TW201122112A - Homogeneously-structured nano-catalyst/enzyme composite electrode, fabricating method and application of the same - Google Patents
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Description
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TW5583PA 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係與一種觸媒/酵素結構及其製備方法有關，特別是與一 種均勻結構之複合式觸媒/酵素結構及其製備方法與應用有關，此方法 可以應用於相當廣泛之領域，其可以應用於有機分子偵測器或生物感 測器（如微型生物感測器）之基材固定化等等。 【先前技術】 請參照第1圖，其繪示一種生物感測器的基本結構之示意圖。生 物感測器的基本結構主要是由生物感測元件（Biological recognition element、Bioreceptor)ll、信號換能器（Signal transducer)12 及訊號處 理器（Signal processor)13這三個部份所組成。其感測原理是：當具有 生物化學特異性的生物感測元件11與待測物質15結合或反應後，其 所產生的物理或化學變化，可以經過信號換能器12而將變化量轉化 成有意義的電子訊號，再經由訊號處理器13來將此訊號放大並且記 錄’以方便後續定性及定量分析。 生物感測器中可用來作為感測元素的生物材料一般可略分為五 大類：⑷酵素(Enzymes)、（b)抗體(Antibody)和抗原(Antigen)、（c)核酸 (Nucleic acids) ' (d)感受體(Receptors)、（e)組織部分(Cell organelle)或 是個體細胞。而利用不同生物感測材料所製備之生物感測器係有其各 自的優缺點，在眾多的生物感測材料中，最早且最常被使用的是酵 素。一般而言，酵素都具有專一性（即一種酵素只能催化某一特定基 質）、可重複利用、易受熱與酸鹼影響等特性。酵素可與特定之待測物 互相結合，此催化行為即可應用於生物感測器。 隨著全球經濟發展逐漸提升’人類在生活與飲食方面也大幅改 201122112
TW5583PA 變’並且國民主要的死亡原因之—已經從急性傳染病逐漸被由慢性 所取代。在眾多慢性病當中，又以糖尿病為國民高盛行的疾病 96年行政院衛生署所公布之國人十大死因，糖尿病高居第四名。^然 現今的醫學技術日新月異，但目前尚未找出能將糖尿病完全根除之 療方法。假使糖尿病病情無法控制得當，其所伴隨之諸多的併發症， 除了會消耗更多的社會醫療資源，也會影響病患本身與家人生活。 質。藉由性能卓越的生物感測器來監控人體中的血糖濃度，做到適告 的追蹤管理，則可以預防或減緩併發症的發生，並達到早期發現早^ 治療的目的。而微型生物感測器能夠提供一個簡易量測且攜帶方便之 測量平台，讓使用者能夠隨身攜帶以便於監測其待測物質之濃度。 其中，可用來監控糖尿病的生物感測器具有許多種組合方式，也 就是說各種類型生物分子在搭配適合的訊號轉能器下，皆能作為分析 葡萄糖之感測元件。長期以來許多研究是藉由利用將葡萄糖氧化酵素 固定於電化學式葡萄糖生物感測器上，來探討葡萄糖的感測分析，因 此葡萄糖氧化酵素(Glucose Oxidase ; GODx)是最常被應用在於此研究 上者。 葡萄糖氧化酵素酵素是一種含有兩個相似之二次單元的糖蛋白 質所組成，而此二次單元之蛋白質係由二硫基所連結，其在每一個次 單元中都含有一個黃素腺嘌呤雙核苷酸(Flavin adenine dinuc丨e〇tide， FAD)為互補群，FAD的分子結構如下所示。 201122112
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在電子受質存在下，GOD可將β-D-glucose催化成 D-glucono-3-lactone，GOD 上之 FAD 會還原形成 FADH2 ;如式 1-1 所 示： β-D-Gucose + GOD(FAD) —^GOIXFADl·^) + D-glucono5-latone (1-1) D-glucono-S-lactone會與更進一步與溶液中的水反應成為 gluconic acid ;如式 1-2 所示： D-glucono-8-lactone + H20 -» gluconic Acid (1-2) 結合式1-2與式1-2可以得到式1-3 β-D-Glucose + GOD(FAD) -> GOD(FADH2) + gluconic Acid (1 -3) 以溶液中的氧氣當作為GOD(FADH2)之電子接受者（electron acceptor) ’ GOD(FADH2)的電子會轉移至氧氣，而使其還原成水並使 本身氧化為GOD(FAD);如式1-4所示： 201122112
TW5583PA GOD(FADH2) + 〇2 GOD(FAD) + H202 (1-4) 結合式1-4與式1-3可得式1-5: (1-5) β-D-Glucose + 02 gluconic acid + H202 如第1圖所示之生物感測器’具有將生化訊號轉變成電子訊號， 以便於進行數值化分析處理及輸出顯示的優點，若應用不同的電子元 件’則可以組成不同塑態的生物感測器。在第1圖中，訊號轉能器12 除了能將物理或化學之變化量轉變成可測量之電子訊號，在適當條件 下，此電子訊號的強度亦與特定之化學物之濃度成正比。若依照訊號 轉能器12的構造與換能機制的不同，則大致可略分為三大類：（1)電 化學式生物感測器、（2)光學式生物感測器和(3)質量式生物感測器，其 等各有其優缺點。 …電化學生滅測H是利用了電化學測量方法中的電位、負 :::電感訊號轉能器’配合上經修飾之電極所組成的生物感測器，^ 而生物分子來與待測樣本中的待測物質進行催㈣ 二:該極表面之觸媒進行電化學氧化細 葡萄搪所使用的葡萄糖感測器為例，固定於電相 應生:===擴:與待測溶液的葡萄糖分子進行_ 氧化還原反應，並產生電流‘至=表料進行電化學 物感測層對對於待測物質之專，專-二 201122112
TW5583PA 優點’並具有無需昂貴複雜的儀器設備、訊號反應/應答時間快速、良 好的線性偵測範圍區，以及操作流程簡易等優勢，其之簡便性有助未 來臨床應用上的普及化，因而成為現今研究上的熱門課題。根據電子 訊號之特性，電化學轉能器又可分為三種：電位式(p〇tenti〇rnetric)、 電流式(Amperometric)、電導式（Conductometric)轉能器，其中又以電 流式電化學轉能器最常被採用。
一般製備微型生物感測器之方法是先用厚膜印刷技術（Screen Printing)將觸媒固定在微型生物感測器之工作電極上’等微型感測器 製備元成，再利用傳統酵素固定化方法來將酵素固定於表面。請參照 第2圖，其繪不-種傳統微型生物感測器的層狀結構示意圖。傳統上 所製備的微型生物❹m之缺點在於：此方法製程之卫作電極（包 括基材和銀線22)表面之結構’係屬於觸媒/酵素分層堆積之結構： =層為觸媒：24，外層為酵素層26。以酵素層％為葡萄糖氧化 =素為例，-般傳統之_定化㈣糖氧化酵素於電極表面之厚度約 為60〜80 μηι。如第2圖所示之層狀結構有可能隨著酵素層％的厚度 :=:=層Α造厂成阻礙’並使表面經由.葡萄糖氧化酵 力，並導致μ之質傳阻 下的靈敏度(Sensitivity)下降。 ^ 11在尚濃度葡萄糖環境 再者，以傳統方法來製備微型生物 ^ 手續且觸媒材料與酵素分子均為高二二而要相當多道之製程 測器之手續往往需要過量的觸媒材料二素二傳統製造微型生物感 能力，而使微型生物感測器之生產成本無法二=，以達到預定之感測 【發明内容】 201122112
TW5583PA 有鑑於此’本發明提供一種具均勻結構之複合式觸媒/酵素及豆製 備方法’其具錢好再雜、敎性解確性，並可應料有機好 偵測器或生物感測器（如微型生物感測器）之基材固定化等各種相當廣 泛之領域。 田兴 根據本發明，其提出一種複合式觸媒/酵素結構，苴包括均勻曰 合和分佈的複數_媒粒子和複數_素分子，其巾料酵素分子 用於催化—生物分子反應，該等觸雜子係用於催化—電化學物質反 ’其係利用一電泳沉積法而在—適當電泳沉積條件下，同時 复數個觸媒材料與酵素分子，而於-基材表面形成 二 膜。此複合式觸媒酵素結構可被用來物型感 勒之生物感測元件中的—卫作電極。根據本發明，其提出一種微 電極之製備方法，其包括：提供—基材；提供—電泳溶液，立 數個觸雜子和複數個酵素分子；並姻—電泳沉積法在: 讀條件下，㈣將沉積觸餘子和酵素分子沉積於一基材 传基材之表面形成一複合式觸媒/酵素薄膜，其中該薄膜 係匕括均勻^合的觸媒粒子和酵素分子。 樹虞树明，其提出—種微型生物感測器，其包括—生物感測元 gica recognition element ^ Bioreceptor) ^ ^ E (Signal 錢_ (Slgnai Pmeessor)。該生滅測元件在座__ 待測物質結合或反應後，會產 ... 入作電極包括-基材和形成於基材表面之-福 二素轉’且該薄膜係包括均勻混合和分佈的複數個觸媒极 :=酵素分子，其+該等酵素分子係用於催化-生物= ==:係用於催化一電化學物質反應，且係藉由-電= 、料和酵素分子同時沉積於基材上，以形成均勻結構之 201122112
TW5583PA 複合式觸媒/酵素之卫作電極。該訊號轉能器係、將物理/化學變化值 化成厂電子訊號。該訊號處理器係接收和處理訊號轉能器所產生 子訊唬。經實驗證實所應用之微塑生物感測器可在室溫下具有長達^ 天以上的保存舰。因此本發明之複合式酵素電極能應料製^ 具有良好舰性、狀性鮮確性之均自複合柄媒/料結構 物感測器。 生
為讓本發明之上述内容能更明顯易懂，下文特舉實施例，並 所附圖式，作詳細說明如下： Q 【實施方式】 本發明係提出一種具有均勻結構之複合式觸媒酵素薄膜結構及 其製備方法與應用。第3 ®係料本發明—實關之複合式觸媒哮素 薄膜結構之示意圖。其中複合式觸媒酵素薄膜35係形成於一基 材(例如是一工作電極)33之表面，且複合式觸媒酵素薄膜35係包括 均勻混合和分佈的複數個觸媒粒子353和酵素分子355，而觸媒粒子 353和酵素分子355係形成於觸媒擔體351上。其中，該些酵素分子 355係用於催化一生物分子反應，該些觸媒粒子353係用於催化一電 化學物質反應。例如在一應用例中，催化生物分子反應之酵素分子， 係與生物:¾子反應而形成過乳化氫(出〇2 ’ Hydrogen Peroxide)，而催 化電化學物質反應之觸媒粒子則與過氧化氫進行一電化學氧化還原 反應。再者’在一實施例中，觸媒擔體351可以例如是碳黑擔體 (Carbon，XC-72R)。在一實施例中，觸媒粒子之一平均粒徑可介於約 0.5奈米至約100微米之間。在本發明實施例中係藉由一電泳沉積法 (Electrophoretic deposition，EPD)來同時將觸媒粒子353與酵素分子 355沉積於基材33之表面上，應用於一微型感測器時，則可將觸媒粒 201122112
TW5583PA 子353與酵素分子355以電泳沉積法，同時沉積於工作電極表面。由 化學分析電子光譜儀（Electron Spectroscopy f0r Chemical Analysis, ESCA)之縱珠分析技術來探討其電極結構，可以證實利用電泳沉積法 來同時沉積觸媒與酵素時，能夠形成如第3圖所示之一層均勻結構的 複合式觸媒酵素薄膜。 在實施例中，酵素分子355可以例如是選自葡萄糖氧化酵素
(Glucose Oxidase ’ EC 1.1.3.4)、蘋果酸氧化酵素（maiate 〇xidase ; EC 1.1.3.3)、六碳糖氧化酵素(hex〇se 〇xidase ; EC i」3 5)、膽固醇氧化 酵素(cho丨esterol oxidase ; Ec 1」3 6)、芳基醇氧化酵素(aryl aic〇h〇1 oxidase，EC 1.1.3.7)、L-古洛糖酸内酉旨氧化酵素（L_gul〇n〇lact〇ne oxidase ’ EC 1.1.3.8)、半乳糖氧化酵素(gaiact〇se 〇xidase ; ec 1.1.3.9)、 六ί衣糖氧化酵素(pyranose oxidase ; EC丨丨3 1〇)、L山梨糖氧化酵素 (L-sorbose oxidase ; EC 丨丨 3 u)、吡哆醇 4 氧化酵素（pyrid〇xine 4 oxidase , EC 1.1.3.12)、甲醇氧化酵素（aic〇h〇i oxidase ; 1.1.3.13 )、 (S)_2_ 經基酸氧化酵素（（S)-2-hydr〇Xy-acid oxidase; 1.1.3.15)、蛻皮 激素氧化酵素（6〇办30加（^如此；£(：11316)、膽鹼氧化酵素（冰〇1^^ oxidase , EC 1.1.3.17)、二級醇氧化酵素（sec〇ndary_aic〇h〇l oxidase ; 1·3·18)、4-沒基扁桃酸氧化酵素（4_hydroxymandelate oxidase ; • 1-3.19)、長鍵乙醇氧化酵素（i〇ng_chain_alc〇h〇l oxidase ; EC 2〇)甘油鱗酸氧化酵素（giyCer〇i_3_ph〇sphate oxidase ; EC .1)維他命 B1 氧化酵素（thiamine oxidase ; EC 1.1.3.23 )、 經基錫酸鋅氧化酵素（hydr〇xyphytanate⑽也％ ; £(： 1」3 27)、n_ 醜基己糖胺氧化酵素（N_acylhex〇samine 〇xidase ; Ec i」3 29)、聚 乙稀醇氧化酵素（P〇lyvinyl-alcohol oxidase; EC 1.1.3.30)、内酯氧 化酵素（D-Arabinono-1,4-lactone oxidase; EC 1.1.3.37)、香莢蘭醇 201122112
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氧化酵素（vanillyl-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.38)、核芽氧化酵素 (nucleoside oxidase (H202-forming) ; EC 1.1.3.39)、D-甘露糖醇氧 化酵素（D-mannitol oxidase ; EC 1.1.3.40)、木糖醇氧化酵素（Xyiit〇i oxidase; EC 1.1.3.41)、纖維二糖脫氫酶（cell〇bi〇se dehydrogenase (acceptor); EC 1.1.99.18)、曱酸脫氫酶（formate dehydrogenase; EC 1.2.1.2)、乙搭氧化酵素（aldehyde oxidase; EC 1.2.3.1 )、丙酮酸氧 化酵素（pyruvate oxidase ; EC 1.2.3.3)、草酸氧化酵素（oxaiate oxidase ; EC 1.2.3.4)、乙越酸氧化酵素（gly0Xyiate oxidase ; EC 1.2.3.5 )、丙酮酸氧化酵素（CoA-乙醯化）（pyruvate oxidase (CoA-acetylating) ; EC 1.2.3.6)、芳基醛氧化酵素（aryi_aidehyde oxidase ; EC 1.2.3.9)、視黃醛氧化酵素（retinal oxidase; EC 1.2.3.11)、 ABA 搭氧化酵素（abscisic-aldehyde oxidase ; EC 1.2.3.14)、酮戊二 酸脫虱 S# (破 ϊό 酿基轉換）（〇x〇glutarate dehydrogenase (succinyl-transferring) ； EC 1.2.4.2 )、二氫乳清酸氧化酵素 (dihydroorotate oxidase ； EC 1.3.3.1 )、糞。卜琳原氧化酵素 (coproporphyrinogen oxidase ； EC 1.3.3.3)、芳基-輔酶 A 氧化酵素 (acy 1-Co A oxidase ’ EC 1.3.3.6)、二氮尿唆。定氧化酵素（dihydrouracil oxidase，EC 1.3.3.7)、四虱小禁域氧化酵素（tetrahydroberberine oxidase , EC 1.3.3.8 )、色氣酸 -氧化酵素（tryptophan
alpha，beta-oxidase’EC 1.3.3.10)、PQQ 合酶（pyrr〇i〇qUin〇line -quinone synthase ’ EC 1 ·3·3· 11 )、L-半乳糖酸内 g旨氧化酵素（L-galactonolactone oxidase ’ EC 1·3_3_12)、方基輔 A 脫氣酶（acyl-CoA dehydrogenase ; EC 1.3.99.3 ) >一 氣乳清酸脫氣每（dihydroorotate dehydrogenase ; EC 1·3·99·11)、D-天冬氨酸氧化酵素（D-aspartate oxidase; EC 1·4_3·1)、 L·氨基酸氧化酵素（L-amino-acidoxidase;ECl_4.3.2)、D-氨基酸氧 201122112
TW5583PA 化酵素（D-amino-acid oxidase ; EC 1.4.3.3)、胺基氧化酵素（含類黃 素）（amine oxidase (flavin-containing) ; EC 1.4.3.4)、哆醛 5，-鱗酸合 成酶（pyridoxal 5'-phosphate synthase ; EC 1.4.3.5 )、胺基氧化酵素（含 銅）（amine oxidase (copper-containing) ; EC 1.4.3.6)、D-縠氨酸鹽氧 化酵素（D-glutamate oxidase ; EC 1.4.3.7 )、乙醇胺氧化酵素 (ethanolamine oxidase ; EC 1.4.3.8)、腐胺氧化酵素（putrescine oxidase ; EC 1.4.3.10)、L-穀氨酸鹽氧化酵素（L-glutamate oxidase ; EC 1.4·3_11 )、壞己胺氧化酵素（cyclohexylamine oxidase ; EC 1.4.3.12 )、蛋白質-離氨基酸 6-氧化酵素（pr〇tein-lysine 6-oxidase ;鲁 EC 1·4·3·13 )、L-離氨基酸氡化酵素（L-lysine oxidase ; EC 1.4_3·14)、 D-毅氣酸鹽（D-天冬氨酸）氧化酵素（D-glutamate(D-aspartate) oxidase ’ EC 1.4.3.15) 、L-天冬氨酸氧化酵素（L-aspartate oxidase ; EC1.4.3.16)、甘氨酸氧化酵素（giyCine oxidase;EC 14.3.19)、L-離氨基酸6-氧化酵素（L-lysine 6-oxidase; EC 1.4.3.20)、胺基脫氫 酶（amine dehydrogenase ; EC 1.4.99.3 )、FMN 還原酵素（FMN reductase ’ EC 1.5.1.29 )、肌氨酸氧化酵素（sarcosine oxidase ; EC 1.5.3.1 )、N-甲基-L 胺基酸氧化酵素（N-methyl-L-amino-acid oxidase ; EC 1.5.3.2 )、N6-甲基-離氨基酸氧化酵素（N6-methyl-lysine oxidase ;鲁 EC 1.5.3.4)、（S)-6-經基煙酸氧化酵素（⑻_6-hydroxynicotine oxidase ; EC 1.5.3.5 ) 、（R)-6-經基煙酸氧化酵素（（R)_6_hydroxynicotine oxidase，EC 1.5.3.6)、L-甲基瓜咬（L-pipecolate oxidase ; EC 1.5.3.7 )、 -一曱基甘氣酸氧化酵素（dimethylglycine oxidase ; EC 1.5·3.10 )、多 胺氧化酵素（polyamine oxidase; EC 1.5.3.11)、DHBP 氧化酵素 (Dihydrobenzophenanthridine oxidase ； EC 1.5.3.12)、三甲胺脫氫酶 (trimethylamine dehydrogenase ； EC 1.5.8.2)、L-六氫吡啶羧酸脫氫 12 201122112
TW5583PA 酶（L-pipecolate dehydrogenase; EC 1.5.99.3)、細胞分裂素脫氫酶 (cytokinin dehydrogenase ； EC 1.5.99.12) 、NAD(P)H 氧化酵素
(NAD(P)H oxidase ; EC 1.6.3.1)、NAD(P)H 脫氫酶（對笨三酮） (NAD(P)Hdehydrogenase(quinone) ; EC 1.6.5.2)、亞硝酸還原酵素 (nitrite reductase (NO-forming) ; EC 1.7.2.1)、硝基烷氧化酵素 (nitmalkane oxidase ; EC 1.7.3.1)、尿酸氧化酵素（urate 〇xidase ; EC 1.7.3.3)、3-硝基丙酸曱酯氧化酵素（3_aci_nitr〇pr〇pan〇ate⑽此纪； EC 1.7.3.5) 一鼠硫辛醯脫氫酶（dihydrolipoyl dehydrogenase ; EC 1_8·1·4)、亞硫酸鹽氧化酵素（suifite oxidase; Ec i s.3.1)、硫醇氧 化酵素（thiol oxidase; EC 1.8.3.2)、縠胱甘肽氧化酵素（glutathi〇ne
oxidase，EC 1.8.3.3)、甲硫醇氧化酵素（methanethiol oxidase ; EC
1.8.3.4) 、烯化半胱胺酸氧化酵素（prenylcysteine oxidase ; EC 1.8.3.5) 、3-經鄰氣本甲酸氧化酵素（3-hydroxyanthranilate oxidase ; EC 1.10.3.5 )、雷福黴素-B 氧化酵素（rifamycin-B oxidase ; EC 1.10.3.6)、NADH 過氧化物酶（NADH peroxidase; EC 1.11.1.1)、 2-硝基丙烧加雙氧酶（2-nitropropane dioxygenase ; EC 1.13.11.32 )、 賴胺酸 2-單加氧酶（lysine 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.2)、乳酸 2-單加氧酶（lactate 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.4)、螢光素 4-單 加氧酶（ATP 水解化）（Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing); EC 1 · 13.12.7 )、苯丙氨酸 2-單加氧酶（phenylalanine 2-monooxygenase； EC 1.13.12.9)、clavaminate 合成酶（clavaminate synthase ; EC 1.14.11.21)、石腦油精 1,2-雙加氧酶（naphthalene 1,2-dioxygenase ； EC 1.14.12.12) 、4-胺基苯曱酸乙酯 1-單加氧酶 (4-aminobenzoate 1-monooxygenase ； EC 1.14.13.27)、烷醛單加氧 酶（alkanal monooxygenase (FMN-linked) ; EC 1.14.14.3)、苯丙胺酸 13 201122112
TW5583PA 4-單加氧酶（phenylalanine 4-monooxygenase ; 1·14·16·1)、卻月女本甲 酸鈉 3-單加氧酶（anthranilate 3-monooxygenase ; EC 1· 14.16.3 )、單 酌單加氧酶（monophenol monooxygenase ; EC 1.14.18.1)、膽甾稀 醇氧化酵素（lathosterol oxidase ; EC 1.14.21.6)、超乳化物歧化_ (superoxide dismutase ; EC 1.15.1.1)、超氧化物還原酶（suPer〇xide reductase ; EC 1.15.1.2)、黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase ; EC 1.17.1.4)、黃"票呤氧化酵素（xanthine oxidase ; EC 1.17.3.2)、 6-經基柊驗脫氫酶（6-hydroxynicotinate dehydrogenase; EC 1.17.3.3)、 香篇枝域酵素（reticuline oxidase ; EC 1.21.3.3 )、二碟酸核酮糖叛化 酶（Ribulose-bisphosphate carboxylase; EC 4.1.1.39)所組成之群組。 在一實施例中，觸媒粒子353可以是一單一金屬元素Μ、一二元 金屬Μ-Χ、一單一金屬氧化物MOy、一二元金屬氧化物MOy-XOy、 一金屬-金屬氧化物複合材料M-MOy、或是包括前述類型所任意選擇 之組合。其中y係小於3，而Μ與X例如是選自：鋰(Li)、鈉(Na)、 鎂(Mg)、鋁(A1)、鉀(K)、鈣（Ca)、鉻(Cr)、鐘(Μη)、鐵(Fe)、钻(Co)、 鎳(Νι)、銅（Cu)、鋅(Zn)、鎵(Ga)、鳃(Sr)、釔(γ)、鍅(zr)、鈮(Nb)、 鉬(Mo)、釕(RU)、铑(Rh)、纪(Pd)、銀(Ag)、鎘(Cd)、銦(In)、錫（Sn)、 鋇(Ba)、鑭(La、鈽(Ce)、錯（Pr)、鈥(Nd)、釤（Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、 铽(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、铒(Er)、鍤(Tm)、镏(Lu)、鈕(Ta)、鎢（W)、 餓(〇s)、銥(Ir)、鉑(Pt)、金(Au)、鉛(Pb)、鉍(Bi)所組成之群組。在一 實施例中，觸媒粒子353可以例如是由二元金屬與該二元金屬氧化物 所組成’其金屬元素莫耳比係大於〇小於丨〇〇0/。。 以下係以鉑銥(Ptlr)奈米金屬觸媒作為觸媒粒子，並以葡萄糖氧 化酵素作為酵素分子為例作為一實施例之相關說明，其係為利用於工 作電極上同時固定鉑銥奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵'素，以與電化學 201122112
TW5583PA 轉月匕器結合的葡萄糖感測器 反應之酵素分子-葡萄糖氧化酵心二應::：，催化生物分子 氫(H2〇2，Hydr〇genPer〇xide) ；^物刀子反應，而形成過氧化 氧化氫進行-電化學氧化'以Z媒粒子，銀奈米金屬觸媒-則與過 積法(EPD)，來將觸媒盘二、：f。貧施例之内容主要係應用電泳沉 Ϊ 時固定於微《應作電極表面 生物感測酵素結構之微型 銀奈米金屬觸媒與葡萄糖氧“；:、= = 析；和(C2)同時將池儿積於微型感測器之電極結構分 感測器之電化學特性分7 與葡萄糖氧化酵素’沉積於微型 下之3明明ΐ有相同領域知識者當可知，本發明並不僅限於如 萄糖氧化—實驗例巾所述·使用奈錢銀(雙元）金屬 觸媒和葡 種類和酵素分子所所2出:觸媒分子 it €.1 Λ, ^ . W田選擇，並利用電泳沉積之製備方法來 器之應用*°式觸媒酵素結構因此本發明也不僅侷限於葡萄糖感測 <c •ϋ沉積法沉積奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵素於微型感測器> :冗穑二^本發明，其制用電㈣積法來同時將觸媒粒子與酵素分子 將it型感測器。電泳沉積法係、藉由施加電場所產生之驅動力，來 液k帶電粒子沉積於〜電極上以達到沉積之目的。而依照 萄撼2—較佳實施m冗積法係同時將歸奈米金屬觸媒與葡 齡積於微型感㈣上。電泳溶液的配製方法為將適量的 ϋ米金屬觸媒、Μ糖氣化酵素與NafiGn均勻混合於PBS中， 形成具有穩定相之懸浮料1泳溶液中帶有電荷的分子有：歸〇n 15 201122112
TW5583PA :解離出氫離子後，而使本身因有亞硫酸根官能基而呈現帶
^ S Γ葡萄糖氧化酵素的Pl值為4.2，在PH值約為7.4的PBS 具有_之分子m金屬觸媒之 體上二離子聚合物_。用，NafiGn會附著於觸媒之擔 N f.雜Z又面▼有負電。因此’在叉到電場所驅動之下，帶負電的 合物、葡賴氧化酵素以及—奈米金屬觸媒，便會往 ▼有正電何之陽極移動，並沉積在微型感—之卫作電極表面。 影，電泳沉積法之參數可略分為兩部分：⑴電泳溶液的狀態⑺ =泳程序的條件。電泳溶液狀態包含有懸浮粒子的尺寸、懸浮粒子的 液的介電常數、溶液的導電性、溶液的黏度以及溶液的 •疋度相素。電泳程序的條件包含有沉積時間、施加電壓溶液中 懸浮粒子濃度、基材導電性等因素。 在-實施例中，配製電泳溶液之步驟如τ:首先，將適量之夺米 加人溶劑中，放置於超音波震㈣3G分鐘使其 二' μ半接著將適里之葡萄糖氧化酵素加人於電泳溶液中使其均^ 步驟不宜使用超音波震i機以避免酵素失去 完 成後’將電泳溶液保存於π環境下。 備好之電泳溶液放置於攪抹哭7 肘已製 將欲沉積觸媒與酵素之微型感心微中 沉積完成後之微型感測器放置於^電^疋電流之電泳沉積程序。將 中以備使用。⑽如相關技藝者=中自顏乾。之後放置於夾鏈袋 僅為參考，而非用以偶限本^明1^實施例所敘述之步驟與參數 各項參數值’均可依實際應用需求其之相關施行步驟與 201122112
TW5583PA 泳沉精法同時於徵璧穑ptir奈来金屬觸媒與 «葙糖氩化酵素結椹 “在實施例中係針對前述以電泳沉積法，同時將鉑銥奈米金屬觸媒 與葡萄糖氧化酵素沉積於微型感測器之電極進行結構分析。其中，其 係利用化學分析電子光譜儀(ESCA)之縱深元素分析，來探討ς同帶電 / 一 “欠况積至電極表面之分佈情形，其結果顯示結構的確如第3圖 所不，可於基材之表面上形成一層均勻結構之複合式觸媒/酵素薄膜。 以下係提出實施例之實驗中採用化學分析電子 :深元素分析’來觀察不同帶電粒子電泳沉積至電極二： 深声k ' Ν以及F之束缚能(Billding Energy)(附表1}和XPS 又乃―利用5 kV的氬氣離子搶（Argon Ion Gun)進行蝕列，蝕刿 秒)(附圖”所得到之元素分析，可知束缚能 ^ 切能位置，積分面積可得到該元切 ：：：：：^
第4圖為ESCA分析If_mini %嶋丨電極表面 :咖氧Γ化酵素之縱深分佈，其中係利…的氯氣 ，單次韻刻時間——i = ^ ===間的組成是否均勻分布，其…二;： 觸素—。從第C 子的葡萄糖氧化酵素所提供膜之推整^且成，大曰部分都還是由帶有N原 較於表面包附Nafi on之麵銀太^今還因應該疋因為葡萄糖氧化酵素相 (V} t , +. u 不未金屬觸媒，係具有更高的電、 (EWophorenc 201122112
TW5583PA 並且從第4圖中也可以觀察出葡萄糖氧化 之影響，由於在電泳溶 糖素·^積比率會 =⑽早體分子表面都是呈現負電荷 ^^化酵素分子與 萄糖氧化酵素分子與N—單體分子，= = 活性位置，戶斤以告 兄t電極表面的電化風 酵素分子之‘置 瓣㈣同㈣了葡萄糖氧Γ匕 第4圖較難觀察pt與ir於此 元f論。第5圖魏大第^ηίΐ 的葡萄糖氧化酵素所包覆，因此最外層之金==::)液: =刻時間皆呈現穩定之組成分佈，其顯示㈣泳:;== 屬觸媒’可以提供—個均勻穩定之結構，其結構將 三 積之葡萄糖氧化酵素得以穩定固定於表面。由第4圖與第5圖可= 電極縱向組成分佈相#之均勻，其證明_此方法確實能構成混合均 勻之複合式觸媒/酵素薄膜結構於微型感測器之電極表面。 £j.··冋時/儿積有始欽奈米金屬觸媒與葡葙糖氳化酵素於播刑成I_ 器之電化學特性分浙 實施例中亦針對同時沉積有鉑銥奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵 素於微型感測器進行多種電化學特性分析，包含了微型感測器之線性 感測區（Linear Detecting Range)、最低偵測極限（Limit 〇f detection，LOD)、干擾物測試(Interference Test)、微型感測器之再現性 (Reproducibility)與穩定性測試 '酵素催化反應動力學之討論，以及微 型感測器之長時間穩定性測試(Long term Stability)等測試。以下係列 201122112
TW5583PA 出部分實驗結果以供參考。 實施例中亦對於同時沉積有鉑銥奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵 素之微型感測器（EPD_PtIr+G0D士_mini sens〇r)進行相關實驗，其係 較佳的可以偵測葡萄糖施加電位值。附圖2為EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor在不同濃度之葡萄糖濃度的pBs溶液下，所量測之循環伏安曲 線圖（cyclic v〇丨tammetry，cv) ’ 掃描範圍為 _〇 4 v 至 〇 4 v (vs pHnted
Ag/AgCl) ’掃描速率為5〇 mV/s，掃描圈數丨〇圈。從附圖2中可以發 現約在0.2 V (vs. Printed Ag/AgC丨)會具有明顯隨著雙氧水濃度增加而 逐1 士升，氧化電流，而約在_〇 25 v ( vs pHnted Ag/AgC1)則會有明 =著雙氧水濃度增加而逐漸上升之還原電流。從附圖2中可以發現 著電壓上升，氧化電流隨之增加，表示施加電位越高，偵測葡萄糖 能力越高。但由於人體血液中有很多其他干擾物，本身也是電化學活 性物質’若施加電位過高，干擾物也會—起隨之反應，而造成電流訊 號的干擾Θ此’必須找尋—個有適當之感測電位，使葡萄糖氧化生 成之雙氧水能財良好之氧化能力，並且能夠避免干擾物在此電位下 進行反應，將會是一個相當重要的課題。 4 =下實驗係揼討藉由電泳沉積法同時沉積有始銀奈求金屬觸媒 :、葡萄糖氧化酵素之微型感測器，對於量測溶液中不同濃度葡萄糖之 表佳施加電位制用不同施加電位進行定電流應答法(細^_此 腦麵1—)，來比較施加電位對於葡萄糖感測能力之影響。 般似用於伯測糖尿病患者之血糖所需之線性债測區為Μ〗 二：二'要能夠符合於實際伯測血液中之血糖制，適當範 區，為判斷是否適用於感測血糖的關鍵之-。在 =實驗中：得知最適化量測雙氧水之施加電位為〇 3 V㈧p-ed g g )之後’可以進行改變施加電位效應，而分別於〇3v、〇4v
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TW5583PA 以及0.5 V (vs. Printed Ag/AgCl)下進行不同葡萄糖濃度之感測來比 較施加電位對於電流値與葡萄糖感測能力。而不同施加電位所量測之 电流値與葡萄糖感測能力的結果(樣品數=3 )’係分別如第6 g、第7 圖以及第8圖所示，其中每隔60秒就收集一次電流數值。 從第6圖〜第8圖中可以看出施加不同電位對於葡萄糖感測之線 性範圍皆有不同。在第6圖中，施加0·3 V (vs.printed Ag/AgC1)之葡 萄糖感測線性範圍為2 mM〜12 mM。在第7圖中，施加0.4 v (vs.Printed Ag/AgCl)之葡萄糖感測線性範圍為2 mM〜20 mM。在第8 圖中’以及施加0,5 V (vs.Printed Ag/AgCl)之葡萄糖感測線性範圍為4 mM〜20 mM。從結果可以看出施加電位於〇.4 v (vs.Printed Ag/AgCl> 時，相較於0.3 V (vs.Printed Ag/AgCl)具有更高濃度之線性範圍。當 施加電位增高為0.5 V (vs.Printed Ag/AgCl)時，其可能是電極表面產 生一些副反應的影響，可以看出葡萄糖感測之偏差值係明顯高於施加 電位為 0.4 V 與 0.3 V (vs.Printed Ag/AgCl)時。 第9圖為EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini於sensor施加不同電位下，對 於不同施加電位0·3 V、0.4 V以及0.5 V之線性範圍區所得到之氧化 電流與葡萄糖濃度曲線圖，其中工作溶液為〇.〇1 Μ之PBS溶液 <ρΗ=7·4>，每隔60秒收集一次電流數值。而表1分別為 EPD-Ptlr-Ir-mini sensor在不同施加電位下之葡萄糖感測靈敏度 (Sensitivity)與檢量線之線性相關係數(Hner coreiati〇n)R2。 表1 施加電位 葡萄糖敏感度 線性相關係 (Potential，V vs. Printed (Glucose 數 0.3 Vb 2.03 χ 102 0.996 0.4 Vb 2.27 x ΙΟ-2 0.995 201122112
TW5583PA 0.5 Vb 3.63 x 10~2 0.985 a. 溫度·· 25 °C(±1 °C) "" b. 電泳沉積參數：定電壓法施加電壓0.5 V，沉積時間5 mins 溶液參數（Slurry Parameters) :1 mg Ptlr/C奈米金屬觸媒+ pL 5% Nafion + 20 mg GOD使其均勻混合並分散於1 mL 0.01 M PBS 溶液 ' c. 測試樣品數=3 從第9圖可以看出葡萄糖感測靈敏度會隨著施加電位上升而增 加，其中可以觀察出隨著施加電位上升而增加之雙氧水感測靈敏度， 在 0.4 V 至 0.5 V (vs. Printed Ag/AgCl)下有最大改變量（約 1.4X1CT8 A/mM)，但雖然施力口電位於0.5 V (vs. Printed Ag/AgCl)具有較高的葡 萄糖感測靈敏度’但相對於施加較低電位之微型感測器所造成的誤差 較大。 因此’從上述貫驗結果可知：將施加電位設在0.4 v (vs.Printed Ag/AgCl)下’可以得到最佳之葡萄糖偵測線性範圍（2mM~；20mM)並 且具有較低之偏差值。 之後的實施例將再針對施加電位於0.3 V與0.4 V (vs. Printed Ag/AgCl)下，對干擾測試(Interference Test)、偵測極限(Limiting of 籲 detection ’ LOD)與再現性(Reproducibility)進行相關實驗與研究。 干擾測試 對％ 般的葡萄糖生物感測器而言，維生素C(Ascorbic Acid， AA)與尿酸(Uric Acid ’ UA) ’為兩種在人體血液中相當常見之電活性 干擾物吳，若施加電位過高，干擾物也會一起隨之反應，而造成電流 訊號的干擾。因此，必須找尋一個具有適當之感測電位，以使葡萄糖 氧化生成之雙氡水能夠具有良好之氧化能力，並且能夠避免干擾物在 此電位下進行反應。 21 201122112
TW5583PA 根據已有文獻指出：一般人體血液中之維生素c平均含量約為 0.4〜0_6 mg/dL，而尿酸於人體血液中之平均含量成年男性約3 5〜7 2 mg/dL，而成年女性約2.6〜6.0 mg/dL·。而在實施例之實驗中所使用之 維生素C與展酸濃度，則設定於略高於一般平均值之濃度，其等分別 為1.5mg/dL與8mg/dL，以做為干擾測試之討論。實驗中將於溶液中 先加入5 mM的葡萄糖濃度並偵測電流訊號，爾後在相同溶液中各別 加入適當量之維生素C與尿酸，以分別觀察適量葡萄糖濃度之環境下 干擾物對於電流訊號之影響。
*第10A、10B圖為利用電泳沉積法同時沉積有鉑銥奈米金屬觸媒 與葡萄糖氧化酵素之微型感測器（樣品數=3)，於各別施加電位〇3 V 與（|.4 V (vs· prmted Ag/AgC1)下分別量測5福葡萄糖溶液、5 mM 葡萄糖+1.5 mg/dL維生素C溶液，以及5 mM葡萄糖+8 mgML尿酸溶 液之電流値比較。其中，第10B圖是第1〇A圖中各溶液數據相較於5 mM葡萄糖溶液的相對電流百分比。 從第10A、10B圖中可顯示出施加電位於〇 4 v (vs printed Ag/AgCl)時文到干擾物之電流影響係小於施加電位於〇 3 v PnntedAg/AgCl)時。一般而言，施加電位越高所受到干擾物之影響會 越嚴重，但在本節實驗中的結果卻發現施加電位較高，相較於施加低 電位具有較好之選擇性。推測原因可能是因為較低之電位對催化雙氧 水的能力不足而造成氧化電流較小，因此造成受到干擾物之影響較為 劇烈。相對地，施加較高之電位能夠增加對雙氧水之催化能力，因而 增加了對葡萄糖的電流應答，使對維生素c、尿酸的電流應答受到壓 縮，所以才降低維生素C和尿酸的干擾。因此從實驗結果所得到之 干擾測試結果發現’實施例中，在施加電位於〇 4 V (vs
Printed
Ag/AgCl)的情況下，可以得到較佳的感測器性能。 22 201122112
TW5583PA 萄糖之最低偵測極限 # ^ %例中亦對於利用電泳沉積法同時沉積有鉑銥奈米金屬觸媒 與葡萄糖氧化酵素的微型感測器之最低偵測極限(Limit of detection, L0D)進行相關實驗。 第1圖與苐12圖分別為利用EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor，施 加電位為0.3 v與〇·4 v (vs. Printed Ag/AgCl)之電流-時間圖，其中葡 φ 萄糖/辰度範圍為0μΜ〜200μΜ，工作溶液為〇_〇1 Μ之PBS溶液 <ρΗ一7·4>。每次加入不同的葡萄糖濃度，然後分別由第11圖與第12 圖可以汁算出最低的有效訊號’若是訊號/雜訊比（S/N)大於3，則為 有效訊號；若是訊號/雜訊比（S/N)小於3，則為無效訊號《因此，從 圖中可以得知施加電位於〇 3 V與〇 4 V (vs printed Ag/AgC1)之最低 偵測極限分別為80 μιη與100 μπι。其之原因可能在於高施加電位情況 底下係具有較大的背景電流(Background current)訊號，因此在低濃度 下所得到之訊號訊比不及低電位來的好。 微型感測器之再現性輿孩它枓 ® 製備感測器最重要的就是要能夠提供使用者一個準確率高且重 現性佳之感測結果。再現性(Reproducibility)是指在不同的人，不同的 儀器，不同的時間等等之不同的條件下，皆能獲得相同測量值的能 力。如果具有良好的可再現性，表示利用電泳沉積法所製備之微型感 測器的製程條件相當之穩定’能夠提高微型感測器之良率並提高訊號 之可信度。重複性(Repeatability)是指感測器在相同的條件下得到相同 測量值的能力，如果具有良好的可重複性，其表示利用電泳沉積法所 製備之微塑感測器，係具有重複使用的能力，利用電泳所沉積之觸媒 23 201122112
TW5583PA 與酵素’在經由測量過程巾與在清洗電極的過程巾還是具有相當穩定 之結構。本發明實施例亦針對再現性和穩定性（重複性）進行相關田實驗。 第13圖為利用EPD_PtIr+G〇D_Ir_mini则沉藉由定電位分析 法，於施加電位為0.4 V(vs. printed Ag/AgC1)、測量葡萄糖濃度範圍 2 m Μ〜2 0 m Μ下所得到之電流時間圖，其中工作溶液為〇 〇丨M之p b § 溶液<PH=7.4>，每隔60秒收集一次電流數值。三次測量均使用不同 組微型感測器’此實驗目的在於藉由測量不同組微型感測器來判斷可 再現性之咼低。從第13圖與表2可以看出三次測量均獲得相當接近 之數據’其之相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD)為 7.14%，由此顯示利用電泳沉積法於微型感測器上，同時沉積鉑銥奈
米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵素之製造流程係相當穩定’因此具有相當 良好之可再現性。 W 表2 電流（Current，μΑ)& 葡萄糖濃度 (Glucose Cone.，mM) 樣品-1 (Sample-1 樣品-2 樣品-3 平均值 )(Sample-2b) (Sample-3b) (Average) 標準偏差 (S.D.C) 相對標 準偏差 (R.S_D.C) 2 2.51x10'' 2.64xl〇·' 2.80x10'' 2.65x10'' 1·44χ1 0·2 5.43% 4 3.2〇xl〇·' 3.64x1ο-1 3.66x10·' 3.5〇χ1〇·' 2.58χ10'2 7.37% 6 3.61x10'' 4.02x10-' 4.04x10'' 3.89x10'' 2.44Χ10'2 6.27% 8 4.15x1ο，1 4.35x10-' 4.38χ1〇·' 4.30Χ10·1 1.27x10-2 2.96% 10 4.63x1ο—1 4.80x1ο·1 4.73x10'' 4.72x1ο·1 8.69χ1〇·3 1.84% 12 5.12X10'1 5.14x1ο·1 5.08x10'' 5.12χ10-1 2.99x10 3 0.58% 14 5.68x1ο.1 5.51x10' 5·56χ10-1 5.58x10'' 8.41 χΙΟ·3 1.51% 16 6.14x10·' 5.81χ1〇·' 5.98χ1〇·' 5.98Χ10'1 1.66x10'2 2.78% 18 6.56x10'' 6.46x1ο，1 6.38χ1〇·' 6.47x10·1 9.22χ10·3 1.43% 20 7.08x10'' 6_81 χΙΟ.1 6.78x10*' 6.89x10'' 1.66χ10·2 2.41% a. 溫度：25°C(±1 °C) b. 電泳沉積參數（EPD parameters):定電壓法施加電壓0.5 V，沉積時間5 mins
溶液參數（Slurry Parameters) : 1 mg Ptlr/C 奈米金屬觸媒 +5 μι 5% Nafion + 20 mg GOD使其均勻混合並分散於2 mL 0.01 M PBS溶液 c.樣品數=3 24 201122112
TW5583PA 表3為EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor藉由定電位分析法，於施加 電位為0.4 V (vs. Printed Ag/AgCl)，測量葡萄糖濃度為5 mM下所得 到之結果。三次測量均使用同一組微型感測器，此實驗目的在於藉由 重複測量同一組微型感測器，以判斷可重複性(Repeatability)之高低。 表3可以看出三次測量均獲得相當接近之數據，相對標準偏差（rsd) 為7.16%，由此顯示利用電泳沉積法來製備翻鈒奈米金屬觸媒與葡萄 φ 糖氧化酵素之微型感測器，可以具有相當良好之可重複性，其顯示藉 由電泳沉積法來將鉑銥奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵素同時沉積於 微型感測器之工作電極，能夠穩定固定於電極表面形成一個良好的觸 媒/酵素複合層之結構。 表3 電流（Current，μΑ) 樣品 (Sample13) 葡萄糖濃度 (Glucose Cone., mM) 第一次第二次第三次平均值標準偏差相^標準 (Run-la) (Run-2a) (Run-3a) (average) (S.D.C) 3.94x1ο·1 3·98χ10-1 3.49x1ο·1 3.80ΧΗΓ1 2.72xl0-2 7.16%
a. 溫度：25°C(±1。〇 b. 電泳沉積參數(epd parameters):定電壓法施加電壓0_5 V，沉積時間 5 mins 溶液參數（Slurry Parameters) : 1 mg Ptlr/C 奈米金屬觸媒 +5 μί 5% Nafion + 20 mg GOD使其均勻混合並分散於2 mL 0·01 M PBS. 相同的 mini sensor. 缝复催化反摩動力學 一般針對其酵素的催化反應可由Michaelis-Menten所提之機構 來插述；如式2-2所示： 25 201122112
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I = I|Vlaxg C 一 K^+C (2-2) 其中：I代表偵測葡萄糖應答電流(A)、IMax代表感測器之最大 理論應答電流(A)、Kmapp代表Michaelis常數(M)、C代表待測溶液之 葡萄糖濃度(M)。
Kmapp值(Michaelis constant)具有判斷待測物與酵素親合性大小之 特性。低Kmapp值則呈高親合性反應。在待測物濃度（[c])遠小於Κ/ΡΡ 時’反應速率正比於待測物濃度（一級反應）；而當待測物濃度遠大於 Km pp時，反應為零級反應，其速率與待測物濃度無關。如果要計算 · Kmapp與1咖時，利用Lineweaver-Burk方程式可獲得感測器之K app 與IMax。如式2-3所示： _1 一 1 + Ky 1 I W IMax C (2-3) 其中I代表偵測葡萄糖應答電流(A)、IMax代表感測器之最大理 論應答電流(A)、Kmapp代表Michaelis常數(M)、C代表待測溶液之葡 萄糖濃度(M)。 可利用實驗中第14圖所獲得之電流⑴與偵測濃度(c)，分別代入隹 Lineweaver-Burk方程式（式2-3)中的1/1和1/c來繪示圖形，分析其生 物感測益之相關參數。如果感測器之彳貞測範圍控制在酵素動力控制 區，經由Lineweaver-Burk方程式所繪出之圖形將會呈現線性，而可 以從直線之斜率（為Kmapp/IMax)與截距(為i/lMax)可以各別求出感測器 之 Kmapp 與 IMax。 第14圖為利用EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor藉由定電位分析法 施加電位0.3 V (vs. Printed Ag/AgCl)，來測量在葡萄糖濃度範圍是2 26 201122112
TW5583PA mM〜40 mM所得到之電流時間圖，其中每隔60秒收集一次電流數 值。從第14圖可以看出當施加電位於〇·3 V(vs.PrintedAg/AgCl)時， 在測量高濃度葡萄糖之範圍會呈現非線性，表示此濃度範圍之速率決 疋步驟反應為酵素動力控制反應(Enzyme kinetic controlled reaction)。 第15圖為第14圖中利用各別應答電流與待測濃度之倒數所繪製 而成’利用Lineweaver-Burk方程式（式2-3，線性方程式）可以獲得 藉由電泳沉積法沉積有鉑銥奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵素的微型 # 感測器之Kmapp為5.68 mM，而IMax為6.02χ10·7Α。和其他文獻比較 可=發現，實施例中經由電泳沉積法沉積有鉑銥奈米金屬觸媒與葡萄 =氧化酵素的微型感測器，係具有相當低之κ/ρρ，其代表經由電泳 積所形成的均勻結構之複合式觸媒/酵素層中之酵素，係具有良好的 酵素活性以及對葡萄糖之親合性。 八 長時間保存測試 是相，於任何—種生物感測&而言，如何有效提高感測器之保存期限 器為2要的課題之—。—般經由傳統固^化方法所製備之生物感測 物残素於工作電極之保存期限，常見之保存方法為將此生 此置於π之環境下，以延長電極表面酵素分子之活性；但 '、存方法將會大幅降低微型感測器攜帶方便之優點。 習慣有rrt為了要能仿照—般使用者實際制生物微型感測器之 放置系採用將完成好之微型感測器放置於失键袋中並 之環=下保存，以進行長時間保存測試。室溫為約1；㈤。C) 第過程中每次均測試將分別測量第1天、第5天、· 1〇天、 、第20天、帛25天，以及第30天之微塑感測器 27 201122112
TW5583PA EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor對於5 mM之葡萄糖溶液的電流訊號（樣 本數=3)。第16圖與表4為儲存時間和電流訊號測量之詳細結果。 表4 電流（Current，μΑ)3 相對標準偏差 (R.S.D.C) 日寺 樣品-1 樣品-2 樣品-3 平均值 標準偏差 (天）(Sample-1 b) (Sample-2b) (Sample-3b) (Average) (S.D c) 1 5 10 15 20 25 30 4.11x10' 4.2〇xl〇· 4.66x10— 4.34x10* 4.78x10' 4.42x10' 4.79xl〇- 3.82x10•丨 4.58X10'1 4.33X10'1 4.73x1ο1 4.44χ1〇·' 4.78x1ο·1 4.42x10' 4.02x10' 4.34x10' 4.95x10 4.82x10. 4.67χ 10' 4.82x10' 4.86x10 3.98ΧΗΤ1 4.38x10'' 4.65χ1〇·' 4.63x10'' 4.63x10'' 4.68x10'' 4.69x10' 1·45χ10-2 1.91 χΙΟ2 3.1 1χ1〇-2 2.55χ1〇-2 1.73x1ο·1 2.2〇χ1〇-' 2.36χ 1 〇' 3.64% 4.37% 6.70% 5.52% 3.73% 4.71% 5.04% a. 溫度：25°C(±1 °C) b. 電泳沉積參數（EPDparameters):定電壓法施加電壓〇5v， 溶液參數（S丨urry Parameters) : 1 mg PtIr/c奈米金屬觸 f 1 a 吨〇〇〇使其均勻混合並分散於2‘001[^1>防1液、MLS/oNafton c. 樣品數=3 狀 20 目前的結果顯示，藉由電泳沉積法同時沉積有*自銀奈米金屬觸媒 金屬觸媒與㈣糖氧化酵素的微型感測器，在長時_存於室溫（約 25。〇下仍然具有穩定之感測葡萄糖能力，推論其原因應為均勾複合 觸媒/酵素結構可以提供穩定、三輕狀複合結構魏，進而使其酵 素穩定性提高，並增長酵素於室溫下之保存期限。 、 <綜合討論> ，據上述的實施例’藉由電泳沉積法同時沉積有⑽奈米金 嫖與《萄糖氧化酵素的微型感測器，所進行的多項電化學特性分析之 28 201122112 TW5583PA 3争夕相關實驗的結果’纟示合考f電泳溶液參數與電泳程序條件之研 究，可得知：將1 mg Ptlr奈米金屬觸媒/mL、5吣5% Nafi〇n /mL與 20 mg GOD/mL加入於0·01 M PBS(PH=7.4)溶液均勻分散，能夠得到 較穩疋之電泳浴液’並在利用定電壓法於施加電位〇 5 v (vs printe(j
Ag/AgCl)、沉積時間5 mins下，可以製備出性能良好的微型葡萄糖生 物感測器。
一藉由ESCA之縱深分佈結果，可知電極縱向組成分佈相當之均 勻’其證㈣職方法確實能浦縣難之電縣面，構成混合均 勻之複^觸媒/酵素結構。均勻複合式觸媒/酵素結構層能提供—個 特殊的環境’⑽短經由待麟f與酵素分子反應所生成之雙氧水至 觸媒表面之路彳$，並使經由雙氧水與觸媒表面反應所生成之電子 米金屬觸媒之擔體，來導入至工作電極之基材上;此結b 構月^夠柃南應答訊號而増進感測器靈敏度。 奈米糖知實施例藉由電泳沉積法同時沉積鈾銀 相較於只用酵素之方法，係為—個相當穩定之製程。 例中^ ’儿、^沉積葡萄糖氧化酵素的微型感測器，結合實 器，可將葡萄糖m卜^屬觸媒與葡萄糖氧化酵素之微型感剛 奈米金屬―與㈣本之丨.25倍。這顯示實施例的鈾銥 測能力。 乳化酵素之複合結構，確實能夠提升葡萄糖感 探討酵素催化動力學之级I# t # 施例中經由電泳沉積法二1果並與其他文獻進行比較，可以發現實 之微型感琪彳器，會具有儿積鉑銥奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵素 5似mM)，這代曰柄由^低之Michaelis常數（在一實驗例中κ，ρ二 冰>儿積所形成的均勻結構之複合式觸媒/酵素 29 201122112
TW5583PA 層中：酵素：？有良好的酵素活性以及對葡萄糖之親合性；推測其 ===原構之複合式觸媒7酵素層，能夠提供一種特殊之結 衣兄 、，工 素安定性上升，並大幅提高生物感測器之保存期 萄糖之感測線性範_#2(vsMpnmedAg/Aga)下，職測到的葡 S68 祭柄伯，目r 丨於 2 mM 〜20 ，MichaeUs constant 為 ^(R2=〇.995, 2·89 酵素電m 出之一種均勻結構之複合式觸媒/ 觸媒)與酵素分子(例如是葡萄糖氡雜子(例如是舰奈米金屬 電極表面上，經由各項實驗例^酵口素）沉積於微型感測器之工作 利用電泳沉積法來同時沉積觸媒粒子盘分=極結構，證實 結構之複合式觸媒/酵素薄膜，”刀子，月匕夠形成一層均勻 室溫中。實驗結果顯示，應用本發明之^^長達3〇天以上)保存於 現性、穩_準確性之％複合 出=良好再 綜上所述，雖然本發明已以實施 2、，，。構微型生物感測器。 本發明。本發㈣屬技術領域纽 路上’然其並非用以限定 精神和範圍内，當可作各種㊉識者，在不脫離本發明之 當視後附之申請專利範二。因此，本發明之保護範園 【圖式簡單說明】 第1圖料—種生域_的基本結構之示意圖。 201122112
TW5583PA 第2圖綠示-種傳統微型生物感測器的層狀結構示意圖。 ί 3圖係繪示本發明實施例之微型生物MR工作電極_ 第4圖為ESCA为析Ir_mini sens〇r電極表面之韵銀奈 媒和葡萄糖氧化酵素之縱深分佈，其係利用5 kv的氬氣離=
(Arg〇nI〇nGUn)來進行餘刻，單次關時間=刚秒，共飯刻六次，r 討電冰修飾層中各元素間的組成是否均勻分布，pt^表示舶銀奈= 合金觸媒、N表示葡萄糖氧化酵素、F表示Nafi〇n。 、 第5圖係放大第4圖中朽與Ir兩種元素之縱轴間距，以更 的觀察Pt與Ir之ESCA縱深分佈。 第6〜8圖分別為施加電位〇·3 v、〇 4 v以及〇 5 v (”卜丨加⑶ Ag/AgCl)時所量測之電流値與葡萄糖感測能力的結果（樣品數=3卜其 中每隔60秒收集一次電流數值。 “ 第9圖為EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor在施加不同電位下，對於 不同施加電位0.3 V、0.4 V以及〇·5 V之線性範圍區，所得到之氧化 電流與葡萄糖濃度曲線圖，其中工作溶液為〇.〇1 Μ之PBS溶液 <ρΗ=7.4>，每隔60秒收集一次電流數值。 第10Α、10Β圖為利用電泳沉積法同時沉積有Ptlr奈米金屬觸媒 與葡萄糖氧化酵素之微型感測器（樣品數=3)，於各別施加電位〇.3 v
與0_4 V (vs. Printed Ag/AgCl)下，分別量測5 mM葡萄糖溶液、5 mM 葡萄糖+1.5 mg/dL維生素C溶液，以及5 mM葡萄糖+8 mg/dL尿酸溶 液之電流値比較。其中，第10B圖是第10A圖中各溶液數據相較於5 mM葡萄糖溶液的相對電流百分比。 第11圖與第12圖分別為利用EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor，施 加電位為〇·3 V與0.4 V (vs. Printed Ag/AgCl)之電流-時間圖，其中葡 31 201122112
TW5583PA 萄糖濃度範圍為ΟμΜ〜200μΜ，工作溶液為0.01 Μ之PBS溶液 <ρΗ=7·4>。 第13圖為利用EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor藉由定電位分析 法，施加電位為0.4 V (vs. Printed Ag/AgCl)、測量葡萄糖濃度範圍2 mM〜20mM所得到之電流時間圖，其中工作溶液為〇_〇ι μ之PBS溶 液<ρΗ=7·4>，每隔60秒收集一次電流數值。 第14圖為利用EPD-Ptlr+GOD-Ir-mini sensor藉由定電位分析法 施加電位0.3 V (vs. Printed Ag/AgCl)，測量葡萄糖濃度範圍2 mM〜40 mM所得到之電流時間圖，其中每隔60秒收集一次電流數值。 鲁 第15圖為第14圖中利用各別應答電流與待測濃度之倒數所緣製 而成，其可以利用Lineweaver-Burk方程式獲得利用電泳藉由電泳沉 積法’來 >儿積Ptlr奈米金屬觸媒與葡萄糖氧化酵素的微型感測器之 Kmapp 與 IMax。 第 16 圖為微型感測器 EPD-PtIr+GOD-Ir-mini sens〇r 對於 5 之葡萄糖溶液的電流訊號(樣本數=3) ’其在不同儲存時間時進行電流 訊號測量之結果。 【主要元件符號說明】 11 :生物感測元件 12 :信號換能器 13 :訊號處理器 15 :待測物質 21、33 :基材 22 :銀線 24 :觸媒層 26 :酵素層 35 :複合式觸媒酵素薄膜 351 :觸媒擔體 353 .觸媒粒子 355 :酵素分子 32
Claims (1)
- 201122112 TW5583PA 七、申請專利範圍： 1. 一種複合式觸媒酵素薄膜結構’其包括均勻混合與分佈之複 數個觸媒粒子和複數個酵素分手’其中該等酵素分子係用於催化一生 物分子反應，該等觸媒粒子係用於催化一電化學物質反應。 2. 如申請範圍第1項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中該 等酵素分子與該等觸媒粒子，係利用一電泳沉積法在一適當電泳沉積 條件下，同時沉積而固定於一基材表面。 3. 如申請範圍第1項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中催 化該生物分子反應之該些酵素分子，係與生物分子反應形成過氧化氫 (H2〇2，Hydrogen Peroxide) 〇 4·如申請範圍第3項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中該 些酵素分子係選自葡萄糖氧化酵素(Glucose Oxidase ; EC 1.1.3.4)、蘋 果酸氧化酵素(malate oxidase ; EC 1.1.3.3)、六碳糖氧化酵素(hexose oxidase ; EC 1.1.3.5)、膽固醇氧化酵素（cholesterol oxidase ; EC 1.1.3.6)、芳基醇氧化酵素（aryi_alc〇hol oxidase ; EC 1.1.3.7)、L-古洛 糖酸内醋氧化酵素(L-gulonolactone oxidase ; EC 1.1.3.8)、半乳糖氧化 酵素（galactose oxidase ; EC 1.1.3.9)、六環糖氧化酵素（pyran〇se oxidase ; EC 1.1.3.10)、L-山梨糖氧化酵素（L-sorbose oxidase ; Ec 1.1.3.11)、n比〇多醇 4-氧化酵素（pyHdoxine 4-oxidase ; EC 1.1.3.12)、 甲醇氧化酵素（alcohol oxidase; 1.1.3.13)、（S)-2-經基酸氧化酵素 ((S)-2-hydroxy-acid oxidase;1.1.3.15)、蛻皮激素氧化酵素（ecdys〇ne oxidase; EC 1.1.3.16)、膽驗氧化酵素（choline oxidase; EC 1.1.3 17)、 一級醇氧化酵素（secondary-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.18)、4_經基扁桃 酸氧化酵素（4-hydroxymandelate oxidase; EC 1.1.3.19)、長鍵乙醇 氧化酵素（long-chain-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.20)、甘油_3_鱗酸氧 33 201122112 TW5583PA化酵素（glycerol-3-phosphate oxidase ; EC 1.1.3.21 )、維他命 B1 氧 化酵素（thiamine oxidase ; EC 1.1.3.23 )、羥基錫酸鋅氧化酵素 (hydroxyphytanate oxidase ; EC 1.1.3.27)、N-酰基己糖胺氧化酵素 (N-acylhexosamine oxidase ； EC 1.1.3.29)、聚乙烯醇氧化酵素 (polyvinyl-alcohol oxidase ； EC 1.1.3.30 )、内 g旨氧化酵素 (D-Arabinono-1,4-lactone oxidase ； EC 1.1.3.37)、香英蘭醇氧化酵 素（vanillyl-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.38)、核苷氧化酵素（nucieoside oxidase (H202-forming) ; EC 1.1.3.39)、D-甘露糖醇氧化酵素 (D-mannitol oxidase;EC 1.1.3.40)、木糖醇氧化酵素（Xyiit〇i 0Xidase; EC 1.1.3.41)、纖維二糖脫氮酶（cellobiose dehydrogenase (acceptor); EC1.1.99.18)、曱酸脫氫酶（f〇rmatedehydrogenase;EC1.2.1.2)、 乙酸氧化酵素（aldehyde oxidase; EC 1.2.3.1)、丙酮酸氧化酵素 (pyruvate oxidase ; EC 1.2.3.3)、草酸氧化酵素（oxalate oxidase ; EC 1.2.3.4)、乙媒酸氧化酵素（glyoxylate oxidase; EC 1.2.3.5)、丙 酮酸氧化酵素(CoA-乙醯化）（pyruvate oxidase (CoA-acetylating) ; EC 1.2.3.6)、芳基路氧化酵素（aryl-aldehyde oxidase ; EC 1.2.3.9)、視 黃搭氧化酵素（retinal oxidase; EC 1.2.3.11)、ABA路氧化酵素 (abscisic-aldehyde oxidase ； EC 1.2.3.14)、酮戊二酸脫氫酶（琥珀醯 基轉換）(oxoglutarate dehydrogenase (succinyl-transferring) ; EC 1.2.4.2)、二氫乳清酸氧化酵素（dihydroorotate oxidase ; EC 1.3.3.1 )、 糞口卜琳原氧化酵素（coproporphyrinogen oxidase ; EC 1.3.3.3)、芳基 -輔酶A氧化酵素（acyl-CoA oxidase ; EC 1.3.3.6)、二氫尿嘴咬氧化 酵素（dihydrouracil oxidase ; EC 1.3.3.7 )、四氫小樂域氧化酵素 (tetrahydroberberine oxidase ； EC 1.3.3.8)、色氨酸 氧化酵素 (tryptophan alpha,beta-oxidase ； EC 1.3.3.10 ) 、PQQ 合成酶 34 201122112 TW5583PA (pyrroloquinoline-quinone synthase ； EC 1.3.3.11) 、L-半乳糖酉复内酉旨 氧化酵素（L-galactonolactone oxidase ; EC 1.3.3.12)、芳基-輔酶 A 脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase ; EC 1.3.99.3)、二氫乳清酸脫氫酶 (dihydroorotate dehydrogenase ； EC 1.3.99.11)、:D-天冬氨酸氧化酵 素（D-aspartate oxidase; EC 1.4.3· 1 )、L-氨基酸氧化酵素（L_amin〇-acidoxidase ; EC 1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酵素（D-amino-acid oxidase ; EC 1.4.3.3 )、胺基氧化酵素（含類黃素）（amine oxidase (flavin-containing) ; EC 1.4.3.4)、哆醛 5’-磷酸合成酶（pyridoxal 5'-phosphate synthase; EC 1.4.3.5 )、胺基氧化酵素(含銅)（amine oxidase (copper-containing) ; EC 1.4.3.6)、D-榖氨酸鹽氧化酵素（D-glutamate oxidase，EC 1.4.3.7)、乙醇胺氧化酵素（ethanolamine oxidase ; EC 1.4.3.8)、腐胺氧化酵素（putrescineoxidase; EC 1.4.3.10)、L-穀氨 酸鹽氧化酵素（L-glutamate oxidase ; EC 1.4.3.11 )、環己胺氧化酵素 (cyclohexylamine oxidase ； EC 1.4.3.12)、蛋白質-離氨基酸 6-氧化 酵素（protein-lysine 6-oxidase ; EC 1.4.3.13 )、L-離氨基酸氧化酵素 (L-lysine oxidase ; EC 1.4.3.14)、D-榖氨酸鹽(D-天冬氨酸)氧化酵 素（D-glutamate(D-aspartate) oxidase ; EC 1.4.3.15 )、L-天冬氨酸氧 化酵素（L-aspartate oxidase ; EC 1.4.3.16)、甘氨酸氧化酵素（glyCine oxidase ; EC 1.4.3.19)、L-離氨基酸 6-氧化酵素（L-lysine 6-oxidase ; EC 1.4.3.20)、胺基脫氫酶（amine dehydrogenase ; EC 1.4.99.3 )、 FMN還原酵素（FMN reductase ; EC 1.5.1.29)、肌氨酸氧化酵素 (sarcosine oxidase ； EC 1.5.3.1 ) 、N曱基-L 胺基酸氧化酵素 (N-methyl-L-amino-acid oxidase ; EC 1.5.3.2)、N6-曱基-離氨基酸氧 化酵素（N6-methyl-lysine oxidase ; EC 1.5.3.4)、（S)-6-經基煙酸氧化 酵素（（S)-6-hydroxynicotine oxidase ; EC 1.5.3.5)、（R)-6·經基煙酸氣 35 201122112 TW5583PA 化酵素（（R)-6-hydroxynicotine oxidase ; EC 1.5.3.6)、L-甲基狐啶 (L-pipecolate oxidase ； EC 1.5.3.7)、二甲基甘氨酸氧化酵素 (dimethylglycine oxidase，EC 1.5.3.10)、多胺氧化酵素（p〇iyamine oxidase ; EC 1.5.3.11 )、DHBP 氧化酵素（Dihydrobenzophenanthridine oxidase ; EC 1.5.3.12)、三甲胺脫氫酶（trimethylamine dehydrogenase ; EC 1.5.8.2)、L-六風0比鳴缓酸脫風酶（L-pipecolate dehydrogenase ; EC 1.5.99.3 )、細胞分裂素脫氣酶（cytokinin dehydrogenase ; EC 1.5.99.12)、NAD(P)H 氧化酵素（NAD(P)H oxidase ; EC 1.6.3.1)、 NAD(P)H 脫氫酶(對苯三酮）（NAD(P)H dehydrogenase (quinone) ; EC · 1.6.5.2)、亞确酸還原酵素（nitrite reductase (NO-forming) ; EC 1.7.2.1)、石肖基烧氧化酵素（nitroalkane oxidase; EC 1.7.3.1 )、尿酸 氧化酵素（urate oxidase ; EC 1.7.3.3)、3-硝基丙酸甲酯氧化酵素 (3-aci-nitropropanoate oxidase； EC 1.7.3.5)、二氫硫辛醯脫氩酶 (dihydrolipoy 1 dehydrogenase; EC 1.8.1.4 )、亞硫酸鹽氧化酵素（sulfite oxidase ; EC 1.8.3.1)、硫醇氧化酵素（thiol oxidase ; EC 1.8.3.2)、 穀耽甘肽氧化酵素（glutathioneoxidase;EC1.8.3.3)、甲硫醇氧化酵 素（methanethiol oxidase ; EC 1.8.3.4 )、烯化半耽胺酸氧化酵素 (prenylcysteine oxidase ； EC 1.8.3.5)、3-羥鄰氨苯曱酸氧化酵素 參 (3-hydroxyanthranilate oxidase ； EC 1.10.3.5)、雷福黴素-B 氧化酵 素（rifamycin-B oxidase ; EC 1.10.3.6)、NADH 過氧化物酶（NADH peroxidase ； EC 1.11.1.1 )、2-硝基丙烷加雙氧酶（2-nitropropane dioxygenase ; EC 1.13.11.32 )、賴胺酸 2-單加氧酶（lySine 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.2)、乳酸 2-單加氧酶（lactate 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.4)、螢光素 4-單加氧酶(ATP 水解化） (Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) ； EC 36 201122112 TW5583FA1.13.12.7)、苯丙氨酸 2-單加氧酶（phenylalanine 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.9) 、clavaminate 合成酶（clavaminate synthase ; EC 1.14.11.21)、石腦油精 1，2-雙加氧酶（naphthalene l，2-dioxygenase ; EC 1.14.12.12)、4-胺基苯甲酸乙 g 旨 i-單加氧酶（4_aminobenzoate 1-monooxygenase ； EC 1.14.13.27 )、烷醛單加氧酶（alkanal monooxygenase (FMN_linked) ; EC 1.14.14.3)、苯丙胺酸 4-單加氧酶 (phenylalanine 4-monooxygenase ； 1.14.16.1)、鄰胺苯甲酸鈉 3-單加 氧酶（anthranilate 3-monooxygenase ; EC 1.14.16.3 )、單紛單加氧酶 (monophenol monooxygenase ； EC 1.14.18.1)、7-膽留稀醇氧化酵素 (lathosterol oxidase ; EC 1.14.21.6)、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ; EC 1.15.1.1)、超氧化物還原酶（superoxide reductase ; EC 1.15.1.2)、黃嗓吟脫氫酶（xanthine dehydrogenase ; EC 1.17.1.4)、 黃嗓吟氧化酵素（xanthine oxidase ; EC Ι.Π.3.2)、6-經基於驗脫氫 酶（6-hydroxynicotinate dehydrogenase ; EC 1.17.3.3 )、香篇枝喊酵 素酵素（reticuline oxidase ; EC 1.21.3.3 )、二構酸核酮糖羧化酶 (Ribulose-bisphosphate carboxylase ; EC 4.1.1.39)所組成之群組。 5. 如申請範圍第1項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中催 化該電化學物質反應之該等觸媒粒子，係與過氧化氫(H2〇2，Hydrogen Peroxide)進行一電化學氧化還原反應。 6. 如申請範圍第5項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中用 於催化過氧化氫之氧化還原的該等觸媒粒子，係包括一單一金屬元素 Μ、一二元金屬M-X、一單一金屬氧化物MOy、一二元金屬氧化物 MOy-XOy、一金屬-金屬氧化物複合材料M-MOy、或選自前述類型之 組合，其中’y係小於3,而Μ與X係選自由鋰(Li)、鈉(Na)、鎂(Mg)、 鋁(A1)、鉀(K)、鈣(Ca)、鉻(Cr)、錳(Μη)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、 37 201122112 TW5583PA 銅(Cu)、鋅(Zn)、鎵(Ga) ' 锶(Sr)、釔(Υ)、锆(Zr)、鈮(Nb)、鉬（Mo)、 釕(Ru)、铑(Rh)、鈀(Pd)、銀(Ag)、鎘(Cd)、銦(In)、錫（Sn)、鋇(Ba)、 鑭(La、鈽(Ce)、镨(pr)、鉉(Ncj)、釤（Sm)、銪（Eu)、釓(Gd) ' 铽(Tb)、 鏑(Dy)、鈥(Ho)、铒(Er)、鍤(Tm)、镏(Lu)、钽(Ta)、鎢(W)、锇(〇s)、 銥(Ir)、鉑(Pt)、金(Au)、鉛(Pb)、鉍(Bi)所組成之群組。 7.如申請範圍第6項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中該 等觸媒粒子係包括該二元金屬與該二元金屬氧化物，且其之金屬元素 莫耳比係大於0小於1〇〇〇/0。8.如申請範圍第1項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中該 等觸媒材料粒子係為複數個鉑銥(Ptlr)奈米觸媒粒子，該等酵素分子係 為複數個葡萄糖氧化酵素分子(Glucose Oxidase, GOD)。 9·如申請專利範圍第1項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其 中該等觸媒粒子之擔體係為破黑。 10. 如申請範圍第1項所述之複合式觸媒酵素薄膜結構，其中驾 等觸媒粒子之一平均粒徑，係介於約〇.5奈米至約100微米之間、。^ 11. 一種微型感測器電極之製備方法，包括： 提供一基材；提供-電泳溶液’其包括複數個觸媒粒子和複數個酵素分子；以 子和積法在一適當電泳沉積條件下，同時將該些觸媒粒 =;素薄膜，其懷膜係—二 12.如申請專利範圍第11項所述之方法，装 式觸媒酵素薄膜，其之均勻混合和分佈的該等酵素分子 38 201122112 TW5583PA 子’係分別用於催化一生物分子反應與用於催化一電化學物質反應。 13. 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中催化該生物分子 反應之該些酵素分子’係與生物分子反應形成過氧化氫（H2〇2， Hydrogen Peroxide)。 14. 如申請專利範圍第u項所述之方法，其中該些酵素分子係 選自葡萄糖氧化酵素(Glucose Oxidase ; EC 1.1.3.4)、蘋果酸氧化酵素(malate oxidase ; EC 1.1.3.3)、六碳糖氧化酵素(hexose oxidase ; EC 1.1.3.5)、膽固醇氧化酵素(ch〇iester〇l oxidase ; EC 1.1.3.6)、芳基醇氧 化酵素(aryl-alcohol oxidase; EC 1.1.3.7)、L-古洛糖酸内酯氧化酵素 (L-gUl〇n〇lact〇ne oxidase ; EC 1.1.3.8)、半乳糖氧化酵素（galactose oxidase，EC 1.1.3.9)、六環糖氧化酵素(pyranose oxidase; EC 1.1.3.10)、 L-山梨糖氧化酵素(L-sorbose oxidase ; EC 1·1.3·11)、《比哆醇4-氧化酵 素（pyridoxine 4-oxidase ; EC 1.1.3.12)、甲醇氧化酵素（alcohol oxidase ; 1.1.3.13 ) 、（S)-2-羥基酸氧化酵素（（S)-2-hydr〇xy-acid oxidase ; 1.1.3.15)、蜆皮激素氧化酵素（ecdysone oxidase ; EC 1.1.3.16)、膽驗氧化酵素（choline oxidase ; EC 1.1.3.17)、二級醇 氧化酵素(secondary-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.18)、4-經基爲桃酸氧化 酵素（4-hydroxymandelate oxidase ; EC 1.1.3.19)、長鏈乙醇氧化酵 素（long-chain-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.20)、甘油-3-鱗酸氧化酵素 (glycerol-3-phosphate oxidase ； EC 1.1.3.21)、維他命 B1 氧化酵素 (thiamine oxidase ； EC 1.1.3.23 )、經基錫酸鋅氧化酵素 (hydroxyphytanate oxidase ； EC 1.1.3.27)、N-酰基己糖胺氧化酵素 (N-acylhexosamine oxidase ； EC 1.1.3.29)、聚乙稀醇氧化酵素 (polyvinyl-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.30 )、内醋氧化酵素 (D-Arabinono-1,4-lactone oxidase； EC 1.1.3.37)、香笑蘭醇氧化酵 39 201122112 TW5583PA 素（vanillyl-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.38)、核苷氧化酵素（nucleoside oxidase (H202-forming) ; EC 1.1.3.39) 、D-甘露糖醇氧化酵素 (D_mannitol oxidase;EC 1·1.3.40)、木糖醇氧化酵素（xylitol oxidase; EC 1.1.3.41 )、纖維二糖脫氫酶（cellobiose dehydrogenase (acceptor); EC 1.1.99.18)、曱酸脫氫酶（formate dehydrogenase ; EC 1.2.1.2)、 乙搭氧化酵素（aldehyde oxidase ; EC 1.2.3.1)、丙綱酸氧化酵素 (pyruvate oxidase ; EC 1.2.3.3)、草酸氧化酵素（oxalate oxidase ; EC 1.2.3.4)、乙路g曼氧化酵素（giy0Xyiate oxidase; EC 1.2.3.5)、丙 酮酸氧化酵素（CoA-乙醯化）（pyruvate oxidase (CoA-acetylating) ; EC 1.2.3.6)、芳基酸氧化酵素（aryi_aidehyde oxidase ; EC 1.2.3.9)、視 黃醛氧化酵素（retinal oxidase; EC 1.2.3.11)、ABA醛氧化酵素 (abscisic-aldehyde oxidase ; EC 1.2.3.14)、酮戊二酸脫氫酶(號珀醯 基轉換）（oxoglutarate dehydrogenase (succinyl-transferring) ; EC 1.2.4.2)、二氳乳清酸氧化酵素（dihydroorotate oxidase ; EC 1.3.3.1 )、 糞卟你原氧化酵素（coproporphyrinogen oxidase ; EC 1.3.3.3)、芳基 -輔酶A氧化酵素（acyl-CoA oxidase ; EC 1.3.3.6)、二氫尿嘴咬氧化 酵素（dihydrouracil oxidase; EC 1.3.3.7)、四氫小檗域氧化酵素 (tetrahydroberberine oxidase ;EC 1.3.3.8)、色氨酸 α,ρ-氧化酵素 (tryptophan alpha,beta-oxidase ； EC 1.3.3.10 ) 、PQQ 合成酶 (pyrroloquinoline-quinone synthase ; EC 1.3.3.11)、L-半乳糖酸内 g旨 氧化酵素（L-galactonolactone oxidase ; EC 1.3.3.12)、芳基-辅酶 A 脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase ; EC 1.3.99.3)、二氫乳清酸脫氫酶 (dihydroorotate dehydrogenase ; EC 1.3.99.11 )、D-天冬氨酸氧化酵 素（D-aspartate oxidase; EC 1 A3· 1 )、L-救基酸氧化酵素（L_amin〇_acid oxidase ; EC 1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酵素（D_amin〇_acid 〇别咖； 201122112 TW5583PA EC 1.4.3.3 )、胺基氧化酵素（含類黃素）（amine oxidase (flavin-containing) ; EC 1.4.3.4)、哆醛 5，-磷酸合成酶（pyridoxal 5’-ph〇Sphate synthase; EC 1 _4.3.5 )、胺基氧化酵素(含銅)（amine 〇xidase (copper-containing) ; EC 1.4.3.6)、D-穀氨酸鹽氧化酵素（D_ghltamate oxidase ; EC 1.4.3.7)、乙醇胺氧化酵素（ethanolaniine oxidase ; EC 1.4.3.8)、腐胺氧化酵素（putrescineoxidase;EC 1.4.3.10)、L-榖氨酸鹽氧化酵素（L-glutamate oxidase ; EC 1.4.3.11 )、環己胺氧化酵素 (cyclohexylamine oxidase ； EC 1.4.3.12)、蛋白質-離氣基酸 6-氧化 酵素（protein-lysine 6-oxidase ; EC 1.4.3.13)、L-離氨基酸氧化酵素 (L-lysine oxidase ;EC 1.4.3.14)、D-榖氨酸鹽(D-天冬氨酸)氧化酵 素（D-glutamate(D-aspartate) oxidase ; EC 1.4.3.15)、L天冬氨酸氧 化酵素（L-aspartate oxidase ; EC 1.4.3.16)、甘氨酸氧化酵素（giycine oxidase ’ EC 1.4.3.19)、L_離氣基酸 6-氧化酵素（L-lysine 6-oxidase ; EC 1.4.3.20)、胺基脫氫酶（amine dehydrogenase ; EC 1.4.99.3)、 FMN還原酵素（FMN reductase ; EC 1.5.1.29)、肌氨酸氧化酵素 (sarcosine oxidase ； EC 1.5.3.1 ) 、N-甲基-L 胺基酸氧化酵素 (N-methyl-L-amino-acid oxidase; EC 1.5.3.2)、N6-曱基-離氨基酸氧 化酵素（N6-methyl-lysine oxidase ; EC 1.5.3.4)、（S)-6-經基煙酸氧化 酵素（（S)-6-hydroxynicotine oxidase ; EC 1.5.3.5)、（R)_6-經基煙酸氧 化酵素（（R)-6-hydroxynicotine oxidase ; EC 1.5.3.6 )、L-曱基n瓜淀 (L-pipecolate oxidase ； EC 1.5.3.7 )、二甲基甘氨酸氧化酵素 (dimethylglycine oxidase ; EC 1.5.3.10)、多胺氧化酵素（polyamine oxidase ; EC 1.5.3.11 )、DHBP 氧化酵素（Dihydrobenzophenanthridine oxidase; EC 1.5.3.12)、三甲胺脫氫酶（trimethylamine dehydrogenase ; EC 1.5.8.2 )、L-六氫°比咬缓酸脫氫酶（L-pipecolate dehydrogenase ; 41 201122112 TW5583PA EC 1.5.99.3)、細胞分裂素脫氫酶（cyt〇kinin dehydrogenase ; EC 1.5.99.12)、NAD(P)H 氧化酵素（NAD(P)H oxidase ; EC 1.6.3.1)、 NAD(P)H 脫虱酶（對苯三_) (NAD(P)H dehydrogenase (quinone) ; EC 1.6.5.2 )、亞硝酸還原酵素（nitrite reductase (NO-forming) ; EC 1.7.2.1)、石肖基烧氧化酵素（nitr〇aikane oxidase ; EC 1.7.3.1)、尿酸 氧化酵素（urate oxidase; EC 1.7.3.3)、3-硝基丙酸甲酯氧化酵素 (3-aci-nitropropanoate oxidase ； EC 1.7.3.5)、二氫硫辛醯脫氫酶 (dihydrolipoyl dehydrogenase;EC 1.8.1.4)、亞硫酸鹽氧化酵素（suifite oxidase; EC 1.8.3.1)、硫醇氧化酵素（thiol oxidase; EC 1.8.3.2)、籲 榖胱甘肽氧化酵素（glutathioneoxidase; EC 1.8.3.3)、甲硫醇氧化酵 素（methanethiol oxidase ; EC 1_8.3.4 )、浠化半胱胺酸氧化酵素 (prenylcysteine oxidase ； EC 1.8.3.5)、3-羥鄰氨苯甲酸氧化酵素 (3-hydroxyanthranilate oxidase ； EC 1.10.3.5)、雷福黴素-B 氧化酵 素（rifamycin-B oxidase ; EC 1.10.3.6)、NADH 過氧化物酶（NADH peroxidase ; EC 1.11.1.1) 、2-硝基丙炫加雙氧酶（2-nitropropane dioxygenase ; EC 1.13.11.32)、賴胺酸 2-單加氧酶（lySine 2-monooxygenase ； EC 1.13.12.2 )、乳酸 2-單加氧酶（lactate 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.4)、螢光素 4-單加氧酶(ATP 水解化）鲁 (Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) ； EC 1.13.12.7)、苯丙氧酸 2-單加氧酶（phenylalanine 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.9 ) 、clavaminate 合成酶（clavaminate synthase ; EC 1.14.11.21 )、石腦油精 1，2-雙加氧酶（naphthalene l，2-dioxygenase ; EC 1.14.12.12)、4_胺基苯甲酸乙酯 1-單加氧酶（4-aminobenzoate 1-monooxygenase ; EC 1.14.13.27 )、烧搭單加氧酶（alkanal monooxygenase (FMN-linked) ; EC 1.14.14.3)、苯丙胺酸 4-單加氧酶 42 201122112 TW5583PA (phenylalanine 4-monooxygenase ； 1.14.16.1 )、鄰胺苯曱酸納 3:單加 氧酶（anthranilate 3-monooxygenase ; EC 1.14.16.3)、單紛單加氧酶 (monophenol monooxygenase ； EC 1.14.18.1 )、7-膽崔稀醇氧化酵素 (lathosterol oxidase ; EC 1.14.21.6)、超氧化物歧化酶（super〇xide dismutase ; EC 1.15.1.1)、超氧化物還原酶（superoxide reductase ; EC 1.15.1.2)、黃嗓吟脫氮酶（xanthine dehydrogenase ; EC 1.17 1 4)、 黃嘌呤氧化酵素（xanthine oxidase ; EC 1.17.3.2)、6-羥基於驗脫氣 酶（6-hydroxynicotinate dehydrogenase ; EC 1.17.3.3)、香篇枝域酵 素酵素（reticuline oxidase，EC 1 ·21 ·3·3 )、二酸核酮糖幾^ 化酶 (Ribulose-bisphosphate carboxylase ; EC 4·1_1·39)所組成之群組。 15. 如申請專利範圍第Π項所述之方法，其中催化該電化學物 質反應之該些觸媒粒子’係與過氧化氫(H2〇2, Hydrogen Peroxide)進 行一電化學氧化還原反應。 16. 如申請範圍第15項所述之方法，其中用於催化過氧化氫之 氧化還原之該等觸媒粒子’係包括一單一金屬元素Μ、一二元金屬 Μ-Χ、一單一金屬氧化物MOy、一二元金屬氧化物MOy-XOy、一金 屬-金屬氧化物複合材料M-MOy、或選自前述類型之組合，其中，y 係小於3，而Μ與X係選自由鋰(U)、鈉(Na)、鎂(Mg)、鋁(A1)、鉀(K)、 鈣(Ca)、鉻(Cr)、猛(Μη)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、銅(Cu)、鋅(Zn)、 鎵(Ga)、锶(Sr)、釔(Y)、锆(Zr)、鈮(Nb)、鉬（Mo)、釕(Ru)、铑(Rh)、 鈀(Pd)、銀(Ag) ' 鎘(Cd)、銦(In)、錫(Sn)、鋇(Ba)、鑭(La、鈽(Ce)、 镨(Pr)、鈦(Nd)、釤（Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、铽(Tb)、鏑(Dy)、鈥(Ho)、 铒(Er)、铥(Tm)、鏑(Lu)、鈕(Ta)、鎢（W)、鉞(Os)、銥(Ir)、鉑(Pt)、 金(Au)、鉛(Pb)、鉍(Bi)所組成之群組。 17. 如申請範圍第16項所述之方法，其中該些觸媒粒子係包括 43 201122112 TW5583PA 該二元金屬與該二元金屬氧化物，且其金屬元素莫耳比係大於〇小於 100%。 18. 如申s月專利範圍帛u項所述之方法，其中該等觸媒粒子係 為複數個絲(Ptlf)奈米金屬卿粒子，該等酵素分子係為複數個葡萄 糖氧化酵素分子（Glucose Oxidase, GOD)。 19. 如申明專利範圍第ι8項所述之方法，其中所提供之該電泳 溶液係包括一 pH值緩衝水溶液、該等鉑銥(PtIr)奈米金屬觸媒粒子、 該等葡萄糖氧化酵素分子，以及一具親水性離子交換官能基之化合 物。 20·如申請專利範圍第19項所述之方法，其中該1)1|值緩衝水溶 液係為填酸緩衝水溶液(Phosphate buffered saline，PBS)，該具親水性 離子父換B t基之化合物係為確酸化四氟乙基共聚物（sulforiated tetrafluorethylene copolymer » Nafion®) 〇 21·如申請專利範圍第20項所述之方法，其中提供該電泳溶液 之步驟係包括： 將適量之該些鉑銥(Ptlr)奈米金屬觸媒粒子和Nafion均勻分散於 適量的無水己醇中； 移除無水乙醇’並加入適當量的磷酸緩衝水溶液，使其均勻分 散；以及 於磷酸緩衝水溶液中加入適量的該等葡萄糖氧化酵素分子，使其 均勻分散。 22.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中該磷酸缓衝水溶 液之濃度係約為〇.〇1 Μ，pH值約為7,4，該等鉑銀(Ptlr)奈米金屬觸媒 粒子之含量約1 mg/ mL ’ Nafion之含量約為5 pL/mL ’該等葡萄糖氧 化酵素分子之濃度為2%和含量約20 mg/mL。 201122112 TW5583PA 其係藉由一定電壓法 23.如申請專利範圍第u項所述之方法 (Potentiostatic Method)來進行電泳沉積。 =4.如中。月專利範圍第23項所述之方法，其中應用該定電壓法 時，其所施加之電壓範圍約為〇.5 v〜〇 75 v，沉積時間約$分鐘，以 將該些齡(P叫奈米金屬觸媒粒子沉積於該基材之表面上。 25.如申請專職圍第11項所述之方法，其中係藉由-定電流 法(Galvanostatic Method)進行電泳沉積。26_如申請專㈣’ 25項所述之方法，其中制該定電流法 時，施加電流約1 μΑ，電流密度約為〇 128 ，沉積時間約5 分鐘’以將該些銘銀(Ptlr)奈米金屬觸媒粒子沉積於該基材之表面上。 27. 如f請專利範圍帛u項所述之方法其中該基材係包括一 形成於該碳材上之碳材和奈米銥金屬觸媒。 28. —種微型生物感測器，其包括有： 生物感測元件(Biological recognition element、Bioreceptor)，其 與一待測物質結合或反應後，會產生一物理/化學變化值，其中該生物 感測元件具有一工作電極，該工作電極包括一基材和形成於該基材表 面之一複合式觸媒酵素薄膜，且該薄膜係包括均勻混合和分佈的複數 個觸媒粒子和複數個酵素分子，其中該等酵素分子係用於催化一生物 分子反應，而該等觸媒粒子係用於催化一電化學物質反應； 一訊號轉能器（Signal transducer) ’其係將該物理/化學變化值轉化 成一電子訊號；以及 一訊號處理器（Signal processor) ’其係接收和處理該訊號轉能器 所產生之該電子訊號。 29.如申請範圍第28項所述之微型生物感測器，其中該等酵素 分子和該等觸媒粒子係利用一電泳沉積法，而在一適當電泳沉積條件 45 201122112 TW5583PA 下同時沉積固定於該基材表面》 30. 如申請範圍第28項所述之微型生物感測器，其中催化該生 物分子反應之該等酵素分子，係與生物分子反應形成過氧化氫 (H2〇2 > Hydrogen Peroxide) 〇31. 如申請範圍第28項所述之微型生物感測器，其中該等酵素 分子係選自葡萄糖氧化酵素(Glucose Oxidase ; EC 1.1.3.4)、蘋果酸氧 化酵素（malate oxidase ; EC 1.1.3.3)、六石炭糖氧化酵素（hexose oxidase ; EC 1.1.3.5)、膽固醇氧化酵素(cholesterol oxidase ; EC 1.1.3.6)、芳基 醇氧化酵素(aryl-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.7)、L-古洛糖酸内醋氧化酵 素(L-gulonolactone oxidase ; EC 1.1.3_8)、半乳糖氧化酵素（galact〇se oxidase; EC 1.1.3.9)、六環糖氧化酵素(pyranose oxidase; EC 1.1.3.10)、 L-山梨糖氧化酵素(L-sorbose oxidase ; EC 1.1.3.11)、《»比今醇4-氧化酵 素（pyridoxine 4-oxidase ; EC 1.1.3.12 )、甲醇氧化酵素（alcohol oxidase ； 1.1.3.13 ) 、（S)-2-羥基酸氧化酵素（（S)-2-hydr〇xy-acid oxidase ; 1.1.3·I5)、蜆皮激素氧化酵素（ecdysone oxidase ; EC 1.1.3.16)、膽驗氧化酵素（choline oxidase ; EC 1.1.3.17)、二級醇 氧化酵素(secondary-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.18)、4-經基爲桃酸氧化 酵素（4-hydroxymandelate oxidase ; EC 1.1.3.19)、長键己醇氧化肖 素（long-chain-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.20)、甘油_3_ 填酸氧化酵素 (glycerol-3-phosphate oxidase ; EC 1.1.3.21)、維他命 Bi 氧化酵素 (thiamine oxidase ； EC 1.1.3.23 )、羥基錫酸辞氧化酵素 (hydroxyphytanate oxidase ； EC 1.1.3.27)、N-酰基己糖胺氧化酵素 (N-acylhexosamine oxidase ； EC 1.1.3.29)、聚乙稀醇氧化酵素 (polyvinyl-alcohol oxidase ； EC 1.1.3.30 )、内 g旨氧化酵素 (D-Arabinono-1,4-lactone oxidase； EC 1.1.3.37)、香笑蘭醇氧化酵 46 201122112 TW5583PA 素（vanillyl-alcohol oxidase ; EC 1.1.3.38)、核苷氧化酵素（nucieoside oxidase (H202-forming) ； EC 1.1.3.39) 、D-甘露糖醇氧化酵素 (D-mannitol oxidase; EC 1 · 1 ·3 ·40 )、木糖醇氧化酵素（Xyiit〇i oxidase ; EC 1.1.3.41)、纖維二糖脫氮酶（cellobiose dehydrogenase (acceptor); EC 1.1.99.18)、曱酸脫氫酶（formate dehydrogenase ; EC 1.2.1.2)、乙搭氧化酵素（aldehyde oxidase; EC 1.2.3.1)、丙酮酸氧化酵素 (pyruvate oxidase ; EC 1.2.3.3)、草酸氧化酵素（oxalate oxidase ; EC 1.2.3.4)、乙裕酸氧化酵素（glyoxylate oxidase; EC 1.2.3.5)、丙 酮酸氧化酵素(CoA-乙醯化）（pyruvate oxidase (CoA-acetylating) ; EC 1.2.3.6)、芳基搭氧化酵素（aryl-aldehyde oxidase ; EC 1.2.3.9)、視 黃搭氧化酵素（retinal oxidase; EC 1.2.3.11)、ABA搭氧化酵素 (abscisic-aldehyde oxidase ； EC 1.2.3.14)、酮戊二酸脫氫酶(號珀酿 基轉換）（oxoglutarate dehydrogenase (succinyl-transferring) ； EC 1.2.4.2)、二氫乳清酸氧化酵素（dihydroorotate oxidase; EC 1.3.3.1 )、 糞口卜琳原氧化酵素（coproporphyrinogen oxidase ; EC 1.3.3.3)、芳基 -辅酶A氧化酵素（acyl-CoA oxidase ; EC 1.3.3.6)、二氫尿喊咬氧化 酵素（dihydrouracil oxidase ; EC 1.3.3.7 )、四氫小禁域氧化酵素 (tetrahydroberberine oxidase ； EC 1.3.3.8)、色氨酸 α ,召-氧化酵素 (tryptophan alpha,beta-oxidase ； EC 1.3.3.10 ) 、PQQ 合成酶 (pyrroloquinoline-quinone synthase ; EC 1.3.3.11 )、L-半乳糖酸内醋 氧化酵素（L-galactonolactone oxidase; EC 1.3.3.12)、芳基-辅酶 A 脫氫酶（acyl-CoA dehydrogenase ; EC 1.3.99.3)、二氩乳清酸脫氫酶 (dihydroorotate dehydrogenase ； EC 1.3.99.11)、D-天冬氨酸氧化酵 素（D-aspartate oxidase; EC 1.4.3.1 )、L-氨基酸氧化酵素（L-amino-acid oxidase ; EC 1.4.3.2)、D-氨基酸氧化酵素（D-amino-acid oxidase ; 47 201122112 TW5583PA EC 1.4.3.3 )、胺基氧化酵素（含類黃素）（amine oxidase (flavin-containing) ; EC 1.4.3.4)、哆醛 5'-磷酸合成酶（pyridoxal 5’-ph〇Sphate synthase; EC 1 ·4.3.5 )、胺基氧化酵素（含銅)（amine 〇xidase (copper-eontaining) ; EC 1.4.3.6)、D-穀氨酸鹽氧化酵素（D-glutamate oxidase，EC 1.4.3.7)、乙醇胺氧化酵素（ethanolamine oxidase ; EC 1.4.3.8)、腐胺氧化酵素(putrescineoxidase;EC 1.4.3.10) 、L-榖氨 酸鹽氧化酵素（L-glutamate oxidase ; EC 1.4.3.11 )、環己胺氧化酵素 (cyclohexylamine oxidase ； EC 1.4.3.12)、蛋白質-離氨基酸 6-氧化 酵素（protein-lysine 6-oxidase ; EC 1.4.3.13)、L-離氨基酸氧化酵素鲁 (L-lysine oxidase ; EC 1.4.3.14)、D-穀氨酸鹽(D-天冬氨酸)氧化酵 素（D-glutamate(D-aspartate) oxidase ; EC 1.4.3.15)、L_天冬敦酸氧 化酵素（L-aspartate oxidase; EC 1.4.3.16)、甘氨酸氧化酵素（glycine oxidase; EC 1.4.3.19)、L-離氨基酸 6-氧化酵素（L-lysine 6-oxidase ; EC 1.4.3.20)、胺基脫氫酶（amine dehydrogenase ; EC 1.4.99.3)、 FMN還原酵素（FMN reductase; EC 1.5.1.29)、肌氨酸氧化酵素 (sarcosine oxidase ； EC 1.5.3.1 ) 、N-甲基-L 胺基酸氧化酵素 (N-methyl-L-amino-acid oxidase; EC 1.5.3.2)、N6_ 甲基-離氨基酸氧 化酵素（N6-methyl-lysine oxidase ; EC 1.5.3.4)、（S)-6-經基煙酸氧化 _ 酵素（（S)-6-hydroxynicotine oxidase ; EC 1.5,3.5)、（R)-6-羥基煙酸氧 化酵素（（R)-6-hydroxynicotine oxidase ; EC 1.5.3.6)、L-甲基》瓜咬 (L-pipecolate oxidase ； EC 1.5.3.7 )、二曱基甘氨酸氧化酵素 (dimethylglycine oxidase ; EC 1.5.3.10)、多胺氧化酵素（p〇iyamine oxidase ; EC 1.5.3.11 )、DHBP 氧化酵素（Dihydrobenzophenanthridine oxidase; EC 1.5.3.12)、三甲胺脫氳酶（trimethylamine dehydrogenase ; EC 1.5.8.2)、L-六氫比咬缓酸脫氫酶（L-pipecolate dehydrogenase ; 48 201122112 TW5583PAEC 1.5.99.3 )、細胞分裂素脫氫酶（Cyt〇kinin dehydrogenase ; EC 1.5.99.12)、NAD(P)H 氧化酵素（NAD(P)Hoxidase; EC 1.6.3.1)、 NAD(P)H 脫氫酶（對苯三綱）（NAD(P)H dehydrogenase (quinone) ; EC 1.6.5.2 )、亞确’酸還原酵素（nitrite reductase (NO-forming) ; EC 1.7.2.1)、确基烧氧化酵素（nitroaikane oxidase; EC 1.7.3.1)、尿酸 氧化酵素（urate oxidase; EC 1.7.3.3)、3-硝基丙酸甲酯氧化酵素 (3-aci-nitropropanoate oxidase ; EC 1.7.3.5)、二氫硫辛醯脫氫酶 (dihydrolipoyl dehydrogenase;EC1.8.1.4)、亞硫酸鹽氧化酵素（suifite oxidase ; EC 1.8.3.1)、硫醇氧化酵素(thiol oxidase ; EC 1.8.3.2)、 穀胱甘肽氧化酵素（glutathione oxidase; EC 1.8.3.3)、甲硫醇氧化酵 素（methanethiol oxidase ; EC 1.8.3.4 )、烯化半胱胺酸氧化酵素 (prenylcysteine oxidase ； EC 1.8.3.5) 、3-羥鄰氨苯甲酸氧化酵素 (3-hydroxyanthranilate oxidase ； EC 1.10.3.5)、雷福黴素-B 氧化酵 素（rifamycin-B oxidase ; EC 1.10.3.6)、NADH 過氧化物酶（NADH peroxidase ; EC 1.11.1.1) 、2-硝基丙烧加雙氧酶（2-nitropropane dioxygenase ； EC 1.13.11.32 )、賴胺酸 2-單加氧酶（iysine 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.2 )、乳酸 2-單加氧酶（lactate 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.4)、螢光素 4-單加氧酶(ATP 水解化） (Photinus-luciferin 4-monooxygenase (ATP-hydrolysing) ； EC 1.13.12.7)、苯丙氨酸 2-單加氧酶（phenylalanine 2-monooxygenase ; EC 1.13.12.9 ) 、clavaminate 合成酶（clavaminate synthase ; EC 1.14.11.21)、石腦油精 1，2-雙加氧酶（naphthalene l，2-dioxygenase ; EC 1_14.12.12)、4-胺基苯曱酸乙 S旨 1-單加氧酶（4-aminobenzoate 1-monooxygenase ; EC 1.14.13.27 )、烧搭單加氧酶（aikanal monooxygenase (FMN-linked) ; EC 1.14.14.3)、苯丙胺酸 4-單加氧酶 49 201122112 TW5583PA (phenylalanine 4-monooxygenase ； 1.14.16.1)、鄰胺苯甲酸鈉 3_翠加 氧酶（anthranilate 3-monooxygenase ; EC 1.14.16.3)、單紛單加氧酶 (monophenol monooxygenase ; EC 1.14.18.1)、7-膽留烯醇氧化酵素 (lathosterol oxidase ; EC 1.14.21.6)、超氧化物歧化酶（super〇xide dismutase ; EC 1.15.1.1)、超氧化物還原酶（SUperoxide recjuctase ; EC 1.15.1 ·2)、黃嗓吟脫氮酶（xanthine dehydrogenase ; EC 1 · 17· 1 4)、 黃嘌呤氧化酵素（xanthine oxidase ; EC 1.17.3.2)、6-羥基於驗脫氮 酶（6-hydroxynicotinate dehydrogenase ; EC 1.17.3.3)、香蒿枝域酵 素酵素（reticuline oxidase ; EC 1.21.3.3)、二磷酸核酮糖叛化酶 (Ribulose-bisphosphate carboxylase ; EC 4.1.1.39)所組成之群組。 32·如申請範圍第28項所述之微型生物感測器，其中催化該電 化學物質反應之該些觸媒粒子係與過氧化氫(H2〇2，Hydrogen Peroxide) 進行一電化學氧化還原反應。 33. 如申請範圍第32項所述之微型生物感測器，其中用於催化 過氧化氫之氧化還原作用的該等觸媒粒子，係包括一單一金屬元素 Μ、一二元金屬Μ-Χ、一單一金屬氧化物MOy、一二元金屬氧化物 MOy-XOy、一金屬-金屬氧化物複合材料M_M〇y、或選自前述類型之 組合’其中’ y係小於3 ’而Μ與X係選自由鋰(Li)、鈉(Na)、鎂(Mg)、 Ιδ(Α1)、鉀(K)、鈣(Ca)、鉻(Cr)、錳(Μη)、鐵(Fe)、鈷(Co)、鎳(Ni)、 銅(Cu)、辞(Zn)、鎵(Ga)、總(Sr)、釔(Y)、錯(Zr)、銳(Nb)、鉬(Mo)、 釕(Ru)、铑(Rh)、鈀(Pd)、銀(Ag)、鎘(Cd)、銦(In)、錫（Sn)、鋇(Ba)、 鑭(La、鈽(Ce)、镨(pr)、鉉(Nd)、釤(Sm)、銪(Eu)、釓(Gd)、铽(Tb)、 鏑(Dy)、鈥(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镏(Lu)、钽(Ta)、鎢(W)、锇(Os)、 銥(Ir)、鉑(Pt)、金(Au)、鉛(Pb)、鉍(Bi)所組成之群組。 34. 如申請範圍第33項所述之微型生物感測器，其中該些觸媒 201122112 TW5583PA 粒子係包括該二元金屬與該二元金屬氧化物，且其之金屬元素 係大於0小於100%。 、 •如申請專利範圍第28項所述之微型生物感測器，其中該些 觸媒粒子之擔體係為碳黑(Cab()t)。 二 •如申請專利範圍第28項所述之微型生物感測器，其中該些 觸媒粒子係為複數個鉑銥(Ptlr)奈米觸媒粒子，該等酵素分子係為複數 個葡萄糖氧化酵素分子(Glucose Oxidase，GOD)。 37. 如申請範圍第28項所述之微型生物感測器，其中該等觸媒 粒子之一平均粒徑，係介於約0.5奈米至約1〇〇微米之間。 38. 如申請專利範圍第28項所述之微型生物感測器’其中該工 作電極之該基材，係為形成於破材上之銀奈米金屬觸媒（Ir metal loading Carbon)。 39. 如申請專利範圍第28读所述之微型生物感測器，其係可於 一室溫下穩定保存至少30天。51
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