JPWO2011068166A1 - ブレオマオシン水解酵素の活性を指標としたアトピー性皮膚炎による乾燥肌改善剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)候補薬剤が、対照薬剤と比較してブレオマオシン水解酵素の発現及び/又は活性を有意に亢進する場合に、当該候補薬剤をアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤と評価する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法。
(2)ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記発現及び/又は活性が有意に亢進していると判断される、(1)の方法。
(3)ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に対する、転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び/又はGATA-1の結合活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記転写活性が有意に亢進していると判断される、(2)の方法。
(4)皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び/又は活性を有意に亢進させることによる、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する方法。
(5)ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性を亢進させることで前記発現及び/又は活性が有意に亢進される、(4)の方法。
(6)ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に対する、転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び/又はGATA-1の結合活性を亢進させることで前記発現及び/又は活性が有意に亢進される、(5)の方法。
(7)皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び/又は活性が、対照の皮膚のものと比べ有意に低下している場合に、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向があると診断し、対照の皮膚のものと比べ同程度以上であるなら、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向がないと診断する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の素因を診断する方法。
(8)ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記発現及び/又は活性が有意に低下していると判断される、(7)の方法。
(9)転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び/又はGATA-1の結合活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記転写活性が低下していると判断される、(8)の方法。
カルパインIは、EMD Bioscience社より購入した。ブレオマイシン水解酵素は、ヒト表皮角層より、非特許文献5に従い作製した。ヒトIL‐4及びIFN‐γは、PEPROTECH EC(London, England)から購入した。ヒトIL‐13及びIL‐17A/Fは、R&D SYSTEM(MINNEAPOLIS, MN)製のものとした。シトルリン4‐メチルクマリル‐7‐アミド(Cit‐MCA)をBachem Bioscience(Bubendorf, Switzerland)から入手した。使用される他のすべての化学物質は、試薬グレードのものであった。
新生児期表皮由来の正常ヒト表皮ケラチノサイト(Kurabo、Osaka, Japan)を、低濃度(0.03mM)のカルシウム、及びHKGS Growth Supplement(Cascade Biologics)を含むEpiLife培地(Cascade Biologics、Portland, OR)中で培養した。すべての細胞を5%のCO2を加えながら37℃にてインキュベートし、そして継代4代以内に使用した。ケラチノサイトを、コンフルエント70%、コンフルエント100%、コンフルエントの2日後、及び2mMのカルシウム中コンフルエントの2日後に採取した。
ブレオマイシン水解酵素は、NMF産生の最終段階で働いていると考えられる。この場合、乾燥肌では本酵素の発現が低下している可能性がある。本実験では、皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の発現及び/又は活性の低下が、乾燥肌と関連しているか否かについて検討した。
本実験では、ヒト皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の量や活性の個体差と、当該酵素量と活性の相関とについて検討した。実験1に記載の方法に従い、20〜25才の女子学生40名の腕の皮膚から角層抽出液を作成した。当該抽出液中のブレオマイシン水解酵素量とその酵素活性を、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)らの方法に従い測定した。発現量はウェスタンブロットにより、そして酵素活性は、当該酵素のアミノペプチダーゼ活性について、蛍光基質であるCit−β−NAの分解量を測定することで評価した。結果を図3に、そしてその相関図を図4に示す。図4の結果から明らかなように、ブレオマイシン水解酵素量とその活性との間には相関関係が存在している。
本実験では、図6に記載のフローチャートに基づいて上記女子学生にアンケートを行い、各学生の肌を潤い肌、乾燥肌、乾燥型脂性肌、脂性肌の4つ分類した。アンケート結果と、上記実験2で測定した皮膚パラメーターの結果との相関関係を図7に示す。図7からは、脂性乾燥肌と分類された学生のブレオマイシン水解酵素活性が有意に高いことが分かる。
本実験では、皮膚におけるブレオマイシン水解酵素とフィラグリンの局在について検討する。
免疫組織化学染色は、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)に記載の方法により行った。材料は5μm厚のヒト皮膚の冷凍切片、そして抗ラットBH IgGを用いた。詳しくは、ヒト皮膚標本を、インフォームドコンセントの上で、東京医科大学のアトピー性皮膚炎を患っている患者から得た。本研究は、倫理(Human Ethics)に関する東京医科大学施設内審査委員会と資生堂特別部会によって承認された。
ヒト・アトピー性皮膚炎(病変皮膚と非病変皮膚)及び正常皮膚の切片を、抗ラットBH IgG及び抗ヒト・フィラグリンIgGと共に室温にて1時間インキュベートし、その後、PBSで洗浄し、そして蛍光結合二次抗体であるAlexa Fluor 555又は488(Molecular Probes Inc.、Eugene, OR)と共にさらにインキュベートした。DAPI(4’,6’‐ジアミジノ‐2‐フェニルインドール;Molecular Probes)を核の可視化に使用した。
ケラチノサイトにおけるブレオマイシン水解酵素の発現量は、以下の方法で、定量的PCRにより測定した。Light Cycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, 試薬はLight Cycler FastStart DNA Master CYBR Green Iを用いた。SYBR Green I master mix 10 μlに以下のブレオマイシン水解酵素プライマーをそれぞれ 0.6 μl、水を6.8 μl加え、全量を20 μlとし、95℃ 15秒、55℃ 20秒、72℃ 20秒で、45サイクルのPCRを行なった。得られた結果は、ハウスキーピング遺伝子であるG3PDHの結果と比較して補正した。
フォワードプライマー: TGTGGTTTGGCTGTGATGTT (配列番号1)
リバースプライマー: GCACCATCCTGATCATCCTT (配列番号2)
1)ヒト表皮ケラチノサイトを用いたBHプロモーターのルシフェラーゼアッセイ:
増殖期(約80%コンフルエント)もしくは、分化後(コンフルエント後、空気曝露し、2 mMカルシウムを添加し、さらに2日培養を継続したもの)のケラチノサイトに、Lysis buffer(200 μlを加え、細胞を溶解させる。測定には、Bright-Glo Luciferase assay System (Promega Co., Madison, WI, USA)を用いた。サンプル20 μlを所定のチューブに移し、Auto Lumat Plus (LB953)8Berthhold GmbH & Co. KG. Bad Wildbad Germany)を用いて測定した。図12の結果から、ブレオマイシン水解酵素が発現するには、上記転写調節領域は、当該酵素のコード配列から少なくとも216bp下流までの領域を有していればよいことが分かる。
30 mJもしくは、60 mJのUVBを照射し(Torex Fl20S-E-30/DMR, 20W, Toshiba Medical Supply)、3時間後、24時間後、48時間後に所定の方法にてRNAを回収し、定量PCRにより、ブレオマイシン水解酵素及びカルパインのmRNA発現を測定した。測定の結果、30mJ照射後48時間で回収した試料が最もブレオマイシン水解酵素のmRNAを発現していた(図13)。
IL-4 (終濃度:0.1, 1.0, 10 ng/ml)、TNFα(終濃度:0.1, 1.0, 10 ng/ml)、IFNγ(終濃度: 1.0, 10, 100 ng/ml)のそれぞれを、増殖期の培養ケラチノサイトに添加し、24時間インキュベートした後、Isogenを用いてRNAを採取した。定量PCRにより、ブレオマイシン水解酵素のmRNA発現を測定した。結果を図14に示す。図14の結果から、Th2サイトカインの一種であるインターロイキン−4(IL-4)は、ブレオマイシン水解酵素の発現をダウンレギュレートすることが分かる。
ヒトBH遺伝子の特性決定
1)BHの5’‐フランキング領域のクローニング
ヒトBH遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、5’‐フランキング領域を、遺伝子特異的プライマー1(GSP1)、5’‐tccctcgagtctgtatcagagcagctaca‐3’(配列番号3)と遺伝子特異的プライマー2(GSP2)、5’‐tgaacacgcgtccgagctgctcatggcg‐3’(配列番号4)を使用して、製造業者の取扱説明書に従いGenome Walker Kit(Clontech、Mountain View, CA)を用いて増幅した。簡単に言えば、5%のジメチルスルホキシドの存在下、Ex Taq DNAポリメラーゼ(Takara、Shiga, Japan)を用いる、製造業者によって推奨されるツーステップPCRプロトコール:94℃にて25秒間、そして72℃にて4分間を7サイクル、それに続いて94℃にて25秒間、そして67℃にて4分間を32サイクル、そして最後の伸長67℃にて4分間、を使用して、GSP1とアダプタープライマー(AP)1を用いた一次PCRを実施した。次いで、一次PCR混合物を希釈し、そしてGSP2とAP2を用いた二次PCR増幅の鋳型として使用した。7サイクルの代わりに5サイクルの初回サイクルと、それに続く32サイクルの代わりに20サイクルの使用を除いて、二次PCRは一次PCRと同一であった。BHの5’‐フランキング領域の連続的な5’‐欠失突然変異株を、図15に列挙したプライマーを使用したPCRによって産出した。増幅後に、すべてのPCR産物をpGEM‐T簡易ベクター(Promega、Madison, WI)内にクローン化し、そしてABI Prism 310 Genetic Analyzer(Applied Biosystems、Foster City, CA)を用いて配列決定した。
MZF‐1、Sp‐1、及びIRF‐1/2結合部位の突然変異誘発を、製造業者の取扱説明書に従ってQuick change site‐directed mutagenesisキット(Stratagene、La Jolla, CA)を使用することによって実施した。Sp‐1に欠失変異を作製するために、5’‐ggaccccgtttcagcctccccgcc-3’ (配列番号7)(突然変異体Sp‐1部位の順方向プライマー)と5’‐ggcggggaggctgaaacggggtcc‐3’ (配列番号8)(突然変異体Sp‐1部位の逆方向プライマー)を使用した。MZF‐1突然変異体については、5’‐gactcagcaacgcggttttgtccctccgc‐3’(配列番号9)(突然変異体MZF‐1部位の順方向プライマー)と5’‐gcggagggacaaaaccgcgttgctgagtca‐3’(配列番号10)(突然変異体MZF‐1部位の逆方向プライマー)を使用した。IRF‐1/2突然変異体については、5’‐gccgccgagcctccggcgctcc‐3’ (配列番号11)(突然変異体IRF‐1/2部位の順方向プライマー)と5’‐ggagcgccggaggctcggcggc‐3’ (配列番号12)(IRF‐1/2部位の逆方向プライマー)を使用した。
ケラチノサイトを、5×104細胞/ウェルの密度にて12ウェル組織培養プレート内で培養し、そしてFuGene HD Transfection試薬(Roche Diagnostics、Basel, Switzerland)を使用して、それぞれの構築物1μgを用いてトランスフェンクションした。トランスフェンクション効率を補正するために、すべての細胞にHSV‐TKプロモーターの制御下にあるウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ遺伝子を含むpGL4.74[hRluc‐TK]ベクターPromega)を同時トランスフェンクションした。特に断りのない限り、細胞を、トランスフェンクションの24時間後に採集し、そして1ウェルあたり250μlのPassive lysisバッファー(Promega)を用いて溶解した。ルシフェラーゼ活性を、Dual Luciferase Reporter Assay System(Promega)及びAutolumat plus luminometer(Berthold Technologies、Bad Wildbad, Germany)を用いて分析した。ホタル・ルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性について標準化した。各構築物について、3つのトランスフェンクションを独立に実施し、そして結果を平均値として表した。
BH及び関連因子の転写レベルを、定量的リアルタイムRT‐PCRによって分析した。全RNAを、製造業者の取扱説明書に従ってISOGEN(Nippon Gene、Tokyo, Japan)を用いて培養細胞から抽出した。SuperScript(商標)II(Invitrogen、Carlsbad, CA)を用いてcDNAに逆転写した。リアルタイムRT‐PCRを、製造業者の取扱説明書に従ってLightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche Diagnostics)を使用してLightCycler raid cyclerシステムにより実施した。使用したプライマーに関する情報を、図16に示す。グリセルアルデヒド‐3‐リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)を基準遺伝子として使用した。増幅した断片の特異性を、LightCycler分析ソフトウェアによる融解曲線の定量分析によって確認した。mRNAの量を、GAPDHのmRNAに対して標準化し、そして最終的に未処理対照のmRNAに対する比として示した。
培養ケラチノサイトを、製造業者の取扱説明書に従って、40nMのsiIRF‐1、siIRF‐2、及びsiControl A(Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz, CA)と共にLipofectamine RNAi Max(Invitrogen、Carlsbad, CA)を使用してトランスフェンクションした。その細胞を、抗生物質不含培地中で24時間培養し、その後、全RNAを抽出し、そして上記したように、リアルタイムRT‐PCRによって分析した。
二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、一本鎖ビオチン化オリゴヌクレオチドと一本鎖未標識オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製した(図17)。核の抽出とEMSAを、Nuclear Extractionキット及びEMSA gel shiftキット(Panomics、Santa Clara, CA)を使用することで実施した。核抽出物(4μg)を、1×結合バッファー及び1μgのポリd(I‐C)、並びにMZF‐1、Sp‐1、IRF‐1/2、及びGATA‐1結合部位に対応するビオチン化プローブ(50pmol)と共に15℃にて30分間インキュベートした。競合アッセイのために、2倍の過剰の未標識プローブを、ビオチン化プローブの添加前に結合反応に加えた。これらのインキュベーション混合物を、次に、0.5×TBEバッファーと共に8%のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、そしてBiodyne Bナイロン膜(Pall、Port Washington, NY)に転写した。EMSA gel shiftキットの中の化学発光検出試薬を使用することで、バンドを可視化した。
ヒトBH遺伝子プロモーターの単離と特性決定
Genome Net MOTIFプログラムによる検索で、ヒトBHの5’‐フランキング領域内の多数の推定転写因子結合部位が明らかになった(図18A)。特に、転写開始部位の位置に近い−216/+1領域の中に、MZF1、Sp‐1、IRF‐1/2、及びGATA‐1/2によって認識されるコンセンサス配列によく合致した配列が存在したので、これらの転写因子がBHプロモーター活性の調整にかかわっていることが示唆された。より厳密にBHのプロモーター領域を決定するために、欠失分析を実施した(図18B)。最高レベルのルシフェラーゼ活性を、pGL3‐816でトランスフェンクションした分化型ケラチノサイトにおいて検出した。しかしながら、欠失プラスミドの相対ルシフェラーゼ活性は、欠失がpGL3‐216に進むまで高いままで残っていた。構築体の中で、(pGL3‐444と表示)断片−444/+1を含むプラスミドは、培養ケラチノサイトにおいて有意に低い活性を示し、−616/−444領域における上流サプレッサー活性の存在が示唆された。これらの結果が−216/−1領域がBH遺伝子転写のための最小プロモーターを含んでいることを実証したので、そのヌクレオチド配列を図18Cに示す。この配列はTATA‐又はCCAAT‐ボックスを含んでいなかったので、この遺伝子のハウスキーピング性質が示唆された。その一方で、いくつかの転写性因子結合部位、例えばMZF‐1、Sp‐1、IRF‐1/2、及びGATA‐1/2などがこのコア・プロモーター領域に存在していた。
BH遺伝子発現の転写調節に関与する最小プロモーターの潜在的cis‐エレメントを決定するために、各cis‐エレメントを標的とした新しい一連の欠失突然変異株を構築した。MZF‐1、Sp‐1、及びIRF‐1/2の結合部位を欠失した場合、プロモーター活性が大きく下方制御された(図19A)。
さらに、これらの転写因子が推定結合部位のそれぞれに実際に結合できるかどうか調査した。このために、電気泳動移動度シフト・アッセイ(EMSA)を培養ケラチノサイトからの核抽出物、及びMZF‐1、Sp‐1、GATA‐1、又はIRF‐1/2結合部位を含むビオチン化二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いて実施した。図19Bに示されているように、Sp‐1、MZF‐1、及びIRF1/2は、BHプロモーターの対応する標的部位に結合したが、GATA‐1/2は結合しなかった。これらの結果は、−216〜−105bpのプロモーター領域のこれらの結合部位が、BH転写のためのcis‐エレメントに不可欠であることを示している。
BHはNMF産出酵素であるので、それがADの病態生理に関与する可能性もある。よって、BH遺伝子発現に対するTh1、Th2、及びTh17サイトカインの効果を調べた。図20Aは、増殖型ケラチノサイトにおいて、Th1サイトカインであるIFN‐γが、用量依存的様式でBH mRNA発現を下方制御したことを示した。その一方、Th2及びTh17サイトカインは、BHの発現に対して有意な効果を全く示さなかった。同様の結果が分化型ケラチノサイトによって得られた(データ未掲載)。BH遺伝子発現の調整におけるIFN‐γの役割を解明するために、プロモーターアッセイを実施して、サイトカイン応答要素を特定した。図20Bに示されているように、IFN‐γは、−131〜−120の間にIRF‐1/2結合配列を含んだpGL3‐BH‐616でトランスフェンクションした培養ケラチノサイトにおいてBHプロモーター活性を下方制御した。この配列の欠失後には、IFN‐γがプロモーター活性を抑制することはもうなかった(図20B)。加えて、IRF‐1/2がBHのIFN‐γ誘発性下方調節の必須メディエーターであるかどうか判断するために、低分子干渉RNA(siRNA)を使用して、IRF‐1及びIRF‐2遺伝子発現を抑制した。IFN‐γの活性は、IRF‐1又は‐2 siRNA(40nM)のいずれかでトランスフェンクションした培養ケラチノサイトにおいて有意に抑制された(図20C)。これらの結果は、IRF‐1/2結合配列がBH遺伝子発現のIFN‐γ誘発性下方調節に不可欠であることを強く示唆している。
表皮における転写調節の機構を調査するために、リアルタイムPCR法によって増殖型又は分化型細胞におけるBH、カルパインI、及び推定転写因子の発現を分析した。図21Aに示されているように、BH mRNAは、例えば、増殖型ケラチノサイトと比較した、集密期の2日後のもの(3.6倍)、及び高カルシウム濃度にて培養したもの(8.6倍)などのように、分化型ケラチノサイトにおいて上方制御された。これらの結果は、プロモーターアッセイデータと一致している(図18B)。同様の結果を、カルパインI(約2.5倍の上方制御)に関して得た。また、培養ケラチノサイトにおいて、様々な転写因子、例えば、MZF‐1、Sp‐1、GATA‐1、IRF‐1及びIRF‐2などの発現パターンを調べた。図21Bに示されているように、これらの転写因子は、BHの発現に沿って、分化型ケラチノサイトにおいて上方制御された。しかしながら、GATA‐1 mRNA発現は、他の因子と比較して有意に低かった(<1/32)。GATA‐1はケラチノサイトにおいて重要な役割を担っていないように思われる。よって、BHがMZF‐1及びSp‐1を介して分化依存的様式で合成されることを示唆する。IRF‐1及びIRF‐2がまた、分化刺激によっても上方制御されたという事実は、BH発現がIFN‐γに対して非常に感受性であることを示している。
これらの転写因子のサイトカイン依存性調節についてさらに調査した。図22Aは、IFN‐γが、用量依存式にIRF‐1 mRNA発現を強く上方制御したことを示す。同様に、IRF‐2発現は、IFN‐γの存在下で上方制御された。対照的に、IRF‐1及びIRF‐2の発現は、100ng/mlにおいてのみIL‐4の存在下で有意に増強された(図22B)。興味深いことに、MZF‐1及びSp‐1は共に、10ng/mlのIL‐4の存在下で最も効果的に下方制御された(図22C)。これらの結果は、BH発現が、それぞれ、直接的及び間接的にTh1及びTh2サイトカインによって調節されていることを示唆している。
FLGの機能喪失型突然変異はADの発症機序に関連するが、遺伝子欠損だけではなく、分解経路の障害もまたADの病理に関連する可能性がある。そのため、AD患者の病変皮膚及び非病変皮膚におけるBH及びフィラグリンの局在、並びにBH活性を次に調べた。正常表皮では、抗BH抗体と抗フィラグリン抗体での二重染色は、上面表皮における、特に、先に報告されたように、顆粒層におけるBHとフィラグリンの同時局在を示した(図23A)。より高い倍率では、BHが顆粒層から角化層までに局所している一方で、フィラグリンが顆粒細胞に限定されていることが明確に示された。対照的に、BH発現は、この研究で診察したAD患者(n=7)の病変皮膚及び非病変皮膚において劇的に減少した。これらの患者のすべては、有意な染色が常に検出されたにもかかわらず、比較的弱いフィラグリン染色を示した(図23A)。免疫組織化学に加えて、BH活性を18人のAD患者及び30人の健常ボランティアから得たテープ剥離サンプルからの角質細胞抽出物において計測した。AD患者の病変皮膚と非病変皮膚からの抽出物は、健常人からのそれと比較して、(それぞれ27.1と8.8%まで)実質的に低いBH活性を示した(図23B)。これらの結果は、BHがフィラグリンと同時局在化され、そしてその活性がADを患っている患者の皮膚において劇的に低減されることを実証した。
この研究では、BH遺伝子発現の調節機序を、プロモーター領域のクローニング及び機能の特徴づけによって研究した。プロモーター解析では、−216bp上流の中にBHプロモーター活性にとって重要な領域を同定した(図18B)。この領域では、推定MZF‐1及びSp‐1結合部位が、BHプロモーター活性に対して有意な効果を示した(図18C及び19A)。興味深いことに、Sp‐1及びMZF‐1もまた、フィラグリン分解の開始にとって重要な酵素であるPAD1の調整に関与することが報告されている。Sp‐1は、哺乳動物細胞において転写因子として機能するジンク・フィンガー・タンパク質のSp/Kruppel様ファミリーの典型的なメンバーである。増殖、アポトーシス、分化、及び腫瘍性形質転換を含めた細胞機能のほとんどすべての面に関与すると考えられる。ヒト表皮において、Sp‐1は、インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ、PAD1、2、及び3のそれを含めて、表皮分化に参加する遺伝子の重要な調節因子である。MZF‐1は、ジンク・フィンガー・タンパク質のKruppleファミリーに属する転写因子であり、分化全能性造血性細胞、並びに骨髄始原細胞において発現される。しかしながら、哺乳動物表皮における転写調節でのMZF‐1の機能は報告されていない。増殖型ケラチノサイトと比較して、分化型ケラチノサイトにおいてMZF‐1及びSp‐1、並びにBHを同時に上方制御することを見つけ(図21B)、ハウスキーピング的な役割よりむしろ分化におけるBHの役割を示した。我々の結果は、これらの転写因子がケラチノサイト最終分化中のBHの基本的な転写調節のための活性化因子として機能することを明確に示した。
その一方で、cis作用エレメントの調査は、この領域内のIRF‐1/2結合部位をさらに規定した。EMSAを使用して、BHプロモーター領域へのIRFsの直接結合を確認した(図19B)。この結合配列の部位特異的突然変異誘発は、BHプロモーター活性の有意な減少をもたらした(図19A)。そのため、IRF‐1/2転写因子もまた、基本条件の下、BH遺伝子の最小プロモーター活性に必要であろう。IRFファミリーは転写因子の群であり、今までのところ、9つのIRFメンバー(IRF‐1〜‐9)が様々な細胞型及び組織で同定された。これらのIRF分子は、IFN‐α、β、及びγによる刺激の下で、抗ウイルス防御、免疫応答/調節、及び細胞成長調節において役割を果たしている。IRF‐1及び‐2は、多くのIFN‐γ誘導性遺伝子の調整に関与する作動薬‐拮抗薬対として機能することが示されている。興味深いことに、IFN‐γは、BH mRNA発現を顕著に抑制した(図20A及びB)。ノックダウン及び部位特異的突然変異誘発分析では、IRF‐1/2結合部位がBH発現のIFN‐γ媒介性抑制に関与することを確認した(図20B及びC)。これらの結果は、IRF‐1/2がヒトケラチノサイトにおけるBH遺伝子のIFN‐γ媒介性下方調節のメディエーターであることを明確に示している。その一方で、Th2サイトカインであるIL‐4及びIL‐13は、24時間のインキュベーションの間、直接的な作用をまったく示さなかった(図20A)。しかしながら、これらのTh2サイトカインは、アクチベーター分子であるMZF‐1及びSp‐1の発現を有意に抑制した。よって、Th2サイトカインがBH発現を負に調節するのは妥当なことである。
Claims (9)
- 候補薬剤が、対照薬剤と比較してブレオマオシン水解酵素の発現及び/又は活性を有意に亢進する場合に、当該候補薬剤をアトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤と評価する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の改善剤をスクリーニング評価する方法。
- ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記発現及び/又は活性が有意に亢進していると判断される、請求項1に記載の方法。
- ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に対する、転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び/又はGATA-1の結合活性が対照のものと比較して有意に亢進している場合に、前記転写活性が有意に亢進していると判断される、請求項2に記載の方法。
- 皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び/又は活性を有意に亢進させることによる、アトピー性皮膚炎による乾燥肌を改善又は予防する方法。
- ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性を亢進させることで前記発現及び/又は活性が有意に亢進される、請求項4に記載の方法。
- ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に対する、転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び/又はGATA-1の結合活性を亢進させることで前記発現及び/又は活性が有意に亢進される、請求項5に記載の方法。
- 皮膚組織におけるブレオマオシン水解酵素の発現及び/又は活性が、対照の皮膚のものと比べ有意に低下している場合に、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向があると診断し、対照の皮膚のものと比べ同程度以上であるなら、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の傾向がないと診断する、アトピー性皮膚炎による乾燥肌の素因を診断する方法。
- ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の転写活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記発現及び/又は活性が有意に低下していると判断される、請求項7に記載の方法。
- 転写因子IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, 及び/又はGATA-1の結合活性が対照のものと比較して有意に低下している場合に、前記転写活性が低下していると判断される、請求項8に記載の方法。
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