlebitis ) ^ (Periodontitis) ^ ^ 膜炎（infective end〇Carditis)、糖尿病、呼吸系統疾病、動脈硬化、冠 狀心臟病、中風、類風濕性關節炎。 2. 與血鏈球齡關之疾病：姓牙、感染性心内膜炎、急感染性關節 炎（Acute septic arthritis)、心血管疾病。 3. 與變種鏈球_關之疾病n感紐（、内膜炎。 4. 與黏放線菌相關之疾病：牙周病。 、本發明所揭露的發酵乳酸桿帛SG-A95活菌本身即具有抑制細菌 滋生的能力’ a此在實際制上，係可將發酵乳轉帛sg_A95菌株以 直接塗抹細㈣方式使用，献料破_株活性畴其能於口腔 内復原的前提下，將本發明之_加以冷賴乾燥化，進而製成鍵劑 或喷劑、溶於液體、以食品或醫藥品或口腔清潔劑添加劑方式加以製 造並使用。惟任何方H不魏猶該賴SG_A95雜抑制細 之能力即為本發明之可能適用方式。 本發明所揭露的發軌轉® SG-A95發酵產物雜發酵乳酸桿 2 SG-A95經能培養出發酵乳酸桿旨似95成分之培養基發酵後的產 該培養基之主要成分為葡萄糖、蛋白酶、肉類萃取物、酵母 取物、鹽類等物質。發酵乳酸桿菌SG_A95發酵後的產物即使經過 膜^屯化後，例如細如讀^騎膜（mwc〇:35gg)蹄透析，亦 $響其抑力’顯轉械能力並非完全仰賴發酵乳畴菌活 菌體’而是在於其發酵触所產生的代謝物。因此，本發明所 以發酵乳酸桿ϋ SG_A95為有效成分的赠保 乳酸桿__讀觀轉祕酵產物。 除去發酵 、在實際應用上’本發明係可將發酵乳酸桿菌SG-A95發酵產物以直 ΐί抹於口腔、製歧劑或噴劑、溶於紐、以食品或醫藥品或口脾 11^加以製造並使用。惟任何方式只要不破壞發酵乳酸桿菌SG-A95 ^ 物抑制細H之能力即為本發明之可能適用方式。 201136596 【實施方式】 本發明係揭露一種用於預防或治療口腔細菌性疾病的保健組合 物’其中有效成分為發酵乳酸桿菌SG-A95 或其發酵產物，在此以體外或活體（加νζ·ν〇)實驗加以驗證 該菌體或其發酵物對於牙周病之療效。 1·趙外實驗（//ivilirastiidy) 以發酵乳酸桿菌SG-A95在液態培養基，本實施例採用MRS培 養基，於30〜37°C培養15〜24小時後，將發酵菌液濃縮成30倍濃度， 並使用透析膜(Spectra/Por®Dialysis Membrane ; MWCO:3500, Spectrum Laboratories Inc，CA)將其透析48小時，再依實驗需求將發酵乳酸桿菌 SG-A95與濃縮發酵產物稀釋成不同濃度。分別與變形鍵球菌

(•Sirepiococcws wwtora) (ATCC 25175 )、血鏈球菌 •sawgwz‘以 ATCC 49295 )、牙齦0卜琳菌（Porp/ywwoms )( ATCC 33277)及黏放線菌從v/沉仍奶）（ATCC 15987)進行紙敍; 瓊脂擴散試驗（Disc agar diffiision test)、肉湯稀釋法（broth dilution method)、發酵乳酸桿菌活菌與病原菌共同培養試驗，瞭解抑制病原菌 生長狀況。以上四株病原菌菌株購自財團法人食品工業發展研究所生 物資源保存及研究中心或ATCC。 MRS培養基常用於乳酸菌培養，其主要成分為葡萄糖、蛋白酶、 肉類萃取物'酵母菌萃取物、鹽類等物質。 (1)紙錠瓊脂擴散試驗 將培養至濁度相當於0.5比濁度的變形鏈球菌、血鏈球菌、牙齦 卟啉菌及黏放線菌菌液，以無菌棉棒沾菌液3秒鐘，在三個方向平均 塗抹於瓊脂表面’使接種原平均分佈。將發酵乳酸桿菌SG-A95的30 倍發酵產物透析後’調整成濃縮4倍(LFP4)、濃縮2倍(LFP2)及1倍 (LFP1)(未濃縮的發酵菌液），及將發酵乳酸桿菌SG-A95活菌稀釋成 不同菌數’分別為 1x109(LFBL)、2xl09(LFBM)及 5xl09(LFBH)。將直 徑6mm消毒滅菌之紙錠浸入不同濃度的發酵乳酸桿菌SG-A95之發酵 產物或不同活菌數的菌液中三秒鐘後，取出紙錠平貼於瓊脂表面，置 201136596 於37C厭氧培養箱中培養24小時後，測量其抑制圈大小。 (2)肉'野稀釋法（Broth dilution method) 立將發酵乳酸桿菌SG-A95的30倍發酵產物透析後，調整成濃縮4 倍仏即4)、濃縮2倍(LFP2)及1倍(LFP1)(未濃縮的發酵菌液），另將 變形鏈球菌、血鏈球菌、牙齦卟啉菌及黏放線菌在無菌標準液態培養 基（BHI broth)培養至濁度相當於〇 5比濁度的菌液，各加入菌 液於管中，置於3rc厭氧培養箱中培養則、時後，以平板計數法 算菌落數’推算樣品抑菌濃度。 (3 )發酵乳酸捍菌SG-A95與病原菌共同培養試驗 將發酵乳酸桿菌SG_A95活菌與變形鏈球菌、金鏈球菌及牙齦卟 ，菌，同放置於試管中，37〇c共同培養4別於不同時間點取樣，以 平板計數法，計算菌落數，瞭解樣品抑制病原菌生長狀況。 2·動物活趙實驗（ί/ι vivo study) /分設實驗組及對照組。發酵乳酸桿菌SG_A95實驗組分成6組： 透析後之發酵乳酸桿自SG_A95發酵產物濃縮液3組，分別為濃縮4 倍、濃縮2倍及1倍（未漠縮發酵菌液），不同菌數之發酵乳酸桿菌 SG-A95 3組，分別為1χ1〇9、2χ1〇9及5χ1〇9，與對照組2組（四環黴素 (tetracycline) 0.267 mg/mL 及蒸餾水（distilled water)。 (1)動物牙周病預防效果之評估 選用八週齡之雌性Balb/c小鼠每組12隻（表二），每日投與不同 濃度之發魏轉H sg_A95^_減發酵減桿帛SG_A95活菌、 四環黴素(U67 mg/mL或蒸顧水各！毫升，並於其下顎前牙紫上齒列橋 正用鋼線（ligature Wire)，並於牙周組織接種牙周病致病菌變形鏈球 菌’即為以人方式引發牙触織病變之病祕物模式。此操作至全 部動物犧牲為止’並觀察記錄其病理表徵^由牙科主治醫師診斷直至 對照組（餵食蒸餾水’模擬治療組馱〇叩））開始牙齦出 201136596 現紅腫及牙菌斑出現後’解除鋼線束缚，並停止接辕牙周病致病菌。 於解除鋼棘職第4、8、12、及16日侧錢牙周賴深度⑼如 deptlO ’ 3 ϋ取檢齡行_學觀察。 表二、動物實驗^組之分組（註：人類使用的四環徽素劑量為每 1000 mg 75 kg艘重，由此推估小鼠每日使用之劑量大約為 0.267 mg 每 20 g 趙重）

pLFP2 pLFP4 發酵乳酸桿菌 SG-A95之發酵物 2 X濃縮 4 X濃縮 曰

pLFBL

pLFBM

pLFBH

pTC

pMT 發酵乳酸桿菌 SG-A95 活菌(CFU) 四環黴素 蒸餾水（模擬治瘓） 1x10s 2xl〇9 5x10s 0.267 mg (2)動物牙周病治療效果之評估 選用八週齡之雌性祕/c小鼠每組12隻(表三），於 =_峨，並謂 對照組牙齦出現紅觀牙斑域為止，即如人工方以丨發 模式。分別由牙科主治醫師診斷於組織病變後，每 sg_a95發料㈣鱗乳酸桿= 其病m 7 mg/mL或蒸館水各1毫升，並觀察記錄 、病表徵。於開始治療日解除鋼線束缚，並 線束物4、8、12、u日，度 各止犧牲3隻採血，並取檢體進行組織學觀察。 201136596 表三、動物實驗治療組之分組 施用劑量(每毫升） 組數 tLFPl 發酵乳酸桿菌SG-A95 之發酵物 IX tLFP2 2 X濃縮 tLFP4 4 X濃縮 tLFBL 發酵乳酸桿菌SG-A95 活菌(CFU) lxlO9 tLFBM 2x109 8 tLFBH 5x109 tTC 四環黴素 0.267 mg tMT 蒸顧水（模擬治療） (3 )牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比 以對照組為標準’使用曼一懷特尼檢定（Mann-Whitney test)與各 組中每個個體做檢測’有顯著差異的個體稱為改善個體。（改善個體個 數/全組個體數)χ 100%=牙周囊袋深度改善百分比。 (4)臨床病理及生化檢驗 將未死亡動物犧牲’頸動脈取血在3000 r.p.m.，4°C的條件下離心 10分鐘後，取上層血清，用自動生化分析儀來檢測其ALT、AST、 Creatinine、BUN生化指標。並取其重要標的臟器（肝、腎）以ι〇%福 馬林液固定，石蠟包埋組織切片後做H.E.染色以進行病理學觀察。 3.統計分析 實驗數值以平均值±標準差（mean 土 S.D.)表示。小鼠牙周囊袋 狀況之實驗組與對照組間統計差異，在縱向（longitudinal)研究是採單 因子變異數分析（One-Way AN0VA)與Dunnett多重事後比較法 (Dunnett multiple post hoc comparison)檢測，而橫斷（cross-sectional) 研究是以單因子變異數分析與LSD多重事後比較法（LSD multiple post hoc comparison)檢測。另外採用曼一懷特尼檢定檢測牙周囊袋改善的 201136596 個體數。統計顯著永準之p值為〇 〇5。 結果 1·想外實驗（mwVwstudy) (1)紙錠瓊脂擴散試驗 表四顯不紙錠伽擴散試驗之抑菌效果。無菌紙旋直徑為6_， 若抑菌，>6 mm表示有抑菌效果，反之則無抑菌效果。培養溫度及時 間為37°C ’ 24小時，對驗為含四職素之驗^ 均值±標準差表示（η=3)。 ^ 表四、紙旋瓊脂擴散試腌夕洳苗姑婁

表四顯示發酵乳酸桿菌SG-A95濃縮2倍以上的發酵產物及活菌對 於黏放線菌、牙齦卟啉菌、變形鏈球菌及血鏈球菌這四種病原菌皆有 抑制圈產生。 (2)肉湯稀釋法 表五、最低抑菌濃度及抑菌百分比（100% -(試驗組+對照組）χ 100%)

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表五顯示發酵乳酸_ SG_A95的發酵產物濃 時處理後有不_抑制效果，廣泛而言/周致病菌48小 度有較好_絲。_顺病_言酵^^^產物之高濃 產物對於牙齦㈣效果最_，呈卿量依賴 =阳=95的發酵 線菌。發酵雛桿細2倍社濃縮產物對於這4 _原放 ⑶發酵乳酸桿菌SG-A95與病願朗培養試驗 表六、發酵乳酸桿g SG_A95活菌（簡稱LF) 抑制病原心錢形。 娜培養，

酵乳酸桿菌㈣95活菌與變形鏈球菌共同培養，不管 ^菌Ϊ組（7次方）、中菌數組（8次方）或高菌數組（9次方），於 小時内皆無變形鏈球菌病原菌存在，可見其皆有抑制變形 鍵球菌生長之效果。 表七H制_ SG_A95活賴血料帛制料，_病原菌生

13 201136596 培養時間 (小時） LF(107) LFOO8) LF(10y) 對照組 0 3.〇xl07 5.〇xl〇7 5.0x10^ 5.0χ107 2 5.1xl06 7.9χΐ06 8.3χ105 5.3χ107 4 1.9xl06 4^0x10^ 3.1χ105 7.6xl07 6 7.6xl05 6.5xl〇5 5.7χ103 9.1xl07 8 1.4χ105 1.9x105 4.8x10' l.OxlO8 10 7.3xl04 6.2x104 0 3.2xl〇8 12 4·5χ103 3.3xl〇3 0 4.3xl〇8 14 0 0 0 7.4xl08 表七顯示發酵乳酸桿菌SG-A95活菌與血鏈球菌共同培養，高菌數 組（9次方）於共同培養1〇小時，已無血鏈球菌病原菌存在，中菌數 組（8次方）與低菌數組（7次方）於共同培養14小時，已無血鏈球 菌病原菌存在，可見其皆有抑制血鏈球菌生長之效果。 ^Α95 ^與牙報柯菌共同培養，抑制病原菌

表八顯示發酵乳酸桿菌 SG-A95活菌與牙齦卟啉菌共同培養， 高菌 201136596 ·· 數組（9次方）於共同培養6小時，已無牙齦卟啉菌病原菌存在，中菌 數組（8次方）於共同培養8小時，已無牙齦卟啉菌病原菌存在低 • 菌數組（7次方）於共同培養14小時，已無牙齦卟啉菌病原菌存在，_ 可見其皆有抑制牙齦卟琳菌生長之效果。 2.動物活趙實驗（ViV〇 study ) (1)動物牙周病預防效果之評估 表九、發酵乳酸桿菌SG-A95預防組(pLF)之小鼠其牙周囊袋深度(111111) (單因子變異數分析與Dunnett多重事後比較法）在不同時間 點，各組與對照組（pMT)之比較。（*ρ<0.05;**ρ<〇·〇1) 第4天 第8天 第12天 第16天 pLFPl 0.79±0.44** 0.75±0.27** 0.42±0.35** 0.35±0.21** pLFP2 〇.77db〇.31** 1.21 土0.64** 0.80 士 0.81** 1.25±0.35** pLFP4 l.〇4±0.66** 0.79±0.26** 0.48 士 0·29** 0.30±0.17** pLFBL 1.33±0.44** 1.17±0.55** 0.83 士 0.41** 0.67±0.29** pLFBM 1.08 土 0.67** 0.83±0.43** 0.57±0.36** 0.33±0.15** pLFBH 1.〇0±〇.50** 0.84±0.41** 0.38 士 0.16** 0.25±0.70** pTC 〇.84±0.50** 0.70±0.34** 0.56±0.26** 0.49±0.25** pMT 2.22±l.〇7 2· 16士 1.25 2.75 士 1.32 2.21 土 0.64 評估預防組發酵乳酸桿菌SG-A95發酵產物及活菌數，各組餵食不 同濃度樣品對於牙周囊袋深度的影響，在不同時間點各組對於餵食蒸 餾水的對照組（ρΜΤ)在所有的時間點皆有顯著差異。餵食四環黴素 的預防對照組（pTC )在所有的時間點皆有顯著差異。 表十、發酵乳睃桿菌SG-A95預防組（plf)之小鼠之牙周囊袋深度 15 201136596 (mm)(單因手變異數分析與LSD多重事後比較法），各濃度組別 在不同時間點與第4天比較。（*ρ<〇.〇5; **ρ<〇.〇1) »

_發酵乳酸桿菌SG-A95預防組發酵產物與活菌數各濃度組別，在不 同時間點的組内比較’ 4倍（pLFP4)濃度、高濃度活菌組（pLFWl) 及四環黴素組（pTC)在12天及16天牙周囊袋的改善程度與第4天比 較有顯著差異。 、 (2)動物牙周病治療效果之評估 表十—、發酵乳酸桿菌SG-A95治療組（tLF)之小鼠其牙周囊袋深度 (*nm)(單因子變異數分析與Dunnett多重事後比較法）在不同時 第4天 第8天 第12天 第16天 0.71±0.38** 1.19±0.62 1.00 土 0.61** 〇.75±0.35* 1.23±0.66** 1.78±0.71 0.92±0.20** 〇.73±0.46* 1.04±0.58** 0.83±0.50* 0.67±0.41** 〇.30±0.17** 1.33±〇.62** 1.28±1.15 0.68±0.72** 0.57±0.40** 1 1.96±0.96 1.75±0.80 1.00±0.50** 1.50±〇.7l 201136596 tLFBH 1.42±0.79* 0.83 士 0.43* 〇.33±0.31** 0.30 土 0.17** tTC 1·05±0·64** 0.89±0.44** 〇.63±0.37** 〇.48±0.33** tMT 2.1〇±〇.63 1·91±0.89 2.10±0.97 2.00±0.92 評估治療組發酵乳酸桿菌SG-A95發酵產物及活菌數，各組餵食不 同/農度對於牙職袋深度的影響，不同時間點各組間都有顯著差異。 在每個時間點與對照組（餅）比較，4倍濃度組（tLFp4)、高濃度活 菌組（tLFBH)及四環黴素組（tTC)在每個時間點皆有顯著差異。銀 食1倍及2倍發酵產物的組(tLFPl與tLFP2 )及低濃度活菌組(tLFBL)， 除了第8天，其餘時間點皆有顯著差異。中濃度活菌組（tLFBM)只有 在第12天有顯著差異。 表十一、發酵乳酸桿g sg_a95治療組（tLF)之小鼠其牙周囊袋深度 (mm)(單因子變異數分析與LSD多重事後比較法)各濃度組 巧在丨不同時間;點與第4夭fcb敕**p<0.01) pMT 2.10 士 0.63 1.91± 0.89 2.10 土 0.97 2.00 士 0.92 第4天 第8天 第12天 第16天 pLFPl 0·71士 0.38 1.19士 0.62 1.00土 0.61 0.75土 0.35 pLFP2 1.23 土 0.66 1.78士 0.71s 0.92土 0.20 0.73士 0.46 PLFP4 1.04士 0.58 0.83 土 0.50 0.67士 0.41 0.30土 0.17 pLFBL 1.33 士 0.63 1.28土 1.15 0.68土 0.72 0.57 士 0.40 pLFBM 1.96士 0.96 1.75土 0.80 1.00 士 0.50 1.50 士 0.71 pLFBH 1.42土 0.79 0.83土 0.43* 0.33± 0.31** 0.30 土 0.17** pTC 1.05 士 0.64 0.89士 0.44 0.63± 0.37** 0.61 士 0.34** 治療組餵食發酵乳酸桿菌SG_A95發酵產物及活菌數的各組，在不 同時間點之組内比較，高濃度活菌組（tLFBH)第8、第12及第16天 (與第4天比較）有顯著差異，而四環黴素組（tTC)第12及第16天 有顯著差異。 17 201136596 (3 )牙周囊袋深度(periodontal pocket depth)改善百分比 表十三、發酵乳後桿菌預防組SG-A95(pLF)牙周囊袋改善百分比（與 預防組中無處理對照組）（pMT)比較有顯著差異(曼一懷特 尼檢定，ρ<〇·〇5)改善的個體百分比）。 第4天 第8天 第12天 第16天 pLFPl 64% 50% 80% 100% pLFP2 40% 29% 75% 50% pLFP4 42% 33% 67% 67% pLFBL 8% 11% 33% 67% pLFBM 42% 22% 67% 100% pLFBH 36% 25% 80% 100% pTC 62% 50% 71% 100% pMT - - - 發酵乳酸桿菌SG-A95預防組牙周囊袋深度改善百分比在第16天， 除了 2倍與4倍濃度組及低濃度活菌組（pLFP2、pLFP4與pLFBL) 外，各組皆達到100%。 表十四、發酵乳酸桿菌SG-A95治療組（tLF )牙周囊袋改善百分比（與 無治療對照組(tMT)比較有顯著差異(曼-懷特尼檢定，p<0.05) 改善的個艏百分比 第4天 第8天 第12天 第16天 tLFPl 58% 22% 40% 50% 201136596 tLFP2 17% 0 17% 33% tLFP4 42% 22% 83% 100% tLFBL 8% 44% 67% 67% tLFBM 9% 13% 40% 0 tLFBH 17% 33% 83% 100% tTC 30% 20% 47% 33% tMT _二—

發酵乳酸桿菌SG-A95治療組，除中濃度活菌組外，在第16天皆 有33°/。〜100%的改善率。 (4)臨床病理檢驗 傲食SG-A95發酵產物姐驗最冑濃度的各組在第16天的肝、 ^織切片（圖2〜圖5與圖1G〜圖13 )，顯示各組肝及腎組織細胞無顯 著毒性傷害之表徵，無發炎峨浸潤，與無練對敝（或ρΜτ) (圖6〜圖9與圖14〜圖17)相較之下無明顯差異。 在體外實驗的紙峨脂擴散試驗可以知道，發酵乳酸桿菌犯舰 答曰2倍9社的發酵產物對於這四種病賴皆有抑棚產生，活菌不 =1x10 _L) ' 2χ1〇9_Μ)或 5xl〇9(LFB珊於黏放線菌、 ，、變形鏈球菌、灰鍵球菌四種牙周致病菌皆有91〇 _的 噥声料1 在㈣藝法额巾，顯神輒雜® SG_A95的發酵產物 酵ί酸桿=5菌=度的抑制效果。共同培養的數據顯示，發 菌^補柳咖翻，錄魏愈高抑做果愈好鍵 及活菌軸讀__ _5 *酵產物 果而言，各ί預防的效果優於治療的效果。就預防效 各餱食㈣濃度對於牙職袋深度的練，林同時間點 201136596 各組對於對照組（ΡΜΤ)皆有顯著差異的改善。而治療效果部分，以 發酵產物4倍濃度組⑽ρ4)、高濃度活菌組㈤丽）表現最好。 餵食發酵紐桿g SG-A95鱗產物統錄最紐度的各組，在 第16天動物犧牲雜綺腎組織進行病理㈣，顯示各組肝及腎臟組 織細胞，無顯著毒性傷害之表徵，表示安全性極高。 結合體外及祕雜實驗’顯科酵乳轉帛SG_A95之發酵產物 及活菌能預防牙周炎的產生並改善牙周發炎的狀況。 【圖式簡單說明】 圖1顯示本發明之SEQIDNO : 1與已知的發酵乳酸桿菌（美國專利 公開號US 2002/0094328中之菌株ATCC14931)之核微序列比對圖 (使用NCBI blast程式）。Query為ATCC14931之序列，_為本發 明SEQ ID NO : 1之序列。 圖2顯二發酵乳酸桿菌SG-A95治療組(tLFP4)肝臟組織切片（2〇〇X> 圖3顯不發酵乳酸桿菌SG-A95治療組(tLFP4)腎臟組織切片（200X)。 圖4顯示發酵乳酸桿菌SG_A95治療組（tLFBH)肝臟組織切片 (200X)。 ^ 5顯不發軌酸翻SG_A95絲組（tLFBH)腎臟組織切片 (200X ) 〇 圖6顯示對照組之四環黴素治療組（tTC)肝臟組織切片(200X)。 圖7顯示對照組之四環黴素治療組⑽）腎臟組織切片(2〇〇χ)。 圖8顯示對照組之無治療（蒸館水） 組(tMT)肝臟組織切片（2〇〇χ)。 圖9顯示對照組之無治療（蒸德水） 組(tMT)腎臟組織切片(2〇〇χ)。 顯不發酵乳酸桿菌SG-A95預防組（pLFP4)肝臟組織切片 (200X) 0 T不發酵乳酸桿菌SG_A95預防組（pLFp4)腎臟組織切片 \ 200X ) 〇 圖12顯不發酵乳酸捍菌SG-Α95預防組（pLFBH)肝臟組織切片 (200X)。 ^ 圖13顯不發酵乳酸桿菌SG-A95預防組（pLFBH)肝臟組織切片 201136596 (200X)。 圖14顯示對照組之四環黴素預防組（pTC)肝臟組織切片（200X)。 圖15顯示對照組之四環黴素預防組（pTC)腎臟組織切片（200X)。 圖16顯示對照組之無預防（蒸餾水）組（pMT)肝臟組織切片（200X)。 圖17顯示對照組之無預防（蒸餾水）組(pMT)腎臟組織切片（200X)。 【主要元件符號說明】 無。

21 201136596 序列表 <110>生展生物科技股份有限公司 <120>改善口腔內細菌群的發酵乳酸桿菌SG-A95 及其保健組合物

<130> 1147-SG-TW <160> 1 <170> Patentln version 3.4

<210> 1 <211> 1113 <212> DNA <213> Lactobacillus fermentum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1573) <400> 1 ggacgtgcga gtgctataca tgcaagtcga acgcgttggc gcacctgatt gattttggtc gccaacgagt ggcggacggg tgcccagaag cgggggacaa catttggaaa cagatgctaa cgcatgaaca acgcttaaaa gatggcttct cgctatcact attagcttgt tggtggggta acggcctacc aaggcgatga ctgatcggcc acaatgggac tgagacacgg cccatactcc {Lactobaci 11 us fermentumSG-k%)

ccaattgatt gatggtgctt 60 tgagtaacac gtaggtaacc 120 taccgcataa cagcgttgtt 180 tctggatgga cctgcggtgc 240 tgcatagccg agttgagaga 300 tacgggaggc agcagtaggg 360 22 420 420

201136596 aatcttccac aatgggcgca agcctgatgg agcaacaccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa gctctgttgt taaagaagaa cacgtatgag agtaactgtt catacgttga cggtatttaa ccagaaagtc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagagagtgc aggcggtttt ctaagtctga tgtgaaagcc ttcggcttaa ccggagaagt gcatcggaaa ctggataact tgagtgcaga agagggtagt ggaactccat gtgtagcggt ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctacctgg tctgcaactg acgctgagac tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga gtgctaggtg ttggagggtt tccgcccttc agtgcccgga gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgagacctta ccagtctgac atcttgcgca accctagaga tagggcgttc cttcgggacg catgacagtg tgcatggtcg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt agtcccgcaa cgagcgcacc cctcgtttac tag 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1113

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Claims (1)

1. 201136596 七、申請專利範圍： 1.一種發酵乳酸桿菌SG-A95 (Ζαί加如c/Z/wiAme对《w，SG-A95)，其寄 存編號為BCRC910440。 2. 根據申請專利範圍第1項之發酵乳酸桿菌SG-A95，其包含編碼如SEq 讧)NO: 1所示之核苷酸序列。 3. —種發酵乳酸桿菌SG_A95之發酵產物，其係以根據申請專利範圍第 1項之發酵乳酸桿菌SG-A95於培養基發酵後製得。 4.-種改善口腔内細菌群之保健組合物，其係包含根據申請專利範 1項5之二==95或根據申請專利範圍第

   為係活菌’爾產=發4^纖合物，射發__ _ 周細菌生/ο _範圍第4項之保健組合物，其係用以抑制個體口内之牙 7.根據申請專利範圍第6項之保健組合物 球菌、血鍵球菌、牙齦外琳菌或黏放線菌。、中μ牙周、、、田菌包3變_ 請專纖_ 6奴保触合物 9.根據申請專利範_ 4 繩㈣礼動物 样菌犯舰，㈣嶋舰酵乳酸 物0 菌SG-A95成分之培養基發酵後的產

   10.根據申請專利範圍第 食品或醫藥品或口腔清潔用品添加齊|之彳且s物’其係呈錠劑、喷劑、溶液、 24