KR20120088813A

KR20120088813A - 항혈액응고 작용을 갖는 친수성 고분자화합물

Info

Publication number: KR20120088813A
Application number: KR1020127014284A
Authority: KR
Inventors: 히로카즈 사카구치; 유카 사카구치; 카즈히로 타나하시
Original assignee: 도레이 카부시키가이샤
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2010-12-22
Publication date: 2012-08-08
Also published as: US20120271010A1; CA2780028A1; EP2518100A4; CN102656213A; JPWO2011078208A1; WO2011078208A1; EP2518100B1; TW201130527A; KR101458485B1; JP5673525B2; CA2780028C; RU2012131580A; CN102656213B; RU2539566C2; TWI476020B; EP2518100A1

Abstract

본 발명은 혈소판이 관여하는 1차 지혈 단계와 혈액응고 인자가 관여하는 응고 혈전 형성 단계에 있어서의 쌍방의 혈액응고 반응을 저해할 수 있고, 의료기재 또는 의료재료의 표면에 항혈액응고 활성을 유지한 상태에서 강고하게 고정화할 수 있는 친수성 고분자화합물을 제공하는 것을 목적으로 하고 있다. 본 발명은 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물과 혈액응고 반응을 저해하는 화합물이 결합하고 있는 친수성 고분자화합물을 제공한다.

Description

항혈액응고 작용을 갖는 친수성 고분자화합물{HYDROPHILIC POLYMER COMPOUND HAVING ANTICOAGULATION EFFECT}

본 발명은 항혈액응고 작용을 갖는 친수성 고분자화합물에 관한 것이다.

혈액을 굳히기 위해서 필요한 혈액응고 반응은 여러 가지 혈액응고 인자가 관여하는 매우 복잡한 반응이지만 혈소판이 관여하는 1차 지혈 단계와 트롬빈과 같은 혈액응고 인자가 관여해서 피브린을 안정 강화하는 응고 혈전 형성 단계가 특히 중요하다고 여겨지고 있다.

혈액응고 반응은 부상 등에 의한 출혈을 지혈로 유도하기 위해서 불가결한 것이지만 한편으로 인공투석에 있어서 혈액과 체외순환 회로 등의 의료기재나 의료재료와의 접촉에 의해 혈액응고 반응이 진행되었을 경우에는 형성된 응고 혈전에 의해 순환 압력의 상승이나 혈관의 폐색을 일으킬 위험성도 있다.

이들 위험성을 경감하는 방법으로서 인공투석을 받는 환자에게 미리 항혈액응고제인 헤파린을 투여해서 혈액응고를 방지하는 방법이 알려져 있지만 헤파린의 과잉투여에는 부작용이 있는 점, 투여량의 관리가 번잡한 점, 출혈 경향이 있는 환자에게는 적용할 수 없는 점 등과 같은 많은 문제점이 있다.

최근에는 이들 문제점을 회피하기 위해서 헤파린을 포함한 항혈액응고 작용을 갖는 화합물을 혈액 회로 등의 의료기재나 의료재료의 표면에 고정화하여 치료 중의 혈액응고를 방지하려고 하는 시도가 보고되고 있다(특허문헌 1~9).

일본 특허 공표 2003-507082호 공보 일본 특허 공개 2001-213984호 공보 일본 특허 공표 2004-525888호 공보 일본 특허 공개 2006-291193호 공보 국제 공개 제 08/032758호 공보 일본 특허 공개 2009-225824호 공보 일본 특허 공개 2010-082067호 공보 일본 특허 공개 2007-181691호 공보 일본 특허 공개 2007-181692호 공보

그러나, 혈액 회로 등의 의료기재나 의료재료의 표면에 고정화하는 항혈액응고 작용을 갖는 화합물로서 혈소판이 관여하는 1차 지혈 단계와 혈액응고 인자가 관여하는 응고 혈전 형성 단계에 있어서의 쌍방의 혈액응고 반응을 저해할 수 있는 구체적인 화합물은 아직 개발되어 있지 않은 것이 현재의 상태이다. 또한, 종래의 항혈액응고 작용을 갖는 화합물을 의료기재나 의료재료의 표면에 고정화하려고 하여도 충분한 항혈액응고 활성을 유지한 상태에서 고정화하는 것은 곤란하고, 가령 고정화에 성공한 경우라도 치료 중에 고정화한 화합물이 의료기재나 의료재료로부터 분리되어, 혈액 중에 용출되어 버리는 문제점이 있었다. 또한, 혈소판이 관여하는 1차 지혈 단계와 혈액응고 인자가 관여하는 응고 혈전 형성 단계에 있어서의 쌍방의 혈액응고 반응을 저해하기 위해서 복수의 화합물을 사용할 경우에는 화합물 간의 경쟁 흡착이나 고정화 비율을 제어할 필요가 있고, 그 작업은 매우 번잡한 것이었다.

그래서 본 발명은 혈소판이 관여하는 1차 지혈 단계와 혈액응고 인자가 관여하는 응고 혈전 형성 단계에 있어서의 쌍방의 혈액응고 반응을 저해할 수 있고, 의료기재 또는 의료재료의 표면에 항혈액응고 활성을 유지한 상태에서 강고하게 고정화할 수 있는 친수성 고분자화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물에 혈액응고 반응을 저해하는 화합물을 결합시킨 친수성 고분자화합물이 현저한 항혈액응고 작용을 나타내고, 또한 의료기재나 의료재료의 표면에 대하여 강고한 고정화를 실현할 수 있는 것을 발견했다.

즉, 본 발명은 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물과 혈액응고 반응을 저해하는 화합물이 결합하고 있는 친수성 고분자화합물을 제공한다.

상기 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물은 소수성 고분자와 친수성 고분자로 이루어지는 공중합체이고, 폴리메타크릴산 메틸에 대한 흡착량이 O.1pg/㎟ 이상인 것이 바람직하며, 에틸렌글리콜, 아세트산 비닐, 비닐피롤리돈, 프로필렌글리콜, 비닐알코올 및 실록산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 모노머의 공중합체가 보다 바람직하고, 폴리에테르 변성 실리콘이 더욱 바람직하다.

상기 혈액응고 반응을 저해하는 화합물은 항트롬빈능을 갖는 것이 바람직하고, 하기 일반식(I)으로 나타내어지는 화합물인 것이 더욱 바람직하며, (2R,4R)-4-메틸-1-((2S)-2-{[(3RS)-3-메틸-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-8-일]술포닐}아미노-5-구아니디노펜타노일)피페리딘-2-카르복실산인 것이 더욱 바람직하다.

[식 중 R¹은 (2R,4R)-4-알킬-2-카르복시피페리디노기를 나타내고, R²는 페닐기 또는 축합 다환식 화합물 잔기를 나타내며, 상기 축합 다환식 화합물 잔기는 저급 알킬기, 저급 알콕시기, 또는 저급 알킬기로 치환된 아미노기로 치환되어 있어도 된다]

또한 본 발명은 상기 친수성 고분자화합물을 함유하고, 항혈액응고 작용을 갖는 의료기재 또는 의료재료의 표면처리제를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 표면처리제로 처리된 의료기재 또는 의료재료를 제공한다.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면 혈소판이 관여하는 1차 지혈 단계와 혈액응고 인자가 관여하는 응고 혈전 형성 단계에 있어서의 쌍방의 혈액응고 반응을 현저하게 저해할 수 있고, 의료기재 또는 의료재료의 표면에 항혈액응고 활성을 유지한 상태에서 강고하게 고정화할 수 있다. 또한, 본 발명의 친수성 고분자화합물은 의료기재 또는 의료재료에 항혈액응고 작용을 부여하는 표면처리제로서 이용할 수 있다.

도 1은 실시예에서 제작한 미니 모듈을 나타내는 개략도이다.
도 2는 in vitro 혈액순환 시험의 폐쇄계 회로의 개략도이다.
도 3은 친수성 고분자화합물의 용출량 측정에 있어서의 인간 혈장순환 회로의 개략도이다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 특별히 규정하지 않는 한 하기의 정의와 같다.

본 발명의 「친수성 고분자화합물」은 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물과 혈액응고 반응을 저해하는 화합물이 결합하고 있는 것을 특징으로 하고 있다. 여기에서 「친수성」이란 화합물이 수용성이거나 또는 비수용성이어도 정전기 상호작용이나 수소결합에 의해 물 분자와 상호작용하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 「친수성 고분자화합물」로서는, 예를 들면 에틸렌글리콜, 아세트산 비닐, 비닐피롤리돈, 프로필렌글리콜, 비닐알코올 및 실록산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 모노머의 공중합체와 하기 일반식(I)으로 나타내어지는 화합물이 결합하고 있는 친수성 고분자화합물을 들 수 있다.

[식 중 R¹은 (2R,4R)-4-알킬-2-카르복시피페리디노기를 나타내고, R²는 페닐기 또는 축합 다환식 화합물 잔기를 나타내며, 상기 축합 다환식 화합물 잔기는 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기 또는 저급 알킬기로 치환된 아미노기로 치환되어 있어도 된다]

「혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물」이란, 혈액 적합성을 갖고, 그 고분자화합물을 의료기재나 의료재료의 표면에 존재시킴으로써 기재 또는 재료의 표면에의 혈소판 부착을 억제할 수 있는, 수평균 분자량이 1000 이상인 고분자화합물을 의미한다.

「혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물」로서는, 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에테르와 폴리실록산으로 이루어지는 고분자화합물, 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 폴리비닐아민, 폴리아세트산 비닐, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 폴리히드록시에틸메타크릴레이트, 또는 이들 고분자화합물의 모노머와 다른 모노머의 공중합체 또는 그래프트체를 들 수 있지만, 혈액응고 반응을 저해하는 화합물을 결합시키기 위해서 아미노기, 카르복실기, 수산기, 에폭시기 또는 메르캅토기를 갖고 있는 것이 바람직하고, 의료기재나 의료재료의 표면에의 흡착을 위하여 소수성 고분자와 친수성 고분자로 이루어지는 공중합체가 보다 바람직하며, 친수성이 높은 폴리에테르와 폴리실록산으로 이루어지는 고분자화합물, 부분 비누화 폴리비닐알코올 또는 비닐피롤리돈과 아세트산 비닐의 공중합체가 더욱 바람직하다.

「폴리에테르와 폴리실록산으로 이루어지는 고분자 화합물」로서는, 예를 들면 폴리에테르와 폴리실록산의 공중합체, 폴리머 컴플렉스 또는 폴리머 블랜드물을 들 수 있다. 폴리에테르와 폴리실록산의 공중합체는 폴리에테르 유닛과 폴리실록산 유닛으로 이루어지고, 그들의 공중합 형태는 랜덤 공중합체, 블록 공중합체 또는 그래프트 공중합체의 어느 것이어도 상관없지만 그 중에서도 친수성이 높은 폴리에테르 변성 실리콘이 바람직하다.

「폴리에테르」란 예를 들면 폴리에틸렌옥사이드 또는 폴리프로필렌옥사이드 유래의 구조를 들 수 있다. 여기에서 「폴리에테르」란 일반식(II)으로 나타내어지는 구조(R³은 탄소수 6 이하의 알킬기를 나타낸다)를 말하고, 폴리에테르의 일례인 「폴리프로필렌글리콜 유래의 구조」란 일반식(III)으로 나타내어지는 구조를 말한다.

「폴리에테르 변성 실리콘」이란 실리콘쇄의 측쇄에 폴리에테르 유닛이 결합되어 있는 실리콘을 말하지만, 또한 아미노 변성이나 카르복시 변성이 된 폴리에테르 변성 실리콘이어도 상관없다.

혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물이 부분 비누화 폴리비닐알코올일 경우 그 비누화도는 취급 용이성 또는 친수성을 적합한 것으로 하는 관점으로부터 50~100mol% 미만인 것이 바람직하고, 74~99.9mol%인 것이 보다 바람직하며, 78~95mol%인 것이 더욱 바람직하다. 여기에서 「비누화도」란 식 1에서 산출되는 수치를 말한다.

비누화도= m/(n+m)×100 ……식1

m : 폴리비닐알코올 중의 일반식(IV)으로 나타내어지는 구조의 수

n : 폴리비닐알코올 중의 일반식(V)으로 나타내어지는 구조의 수

혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물이 비닐피롤리돈과 아세트산비닐의 공중합체일 경우 취급 용이성 또는 친수성을 적합한 것으로 하는 관점으로부터 비닐피롤리돈 유닛이 50유닛mol% 이상인 것이 바람직하고, 60유닛mol% 이상인 것이 보다 바람직하다. 한편, 기재에 대한 흡착량을 적합한 것으로 하는 관점으로부터 비닐피롤리돈 유닛은 100유닛mol% 미만이 바람직하다. 또한, 비닐피롤리돈과 아세트산 비닐의 공중합체에 있어서 비닐피롤리돈 유닛이 차지하는 비율(유닛mol%)은 공중합체를 ¹H-NMR 측정(용매 : CDCl₃)함으로써 산출할 수 있다.

의료기재 또는 의료재료 등의 기재에 대한 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물의 흡착량은 0.1pg/㎟ 이상이 바람직하고, 1pg/㎟ 이상이 보다 바람직하며, 10pg/㎟ 이상이 더욱 바람직하다.

상기 흡착량은 이하의 방법에 의해 측정된다. 우선, 미처리의 센서 칩(Sensor Chip Au ; GE헬스케어)을 표면 플라스몬 공명 장치(이하, 「SPR」) (BIACORE3000 ; GE헬스케어)로 전처리(25℃의 증류수, 유속 20㎕/min, 10분간) 하고, 그 시그널값(RU : resonance unit)을 측정한다.

「기재」, 즉 피흡착 소재는 용매에 용해하여 0.5중량% 피흡착 소재 용액을 조제한다. 이 피흡착 소재 용액을 스핀코터에 장착한 전처리가 끝난 센서칩의 금막 부분의 중심에 1방울 적하하고, 실온하에서 즉시 3000rpm으로 1분간 회전시켜 센서칩에 피흡착 소재를 피복시킨다.

센서칩 상에 액적이 없는 것을 확인 후 SPR로 센서칩을 증류수 세정(25℃, 유속 20㎕/min, 10분간)한 후에 0.025중량% Triton-X100 용액으로 3회 더 세정(25℃, 유속 20㎕/min, 1분간)하고, 세정 종료로부터 10분 후의 시그널값을 측정한다.

상기와 같이 해서 얻은 센서칩 중 스핀코팅 전후의 시그널값의 차가 3000~8000의 범위에 있는 것을 선별하고, 증류수로 세정(25℃, 유속 20㎕/min, 10분간)한 후에 0.025중량% Triton-X100 용액으로 3회 더 세정(25℃, 유속 20㎕/min, 1분간)했다.

세정 종료로부터 10분 후에 기재에 흡착하는 친수성 고분자화합물 수용액(농도 : 100㎍/㎖)을 주입(25℃, 유속 20㎕/min, 1분간)하고, 증류수로 세정(25℃, 유속 20㎕/min, 3분간)한다. 주입 개시 직전의 시그널값(이하, 「시그널값A」)과 주입 종료로부터 3분 후의 시그널값(이하, 「시그널값B」)의 차를 구하고, 1RU=1pg/㎟로서 환산한다.

계속해서 증류수로 세정(25℃, 유속 20㎕/min, 2분간)을 하고, 0.025중량% Triton-X100 용액으로 3회 더 세정(25℃, 유속 20㎕/min, 1분간)을 하고 나서 다시 흡착하는 친수성 고분자화합물 수용액(농도 : 100㎍/㎖)을 주입(25℃, 유속 20㎕/min, 1분간)한다. 이후, 마찬가지의 작업을 반복하여 계 5회의 시그널차(시그널값A와 시그널값B의 차)를 구하고, 그 평균값을 「기재에 대한 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물의 흡착량」으로 한다.

「혈액응고 반응을 저해하는 화합물」이란 항트롬빈능과 같은 항혈액응고능을 갖는 화합물을 말하고, 보다 구체적으로는 혈액에 그 화합물을 10㎍/㎖의 농도가 되도록 혈액에 첨가했을 경우에 프로트롬빈 시간이 블랭크 혈액과 비교해서 30% 이상 연장되는 화합물을 말한다.

「프로트롬빈 시간」은 공지의 문헌(가나이 마사미쯔 외, 「임상검사법 제요 개정 제 30판」, 가네하라 출판, 1993년, p.416-418)에 기재된 방법에 의해 측정된다. 구체적으로는 3.2% 시트르산 나트륨 1체적부와 혈액 9체적부를 혼합하고, 분리한 시트르산 혈장 0.1㎖를 소시험관(내경 8mm, 길이 7.5cm)에 취하고, 37℃의 항온수조에 넣어서 3분간 가열하고 나서 37℃로 보온한 조직 트롬보플라스틴?칼슘 시약 0.2㎖를 첨가하고, 소시험관을 가볍게 진탕한 후에 정치해서 경사지게 하면서 피브린을 석출시킨다. 여기에서, 조직 트롬보플라스틴?칼슘 시약을 첨가한 후에 피브린이 석출되기 까지의 시간을 측정하고, 이것을 「프로트롬빈 시간」으로 한다.

「혈액응고 반응을 저해하는 화합물」로서는, 예를 들면 헤파린, 나파모스타트 메실레이트, 시트르산 나트륨, 옥살산 나트륨, α1 안티트립신, α2 매크로글로불린, C1 조해제, 트롬보모듈린, 단백질C, 구아니디노 구조를 갖는 화합물, 프로스타글란딘, 히루딘, Xa 조해제, 조직인자 조해제 또는 안티트롬빈을 들 수 있지만, 항트롬빈능을 갖는 화합물이 바람직하다.

「항트롬빈능을 갖는 화합물」이란, 트롬빈과의 결합 친화성이 높은 화합물을 의미한다.

화합물의 항트롬빈능을 평가하는 지표로서는, 예를 들면 피검 용액의 흡광도값에 근거해 Lineweaver-Burk plot으로부터 산출되는 저해 정수(이하, 「Ki」)를 들 수 있다. Ki는 작을 수록 트롬빈과의 결합 친화성이 높고, 항트롬빈능이 높은 것을 나타낸다.

「항트롬빈능을 갖는 화합물」로서는, 예를 들면 구아니디노 구조를 갖는 화합물을 들 수 있지만, (2R,4R)-4-메틸-1-((2S)-2-{[(3RS)-3-메틸-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-8-일]술포닐}아미노-5-구아니디노펜타노일)페피리딘-2-카르복실산(이하, 「아르가트로반」)이 바람직하다. 아르가트로반은 1978년에 합성된 아르기닌 유도체의 선택적 항트롬빈능을 갖는 의약화합물이다.

또한, 본 발명의 의료기재 또는 의료재료의 표면처리제는 상기 친수성 고분자화합물을 함유하고, 항혈액응고 작용을 갖는 것을 특징으로 하고 있다.

「의료기재 또는 의료재료」로서는, 예를 들면 이식형 인공장기, 인공혈관, 카테터, 스텐트, 혈액백, 콘택트렌즈, 안내렌즈 또는 수술용 보조 기구, 또는 생체성분 분리용 모듈 또는 혈액정화용 모듈 등에 내장되는 분리막 또는 흡착제를 들 수 있다.

상기 표면처리제를 이용하여 의료기재 또는 의료재료의 표면처리를 하는 방법, 즉 그 유효성분인 상기 친수성 고분자화합물을 의료기재 또는 의료재료의 표면에 고정화하는 방법으로서는, 예를 들면 의료기재 또는 의료재료에 상기 표면처리제를 접촉시켜 두고, 거기에 방사선을 조사하는 방법을 들 수 있다. 또한, 방사선의 종류로서는 전자선, 감마선이 바람직하다.

「의료기재 또는 의료재료」의 소재로서는, 예를 들면 셀룰로오스, 셀룰로오스아세테이트, 폴리카보네이트, 폴리술폰, 폴리에테르술폰, 폴리메타크릴산 메틸(이하, 「PMMA」) 등의 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴레이트, 폴리아미드, 폴리 불화비닐리덴, 폴리염화비닐, 폴리아크릴로니트릴, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메틸펜텐 또는 폴리이미드를 들 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이것들에 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1 : 아미노?폴리에테르 변성 실리콘과 아르가트로반의 결합)

아르가트로반 5mmol을 나스 플라스크에 취하고, 무수 디메틸포름아미드(이하, 「무수DMF」)를 10㎖ 첨가해서 용해한 후에 나스 플라스크를 빙냉하면서 4N 염산/1,4-디옥산(토요카세이 가부시키가이샤)을 10㎖ 적하하고, 1시간 교반했다. 이어서, 로터리 이배퍼레이터로 용매를 증류제거하고, 또한 진공건조기 내에서 하룻밤 건조한 것에 무수DMF를 25㎖첨가하여 아르가트로반염산염/무수DMF 용액으로 했다.

표 1에 나타내는 분량으로 2구 플라스크에 아르가트로반염산염/무수DMF 용액을 취하고, 빙냉 하에서 교반하면서 디시클로헥실카르보디이미드(이하, 「DCC」)/무수DMF 용액 및 4-히드록시벤조트리아졸(이하, 「HOBt」)/무수DMF 용액을 각각 첨가하고, 또한 폴리에테르 변성 실리콘(X-22-3939A ; 신에쓰가가쿠샤)을 첨가해서 실온에서 3일간 반응시켰다. 이어서, 반응액을 투석 튜브(스펙트라포어RC 포어6 MWCO=1000)에 넣고, 반응액의 10배 체적량을 초과하는 증류수 속에서 적당하게 증류수를 교환하면서 3일간 투석했다. 투석 후의 반응액을 여과하고, 여액의 용매를 로터리 이배퍼레이터로 증류제거하고 나서 진공건조기 내에서 하룻밤 건조시켜 친수성 고분자화합물(이하, 「실시예 1 화합물」)을 얻었다.

(실시예 1 화합물의 항트롬빈능의 측정)

측정에는 ECA-T 키트(HaemoSys사)를 사용했다. 실시예 1 화합물 100㎕에 증류수 900㎕를 첨가하여 실시예 1 화합물 수용액을 조제했다. 실시예 1 화합물 수용액을 30㎕ 채취하고, ECA prothrombin buffer 100㎕ 및 ECA-T substrate 25㎕를 혼합해서 37℃에서 60초간 인큐베이팅하고 나서 장치[COATRON M1(code 80 800 000) ; Production사]에 셋팅하고, 또한 ECA ecarin reagent 50㎕를 첨가해서 측정을 행했다.

에탄올/염산(체적비율 4/1) 혼합 용매를 이용하여 임의의 농도로 조제한 아르가트로반 용액 20㎕를 인간 혈장 80㎕에 혼합한 것, 또는 블랭크 증류수 20㎕를 인간 혈장 80㎕에 혼합한 것을 상기 실시예 1 화합물 수용액 대신에 ECA-T 키트를 이용하여 각각 측정하고, 그것들의 결과로부터 검량선을 작성했다. 검량선에 근거해 산출한 실시예 1 화합물 수용액의 아르가트로반 상당 농도 1494.3중량ppm을 실시예 1 화합물 수용액의 항트롬빈능을 나타내는 값으로 했다.

(실시예 2~13)

아르가트로반염산염에 대한 DCC, HOBt 및 폴리에테르 변성 실리콘(X-22-3939A)의 몰비 및 폴리에테르 변성 실리콘에 대한 무수DMF의 체적비를 변경한 점을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 실시예 2~13 화합물을 각각 얻고, 그것들의 항트롬빈능을 측정했다. 아르가트로반염산염에 대한 DCC, HOBt 및 폴리에테르 변성 실리콘(X-22-3939A)의 몰비 및 실시예 2~13 화합물 각각의 항트롬빈능의 측정 결과를 표 1에 나타낸다.

또한, 폴리에테르 변성 실리콘(X-22-3939A)에 대해서도 마찬가지로 항트롬빈능을 측정했지만 그 값은 블랭크 증류수와 변함이 없는 것이고, 폴리에테르 변성 실리콘 자체는 항트롬빈능을 갖지 않는 것을 확인할 수 있었다.

(실시예 1 화합물의 트롬빈 저해 정수의 측정)

소 트롬빈액(이토 라이프 사이언스) 10000U를 생리식염수 1㎖에 용해하여 소 트롬빈 수용액을 조제했다.

S-2238 스톡액(세키스이 메디칼) 25㎎을 증류수 40㎖에 용해하여 S-2238 스톡 수용액을 조제했다.

희석완충액(0.05M Tris, 0.1M NaCl, 1㎎/㎖ 소 혈청 알부민(BSA), pH7.4)을 이용하여 소 트롬빈 수용액, S-2238 스톡 수용액 및 상기 실시예 1 화합물 수용액을 각각 희석했다.

96 웰 플레이트에 S-2238 스톡 수용액의 희석액 100㎕ 및 실시예 1 화합물 수용액의 희석액 50㎕를 분주(分注)하고, 밀봉을 하고 나서 37℃로 설정한 항온건조기에서 30분간 가온했다. 이어서, 37℃에서 30분간 가온한 소 트롬빈 수용액의 희석액을 50㎕ 더 분주하고, 즉시 마이크로플레이트 리더(측정 파장 405㎚, 참조 파장 595㎚)로 그 흡광도를 측정했다.

1회째의 흡광도 측정이 종료된 후 즉시 2회째의 흡광도 측정을 행했다. 3회째 이후의 흡광도 측정은 소트롬빈 수용액의 희석액의 분주로부터 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20분 후에 각각 행했다. 얻어진 각 흡광도의 값으로부터 Ki를 Lineweaver-Burk plot에 의해 산출했다. 실시예 1 화합물의 Ki는 21nM이었다.

또한, 폴리에테르 변성 실리콘(X-22-3939A)에 대해서도 마찬가지로 Ki를 산출했지만, 항트롬빈능을 갖지 않는 폴리에테르 변성 실리콘의 Ki는 역시 블랭크와 같은 값이 되었다.

또한, 아르가트로반에 대해서도 마찬가지로 Ki를 산출한 바 Ki는 42nM이고, 실시예 1 화합물의 Ki와 비교했을 경우 2배 이상의 수치가 되었다.

이들 결과로부터 상기 친수성 고분자화합물은 트롬빈과의 결합 친화성이 매우 높고, 중공사형 투석기를 비롯한 의료기재 또는 의료재료에 대하여 항트롬빈능을 갖는 것으로 알려진 아르가트로반을 훨씬 상회하는 현저한 항트롬빈능을 부여 할 수 있는 것은 명백하다.

(PMMA 중공사막 미니 모듈의 제작)

아이소택틱-PMMA 5중량부와 신디오택틱-PMMA 20중량부를 디메틸술폭시드 75중량부에 첨가하고, 110℃에서 8시간 교반하여 제막 원액을 얻었다. 이 제막 원액을 오리피스형 이중원통형 구금으로부터 토출시키고, 공기 중을 300mm 통과시킨 후에 물 100%의 응고욕 안으로 유도하여 내경 0.2mm, 막두께 0.03mm의 PMMA 중공사를 얻었다. 또한, 내부 주입 기체로서는 건조 질소를 사용했다.

일반적인 중공사형 투석기와 마찬가지로 중공사의 내측으로 통하는 포트(혈액 포트) 및 외측으로 통하는 포트(투석액 포트)를 각각 2개씩 갖는 내경 10mm, 길이 120mm의 모듈 케이스를 준비했다.

상기 PMMA 중공사를 50가닥 묶어서 PMMA 중공사막으로 하고, PMMA 중공사막의 중공부가 폐색되지 않도록 유의하면서 그 양 말단을 에폭시계 포팅제로 상기 모듈 케이스에 고정하고 나서 PMMA 중공사막 및 모듈 케이스 내부를 증류수로 세정하여 도 1에 나타내는 미니 모듈(6)을 얻었다.

(PMMA 중공사막에의 실시예 1 화합물의 고정화)

Bis-Tris(도진도 카가쿠) 및 염화나트륨을 각각의 최종 농도가 0.25M 및 0.5M이 되도록 초순수에 용해하고, 거기에 6N 염산을 적하해서 pH5로 조정하여 5배 농도의 Bis-Tris 완충액을 조제했다.

제작한 미니 모듈(6)의 혈액 접촉측(PMMA 중공사막 내측)과 혈액 비접촉측(PMMA 중공사막 외측)에 잔존하는 증류수를 압축공기에 의해 제거했다. 이어서, 아르가트로반 농도 상당 4000중량ppm 상당의 실시예 1 화합물 수용액, 프로필렌글리콜 및 5배농도의 Bis-Tris 완충액을 체적비율 5/3/2로 혼합하여 충전액을 얻었다.

상기 충전액 400㎕를 실린지를 이용하여 미니 모듈(6)의 혈액 접촉측에만 충전했다. 그 후, 압축공기에 의해 충전액을 제거하고 나서 혈액 포트(1a, 1b) 및 투석액 포트(2a, 2b)를 전부 밀전(密栓)한 미니 모듈(6)에 흡수선량 25kGy의 감마선을 약 3시간 조사했다.

연동 펌프(8)를 이용하여 PMMA 중공사막(4) 및 미니 모듈(6)의 내부에 0.025중량% 폴리옥시에틸렌옥틸페닐에테르 수용액을 유속 10㎖/min으로 8시간 통액하여 PMMA 중공사막(4) 및 미니 모듈(6)의 내부를 세정했다. 그 후에 증류수 및 생리식염수를 모두 유속 10㎖/min으로 30분씩 통액해서 더 세정을 하여 실시예 1 화합물이 고정화된 미니 모듈(이하, 「실시예 1 미니 모듈」)을 얻었다.

한편으로, 아르가트로반 상당 농도 4000중량ppm 상당의 실시예 1 화합물 수용액 대신에 폴리에테르 변성 실리콘(X-22-3939A)을 사용한 이외에는 상기와 마찬가지의 조작을 행하여 폴리에테르 변성 실리콘이 고정화된 미니 모듈(이하, 「비교예 1 미니 모듈」)을 얻었다.

(in vitro 혈액순환 시험)

지원자로부터 제공된 혈액과 시트르산을 체적비율 9/1로 혼합하여 시트르산 첨가 혈액을 얻었다. 시트르산 첨가 혈액 1㎖에 대하여 응고 촉진제로서 카르티콜을 43.6㎕ 첨가한 것을 피검혈액으로 했다.

실리콘 튜브(7a, 7b)를 실시예 1 미니 모듈에 접속시키고, 실리콘 튜브(7b)의 도중에 연동 펌프(8)를 설치했다. 혈액 포트(1a)에 접속된 실리콘 튜브(7a)로부터 피검혈액을 유량 0.9㎖/min으로 5초간 통액시키고, 혈액 포트(1b)로부터 유출된 피검혈액은 이것을 실리콘 튜브(7b)로부터 폐기하고 PMMA 중공사막 내부의 기포를 제거했다. 계속해서, 실리콘 튜브(7a)와 실리콘 튜브(7b)를 포접부(包接部 ; 9)에서 접속시켜 도 2에 나타나는 폐쇄계 회로를 제작했다.

유량 0.9㎖/min으로 피검혈액의 순환을 개시하고, 회로 내에 생성된 응고 혈전에 의해 회로 내압이 상승해서 포접부(9)로부터 실리콘 튜브(7a) 또는 실리콘 튜브(7b)가 빠질 때까지의 순환 계속 시간을 측정했다. 실시예 1 미니 모듈을 사용했을 경우의 순환 계속 시간은 46분이었다.

PMMA 중공사막에 어떠한 화합물도 고정화되어 있지 않은 미니 모듈(6)(이하, 「비교예 2 미니 모듈」)을 준비하고, 상기와 마찬가지의 혈액순환 시험을 행했다. 이 경우의 순환 계속 시간은 20분이고, 실시예 1 미니 모듈을 사용했을 경우의 절반 이하의 값이었다. 이들의 결과로부터 상기 친수성 고분자화합물이 중공사형 투석기를 비롯한 의료기재 또는 의료재료에 대하여 뛰어난 항혈액응고 작용을 부여할 수 있는 것은 명백하다.

또한, 비교예 1 미니 모듈을 이용하여 상기와 마찬가지의 혈액순환 시험을 행했을 경우의 순환 계속 시간은 20분이고, PMMA 중공사막에 어떠한 화합물도 고정화되어 있지 않은 비교예 2 미니 모듈을 사용했을 경우와 변함이 없는 것이었다.

(실시예 1 화합물의 용출량 측정)

별도 제작한 실시예 1 미니 모듈의 혈액 포트(1b)에 내경 0.8mm, 길이 520mm의 실리콘 튜브(7b)를 접속하고, 그 도중에 연동 펌프(8)를 설치했다. 혈액 포트(1a)에는 내경 0.8mm, 길이 160mm의 실리콘 튜브(7a)를 접속했다. 그 후에 실리콘 튜브(7a) 및 실리콘 튜브(7b)의 각각의 타단을 인간 혈장 5㎖를 넣은 폴리스티렌 라운드 튜브(Code : 352054 ; BECTON DICKINSON사)(10)에 끼워 넣어 도 3에 나타내는 순환 회로를 제작했다.

연동 펌프(8)를 이용하여 인간 혈장 내를 유속 0.5㎖/min으로 4시간 순환시키고 나서 폴리스티렌 라운드 튜브(10) 내의 인간 혈장 중 실시예 1 화합물 농도를 ECA-T 키트를 사용해서 측정했다. 그러나, 순환 후 인간 혈장 중의 실시예 1 화합물 농도는 ECA-T 키트의 검출 한계 이하이고, 실시예 1 미니 모듈로부터의 실시예 1 화합물의 용출은 확인되지 않았다. 이 결과는 상기 친수성 고분자화합물은 중공사형 투석기를 비롯한 의료기재 또는 의료재료에 대하여 강고한 고정화가 가능한 것을 나타내는 것이다.

(항혈소판 부착능을 갖는 고분자화합물의 흡착량 평가)

상기 친수성 고분자화합물을 구성하는, 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물의 하나인 비닐피롤리돈 및 아세트산 비닐의 공중합체(이하, 「VA계 공중합체」)로서 PVP(K-90), VA73, VA64, VA55, VA37(모두 BASF사)을 준비했다. 마찬가지로, 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물의 하나인 부분 비누화 폴리비닐알코올로서 PVA217, PVA417, PVA205c(모두 쿠라레이)를 준비했다. 또한, 폴리에테르 변성 실리콘으로서 F114, F244, F303, F3031, F348, F350s, F502, F506, X-22-3939A(모두 신에쓰 실리콘사)를 준비했다. 또한, 준비한 VA계 공중합체, 부분 비누화 폴리비닐알코올 및 폴리에테르 변성 실리콘은 모두 증류수로 희석해서 10000중량ppm의 수용액을 조제했다.

한편, 비교 대상으로서 상기 친수성 고분자화합물을 구성하는, 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물에는 포함되지 않는 고분자화합물로서 PEG2000, PEG4000, PEG6000, PEG20000(모두 나카라이테스크) 및 PEG메틸에테르(PEG-em), PEG디메틸에테르(PEG-dm)(모두 시그마알드리치)를 준비했다. 또한, 준비한 고분자화합물은 모두 증류수로 희석해서 10000중량ppm의 수용액을 조제했다.

혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물을 흡착하는 피흡착 소재의 0.5중량% 용액으로서 PMMA(중량평균 분자량 93000 ; 시그마알드리치)/톨루엔 용액, 폴리우레탄/디메틸아세트아미드 용액, 폴리술폰[솔베아사제 유델(등록상표) P-3500]/디메틸아세트아미드 용액, 폴리염화비닐(중량평균 분자량 80000 ; 시그마알드리치)/테트라히드로푸란 용액, 폴리스티렌(Wako)/클로로포름 용액 및 폴리카보네이트(중량평균 분자량 20000 ; 테이진)/클로로포름 용액을 각각 조제했다.

각각의 피흡착 소재에 대한 여러 가지 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물의 흡착량을 측정했다. 결과를 표 2에 나타낸다.

표 2의 결과로부터 상기 친수성 고분자화합물을 구성하는, 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물은 폴리에테르 변성 실리콘(X-22-3939A)에 한정되는 것은 아니고, 중공사형 투석기를 비롯한 의료기재 또는 의료재료에 대하여 강고한 흡착이 가능한 것은 명백하다.

(항혈소판 부착능의 평가)

별도 제작한 실시예 1 미니 모듈의 모듈 케이스를 초음파 커터로 절단하고, 실시예 1 화합물이 고정화된 PMMA 중공사막(이하, 「실시예 1 중공사막」)을 인출했다.

지름 18mm의 폴리에틸렌테레프탈레이트제 원형 필름의 편면에 양면 테이프를 붙이고, 거기에 실시예 1 중공사막을 고정하고 나서 고정한 PMMA 중공사막을 반원통 형상으로 잘라 그 내표면을 노출시켰다. 통 형상으로 자른 Falcon(등록상표) 원통 튜브(18mmΦ, No.2051)의 내부에 원형 필름에 고정한 실시예 중공사막을 넣고, 원통 튜브와 원형 필름의 간극을 파라 필름으로 밀봉했다. 그 후에 이 원통 튜브 안은 생리식염수로 채워 두었다.

미리 헤파린을 채취해 둔 채혈관에 채취 직후의 지원자의 정맥혈을 넣어서 전도 혼화하여 헤파린 첨가 혈액을 조제했다. 또한, 헤파린 첨가 혈액의 헤파린 농도는 50U/㎖가 되도록 했다.

상기 원통 튜브 내의 생리식염수를 폐기하고 나서 헤파린 첨가 혈액을 1.0㎖ 넣고서 37℃에서 1시간 진탕했다. 이어서, 상기 원통 튜브 내의 실시예 1 중공사막을 10㎖의 생리식염수로 세정하고 나서 2.5체적%의 글루타르알데히드를 함유한 생리식염수를 첨가해서 혈액 성분의 고정을 행하고, 또한 증류수로 세정했다. 그 후에 상기 원통 튜브로부터 실시예 1 중공사막을 고정한 원형 필름을 제거하고, 실시예 중공사막을 고정한 원형 필름을 상온, 0.5Torr 절대압에서 12시간 감압 건조했다.

감압 건조 후의 실시예 1 중공사막을 고정한 원형 필름을 주사형 전자현미경의 시료대에 양면 테이프로 접합한 후에 스퍼터링에 의해 백금/팔라듐 박막을 실시예 중공사막 표면에 형성했다. 백금/팔라듐 박막을 표면에 형성한 실시예 중공사막의 길이 방향에 있어서의 중앙 부근의 내표면을 필드 에미션형 주사형 전자현미경(S800 ; 히타치세이사쿠쇼)을 이용하여 배율 1500배에서 관찰하고, 1시야 중(4.3×10³㎛²)의 부착 혈소판 수를 셌다.

다른 5시야에서의 부착 혈소판 수의 평균치의 정수값을 혈소판 부착수(개/4.3×10³㎛²)로 한 바, 실시예 1 중공사막에의 부착 혈소판 수는 1개였다.

한편, 별도 제작한 비교예 2 미니 모듈의 모듈 케이스를 초음파 커터로 절단하고, 어떠한 화합물도 고정화되어 있지 않은 중공사막을 인출하고(이하, 「비교예 2 중공사막」), 이것에 대해서도 마찬가지로 혈소판 부착수를 확인한 바, 비교예 2 중공사막의 부착 혈소판 수는 100개 이상이었다.

이들 결과로부터 상기 친수성 고분자화합물이 중공사형 투석기를 비롯한 의료기재 또는 의료재료에 대하여 현저한 항혈소판 부착능을 부여할 수 있는 것은 명백하다.

(전혈응고 시간의 측정)

지원자로부터 채취한 혈액과 시트르산을 체적비율 9/1로 혼합하여 시트르산 첨가 혈액을 조제했다.

큐벳트(NON-ACTIVATED CLOTTING TEST KIT)에 생리식염수 18㎕를 취하고, 이것에 칼시콜(calcicol) 14.8㎕를 첨가하고, 또한 시트르산 첨가 혈액 342㎕를 첨가하고 나서 소노클롯(sonoclot) 혈액응고/혈소판 기능 분석 장치(아이엠아이카부시키가이샤)로 측정하여 얻어진 ACT ONSET값을 전혈응고 시간으로 했다. 지원자로부터 채취한 혈액의 전혈응고 시간은 545초이었다.

생리식염수 대신에 2, 10, 20μM의 아르가트로반 용액[용매는 메탄올/염산(체적비율 4/1)]을 각각 사용해서 마찬가지의 측정을 한 바, 전혈응고 시간은 각각 531, 746, 849초였다.

생리식염수 대신에 0.3, 1.3, 2.5μM의 실시예 1 화합물 수용액을 각각 사용해서 마찬가지의 측정을 한 바, 전혈응고시간은 각각 527, 693, 730초였다.

(실시예 14 : 아세트산 비닐-비닐피롤리돈 공중합체와 아르가트로반의 결합)

스크류병에 테트라히드로푸란 14.9g, 아세트산 비닐 11.5g, N-비닐피롤리돈 10.8g, 2-아미노에탄티올 0.028g 및 아조비스이소부티로니트릴 0.016g을 취하고, 밀폐하고 나서 초음파를 10분간 조사했다. 스크류병을 일단 개봉해서 아르곤 가스를 10분간 버블링하고, 다시 밀폐 후에 교반하면서 60℃의 탕욕에 1시간, 또한 70℃의 탕욕에 6시간 스크류병을 침지시켜 아세트산 비닐과 비닐피롤리돈을 공중합 반응시켰다. 이 반응액에 메탄올 80㎖를 첨가한 것을 약 5배량의 에테르 내에 첨가하고, 상청액을 제거했다. 새로 에테르를 첨가하고, 상청액을 제거하는 세정 작업을 3회 반복하고 나서 감압 건조를 하여 아세트산 비닐-비닐피롤리돈 공중합체를 얻었다. 얻어진 아세트산 비닐-비닐피롤리돈 공중합체를 ¹H-NMR 측정(용매 : CDCl₃)한 바, 비닐피롤리돈 유닛은 60.6유닛mol%였다.

얻어진 아세트산 비닐-비닐피롤리돈 공중합체 3.58g을 무수DMF 20㎖에 용해하여 아세트산 비닐-비닐피롤리돈 공중합체/무수DMF 용액을 조제했다. 2구 플라스크에 조제한 아세트산 비닐-비닐피롤리돈 공중합체/무수DMF 용액의 전량 및 아르가트로반 염산염/무수DMF 용액(0.49M) 0.5㎖를 취하고, 빙냉 하에서 교반하면서 DCC/무수DMF 용액(1.04M) 0.5㎖ 및 HOBt/무수DMF 용액(1.02M) 0.5㎖를 각각 첨가하고, 질소분위기 하, 실온에서 3일간 반응시켰다. 이어서, 반응액을 투석 튜브(스펙트라포어 RC 포어6 MWC0=1000)에 넣고, 반응액의 10배 체적량 초과의 증류수 내에서 적당하게 증류수를 교환하면서 3일간 투석했다. 투석 후의 반응액을 여과하고, 여액의 용매를 로터리 이배퍼레이터로 증류제거하고 나서 진공건조기 안에서 하룻밤 건조시켜 친수성 고분자화합물(이하, 「실시예 14 화합물」)을 얻었다.

(실시예 14 화합물의 항트롬빈능의 측정)

실시예 1 화합물의 항트롬빈능의 측정과 마찬가지의 방법으로 실시예 14 화합물/메탄올 용액(농도 20중량%)을 측정하고, 산출된 실시예 14 화합물/메탄올 용액의 아르가트로반 상당 농도 104.1ppm을 실시예 14 화합물/메탄올 용액의 항트롬빈능을 나타내는 값으로 했다.

이들 결과로부터 상기 친수성 고분자화합물은 항트롬빈능을 갖는 것으로 알려진 아르가트로반과 비교하여 극히 저농도이어도 전혈응고 시간의 연장이 가능하여 중공사형 투석기를 비롯한 의료기재 또는 의료재료에 대하여 뛰어난 항혈액응고 작용을 부여할 수 있는 것은 명백하다.

<산업상의 이용 가능성>

본 발명은 중공사형 투석기를 비롯한 의료기재 또는 의료재료에 대하여 뛰어난 항혈액응고 작용을 부여하기 위해서 사용할 수 있다.

1a, 1b : 혈액 포트 2a, 2b : 투석액 포트
3 : 모듈 케이스 4 : PMMA 중공사막
5 : 포팅제 6 : 미니 모듈
7a, 7b : 실리콘 튜브 8 : 연동 펌프
9 : 포접부 10 : 폴리스티렌 라운드 튜브

Claims

혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물과 혈액응고 반응을 저해하는 화합물이 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 친수성 고분자화합물.
제 1 항에 있어서,
상기 혈소판의 부착을 저해하는 고분자화합물은 소수성 고분자와 친수성 고분자로 이루어진 공중합체이고, 폴리메타크릴산 메틸에 대한 흡착량이 0.1pg/㎟ 이상인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자화합물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 혈액응고 반응을 저해하는 화합물은 항트롬빈능을 갖는 화합물인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자화합물.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혈액응고 반응을 저해하는 화합물은 하기 일반식(I)으로 나타내어지는 화합물인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자화합물.

[식 중 R¹은 (2R,4R)-4-알킬-2-카르복시피페리디노기를 나타내고, R²는 페닐기 또는 축합 다환식 화합물 잔기를 나타내며, 상기 축합 다환식 화합물 잔기는 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기 또는 저급 알킬기로 치환된 아미노기로 치환되어 있어도 된다]
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 공중합체는 에틸렌글리콜, 아세트산 비닐, 비닐피롤리돈, 프로필렌글리콜, 비닐알코올 및 실록산으로 이루어지는 군으로부터 선택된 모노머의 공중합체인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자화합물.
제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
상기 공중합체는 폴리에테르 변성 실리콘인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자화합물.
제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 일반식(I)의 화합물은 (2R,4R)-4-메틸-1-((2S)-2-{[(3RS)-3-메틸-1,2,3,4-테트라히드로퀴놀린-8-일]술포닐}아미노-5-구아니디노펜타노일)피페리딘-2-카르복실산인 것을 특징으로 하는 친수성 고분자화합물.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 친수성 고분자화합물을 함유하고, 항혈액응고 작용을 갖는 것을 특징으로 하는 의료기재 또는 의료재료의 표면처리제.
제 8 항에 기재된 표면처리제로 처리된 것을 특징으로 하는 의료기재 또는 의료재료.