201130527 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明爲有關具有抗血液凝固作用之親水性高分子化 合物。 【先前技術】 爲凝固血液所必要之血液凝固反應雖爲有種種血液凝 固因子參與之極複雜之反應，但於血小板參與之一次止血 之階段，如凝血酶等血液凝固因子參與而血纖維蛋白安定 強化之凝固血栓形成之階段特別重要。 血液凝固反應爲雖爲對因外傷等之出血誘導止血所不 可或缺，另一方面，於人工透析中血液和外循環回路等醫 療器材或醫療材料之接觸而進行血液凝固反應時，也有由 所形成之凝固血栓而發生循環壓力之上昇或血管之閉塞之 危險性。 減輕這些危險性之方法，雖已知對接受人工透析之患 者預先投與抗血液凝固劑肝素來預防血液凝固之方法，但 肝素之過剩投與有副作用，和投與量之管理煩雜，不能適 用於出血傾向之患者等諸多問題。 最近爲回避這些問題，將包括肝素具有抗血液凝固作 用之化合物固定化於血液回路等之醫療器材或醫療材料之 表面，來防止治療中血液凝固之嘗試之報告（專利文獻1〜 9)。 201130527 先前技術文獻 專利文獻 專利文獻1 特表2003-507082號公報 專利文獻2 特開2001-213984號公報 專利文獻3 特表2004-525888號公報 專利文獻4 特開2006-291193號公報 專利文獻5 國際公開第08/03 275 8號公報 專利文獻6 特開2009-225824號公報 專利文獻7 特開2010-082067號公報 專利文獻8 特開2 0 0 7 - 1 8 1 6 9 1號公報 專利文獻9 特開2007-181692號公報 【發明內容】 發明欲解決之課題 但作爲具有固定化於血液回路等之醫療器材或醫療材 料之表面之抗血液凝固作用之化合物，於血小板參與一次 止血之階段和血液凝固因子參與凝固血栓形成之雙方階段 中能阻礙血液凝固反應之具體化合物仍未開發爲現狀。又 即使欲將以往之具有抗血液凝固作用之化合物固定化於醫 療器材或醫療材料之表面，也難以充分保持抗血液凝固活 性之狀態固定化，即使固定化成功之場合，治療中固定化 之化合物由醫療器材或醫療材料脫離，而溶出於血液中之 問題。且血小板參與一次止血之階段和血液凝固因子參與 凝固血栓形成之雙方階段中爲阻礙之血液凝固反應使用複 -4- 201130527 數化合物之場合，必須控制化合物間之競爭吸著或固定化 比率，其作業極煩雜。 於是本發明爲以提供於血小板參與之一次止血之階段 和血液凝固因子參與之凝固血栓形成之雙方階段中能阻礙 血液凝固反應，能於醫療器材或醫療材料之表面以保持抗 血液凝固活性之狀態穩定地固定化之親水性高分子化合物 爲目的。 解決課題之手段 本發明者爲解決上述課題而致力檢討之結果，發現於 阻礙血小板附著之高分子化合物結合將血液凝固反應阻礙 之化合物之親水性高分子化合物呈示顯著抗血液凝固作 用’且對醫療器材或醫療材料之表面能實現穩定之固定化。 也即本發明爲提供阻礙血小板附著之高分子化合物， 與阻礙血液凝固反應之化合物結合之親水性高分子化合 物。 阻礙上述血小板附著之高分子化合物爲由疏水性高分 子與親水性高分子而成之共聚物，以對聚甲基丙烯酸甲酯 之吸著量爲〇. 1 pg/mm2以上較佳，尤其由乙二醇、乙酸乙 烯酯、乙烯吡咯啶酮' 丙二醇、乙烯醇及矽氧烷而成之群 選擇之單體之共聚物較佳’尤其以聚醚變性聚矽氧烷更佳。 上述阻礙血液凝固反應之化合物以具有抗凝血酶能較 佳’尤其以如下式（I)化合物較佳，尤其（2R，4R)-4 -甲基 -l-((2S)-2-{[(3RS)-3-甲基- l，2,3,4-四氫喹啉-8-基]磺醯基} 胺基-5-胍戊醯基）哌啶-2-羧酸更佳。 -5- (I)201130527 Η
ΗΝ Ν、 R1 Ο [式中 或稠合多環 以低級烷基 又本發 有抗血液凝 本發明 療材料。 發明之效果 依本發 血液凝固因 固反應，可 固活性之狀 合物可作爲 表面處理劑 【實施方式 實施發明之 本說明 本發明 著之高分子 NH2 ，R1爲（2R,4R)-4 -烷基-2-羧哌啶基，R2爲苯基 式化合物殘基，該稠合多環式化合物殘基爲可 或低級烷氧基或低級烷基取代之胺基取代]。 明爲提供含有上述親水性高分子化合物，而具 固作用之醫療器材或醫療材料之表面處理劑。 更提供用上述表面處理劑處理之醫療器材或醫 明可顯著阻礙血小板參與之一次止血之階段和 子參與之凝固血栓形成之階段中雙方之血液凝 於醫療器材或醫療材料之表面以保持抗血液凝 態穩定地固定化。又本發明之親水性高分子化 對醫療器材或醫療材料附與抗血液凝固作用之 來利用。 形態 書使用之用語除特別規定外，皆依如下定義。 之「親水性高分子化合物」乃以阻礙血小板附 化合物，與阻礙血液凝固反應之化合物結合爲 -6- 201130527 特徴。在此「親水性」乃指化合物爲 水溶性也由靜電相互作用或氫結合而 又本發明之「親水性高分子化合物」 乙酸乙烯酯、乙烯吡咯啶酮、丙二醇 成之群選擇之單體之共聚物，與如下 水性高分子化合物。
[式中，R1爲（2R，4R)-4-烷基-2-殘 稠合多環式化合物殘基，該稠合多環 以低級烷基或低級烷氧基或低級烷基 「阻礙血小板之附著之高分子化 適合性，可將其高分子化合物於醫療 面存在，則可抑制血小板附著於基材 均分子量爲1 00 0以上之高分子化合乘 「阻礙血小板附著之高分子化合 烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙二醇、 矽氧烷而成之高分子化合物、聚乙烯 乙烯胺、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯胺、 丙烯酸羥乙酯或這些高分子化合物之 共聚物或接枝體，惟爲使阻礙血液 水溶性’或即使爲非 與水分子相互作用。 可爲例如由乙二醇、 、乙嫌醇及矽氧烷而 式（I)化合物結合之親 R1 (I) 哌啶基，R2爲苯基或 式化合物殘基爲也可 取代之胺基取代]。 合物」乃指具有血液 器材或醫療材料之表 或材料之表面，數平 7} ° 物」可爲例如由聚乙 聚丙二醇、聚醚與聚 亞胺、聚烯丙胺、聚 聚丙烯醯胺或聚甲基 單體，與其他單體之 凝固反應之化合物結 201130527 合，以具有胺基、羧基、羥基、乙氧基或氫硫基較佳，爲 吸著於醫療器材或醫療材料之表面，以由疏水性高分子和 親水性高分子而成之共聚物更佳，由親水性高之聚醚與聚 矽氧烷而成之高分子化合物、部分鹼化聚乙烯醇或乙烯吡 咯啶酮與乙酸乙烯酯之共聚物最佳》 「由聚醚與聚矽氧烷而成之高分子化合物」可爲例如 聚醚與聚矽氧院之共聚物、聚合物錯合物或聚合物混合 物。聚醚與聚矽氧烷之共聚物爲由聚醚單元與聚矽氧烷單 元而成，這些之共聚合形態雖無規共聚物、塊狀共聚物或 辑枝共聚物皆可，尤其以親水性高之聚醚變性聚矽氧烷較 佳。 「聚醚」可爲例如聚氧乙烯或聚氧丙烯由來之構造。 在此’ 「聚醚」乃指如下式（Π)構造（R3爲碳數6以下之烷 基）、聚醚之一例之「聚丙二醇由來之構造」乃指如下式（111) 構造。
(III) 「聚醚變性聚矽氧烷」乃指於聚矽氧烷鏈之側鏈結合 聚醚單元之聚矽氧烷，惟也可更予以胺基變性或羧基變性 之聚醚變性聚矽氧烷。 -8- 201130527 若阻礙血小板附著之高分子化合物爲部分鹼化聚乙烯 醇時，其鹼化度由操作容易性或適宜親水性之觀點，以小 於50〜lOOmol%較佳’若74〜99.9mol%更佳’尤其以78 〜9 5 m ο 1 %最佳。在此’ 「鹼化度」乃指以如下式1算出之 數値。 鹼化度=m/(n + m)xl〇〇......式 1 m:聚乙烯醇中之如下式（IV)構造之數 η:聚乙烯醇中之如下式（V)構造之數
阻礙血小板附著之高分子化合物爲乙烯吡咯啶酮與乙 酸乙烯酯之共聚物時，由操作容易性或適宜親水性之觀 點，以乙烯吡咯啶酮單元爲5 〇單元莫耳％以上較佳，尤其 60單元莫耳％以上更佳。另一方面’由對基材之吸著量適 宜之觀點，乙烯吡咯啶酮單元以小於1 〇〇單元莫耳％較佳。 又乙烯吡咯啶酮與乙酸乙烯酯之共聚物中乙烯吡咯啶酮單 元所佔比例（單元莫耳％)可將共聚物以1h-nmr測定（溶 劑：CDC13)來算出。 201130527 對醫療器材或醫療材料等基材之阻 分子化合物之吸著量以0.1 pg/mm2以上 以上更佳’尤其10pg/mm2以上最佳。 上述吸著量乃依如下方法測定。首 片（Sensor Chip Au; GE保健公司）以表 裝置（以下稱「SPR」）（BIACORE3000; 處理（2 5°C之蒸餾水、流速20μ1/ιηίη、1 信號値（RU: resonance unit)。 「基材」，也即被吸著素材乃溶解ί 重量％被吸著素材溶液。將此被吸著素 機之前處理過.之偵測片之金膜部分之中 溫下立即以3000rpm回轉1分鐘，而於 素材。 確認於偵測片上無液滴後，用S P R 洗淨（25°C、流速 20μ1/πιίη、10 分鐘） %Triton-Xl 00溶洗淨液3回（25°C、流速 測定洗淨終了起1 0分鐘後之信號値。 由如上述所得偵測片之內，選別轉 爲3 000〜8000之範圍者，以蒸餾水 20μ1/ιηίη、10分鐘）後，更以0.025重量 洗淨3回（25°C、流速20μ1/ιηίη、1分鐘 礙血小板附著之高 較佳，以 lpg/mm2 先將未處理之偵測 面質粒基因組共振 GE保健公司）來前 〇分鐘），而測定其 冷溶劑，而調製0.5 材溶液於裝在轉塗 心滴下1滴，於室 偵測片被覆被吸著 將偵測片以蒸餾水 ，更以 0_025重量 20μ1/ηιίη、1 分鐘）， 塗前後之信號値差 洗淨（2 5°C 、流速 % T r i t ο η - X 1 〇 〇 溶液 )° -10- 201130527 洗淨終了之10分鐘後，將吸著於基材之親水性高分子 化合物水溶液（濃度：注入（25°C、流速20μ1/πιίη、 1分鐘），以蒸餾水洗淨（25°C、流速20μ1/πιίη、3分鐘）。將 注入開始即前之信號値（以下稱「信號値A」），與注入終了 起3分鐘後之信號値（以下稱「信號値B」）之差求出，作爲 lRU = lpg/mm2 換算。 續以蒸餾水洗淨（25°C、流速20Ml/min、2分鐘），更以 0.025重量％Triton-X100溶液洗淨 3 回（25°C 、流速 20μ1/Γηίη、1分鐘）後，再將吸著之親水性高分子化合物水 溶液（濃度：lOOpg/ml)注入（25°C、流速20μ1/ιηίη、1分鐘）。 以下，重複同樣之作業，求出計5回之信號差（信號値Α與 信號値B之差），將其平均値作爲「對基材阻礙血小板附著 之高分子化合物之吸著量」。 「阻礙血液凝固反應之化合物」乃指具有如抗凝血酶 能之抗血液凝固能之化合物，更具體而言，於血液將其化 合物添加成l〇Hg/mL之濃度時，凝血酶原時間與空白之血 液比較延長3 0 %以上之化合物。 「凝血酶原時間」爲依公知之文獻（金井正光等、「臨 床檢査法提要改訂第30版」、金原出版、1993年、 p.416-418)記載之方法來測定。具體而言，混合3.2%檸檬 酸鈉1容量與血液9容量，將分取之檸檬酸血漿〇.imL採 入小試驗管（內徑8 mm、長7,5 cm)，移入3 7 °C之恒溫水槽 而加熱3分鐘後’添加保溫3 7 »C之組織促凝血酶原激酶. 201130527 鈣試藥〇.2mL，將小試驗管輕輕震盪後，靜置而邊傾斜邊 將血纖維蛋白析出。在此，測定將組織促凝血酶原激酶· 鈣試藥添加至血纖維蛋白析出之時間，將此作爲「凝血酶 原時間」。 「阻礙血液凝固反應之化合物」可爲例如肝素、那法 莫斯特甲擴酸鈉（Nafamostat Mesylate)、檸檬酸鈉、草酸 鈉、αΐ抗胰蛋白酶、α2巨球蛋白、C1阻礙劑、血检調節 蛋白（thrombomodulin)、蛋白質C、具有胍基構造之化合 物、前列腺素、水蛭素、Xa阻礙劑、組織因子阻礙劑或抗 凝血酶，惟以具有抗凝血酶能之化合物較佳。 「具有抗凝血酶能之化合物」乃指與凝血酶之結合親 和性高之化合物。 評價化合物之抗凝血酶能之指標可爲例如基於被檢溶 液之吸光度値由Lineweavei-Burk plot算出之阻礙定數（以 下稱「Ki」）。Ki越小，與凝血酶之結合親和性越高、表示 抗凝血酶能高。 「具有抗凝血酶能之化合物」可爲例如具有胍基構造 之化合物，惟以（2R，4R)-4-甲基-l-((2S)-2-{[(3RS)-3-甲基 -1，2,3，4-四氫喹啉-8-基]磺醯基}胺基-5-胍戊醯基）哌啶- 2-羧酸（以下稱「阿加曲班（argatroban)」）較佳。阿加曲班爲 於1 97 8年合成之具有精胺酸衍生物之選擇性抗凝血酶能 之醫藥化合物。 -12- 201130527 又本發明之醫療器材或醫療材料之表面處理劑爲含有 上述親水性高分子化合物，而以具有抗血液凝固作用爲特 徴。 「醫療器材或醫療材料」可爲例如內藏於埋入型人工 臓器、人工血管、導管、支架、血液袋、隱形眼鏡、眼內 透鏡或手術用補助器具或活體成分分離用模組或血液淨化 用模組等之分離膜或吸著劑。 使用上述表面處理劑來表面處理醫療器材或醫療材料 之方法，也即將其有效成分之上述親水性高分子化合物於 醫療器材或醫療材料之表面固定化之方法可爲例如於醫療 器材或醫療材料接觸上述表面處理劑，於此照射放射線之 方法.。又放射線之種類以電子線、γ線較佳。 「醫療器材或醫療材料」之素材可爲例如纖維素、纖 維素乙酸酯、聚羧酸酯、聚颯、聚醚碾、聚甲基丙烯酸甲 酯（以下稱「ΡΜΜΑ」）等之聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、 聚醯胺、聚二氟乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、聚酯、聚胺 甲酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚二氟乙烯、聚甲 基戊烯或聚亞胺。 實施例 以下舉實施例詳細說明本發明，惟本發明不受這些限 定。 •13- 201130527 (實施例1 :胺基·聚醚變性聚矽氧烷與阿加曲班之結合） 將阿加曲班5mmol採入茄型燒瓶，而添加無水二甲基 甲醯胺（以下稱「無水DMF」）10mL來溶解後，將茄型燒瓶 邊冰冷邊滴下4N鹽酸/1,4 -二噚烷（東洋化成公司）l〇mL， 而攪拌1小時。次以回轉蒸發器蒸除溶劑，更於真空乾燥 機中乾燥一晚，而添加無水DMF2 5mL，作成argatroban鹽 酸鹽/無水DMF溶液。 於如表1所示份量於雙頸燒瓶採入阿加曲班鹽酸鹽/無 水DMF溶液，於冰冷下邊攪拌邊將二環己基羧二亞胺（以 下稱「DCC」）/無水DMF溶液及4-羥基苯并三唑（以下稱 「HOBt」）/無水DMF溶液分別添加，更添加聚醚變性聚矽 氧烷（X-22-3939A;信越化學公司），而於室溫反應3日。 次將反應液投入透析管（譜孔RC孔6 MWCO= 1 000)，於反 應液之超過10倍體積量之蒸餾水中適宜將蒸餾水邊交換 邊透析3日。將透析後之反應液過濾，將濾液之溶劑以回 轉蒸發器蒸除後於真空乾燥機中乾燥一晚，得親水性高分 子化合物（以下稱「實施例1化合物」）。 (實施例1化合物之抗凝血酶能之測定） 測定使用ECA-T套組（HaemoSys公司）。於實施例1化 合物100 μί添加蒸餾水900 pL，來調製實施例1化合物水 溶液。採集實施例1化合物水溶液3 0μΙ>，混合ECA凝血酶 原緩衝液1〇〇μί及ECA-T基質25μ[，而於37°C保溫60秒 後，設置於裝置（COATRON Ml(code 8 0 8 00 000);
Production公司），更添加ECAecarin試劑50pL來測定。 -14- 201130527 將使用乙醇/鹽酸（體積比率4/1)混合溶劑來調製成任 意濃度之阿加曲班溶液20μί而與人血漿混合者，或 .將空白之蒸餾水20μί與人血漿80μί混合者，上述實施例 1化合物水溶液代之以E C A - Τ套組來分別測定，這些結果 作成檢量線。將基於檢量線而算出之實施例1化合物水溶 液之阿加曲班相當濃度14SM.3重量ppm，作爲實施例1化 合物水溶液之抗凝血酶能之所示値。 (實施例2〜1 3 ) 除對於阿加曲班鹽酸鹽之DCC'HOBt及聚醚變性聚矽 氧院（X-22-3939A)之莫耳比及對聚醚變性聚矽氧烷之無水 DMF之體積比變更之外，與實施例1同一方法分別得實施 例2〜1 3化合物’來測定這些之抗凝血酶能。對於阿加曲 班鹽酸鹽、DCC、HOBt及聚醚變性聚矽氧烷（χ_22_3939Α) 之莫耳比及實施例2〜1 3化合物分別之抗凝血酶能之測定 結果如表1 β -15- 201130527 [表1] 化合物 對阿加曲班鹽酸鹽1.00之莫耳比 對聚醚變性 聚矽氧烷1之 無水DMF之 體積比 阿加曲班 相當濃度 (重量I>pm) DCC HOBt X-22- 3939A 實施例1 1.07 1.06 0.060 - 1494.3 實施例2 1.04 1.04 0.060 - 831.2 實施例3 0.20 0.20 0.060 1.4 6610.7 實施例4 0.20 0.20 0.030 3.9 8393.3 實施例5 1.29 1.27 0.493 1.8 505.3 實施例6 1.29 1.27 0.203 4.3 771.7 實施例7 1.29 1.27 0.101 8.6 606.7 實施例8 1.29 1.27 0.067 13.0 441.7 實施例9 1.29 1.27 0.049 17.6 436.7 實施例10 1.29 1.27 0.020 42.9 738.9 實施例11 1.29 1.27 0.010 88.2 895.0 實施例.12 1.00 1.00 0.060 - 6000.0 實施例13 1.00 1.00 0.060 40.0 5999.4 又就聚醚變性聚矽氧烷（X-22 -3 93 9 A)也同樣測定抗凝 血酶能，但其値與空白之蒸餾水無變，可確認聚瞇變性聚 砂氧院本身不具有抗凝血酶能。 (實施例1化合物之凝血酶阻礙定數之測定） 將牛凝血酶液（伊藤生命科學公司）10000U溶解於生理 食鹽水lmL，來調製牛凝血酶水溶液。 將S-223 8貯備液（積水醫學公司）25mg溶解於蒸餾水 40mL，來調製S-22 3 8貯備水溶液。 使用稀釋緩衝液（0.05M Tris，0.1M NaCl，lmg/mL 牛 血清蛋白素（BSA),PH 7.4)，來分別稀釋牛凝血酶水溶液、 S - 2 2 3 8貯備水溶液及上述之實施例1化合物水溶液。 -16- 201130527 於96穴盤分注S-2238貯備水溶液之稀釋液10〇μί及 實施例1化合物水溶液之稀釋液50 μί，將封於設定後37°C 之恒溫乾燥機加溫30分鐘。次於37 °C將加溫30分鐘之牛 凝血酶水溶液之稀釋液更分注5 0 μί，立即以微盤讀機（測 定波長4 05 ηιη、參照波長59 5nm)測定其吸光度。 第1次之吸光度測定終了後，立即施行第2次之吸光 度測定。第3次以後之吸光度測定乃由牛凝血酶水溶液之 稀釋液之分注起4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20分鐘 後分別施行。由所得各吸光度之値，將 Ki依 Lineweaver-Burkplot算出。實施例1化合物之Ki爲21nM。 又就聚醚變性聚矽氧烷（X-2 2- 3 9 3 9A)也同樣算出Ki， 惟不具有抗凝血酶能之聚醚變性聚矽氧烷之Ki仍然與空 白同値。 且就阿加曲班同樣算出Ki，結果Ki爲42nM，與實施 例1化合物之Ki比較，成2倍以上之數値。 由這些結果，上述親水性高分子化合物與凝血酶之結 合親和性極高，對以中空絲型透析器爲首之醫療器材或醫 療材料，遠較以具有抗凝血酶能而知悉之阿加曲班優異， 確能附與顯著抗凝血酶能。 (PMMA中空絲膜模組之作製） 將定型PMMA5重量份和異位PMMA20重量份加入二 甲基亞颯7 5重量份，於11 〇。(：攪拌8小時，得製膜原液。 將此製膜原液由孔口型雙重圓筒型噴嘴吐出，於空氣中以 -17- 201130527 300mm通過後，導入水100 %之凝固浴中，得內徑〇.2mm、 膜厚0.03nim之PMMA中空絲。又內部注入氣體使用乾燥 氮。 與一般中空絲型透析器同樣，準備具有通過中空絲內 側之口（血液口）及通過外側之口（透析液口）各2個之內徑 1 0 m m、長1 2 0 m m之模組箱。 將上述Ρ Μ Μ A中空絲束集5 0條作爲Ρ Μ Μ A中空絲膜， 邊注意PMMA中空絲膜之中空部不閉塞，邊將其兩末端以 乙氧基系罐燒劑固定於上述模組箱後，將PMMA中空絲膜 及模組箱內部以蒸餾水洗淨，得第1圖所示模組6。 (對PMMA中空絲膜之實施例1化合物之固定化） 將Bis-Tris(同仁化學公司）及氯化鈉分別呈最終濃度 爲0.25M及0.5M地溶解於超純水，於此滴下6N鹽酸來調 整爲pH5，而調製5倍濃度之Bis-Tris緩衝液。 將殘存於製作模組6之血液接觸側（PMMA中空絲膜內 側）和血液非接觸側（PMMA中空絲膜外側）之蒸餾水以壓縮 空氣去除。次將阿加曲班濃度相當4000重量ppm相當之實 施例1化合物水溶液、丙二醇及5倍濃度之Bis-Tris緩衝 液以體積比率5/3/2混合，得塡充液。 將上述塡充液400μί使用注射筒只塡充於模組6之血 液接觸側。其後由壓縮空氣去除塡充液後，於血液口 1 a、 lb及透析液口 2a、2b皆密栓之模組6將吸收線量25kGy 之γ線照射約3小時。 -18- 201130527 使用Peristapump(註冊商標）8，於PMMA中空絲膜4 及模組6之內部將0.0 2 5重量％聚氧乙烯辛基苯基醚水溶液 以流速1 OmL/min通液8小時，來洗淨PMMA中空絲膜4 及模組6之內部。其後將蒸餾水及生理食鹽水皆以流速 1 OmL/min各通液30分鐘來再洗淨，得實施例1化合物被 固定化之模組（以下稱「實施例1模組」）。 另一方面，除阿加曲班相當濃度4000重量ppm相當之 實施例 1化合物水溶液代之以聚醚變性聚矽氧烷 (X-22- 3 9 3 9A)以外，施行與上述同樣之操作，得聚醚變性 聚矽氧烷非固定化之模組（以下稱「比較例1模組」）。 (活體外血液循環試驗） 將由志願者提供之血液與檸檬酸依體積比率 9/1混 合，得加血檸檬酸。對加血檸檬酸lmL，作爲凝固促進劑 將鈣克康（calcium gluconate)436pL添加者作爲被驗血液。 將矽酮管7a、7b接續於實施例1模組，於矽酮管7b 之途中設置Peristapump8。由血液口 la接續之砂P管7a 將被驗血液以流量〇.9mL/min通液5秒，血液口 lb流出之 被驗血液乃此矽酮管7b廢棄，而去除PMMA中空絲膜內 部之氣泡。續將矽酮管7a和7b以包接部9接續，作成如 第2圖所示閉鎖系回路。 以流量〇.9mL/min開始被驗血液之循環，於回路內生 成之凝固血栓而回路內壓上昇，測定由包接部9脫離矽酮 管7a或7b之循環繼續時間。使用實施例1模組時之循環 繼續時間爲46分鐘。 -19- 201130527 於PMMA中空絲膜準備任何化合物也無固定 6 (以下稱「比較例2模組」）’施行與上述同樣之 試驗。於此場合之循環繼續時間爲2 0分鐘’爲使 1模組時之一半以下之値。由這些結果明白上述 分子化合物對以中空絲型透析器爲首之醫療器材 料可附與優異抗血液凝固作用。 又使用比較例1模組施行與上述同樣之血液 時之循環繼續時間爲20分鐘’與使用於PMM A 無任何化合物被固定化之比較例2模組之場合無 (實施例1化合物之溶出量之測定） 於別途作成之實施例1模組之血液口 1 b 0.8mm、長 5 2 0mm 之砂酮管 7b，於其途 Peristapump8。於血液口 la接續內徑0.8mm、長 矽酮管7a。其後將矽酮管7a及7b之各他端插入 漿 5mL 之聚苯乙烯圓管（Code : 3 5 20 5 4 ; DICKINSON公司）1〇，而製作第3圖所示循環回j 使用 Peristapump8，而將人血漿中以流速< 循環4小時後，將聚苯乙烯圓管1〇內之人血漿中 1化合物濃度使用ECA-T套組來測定。但循環後 之實施例1化合物濃度爲ECA-T套組之檢出限界 法確認由實施例1模組之實施例1化合物之溶出 乃示上述親水性高分子化合物對以中空絲型透析 醫療器材或醫療材料，可能予以穩定之固定化。 化之模組 血液循環 用實施例 親水性高 或醫療材 循環試驗 中空絲膜 變。 接續內徑 :中設置 1 6 0 m m 之 裝有人血 BECTON 珞。 ).5 m L/m i η 之實施例 人血漿中 •以下，無 。此結果 器爲首之 -20- 201130527 (具有抗血小板附著能之高分子化合物之吸著量評價） 構成上述親水性高分子化合物之阻礙血小板附著之高 分子化合物之一之作爲乙烯吡咯啶酮及乙酸乙烯酯之共聚 物（以下稱「VA系共聚物」），準備PVP(K-90)、VA73、VA64、 VA55、VA37(皆BASF公司）。同樣，阻礙血小板附著之高 分子化合物之一之作爲部分鹼化聚乙烯醇，準備PVA21 7、 PVA417、PVA2 0 5 c(皆可樂麗公司）。且作爲聚醚變性聚砂 氧烷準備 F114、 F244、 F303、 F3031、 F348、 F350s、 F502 、 F506 ' X-22-3 93 9A(皆信越聚矽氧烷公司）。又準備之 VA 系共聚物、部分鹼化聚乙烯醇及聚醚變性聚矽氧烷皆以蒸 餾水稀釋，而調製10000重量ppm之水溶液。 另一方面，作爲比較對象，構成上述親水性高分子化 合物，作爲不包括於阻礙血小板附著之高分子化合物之高 分子化合物，準備 PEG2000、 PEG4000、 PEG6000、 PEG20000(皆半井科技公司）及PEG甲基醚（PEG-em)、PEG 二甲基醚（PEG-dm)(皆SigmaAldrich公司）。又準備之高分 子化合物皆以蒸餾水稀釋，而調製成1 0000重量ppm之水 溶液。 作爲將阻礙血小板附著之高分子化合物吸著之被吸著 素材之0.5重量％溶液，分別調製PMMA(重量平均分子量 93000; Sigma Aldrich公司）/甲苯溶液、聚胺甲酸酯/二甲 基乙醯胺溶液、聚颯（Solvay公司製 Udel(註冊商 標）P-3500)/二甲基乙醯胺溶液、聚氯乙烯（重量平均分子量 -2 1- 201130527 80000; SigmaAldrich公司）/四氫呋喃溶液、聚苯乙烯（Wako 公司）/氯仿溶液及聚羧酸酯（重量平均分子量20000 ;帝人 公司）/氯仿溶液。 對分別之被吸著素材，測定種種阻礙血小板附著之高 分子化合物之吸著量。結果如表2所示。 [表2] 信號値B-信號値A[pg/mm2] 阻礙血小板附著之高分子化合物 被吸著素材 PMMA 聚颯 聚胺甲酸酯 聚氯乙嫌 聚苯乙烯 聚羧酸酯 PVPK90 789 • - _ _ VA37 2760 _ _ _ VA55 472 • • VA64 920 _ • _ _ _ VA73 426 _ • • • • PVA217 2529 2886 1635 2468 2777 2356 PVA417 2475 2742 1911 2330 2662 2346 PVA205C 2223 2130 1411 1796 1989 1819 F114 1003 844 514 739 621 756 F244 1639 1272 1144 1118 1052 1243 F303 1268 1156 1604 1037 _ 1374 F3031 947 559 614 418 339 536 F348 875 784 756 608 283 800 F350s 751 657 674 544 275 591 F502 827 657 696 385 197 482 F506 691 308 437 167 43 279 X-22-3939A 1182 910 1204 695 924 1424 PEG2000 2 _ • _ PEG4000 2 _ • 焉 PEG6000 5 • • • PEG20000 113 - _ PEG-me 5 • _ • PEG-dm 67 - - - - - -22- 201130527 由表2之結果明白，構成上述親水性高分子化合物之 阻礙血小板附著之高分子化合物不限於聚醚變性聚矽氧烷 (X-22-3 93 9A) ’對中空絲型透析器爲首之醫療器材或醫療 材料可能呈強固之吸著。 (抗血小板附著能之評價） 將別途製作之實施例1模組之模組箱以超音波刀切 斷’取出實施例1化合物被固定化之Ρ Μ Μ A中空絲膜（以下 稱「實施例1中空絲膜」）。 於直徑18mm之聚乙烯酞酸酯製之圓形薄膜之片面貼 附雙面膠帶，於此將實施例1中空絲膜固定後，將固定之 PMM A中空絲膜呈半圓筒狀切取，使其內表面露出。於切 成筒狀之Falcon(註冊商標）圓筒管（18mm(p、No.2051)之內 部，放入固定於圓形薄膜之實施例中空絲膜，將圓筒管和 圓形薄膜之隙間以石蠟薄膜封止。其後，此圓筒管內以生 理食鹽水生理食鹽水充滿。 於預先採集肝素之採血管，注入採集即後之志願者之 靜脈血而轉倒混和，來調製加血肝素。又加血肝素之肝素 濃度作成50U/mL。 將上述圓筒管內之生理食鹽水廢棄後，將加血肝素注 入l.OmL，而於37°C震盪1小時。次將上述圓筒管內之實 施例1中空絲膜以1 〇mL之生理食鹽水洗淨後，將含有2 . 5 體積％之戊二醛之生理食鹽水施行添加血液成分之固定， 更以蒸餾水洗淨。其後，由上述圓筒管拆除將實施例1中 -23- 201130527 空絲膜固定之圓形薄膜’將固定實施例中空絲膜之圓形薄 膜以常溫、0.5 Τ 〇 rr絶對壓減壓乾燥1 2小時。 將減壓乾燥後之固定實施例1中空絲膜之圓形薄膜， 於掃描型電子顯微鏡之試料台以雙面膠帶貼附後，由噴濺 將鈾/鈀薄膜形成於實施例中空絲膜表面。將於表面形成鉛 /鈀薄膜之實施例中空絲膜之長方向中中央附近之內表 面’使用磁場發射型掃描型電子顯微鏡（S80〇;日立製作 所）’以倍率1 500倍觀察，計數1視野中（4.3 χ103μπι2)之附 著血小板數。 將於不同視野之附著血小板數之平均値之整數値，作 爲血小板附著數（個/4·3χ103μιη2)，結果對實施例1中空絲 膜之附著血小板數爲1個。 另一方面，將別途製作之比較例2模組之模組箱以超 音波刀切斷，取出任何化合物也無固定化之中空絲膜（以下 稱「比較例2中空絲膜」），就此也同樣確認血小板附著數 之結果，比較例2中空絲膜之附著血小板數爲1 00個以上。 由這些結果明白，上述親水性高分子化合物對以中空 絲型透析器爲首之醫療器材或醫療材料’可能附與顯著抗 血小板附著能。 (全血凝固時間之測定） 將由志願者採集之血液與檸檬酸依體積比率9/1混合’而 調製加血檸檬酸。 -24- 201130527
於 Cuvette(NON-ACTIVATED CLOTTING TEST KIT) 採入生理食鹽水18μί，於此加耗克康（calcium gluconate) 1 4.8pL，更添力Q力[I血檸檬酸342jaL，而測定Sonoclot血液 凝固/血小板機能分析裝置（I.Μ.I公司）、所得ACT ONSET 値作爲全血凝固時間。由志願者採集之血液之全血凝固時 間爲5 4 5秒。 將生理食鹽水代之以2、1 0、2 0 μ Μ之阿加曲班溶液（溶 劑爲甲醇/鹽酸（體積比率4/1))，分別使用來同樣測定結 果，全血凝固時間分別爲5 3 1、7 4 6、8 4 9秒。 將生理食鹽水代之以0.3、1 . 3、2.5 μΜ之實施例1化 合物水溶液，分別使用來同樣測定結果，全血凝固時間分 別爲 5 2 7、6 93、7 3 0 秒。 (實施例14:乙酸乙烯酯-乙烯吡咯啶酮共聚物與阿加曲班 之結合） 於螺旋槳瓶採入四氫呋喃14.9g、乙酸乙烯酯11.5g、 N-乙烯吡咯啶酮10.8g、2-胺基乙硫醇0.〇28g及吖雙異丁 腈0.0 16g，密閉後，以超音波照射10分鐘。將螺旋槳瓶一 旦開封，而將氬氣冒泡1 0分鐘，再密閉後’邊攪拌邊於 60t之湯浴1小時，更於70°C之湯浴6小時’浸泡螺旋槳 瓶，將乙酸乙烯酯和乙烯吡咯啶酮予以共聚合反應。於此 反應液添加甲醇80m L，而添加於約5倍量之乙醚中’去除 上澄。新加乙醚，去除上澄之洗淨作業重複3回後’減壓 乾燥，得乙酸乙烯酯-乙烯吡咯啶酮共聚物。將所得乙酸乙 -25- 201130527 烯酯-乙烯吡咯啶酮共聚物予以1H-NMR測定（溶劑：CDCh) 結果，乙烯吡咯啶酮單元爲60.6單元莫耳％ ^ 將所得乙酸乙烯酯-乙烯吡咯啶酮共聚物3 · 5 8 g溶解於 無水DMF20mL，來調製乙酸乙烯酯-乙烯吡咯啶酮共聚物/ 無水DMF溶液。於雙頸燒瓶採入調製之乙酸乙烯酯-乙烯 吡咯啶酮共聚物/無水DMF溶液之全量及阿加曲班鹽酸鹽/ 無水DMF溶液（0.4 9M)0.5mL，於冰冷下邊攪拌邊分別添加 DCC /無水DMF溶液（l.〇4M)0.5mL及HOBt /無水DMF溶液 (1.02M)0.5mL，於氮環境氣下，於室溫反應3日。次將反 應液注入透析管（譜孔R C孔6 M W C Ο = 1 0 0 0 )，於反應液之 超1〇倍體積量之蒸餾水中適宜將蒸餾水邊交換邊透析3 曰’將透析後之反應液過濾，濾液之溶劑以回轉蒸發器蒸 除後’於真空乾燥機中乾燥一晚，得親水性高分子化合物 (以下稱「實施例1 4化合物」）。 (實施例1 4化合物之抗凝血酶能之測定） 與實施例1化合物之抗凝血酶能之測定同樣之方法， 測定實施例1 4化合物/甲醇溶液（濃度2 0重量％ )，將算出 之實施例 1 4化合物/甲醇溶液之阿加曲班相當濃度 l〇4」ppm作爲實施例14化合物/甲醇溶液之抗凝血酶能所 示値。 由這些結果明白，上述親水性高分子化合物與具有抗 凝血酶能之知悉之阿加曲班比較，即使爲極低濃度也可能 延長全血凝固時間，對以中空絲型透析器爲首之醫療器材 或醫療材料，可能附與優異抗血液凝固作用。 -26- 201130527 產業上之利用可能性 本發明爲可用於對以中空絲型透析器爲首之醫療器材 或醫療材料，可能附與優異抗血液凝固作用。 【圖式簡單說明】 第1圖顯示實施例製作之模組之槪略圖。 第2圖爲活體外血液循環試驗之閉鎖系回路之槪略圖。 第3圖爲親水性高分子化合物之溶出量之測定中，人 血漿循環回路之槪略圖。 【主要元件符號說明】 la、 lb 血液口 2a > 2b 透析液口 3 模組箱 4 Ρ Μ Μ A中空絲膜 5 罐燒劑 6 模組 7a ' 7b 矽酮管 8 peristapump 9 包接部 10 聚苯乙烯圓管 -27-