CN114904583B - 一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114904583B
CN114904583B CN202210659113.7A CN202210659113A CN114904583B CN 114904583 B CN114904583 B CN 114904583B CN 202210659113 A CN202210659113 A CN 202210659113A CN 114904583 B CN114904583 B CN 114904583B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ascorbic acid
oxidation
specificity
mimic enzyme
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210659113.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114904583A (zh
Inventor
李晓宏
于敏聪
张驰
方曼
田思佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Normal University
Original Assignee
Beijing Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Normal University filed Critical Beijing Normal University
Priority to CN202210659113.7A priority Critical patent/CN114904583B/zh
Publication of CN114904583A publication Critical patent/CN114904583A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114904583B publication Critical patent/CN114904583B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J31/00—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds
    • B01J31/16—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes
    • B01J31/18—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes containing nitrogen, phosphorus, arsenic or antimony as complexing atoms, e.g. in pyridine ligands, or in resonance therewith, e.g. in isocyanide ligands C=N-R or as complexed central atoms
    • B01J31/1805—Catalysts comprising hydrides, coordination complexes or organic compounds containing coordination complexes containing nitrogen, phosphorus, arsenic or antimony as complexing atoms, e.g. in pyridine ligands, or in resonance therewith, e.g. in isocyanide ligands C=N-R or as complexed central atoms the ligands containing nitrogen
    • B01J31/181—Cyclic ligands, including e.g. non-condensed polycyclic ligands, comprising at least one complexing nitrogen atom as ring member, e.g. pyridine
    • B01J31/1825—Ligands comprising condensed ring systems, e.g. acridine, carbazole
    • B01J31/183—Ligands comprising condensed ring systems, e.g. acridine, carbazole with more than one complexing nitrogen atom, e.g. phenanthroline
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2531/00—Additional information regarding catalytic systems classified in B01J31/00
    • B01J2531/10—Complexes comprising metals of Group I (IA or IB) as the central metal
    • B01J2531/16—Copper

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于纳米酶技术领域，公开了一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法及其应用。本发明将三水合硝酸铜、腺嘌呤和磷酸缓冲溶液混合加热反应，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶。本发明的氧化模拟酶具有特异性催化氧化抗坏血酸分子的活性，却不催化氧化多巴胺、尿酸、葡萄糖、半乳糖、谷胱甘肽、半胱氨酸、维生素A酸、维生素K1、维生素B1等生物小分子。在五倍干扰底物分子共存的条件下，优先催化氧化抗坏血酸分子，催化活性保持在90％左右。本发明的制备方法简单，生物兼容性好，有望应用于检测抗坏血酸分子，甚至抗肿瘤和抗菌消炎等方面的治疗。

Description

一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米酶技术领域，尤其涉及一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用。
背景技术
天然酶是一类具有催化功能的生物分子，以蛋白质为主，少数为核酸。其催化特点是效率高、底物专一。然而，因受限于含量低，催化条件苛刻(适宜的温度及酸碱性，一旦遇到热、酸、碱等非生理条件极易发生变性而失活)，分离提纯成本高，工序复杂，不易长时间保存且难以回收等问题，难于实现天然酶在实际生产生活中的广谱应用。
纳米酶是一类具有类酶催化活性的纳米材料，因易实现可控制备、稳定性高、成本低、可回收利用等特点，在肿瘤治疗、抗菌消炎、生物传感以及污染物去除等领域展现了潜在的应用价值。
然而，纳米酶发展至今出现的两个主要技术瓶颈问题是：(1)相较于天然酶，纳米模拟酶几乎不具有选择性催化特性，如何发展具有特异性催化活性的纳米酶是一个科学难题(2)催化底物相对单一，目前常用的催化底物都是模型底物分子，如显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，2’2-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和邻苯二胺(OPD)等，将催化底物逐渐由常规底物分子拓展到生物小分子，是纳米酶未来发展的主要趋势。
抗坏血酸(维生素C)是一种存在于动植物体内具有氧化还原活性的重要的生物分子。抗坏血酸不仅能维持牙齿、骨骼、血管和肌肉等正常的生理功能，而且还参与生物体的氧化还原反应，神经调节等重要生理功能。另外，抗坏血酸表达水平与多种疾病密切相关，如肝病、动脉硬化、心血管疾病甚至癌症等，因而血液中抗坏血酸的水平也是研究病理过程的重要指标。基于抗坏血酸如此重要的生理功能，研究特异性抗坏血酸氧化模拟酶具有非常重要的科学意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和潜在的应用，解决现有纳米酶存在的上述问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法：
将三水合硝酸铜、腺嘌呤和磷酸盐缓冲溶液混合加热反应，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶；
其中，反应的温度为60～80℃，反应的时间为10～50min。
优选的，在上述一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法中，所述三水合硝酸铜、腺嘌呤和磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1～4g：0.5～3g：80～120mL。
优选的，在上述一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为50～100mmol/L；磷酸盐缓冲溶液的pH为6.2～7.5。
优选的，在上述一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法中，所述反应结束后还包括将反应产物离心、洗涤、干燥。
优选的，在上述一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法中，所述洗涤为顺次使用无水乙醇和水洗涤。
优选的，在上述一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法中，所述干燥的温度为50～60℃；干燥的时间为6～15h。
本发明还提供了上述制备方法制得的一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶。
本发明还提供了一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶在分析检测抗坏血酸中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明的氧化模拟酶具有特异性催化氧化抗坏血酸分子的活性，而不催化氧化多巴胺、尿酸、葡萄糖、半乳糖、谷胱甘肽、半胱氨酸、维生素A酸、维生素K1、维生素B1等。在五倍干扰底物分子共存的条件下，优先催化氧化抗坏血酸分子，催化活性保持在90％左右。
(2)本发明的制备方法简单，环境友好，所用小分子配体具有良好的生物兼容性，有望进一步用于生物体系的抗肿瘤和抗菌消炎治疗。本发明对于特异性催化活性纳米酶的制备与生物小分子底物的拓展，具有非常重要的理论和实验指导意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例和现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1的Cu-A@PO4催化抗坏血酸生成脱氢抗坏血酸的质谱图；
图2为氧气、空气及氮气对实施例1的Cu-A@PO4催化抗坏血酸氧化过程的影响；
图3为温度对于实施例1的Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子影响图；
图4为BR缓冲溶液的pH对于实施例1的Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子影响图；
图5为反应时间对于实施例1的Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子影响图；
图6为实施例1的Cu-A@PO4作为抗坏血酸氧化酶的稳态动力学曲线；
图7为实施例1的Cu-A@PO4作为抗坏血酸氧化酶的动力学双倒数曲线；
图8为硫酸钛探测过氧化氢产生的复合物的紫外吸收图；
图9为实施例1的Cu-A@PO4作为抗坏血酸氧化酶在催化过程中产生自由基的电子自旋波谱图；
图10为其他底物小分子对实施例1的Cu-A@PO4氧化抗坏血酸活性的影响；其中，1-抗坏血酸，2-抗坏血酸和五倍浓度维生素A酸，3-抗坏血酸和五倍浓度维生素B1，4-抗坏血酸和五倍浓度维生素K1，5-抗坏血酸和五倍浓度谷胱甘肽，6-抗坏血酸和五倍浓度半胱氨酸，7-抗坏血酸和五倍浓度葡萄糖，8-抗坏血酸和五倍浓度半乳糖，9-抗坏血酸和五倍浓度多巴胺；
图11为实施例1的Cu-A@PO4-抗坏血酸-邻苯二胺荧光体系测定低浓度抗坏血酸的标准曲线图；
图12为实施例1的Cu-A@PO4-抗坏血酸-邻苯二胺荧光体系测定高浓度抗坏血酸的标准曲线图；
图13为实施例1的Cu-A@PO4作为抗坏血酸氧化酶检测抗坏血酸对其他小分子的选择性；其中，1-抗坏血酸，2-尿酸，3-半乳糖，4-葡萄糖，5-半胱氨酸，6-谷胱甘肽，7-丙氨酸，8-组氨酸，9-丝氨酸，10-甘氨酸，11-苏氨酸，12-赖氨酸，13-亮氨酸，14-色氨酸，2～14均为十倍的抗坏血酸分子的浓度；
图14为实施例1的Cu-A@PO4-抗坏血酸-邻苯二胺荧光体系在实际血清样品测定低浓度抗坏血酸的标准曲线图；
图15为实施例1的Cu-A@PO4-抗坏血酸-邻苯二胺荧光体系在实际血清样品测定高浓度抗坏血酸的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
将三水合硝酸铜、腺嘌呤和磷酸盐缓冲溶液混合，加热反应，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶。
在本发明中，反应的温度优选为60～80℃，进一步优选为63～78℃，更优选为69℃；反应的时间优选为10～50min，进一步优选为15～42min，更优选为34min。
在本发明中，三水合硝酸铜、腺嘌呤和磷酸盐缓冲溶液的质量体积比优选为1～4g：0.5～3g：80～120mL，进一步优选为1.2～3.5g：0.9～2.7g：87～112mL，更优选为2.4g：1.4g：108mL。
在本发明中，磷酸盐缓冲溶液的浓度优选为50～100mmol/L，进一步优选为56～92mmol/L，更优选为78mmol/L；磷酸盐缓冲溶液的pH优选为6.2～7.5，进一步优选为6.5～7.3，更优选为6.7。
在本发明中，反应结束后还包括将反应产物离心、洗涤、干燥。
在本发明中，洗涤优选为顺次使用无水乙醇和水洗涤。
在本发明中，干燥的温度优选为50～60℃，进一步优选为53～59℃，更优选为56℃；干燥的时间优选为6～15h，进一步优选为8～13h，更优选为12h。
本发明还提供了上述制备方法制得的一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶。
本发明还提供了一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶在分析检测抗坏血酸中的应用。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
将0.24g三水合硝酸铜和0.14g腺嘌呤加入10mL磷酸盐缓冲溶液(pH为7，浓度为60mmol/L)中，加热至70℃反应20min，得到沉淀；将沉淀离心，依次用无水乙醇和水洗涤，于60℃干燥12h，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶，记为Cu-A@PO4。
实施例2
一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
将0.32g三水合硝酸铜和0.21g腺嘌呤加入10mL磷酸盐缓冲溶液(pH为6.7，浓度为70mmol/L)中，加热至66℃反应25min，得到沉淀；将沉淀离心，依次用无水乙醇和水洗涤，于60℃干燥8h，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶，记为Cu-A@PO4。
实施例3
一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
将0.19g三水合硝酸铜和0.25g腺嘌呤加入9mL磷酸盐缓冲溶液(pH为6.8，浓度为50mmol/L)中，加热至75℃反应40min，得到沉淀；将沉淀离心，依次用无水乙醇和水洗涤，于50℃干燥6h，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶，记为Cu-A@PO4。
实施例4
一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法，包括以下步骤：
将0.4g三水合硝酸铜和0.3g腺嘌呤加入12mL磷酸盐缓冲溶液(pH为7.5，浓度为100mmol/L)中，加热至80℃反应50min，得到沉淀；将沉淀离心，依次用无水乙醇和水洗涤，于60℃干燥15h，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶，记为Cu-A@PO4。
实施例1制备的Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子生成脱氢抗坏血酸，抗坏血酸的消耗和脱氢抗坏血酸的形成通过质谱法表征。通过单独抗坏血酸和抗坏血酸与Cu-A@PO4共同孵育的质谱对比实验，结果如图1所示。由图1可知，Cu-A@PO4与抗坏血酸孵育后，抗坏血酸在175.02处的质谱峰强度降低，而生成的脱氢抗坏血酸在173.02处的质谱峰强度明显增强，即抗坏血酸的量减少，脱氢抗坏血酸的量增多，直接证明了Cu-A@PO4可以氧化抗坏血酸生成脱氢抗坏血酸。
实施例1制备的Cu-A@PO4具有抗坏血酸氧化模拟酶的活性，在有氧气存在的条件下可特异性催化抗坏血酸氧化生成脱氢抗坏血酸；生成的脱氢抗坏血酸可以和邻苯二胺反应生成蓝色荧光产物(DFQ，激发波长360nm，发射波长425nm)，在425nm处有明显的荧光发射。探究Cu-A@PO4在氧气、空气和氮气氛围下对抗坏血酸的特异性催化活性。在1mL离心管中加入700μL、pH＝7、20mM的BR缓冲溶液，100μL 0.5mg/mL Cu-A@PO4，100μL 10mM抗坏血酸分子和100μL 10mM邻苯二胺，在氧气、空气、氮气条件下孵育25min，用荧光光度计测量不同孵育温度下425nm处的荧光强度，结果如图2所示。由图2可知，相对于在空气中的催化效果，425nm处的荧光在氧气条件下明显增强，在氮气条件下略有减弱，说明在氧气条件下更有利于Cu-A@PO4催化抗坏血酸形成脱氢抗坏血酸。
实施例1制备的Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子生成脱氢抗坏血酸，分别探究温度、BR缓冲溶液的pH、反应时间对Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子的影响，结果如图3～5所示。
探究温度对于Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子影响的方法为：在不同温度下，在1mL离心管中加入700μL pH＝7、20mM的BR缓冲溶液，100μL 0.5mg/mL Cu-A@PO4、100μL10mM抗坏血酸分子和100μL 10mM邻苯二胺，孵育25min，用荧光光度计测量不同孵育温度下425nm处的荧光强度。如图3所示，温度在37℃下达到催化活性最大值。
探究pH对于Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子影响的方法为：在37℃的温度下，在1mL离心管中加入700μL不同pH的20mM的BR缓冲溶液，100μL 0.5mg/mL Cu-A@PO4，100μL10mM抗坏血酸分子和100μL 10mM邻苯二胺，孵育25min，在不同pH下，用荧光光度计测量不同孵育温度下425nm处的荧光强度。如图4所示，在pH＝7的条件下达到催化活性最大值。
探究时间对于Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子影响的方法为：在37℃的温度下，在1mL离心管中加入700μL pH＝7、20mM的BR缓冲溶液，100μL 0.5mg/mL Cu-A@PO4，100μL10mM抗坏血酸分子和100μL 10mM邻苯二胺，孵育不同时间，用荧光光度计测量不同孵育温度下425nm处的荧光强度，如图5所示，在25min时达到催化活性最大值，之后趋于平稳。
在氧气的存在下，考察实施例1的Cu-A@PO4抗坏血酸氧化模拟酶活性的稳态动力学参数。在37℃温度条件下，在1mL离心管中加入700μL pH＝7、20mM的BR缓冲溶液，100μL0.5mg/mL Cu-A@PO4，改变抗坏血酸分子的浓度(100μL，终浓度为0.3mM～1mM)，孵育5min后，得到抗坏血酸分子的动力学曲线，通过米氏方程
Figure BDA0003688172620000071
拟合得到Cu-A@PO4对抗坏血酸的稳态动力学参数，如图6～7所示，可以得出Cu-A@PO4对抗坏血酸的米氏常数Km＝0.12mM，最大反应速率Vmax＝1.7×10-3mM﹒s-1。
实施例1制备的Cu-A@PO4催化氧化抗坏血酸分子生成脱氢抗坏血酸，探究其催化过程。使用硫酸钛做探针，利用硫酸钛与过氧化氢形成的复合物可用紫外分光光度计测定紫外可见吸收光谱及波长410nm的吸光度，证明催化氧化过程中过氧化氢的产生，结果如图8所示。以5,5-二甲基-1-吡啶-n-氧化物(DMPO)为捕获剂，电子自旋共振(ESR)光谱检测到1:1:1:1超氧自由基(·O2 -)和1:2:2:1羟基自由基(·OH)的特征信号，结果如图9所示。由图9结合上述在氧气条件下荧光信号增强的结论以及过氧化氢产生的结论可知，催化过程是由氧气经超氧自由基到过氧化氢到羟基自由基，最后生成水。
分别以五倍的生物小分子底物(葡萄糖、半乳糖、多巴胺、谷胱甘肽、半胱氨酸)以及维生素(维生素A酸、维生素K1、维生素B1)与抗坏血酸共存，催化活性结果如图10所示。由图10结果表明Cu-A@PO4优先催化氧化抗坏血酸而不受其他小分子底物的干扰。
利用Cu-A@PO4抗坏血酸氧化模拟酶的活性，实现了对抗坏血酸的灵敏检测。Cu-A@PO4可以特异性催化抗坏血酸生成脱氢抗坏血酸，使用邻苯二胺做探针，生成的脱氢抗坏血酸与邻苯二胺可以生成荧光物质，在425nm处有荧光发射，具体为：在1mL离心管中加入700μL pH＝7、20mM的BR缓冲溶液，100μL 0.5mg/mL Cu-A@PO4，100μL不同浓度的抗坏血酸分子和100μL 10mM邻苯二胺，孵育25min，检测范围测试结果如图11～12所示。由图11～12可知，随着抗坏血酸浓度的降低，425nm处荧光发射峰降低，氧化态邻苯二胺的在565nm荧光峰升高，利用425nm处荧光强度与565nm荧光峰强度之比，比率荧光检测抗坏血酸。获得了宽的检测范围：10～250μM和250～800μM。检测限为2.06μM。检测方法操作简单，灵敏度高，对样品简单稀释处理即可实现灵敏检测。
利用实施例1的Cu-A@PO4作为抗坏血酸氧化酶可以特异性催化氧化抗坏血酸，实现了对抗坏血酸的灵敏检测，同时检测了对其他小分子(尿酸、半乳糖、葡萄糖、半胱氨酸、谷胱甘肽、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、赖氨酸、亮氨酸、色氨酸)的选择性，由图13可知，即使其他样品为10倍的抗坏血酸的浓度取代抗坏血酸分子，也不产生强烈的信号，只有抗坏血酸有信号响应，具有良好的选择性。
在稀释50倍的人血清中进一步探索了实施例1的Cu-A@PO4作为抗坏血酸氧化酶的潜在的应用。将血清样品先稀释5倍，再取100μL血清样品加入到1mL离心管中，再向离心管中加入600μL pH＝7、20mM的BR缓冲溶液，100μL 0.5mg/mL Cu-A@PO4，100μL不同浓度的抗坏血酸分子和100μL 10mM邻苯二胺，孵育25min，检测范围测试结果如图14～15所示。由图14～15可知，同样随着抗坏血酸的浓度由低到高，425nm处的荧光强度增强，而565nm处的荧光强度降低，利用425nm处荧光强度与565nm荧光峰强度之比，比率荧光检测抗坏血酸。获得了宽的检测范围：10～250μM和400～800μM。检测限为2.90μM。体现了Cu-A@PO4作为抗坏血酸氧化酶在实际分析检测人体血液抗坏血酸应用中的可行性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶在分析检测抗坏血酸中的应用，
所述高特异性抗坏血酸氧化模拟酶的制备方法如下，将三水合硝酸铜、腺嘌呤和磷酸盐缓冲溶液混合加热反应，得到高特异性抗坏血酸氧化模拟酶；
其中，反应的温度为60～80℃，反应的时间为10～50min；
所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为50～100mmol/L；磷酸盐缓冲溶液的pH为
6.2～7.5；
所述三水合硝酸铜、腺嘌呤和磷酸盐缓冲溶液的质量体积比为1～4g：
0.5～3g：80～120mL；
所述应用用于非疾病的诊断与治疗的目的。
2.根据权利要求1所述的高特异性抗坏血酸氧化模拟酶在分析检测抗坏血酸中的应用，其特征在于，反应结束后还包括将反应产物离心、洗涤、干燥。
3.根据权利要求2所述的高特异性抗坏血酸氧化模拟酶在分析检测抗坏血酸中的应用，其特征在于，所述洗涤为顺次使用无水乙醇和水洗涤。
4.根据权利要求2所述的高特异性抗坏血酸氧化模拟酶在分析检测抗坏血酸中的应用，其特征在于，所述干燥的温度为50～60℃；干燥的时间为6～15h。
CN202210659113.7A 2022-06-10 2022-06-10 一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用 Active CN114904583B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210659113.7A CN114904583B (zh) 2022-06-10 2022-06-10 一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210659113.7A CN114904583B (zh) 2022-06-10 2022-06-10 一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114904583A CN114904583A (zh) 2022-08-16
CN114904583B true CN114904583B (zh) 2023-05-16

Family

ID=82770335

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210659113.7A Active CN114904583B (zh) 2022-06-10 2022-06-10 一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114904583B (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI450967B (zh) * 2009-12-30 2014-09-01 Univ Nat Taiwan Science Tech 均勻之複合式觸媒／酵素結構及其製備方法與應用
CN106866762B (zh) * 2016-12-22 2019-10-18 北京化工大学 一种核苷酸基金属仿生漆酶
CN107573344A (zh) * 2017-09-08 2018-01-12 广东工业大学 一种生物金属有机框架配合物的制备方法及其应用
CN110196234A (zh) * 2019-06-09 2019-09-03 福建医科大学 纳米氧化铜的抗坏血酸氧化模拟酶活性
CN112608351B (zh) * 2020-12-25 2022-06-21 北京化工大学 一种负载型金属催化剂催化再生nad(p)h的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN114904583A (zh) 2022-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113237868B (zh) 一种基于氧化石墨烯基的表面增强拉曼传感器对真菌毒素的比率型检测法
Ahmed et al. Strong nanozymatic activity of thiocyanate capped gold nanoparticles: an enzyme–nanozyme cascade reaction based dual mode ethanol detection in saliva
CN114518344B (zh) 基于ACP@Ce/Tb-IPA的比率荧光和比色双模式检测农药残留的方法
Chen et al. An eco-friendly near infrared fluorescence molecularly imprinted sensor based on zeolite imidazolate framework-8 for rapid determination of trace trypsin
Wang et al. Catalase active metal-organic framework synthesized by ligand regulation for the dual detection of glucose and cysteine
Chauhan et al. Immobilization of barley oxalate oxidase onto gold–nanoparticle-porous CaCO3 microsphere hybrid for amperometric determination of oxalate in biological materials
Li et al. Chemiluminescence flow biosensor for determination of total D-amino acid in serum with immobilized reagents
Huang et al. Bimetallic CuCo Prussian blue analogue nanocubes induced chemiluminescence of luminol under alkaline solution for uric acid detection in human serum
CN112763484A (zh) 一种基于比色生物传感器检测谷胱甘肽和/或过氧化氢的方法
CN114062287B (zh) 一种尿酸氧化酶负载四氧化三铁复合纳米酶检测尿酸的方法
Sun et al. Ratiometric fluorometric and colorimetric dual-mode sensing of glucose based on gold-platinum bimetallic nanoclusters
Wang et al. Bifunctionalized Prussian blue analogue particles oxidize luminol to produce chemiluminescence without other oxidants
Çubuk et al. Development of photopolymerized fluorescence sensor for glucose analysis
Chen et al. Bifunctional Fe@ PCN-222 nanozyme-based cascade reaction system: Application in ratiometric fluorescence and colorimetric dual-mode sensing of glucose
CN103411949A (zh) 利用sers技术间接检测血清中葡萄糖含量的方法
CN114904583B (zh) 一种高特异性抗坏血酸氧化模拟酶及其制备方法和应用
Wang et al. Diacetyl as a new-type of artificial enzyme to mimic oxidase mediated by light and its application in the detection of glutathione at neutral pH
Su et al. Novel scandium-MOF nanocrystals as peroxidase-mimicking nanozymes for highly sensitive colorimetric detection of ascorbic acid in human serum
Huanan et al. A smartphone-integrated dual-mode nanosensor based on Fe3O4@ Au for rapid and highly selective detection of glutathione
Zhang et al. A ratiometric fluorescence sensor for determination of choline based on gold nanoclusters and enzymatic reaction
CN112179875B (zh) 一种一型透明质酸酶荧光纳米传感器的制备及应用
CN109612973B (zh) 一种通过荧光金纳米簇探针检测胆固醇及其浓度的方法、检测胆固醇氧化酶及其浓度的方法
CN106872430B (zh) 半胱氨酸荧光分析方法
Li et al. Silver nanosol SERS/Flu/Abs trimode analysis of trace H2O2 based on Fe-doped carbon dot catalytic oxidation of TMB
CN110361371A (zh) 一种基于氮掺杂碳点和催化氧化反应的荧光传感器及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant