TW201043242A - Vaccine for protection against Streptococcus suis bacteria of various serotypes - Google Patents

Description

201043242 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於保護小豬拮抗多種血清型之豬鏈球菌（ iSVrepiococcws ίΜ/ί)細菌之疫苗，該保護作用特別是由防 備異源性菌株之交叉保護作用所提供。 【先前技術】 Q 豬鏈球菌（心wb)係豬傳染性細菌性疾

病的主要病原菌之一。該病原菌可引起各種不同之臨床徵 候群，其包括腦膜炎、關節炎、心包炎、多發性漿膜炎、 敗血症、肺炎及猝死。豬鏈球菌係革蘭氏陽性兼性厭氧球 菌，原先被定義爲藍斯菲爾德（Lancefield) R型、S型 、R/S型或T型。後來，提出根據位於細胞壁內之特異性 莢膜多醣抗原之新分類系統。此導致包含35種血清型之 系統（Rasmussen and Andresen, 1998, “16S rDNA sequence variations of some Streptococcus suis serotypes”，Int. J. Syst. Bacteriol. 48，1063-1065)，其 中血清型2、1、9、7及1/2最爲普遍。對於豬群中豬鏈 球菌的控制通常受阻於缺乏能提供拮抗多種不同血清型之 保護作用的疫苗’及缺乏具有高專一性及敏感性之診斷測 試。該等工具之有限可得性可能是因爲大量現存之血清型 、不同菌株間之毒性差異及對於造成毒性及保護作用之因 素所知仍少所致。

Porcilis Strepsuis®係供防備豬之豬鏈球菌血清型2 201043242 的註冊疫苗（英特威/先靈葆雅動物保健公司）。該疫苗 亦經由攝取初乳被動性地保護小豬拮抗血清型2。然而， 該疫苗未被註冊於防備其他血清型之豬鏈球菌細菌。事實 上，就一般對於主動性防備豬鏈球菌之疫苗的了解而言’ 拮抗其他血清型之細菌的交叉保護作用並未發生。除其他 外，此係由亨德里克斯（Hendrikus Jan Wisselink)於 200 1年12月6日所發表之博士論文證實，論文名稱“ Streptococcus suis infection in pigs: Use of virulence-associated markers in diagnostics and vaccines’’。在其摘 要中（第129頁）述及，「預防豬鏈球菌所引起之疾病的 策略係藉由使用疫苗。死的全細胞疫苗似乎對同源性血清 型之菌株的攻擊提供顯著之保護作用’但是此保護作用可 能具血清型特異性。」 上述發現與史密斯之發現一致（2006年10月24日 公告之美國專利7,125,548)。她提到，「抗體具有血清型 特異性，通常只對鏈球菌中許多已知血清型中之一型授予 保護作用。舉例來說’目前可購得之豬鏈球菌疫苗通常係 以全細胞細菌製劑或豬鏈球菌之富含莢膜部分爲基礎’該 等疫苗僅授予有限之拮抗異源性菌株之保護作用。」（該 美國專利第4欄第42至28行）°最近發表的硏究（ January 2 0 0 8: Medycyna Weterynaryj na，Volume 64, issue 1, pages 113-116)描述拮抗血清型2及1/2之豬鏈球菌細 菌的保護作用。如果在不同的血清型[之間有任何預期程度 之交叉保護作用’該交叉保護作用將出現在該等血清型之 -6 - 201043242 間，因爲彼等在免疫上具有非常密切的相關性。另外，二 種血清型均被包含於疫苗中以獲得適當之保護作用。英國 之RUMA (負責藥物使用農業聯盟）已於2006年1 1月發 表在養豬產業中使用疫苗及免疫接種之指南。就豬鏈球菌 所引起之疾病而言，該指南提及（第19頁）對小豬之保 護作用可藉由免疫接種母豬達成，但是「拮抗其他豬鏈球 菌血清型所引起之疾病的保護作用不會發生。」 〇 迄今已知疫苗之缺點在於，爲具備拮抗最爲普遍之血 清型（意即血清型2及1和次要普遍之血清型9及7)的 保護作用，所有應對其提供保護作用之血清型必須被包含 在該疫苗中。就安全性的觀點而言，此係不利的（較多細 菌存在通常導致疫苗中較高之LPS含量），且另從經濟 觀點來說亦不利：多種血清型之細菌存在於疫苗中意謂著 較高之疫苗批次失敗機率及較高之污染風險。因此，發現 疫苗批次不適合販售之機率增加。據此，本發明之目的即 Ο 爲克服或至少減輕目前防備豬鏈球菌之疫苗的缺點，及達 成具備拮抗因豬鏈球菌細菌感染所引起之疾病（至少減輕 臨床徵候，較佳地亦減少感染及更佳地亦降低死亡風險） 之保護作用的疫苗，其中該保護作用係拮抗多種血清型之 細菌。 爲達此目的，硏究已經發現可利用對應預定血清型之 豬鏈球菌細菌的豬鏈球菌抗原以製造供給予母豬或女豬之 疫苗，經由攝取該母豬或女豬之初乳以保護小豬拮抗因該 預定血清型以外之血清型的豬鏈球菌細菌所引起之疾病（ 201043242 除了從習知技藝得知之固有同源保護作用以外）。申請人 已經證實，當使用以特定血清型之豬鏈球菌細菌的抗原爲 基礎之疫苗免疫接種該母豬或女豬時，小豬經由攝取該母 豬或女豬之初乳以保護該小豬拮抗因另一血清型之豬鏈球 菌細菌所引起之疾病。由於習知技藝特別地且持續地揭示 包含預定血清型之豬鏈球菌細菌的抗原之疫苗不提供防備 另一血清型之豬鏈球菌細菌的保護作用，即使是經由攝取 初乳所獲得之被動免疫，因此該保護作用並不被合理地預 期。應注意的是，一旦知道藉由以預定血清型之豬鏈球菌 細菌免疫接種該母豬或女豬可提供防備另一血清型之細菌 的交叉保護作用，本發明之用途的許多實施態樣可被設計 。舉例來說，細菌可被如此地放入疫苗中（不論是活的減 毒或死的）、該細菌可被用來獲得該細菌之一或多種免疫 原性成分之萃取物以放入疫苗中，或彼等可被用來達成該 細菌之重組次單位以作爲調製該疫苗本身之實際抗原。所 有這些實施態樣係由用語「豬鏈球菌抗原於製造疫苗上之 (J 用途」所涵蓋。 【發明內容】 發明摘要 應注意的是就本發明之意義而言，疫苗係一適合應用 於動物（包括人）之組成物，該組成物包含一或多種免疫 有效量（意即能充分地刺激目標動物之免疫系統以至少減 少野生型微生物攻擊所帶來之負面效應）之抗原諸如經減 -8- 201043242 毒或死的微生物及/或彼等之次單位，或任何其他物質諸 如有機體之代謝物，該抗原通常與醫藥上可接受之載劑諸 如包含水之液體組合，該組成物在給予動物時誘發免疫反 應以治療疾病或疾患，意即幫助疾病或疾患之預防、改善 或治療。一般來說，疫苗可利用該領域已知之方法製造， 該方法基本上包含混合該抗原（或包含該抗原之組成物） 與醫藥上可接受之載劑，例如液體載劑諸如（可任意選擇 〇 地經緩衝之）水或諸如經常用於獲得冷凍乾燥疫苗之固體 載劑。可任意選擇地其它物質諸如佐劑、穩定劑、黏度調 節劑或其他成分根據該疫苗之意圖用途或所需性質添加。 許多型式適用於免疫接種，特別是液體調製劑（含有溶解 、乳化或懸浮抗原）但亦包括固體調製劑諸如植入物或中 間型式諸如供懸浮於液體中之抗原之固體載劑。非經腸及 經口免疫接種及供該免疫接種之適當（物理）型式之疫苗 已經爲人所知超過200年。 Ο 在一實施態樣中，該預定血清型係選自由血清型1、 2、7及9所組成之群組，且提供防備該相同群組中之異 源性血清型之細菌的保護作用。該些血清型之豬鏈球菌細 菌係最爲普遍之血清型，本發明因此提供調製疫苗之選擇 ，該疫苗包含僅對應一種血清型之豬鏈球菌細菌的抗原， 以獲得防備4種最普遍血清型之細菌的保護作用。 在另一實施態樣中，該預定血清型係選自由血清型1 及2所組成之群組，且提供防備由血清型1、2、7及9所 組成之群組中之異源性血清型之細菌的保護作用。可預期 -9- 201043242 的是，同源性保護作用仍是最適當之保護作用。因此，最 有利的是在實際疫苗中具有對應血清型1及/或2 (該等 血清型爲田野中之主要血清型）之豬鏈球菌細菌的細菌抗 原。此提供適當田野保護與降低製造風險之間幾乎完美的 平衡。 在另一實施態樣中，該預定血清型係血清型2，且提 供防備由血清型1、7及9所組成之群組中之血清型之細 菌的保護作用。二者擇一地，該預定血清型係血清型1， 且提供防備血清型2之細菌的保護作用。 在另一實施態樣中，該疫苗包含豬鏈球菌細菌之未經 活化之細胞及/或彼等之衍生物。包含未經活化之細胞及/ 或彼等之衍生物的疫苗似乎提供足夠之保護作用。不活化 抗原的優點是安全。豬鏈球菌細菌可能藉由任何該領域已 知之方法不活化，諸如藉由使用化學不活化劑諸如々丙內 酯、硫柳汞（或另一供汞劑）、甲醛等，採用物理方法諸 如加熱' UV光、微波等，藉由使用生物方法諸如酶基底 方法以殺死細菌，及任何其他經常應用於該領域之方法。 胃等方法，細菌細胞之多個部分可能喪失彼等與 該細胞2相關性。特定地，此可能爲細胞膜相關成分諸如 外膜本身或外膜蛋白質。如此一來，剩下之非完整之死的 細胞就本發明之意義上可被視爲衍生物。另外，喪失與細 胞β相關性之多個部分就本發明之意義上可被視爲衍生物 ° m Μ @是該些成分（特別是外膜相關性成分）可充 分地促成目標動物對疫苗之有效免疫反應。因此，該些成 -10- 201043242 分在許多情況下可被用來作爲該疫苗中之單一成分。在後 者情況中，我們可使用該領域已知之多種方法獲得（實質 上）純的形式之該成分，例如藉由重組技術製備、藉由合 成該成分或藉由自醱酵液純化該成分。一般來說’就本發 明之意義而言，衍生物係豬鏈球菌細菌之非活的成分，不 同於未經活化之全細胞。 在另一實施態樣中，在第一次免疫接種該母豬或女豬 〇 之後進行第二次免疫接種，該第一及第二次免疫接種發生 在該母豬或女豬生產之前。此免疫接種計畫已被提供以導 致對小豬之最佳保護作用。在較佳之實施態樣中，該第一 次免疫接種發生在預定生產日期之前4至8週，且第二次 免疫接種發生在該日期之前1至4週。 本發明亦關於對應預定血清型之豬鏈球菌細菌的豬鏈 球菌抗原，其係用於製造供給予母豬或女豬之疫苗以經由 攝取該母豬或女豬之初乳以保護小豬拮抗因該預定血清型 ^ 以外之血清型的豬鏈球菌細菌所引起之疾病。 本發明將由下列實施例說明，該些實施例關於本發明 之較佳實施態樣。 【實施方式】 實驗設計 4隻母豬（SPF豬，無豬鏈球菌感染之典型臨床症狀 )在預定生產日期之前6至8週（肌肉內注射，2毫升） 及4週後（再次肌肉內注射，2毫升）以購得之疫苗 -11 - 201043242

Porcilis Strepsuis進行免疫接種。該疫苗係購自荷蘭博克 斯曼英特威先靈葆雅動物保健公司。該疫苗包含以甲醛不 活化之全細胞豬鏈球菌血清型2細菌，且該活性成分係懸 浮於Diluvac Forte (油水型）佐劑。該疫苗包含0 D 6 〇 〇 値爲18之5% (重量：重量）抗原，該値被定義爲標準 或1 00%疫苗強度。同樣地，其他包含4隻母豬之各組接 受下列實驗疫苗：包含血清型1、2、7及9之100%疫苗 ;50 % 疫苗（1、2、7、9) ; 100 % 疫苗（2、7、9)； 1 〇 〇 % 疫苗（1、7、9 ) ; 1 0 0 % 疫苗（1、2、9 );及 1 0 0 % 疫苗（1、2、7):見表1。 一般來說，包含豬鏈球菌抗原之任何其他疫苗可使用 該領域已知之方法調製，該方法基本上包含混合適當之豬 鏈球菌抗原（活的或不活化、全細胞、萃取物、純化部分 或甚至次單位）與醫藥上可接受之載劑，例如液體載劑諸 如（可任意選擇地經緩衝之）水或固體載劑諸如經常用於 獲得冷凍乾燥疫苗者。可任意選擇地其它物質諸如佐劑、 穩定劑、黏度調節劑或其他成分係根據該疫苗之意圖用途 或所需性質添加。在本實施例中，我們使用可購得之商用 疫苗及如上所述之實驗疫苗。 每種血清型包括4隻未經免疫接種之母豬以作爲陰性 對照組。在大約3週齡時，每隻母豬生產之2隻小豬被轉 移至實驗農場。接著，該些小豬（每個治療組共8隻小豬 )以豬鏈球菌血清型1或2或7或9攻擊。組別處理（攻 毒組）係如表1所述進行。死後檢查於攻毒後7天（血清 -12- 201043242 型1、7及9)或14天（血清型2)或更早當動物死亡或 因動物福利因素被安樂死時進行。 該攻擊株係豬鏈球菌血清型1或2或7或9之田野分 離株（活的菌株）。該攻毒培養液係於攻毒前新鮮製備。 猪鏈球菌被接種於托德休伊特（Todd Hewitt)洋菜培養 基上，並於37 °C隔夜培養。用5毫升托德休伊特肉汁（ 包含0.1% (重量：體積）半胱胺酸）收集各培養板上之 ❹ 細菌，使用1毫升細菌懸浮液接種40毫升該相同肉汁。 將細菌懸浮液添加至肉汁直到〇D6QQ値達到0.1至0.2。 隨後於3 7 °C培養4至5小時。接著該培養液經濃縮或稀 釋以獲得適當之疫苗強度（見表1)。將該攻毒物質保持 於融冰中直到使用，該使用在2小時內完成。各包含8隻 小豬之組使用德威必士（Devilbiss)氣霧器於噴霧箱中藉 由噴霧途徑以血清型2攻毒（每16隻小豬40毫升攻毒培 養液）。使該些小豬留在噴霧箱中約3 0分鐘。各包含8 〇 隻小豬之組藉由氣管內注射2毫升具有適當0D之血清型 1或7或9攻毒培養液攻毒。有關治療組及劑量之資訊見 表1。每種攻毒血清型使用一未經免疫接種之對照組。 13- 201043242 表1.治療組(免疫接種母豬及經攻毒之小豬) 母豬組(n=4) 小豬組(n=8) 疫苗 攻毒血清型a 1 1 Porcilis Strepsuis (100%血清型2) f 2 2 τ 3 3 9b 4 4 100% 1,2,7,9 1 5 5 2° 6 6 7 7 7 9 8 8 50% 1,2,7,9 1 9 9 2 10 10 7 11 11 9 12 12 100% 2,7,9 1 13 13 100% 1,7,9 2 14 14 100% 1,2,9 7 15 15 100% 1,2,7 9 16 16 — 1 17 17 — 2 18 18 — 7 19 19 — 9 a攻毒途徑：血清型2，噴霧（每16隻小豬40毫升）； 血清型1、7及9，氣管內（每隻小豬2毫升） ^女毒液之OD値如下：血清型1，〇D = 5.0;血清型2’ OD = 2.0;血清型 7，〇D = 1.0;血清型 9，OD = 7.5 在攻毒後，每天評估肛溫、整體狀況、移動運動、神 經系統及其他異常之得分。 整體狀況之評分系統如下： 〇 =正常 1 =較不活躍 -14- 201043242 2 =無法起立 4 =死亡/瀕死 移動運動系統之評分系統如下： 〇 =正常 1=關節腫脹及/或疼痛 2 =跛行（一或多隻腳跛腳） 3 =無法以單腳站立 〇 神經系統之評分系統如下： 〇 =正常行爲 1=斜頸 2 =步伐搖晃 3 =無法站立/抽搐 任何被安樂死之小豬自動地在臨床症狀之類別給予導 致人道中止之決定的4分每日得分。每隻小豬之臨床總分 〇 係自攻毒至死後檢查之每日臨床得分之總和。在屍體解剖 時，自腦、腦膜、脾、二個肘關節及二個跗關節以拭子採 樣以供再分離攻毒微生物。使該拭子於托德修伊特洋菜板 上進行畫線分離。該板於3 7 t隔夜培養，之後計算該板 上典型之豬鏈球菌菌落數。檢查各板上典型菌落之物質的 特性（豬鏈球菌），並以抗豬鏈球菌兔血清測定血清型。 豬鏈球菌菌落之數量被轉換成如下之再分離分數： 0 =無菌落形成單位（CFU)

1 = 1-10 CFU -15- 201043242

2 = 11-100 CFU 3=101-1000 CFU 4=>1000 CFU 結果 各別試驗之結果（每個攻毒血清型一個試驗）顯不於 表2至5。 表2以血清型1攻毒後小豬保護作用之結果 疫苗 平均臨床得分 (標準差） 死亡率 [n/ritotai] 再分離分數 (標準差） Porcilis Strepsuis (100%血清型2) 1.6 P.2) 0/8 1.0(1.9) 100% 1,2,7,9 2.6 (5.0) 0/8 2.5 (6.0) 50% 1,2,7,9 0.1 (0.4) 0/8 1.4(1.3) 100% 2, 7, 9 2.3 (5.3) 1/8 1.4(1.9) — 3.6 (5.9) 1/8 4.3(4.1) 表3以血清型2攻毒後小豬保護作用之結果 疫苗 平均臨床得分 (標準差） 死亡率 [n/n,otai] 再分離分數 (標準差） 100% 1,2, 7, 9** 6.4(11.9) 2/8 2.8 (4.2) 50% 1,2,7,9 23.1 (16.5) 6/8 3.8 (2.5) 100% 1,7,9 4.5(10.4) 1/8 0.4 (0.5) - 36.8(16.4) 7/8 5.5 (5.4) 201043242 表4以血清型7攻毒後小豬保護作用之結果 疫苗 平均臨床得分 (標準差） 死亡率 [n/nt0,ai] 再分離分數 (標準差） 100% 1,2,7,9 13.9(13.7) 6/12 4.0 (5.7) 50% 1,2,7,9 8.7(11.2) 5/12 4.3 (5.4) 100% 1,2, 9 12.3(12.7) 6/12 1.8 (3.3) — 21.9(12.4) 8/12 7.3 (7.5) 表5以血清型9攻毒後小豬保護作用之結果 疫苗 平均臨床得分 (標準差） 死亡率 [n/rit〇tal] 再分離分數 (標準差） Porcilis Strepsuis (100%血清型2) 8.1 (7.5) 2/8 2.8 P.5) 100%1,2, 7, 9 7.0 (8.7) 2/8 2.0 (2.9) 50% 1,2,7,9 5.3 (5.7) 2/8 2.4 (4.4) 100% 1,2,7 7.3 (4.3) 1/8 5.1 (3.8) — 14.1 (10.1) 4/8 7.4(9.8) 表2顯示來自所有免疫接種母豬組之小豬的平均臨床 分數（意即所有8隻小豬之每隻小豬的總臨床分數之平均 値，也就是從攻毒至死後檢査之每日臨床分數之總和）相 〇 較於對照動物之平均臨床分數爲低。同樣情形亦見於再分 離分數。此暗示二種不含血清型1之疫苗（僅包含血清型 2之Porcilis Strepsuis及包含血清型2、7及9之三價疫 苗）誘發（至少部分）拮抗血清型1之交叉保護作用。 表3顯示來自所有免疫接種母豬組之小豬的平均臨床 分數相較於對照動物之平均臨床分數爲低。同樣情形亦見 於再分離分數。死亡率之結果顯示包含血清型1、2、7及 9和包含血清型1、7及9之二種1 00%疫苗誘發顯著降低 之死亡率。此暗示不含血清型2之疫苗（包含血清型1、 -17- 201043242 7及9之三價疫苗）至少誘發拮抗血清型2之部分交叉保 護作用。與血清型1攻毒試驗之結果組合，此暗示血清型 1及2之抗原給予相互交叉保護作用。 表4顯示來自所有免疫接種母豬組之小豬的平均臨床 分數相較於對照動物之平均臨床分數爲低。同樣情形亦見 於再分離分數。死亡率之結果顯示三種疫苗沒有一種誘發 顯著降低死亡率。該些結果一起暗示不含血清型7之疫苗 (包含血清型1、2及9之三價疫苗）誘發（至少部分） 拮抗血清型7之交叉保護作用。 表5顯示來自所有免疫接種母豬組之小豬的平均臨床 分數相較於對照動物之平均臨床分數爲低。同樣情形亦見 於再分離分數，雖然該三價疫苗不誘發再分離分數之顯著 降低。死亡率之結果顯示該三價疫苗相較於未經免疫接種 之對照組誘發最高之死亡率降低。該些結果一起暗示不含 血清型9之二種疫苗（僅包含血清型 2之 Porcilis Strepsuis及包含血清型1、7及9之三價疫苗）誘發（至 少部分）拮抗血清型9之交叉保護作用。 結論 本發明顯示當豬攝取已免疫接種特定血清型之豬鏈球 菌細菌之抗原的母豬初乳時可保護豬拮抗異源性攻毒（除 同源性攻毒以外）。本發明特定地顯示當豬攝取已免疫接 種血清型2之豬鏈球菌抗原的母豬初乳時可保護豬拮抗血 清型1、7或9之豬鏈球菌細菌之攻毒。由於保護作用已 -18- 201043242 被證實與攻毒血清型無關（此由血清型2、7及9所組 成之群組證實）’且當以不同血清型之細菌免疫接種時亦 提供該相同群組中之交叉保護作用’應了解的是當猪攝取 已免疫接種特定豬鏈球菌血清型之母豬的初乳時’對豬有 拮抗異源性攻毒之整體交叉保護作用，特定地當該疫苗包 含由屬於任何血清型1、2、7及9之細菌所組成之族群的 豬鏈球菌細菌抗原以獲得拮抗該相同群組中之異源性血清 0 型之豬鏈球菌細菌的保護作用。 〇 -19-

Claims (1)

1. 201043242 七、申請專利範圍： 種對應預定血清型之豬鏈球菌（Streptococcus suis )細菌的豬鏈球菌抗原於製造供給予母豬或女豬之疫 苗上之用途，該用途係經由攝取該母豬或女豬之初乳以保 護小豬拮抗因該預定血清型以外之血清型的豬鏈球菌細菌 所引起之疾病。 2. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該預定血清型 係選自由血清型1、2、7及9所組成之群組，且提供防備 該相同群組中之異源性血清型之細菌的保護作用。 3. 如申請專利範圍第2項之用途，其中該預定血清型 係選自由血清型1及2所組成之群組，且提供防備由血清 型1、2、7及9所組成之群組中之異源性血清型之細菌的 保護作用。 4. 如申請專利範圍第3項之用途，其中該預定血清型 係血清型2，且提供防備由血清型1、7及9所組成之群 組中之血清型之細菌的保護作用。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之用途，其中 該疫苗包含豬鏈球菌細菌之未經活化之細胞及/或彼等之 衍生物。 6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之用途，其中 在第一次免疫接種該母豬或女豬之後進行第二次免疫接種 ，該第一及第二次免疫接種發生在該母豬或女豬生產之前 〇 7. 如申請專利範圍第6項之用途，其中該第一次免疫 -20- 201043242 接種發生在預定生產日期之前6至8週 種發生在該日期之前2至4週。 8.—種對應預定血清型之豬鏈球菌 原，其係用於製造供給予母豬或女豬之 母豬或女豬之初乳以保護小豬掊抗因該 血清型的豬鏈球菌細菌所引起之疾病。 〇 且第二次免疫接 菌的豬鏈球菌抗 苗以經由攝取該 定血清型以外之

   -21 - 201043242 四、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：無。 (二） 本代表圖之元件符號簡單說明：無

   ❹ 201043242 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學 式：無

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