TW201131169A - Method of screening for agent for improving dry skin associated with atopic dermatitis employing activity of bleomycin hydrolase activity as measure - Google Patents

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201131169 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明提供一種乾燥肌膚尤其因過敏性皮膚炎所導致之 乾燥肌膚之改善劑的篩選評價方法、因過敏性皮膚炎所導 致之乾燥肌膚的改善或預防方法、進而因過敏性皮膚炎所 導致之乾燥肌膚之診斷方法。 【先前技術】 表皮之顆粒層之角蛋白纖維於角化時與稱為絲聚蛋白之 蛋白質結合並凝聚，形成稱為「角蛋白圖案」之特異形 態。顆粒細胞内之角質層透明質顆粒中大量存在作為絲聚 蛋白之前驅物之絲聚蛋白源（絲聚蛋白單元縱向排列1〇至 12個者），於角化時，絲聚蛋白單體生成並且藉由脫磷酸 化而使角蛋白纖維凝聚。其後，藉由肽醯基精胺酸亞氨酶 (PAD，peptidylarginine deiminase)之酵素之作用而脫亞胺 基化，使角蛋白游離後，於角質層之上層分解成胺基酸 等。該等胺基酸稱為天然保濕因子（natural moisturizing factor ; NMF)，已知對角質層之含水量之保持具有重要作 用’又具有紫外線吸收能力（Blank [ H. j^ Dermat〇1， 18，433 (1952) ; Blank I. H. J. I· Dermatol” 21，259 (1953)) 〇 明確作為NMF之主成分之胺基酸源自絲聚蛋白以來，對 呈現乾燥肌膚之病態與絲聚蛋白之關聯性進行研究。近年 來明確老年性乾皮病、過敏性疾病等乾燥肌膚中，角質層 中之胺基酸減少（Horii I. et al.，Br. j· Dermatol.，121，587_ 152654.doc 201131169 592 (1989) ; Tanaka M. et al.，Br. J. Dermatol.，139, 618-621 (1989))。 PAD作用於絲聚蛋白之精胺酸殘基而脫亞胺基化，轉換 成瓜胺酸殘基。如此藉由絲聚蛋白進行脫亞胺基化，而減 弱絲聚蛋白與角蛋白纖維之親和性，使角蛋白纖維游離， 其結果認為絲聚蛋白易於受到蛋白酶之作用，最終分解成 NMF » 本發明者明確特別規定鈣蛋白酶-1作為分解藉由PAD而 脫亞胺基化之絲聚蛋白之酵素，作為其分解產物之小肽片 段藉由博來黴素水解酵素（BH)而分解成胺基酸單元即 NMF(Journal of Investigative Dermatology (2008), Volume 128, ABSTRACTS, S90，539;第30次曰本分子生物學會年 會第80次日本生化學會大會聯合大會報告要旨集，第 583 頁，3P-0251 ; JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284，NO. 19，pp. 12829-12836，2009 ;及日本專利特願 2008-135944號（以下稱為第944號申請案））。 最近研究中已知過敏性皮膚炎之一部分係由於絲聚蛋白 源基因之異常而生成，過敏性皮膚炎患者之5-50%左右中 發現該基因之異常（Smith FJD，et al. Nat Genet 38 : 337-42 (2006) ； Aileen Sandilandsl, et al., J. I. Dermatol., 127, 1282-1284 (2007)及Nomura T，et al·，J. I· Dermatol.，128 (6) : 1436-41 (2008))。然而，過敏性皮膚炎患者之皮膚中 並非絲聚蛋白之表現肯定急劇下降。 [先前技術文獻] 152654.doc 201131169 [非專利文獻] [非專利文獻 1] Blank I. H. J. I. Dermatol.，18，433 (1952) [非專利文獻2] Blank I. H. J. I. Dermatol.，21，259 (1953) [非專利文獻 3] Horii I. et al·，Br. J. Dermatol.，121，587-592 (1989) [非專利文獻 4] Tanaka M. et al·，Br. J. Dermatol.，139， 618-621 (1989) [非專利文獻 5] Kamata et al.，J. Biochem.，141，69-76， 2007 [非專利文獻 6] Journal of Investigative Dermatology (2008), Volume 128, ABSTRACTS, S90, 539 [非專利文獻7]第30次曰本分子生物學會年會·第80次曰 本生化學會大會聯合大會報告要旨集，第583頁，3P-0251 [非專利文獻8] JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284, NO. 19, pp. 12829-12836, 2009 [非專利文獻 9] Smith FJD，et al. Nat Genet 38 : 337-42 (2006) [非專利文獻 10] Aileen Sandilandsl，et al·, J. I. Dermatol.， 127, 1282-1284 【發明内容】 [發明所欲解決之問題] 本發明之課題在於根據因NMF產生酵素之表現的變動所

S 152654.doc -5- 201131169 導致之新的皮膚粗糙機制，提供一種杜莫+ 裡改善或預防因過敏性 皮膚炎所導致之乾燥肌膚之藥劑的篩選大、土 ^ 1巧乃冼、或因過敏性 皮膚炎所導致之乾燥肌膚之評價方法、因過敏性皮膚产 導致之乾燥肌膚之改善或預防方法、進而因過敏性皮= 所導致之乾燥肌膚之診斷方法。 火 [解決問題之技術手段] 上述第944號申請案中’本發明者明確博來徽素水解酵 素之活性充進會由於NMF之產生而改善皮膚屏障功能。如 此，認為博來黴素水解酵素於NMF產生之最終階段起作 用。然而，頗有意思的是，關於由於過敏性皮膚炎所生成 之乾燥肌膚，很多過敏性皮膚炎患者中依然發⑽聚蛋白 之表現，因此預測乾燥肌膚係由與絲聚蛋白基因之異常不 同的其他原因產生。 、 本發明者根據如下假設’驗證依據乾燥肌膚人體試驗之 該酵素之表現的變動，並且進行該表現控制機構之解析 等：人體皮膚中之博來黴素水解酵素之表現下降不僅與由 於MMF產生機構之異常所生成之皮f屏障功能的下降有 關亦與主要因免疫異常引起之過敏性皮膚炎或由於該皮 膚炎所產生之乾燥皮膚等均相關。其結果，本發明者發現 博來黴素水解酵素之表現下降與由於過敏性皮膚炎所生成 之乾燥肌膚相關聯’且編碼該酵素之基因之5,田比鄰區域内 存在明顯誘導該酵素之表現的控制區域。詳細而言，本發 明者選殖BH之5··毗鄰區域。於其缺失分析中，於_2i6 bp 上游之中鑑定對BH啟動子活性較為重要之區域。明確電 152654.doc 201131169 泳遷移率改變分析中，於試驗管内，MZF-1、Sp-1、及干 擾素調節因子（IRF(interferon regulatory factor))-l/2可結合 於該區域。其中，MZF-1及Sp-1主結構之定點突變誘發 時，BH啟動子活性下降較多。該等資料暗示bh表現經由 MZF-1及Sp-Ι而上方控制。頗有意思的是，作為Thl細胞 激素之干擾素（IFN(interferon))-y顯著減少bh之表現。使 用定點突變誘發及低分子干擾RNA(db〇nucleic acid，核糖 核酸）之分析時’證實IFN-γ對於BH表現之抑制效果。另一 方面，作為Th2細胞激素之IL-4完全未顯示出對於BH表現 之直接作用。然而，其於培養角質形成細胞中下方.控制 MZF-1及Sp-Ι，因此暗示化_4可作為BH調整之抑制因子而 起作用。最後，患有AD(AlZheimer，s diSease，阿爾茨海默 氏病）之患者之皮膚中檢查BH之表現。由於AD病變皮膚中 BH活性與表現減少較多，因此，暗示AD中之絲聚蛋白分 解路徑的缺陷。如以上所示，本發明者發現可於分化過程 中及炎症過程中之雙方調節BH之轉錄，從而完成本申請 案發明。 因此’本申請案包含以下發明。 ⑴一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑之筛選 評價方法’其係於候補藥劑與對照藥劑相比顯著亢進博來 黴素水解酵素之表現及/或活性之情料，將該候補華劑 評價為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑。 ⑺如⑴之方法，其巾於編碼博來黴素讀酵素之基因之 轉錄活性與對照者相比顯著完進之情形時，判斷出上述表 152654.doc 201131169 現及/或活性顯著亢進。 如（2)之方法，其中於轉錄因子IRF-l、IRF-2、MZF-1、

Sp_l、及/或GATA-1對於編碼博來黴素水解酵素之基因的 轉錄調節區域之結合活性與對照之結合活性相比顯著亢進 之情形時’判斷出上述轉錄活性顯著亢進。 (4)一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善或預防方 法其係藉由使顯著亢進皮膚組織中之博來黴素水解酵素 之表現及/或活性而進行。 ’、 5如（4)之方法，其中藉由亢進編碼博來黴素水解酵素^ 基因之轉錄活性’而使上述表現及/或活性顯著亢進。 (6)如（5)之方法，其中藉由宄進轉錄因子IRF-1、IRf_2， MZF-1 ^ Qp 1 — , ., _ _ 、及/或GATA-1對於編碼博來黴素水解酵 之基因的轉錄調節區域之結合活性，而使上 — 活性顯著亢進。 矛見及/資 (7)—種因過敏性皮膚炎導 您乾枭肌膚之原因之診斷 ^係於皮膚組❹之博來黴素水解酵素 活性與對照之皮膚中 表見及/ 性相比顯著下降之情形H… 表現及/或: 導致之0斷為存在因過敏性皮膚炎/ 導致之乾刼肌膚之傾 人/ 解酵音夕主 與對照之皮膚中之博來黴素7 '、之表現及/或活性相比為 不存在因過敏性皮度以上’則診斷i ⑻如m 導致之乾燥肌膚之傾向。 轉if ^之方法，其巾於編碼博來黴素水解酵f之 轉錄活性與對照者相比顯 肖素之基因之 現及/或活性顯著下降。 之情形時，判斷出上述表 J52654.doc 201131169 (9)如（8)之方法，其中於轉錄因子miM、mF_2、、 SIM、及/或GATA.R結合活性與對照之結合活性相比顯 著下降之情形時’判斷出上述轉錄活性下降。 [發明之效果] 可根據藉由本發明確立之因博來黴素水解酵素之表現之 變動所導狀新的皮膚㈣機制尤其以博來黴素水解酵素 之表現及/或活性作為指標之筛選线，而探索因過敏性 皮膚炎所導致之乾燥肌膚之新穎的改善劑。進而，認為本 申請案發明之方法亦可應用於並非因過敏性皮膚炎所引起 =通常的乾燥肌膚之改#劑的探索。事實上，㈠請案之 實施例中’博來黴素水解酵素之表現及/或活性較低之群 中，屏障功能（表皮水分H聊叩⑽㈣咖丨*浙 loss))顯著下降，角質層之含水量亦下降。 【實施方式】 本^明之第-觀點中，提供一種因過敏性皮膚炎所導致 之乾燥肌膚之改善劑的篩選評價方法，其係於候補藥劑盥 對照藥劑相比顯著Μ博來歸轉料之表現及/或活 性之情形時’將該候補藥劑評價為因過敏性皮膚炎所導致 之乾燥肌膚之改善劑。 博來黴素水解酵素為分子量25〇〜280 kDa(六聚物）之細胞 質半胱胺酸肽水解酵素，最初已知之功能為癌之組合化學 療法中頻繁使用之糖肽博來黴素的代謝惰性化。含有半胱 :酸蛋白質分解酵素木瓜酶超家族之特徵之活性部位殘 土’編碼基因存在於人體之基因座17qll.2中（Takeda et 152654.doc 201131169 a】.，JBioc^，U9,29_36, 1996)。博來黴素水解酵素存 在於所有組織中’亦已知存在於皮膚中了 —·，⑷，69·76,2〇〇7)，但直至本發明者明確為止完 全未知與絲聚蛋白之關係。 组織染色之結果可知，博來黴素水解酵素與絲聚蛋白 ，於正㊉皮膚之表皮上層較多表現（圖8)。另一方面， 由 相同 過敏性皮膚炎患者，於異位性皮疹部，該酵素及絲聚蛋白 之表現下降（圖9卜認為其㈣暗示並非絲聚蛋白源基因之 異常，而是該分解酵素系之異常導致過敏性皮膚炎。又， 異位性皮膚炎患者之皮膚中，不僅病變部，於非病變部 博來黴素水解酵素活性亦顯著較低(資料未顯示）。 進而’關於博來黴素水解酵素之表現量之變動，使用培 養角質形成細胞進行研究之結果可知，該酵素於未分化: 角質形成細胞中未怎麼表現，相對於此’於達到融合並進 行分化之角質形成細胞中較高表現，於基底細胞中幾乎未 表現，於進行分化向表皮細胞轉移後較高表現（圖1〇)。其 結果支持上述細胞染色之結果。 本發明之博來黴素讀酵素之表現及/或活性的測定可 依據可測定該酵素之表現及/或活性之任意方法，例如利 用對博來黴素水解酵素特異之抗體之免疫敎方法、例如 利用酵素標籤之ELISA(enZyme-nnked immunosorbent assay ’酶聯結免疫吸附劑分析）法、利用放射性標籤之ria (radio Immunoassay，放射免疫分析）法、免疫比濁法、西 方墨點法 '乳膠凝聚法、紅血球凝聚法等，定量或定性實 152654.doc •10· 201131169 施。免疫測定法之方式可列舉：競爭法或夹層法。 而言，上述活性之測定係藉由如下方式而進行：例如㈣ 用瓜胺酸對博來黴素水解酵素大致特異之基質的性質 用勞光分光光度計對作為其螢光合成基質之cit McA之八 解進行評價。博來黴素水解酵素量之測定亦可藉由測定: 碼該酵素之基因之表現量而進行。於該情形時，較佳為藉 由測定編瑪細胞内之博來黴素水解酵素之灿叫咖咖啊 RN曰A ’信使核糖核酸)的量而決定博來黴素水解酵素之表 見3： mRNA之萃取、其量之定量或定性之測定亦為業界 眾所周知，例如可利用PCR(p〇lymerase .η Γ_〇η，聚 合酶鏈反應）法、3SR(self_sustainedsequ⑽ ， 自主序列複製）法、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification ’ 核酸序列擴增）法、TMA(th_〇mech_w analysis，熱機械分析）法等各種各樣眾所周知之方法而實 細*此外博來域素水解酵素可通過in situ(原位）雜交法 或其生物活性之測定而定性決定。 本發明之因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑的 4選評價方法中’於候補藥劑與對照藥劑相比顯著亢進博 來徽:素水解酵素之表現及/或活性之情形時，將該藥劑評 價為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑。認為依 據本發明之方法篩選之藥劑對乾燥肌膚尤其因過敏性皮膚 k引起之乾燥肌膚較為有效。 依據日本皮膚科學會過敏性皮膚炎診療準則，所謂「過 敏性皮膚炎」係指以重複惡化.緩解之搔癢性濕疹作為主 152654.doc 201131169 病變的疾病’該疾病可根據搔癢之有無，作為特徵性皮療 .之紅斑、濕濁性紅斑、轉、漿液性丘療、鱗屑、病皮等 急性病變，或浸潤m斑1蘚化病變、錄、鱗屬、蘇 皮等慢性病變之有無而診斷。於本說明書中使用之情形 時，所謂「因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚」意指含有 絲聚蛋白基因之異常，伴有藉由上較義確定診斷之過敏 性皮膚炎的乾燥肌膚。 本發明之篩選方法有下列方法··於試驗之藥劑存在下利 用通常之PCR敎$進編碼博來黴素水解酵素之抓财之 表現的方法；將參與㈣素表狀啟動子區域插人螢光酶 基因載體巾’直接敎作為啟動子分析系統之表現之強弱 的方法等。於後者之情形時，較佳為冊之啟動子區域使 用自BH表現成為最大之·216 bp至_816 bp之區域。又表 現篁之測定不僅使用螢光酶，亦可使用業界通常所使用之 薊綠等螢光蛋白。可藉由將含有該等融合基因之載體導入 細胞中，於藥劑存在下對細胞進行培養，通常Μ小時後使 細胞溶解，測定螢光酶活性，而測定藥劑對611表現所造 成之作用。所使用之細胞可使用市售之正常表皮細胞 (NHEK(normaI human epidermal keratinocytes，正常人體 表皮角質形成細胞）：Kurabo等）或不死化HaCaT細胞等， 但並不限定於此。螢光酶活性之測定較佳為藉由使用 Roche Diagnostics之螢光酶試劑套組等而實施。 於本說明書中所使用之情形時，所謂「與對照藥劑相比 顯著亢進博來黴素水解酵素之表現及/或活性」係指與並 152654.doc 12 201131169 無乾*無肌膚改善^L· m jtj, +1. 谭肌膚過敏性皮膚炎所導致之乾 森肌膺的改善效果之對昭 解酵素之矣斑田 …、樂相比’所測定之博來黴素水 =:Γ性或其雙方例如分別為麵以上、 次150/。以上、或2〇〇%以上之情形。 博來黴素水解酵素之矣 編碼該酵辛之茂因^ 或活性之充進亦可藉由使 水解酵k其性^而達成。編碼博來黴素 水解酵素之基因之〜比鄰 域結合之轉錚…- ，、轉錄調即區域及與該區 時，若博來黴素水解酵素表現 :右上述轉錄調節區域具有自該酵素之編碼序列直至 bP〜1216 bp下游之區域即可1獲得較高 水解酵素活性之觀點博末徽素 謂“。下游之區域。““轉錄調節區域含有直 至：來黴素水解酵素之表現若含有自該酵素之編碼序列直 = 21“Ρ下游為止之區域即可。認為圖Η中記載之轉 错由几進該區域中所含IRIM、 1、SP-1、GATA-1之結合活性，而尤其A " 酵素之表現。事廉1補也 Ί 來黴素水解 ⑽“上’博來黴素水解酵素係藉由紫外線 (UV ’ uuravi0let)照射而完進其表現（資料未表示），結果於 MZF-!、GATA·!之表現宄進與剩度及照射 發 現相關關係（圖13)。 之間發 因此’與對照藥劑相比，藉由候補藥劑可將編碼 ”水解酵素之基因之轉錄活性、或轉錄因子對於該基夕 轉錄調節區域的結合活性顯著地宄進，例如分： 120/。以上、或15〇%以上或2〇〇%以上之情形時，可認為

S 152654.doc •13- 201131169 博來徽素水解酵素之表現量及/或活性顯著亢進。 博來黴素水解酵素之表現及/或活性亦受到細胞激素之 影響。例如已知參與過敏性皮膚炎之作為Th2細胞激素之 種的介白素_4(IL(interleukin)-4)下調博來黴素水解酵素 之表現。其支持過敏性皮膚炎患者之皮膚中發現之博來黴 素水解酵素的低表現。另一方面，與IL-4相反具有抑制 IgE產生之作用的ΤΜ細胞激素之代表的干擾素丫顯著亢進 博來徽素水解酵素之表現。又，Th2細胞激素中作為炎症 性細胞激素之代表之腫瘤細胞壞死因子a(TNFa)亦顯著完 進該酵素之表現。不僅該等物質，博來黴素水解酵素之2 :及/或活性亦藉由旧照射而宄進'结果雖未顯示但確 <體表面之中易於接受紫外線照射之臉頰等皮膚中之博來 黴素水解酵素的活性藉由uv照射而亢進。 本發明之第二觀點中，提供一種因過敏性 之乾燥肌膚之改善或預防方法，其係藉由使顯著 組織中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性而進行。， 本發明之因過敏性皮膚炎所導致之乾燥 防方法中，例如與實施該處理方法前之 ;^或劳 或活性相“顯著…膚中之博來黴素 = 表現及 及/或活性。所謂「顯著 素之表現 素之表㈣或活性為_以：係黴素水_ 上之值的情形》 上、或200。/〇以 素水解酵素之表 進該酵素之表現 本發明之方法中，使用顯著完進博^ 現及/或活性之任意的藥χ J 52654.doc • J 4 · 201131169 或活丨生者，則藥劑並無限定。本發明之方法中所使用之藥 劑等只要可應用於皮膚且可達成本發明之目的，則可以任 意形態而應用於皮膚，又，亦可單獨應用，或與其他任意 成分共同調配而應用。又，所應用之皮膚之部位亦無限 定，含有包含頭皮之體表面的所有皮膚。 本發明之第三觀點中，提供一種因過敏性皮膚炎所導致 之乾燥肌膚之原因之診斷方法，其係於皮膚組織中之博來 黴素水解酵素之表現及/或活性與對照皮膚中之博來黴素 水解酵素之表現及/或活性相比顯著下降之情形時，診斷 為存在因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向，與對照 皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比若為相 同程度以上，則診斷為不存在因過敏性皮膚炎所導致之乾 燥肌膚之傾向。 被試驗者之肌膚是否為乾燥肌膚，可由被試驗者'醫生 等主觀判斷，或可藉由使用皮表水分測定器測定皮膚之含 水量而客觀判斷。例如’亦可如本說明書之實驗3所說 明，依據圖6中記載之流程表，根據易出油程度、容易乾 程度等，由被試驗者等主觀判斷是否為「乾燥肌膚」。 乾燥肌膚之判定可容易地進行，但判斷被試驗者之肌膚 是否由於「因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚」所引起較 為困難。根據本發明之診斷方法，不僅可判斷被試驗者之 當前之肌膚狀態，亦可診斷是否容易成為因過敏性皮膚炎 所導致之乾燥肌膚。 所谓「博來黴素水解酵素之表現及/或活性與對照皮膚 152654.doc .. 201131169 中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比顯著下降」 係：若與例如自皮膚醫學之立場由醫生判斷為濕潤肌膚之 正*的肖照皮膚」相比，所測定之博來黴素水解酵素之 表現及/或活性為8〇%以下、或7〇%以下或以下或 50/〇以下、或3〇%以下、或1〇%以下之情形。所謂「與對 了皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比為相 同程度以上」係指若與例如自皮膚醫學立場由醫生判斷為 濕潤肌膚之正常「對照皮膚」相比’所測定之博來徽素水 解酵素之表現及/或活性例如為8G%以上或㈣以上、或 100%以上之情形。 成為又檢體之皮膚肖質層試樣的採取可利用任意方法而 實鉍’但就簡便性之觀點而言，較佳為膠帶剝離法。所謂 膠帶剝離係指藉由於皮膚表層貼附膠帶片，然後剝下，皮 膚角質層附著於所剝下之膠帶上，而採取角質層試樣之方 法。若利用膠帶剝離法，則可以僅採取一片夥帶之角質層 之程度而測定博來黴素水解酵素之表現或活性，可成為: 博來黴素水解酵素作為指標之因過敏性皮膚炎所導致之乾 燥肌膚的非侵襲性的評價方法。膠帶剝離之較佳之方法係 藉由如下方式而進行：首先利用例如乙醇等使皮膚之表層 淨化’除去皮脂、污垢#，將切成適當之尺寸(例如5x5 cm)之膠帶片輕輕放置於皮膚表面上，對膠帶整體施加均

專之力壓至平坦，盆接1；2的望今4^ AI -八後以均等之力剝下膠帶。膠帶可為市 售之赛料帶等’亦可使用例如Weh Superstrength

MaUing Tape〇司製造）、赛路紛帶（㈣。邮（註冊商 152654.doc • 16- 201131169 標）；Nichiban股份有限公司）等。 以下，列舉具體例，進而具體地說明本發明。再者，本 發明並不限定於此。 [實施例] 本實驗中使用以下材料。 約蛋白酶I係由EMD Bioscience公司購入。博來黴素水 解酵素係自人體表皮角質層，依據非專利文獻5而製作。 人體 IL-4及 IFN-γ係自 PEPROTECH EC(London, England)構 入。人體IL-13及IL-17A/F係R&D SYSTEM (MINNEAPOLIS, MN)製造者。自 Bachem Bioscience (Bubendorf，Switzerland) 獲取瓜胺酸4-曱基香豆基-7-醯胺（Cit-MCA)。所使用之其 他所有化學物質為試劑等級者。 角質形成細胞之培養 將源自新生兒期表皮之正常人體表皮角質形成細胞 (Kurabo，Osaka，Japan)於含有低濃度（0.03 mM)之約、及 HKGS Growth Supplement(Cascade Biologies)之 EpiLife培 養基（Cascade Biologies，Portland，OR)中進行培養。一面 添加5% C02—面將所有細胞於37°C下進行培養，並且於繼 代4代以内使用。於融合70%、融合100%、融合2天後、及 2 mM之鈣中融合2天後，採取角質形成細胞。 實驗1 認為博來黴素水解酵素於NMF產生之最終階段起作用。 於該情形時，於乾燥肌膚中存在本酵素之表現下降之可能 性。本實驗中，對皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/

S 152654.doc •17- 201131169 或活性的下降是否與乾燥肌膚有關聯進行研究。 皮膚角質層試樣係藉由將透明穋帶（Sellotape(註冊商 標）(NICHIBAN))貼附於手腕皮膚表面後進行剝離之膠帶剝 離法而採取。裁剪附著有皮膚角質層之該膠帶，浸潰於萃 取緩衝液（0·1 M Tris，HCl(pH 值為 8·0)，0.14 M NaCl, 0.1% Tween-20, 1 ml)中，實施超音波處理（20 secx4)，製作角質 層萃取液。對該萃取液實施西方墨點法。所使用之抗博來 黴素水解酵素（BH),抗體係使用由鎌田等人（Journal 〇f Biological Chemistry 2009)製作之抗體。具體而言，對角 質層萃取液進行SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烧基硫 酸鈉）電泳後，轉印至Imm〇bii〇n_p(Millip〇re公司）上，清 洗該轉印之膜後’於室溫下與抗BH抗體反應1小時。進而 藉由清洗而除去抗體後，使HRP(h〇rSeradish peroxidase， 辣根過氧化酶）結合二次抗體進行反應。清洗後，將藉由 ECL Plus Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)而 發光之BH蛋白條帶曝光於x射線膜上，根據條帶之濃淡推 測表現量。將結果示於圖1及圖2。 圖1中，檢體1為本人自認為乾燥肌膚之人體之皮膚角質 層試樣，檢體2為認為並非乾燥肌膚之健康學生之皮膚角 質層試樣。又，圖2中之檢體丁及a為源自並不感覺乾燥之 被忒驗者之忒樣，檢體；^為源自稍感覺乾燥之被試驗者之 試樣’並且檢體Μ為源自感覺乾燥之被試驗者之試樣。檢 體1中之博來黴素水解酵素之表現量較少，另一方面，檢 體2中之該酵素表現量較多。由該結果可知檢體卜2分 152654.doc 201131169 別源自乾燥肌膚、濕潤肌膚《又，自使用檢體丨之結果可 知’乾燥肌膚中，越接近作為NMF產生之場所之表皮表 面’博來黴素水解酵素量越下降。圖2中，檢體丁及A表示 自未特別感覺乾燥之檢體獲得之萃取液之西方墨點像，檢 體N及]VI表示自強烈意識到乾燥之檢體獲得之萃取液之西 方墨點像。 實驗2 本實驗中，對人體皮膚中之博來黴素水解酵素之量或活 性之個體差，及該酵素量與活性之相關進行研究。依據實 驗1中記載之方法，自40名20〜25歲女學生之手腕皮膚製作 角質層萃取液。依據Kamata et al(J. Biol. Chem.，Vol. 284, Issue 19’ 12829-12836, May 8, 2〇〇9)等方法測定該萃取液 中之博來黴素水解酵素量及其酵素活性。表現量係利用西 方墨點法而進行評價，並且酵素活性係藉由測定作為榮光 基質之Cit-β-ΝΑ之分解量而評價該酵素之胺基肽酶活性。 結果示於圖3，並且其相關圖示於圖4。由圖4之結果明 確’博來歸轉料量與其活性之时在相關關係。 繼而，關於上述角質層萃取液，對博來黴素水解酵素 各種皮膚參數進行統計解f本實驗中，將扣人之角質 萃取液分類成以下2種。利用密度計將根據西方墨點法 結果明確之博來黴素水解酵素量數值化後，以任意單位 不1之If料種為博來黴素水解酵素量未達1〇且該I 素之活性未達M nm°1/min/ml之萃取液：博來黴素水解, 素之蛋白質量較少且活性較低(BH 1〇w); 一種為博來黴· 152654.doc 201131169 水解酵素量未達10且該酵素之活性未達1.5 nmol/min/ml以 外之萃取液：蛋白質量較多且活性較高（BH high)。 游離胺基酸係依據 Kamata et al(J. Biol. Chem·，Vol. 284, Issue 19，12829-12836，May 8，2009)等方法而測定。具體 而言，藉由使藉由鈣蛋白酶I分解之絲聚蛋白肽與各萃取 液進行反應，使用熒胺對胺基進行定量分析，而測定游離 胺基酸量。游離胺基酸之測定結果示於圖5A。圖5A中之 縱軸之單位表示測定試樣3 ml中之總游離胺基酸量 (nmol) 〇 博來黴素水解酵素之活性如上所述，係藉由測定作為螢 光基質之Cit-β-ΝΑ之分解量而評價該酵素之胺基肽酶活 性。博來黴素水解酵素活性之測定結果示於圖5 B。圖5 B 中之縱軸之單位表示Cit-β-ΝΑ的分解量（nmol/min/ml)。 上述學生之皮膚之TEWL係使用Vapometer(Delfin Technologies, Ltd, Finland)進行測定，以g/m2/h為單位表 示。TEWL之測定結果示於圖5C。 如圖5C所示，博來黴素水解酵素活性較低之群（2,5 U<) 與較高之群中，角質層之含水量存在顯著之差。進而，該 酵素之量與活性雙方均較低之群中，游離胺基酸較少，並 且TEWL亦較高（圖5A及5C)。 資料雖未顯示，游離胺基酸較低之群（1000<)與較高之 群中，NMF、尿刊酸之量存在顯著之差，並且NMF較低之 群（〇.8<)與較高之群甲，尿刊酸存在顯著之差。又，TEWL 較低之群（2.5<)與較高之群中，NMF、乳酸、脲存在顯著 152654.doc -20- 201131169 之差。若考慮尿刊酸由絲聚蛋白中大多含 作，可知禮*似本^ 夕3有之組胺酸製 博來黴素水解酵素於絲聚蛋白分解中較為重要。 由本實狀結果可知，㈣來黴素轉酵素之絕對 >、之情形時’游離胺基酸量及屏障功能共同顯著下降。次 料雖未顯示，於使用源自臉頰之角質層萃取液之情形時貝 亦確認博來黴素水解酵素量與屏障功能成比例關係。 實驗3 本實驗中，根據圖6中記載之流程表，對上述女學生進 行問卷調查，將各學生之肌膚分類成濕潤肌膚、乾燥肌 膚、乾燥型油性肌膚、油性肌膚四種。問卷調查結果，與 上述實驗2中測定之皮膚參數之結果的相關關係示於圖7。 由圖7可知，分類成油性乾燥肌膚之學生的博來黴素水解 酵素活性顯著較高。 實驗4 本實驗中，對皮膚中之博來黴素水解酵素與絲聚蛋白之 定域進行研究。 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色係利用Kamata et al(J. Biol. Chem.， Vol. 284, lssue 19，12829-12836, May 8, 2009)中記載之方 法進行。材料係使用5 μπι厚之人體皮膚之冷凍切片，並且 使用抗大白鼠BH IgG。詳細而言’知情同意後，自東京醫 科大學之患有過敏性皮膚炎之患者獲得人體皮膚標本。本 研究係由與倫理（Human Ethics)相關之東京醫科大學設施 内審查委員會及資生堂特別會議承認。

S 152654.doc -21· 201131169 將人體.過敏性皮膚炎（病變皮膚與非病變皮膚）及正常皮 膚之切片與抗大白鼠BH IgG及抗人體·絲聚蛋白IgG—併於 室溫下培養1小時，其後，利用PBS(phosphate buffered saline，麟酸鹽緩衝鹽水）清洗，並且進而與作為榮光結合 二次抗體之 Alexa Fluor 555 或 488(Molecular Probes Inc·， Eugene, OR)—併培養。核之可視化係使用DAPI(4W-二脒 基-2-苯基 β 引 D朵；Molecular Probes)。 正常皮膚之組織染色結果示於圖8，並且源自健康者之 皮膚（正常皮膚）與源自過敏性皮膚炎患者之皮膚（異位性皮 疹部）的對比結果示於圖9。如圖8所示，博來黴素水解酵 素於表皮之上層較高表現，表示與絲聚蛋白相同之定域。 另一方面，於異位性皮疹部，與正常皮膚相比，博來黴素 水解酵素及絲聚蛋白之表現較低（圖9)。

定量PCR 角質形成細胞中之博來黴素水解酵素之表現量係利用以 下方法藉由定量PCR而測定。Light Cycler 480(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)試劑係使用 Light Cycler FastStart DNA Master CYBR Green I。於10 μΐ之 SYBR Green I master mix中分別添加0.6 μΐ之以下博來徽素 水解酵素引子、及6.8 μΐ水，使總量為20 μΐ，於95°C下15 秒、55°C下20秒、72°C下20秒進行45週期之PCR。所獲得 之結果與作為管家基因之G3PDH的結果相比較而修正。 正向引子：TGTGGTTTGGCTGTGATGTT(序列編號1) 反向弓I 子：GCACCATCCTGATCATCCTT(序列編號2) 152654.doc -22- 201131169 上述定量PCR之結果示於圖10。如圖10所示，與80%融 合之角質形成細胞即未分化之角質形成細胞相比，於達到 融合即分化之角質形成細胞中，博來黴素水解酵素較高表 現。換言之，由本實驗結果可知，該酵素於分化前之基底 細胞中未怎麼表現。該定量PCR之結果支持上述組織染色 之結果。 實驗5 1) 使用人體表皮角質形成細胞之BH啟動子之螢光酶分析： 於增殖期（約80%融合）或分化後（融合後，空氣曝露，添 加2 mM鈣，進而繼續培養2天者）之角質形成細胞中添加 Lysis buffer(200 μΐ)，使細胞溶解。測定係使用Bright-Glo Luciferase assay System(Promega Co” Madison, WI, USA)。將樣品20 μΐ移至特定之管中，使用Auto Lumat Plus(LB95 3)8Berthhold GmbH & Co. KG. Bad Wildbad Germany)進行測定。由圖12之結果可知，於博來黴素水解 酵素表現時，上述轉錄調節區域若具有自該酵素之編碼序 列直至至少216 bp下游的區域即可。 2) 對NHEK之UV照射： 照射 30 mJ或 60 mJ之UVB(Torex F120S-E-30/DMR, 20 W, Toshiba Medical Supply)，於 3 小時後、24小時後、48 小時 後，利用特定之方法回收RNA，利用定量PCR，測定博來 黴素水解酵素及鈣蛋白酶之mRNA表現。測定之結果，照 射30 mJ後以48小時所回收之試樣最表現出博來黴素水解 酵素之mRNA(圖13)。

S 152654.doc -23- 201131169 3) 細胞激素對博來黴素表現所造成之影響 將 IL-4(最終濃度：0.1、1.0、10 ng/ml)、TNFot(最終濃 度：0.1 ' 1.0、10 ng/ml)、IFNy(最終濃度：1·〇、1〇、1〇〇 ng/ml)分別添加於增殖期之培養角質形成細胞中，培養24 小時後，使用Isogen(等基因）採取RNA。利用定量PCR， 測定博來黴素水解酵素之mRNA表現。結果示於圖14。由 圖14之結果可知，作為Th2細胞激素之一種之介白素-4(IL- 4) 下調博來黴素水解酵素之表現。 實驗6 人體BH基因之特性決定 1) BH之5’-毗鄰區域之選殖 根據人體BH基因之核苷酸序列，使用基因特異引子1 (GSP1)、5'-tccctcgagtctgtatcagagcagctaca-3’（序列編號 3)與 基因特異引子 2(GSP2)、5'-tgaacacgcgtccgagctgctcatggcg-3’（序列編號4)，依據製造業者之操作說明書，使用 Genome Walker Kit(Clontech，Mountain View, CA)，放大 5’-毗鄰區域。簡言之，於5%二曱基亞砜存在下，實施一 次 PCR:使用 Ex Taq DNA聚合酶（Takara，Shiga，Japan)， 利用由製造業者推薦之兩步驟PCR協議：於94°C下25秒， 並且於72°C下4分鐘進行7週期，繼而於94°C下25秒，並且 於67°C下4分鐘進行32週期，並且於最後伸長67°C下4分 鐘，並使用GSP1與適配器引子（AP)1。繼而，用作二次 PCR放大之範本，其係稀釋一次PCR混合物，並且使用 GSP2與AP2。除了使用5週期之初次週期代替7週期，繼續 152654.doc •24· 201131169 使用20週期代替32週期之外，二次PCR與一次PCR相同。 藉由使用圖15中所列舉之引子之PCR而產出BH之5'-毗鄰區 域的連續5'-缺失突變株。放大後，所有PCR產物於pGEM-T簡易載體（Promega，Madison, WI)内克隆化’並且使用 ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City，CA)決定序列 e 為了構築通報質體pGL3-1216/+1，於以下條件下：最初 改質94°C下4分鐘、94°C下30秒、60°C下1分鐘、72°C下1 分鐘進行30週期、並且最後伸長72°C下4分鐘，使用作為 範本之PGEM-T-1216/+1、以及含有限制部位Κρη I及Mlu I 之 1 組特異 BH 引子（5'-ccgggtaccatcagagttccttagaa-3'(序列編 號 5)及 5’-taaatacgcgttggcgcccacgctgccg-3’）（序列編號 6)，而 實施PCR。將所獲得之PCR產物藉由Κρη I及Mlu I分解， 並且於pGL3-Basic載體（Promega)内選殖》再者，pGL3-Basic載體含有螢火蟲螢光素酶基因。藉由使用QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN，Duesseldorf，Germany)而製備 構築物。 2)定點突變誘發 藉由依據製造業者之操作說明書，使用Quick change site-directed mutagenesis試劑盒（Stratagene，La Jolla, CA) 而實施MZF-1、Sp-1、及IRF-1/2結合部位之突變誘發。為 了 製作缺失變異 Sp-1 使用 5'-ggaccccgtttcagcctccccgcc-3,（序 列編號7)(突變體Sp-Ι部位之正向引子）及5·· ggcggggaggctgaaacggggtcc-3'(序列編號 8)(突變體 Sp-Ι 部位

S 152654.doc -25- 201131169 之反向引子）。關於MZF-1突變體，使用5’- 部位之正向引子）及 5'-gcggagggacaaaaccgcgttgctgagtca-3'(序列編號10)(突變體MZF-1部位之反向引子）。關於IRF-1/2突變體，使用 5'-gccgccgagcctccggcgctcc-3'(序列編號 11)(突變體IRF-1/2部位之正向引子）及5·-ggagcgccggaggctcggcggc-3·(序列編號 12)(IRF-l/2部位之反 向引子）。 3) 轉染與啟動子活性之測量 將角質形成細胞以5x104細胞/孔之密度於12孔組織培養 板内進行培養，並且使用FuGene HD Transfection試劑 (Roche Diagnostics，Basel，Switzerland)，使用各個構築物 1 pg，進行轉染。為了修正轉染效率，於所有細胞中使 HSV-TK啟動子之控制下存在之含有海紫羅蘭科（Renilla)螢 光酶基因之pGL4.74[hRluc-TK]載體（Promega)同時轉染。 只要未事先說明，於轉染24小時後採集細胞，並且使用每 1孔之250 μΐ的Passive lysis緩衝液（Promega)而溶解。使用 Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)及 Autolumat plus luminometer(Berthold Technologies, Bad Wildbad，Germany)分析螢光酶活性。關於海紫羅蘭科.螢 光酶活性，將螢火蟲螢光素酶活性標準化。關於各構築 物，獨立實施3個轉染，並且以平均值為單位表示結果。 4) 定量即時RT-PCR分析 利用定量即時RT-PCR而分析BH及關聯因子之轉錄水 152654.doc -26- 201131169 平。依據製造業者之操作說明書，使用ISOGEN(Nippon Gene, Tokyo，Japan)自培養細胞萃取全RNA。使用 Superscript(商標）II(Invitrogen，Carlsbad, CA)逆轉錄成 cDNA。依據製造業者之操作說明書，使用LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche Diagnostics)，利用 LightCycler raid cycler系統而實施即時RT-PCR。與所使用 之引子相關之資訊示於圖16。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase))作為 基準基因。藉由LightCycler分析軟體之融解曲線之定量分 析而確認所放大之片段的特異性。對於GAPDH之mRNA， 將mRNA之量標準化，並且作為相對於最終未處理對照之 mRNA的比而表示。 5) IRF-1及-2之siRNA基礎的抑制 依據製造業者之操作說明書，與40 nM之silRF-1、 siIRF-2、及 siControl A(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) — 併使用 Lipofectamine RNAi Max(Invitrogen， Carlsbad，CA)，對培養角質形成細胞進行轉染。將該細胞 於不含抗生物質之培養基中培養24小時，其後，萃取全 RNA，並且如上所述，利用即時RT-PCR進行分析。 6) 電泳遷移率改變分析（EMSA(electrophoretic mobility shift assay)) 藉由對單鏈生物素化寡核苷.酸與單鏈未標識寡核苷酸進 行退火而製備雙鏈募核苷酸探針（圖17)。藉由使用Nuclear Extraction(核萃取）試劑盒及EMS A gel shift(凝膠遷移）試劑

S 152654.doc -27- 201131169 盒（Panomics，Santa Clara，CA)而實施核之萃取及 EMSA。 將核萃取物（4 pg)與lx結合緩衝液及1 pg之聚d(I-C)、以及 對應於MZF-1、Sp-1、IRF-1/2、及GATA-1結合部位之生 物素化探針（50 pmol)—併於15°C下培養30分鐘。為了分析 競爭，將2倍過剩之未標識探針於生物素化探針添加前於 結合反應中添加。繼而，將該等培養混合物與〇·5χΤΒΕ緩 衝液一併於8°/。之聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，並且轉印 至 Biodyne B尼龍膜（Pall，Port Washington, NY)。藉由使 用EMSA gel shift試劑盒中之化學發光檢測試劑而使條帶 可見化。 7)結果 人體BH基因啟動子之離析及特性決定 藉由Genome Net MOTIF程式之檢索，明確人體BH之5·-毗鄰區域内大多數之推測轉錄因子結合部位（圖1 8A)。尤 其，於接近轉錄開始部位之位置的-216/+1區域中，存在與 藉由MZF1、Sp-1、IRF-1/2、及GATA-1/2而識別之複合序 列很好吻合的序列，因此暗示該等轉錄因子與BH啟動子 活性之調整有關。更嚴密而言，為了決定BH之啟動子區 域，實施缺失分析（圖18B)。於藉由pGL3-816而轉染之分 化型角質形成細胞中檢測出最高水平之螢光酶活性。然 而，缺失質體之相對螢光酶活性為直至進行到pGL3-216， 缺失仍然較高殘留。槔築體中，含有（表示成PGL3-444)片 段-444/+1之質體於培養角質形成細胞中顯示出顯著較低之 活性，暗示存在-616/-444區域中之上游抑制因子活性。該 152654.doc -28- 201131169 等結果證實-216/-1區域含有用以BH基因轉錄之最小啟動 子，因此其核苷酸序列示於圖18C。該序列不含有TATA· 或CCAAT-盒，因此暗示該基因之管家性質。另一方面， 幾個轉錄性因子結合部位例如MZF-1、Sp-1、IRF-1/2、及 GATA-1/2等存在於該核心·啟動子區域。 參與BH基因調節之潛在cis-element之鑑定 為了決定參與BH基因表現之轉錄調節的最小啟動子之 潛在cis-element，構築以各cis-element為標的之新的一系 列缺失突變株。於MZF-1、Sp-Ι、及IRF-1/2之結合部位缺 失之情形時，較多下方控制啟動子活性（圖19A)。 進而，調查該等轉錄因子是否可分別與推測結合部位實 際結合。為此，使用來自培養角質形成細胞之核萃取物， 及含有MZF-1、Sp-1、GATA-1、或IRF-1/2結合部位之生 物素化雙鏈寡核苷酸探針，實施電泳遷移率改變分析 (EMSA)。如圖 19B 所示，Sp-1、MZF-1、及 IRF1/2 結合於 BH啟動子之對應之標的部位，但GATA-1/2未結合。該等 結果表示-216〜-105 bp之啟動子區域中之該等結合部位對 用以BH轉錄之cis-element而言為不可或缺。 BH基因表現之細胞激素媒介性調節 BH為NMF產出酵素，因此亦存在其參與AD之病態生理 的可能性。藉此，檢查Thl ' Th2、及Thl7細胞激素對於 BH基因表現之效果。圖20A表示增殖型角質形成細胞中， 作為Thl細胞激素之IFN-γ藉由用量依賴樣式而下方控制 BHmRNA表現。另一方面，Th2及Thl7細胞激素完全未顯 152654.doc -29- 201131169 不出對於BH之表現的顯著效果。藉由分化型角質形成細 胞而獲得相同之結果（資料未揭示）。為了闡明BH基因表現 之調整中之IFN-γ的功能，實施啟動子分析，特別規定細 胞激素響應要素。如圖2〇B所示，IFN_Y於藉由_131〜·12〇 之間含有IRF-1/2結合序列之pGL3_BH_616轉染的培養角質 形成細胞中，下方控制BH啟動子活性。該序列缺失後 IFN-γ尚未抑制啟動子活性（圖2〇B)。此外，為了判斷irf_ 1/2是否為BH之IFN-γ誘發性下方調節的必需媒介物，使用 低分子干擾RNA(siRNA) ’抑制基因表現。 於藉由IRF-1或-2 siRNA(40 nM)之任一者轉染的培養角質 形成細胞中顯著抑制ΙΪ?Ν·γ之活性（圖2〇c)。該等結果強烈 暗不IRF-1/2結合序列對BH基因表現之ΙΪ?Ν_γ誘發性下方調 節而言為不可或缺。 培養角質形成細胞中之ΒΗ及關聯因子之表現 為了調查表皮中之轉錄調節之機構，利用即時PCR法分 析增殖型或分化型細胞中之ΒΗ、鈣蛋白酶1、及推測轉錄 因子的表現如圖21Α所示，例如與增瘦型角質形成細胞 相比較之密集期2天後者（3_6倍）、及以高鈣濃度培養者（86 倍）等所示’於分化型角質形成細胞中上方控制BH mRNA。該等結果與啟動子分析資料一致（圖i8B)。關於鈣 蛋白酶1(約2.5倍之上方控制）獲得相同之結果。又，培養 角質形成，、·田胞中，檢查各種轉錄因子，例如^、Sp_ 1 GATA 1 IRF-1及IRF-2等之表現圖案。如圖21B所 示，該等轉錄因子沿著BH之表現，於分化型角質形成細 152654.doc •30· 201131169 胞中上方控制。然而，GATA-l mRNA表現與其他因子相 比顯著較低（<1/32)。認為GATA-1於角質形成細胞中未起 到重要作用。藉此，暗示BH經由MZF-1及Sp-Ι藉由分化依 賴樣式而合成。IRF-1及IRF-2又亦藉由分化刺激而上方控 制之事實，顯示出BH表現對於IFN-γ具有非常之敏感性。

Thl及Th2細胞激素對於推測轉錄因子之表現的效果 進而對該等轉錄因子之細胞激素依賴性調節進行調查。 圖22A表示IFN-γ係藉由用量依賴式強烈上方控制iRF_i mRNA表現。相同地，IRF_2表現係於ifn_y存在下上方控 制。作為對照’ IRF-1&IRF_2之表現僅於1〇〇 ng/mkIL_4 存在下顯著增強（圖22B)。頗有意思的是，與 一併，於10 ng/ml2IL_4存在下最有效進行下方控制（圖 22C)。該等結果暗示，BH表現分別直接及間接藉由丁…及 Th2細胞激素而調節。

過敏性皮膚炎皮膚中下方控制BH FLG之功能喪失型突變與AD之發病機制相關聯，不僅基 、員刀解路位之損傷亦與AD之病理有關聯之可能 性。因此，以下檢查AD患者之病變皮膚及非病變皮膚中 之BH及絲聚蛋白的定域、以及M活性。正常表皮中，抗 BH抗體^抗絲聚蛋白抗體的二重染色於上面表皮中，尤 :、月』報〇所不’表不顆粒層中之BH與絲聚蛋白的同 疋域(圖23 A)。明破海+仇苗山 月確頁不於更咼之倍率，BH自顆粒層直 至角化層進行定祕，3

域另一方面，絲聚蛋白限定於顆粒細 胞。作為對昭，R w I 、、、B Η表現於藉由該研究而診察之ad患者 152654.doc 201131169 (n=7)的病變皮膚及非病變皮膚中急劇減少。儘管所有該 等患者經常檢測出顯著之染色，但是顯示出比較弱之絲聚 蛋白染色（圖23A)。除了免疫組織化學，對來自18名八〇患 者及30名健康志願者獲得之膠帶剝離樣品的角質細胞萃取 物測量BH活性。來自AD患者之病變皮膚及非病變皮膚的 萃取物與來自健康人的萃取物相比’顯示出實質較低之 BH活性（分別低至27.1及8.8%)(圖23B)。該等結果證實bh 與絲聚蛋白同時定域化，並且其活性於患有AD之患者的 皮膚中急劇下降。 考察 該研究中，藉由附上啟動子區域之選殖及功能的特徵而 研究BH基因表現之調節機制。啟動子解析中，於、216 上游中鑑定對BH啟動子活性而言較為重要之區域（圖 18B)。該區域中，推測結合部位顯示出對於 BH啟動子活性顯著之效果（圖18C及19A) ^頗有意思的 是’報告有Sp-Ι及MZF-1亦又參與對開始絲聚蛋白分解而 言較為重要之酵素即PAD1的調整。Sp-1為哺乳動物細胞中 作為轉錄因子而發揮功能之辞.梭·蛋白質之Sp/Kru卯d樣 家族的典型成員。認為參與包含增殖、細胞凋亡、分化、 及腫瘤性形質轉換之細胞功能的幾乎所有方面。人體表皮 中，Sp-Ι含有套膜蛋白、兜甲蛋白、轉穀氨醯胺酵素、 PAD!、2、及3 ’係參加表皮分化之基因的重要調節因 子。MZF-1為屬於鋅.梭·蛋白質之Krupple家族的轉錄因 子，於分化全能性造血性細胞、以及骨髓原始細胞中表 152654.doc •32- 201131169 現。然而，未報告有哺乳動物表皮中之轉錄調節的MZF-1 之功能。與增殖型角質形成細胞相比，分化型角質形成細 胞中發現同時上方控制MZF-1及Sp-Ι、以及BH(圖21B)， 與其說顯示出管家作用，不如說是顯示出分化中之BH之 作用。各個結果明確表示該等轉錄因子作為角質形成細胞 最終分化過程中之BH的基本之用以轉錄調節的活化因子 而發揮功能。 另一方面，cis作用element之調查進而規定該區域内之 IRF-1/2結合部位。使用EMSA，確認IRFs對於BH啟動子區 域的直接結合（圖19B)。該結合序列之定點突變誘發導致 BH啟動子活性之顯著減少（圖19A)。為此，IRF-1/2轉錄因 子亦又為基本條件下BH基因之最小啟動子活性所必需。 IRF家族為轉錄因子之群，直至當前，於各種細胞型及組 織中鑑定出九個IRF成員（IRF-1〜-9)。該等IRF分子於因 IFN-α、β、及γ引起之刺激下，實現抗病毒防禦、免疫響 應/調節、及細胞成長調節之功能。表示IRF-1及-2作為很 多參與IFN-γ誘導性基因調整的激動劑-拮抗劑對而發揮功 能。頗有意思的是，IFN-γ明顯抑制BH mRNA表現（圖20Α 及B)。弱化及定點突變誘發分析中，確認IRF-1/2結合部位 參與BH表現之IFN-γ媒介性抑制（圖20B及C)。該等結果明 確表示IRF-1/2為人體角質形成細胞中之BH基因的IFN-γ媒 介性下方調節的媒介物。另一方面，作為Th2細胞激素之 IL-4及IL-13完全未顯示出24小時培養之間的直接作用（圖 20A)。然而，該等Th2細胞激素顯著抑制作為活化物分子 s 152654.doc -33- 201131169 之MZF-WSp-i的表現。藉此，Th2細胞激素對負調節冊 表現較為妥當。 又，亦表示於病變及非病變AD皮膚中急劇下方控制 BH(圖23A及B)。絲聚蛋白突變為AD等屏障損傷關聯疾病 的主要危險因子，突變分析中，指出未達愛爾蘭產生之 50%，並且僅占日本之〜2〇%的比例。假設不僅絲聚蛋白合 成不全，絲聚蛋白之分解傷害亦參與屏障功能之崩解。明 確NMF之減少導致乾燥肌膚，其使屏障之崩解進行。ad 為Th2極性化疾病是眾所周知。然而，最近報告暗示細 胞激素亦於AD中起作用。例如，「内因性AD」免疫學附有 IL-4、IL-5、及IL-13較低之表現、及ΙΙ7Ν_γ較高之表現的 特徵。此外，自Thl對Th2之偏移係於入1)皮膚中之急性相 向慢性相之間引起。各種結果表示亦存在AD中ifn_Y起到 較所認為更重要之功能的可能性。 作為結論，各種結果表示人體表皮中2BH轉錄係藉由 二重樣式而調節。其中之—路徑存在於角質形成細胞最終 分化的控制下，並且另—者依賴於Thl及Th2細胞激素。該 等路徑相互關聯，因此朝向BH表現之下方調節而容易使 平衡偏移。BH之下降導致NMF之不足，由此與乾燥肌膚 或進而屏障崩解相關。該等結果提供一種對BH調整與AD 之發病機制的新認識。 【圖式簡單說明】 圖1係表示藉由膠帶剝離獲得之人體皮膚萃取液中之博 來徽素酵素£與膠帶剥離之次數之關係的西方墨點法圖。 152654.doc •34- 201131169 圖2係表示人體皮膚萃取液中之博來黴素酵素量 肌膚之關係的西方墨點法圖。T、A :调ό 土 L辟 你自未感覺乾燥 a οα 被試驗者的樣品；N :源自稍感覺乾燥之被試驗者、 品；及Μ:源自感覺乾燥之被試驗者的樣 的樣 萃取液中之博來黴素水解 表。橫軸之編號表示被試 圖3係表示人體手腕之角質層 酵素量與其酵素活性之關係的圖 驗者之識別編號。 圖4係依據關於圖3中所獲得之博來黴素水解酵素量與活 性之關係的袁小平方法之一次近似。 、 圖5係與人體手腕之角質層萃取液中之博來黴素水解酵 素與皮膚參數（Α :游離胺基酸，β :活性，c : tewl)才 關之統計解析。BH low :博來黴素水解酵素量<1〇、活)性 ^(nn^Anin/nU) ; BH high :博來黴素水解酵素量 2 10、活性 g 1.5(nmol/min/ml)。 圖6係肌膚分類用問卷調查流程表。 圖7係依據圖6之流程表分類之被試驗者的角質層之皮膚 參數測定結果。 圖8係表示正常皮膚中之博來黴素水解酵素及絲聚蛋白 之定域的組織染色圖。 圖9係表示異録患者皮膚巾之博來黴素水料素及絲 聚蛋白之定域的組織染色圖。 圖10係使用定量PCR之备& 、 之角貝形成細胞之分化與博來黴素 水解酵素之表現量的關作夕_圭 ,, ^ ^ 里幻關保之圖表。縱軸之值表示以8〇%融 合之表現量為1之情形時的相對量。 152654.doc i •35· 201131169 圖11係表示編碼博來黴素水解酵素之基因之5ι毗鄰區域 的模式圖。 圖12係表示使用人體表皮角質形成細胞之bh啟動子之 螢光酶分析之結果的圖表。 圖13係表示轉錄因子SP1、MZFi及GATAi之表現與1^ 照射之關係的圖表。 圖14係表示正常人體表皮角化細胞中之博來黴素水解酵 素及蛋白酶之表現與UV照射之關係的圖表。 圖15係為了利用PCR製作BH之5'-毗鄰區域的連續5ι_缺 失突變株而使用之引子。 圖16係為了利用定量即時11丁_1>(：11分析BH及關聯因子之 轉錄水平而使用之引子。 圖17係電泳遷移率改變分析中所使用之探針。 圖18(A)表示人體bh之5，-毗鄰區域之模式圖。5，_毗鄰區 域内之推測轉錄因子結合部位藉由Gen〇me Net 1^〇丁11?程 式之檢索而明確。（B)係藉由缺失分析而決定之BH之啟動 子區域。（C)係對包含犯之冑小啟動子之序列及推測轉錄 因子結合部位的，216/-1區域之表示核苷酸序列的推測轉錄 因子結合部位附上下劃線。 圖19(A)係定點突變誘發引起之BH啟動子中之轉錄因子 結合部位的特性決定。表示推測轉錄因子結合部位之缺失 構築體之模式圖及培養角質形成細胞中之Μ酶活性。定 點突變誘發係藉由跨越·616/+1區域之核普酸序列的構㈣ 而實施。（Β)表示MZF]、外]、GATA]、或抓1/2對於 152654.doc -36- 201131169 BH啟動子之cis-作用element的結合。實驗係藉由使用來自 培養角質形成細胞之核萃取物、及含有推測轉錄因子結合 部位MZF-1、Sp-1、GATA-1、或IRF-1/2之生物素化雙鏈 寡核苷酸探針的電泳遷移率改變分析（EMSA)而進行。區 帶1為核萃取物中之生物素化探針之結合分佈，區帶2表示 與2倍過剩量之非標籤化探針競爭後之生物素化探針的結 合分佈。 圖20(A)係BH表現之即時RT-PCR分析。表示Thl、Th2、 及Thl7細胞激素對於BH基因表現之效果。（B)為IRF-1/2結 合部位之突變分析。表示IFN-γ存在下的培養角質形成細 胞中之BH啟動子活性。藉由含有BH啟動子區域之Imtakt IRF-1/2結合部位之pGL3-216對角質形成細胞進行轉染， 藉由IFN-γ處理24小時（上面板）。藉由△pGL3-616(IRF-l/2 缺失突變體）對角質形成細胞進行轉染，於10 ng/ml之IFN-γ或IL-4存在下或不存在下處理24小時（下面板）。（C)係使 用用以判斷IRF-1/2是否為ΒΗ之IFN-γ誘發性下方調節的必 需媒介物的低分子干擾RNA(siRNA)對IRF-1及IRF-2基因 表現進行測定。藉由IRF-1或IRF-2之siRNA(40 nM)對角質 形成細胞進行轉染，培養24小時，藉由10 ng/ml之IFN-γ進 行處理，進而培養24小時後進行RNA離析。右面板表示 IRF-1及IRF-2之沉默之效果。 圖2 1(A)係利用用以調查表皮中之轉錄調節之機構的即 時PCR法進行之增殖型或分化型細胞中之BH、鈣蛋白酶 I、及推測轉錄因子的表現分析。（B)為培養角質形成細胞 152654.doc -37- 201131169 中之轉錄因子MZF-l ' Sp-l、GATA-l、IRF-1及IRF-2之表 現圖案分析β 圖22(A)係IFN-γ對於推測轉錄因子IRF-1及IRF-2之表現 之效果。（B)係IL-4對於推測轉錄因子IRF-1、IRF-2、 MZF-1及Sp-l之表現之效果。 圖23係（A)正常表皮中之抗BH抗體與抗絲聚蛋白抗體中 之二重染色所示顆粒層中之BH與絲聚蛋白的同時定域。 (B)係來自AD患者之病變皮膚與非病變皮膚之萃取物的BH 活性。 152654.doc -38 - 201131169 序列表 <110>日商資生堂股份有限公司 <120>以博來黴素水解酵素之活性作為指標之因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚改 善劑之筛選方法

<130〉Y697-PCT <140〉 099142234 <141> 2010-12-03 <150〉JP 2009-275909 <151> 2009-12-03 <160> 12 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211〉 20 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉G3PDH前置引子 <400> 1 tgtggtttgg ctgtgatgtt 20 <210> 2 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉G3PDH反置引子 152654-序列表.doc 201131169 <400> 2 gcaccatcct gatcatcctt 20 <210〉 3 <211〉 29 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉BG基因特異性引子1 <400> 3 29 28 tccctcgagt ctgtatcaga gcagctaca <210〉 4 <211> 28 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉BH基因特異性引子2 <400> 4 tgaacacgcg tccgagctgc tcatggcg 〈210〉 5 <211〉 26 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉含有Kpnl之BH特異性引子 152654·序列表.doc -2- 26 201131169 <400〉 5 ccgggtacca tcagagttcc ttagaa <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213〉人工序列 〈220> 〈223>含有Mlul之BH特異性引子 <400〉 6 28 taaatacgcg ttggcgccca cgctgccg <210〉 7 <211〉 24 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <223〉Sp-Ι部位前置引子 <400> 7 24 ggaccccgtt tcagcctccc cgcc <210〉 8 <211〉 24 <212> DNA 〈213>人工序列 <220〉 <223〉Sp-Ι部位反置引子 152654-序列表.doc

S 201131169 <400〉 8 ggcggggagg ctgaaacggg gtcc 24 <210> <211> <212> <213> 9 29 DNA 人工序列 <220> <223〉MZF-1部位前置引子 <400> 9 gactcagcaa cgcggttttg tccctccgc 29 <210> 10 <211> 〈212〉 〈213〉 30 DNA 人工序列 <220〉 <223〉MZF-1部位反置引子 <400> 10 gcggagggac aaaaccgcgt tgctgagtca 30 <210> 11 <211> <212> <213> 22 DNA 人工序列 <220> <223〉IRF-1/2部位前置引子 152654-序列表.doc 201131169 <400〉 11 gccgccgagc ctccggcgct cc <210> 12 <211> . <212> <213> 22 DNA 人工序列 <220〉 <223〉IRF-1/2部位反置引子 <400〉 12 ggagcgccgg aggctcggcg gc 152654-序列表.doc

Claims (1)

1. 201131169 七、申請專利範圍： 1. 士，因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑之筛選 平<貝方法’其於候補藥劑與對照藥劑相比顯著宄進博來 黴素水解酵素之表現及/或活性之㈣時，將該候補藥劑 ㈣為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑。 2·如請求項1之方法’其中於編碼博來黴素水解酵素之基 =之轉錄活性與對照者相比為顯著完進之情形時，判斷 出上述表現及/或活性顯著亢進。 如叫求項2之方法，其中於轉錄因子irf] '⑽·2 ' MZF]、SIM、及/或gah對於編碼博來黴素水解酵素 :二因的轉錄調節區域之結合活性與對照者相比較顯著 之情形時，判斷出上述轉錄活性顯著究進。 4_ :種：過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善或預防方 及=藉由使皮膚組織中之博來黴素水解酵素之表現 及/或居性顯著亢進而進行。 5· Γ2Γ之方法’其中藉由以編碼博來黴素水解酵 進，因之轉錄活性，而使上述表現及/或活性顯著宄 6.如叫求項5之方法，其中由亢谁 2 其⑼由几進轉錄因子㈣]、IRF. 酵辛之^嗜·1、請遍.1心料博來黴素水解 =之基因的轉錄調節區域之結合活性 及/或活性顯著亢進。 1衣現 7·法種:：敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之原因之診斷方 …糸於皮膚組織中之博來黴素水解酵素之表現及/或 152654.doc 201131169 活性與對照之皮膚組織中之博來黴素水解酵素之表現及/ 或活性相比顯著下降之情形時，診斷為存在因過敏性皮 膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向’若與對照皮膚組織中之 博來徵素水解酵素之表現及/或活性相比為相同程度以 上，則診斷為並無因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌^之 傾向。 8.如請求項7之方法，其中於編碼博來黴素水解酵素之基 因之轉錄活性與對照者相比顯著下降之情形時，判斷$ 上述表現及/或活性顯著下降。 9·如請求項8之方法，其中於轉錄因子iRFim 黯-1、SIM、及/或GATA]之結合活性與對照者相比顯 者下降之情形時，判斷出上述轉錄活性下降。 152654.doc