KR102063610B1 - 퇴행성 신경질환 진단용 신규한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

퇴행성 신경질환 진단용 신규한 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 퇴행성 신경질환 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 CCN3-TSP1 도메인 영역에서 특정 아미노산의 변이를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트; 및 상기 바이오마커를 이용한 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다. 본 발명은 CCN3의 TSP1 도메인 영역에 있는 특정 시스테인 잔기의 변이가 CCN3의 정상적인 분비를 억제하며, 이 아미노산(시스테인, Cysteine)에 단백질의 해독 후 변형 과정 중 하나인 팔미토일화(Palmitoylation)가 CCN3의 정상적인 분비에 핵심적인 역할을 한다는 사실을 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경질환을 조기에 진단할 수 있다. 또한, 이러한 CCN3의 팔미토일화에 있어 ZDHHC22라고 하는 효소가 관여할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였는바, 상기 효소를 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 소재로서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

퇴행성 신경질환 진단용 신규한 바이오마커 및 이의 용도{Novel biomarkers for diagnosis of neurodegenerative diseases and uses thereof}
본 발명은 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 CCN3-TSP1 도메인 영역에서 특정 아미노산의 변이를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물; 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트; 및 상기 바이오마커를 이용한 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 고령인구가 증가하고 있으며, 우리나라도 2000년도에 이미 고령화 사회에 접어들었고, 2010년에는 65세 이상 인구가 차지하는 비율이 11%로 상승했다. 2018년이면 고령 사회, 2026년이면 초고령 사회로 접어들 것이라고 예견되고 있는 상황에서 고령인구의 노인성 질병의 해결이 시급한 사회적 문제로 대두되고 있다. 특히 노인성 치매질환의 약 절반을 차지하는 알츠하이머병은 현재로써는 유효한 치료방법과 예방 방법이 없으며, 고령화 사회에 있어서 가장 시급히 해결해야 할 신경질환 중의 하나이기에 연구가 많이 요구되는 분야이다.
한편, CCN3는 4개의 보존된 도메인(insulin-like growth factor binding protein-like domain, von Willebrand factor C repeat domain, thrombospondin-1 repeat domain, 및 C-terminal domain containing a cysteine knot)으로 구성된, CCN 패밀리 단백질 멤버이다. 사람을 포함한 포유동물의 대뇌피질에서 공통적으로 발현하는 CCN3는 세포밖 분비를 통해 개체의 전주기에 걸쳐 다양한 기능을 수행한다. 특히 CCN3의 분비 조절 실패는 신경세포내 CCN3의 축적으로 이어져 신경세포 분화 이상 및 퇴행으로 이어질 수 있다. 따라서 CCN3의 정상적인 분비 조절 기전을 밝히는 것이 필요하다.
CCN3는 인간을 포함한 고등 포유동물의 발생 중인 태아로부터 노년기에 이르기까지 대뇌피질의 신경세포(뉴런)에서 지속적으로 발현되어 세포 밖으로 분비되는 단백질로서, 이 단백질의 분비에 문제가 생기면 신경세포 내에 축적된다. 이렇게 신경세포 내에 CCN3의 농도가 증가하게 되면, 원래 발현되지 않던 랩25(RAB25)라고 하는 단백질의 발현을 유도하여 정상적인 신경세포의 분화를 억제한다(이전 특허 내용: 한국공개특허 10-2017-0005587호). 또한 이러한 비정상적인 단백질의 세포 내 축적은 일반적으로 세포 사멸을 유도하게 되는데, 문제는 CCN3가 발현되는 세포가 재생이 거의 불가능한 신경세포(뉴런)이라는데 있다. 따라서, 신경세포의 사멸은 알츠하이머 병과 같은 신경질환의 증상이므로, CCN3의 신경세포 내 축적으로 인한 세포 사멸은 퇴행성 신경질환과 깊은 연관성이 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자는 CCN3의 정상적인 분비 조절 기전을 밝히기 위하여 다양한 실험을 진행하였으며, 그 결과 CCN3의 TSP1 도메인 영역에 있는 특정 시스테인 잔기의 변이가 CCN3의 정상적인 분비를 억제하며, 이 아미노산(시스테인, Cysteine)에 단백질의 해독 후 변형 과정 중 하나인 팔미토일화(Palmitoylation)가 CCN3의 정상적인 분비에 핵심적인 역할을 한다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국공개특허 제10-2014-0130846호 한국공개특허 제10-2017-0009028호
따라서 본 발명의 목적은 바이오마커에 해당하는 특정 아미노산 잔기의 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 바이오마커를 이용하여 퇴행성 신경질환을 효과적으로 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바이오마커에 해당하는 특정 아미노산 잔기의 팔미토일화를 검출할 수 있는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바이오마커에 해당하는 특정 아미노산 잔기의 팔미토일화 검출을 통해 퇴행성 신경질환을 효과적으로 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 바이오마커에 해당하는 특정 아미노산 잔기를 팔미토일화시킬 수 있는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 상기 제제는 CCN3의 TSP1 도메인의 38번째 아미노산에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 서열이 시스테인에서 다른 아미노산 잔기로 변이된 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 검출할 수 있는, 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기가 팔미토일화가 이루어지지 않은 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기를 팔미토일화시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제제는 ZDHHC22일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 ZDHHC22는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명은 CCN3의 TSP1 도메인 영역에 있는 특정 시스테인 잔기의 변이가 CCN3의 정상적인 분비를 억제하며, 이 아미노산(시스테인, Cysteine)에 단백질의 해독 후 변형 과정 중 하나인 팔미토일화(Palmitoylation)가 CCN3의 정상적인 분비에 핵심적인 역할을 한다는 사실을 처음으로 규명함에 따라, 이를 바이오마커로 사용함으로써 알츠하이머병과 같은 퇴행성 신경질환을 조기에 진단할 수 있다. 또한, 이러한 CCN3의 팔미토일화에 있어 ZDHHC22라고 하는 효소가 관여할 수 있다는 사실을 최초로 규명하였는바, 상기 효소를 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 소재로서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 CCN3 도메인 특이적 돌연변이를 간략하게 도식화한 것이다.
도 1b는 Neuro2a 세포에서 CCN3 도메인 특이적 돌연변이의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다(CM: conditioned media, WCL: whole cell lysates).
도 1c는 CCN3 도메인 결실 돌연변이의 발현에 따른 뇌량투사 형성에 대한 생체 내(in vivo) 분석 결과를 나타낸 것이다. CCN3 돌연변이 및 GFP(또는 RFP) 발현 플라스미드를 갖는 E14.5에서 신피질 벽의 In utero 일렉트로포레이션을 수행하였다. P0 뇌의 대표적인 형광 이미지가 나타나, 발현벡터가 목적 대뇌피질 위치에 도입된 것을 증명하였다. 대뇌피질의 절단면 위치는 흰색선으로 표시하였다. 화살표는 대내피질 측색돌기(axon)의 경로를 가리킨다. Scale bar, 2 mm.
도 2a는 CCN 패밀리에서 보존된 TSP1 도메인의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2b는 CCN3-TSP1 결실 돌연변이(M1~M5)를 간략하게 도식화한 것이다.
도 2c는 CCN3-TSP1 점돌연변이를 간략하게 도식화한 것이다.
도 2d는 CCN3-TSP1 결실 돌연변이(M1~M5)의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다(CM: conditioned media, WCL: whole cell lysates).
도 2e는 CCN3-TSP1 점돌연변이의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 것이다(CM: conditioned media, WCL: whole cell lysates).
도 2f는 CCN3-TSP1 도메인에서 C241A 및 C246A 점돌연변이의 발현에 따른 뇌량투사 형성에 대한 생체 내(in vivo) 분석 결과를 나타낸 것이다. 화살표는 대내피질 측색돌기(axon)의 경로를 가리킨다. Scale bar, 2 mm.
도 3a는 팔미토일화 억제제 2-BP의 농도별 처리에 따른 CCN3의 세포 외 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 3b는 팔미토일화 억제제 세룰레닌(cerulenin)의 농도별 처리에 따른 CCN3의 세포 외 분비에 미치는 영향을 측정한 결과이다.
도 4a는 Neuro2a 세포에서 ZDHHC 패밀리 단백질의 발현량 나타낸 것이다. 위에 그래프는 ZDHHC 패밀리 단백질의 발현량을 qPCR로 측정하고 GAPDH를 기준으로 표준화하여 상대적인 발현량으로 나타낸 것이며, 아래 그림은 ZDHHC의 qPCR 앰플리콘을 나타내는 이미지이다.
도 4b는 히스티딘 풀다운 에세이를 통해 CCN3이 ZDHHC22에는 결합하는 것을 확인한 결과이다. 최종 레인에는 CCN3-V5/His가 없는 컨트롤 풀다운을 보여준다.
본 발명은 퇴행성 신경질환 진단을 위한 바이오커에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퇴행성 신경질환(neurodegenerative disease)"이란, ‘신경퇴행성질환’이라고도 하며, 광의로는 신경세포(nerve cell)가 퇴행하는 병태 전부를 포합하지만 일반적으로는 뇌혈관장해, 외상(外傷), 대사이상 등, 뚜렷한 신경계세포외의 요인이 될 수 있는 것은 포함하지 않는다. 예를 들어, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 루게릭 질환, 헌팅톤 질환, 근위축성 측석 경화증, 다발성 경화증, 면역계이상 뇌기능 부전, 진행성 신경퇴행질환, 대사성 뇌질환, 니만-픽병, 뇌 허혈 및 뇌출혈로 인한 치매 등을 예시할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 진단은 퇴행성 신경질환의 진행 또는 발병 여부를 확인하는 것으로 해석될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산(또는, CCN3단백질의 241번째 아미노산)의 신경 퇴행을 진달할 수 있는 바이오마커로의 용도에 관한 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 퇴행성 신경질환 진단용 바이오마커로서 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산은 정상조직에서는 시스테인(Cysteine)에 해당되나 상기 아미노산이 알라닌으로 변이된 경우 CCN3의 정상적인 세포밖 분비가 일어나지 않아 CCN3 단백질이 신경세포내에 축적되는 것을 확인하였다.
이러한 결과를 통하여, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산이 CCN3의 정상적인 세포밖 분비에 있어서 결정적인 역할을 함을 확인할 수 있었고, 본 발명의 상기 아미노산 변이를 측정할 수 있는 제제를 이용하면 퇴행성 신경질환을 효과적으로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 제제는 CCN3의 TSP1 도메인의 38번째 아미노산에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드, 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명의 용어 "항체"란, 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산을 포함하는 특정 폴리펩티드 서열(RLCIVRPC, Arg Leu Cys Ile Val Arg Pro Cys)에 특이적으로 결합할 수 있는 항체가 될 수 있다.
본 발명의 용어 "앱타머(aptamer)"란, 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질로 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지는 단일 가닥 핵산(DNA, RNA, 또는 변형 핵산)을 의미하는데, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있다. 상기 앱타머의 제조는 일반적인 앱타머의 제조 방법에 따라, 확인하고자 하는 표적 단백질에 대해 선택적이고 높은 결합력을 가지는 올리고뉴클레오티드의 서열을 결정하여 합성한 후, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이나 3' 말단을 링커의 작용기에 결합할 수 있도록, -SH, -COOH, -OH 또는 -NH2로 변형시킴으로써 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 앱타머는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산을 포함하는 특정 폴리펩티드 서열(RLCIVRPC, Arg Leu Cys Ile Val Arg Pro Cys)에 특이적으로 결합할 수 있는 앱타머가 될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 키트는 퇴행성 신경질환 진단 마커인, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이 여부를 측정(확인)함으로써 피험체를 대상으로 하여 퇴행성 신경질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 퇴행성 신경질환 진단용 키트에는 상기 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 확인하기 위한 항체 또는 앱타머뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 용어 "시료"란, 퇴행성 신경질환이 발병된 개체에서 분리되어 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 일 예로서 퇴행성 신경질환이 발병된 환자의 신경세포를 포함하는 혈액, 조직시료 등이 될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"란 심혈관계 질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
구체적인 일 예로서, 본 발명의 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 측정하기 위한 ELISA 키트가 될 수 있는데, 상기 키트는 특별히 이에 제한되지 않으나, CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산을 포함하는 특정 폴리펩티드 서열(RLCIVRPC, Arg Leu Cys Ile Val Arg Pro Cys)의 면역학적 검출을 위하여 기재, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기 기재는 특별히 이에 제한되지 않으나 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 특별히 이에 제한되지 않으나 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있으며, 형광물질은 특별히 이에 제한되지 않으나 FITC, RITC 등이 될 수 있고, 발색 기질액은 특별히 이에 제한되지 않으나 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 될 수 있다.
다른 예로서, 본 발명의 키트는 음성 및 양성 대조군 반응을 수행하는데 필요한 시약 또는 혼성화 반응에 필요한 완충액과 같은 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 이용되는 시약의 최적량은 본 명세서의 내용을 파악한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 분리된 패키지 또는 컴파트먼트에 상술한 성분들을 포함할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 마이크로어레이에 관한 것이다.
상기 마이크로어레이는 본 발명의 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 마이크로어레이로 이루어질 수 있다.
마이크로어레이 상에서의 핵산의 혼성화 및 혼성화 결과의 검출은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 검출은 예를 들면, 핵산 시료를 형광 물질, 예를 들면, Cy3 및 Cy5와 같은 물질을 포함하는 검출 가능한 신호를 발생시킬 수 있는 표지 물질로 표지한 다음, 마이크로어레이 상에 혼성화하고 상기 표지 물질로부터 발생하는 신호를 검출함으로써 혼성화 결과를 검출할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 예로서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 서열이 시스테인 잔기가 다른 아미노산 잔기로 변이된 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 퇴행성 신경질환이 발병된 환자의 신경 모세포종를 포함하는 혈액, 조직시료 등이 될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 검출할 수 있는, 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에서는 팔미토일화를 억제할 수 있는 제제(2-BP 또는 cerulenin)를 세포에 처리한 경우 CCN3 단백질이 세포밖으로 분비가 감소되며, 세포 내부에 축적되는 것을 실험을 통해 확인하였으며, 이를 통해 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화가 CCN3 단백질의 세포밖 분비를 위해 핵심적인 역할을 수행하는 것을 최초로 규명하였다.
이에, 본 발명의 키트는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 검출함으로써 피험체를 대상으로 하여 퇴행성 신경질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 퇴행성 신경질환 진단용 키트에는 상기 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 확인하기 위한 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 예로서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기가 팔미토일화가 이루어지지 않은 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정할 수 있다.
상기 생물학적 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 퇴행성 신경질환이 발병된 환자의 신경 모세포종를 포함하는 혈액, 조직시료 등이 될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기를 팔미토일화시킬 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 제제는 팔미토일트란스퍼레이스일 수 있으며, 바람직하게는 ZDHHC22일 수 있다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 ZDHHC22는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 재료 및 방법
플라스미드 컨스트럭트
야생형 타입 및 돌연변이 CCN3 발현 벡터를 구축하기 위하여, V5 에피토프 태그된 전장 상보적 DNA 서열 코딩하는 마우스 CCN3(BC003774)는 pCAGEN 벡터(Addgene, Cambridge, MA, USA)에 삽입되었으며, overlapping PCR을 이용하여 돌연변이유발을 수행하였다. CCN3-△IGFBP 구조물인 96bp 프래그먼트는 5‘-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGCGATG-3’ (포워드) 및 5‘-ACAGTTGTCTCCCTCTGGAGATGCAGAGACTTGACTTAAG-3’ (리버스) 프라이머를 이용하여 증폭되었으며, 786 bp 프래그먼트는 5‘-AGTCAAGTCTCTGCATCTCCAGAGGGAGACAACTGTGTGTTC-3’(포워드) 및 5‘-AATTTCTCCTCTGCTTGTCTTC-3’(리버스) 프라이머로 증폭되었다. CCN3-△VWC 구조물인 329bp 프래그먼트는 5‘-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGCGATG-3‘ (포워드) 및 5‘- GTCCCCTGCTCGTCTGAGCCGTTGTCTCCCTCTGGAACCATGC-3‘ (리버스) 프라이머로 증폭되었고, 581 bp는 5’-TGGTTCCAGAGGGAGACAACGGCTCAGACGAGCAGGGGACGCAG-3‘(포워드) 및 5’-AATTTCTCCTCTGCTTGTCTTC-3‘(리버스) 프라이머로 증폭되었다. CCN3-△TSP1 구조물인 629bp 프래그먼트는 5’-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGCGATG-3‘(포워드) 및 5’-GTTACTTCCTCGGGCTCTTGGCAGTTAATGCTGGAGTCAGAGACT-3‘ (리버스) 프라이머로 증폭하였으며, 346bp 프래그먼트는 5’-AGTCTCTGACTCCAGCATTAACTGCCAAGAGCCCGAGGAAGTAACAGAC-3‘ (포워드) 및 5’-AATTTCTCCTCTGCTTGTCTTC-3‘ (리버스) 프라이머로 증폭하였다. CCN3-△CT 구조물인 975 bp 프래그먼트는 5’-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGCGATG-3‘ (포워드) 및 5’-CTTGGTGCGGAGACACTTTTTACC-3‘ (리버스) 프라이머로 증폭되었다. 각각의 돌연변이를 위하여, 2개의 부분적인 상보적 PCR 프래그먼트는 어닐링되고 5’-ATGAGCCTCTTCCTGCGAAAGCGATG-3’ 및 5’-AATTTCTCCTCTGCTTGTCTTC-3’ 프라이머를 갖는 다른 PCR에서 템플레이트로 사용되었다. 생성된 도메인-특이적 결실 돌연변이는 SpeI로 분해되어지고 V5 에피토프를 포함하는 pCAGEN 벡터 내로 클로닝되었다. TSP1의 결실 돌연변이 및 점돌연변이를 위해, 두 개의 부분적인 상보적 PCR 프래그먼트는 어닐링되고 포워드와 리버스 프라이머를 갖는 다른 PCR에서 템플레이트로 사용되었으며, 상기 PCR 생산물은 SpeI로 분해되고 pCAGEN 벡터 내로 클로닝되었다. 상기 프라이머 서열은 하기 표 1 및 표 2에서 나타내었다.
CCN3-TSP1 결실 돌연변이 생산을 위한 프라이머
Primer Name Sequence
TSP1-M1 Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
M1-R 5' - attccacagctcttcgtcgtctgctcaatg - 3'
M1-F 5' - cattgagcagacgacgaagagctgtggaat - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
TSP1-M2 Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
M2-R 5' - acccgggtggacaccttggaacatgcgctc - 3'
M2-F 5' - gagcgcatgttccaaggtgtccacccgggt - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
TSP1-M3 Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
M3-R 5' - ctggcgattcctgttcacgcccattccaca - 3'
M3-F 5' - tgtggaatgggcgtgaacaggaatcgccag - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
TSP1-M4 Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
M4-R 5' - tgttttaccatctcggtgacccgggtggac - 3'
M4-F 5' - gtccacccgggtcaccgagatggtaaaaca - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
TSP1-M5 Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
M5-R 5' - tcgggctcttgttcagtctgttttaccatc - 3'
M5-F 5' - gatggtaaaacagactgaacaagagcccga - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
CCN3-TSP1 점돌연변이 생산을 위한 프라이머
Primer Name Sequence
N227Q Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
N227Q-R 5' - ctggcgattcct ctg ggtgacccgggtgga - 3'
N227Q-F 5' - tccacccgggtcacc cag aggaatcgccag - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
N229Q Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
N229Q-R 5' - catctcacactggcg ctg cctgttggtgac - 3'
N229Q-F 5' - gtcaccaacagg cag cgccagtgtgagatg - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
C241A Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
C241A-R 5' - acaaggccgaacgat ggc gagacgagtctg - 3'
C241A-F 5' - cagactcgtctc gcc atcgttcggccttgt - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
C246A Fwd 5' - atgagcctcttcctgcgaaagcgatg - 3'
C246A-R 5' - ctcgggctcttgttc tgc aggccgaacgat - 3'
C246A-F 5' - atcgttcggcct gca gaacaagagcccgag - 3'
Rev 5'- aatttctcctctgcttgtcttc - 3'
세포 배양 및 웨스턴 블랏
Neuro2a 및 HEK293T 세포는 5% CO2를 포함하는 humidified 인큐베이터 37℃에서 10% 열-불활성화된 FBS, 0.5mM 글루타민, 페니실린-스트렙토마이신(100 mg/mL)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 유지되었다. 세포 (80~90% confluent)는 리포펙타민 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 형질감염시켰다. 24시간 후 세포를 radioimmunoprecipitation assay buffer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)에서 용해시켰다. 총 단백질은 4-12% SDS-PAGE gell(Invitrogen) 상에 로딩한 후 폴리비닐리덴 디플로라이드 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인은 항-V5(1:3000, Invitrogen) 및 항-액틴(I-19; 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 항체로 면역블랏되었다. 팔미토닐화 억제제인 세룰레닌 및 2-브로모팔미테이트(2-BP; both from Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)는 디메틸 설폭사이드에서 100mM 농도로 준비하고, 이후 성장 배지에서 최종 농도가 0.01-0.05mM까지 희석하였다. 세포는 2-BP 또는 세룰레닌으로 처리되고 1시간 후 트랜스펙션되었다.
히스티딘 풀다운 에세이
HEK293T 세포는 ZDHHC22-HA 및 CCN3-V5-His 발현 벡터로 형질전환되었다. 형질전환 48시간 후 세포를 PBS로 세척하고, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제(Sigma-Aldrich)가 첨가된 용해버퍼 A(20mM Tris, 137mM NaCl, 10% glycerol, 1% NP-40, 2mM EDTA, pH 8.0) 400μL에서 용해시켰다. 용해물을 4℃에서 하룻밤 동안 Ni-NTA-agarose beads (QIAGEN, Venlo, The Netherlands)와 함께 반응시켰다. 레진은 1mL의 용해버퍼 A로 세척하고 이후 SDS 샘플 버퍼에서 재부유(resuspend)시켰다. 레진을 제거하기 위하여 샘플을 10분 동안 끊이고 30분동안 10,000×g에서 원심분리를 진행하였다. 그리고 상등액을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏을 통해 분석하였다. 항-HA 항체는 Roche (Basel,Switzerland)에서 구입하였다.
In utero 일렉트로포레이션 및 이뮤노스테이닝
모든 동물실험은 충북대학교 동물시험윤리위원회의 승인 하에 충북대학교 실험동물센터의 표준작업절차에 따라 수행되었다. In utero 일렉트로포레이션은 이전에 개시된 방법을 일부 수정하여 진행되었다(M. Park, I.J. Baek, H. Kim, D.K. Woo, Y.J. Park, S. Shim, CCN3 overexpression inhibits growth of callosal projections via upregulation of RAB25, Biochem. Biophys. Res. Commun. 461 (2015) 456e462.).
간략하게는 E14.5 timed-pregnant ICR 마우스를 ketamine/xylazine (80/10 mg/kg, Sigma)으로 마취시키고, 자궁각(uterine horn)을 개복술로 노출시켰다. DNA (2 mg/mL in distilled water)를 mouth-controlled glass capillary micropipette을 이용하여 주입시켰다. 이후 자궁각을 따뜻한 생리식염수에 침지시키고 embryo's head를 전극 사이에 조심스럽게 걸었다. 3가지 전기파동(amplitude, 40 V; duration, 50 ms/pulse; interval, 950 ms)을 ECM 830 electroporator(BTX, Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 사용하여 전달되어졌다. 리포터 플라스미드 인코딩 레드 플루오레슨트 단백질(RFP, 2 mg/mL)은 뇌량 투사를 가시화하기 위한 컨트롤러로서 주입되었다. 전기천공된 동물의 뇌 영역을 P0에서 4% 파라포름알데하이드로 고정 후 GFP/RFP 발현을 위해 분석하였으며 그리고 vibratome(Leica, Wetzlar, Germany)으로 절개하였으며, 얇게 잘라진 절편은 4‘,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma)를 포함하는 mounting medium(VECTOR Laboratories, USA)에 봉입하고, Nikon C2 inverted confocal microscope(Nikon, Tokyo, Japan)로 관찰하였다. 면역염색법을 위하여 뇌를 절개하고, 4% 파라포름알데하이드로 4℃에서 하룻밤 동안 고정화한 다음 vibratome(Leica)를 이용하여 절개하였다. Free floating slice를 투과시키고 0.3% TritionX-100, 5% normal donkey serum (Jackson Immunoresearch Labs, PA, USA), 1% 소혈청알부민, 0.2% 글라이신(Sigma) 및 0.2% 라이신(Sigma)을 포함하는 PBS로 블락시켰다. 상기 절편을 블로킹 버퍼에서 pan-neuronal marker L1 cell adhesion molecule (L1-CAM) (rat, 1:300, Millipore)를 인식하는 1차 항체와 적절한 2차 항체 (Jackson Immunoresearch Labs, PA, USA)로 반응시키고, 공초점현미경으로 분석하였다.
Quantitative PCR ( qPCR )
RNeasy Mini Kit (QIAGEN)를 이용하여 Neuro2a 세포로부터 총 RNA를 추출하였으며, 제조자의 지시에 따라 HiSenScript RH(-) RT PreMix Kit (iNtRON, Seongnam, South Korea)를 이용하여 cDNA 합성을 진행하였다. qPCR는 HotStarTaq® PreMix DNA polymerase (QIAGEN) 및 하기 표 3의 프라이머 서열을 갖는 SYBR Green Mastermix (BioRad)를 이용하여 수행되었다. 데이터는 GAPDH(endogenous glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 발현 수준을 기준으로 표준화되었다. qPCR 생산물은 2.5% 아가로오스 젤에서 분리되었다.
qPCR 프라이머
Gene Name Accession Number Sequence
Zdhhc1 NM_175160.3 포워드 5' - ctggctatgcttgcatgggg - 3'
리버스 5' - ctcttgtcccgcacattggc - 3'
Zdhhc2 NM_178395.3 포워드 5' - tgcctgatactcaagccaag - 3'
리버스 5'- agccagcaatgataaccaaa - 3'
Zdhhc3 NM_026917.5 포워드 5' - ctcatcctgctgtgctttga - 3'
리버스 5' - ctatgcccgtctcatctgtg - 3'
Zdhhc4 NM_028379.5 포워드 5' - atttccaggctgtggacact - 3'
리버스 5' - agcatgctcaaaacgatgac - 3'
Zdhhc5 NM_144887.4 포워드 5'- gccgaggaagatgaagacaa - 3'
리버스 5' - aggtggcacaccatttcatt - 3'
Zdhhc6 NM_025883.3 포워드 5' - cacctccaattgttcccttc - 3'
리버스 5' - aaaaacaacatcccaacagc - 3'
Zdhhc7 NM_133967.3 포워드 5' - tgggcttcagttcatctcct - 3'
리버스 5'- ctcaaggcacaggaagacca - 3'
Zdhhc8 NM_172151.4 포워드 5' - gtggctggccttttcttcat - 3'
리버스 5' - acttcccagtcacctgctca - 3'
Zdhhc9 NM_172465.4 포워드 5' - ctgaaagaaacgcctggaac - 3'
리버스 5' - gagccacaaggaatgtgtga - 3'
Zdhhc11 NM_027704.2 포워드 5'- ccagtactgccacctgtgtg - 3'
리버스 5' - catttgcagtggtggtcaaa - 3'
Zdhhc12 NM_025428.2 포워드 5' - tggtctggccttcagttctt - 3'
리버스 5' - aggccccacagcagaactac - 3'
Zdhhc13 NM_028031.3 포워드 5' - gtgccacaacattcaaggaa - 3'
리버스 5'- tggaaagctgctagcatgaa - 3'
Zdhhc14 NM_146073.3 포워드 5' - agcaaaagggattcctcgat - 3’
리버스 5' - ctgaaaggccaatgatggac - 3'
Zdhhc15 NM_175358.4 포워드 5' - gcccagtgttcgctctaagt - 3'
리버스 5' - tattaacccatgggcagtga - 3'
Zdhhc16 NM_023740.2 포워드 5'- tttcatgactctgggctgtg - 3'
리버스 5' - ggtggtggagtctggtggta - 3'
Zdhhc17 NM_172554.2 포워드 5' - gaagccagtgaggtccaaac - 3'
리버스 5' - ttgcctgcacctacacagtt - 3'
Zdhhc18 NM_001017968.2 포워드 5' - ggaacggtttgaccatcact - 3'
리버스 5'- cgtcaagaaggagagggaga - 3'
Zdhhc19 NM_199309.2 포워드 5' - acatttgcgtggaggacttc - 3'
리버스 5' - cagagtgacaggaccagcag - 3'
Zdhhc20 NM_029492.4 포워드 5' - tttgagaagagcggcaagag - 3'
리버스 5' - ggctcggtcaggtttaatca - 3'
Zdhhc21 NM_026647.3 포워드 5'- agggcctccttaactgatcc - 3'
리버스 5' - catcaggttgcacttgttgc - 3'
Zdhhc22 NM_001080943.2 포워드 5' - tgtcctttccatctccttcg - 3'
리버스 5' - atgtcagaaccgaggacagc - 3'
Zdhhc23 NM_001007460.1 포워드 5' - tatcgctgaccttgaacacc - 3'
리버스 5' - aggacagggctgagctgtaa - 3'
Zdhhc24 NM_027476.3 포워드 5'- cgtagtggtcactgctctgc - 3'
리버스 5' - agggccggtaattatggaag - 3'
Gapdh - 포워드 5'- ATCACTGCCACCCAGAAGAC - 3'
리버스 5' - CATGCCAGTGAGCTTCCCGT - 3'
통계분석
정량적인 데이터는 대표 실험(n=3)의 평균±표준편차로 나타내었다.
2. 결과
CCN3의 분비 및 세포 내 기능에서 각 도메인의 기능 규명
CCN3 및 세포내 기능에서 각 도메인의 기능 규명을 위하여, 개별적인 결실 돌연변이를 구축하였다(도 1a 참조). 그 결과, Neuro2a 세포에서 발현 후, 오직 CCN3-△TSP1 돌연변이에서 CCN3가 세포 외로 분비되지 않는 것으로 나타났다(도 1b 참조).
△IGFPB, △VWC, 및 △TPS1 돌연변이는 생체내(in vivo)에서 발현되어질 때, GFP-positive 상층 추체세포로부터 투영은 뇌량의 정중선을 통해 반대측까지 확장되고, 뉴런의 축삭돌기 성장 억제는 관찰되지 않았다(도 1c 참조). 그러나, CCN3-△CT 과발현한 GFP-양성 축삭돌기 섬유는 야생형 CCN3 과발현에서 관찰된 바와 같이 뇌량(corpus callosum)에서 짧은 가지가 발달되고 극적으로 적은 midline cross를 보여주었다. 이러한 결과는 CCN3의 N 말단 영역이 CCN3의 세포 내 축적을 통한 신경 세포의 축삭 성장 억제에 필수적이며, TSP1 영역이 CCN3의 분비에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
C241A 돌연변이는 CCN3 분비 및 뇌량 투사를 억제함
상기 실험에서 확인한 바와 같이 TSP1 도메인은 CCN3의 분비에 중요한 역할을 담당하는바, 추가적인 실험을 통해 TSP1 도메인의 어느 부분이 CCN3 분비에 중요한지를 확인하였다. 이를 위해 본 실험에서는 6개의 CCN 패밀리 구성원의 TSP1 아미노산 서열의 보존에 기초한 5개의 영역 결실 돌연변이를 구축하였다(도 2a 참조). 그 결과, Neuro2a 세포에서의 발현시, TSP1-M5만이 세포 외 분비가 억제되는 것으로 나타났다(도 2d 참조).
이전 연구에 따르면 글리코실화는 분비된 CCN3의 활성에 중요한 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명자는 단백질 변형이 CCN3 분비에 관여하는지를 조사하였다. 예측 프로그램 (NetNGlyc 1.0 Server)은 CCN3의 아스파라긴 (N)227 및 N229를 높은 당질화 잠재력을 갖는 잔기로 확인하였다. 그러나, 결실 돌연변이체 또는 N227Q (Q, 글루타민) 및 N229Q 변이체의 발현은 분비 억제를 초래하지 않는 것으로 나타났다(도 2c 및 e 참조). 이러한 결과를 통해 이들 부위의 글리코실화가 CCN3 분비에 관여하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, C241 및 C246은 TSP1-M5에서 가장 보존된 잔기이며, 따라서 알라닌으로 치환되었다. 생성된 플라스미드를 Neuro2a 세포에서 발현시켰다(도 2c 참조). 그 결과, C246A 돌연변이체의 발현시 CCN3의 분비는 감소되었지만 완전히 차단되지는 않는 것으로 나타났다. 반면에, C241A 돌연변이 단백질의 발현은 CCN3의 세포 외 분비를 완전히 저해하는 것으로 나타났다(도 2e 참조). 또한, C241A 돌연변이의 경우 뇌량 투사 형성 동안에도 야생형 CCN3의 과발현에서 관찰된 것과 유사하게 뉴런의 축삭돌기 성장이 억제되는 것으로 나타났으며, 반면에 C246A 돌연변이체가 과발현되었을 때, 뇌량 투사 형성은 정상적인 것으로 나타났다(도 2f 참조).
상기와 같은 결과를 통해, C241 잔기가 CCN3의 세포 내 기능과 밀접한 관련이 있으며, 특히 CCN3의 세포 외 분비에 핵심적인 역할을 하는 것을 확인할 수 있었다.
CCN3의 세포 외 분비에 있어서 팔미토닐화의 필요성
일반적으로, 시스테인 잔기는 번역 후 니트로실화, 팔미토일화 및 미리스토일화될 수 있다. 최근 팔미토일화는 Wnt 및 Shh의 분비에 관여하는 것으로 나타났다. 따라서 CCN3도 이러한 방식으로 조절될 수 있을 것으로 가정하였으며, 이를 확인하기 위하여 팔미토일화 억제제인 2-BP 및 세룰레닌을 처리한 후 CCN3의 세포 외 분비를 조사하였다. 그 결과, 팔미토일화 억제제(2-BP 및 세룰레닌)를 처리한 경우 배지에서 농도 의존적으로 CCN3의 양이 감소되는 것으로 나타났으며, 동시에, 세포 내에서 CCN3 양이 증대되는 것을 확인할 수 있었다(도 3a 및 3b 참조). 이러한 결과는 Neuro2a 세포로부터 CCN3 분비를 위하여 팔미토닐화가 반드시 수반되어야 함을 시사하는 것이다.
CCN3와 ZDHHC22의 상호작용
팔미토일트랜스퍼라아제(palmitoyltransferase)의 DHHC (Asp-His-His-Cys) 패밀리는 신경 분화 및 기능과 관련이 있다. 따라서 본 발명자는 DHHC 패밀리의 구성원이 CCN3 팔미토일화와 관련이 있을 수 있음을 가정하였으며, 이러한 내용을 확인하기 위해 인간 두뇌 전사체 데이터베이스(http://hbatlas.org/)에서 CCN3와 유사한 발현 양상을 보이는 ZDHHC 패밀리를 조사하였다. 그 결과 ZDHHC22의 발현이 CCN3의 발현과 닮은 것을 발견하였다. 또한, Neuro2a 세포로부터의 CCN3 분비는 내인성 팔미토일트랜스퍼라아제의 발현을 나타낸다. 따라서, 추가적 실험을 통해 qPCR에 의한 Neuro2a 세포에서 ZDHHC 패밀리 구성원의 발현을 조사하였다. 그 결과, ZDHHC4, 5, 6, 7, 11, 14, 15, 17 및 22의 발현을 관찰한 결과 ZDHHC22가 가장 많이 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 4a 참조). 한편, CCN3가 Neuro2a 세포에서 발현된 ZDHHC와 상호 작용할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 히스티딘 풀다운 에세이를 수행했다. 그 결과, CCN3은 ZDHHC4, 5, 6, 7, 11 또는 14에 결합하지 않았지만(데이터 미도시), ZDHHC22에는 결합하는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 참조). 결론적으로, 상기와 같은 결과는 CCN3의 C241의 팔미토일화가 CCN3 분비에 직접 관여하고, 이 번역 후 변형은 ZDHHC22에 의해 조절될 수 있음을 나타내는 것이다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
IGFBP: insulin-like growth factor-binding protein
VWC: Von Willebrand factor type C
TSP1: thrombospondin type-1
CT: cysteine-knot-containing module
ZDDHC: zinc finger DHHC-type containing
SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
2-BP: 2-bromopalmitate
GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
WCL: whole cell lysates
CM: conditioned media
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel biomarkers for diagnosis of neurodegenerative diseases and uses thereof <130> NPDC-68910 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TSP1 domain polypeptide sequence <400> 1 Ile Glu Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met 1 5 10 15 Gly Val Ser Thr Arg Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met Val 20 25 30 Lys Gln Thr Arg Leu Cys Ile Val Arg Pro Cys Glu 35 40 <210> 2 <211> 263 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ZDHHC22 polypeptide sequence <400> 2 Met Leu Ala Leu Arg Leu Leu Asn Val Val Ala Pro Ala Tyr Phe Leu 1 5 10 15 Cys Ile Ser Leu Val Thr Phe Val Leu Gln Leu Phe Leu Phe Leu Pro 20 25 30 Ser Met Arg Glu Asp Pro Thr Ala Thr Pro Leu Phe Ser Pro Ala Val 35 40 45 Leu His Gly Ala Leu Phe Leu Phe Leu Ser Ala Asn Ala Leu Gly Asn 50 55 60 Tyr Val Leu Val Ile Gln Asn Ser Pro Asp Asp Leu Gly Thr Cys Gln 65 70 75 80 Gly Thr Met Ser Gln Arg Pro Gln Cys Pro Pro Pro Ser Thr His Phe 85 90 95 Cys Arg Val Cys Ser Arg Val Thr Leu Arg His Asp His His Cys Phe 100 105 110 Phe Thr Gly Asn Cys Ile Gly Ser Arg Asn Met Arg Asn Phe Ile Leu 115 120 125 Phe Cys Leu Tyr Thr Ser Leu Ala Cys Leu Tyr Ser Met Val Ala Gly 130 135 140 Val Ala Tyr Ile Ser Ala Val Leu Ser Ile Ser Phe Ala His Pro Leu 145 150 155 160 Ala Phe Leu Thr Leu Leu Pro Thr Ser Ile Ser Gln Phe Phe Ser Gly 165 170 175 Ala Val Leu Gly Ser Asp Met Phe Val Ile Leu Met Leu Tyr Leu Trp 180 185 190 Phe Ala Val Gly Leu Ala Cys Ala Gly Phe Cys Cys His Gln Leu Leu 195 200 205 Leu Ile Leu Arg Gly Gln Thr Arg Tyr Gln Val Arg Lys Gly Met Ala 210 215 220 Val Arg Ala Arg Pro Trp Arg Lys Asn Leu Gln Glu Val Phe Gly Lys 225 230 235 240 Arg Trp Leu Leu Gly Leu Leu Val Pro Met Phe Asn Val Gly Thr Glu 245 250 255 Ser Ser Lys Gln Gln Asp Lys 260 <210> 3 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CCN3 polypeptide sequence <400> 3 Met Ser Leu Phe Leu Arg Lys Arg Cys Leu Cys Leu Gly Phe Leu Leu 1 5 10 15 Phe His Leu Leu Ser Gln Val Ser Ala Ser Leu Arg Cys Pro Ser Arg 20 25 30 Cys Pro Pro Lys Cys Pro Ser Ile Ser Pro Thr Cys Ala Pro Gly Val 35 40 45 Arg Ser Val Leu Asp Gly Cys Ser Cys Cys Pro Val Cys Ala Arg Gln 50 55 60 Arg Gly Glu Ser Cys Ser Glu Met Arg Pro Cys Asp Gln Ser Ser Gly 65 70 75 80 Leu Tyr Cys Asp Arg Ser Ala Asp Pro Asn Asn Gln Thr Gly Ile Cys 85 90 95 Met Val Pro Glu Gly Asp Asn Cys Val Phe Asp Gly Val Ile Tyr Arg 100 105 110 Asn Gly Glu Lys Phe Glu Pro Asn Cys Gln Tyr Phe Cys Thr Cys Arg 115 120 125 Asp Gly Gln Ile Gly Cys Leu Pro Arg Cys Gln Leu Asp Val Leu Leu 130 135 140 Pro Gly Pro Asp Cys Pro Ala Pro Arg Lys Val Ala Val Pro Gly Glu 145 150 155 160 Cys Cys Glu Lys Trp Thr Cys Gly Ser Asp Glu Gln Gly Thr Gln Gly 165 170 175 Thr Leu Gly Gly Leu Ala Leu Pro Ala Tyr Arg Pro Glu Ala Thr Val 180 185 190 Gly Val Glu Val Ser Asp Ser Ser Ile Asn Cys Ile Glu Gln Thr Thr 195 200 205 Glu Trp Ser Ala Cys Ser Lys Ser Cys Gly Met Gly Val Ser Thr Arg 210 215 220 Val Thr Asn Arg Asn Arg Gln Cys Glu Met Val Lys Gln Thr Arg Leu 225 230 235 240 Cys Ile Val Arg Pro Cys Glu Gln Glu Pro Glu Glu Val Thr Asp Lys 245 250 255 Lys Gly Lys Lys Cys Leu Arg Thr Lys Lys Ser Leu Lys Ala Ile His 260 265 270 Leu Gln Phe Glu Asn Cys Thr Ser Leu Tyr Thr Tyr Lys Pro Arg Phe 275 280 285 Cys Gly Val Cys Ser Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Asn Thr Lys 290 295 300 Thr Ile Gln Val Glu Phe Gln Cys Leu Pro Gly Glu Ile Ile Lys Lys 305 310 315 320 Pro Val Met Val Ile Gly Thr Cys Thr Cys Tyr Ser Asn Cys Pro Gln 325 330 335 Asn Asn Glu Ala Phe Leu Gln Asp Leu Glu Leu Lys Thr Ser Arg Gly 340 345 350 Glu Ile

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 변이를 측정하는 제제를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제제는 CCN3의 TSP1 도메인의 38번째 아미노산에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드, 항체 또는 앱타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트.
  5. 검사대상 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 아미노산 서열이 시스테인에서 다른 아미노산 잔기로 변이된 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 검출할 수 있는, 퇴행성 신경질환 진단용 키트.
  8. 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기의 팔미토일화를 검출하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 CCN3-TSP1 도메인의 38번째 시스테인 잔기가 팔미토일화가 이루어지지 않은 경우 퇴행성 신경질환이 발병되거나 발병 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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