TWI528034B - Screening method of dry skin improving agent due to allergic dermatitis caused by the activity of bleomycin hydrolytic enzyme as an index - Google Patents

Screening method of dry skin improving agent due to allergic dermatitis caused by the activity of bleomycin hydrolytic enzyme as an index Download PDF

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Description

以博來黴素水解酵素之活性作為指標之因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚改善劑之篩選方法
本發明提供一種乾燥肌膚尤其因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑的篩選評價方法、因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚的改善或預防方法、進而因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之診斷方法。
表皮之顆粒層之角蛋白纖維於角化時與稱為絲聚蛋白之蛋白質結合並凝聚，形成稱為「角蛋白圖案」之特異形態。顆粒細胞內之角質層透明質顆粒中大量存在作為絲聚蛋白之前驅物之絲聚蛋白源(絲聚蛋白單元縱向排列10至12個者)，於角化時，絲聚蛋白單體生成並且藉由脫磷酸化而使角蛋白纖維凝聚。其後，藉由肽醯基精胺酸亞氨酶(PAD，peptidylarginine deiminase)之酵素之作用而脫亞胺基化，使角蛋白游離後，於角質層之上層分解成胺基酸等。該等胺基酸稱為天然保濕因子(natural moisturizing factor；NMF)，已知對角質層之含水量之保持具有重要作用，又具有紫外線吸收能力(Blank I. H. J. I. Dermatol.,18,433(1952)；Blank I. H. J. I. Dermatol.,21,259(1953))。
明確作為NMF之主成分之胺基酸源自絲聚蛋白以來，對呈現乾燥肌膚之病態與絲聚蛋白之關聯性進行研究。近年來明確老年性乾皮病、過敏性疾病等乾燥肌膚中，角質層中之胺基酸減少(Horii I. et al.,Br. J. Dermatol.,121,587-592(1989)；Tanaka M. et al.,Br. J. Dermatol.,139,618-621(1989))。
PAD作用於絲聚蛋白之精胺酸殘基而脫亞胺基化，轉換成瓜胺酸殘基。如此藉由絲聚蛋白進行脫亞胺基化，而減弱絲聚蛋白與角蛋白纖維之親和性，使角蛋白纖維游離，其結果認為絲聚蛋白易於受到蛋白酶之作用，最終分解成NMF。
本發明者明確特別規定鈣蛋白酶-1作為分解藉由PAD而脫亞胺基化之絲聚蛋白之酵素，作為其分解產物之小肽片段藉由博來黴素水解酵素(BH)而分解成胺基酸單元即NMF(Journal of Investigative Dermatology(2008),Volume 128,ABSTRACTS,S90,539；第30次日本分子生物學會年會‧第80次日本生化學會大會　聯合大會　報告要旨集，第583頁，3P-0251；JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284,NO. 19,pp. 12829-12836,2009；及日本專利特願2008-135944號(以下稱為第944號申請案))。
最近研究中已知過敏性皮膚炎之一部分係由於絲聚蛋白源基因之異常而生成，過敏性皮膚炎患者之5-50%左右中發現該基因之異常(Smith FJD,et al. Nat Genet 38：337-42(2006)；Aileen Sandilandsl,et al.,J. I. Dermatol.,127,1282-1284(2007)及Nomura T,et al.,J. I. Dermatol.,128(6)：1436-41(2008))。然而，過敏性皮膚炎患者之皮膚中並非絲聚蛋白之表現肯定急劇下降。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1] Blank I. H. J. I. Dermatol.,18,433(1952)
[非專利文獻2] Blank I. H. J. I. Dermatol.,21,259(1953)
[非專利文獻3] Horii I. et al.,Br. J. Dermatol.,121,587-592(1989)
[非專利文獻4] Tanaka M. et al.,Br. J. Dermatol.,139,618-621(1989)
[非專利文獻5] Kamata et al.,J. Biochem.,141,69-76,2007
[非專利文獻6] Journal of Investigative Dermatology(2008),Volume 128,ABSTRACTS,S90,539
[非專利文獻7]第30次日本分子生物學會年會‧第80次日本生化學會大會　聯合大會　報告要旨集，第583頁，3P-0251
[非專利文獻8] JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284,NO. 19,pp. 12829-12836,2009
[非專利文獻9] Smith FJD,et al. Nat Genet 38：337-42(2006)
[非專利文獻10] Aileen Sandilandsl,et al.,J. I. Dermatol.,127,1282-1284
本發明之課題在於根據因NMF產生酵素之表現的變動所導致之新的皮膚粗糙機制，提供一種改善或預防因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之藥劑的篩選方法、或因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之評價方法、因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善或預防方法、進而因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之診斷方法。
上述第944號申請案中，本發明者明確博來黴素水解酵素之活性亢進會由於NMF之產生而改善皮膚屏障功能。如此，認為博來黴素水解酵素於NMF產生之最終階段起作用。然而，頗有意思的是，關於由於過敏性皮膚炎所生成之乾燥肌膚，很多過敏性皮膚炎患者中依然發現絲聚蛋白之表現，因此預測乾燥肌膚係由與絲聚蛋白基因之異常不同的其他原因產生。
本發明者根據如下假設，驗證依據乾燥肌膚人體試驗之該酵素之表現的變動，並且進行該表現控制機構之解析等：人體皮膚中之博來黴素水解酵素之表現下降不僅與由於MMF產生機構之異常所生成之皮膚屏障功能的下降有關，亦與主要因免疫異常引起之過敏性皮膚炎或由於該皮膚炎所產生之乾燥皮膚等均相關。其結果，本發明者發現博來黴素水解酵素之表現下降與由於過敏性皮膚炎所生成之乾燥肌膚相關聯，且編碼該酵素之基因之5'毗鄰區域內存在明顯誘導該酵素之表現的控制區域。詳細而言，本發明者選殖BH之5'-毗鄰區域。於其缺失分析中，於-216 bp上游之中鑑定對BH啟動子活性較為重要之區域。明確電泳遷移率改變分析中，於試驗管內，MZF-1、Sp-1、及干擾素調節因子(IRF(interferon regulatory factor))-1/2可結合於該區域。其中，MZF-1及Sp-1主結構之定點突變誘發時，BH啟動子活性下降較多。該等資料暗示BH表現經由MZF-1及Sp-1而上方控制。頗有意思的是，作為Th1細胞激素之干擾素(IFN(interferon))-γ顯著減少BH之表現。使用定點突變誘發及低分子干擾RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)之分析時，證實IFN-γ對於BH表現之抑制效果。另一方面，作為Th2細胞激素之IL-4完全未顯示出對於BH表現之直接作用。然而，其於培養角質形成細胞中下方控制MZF-1及Sp-1，因此暗示IL-4可作為BH調整之抑制因子而起作用。最後，患有AD(Atopic Dermatitis，過敏性皮膚炎)之患者之皮膚中檢查BH之表現。由於AD病變皮膚中BH活性與表現減少較多，因此，暗示AD中之絲聚蛋白分解路徑的缺陷。如以上所示，本發明者發現可於分化過程中及炎症過程中之雙方調節BH之轉錄，從而完成本申請案發明。
因此，本申請案包含以下發明。
(1)一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑之篩選評價方法，其係於候補藥劑與對照藥劑相比顯著亢進博來黴素水解酵素之表現及/或活性之情形時，將該候補藥劑評價為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑。
(2)如(1)之方法，其中於編碼博來黴素水解酵素之基因之轉錄活性與對照者相比顯著亢進之情形時，判斷出上述表 現及/或活性顯著亢進。
(3)如(2)之方法，其中於轉錄因子IRF-1、IRF-2、MZF-1、SP-1、及/或GATA-1對於編碼博來黴素水解酵素之基因的轉錄調節區域之結合活性與對照之結合活性相比顯著亢進之情形時，判斷出上述轉錄活性顯著亢進。
(4)一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善或預防方法，其係藉由使顯著亢進皮膚組織中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性而進行。
(5)如(4)之方法，其中藉由亢進編碼博來黴素水解酵素之基因之轉錄活性，而使上述表現及/或活性顯著亢進。
(6)如(5)之方法，其中藉由亢進轉錄因子IRF-1、IRF-2、MZF-1、SP-1、及/或GATA-1對於編碼博來黴素水解酵素之基因的轉錄調節區域之結合活性，而使上述表現及/或活性顯著亢進。
(7)一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之原因之診斷方法，其係於皮膚組織中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性與對照之皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比顯著下降之情形時，診斷為存在因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向，若與對照之皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比為相同程度以上，則診斷為不存在因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向。
(8)如(7)之方法，其中於編碼博來黴素水解酵素之基因之轉錄活性與對照者相比顯著下降之情形時，判斷出上述表現及/或活性顯著下降。
(9)如(8)之方法，其中於轉錄因子IRF-1、IRF-2、MZF-1、SP-1、及/或GATA-1之結合活性與對照之結合活性相比顯著下降之情形時，判斷出上述轉錄活性下降。
可根據藉由本發明確立之因博來黴素水解酵素之表現之變動所導致之新的皮膚粗糙機制尤其以博來黴素水解酵素之表現及/或活性作為指標之篩選系統，而探索因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之新穎的改善劑。進而，認為本申請案發明之方法亦可應用於並非因過敏性皮膚炎所引起之通常的乾燥肌膚之改善劑的探索。事實上，本申請案之實施例中，博來黴素水解酵素之表現及/或活性較低之群中，屏障功能(表皮水分丟失：TEWL(transepidermal water loss))顯著下降，角質層之含水量亦下降。
本發明之第一觀點中，提供一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑的篩選評價方法，其係於候補藥劑與對照藥劑相比顯著亢進博來黴素水解酵素之表現及/或活性之情形時，將該候補藥劑評價為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑。
博來黴素水解酵素為分子量250~280 kDa(六聚物)之細胞質半胱胺酸肽水解酵素，最初已知之功能為癌之組合化學療法中頻繁使用之糖肽博來黴素的代謝惰性化。含有半胱胺酸蛋白質分解酵素木瓜酶超家族之特徵之活性部位殘基，編碼基因存在於人體之基因座17q11.2中(Takeda et al.,J Biochem.,119,29-36,1996)。博來黴素水解酵素存在於所有組織中，亦已知存在於皮膚中(Kamata et al.,J. Biochem.,141,69-76,2007)，但直至本發明者明確為止完全未知與絲聚蛋白之關係。
由組織染色之結果可知，博來黴素水解酵素與絲聚蛋白相同，於正常皮膚之表皮上層較多表現(圖8)。另一方面，過敏性皮膚炎患者，於異位性皮疹部，該酵素及絲聚蛋白之表現下降(圖9)。認為其強烈暗示並非絲聚蛋白源基因之異常，而是該分解酵素系之異常導致過敏性皮膚炎。又，異位性皮膚炎患者之皮膚中，不僅病變部，於非病變部，博來黴素水解酵素活性亦顯著較低(資料未顯示)。
進而，關於博來黴素水解酵素之表現量之變動，使用培養角質形成細胞進行研究之結果可知，該酵素於未分化之角質形成細胞中未怎麼表現，相對於此，於達到融合並進行分化之角質形成細胞中較高表現，於基底細胞中幾乎未表現，於進行分化向表皮細胞轉移後較高表現(圖10)。其結果支持上述細胞染色之結果。
本發明之博來黴素水解酵素之表現及/或活性的測定可依據可測定該酵素之表現及/或活性之任意方法，例如利用對博來黴素水解酵素特異之抗體之免疫測定方法、例如利用酵素標籤之ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，酶聯結免疫吸附劑分析)法、利用放射性標籤之RIA(radio Immunoassay，放射免疫分析)法、免疫比濁法、西方墨點法、乳膠凝聚法、紅血球凝聚法等，定量或定性實施。免疫測定法之方式可列舉：競爭法或夾層法。更具體而言，上述活性之測定係藉由如下方式而進行：例如可利用瓜胺酸對博來黴素水解酵素大致特異之基質的性質，利用螢光分光光度計對作為其螢光合成基質之Cit-MCA之分解進行評價。博來黴素水解酵素量之測定亦可藉由測定編碼該酵素之基因之表現量而進行。於該情形時，較佳為藉由測定編碼細胞內之博來黴素水解酵素之mRNA(messenger RNA，信使核糖核酸)的量而決定博來黴素水解酵素之表現量。mRNA之萃取、其量之定量或定性之測定亦為業界眾所周知，例如可利用PCR(polymerase chain reaction，聚合酶鏈反應)法、3SR(self-sustainedsequence replication，自主序列複製)法、NASBA(nucleic acid sequence-based amplification，核酸序列擴增)法、TMA(thermomechanical analysis，熱機械分析)法等各種各樣眾所周知之方法而實施。此外，博來黴素水解酵素可通過in situ(原位)雜交法或其生物活性之測定而定性決定。
本發明之因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑的篩選評價方法中，於候補藥劑與對照藥劑相比顯著亢進博來黴素水解酵素之表現及/或活性之情形時，將該藥劑評價為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑。認為依據本發明之方法篩選之藥劑對乾燥肌膚尤其因過敏性皮膚炎引起之乾燥肌膚較為有效。
依據日本皮膚科學會過敏性皮膚炎診療準則，所謂「過敏性皮膚炎」係指以重複惡化‧緩解之搔癢性濕疹作為主病變的疾病，該疾病可根據搔癢之有無，作為特徵性皮疹之紅斑、濕潤性紅斑、丘疹、漿液性丘疹、鱗屑、痂皮等急性病變，或浸潤性紅斑‧苔蘚化病變、癢疹、鱗屑、痂皮等慢性病變之有無而診斷。於本說明書中使用之情形時，所謂「因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚」意指含有絲聚蛋白基因之異常，伴有藉由上述定義確定診斷之過敏性皮膚炎的乾燥肌膚。
本發明之篩選方法有下列方法：於試驗之藥劑存在下利用通常之PCR測定亢進編碼博來黴素水解酵素之mRNA之表現的方法；將參與該酵素表現之啟動子區域插入螢光酶基因載體中，直接測定作為啟動子分析系統之表現之強弱的方法等。於後者之情形時，較佳為BH之啟動子區域使用自BH表現成為最大之-216 bp至-816 bp之區域。又，表現量之測定不僅使用螢光酶，亦可使用業界通常所使用之薊綠等螢光蛋白。可藉由將含有該等融合基因之載體導入細胞中，於藥劑存在下對細胞進行培養，通常24小時後使細胞溶解，測定螢光酶活性，而測定藥劑對BH表現所造成之作用。所使用之細胞可使用市售之正常表皮細胞(NHEK(normal human epidermal keratinocytes，正常人體表皮角質形成細胞)：Kurabo等)或不死化HaCaT細胞等，但並不限定於此。螢光酶活性之測定較佳為藉由使用Roche Diagnostics之螢光酶試劑套組等而實施。
於本說明書中所使用之情形時，所謂「與對照藥劑相比顯著亢進博來黴素水解酵素之表現及/或活性」係指與並無乾燥肌膚改善效果尤其對於因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚的改善效果之對照藥劑相比，所測定之博來黴素水解酵素之表現量或活性或其雙方例如分別為120%以上、或150%以上、或200%以上之情形。
博來黴素水解酵素之表現及/或活性之亢進亦可藉由使編碼該酵素之基因之轉錄活性亢進而達成。編碼博來黴素水解酵素之基因之5'-毗鄰區域尤其轉錄調節區域及與該區域結合之轉錄因子示於圖11。於博來黴素水解酵素表現時，若上述轉錄調節區域具有自該酵素之編碼序列直至216 bp~1216 bp下游之區域即可。就獲得較高之博來黴素水解酵素活性之觀點而言，較佳為該轉錄調節區域含有直至816 bp下游之區域。
博來黴素水解酵素之表現若含有自該酵素之編碼序列直至至少216 bp下游為止之區域即可。認為圖11中記載之轉錄因子之中，藉由亢進該區域中所含IRF-1、IRF-2、MZF-1、SP-1、GATA-1之結合活性，而尤其亢進博來黴素水解酵素之表現。事實上，博來黴素水解酵素係藉由紫外線(UV，ultraviolet)照射而亢進其表現(資料未表示)，結果於MZF-1、GATA-1之表現亢進與UV強度及照射時間之間發現相關關係(圖13)。
因此，與對照藥劑相比，藉由候補藥劑可將編碼博來黴素水解酵素之基因之轉錄活性、或轉錄因子對於該基因之轉錄調節區域的結合活性顯著地亢進，例如分別亢進120%以上、或150%以上、或200%以上之情形時，可認為博來黴素水解酵素之表現量及/或活性顯著亢進。
博來黴素水解酵素之表現及/或活性亦受到細胞激素之影響。例如已知參與過敏性皮膚炎之作為Th2細胞激素之一種的介白素-4(IL(interleukin)-4)下調博來黴素水解酵素之表現。其支持過敏性皮膚炎患者之皮膚中發現之博來黴素水解酵素的低表現。另一方面，與IL-4相反具有抑制IgE產生之作用的Th1細胞激素之代表的干擾素γ顯著亢進博來黴素水解酵素之表現。又，Th2細胞激素中作為炎症性細胞激素之代表之腫瘤細胞壞死因子α(TNFα)亦顯著亢進該酵素之表現。不僅該等物質，博來黴素水解酵素之表現及/或活性亦藉由UV照射而亢進。結果雖未顯示，但確認體表面之中易於接受紫外線照射之臉頰等皮膚中之博來黴素水解酵素的活性藉由UV照射而亢進。
本發明之第二觀點中，提供一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善或預防方法，其係藉由使顯著亢進皮膚組織中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性而進行。
本發明之因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善或預防方法中，例如與實施該處理方法前之皮膚中的表現及/或活性相比，顯著亢進皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性。所謂「顯著亢進」係指例如博來黴素水解酵素之表現及/或活性為120%以上、或150%以上、或200%以上之值的情形。
本發明之方法中，使用顯著亢進博來黴素水解酵素之表現及/或活性之任意的藥劑。又，若為亢進該酵素之表現或活性者，則藥劑並無限定。本發明之方法中所使用之藥劑等只要可應用於皮膚且可達成本發明之目的，則可以任意形態而應用於皮膚，又，亦可單獨應用，或與其他任意成分共同調配而應用。又，所應用之皮膚之部位亦無限定，含有包含頭皮之體表面的所有皮膚。
本發明之第三觀點中，提供一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之原因之診斷方法，其係於皮膚組織中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性與對照皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比顯著下降之情形時，診斷為存在因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向，與對照皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比若為相同程度以上，則診斷為不存在因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向。
被試驗者之肌膚是否為乾燥肌膚，可由被試驗者、醫生等主觀判斷，或可藉由使用皮表水分測定器測定皮膚之含水量而客觀判斷。例如，亦可如本說明書之實驗3所說明，依據圖6中記載之流程表，根據易出油程度、容易乾程度等，由被試驗者等主觀判斷是否為「乾燥肌膚」。
乾燥肌膚之判定可容易地進行，但判斷被試驗者之肌膚是否由於「因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚」所引起較為困難。根據本發明之診斷方法，不僅可判斷被試驗者之當前之肌膚狀態，亦可診斷是否容易成為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚。
所謂「博來黴素水解酵素之表現及/或活性與對照皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比顯著下降」係指若與例如自皮膚醫學之立場由醫生判斷為濕潤肌膚之正常的「對照皮膚」相比，所測定之博來黴素水解酵素之表現及/或活性為80%以下、或70%以下、或60%以下、或50%以下、或30%以下、或10%以下之情形。所謂「與對照皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比為相同程度以上」係指若與例如自皮膚醫學立場由醫生判斷為濕潤肌膚之正常「對照皮膚」相比，所測定之博來黴素水解酵素之表現及/或活性例如為80%以上、或90%以上、或100%以上之情形。
成為受檢體之皮膚角質層試樣的採取可利用任意方法而實施，但就簡便性之觀點而言，較佳為膠帶剝離法。所謂膠帶剝離係指藉由於皮膚表層貼附膠帶片，然後剝下，皮膚角質層附著於所剝下之膠帶上，而採取角質層試樣之方法。若利用膠帶剝離法，則可以僅採取一片膠帶之角質層之程度而測定博來黴素水解酵素之表現或活性，可成為以博來黴素水解酵素作為指標之因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚的非侵襲性的評價方法。膠帶剝離之較佳之方法係藉由如下方式而進行：首先利用例如乙醇等使皮膚之表層淨化，除去皮脂、污垢等，將切成適當之尺寸(例如5×5 cm)之膠帶片輕輕放置於皮膚表面上，對膠帶整體施加均等之力壓至平坦，其後以均等之力剝下膠帶。膠帶可為市售之賽璐玢帶等，亦可使用例如Scotch Superstrength Mailing Tape(3M公司製造)、賽璐玢帶(Sellotape(註冊商標)；Nichiban股份有限公司)等。
以下，列舉具體例，進而具體地說明本發明。再者，本發明並不限定於此。
[實施例]
本實驗中使用以下材料。
鈣蛋白酶I係由EMD Bioscience公司購入。博來黴素水解酵素係自人體表皮角質層，依據非專利文獻5而製作。人體IL-4及IFN-γ係自PEPROTECH EC(London,England)購入。人體IL-13及IL-17A/F係R&D SYSTEM(MINNEAPOLIS,MN)製造者。自Bachem Bioscience(Bubendorf,Switzerland)獲取瓜胺酸4-甲基香豆基-7-醯胺(Cit-MCA)。所使用之其他所有化學物質為試劑等級者。
角質形成細胞之培養
將源自新生兒期表皮之正常人體表皮角質形成細胞(Kurabo,Osaka,Japan)於含有低濃度(0.03 mM)之鈣、及HKGS Growth Supplement(Cascade Biologics)之EpiLife培養基(Cascade Biologics,Portland,OR)中進行培養。一面添加5% CO2一面將所有細胞於37℃下進行培養，並且於繼代4代以內使用。於融合70%、融合100%、融合2天後、及2 mM之鈣中融合2天後，採取角質形成細胞。
實驗1
認為博來黴素水解酵素於NMF產生之最終階段起作用。於該情形時，於乾燥肌膚中存在本酵素之表現下降之可能性。本實驗中，對皮膚中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性的下降是否與乾燥肌膚有關聯進行研究。
皮膚角質層試樣係藉由將透明膠帶(Sellotape(註冊商標)(NICHIBAN))貼附於手腕皮膚表面後進行剝離之膠帶剝離法而採取。裁剪附著有皮膚角質層之該膠帶，浸漬於萃取緩衝液(0.1 M Tris-HCl(pH值為8.0)，0.14 M NaCl,0.1% Tween-20,1 ml)中，實施超音波處理(20 sec×4)，製作角質層萃取液。對該萃取液實施西方墨點法。所使用之抗博來黴素水解酵素(BH)抗體係使用由鎌田等人(Journal of Biological Chemistry 2009)製作之抗體。具體而言，對角質層萃取液進行SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉)電泳後，轉印至Immobilon-P(Millipore公司)上，清洗該轉印之膜後，於室溫下與抗BH抗體反應1小時。進而藉由清洗而除去抗體後，使HRP(horseradish peroxidase，辣根過氧化酶)結合二次抗體進行反應。清洗後，將藉由ECL Plus Western Blotting Detection Kit(GE Healthcare)而發光之BH蛋白條帶曝光於X射線膜上，根據條帶之濃淡推測表現量。將結果示於圖1及圖2。
圖1中，檢體1為本人自認為乾燥肌膚之人體之皮膚角質層試樣，檢體2為認為並非乾燥肌膚之健康學生之皮膚角質層試樣。又，圖2中之檢體T及A為源自並不感覺乾燥之被試驗者之試樣，檢體N為源自稍感覺乾燥之被試驗者之試樣，並且檢體M為源自感覺乾燥之被試驗者之試樣。檢體1中之博來黴素水解酵素之表現量較少，另一方面，檢體2中之該酵素表現量較多。由該結果可知，檢體1、2分別源自乾燥肌膚、濕潤肌膚。又，自使用檢體1之結果可知，乾燥肌膚中，越接近作為NMF產生之場所之表皮表面，博來黴素水解酵素量越下降。圖2中，檢體T及A表示自未特別感覺乾燥之檢體獲得之萃取液之西方墨點像，檢體N及M表示自強烈意識到乾燥之檢體獲得之萃取液之西方墨點像。
實驗2
本實驗中，對人體皮膚中之博來黴素水解酵素之量或活性之個體差，及該酵素量與活性之相關進行研究。依據實驗1中記載之方法，自40名20~25歲女學生之手腕皮膚製作角質層萃取液。依據Kamata et al(J. Biol. Chem.,Vol. 284,Issue 19,12829-12836,May 8,2009)等方法測定該萃取液中之博來黴素水解酵素量及其酵素活性。表現量係利用西方墨點法而進行評價，並且酵素活性係藉由測定作為螢光基質之Cit-β-NA之分解量而評價該酵素之胺基肽酶活性。結果示於圖3，並且其相關圖示於圖4。由圖4之結果明確，博來黴素水解酵素量與其活性之間存在相關關係。
繼而，關於上述角質層萃取液，對博來黴素水解酵素與各種皮膚參數進行統計解析。本實驗中，將40人之角質層萃取液分類成以下2種。利用密度計將根據西方墨點法之結果明確之博來黴素水解酵素量數值化後，以任意單位表示1之情形時，一種為博來黴素水解酵素量未達10且該酵素之活性未達1.5 nmol/min/ml之萃取液：博來黴素水解酵素之蛋白質量較少且活性較低(BH low)；一種為博來黴素水解酵素量未達10且該酵素之活性未達1.5 nmol/min/ml以外之萃取液：蛋白質量較多且活性較高(BH high)。
游離胺基酸係依據Kamata et al(J. Biol. Chem.,Vol. 284,Issue 19,12829-12836,May 8,2009)等方法而測定。具體而言，藉由使藉由鈣蛋白酶I分解之絲聚蛋白肽與各萃取液進行反應，使用熒胺對胺基進行定量分析，而測定游離胺基酸量。游離胺基酸之測定結果示於圖5A。圖5A中之縱軸之單位表示測定試樣3 ml中之總游離胺基酸量(nmol)。
博來黴素水解酵素之活性如上所述，係藉由測定作為螢光基質之Cit-β-NA之分解量而評價該酵素之胺基肽酶活性。博來黴素水解酵素活性之測定結果示於圖5B。圖5B中之縱軸之單位表示Cit-β-NA的分解量(nmol/min/ml)。
上述學生之皮膚之TEWL係使用Vapometer(Delfin Technologies,Ltd,Finland)進行測定，以g/m2/h為單位表示。TEWL之測定結果示於圖5C。
如圖5C所示，博來黴素水解酵素活性較低之群(2.5 U<)與較高之群中，角質層之含水量存在顯著之差。進而，該酵素之量與活性雙方均較低之群中，游離胺基酸較少，並且TEWL亦較高(圖5A及5C)。
資料雖未顯示，游離胺基酸較低之群(1000<)與較高之群中，NMF、尿刊酸之量存在顯著之差，並且NMF較低之群(0.8<)與較高之群中，尿刊酸存在顯著之差。又，TEWL較低之群(2.5<)與較高之群中，NMF、乳酸、脲存在顯著之差。若考慮尿刊酸由絲聚蛋白中大多含有之組胺酸製作，可知博來黴素水解酵素於絲聚蛋白分解中較為重要。
由本實驗之結果可知，於博來黴素水解酵素之絕對量較少之情形時，游離胺基酸量及屏障功能共同顯著下降。資料雖未顯示，於使用源自臉頰之角質層萃取液之情形時，亦確認博來黴素水解酵素量與屏障功能成比例關係。
實驗3
本實驗中，根據圖6中記載之流程表，對上述女學生進行問卷調查，將各學生之肌膚分類成濕潤肌膚、乾燥肌膚、乾燥型油性肌膚、油性肌膚四種。問卷調查結果，與上述實驗2中測定之皮膚參數之結果的相關關係示於圖7。由圖7可知，分類成油性乾燥肌膚之學生的博來黴素水解酵素活性顯著較高。
實驗4
本實驗中，對皮膚中之博來黴素水解酵素與絲聚蛋白之定域進行研究。
免疫組織化學染色
免疫組織化學染色係利用Kamata et al(J. Biol. Chem.,Vol. 284,Issue 19,12829-12836,May 8,2009)中記載之方法進行。材料係使用5 μm厚之人體皮膚之冷凍切片，並且使用抗大白鼠BH IgG。詳細而言，知情同意後，自東京醫科大學之患有過敏性皮膚炎之患者獲得人體皮膚標本。本研究係由與倫理(Human Ethics)相關之東京醫科大學設施內審查委員會及資生堂特別會議承認。
將人體‧過敏性皮膚炎(病變皮膚與非病變皮膚)及正常皮膚之切片與抗大白鼠BH IgG及抗人體‧絲聚蛋白IgG一倂於室溫下培養1小時，其後，利用PBS(phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝鹽水)清洗，並且進而與作為螢光結合二次抗體之Alexa Fluor 555或488(Molecular Probes Inc.,Eugene,OR)一倂培養。核之可視化係使用DAPI(4',6'-二脒基-2-苯基吲哚；Molecular Probes)。
正常皮膚之組織染色結果示於圖8，並且源自健康者之皮膚(正常皮膚)與源自過敏性皮膚炎患者之皮膚(異位性皮疹部)的對比結果示於圖9。如圖8所示，博來黴素水解酵素於表皮之上層較高表現，表示與絲聚蛋白相同之定域。另一方面，於異位性皮疹部，與正常皮膚相比，博來黴素水解酵素及絲聚蛋白之表現較低(圖9)。
定量PCR
角質形成細胞中之博來黴素水解酵素之表現量係利用以下方法藉由定量PCR而測定。Light Cycler 480(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)試劑係使用Light Cycler FastStart DNA Master CYBR Green I。於10 μl之SYBR Green I master mix中分別添加0.6 μl之以下博來黴素水解酵素引子、及6.8 μl水，使總量為20 μl，於95℃下15秒、55℃下20秒、72℃下20秒進行45週期之PCR。所獲得之結果與作為管家基因之G3PDH的結果相比較而修正。
正向引子：TGTGGTTTGGCTGTGATGTT(序列編號1)
反向引子：GCACCATCCTGATCATCCTT(序列編號2)
上述定量PCR之結果示於圖10。如圖10所示，與80%融合之角質形成細胞即未分化之角質形成細胞相比，於達到融合即分化之角質形成細胞中，博來黴素水解酵素較高表現。換言之，由本實驗結果可知，該酵素於分化前之基底細胞中未怎麼表現。該定量PCR之結果支持上述組織染色之結果。
實驗5 1)使用人體表皮角質形成細胞之BH啟動子之螢光酶分析：
於增殖期(約80%融合)或分化後(融合後，空氣曝露，添加2 mM鈣，進而繼續培養2天者)之角質形成細胞中添加Lysis buffer(200 μl)，使細胞溶解。測定係使用Bright-Glo Luciferase assay System(Promega Co.,Madison,WI,USA)。將樣品20 μl移至特定之管中，使用Auto Lumat Plus(LB953)8Berthhold GmbH & Co. KG. Bad Wildbad Germany)進行測定。由圖12之結果可知，於博來黴素水解酵素表現時，上述轉錄調節區域若具有自該酵素之編碼序列直至至少216 bp下游的區域即可。
2)對NHEK之UV照射：
照射30 mJ或60 mJ之UVB(Torex Fl20S-E-30/DMR,20 W,Toshiba Medical Supply)，於3小時後、24小時後、48小時後，利用特定之方法回收RNA，利用定量PCR，測定博來黴素水解酵素及鈣蛋白酶之mRNA表現。測定之結果，照射30 mJ後以48小時所回收之試樣最表現出博來黴素水解酵素之mRNA(圖13)。
3)細胞激素對博來黴素表現所造成之影響
將IL-4(最終濃度：0.1、1.0、10 ng/ml)、TNFα(最終濃度：0.1、1.0、10 ng/ml)、IFNγ(最終濃度：1.0、10、100 ng/ml)分別添加於增殖期之培養角質形成細胞中，培養24小時後，使用Isogen(等基因)採取RNA。利用定量PCR，測定博來黴素水解酵素之mRNA表現。結果示於圖14。由圖14之結果可知，作為Th2細胞激素之一種之介白素-4(IL-4)下調博來黴素水解酵素之表現。
實驗6 人體BH基因之特性決定 1) BH之5'-毗鄰區域之選殖
根據人體BH基因之核苷酸序列，使用基因特異引子1(GSP1)、5'-tccctcgagtctgtatcagagcagctaca-3'(序列編號3)與基因特異引子2(GSP2)、5'-tgaacacgcgtccgagctgctcatggcg-3'(序列編號4)，依據製造業者之操作說明書，使用Genome Walker Kit(Clontech,Mountain View,CA)，放大5'-毗鄰區域。簡言之，於5%二甲基亞碸存在下，實施一次PCR：使用Ex Taq DNA聚合酶(Takara,Shiga,Japan)，利用由製造業者推薦之兩步驟PCR協議：於94℃下25秒，並且於72℃下4分鐘進行7週期，繼而於94℃下25秒，並且於67℃下4分鐘進行32週期，並且於最後伸長67℃下4分鐘，並使用GSP1與適配器引子(AP)1。繼而，用作二次PCR放大之範本，其係稀釋一次PCR混合物，並且使用GSP2與AP2。除了使用5週期之初次週期代替7週期，繼續使用20週期代替32週期之外，二次PCR與一次PCR相同。藉由使用圖15中所列舉之引子之PCR而產出BH之5'-毗鄰區域的連續5'-缺失突變株。放大後，所有PCR產物於pGEM-T簡易載體(Promega,Madison,WI)內克隆化，並且使用ABI Prism 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems,Foster City,CA)決定序列。
為了構築通報質體pGL3-1216/+1，於以下條件下：最初改質94℃下4分鐘、94℃下30秒、60℃下1分鐘、72℃下1分鐘進行30週期、並且最後伸長72℃下4分鐘，使用作為範本之pGEM-T-1216/+1、以及含有限制部位Kpn I及Mlu I之1組特異BH引子(5'-ccgggtaccatcagagttccttagaa-3'(序列編號5)及5'-taaatacgcgttggcgcccacgctgccg-3')(序列編號6)，而實施PCR。將所獲得之PCR產物藉由Kpn I及Mlu I分解，並且於pGL3-Basic載體(Promega)內選殖。再者，pGL3-Basic載體含有螢火蟲螢光素酶基因。藉由使用QIAGEN Plasmid Midi Kit(QIAGEN,Duesseldorf,Germany)而製備構築物。
2)定點突變誘發
藉由依據製造業者之操作說明書，使用Quick change site-directed mutagenesis試劑盒(Stratagene,La Jolla,CA)而實施MZF-1、Sp-1、及IRF-1/2結合部位之突變誘發。為了製作缺失變異Sp-1使用5'-ggaccccgtttcagcctccccgcc-3'(序列編號7)(突變體Sp-1部位之正向引子)及5'-ggcggggaggctgaaacggggtcc-3'(序列編號8)(突變體Sp-1部位之反向引子)。關於MZF-1突變體，使用5'-gactcagcaacgcggttttgtccctccgc-3'(序列編號9)(突變體MZF-1部位之正向引子)及5'-gcggagggacaaaaccgcgttgctgagtca-3'(序列編號10)(突變體MZF-1部位之反向引子)。關於IRF-1/2突變體，使用5'-gccgccgagcctccggcgctcc-3'(序列編號11)(突變體IRF-1/2部位之正向引子)及5'-ggagcgccggaggctcggcggc-3'(序列編號12)(IRF-1/2部位之反向引子)。
3)轉染與啟動子活性之測量
將角質形成細胞以5×104細胞/孔之密度於12孔組織培養板內進行培養，並且使用FuGene HD Transfection試劑(Roche Diagnostics,Basel,Switzerland)，使用各個構築物1 μg，進行轉染。為了修正轉染效率，於所有細胞中使HSV-TK啟動子之控制下存在之含有海紫羅蘭科(Renilla)螢光酶基因之pGL4.74[hRluc-TK]載體(Promega)同時轉染。只要未事先說明，於轉染24小時後採集細胞，並且使用每1孔之250 μl的Passive lysis緩衝液(Promega)而溶解。使用Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)及Autolumat plus luminometer(Berthold Technologies,Bad Wildbad,Germany)分析螢光酶活性。關於海紫羅蘭科‧螢光酶活性，將螢火蟲螢光素酶活性標準化。關於各構築物，獨立實施3個轉染，並且以平均值為單位表示結果。
4)定量即時RT-PCR分析
利用定量即時RT-PCR而分析BH及關聯因子之轉錄水平。依據製造業者之操作說明書，使用ISOGEN(Nippon Gene,Tokyo,Japan)自培養細胞萃取全RNA。使用SuperScript(商標)II(Invitrogen,Carlsbad,CA)逆轉錄成cDNA。依據製造業者之操作說明書，使用LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche Diagnostics)，利用LightCycler raid cycler系統而實施即時RT-PCR。與所使用之引子相關之資訊示於圖16。使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase))作為基準基因。藉由LightCycler分析軟體之融解曲線之定量分析而確認所放大之片段的特異性。對於GAPDH之mRNA，將mRNA之量標準化，並且作為相對於最終未處理對照之mRNA的比而表示。
5) IRF-1及-2之siRNA基礎的抑制
依據製造業者之操作說明書，與40 nM之siIRF-1、siIRF-2、及siControl A(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)一倂使用Lipofectamine RNAi Max(Invitrogen,Carlsbad,CA)，對培養角質形成細胞進行轉染。將該細胞於不含抗生物質之培養基中培養24小時，其後，萃取全RNA，並且如上所述，利用即時RT-PCR進行分析。
6)電泳遷移率改變分析(EMSA(electrophoretic mobility shift assay))
藉由對單鏈生物素化寡核苷酸與單鏈未標識寡核苷酸進行退火而製備雙鏈寡核苷酸探針(圖17)。藉由使用Nuclear Extraction(核萃取)試劑盒及EMSA gel shift(凝膠遷移)試劑盒(Panomics,Santa Clara,CA)而實施核之萃取及EMSA。將核萃取物(4 μg)與1×結合緩衝液及1 μg之聚d(I-C)、以及對應於MZF-1、Sp-1、IRF-1/2、及GATA-1結合部位之生物素化探針(50 pmol)一倂於15℃下培養30分鐘。為了分析競爭，將2倍過剩之未標識探針於生物素化探針添加前於結合反應中添加。繼而，將該等培養混合物與0.5×TBE緩衝液一倂於8%之聚丙烯醯胺凝膠中進行電泳，並且轉印至Biodyne B尼龍膜(Pall，Port Washington,NY)。藉由使用EMSA gel shift試劑盒中之化學發光檢測試劑而使條帶可見化。
7)結果 人體BH基因啟動子之離析及特性決定
藉由Genome Net MOTIF程式之檢索，明確人體BH之5'-毗鄰區域內大多數之推測轉錄因子結合部位(圖18A)。尤其，於接近轉錄開始部位之位置的-216/+1區域中，存在與藉由MZF1、Sp-1、IRF-1/2、及GATA-1/2而識別之複合序列很好吻合的序列，因此暗示該等轉錄因子與BH啟動子活性之調整有關。更嚴密而言，為了決定BH之啟動子區域，實施缺失分析(圖18B)。於藉由pGL3-816而轉染之分化型角質形成細胞中檢測出最高水平之螢光酶活性。然而，缺失質體之相對螢光酶活性為直至進行到pGL3-216，缺失仍然較高殘留。構築體中，含有(表示成pGL3-444)片段-444/+1之質體於培養角質形成細胞中顯示出顯著較低之活性，暗示存在-616/-444區域中之上游抑制因子活性。該等結果證實-216/-1區域含有用以BH基因轉錄之最小啟動子，因此其核苷酸序列示於圖18C。該序列不含有TATA-或CCAAT-盒，因此暗示該基因之管家性質。另一方面，幾個轉錄性因子結合部位例如MZF-1、Sp-1、IRF-1/2、及GATA-1/2等存在於該核心‧啟動子區域。
參與BH基因調節之潛在cis-element之鑑定
為了決定參與BH基因表現之轉錄調節的最小啟動子之潛在cis-element，構築以各cis-element為標的之新的一系列缺失突變株。於MZF-1、Sp-1、及IRF-1/2之結合部位缺失之情形時，較多下方控制啟動子活性(圖19A)。
進而，調查該等轉錄因子是否可分別與推測結合部位實際結合。為此，使用來自培養角質形成細胞之核萃取物，及含有MZF-1、Sp-1、GATA-1、或IRF-1/2結合部位之生物素化雙鏈寡核苷酸探針，實施電泳遷移率改變分析(EMSA)。如圖19B所示，Sp-1、MZF-1、及IRF1/2結合於BH啟動子之對應之標的部位，但GATA-1/2未結合。該等結果表示-216~-105 bp之啟動子區域中之該等結合部位對用以BH轉錄之cis-element而言為不可或缺。
BH基因表現之細胞激素媒介性調節
BH為NMF產出酵素，因此亦存在其參與AD之病態生理的可能性。藉此，檢查Th1、Th2、及Th17細胞激素對於BH基因表現之效果。圖20A表示增殖型角質形成細胞中，作為Th1細胞激素之IFN-γ藉由用量依賴樣式而下方控制BH mRNA表現。另一方面，Th2及Th17細胞激素完全未顯示出對於BH之表現的顯著效果。藉由分化型角質形成細胞而獲得相同之結果(資料未揭示)。為了闡明BH基因表現之調整中之IFN-γ的功能，實施啟動子分析，特別規定細胞激素響應要素。如圖20B所示，IFN-γ於藉由-131~-120之間含有IRF-1/2結合序列之pGL3-BH-616轉染的培養角質形成細胞中，下方控制BH啟動子活性。該序列缺失後IFN-γ尚未抑制啟動子活性(圖20B)。此外，為了判斷IRF-1/2是否為BH之IFN-γ誘發性下方調節的必需媒介物，使用低分子干擾RNA(siRNA)，抑制IRF-1及IRF-2基因表現。於藉由IRF-1或-2 siRNA(40 nM)之任一者轉染的培養角質形成細胞中顯著抑制IFN-γ之活性(圖20C)。該等結果強烈暗示IRF-1/2結合序列對BH基因表現之IFN-γ誘發性下方調節而言為不可或缺。
培養角質形成細胞中之BH及關聯因子之表現
為了調查表皮中之轉錄調節之機構，利用即時PCR法分析增殖型或分化型細胞中之BH、鈣蛋白酶I、及推測轉錄因子的表現。如圖21A所示，例如與增殖型角質形成細胞相比較之密集期2天後者(3.6倍)、及以高鈣濃度培養者(8.6倍)等所示，於分化型角質形成細胞中上方控制BH mRNA。該等結果與啟動子分析資料一致(圖18B)。關於鈣蛋白酶I(約2.5倍之上方控制)獲得相同之結果。又，培養角質形成細胞中，檢查各種轉錄因子，例如MZF-1、Sp-1、GATA-1、IRF-1及IRF-2等之表現圖案。如圖21B所示，該等轉錄因子沿著BH之表現，於分化型角質形成細胞中上方控制。然而，GATA-1 mRNA表現與其他因子相比顯著較低(<1/32)。認為GATA-1於角質形成細胞中未起到重要作用。藉此，暗示BH經由MZF-1及Sp-1藉由分化依賴樣式而合成。IRF-1及IRF-2又亦藉由分化刺激而上方控制之事實，顯示出BH表現對於IFN-γ具有非常之敏感性。
Th1及Th2細胞激素對於推測轉錄因子之表現的效果
進而對該等轉錄因子之細胞激素依賴性調節進行調查。圖22A表示IFN-γ係藉由用量依賴式強烈上方控制IRF-1 mRNA表現。相同地，IRF-2表現係於IFN-γ存在下上方控制。作為對照，IRF-1及IRF-2之表現僅於100 ng/ml之IL-4存在下顯著增強(圖22B)。頗有意思的是，與MZF-1及Sp-1一倂，於10 ng/ml之IL-4存在下最有效進行下方控制(圖22C)。該等結果暗示，BH表現分別直接及間接藉由Th1及Th2細胞激素而調節。
過敏性皮膚炎皮膚中下方控制BH
FLG之功能喪失型突變與AD之發病機制相關聯，不僅基因缺損，分解路徑之損傷亦與AD之病理有關聯之可能性。因此，以下檢查AD患者之病變皮膚及非病變皮膚中之BH及絲聚蛋白的定域、以及BH活性。正常表皮中，抗BH抗體與抗絲聚蛋白抗體的二重染色於上面表皮中，尤其如之前報告所示，表示顆粒層中之BH與絲聚蛋白的同時定域(圖23A)。明確顯示於更高之倍率，BH自顆粒層直至角化層進行定域，另一方面，絲聚蛋白限定於顆粒細胞。作為對照，BH表現於藉由該研究而診察之AD患者(n=7)的病變皮膚及非病變皮膚中急劇減少。儘管所有該等患者經常檢測出顯著之染色，但是顯示出比較弱之絲聚蛋白染色(圖23A)。除了免疫組織化學，對來自18名AD患者及30名健康志願者獲得之膠帶剝離樣品的角質細胞萃取物測量BH活性。來自AD患者之病變皮膚及非病變皮膚的萃取物與來自健康人的萃取物相比，顯示出實質較低之BH活性(分別低至27.1及8.8%)(圖23B)。該等結果證實BH與絲聚蛋白同時定域化，並且其活性於患有AD之患者的皮膚中急劇下降。
考察
該研究中，藉由附上啟動子區域之選殖及功能的特徵而研究BH基因表現之調節機制。啟動子解析中，於-216 bp上游中鑑定對BH啟動子活性而言較為重要之區域(圖18B)。該區域中，推測MZF-1及Sp-1結合部位顯示出對於BH啟動子活性顯著之效果(圖18C及19A)。頗有意思的是，報告有Sp-1及MZF-1亦又參與對開始絲聚蛋白分解而言較為重要之酵素即PAD1的調整。Sp-1為哺乳動物細胞中作為轉錄因子而發揮功能之鋅‧梭‧蛋白質之Sp/Kruppel樣家族的典型成員。認為參與包含增殖、細胞凋亡、分化、及腫瘤性形質轉換之細胞功能的幾乎所有方面。人體表皮中，Sp-1含有套膜蛋白、兜甲蛋白、轉穀氨醯胺酵素、PAD1、2、及3，係參加表皮分化之基因的重要調節因子。MZF-1為屬於鋅‧梭‧蛋白質之Krupple家族的轉錄因子，於分化全能性造血性細胞、以及骨髓原始細胞中表現。然而，未報告有哺乳動物表皮中之轉錄調節的MZF-1之功能。與增殖型角質形成細胞相比，分化型角質形成細胞中發現同時上方控制MZF-1及Sp-1、以及BH(圖21B)，與其說顯示出管家作用，不如說是顯示出分化中之BH之作用。各個結果明確表示該等轉錄因子作為角質形成細胞最終分化過程中之BH的基本之用以轉錄調節的活化因子而發揮功能。
另一方面，cis作用element之調查進而規定該區域內之IRF-1/2結合部位。使用EMSA，確認IRFs對於BH啟動子區域的直接結合(圖19B)。該結合序列之定點突變誘發導致BH啟動子活性之顯著減少(圖19A)。為此，IRF-1/2轉錄因子亦又為基本條件下BH基因之最小啟動子活性所必需。IRF家族為轉錄因子之群，直至當前，於各種細胞型及組織中鑑定出九個IRF成員(IRF-1~-9)。該等IRF分子於因IFN-α、β、及γ引起之刺激下，實現抗病毒防禦、免疫響應/調節、及細胞成長調節之功能。表示IRF-1及-2作為很多參與IFN-γ誘導性基因調整的激動劑-拮抗劑對而發揮功能。頗有意思的是，IFN-γ明顯抑制BH mRNA表現(圖20A及B)。弱化及定點突變誘發分析中，確認IRF-1/2結合部位參與BH表現之IFN-γ媒介性抑制(圖20B及C)。該等結果明確表示IRF-1/2為人體角質形成細胞中之BH基因的IFN-γ媒介性下方調節的媒介物。另一方面，作為Th2細胞激素之IL-4及IL-13完全未顯示出24小時培養之間的直接作用(圖20A)。然而，該等Th2細胞激素顯著抑制作為活化物分子之MZF-1及Sp-1的表現。藉此，Th2細胞激素對負調節BH表現較為妥當。
又，亦表示於病變及非病變AD皮膚中急劇下方控制BH(圖23A及B)。絲聚蛋白突變為AD等屏障損傷關聯疾病的主要危險因子，突變分析中，指出未達愛爾蘭產生之50%，並且僅占日本之~20%的比例。假設不僅絲聚蛋白合成不全，絲聚蛋白之分解傷害亦參與屏障功能之崩解。明確NMF之減少導致乾燥肌膚，其使屏障之崩解進行。AD為Th2極性化疾病是眾所周知。然而，最近報告暗示Th1細胞激素亦於AD中起作用。例如，「內因性AD」免疫學附有IL-4、IL-5、及IL-13較低之表現、及IFN-γ較高之表現的特徵。此外，自Th1對Th2之偏移係於AD皮膚中之急性相向慢性相之間引起。各種結果表示亦存在AD中IFN-γ起到較所認為更重要之功能的可能性。
作為結論，各種結果表示人體表皮中之BH轉錄係藉由二重樣式而調節。其中之一路徑存在於角質形成細胞最終分化的控制下，並且另一者依賴於Th1及Th2細胞激素。該等路徑相互關聯，因此朝向BH表現之下方調節而容易使平衡偏移。BH之下降導致NMF之不足，由此與乾燥肌膚或進而屏障崩解相關。該等結果提供一種對BH調整與AD之發病機制的新認識。
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圖1係表示藉由膠帶剝離獲得之人體皮膚萃取液中之博來黴素酵素量與膠帶剝離之次數之關係的西方墨點法圖。
圖2係表示人體皮膚萃取液中之博來黴素酵素量與乾燥肌膚之關係的西方墨點法圖。T、A：源自未感覺乾燥之被試驗者的樣品；N：源自稍感覺乾燥之被試驗者的樣品；及M：源自感覺乾燥之被試驗者的樣品。
圖3係表示人體手腕之角質層萃取液中之博來黴素水解酵素量與其酵素活性之關係的圖表。橫軸之編號表示被試驗者之識別編號。
圖4係依據關於圖3中所獲得之博來黴素水解酵素量與活性之關係的最小平方法之一次近似。
圖5係與人體手腕之角質層萃取液中之博來黴素水解酵素與皮膚參數(A：游離胺基酸，B：活性，C：TEWL)相關之統計解析。BH low：博來黴素水解酵素量<10、活性<1.5(nmol/min/ml)；BH high：博來黴素水解酵素量≧10、活性≧1.5(nmol/min/ml)。
圖6係肌膚分類用問卷調查流程表。
圖7係依據圖6之流程表分類之被試驗者的角質層之皮膚參數測定結果。
圖8係表示正常皮膚中之博來黴素水解酵素及絲聚蛋白之定域的組織染色圖。
圖9係表示異位性患者皮膚中之博來黴素水解酵素及絲聚蛋白之定域的組織染色圖。
圖10係使用定量PCR之角質形成細胞之分化與博來黴素水解酵素之表現量的關係之圖表。縱軸之值表示以80%融合之表現量為1之情形時的相對量。
圖11係表示編碼博來黴素水解酵素之基因之5'毗鄰區域的模式圖。
圖12係表示使用人體表皮角質形成細胞之BH啟動子之螢光酶分析之結果的圖表。
圖13係表示轉錄因子SP1、MZF1及GATA1之表現與UV照射之關係的圖表。
圖14係表示正常人體表皮角化細胞中之博來黴素水解酵素及蛋白酶之表現與UV照射之關係的圖表。
圖15係為了利用PCR製作BH之5'-毗鄰區域的連續5'-缺失突變株而使用之引子。
圖16係為了利用定量即時RT-PCR分析BH及關聯因子之轉錄水平而使用之引子。
圖17係電泳遷移率改變分析中所使用之探針。
圖18(A)表示人體BH之5'-毗鄰區域之模式圖。5'-毗鄰區域內之推測轉錄因子結合部位藉由Genome Net MOTIF程式之檢索而明確。(B)係藉由缺失分析而決定之BH之啟動子區域。(C)係對包含BH之最小啟動子之序列及推測轉錄因子結合部位的-216/-1區域之表示核苷酸序列的推測轉錄因子結合部位附上下劃線。
圖19(A)係定點突變誘發引起之BH啟動子中之轉錄因子結合部位的特性決定。表示推測轉錄因子結合部位之缺失構築體之模式圖及培養角質形成細胞中之螢光酶活性。定點突變誘發係藉由跨越-616/+1區域之核苷酸序列的構築體而實施。(B)表示MZF-1、Sp-1、GATA-1、或IRF-1/2對於BH啟動子之cis-作用element的結合。實驗係藉由使用來自培養角質形成細胞之核萃取物、及含有推測轉錄因子結合部位MZF-1、Sp-1、GATA-1、或IRF-1/2之生物素化雙鏈寡核苷酸探針的電泳遷移率改變分析(EMSA)而進行。區帶1為核萃取物中之生物素化探針之結合分佈，區帶2表示與2倍過剩量之非標籤化探針競爭後之生物素化探針的結合分佈。
圖20(A)係BH表現之即時RT-PCR分析。表示Th1、Th2、及Th17細胞激素對於BH基因表現之效果。(B)為IRF-1/2結合部位之突變分析。表示IFN-γ存在下的培養角質形成細胞中之BH啟動子活性。藉由含有BH啟動子區域之Imtakt IRF-1/2結合部位之pGL3-216對角質形成細胞進行轉染，藉由IFN-γ處理24小時(上面板)。藉由△pGL3-616(IRF-1/2缺失突變體)對角質形成細胞進行轉染，於10 ng/ml之IFN-γ或IL-4存在下或不存在下處理24小時(下面板)。(C)係使用用以判斷IRF-1/2是否為BH之IFN-γ誘發性下方調節的必需媒介物的低分子干擾RNA(siRNA)對IRF-1及IRF-2基因表現進行測定。藉由IRF-1或IRF-2之siRNA(40 nM)對角質形成細胞進行轉染，培養24小時，藉由10 ng/ml之IFN-γ進行處理，進而培養24小時後進行RNA離析。右面板表示IRF-1及IRF-2之沉默之效果。
圖21(A)係利用用以調查表皮中之轉錄調節之機構的即時PCR法進行之增殖型或分化型細胞中之BH、鈣蛋白酶I、及推測轉錄因子的表現分析。(B)為培養角質形成細胞中之轉錄因子MZF-1、Sp-1、GATA-1、IRF-1及IRF-2之表現圖案分析。
圖22(A)係IFN-γ對於推測轉錄因子IRF-1及IRF-2之表現之效果。(B)係IL-4對於推測轉錄因子IRF-1、IRF-2、MZF-1及Sp-1之表現之效果。
圖23係(A)正常表皮中之抗BH抗體與抗絲聚蛋白抗體中之二重染色所示顆粒層中之BH與絲聚蛋白的同時定域。(B)係來自AD患者之病變皮膚與非病變皮膚之萃取物的BH活性。
(無元件符號說明)

Claims (2)

  1. 一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑之篩選評價方法，其於候補藥劑與對照藥劑相比博來黴素水解酵素之表現及/或活性顯著亢進之情形時，將該候補藥劑篩選評價為因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之改善劑，其中，於編碼博來黴素水解酵素之基因之轉錄活性與對照者相比為顯著亢進之情形時，判斷出上述表現及/或活性顯著亢進，於轉錄因子IRF-1、IRF-2、MZF-1、SP-1、及/或GATA-1對於編碼博來黴素水解酵素之基因的轉錄調節區域之結合活性與對照者相比顯著亢進之情形時，判斷為上述轉錄活性顯著亢進。
  2. 一種因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之原因之診斷方法，其係於皮膚試樣中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性，與對照之皮膚試樣中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比顯著下降之情形時，診斷為存在因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向，若與對照皮膚試樣中之博來黴素水解酵素之表現及/或活性相比為相同程度以上，則診斷為並無因過敏性皮膚炎所導致之乾燥肌膚之傾向，其中於編碼博來黴素水解酵素之基因之轉錄活性與對照者相比顯著下降之情形時，判斷為上述表現及/或活性顯著下降， 於轉錄因子IRF-1、IRF-2、MZF-1、SP-1、及/或GATA-1之結合活性與對照者相比顯著下降之情形時，判斷為上述轉錄活性下降。
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