TW201036631A - Pharmaceutical composition to protect an animal against a disorder arising from an infection with a bacterium that belongs to the group of nocardioform actinomycetes - Google Patents

Description

201036631 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於一種供動物防備由屬於諾卡菌形放線菌族 群之細菌感染所引起的疾病之醫藥組成物。本發明亦關於 此族群之減毒活菌於製備該組成物上之用途及以該組成物 治療動物之方法。 0 【先前技術】 在放線菌綱（Actinobacteria)之細菌中有一目之細菌稱 爲放線菌目（Actinomycetales)，通常被稱爲放線菌 (actinomycetes)。屬於此目之細菌係有較高G + C含量之絲 狀革蘭氏陽性細菌（然而有些物種的複雜細胞壁結構較不 適合或甚至不適合用傳統革蘭氏染色，例如許多屬於放線 菌目分枝桿菌科（Mycobacteriaceae)之物種）。它們是廣爲 周知之土壤微生物，雖然有些菌株棲息於植物及動物，包 〇 括人。它們產生通常連接於氣生菌絲體或菌絲之穩定孢子 。放線菌在有機物質之去組成（decomposition)上扮演重要 角色。有些物種因爲彼等之典型性質被用於工業及製藥硏 究。 大部分放線菌對動物不具致病性（本發明中所使用之 動物用語包括人）。然而，在放線菌目之許多亞目中（包 括鏈孢囊菌亞目（Streptosporangineae)、微球菌亞目 (Micrococcineae)、鏈黴菌亞目（Streptomycineae)及弗蘭 克氏亞目（Frankineae))，有一亞目即棒狀桿菌亞目 201036631 (Corynebacterineae)除了大量之非致病性細菌之外，還 有爲數眾多之動物病原菌。這些病原菌似乎存在於稱爲 諾卡菌形放線菌之種系發生（phylogenic)族群中，該族群 包含分枝桿菌科（Mycobacteriaceae)、諾卡菌科 (Nocardiaceae)及棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae)(特別 參見 “ Opportunistic Intracellular Bacteria and Immunity” by Lois J. Paradise et al (eds.)，New York, 1999 之第 11 章，標題爲 eqw/.· Pathogenesis and Replication in Macrophages)。値得注意的是，幾乎 沒有任何可適當防備與這些病原菌感染有關之大部分疾 病的預防性治療（意即在暴露於致病性病原菌之前或實質 上在暴露同時之治療，該治療可預防疾病發生或至少減 輕該疾病之影響）。近年來，認識諾卡菌形放線菌之種系 發生族群中的分枝桿菌科、諾卡菌科及棒狀桿菌科係棒 狀桿菌亞目中關係非常密切之科已被證實（亦見 University of California, San Diego, Outline of Senior Project, Marelle L. Yehuda, June 2, 2005)。也變得清楚 的是，此族群中特別是致病性細菌（至少該些無可得之適 當預防性治療之細菌，諸如舉例來說結核分枝桿菌 (、鯽諾卡菌（TVocardM 、馬紅球菌（i?/?Oi/〇Ci)CCW5： egw/))具有重要的共 通特性：感染通常經由皮膚或黏膜發生，該細菌隨後散 佈於巨噬細胞內且在該些巨噬細胞內複製（特別參見 Microbes and Infection 7, 2005, 1352-1363; Proceedings 201036631 of the National Academy of Sciences, June 7，2 005, Vol. 102, no 23, pp 8327-8 33 2; Nature Medicine 1 3, 282-284, 2 0 0 7; Transplantation Proceedings, Volume 36，Issue 5, June 2004, pp 1415-1418)。事實上巨噬細胞是宿主免疫 防備微生物感染之前線，因此和依賴避免吞噬作用以在 宿主體內存活之細菌不同的是，目前考慮之此族群之致 病性細菌將巨噬細胞當作標靶以在宿主體內存活甚至複 〇 製。本發明係關於這些能在動物之巨噬細胞內存活之細 菌，且在本發明中將被稱爲巨噬細胞存活性諾卡菌形放 線菌。 很明顯的，巨噬細胞存活性諾卡菌形放線菌已經過演 化以入侵動物防禦微生物之重要功能。特別地，結核病之 致病微生物結核分枝桿菌即爲成功利用巨噬細胞作爲彼之 活體內主要小生境（primary niche)之物種，不過其他屬於 諾卡菌形放線菌族群之細菌物種包括分枝桿菌科、諾卡菌 〇 科及棒狀桿菌科已採取相同策略。這些舉例來說包括造成 布路里（Buruli)潰瘍之潰瘍分枝桿菌（M_yco 6a cier/MW M/ceraw·?)、造成牛副結核病（Johne’s disease)且與人克隆 氏病（Crohn’s disease)有關之禽分枝桿菌副結核亞種 (My cobacterium avium paratuberculosis) ' 造成牛結核病 之牛分枝桿菌6oW·?)、與伺機感染免疫不 全個體諸如AIDS病患有關之禽分枝桿菌（Mj/cWacMrhm flWw/n)、造成魚諾卡菌症之鯽諾卡菌（Trocar serio/ae) 及皮疽諾卡菌、造成腎移植接受病患 201036631 感染之星形諾卡菌、造成幼馬肺炎且 亦與伺機感染免疫不全個體有關之馬紅球菌（i?/2〇i/〇C〇CCM e 9 w z’）（以則被認爲是棒狀桿囷）及除其他外在肺、在綿羊、 山羊、馬及有時亦在人等造成膿瘍之假結核棒狀桿菌 {Corynebacterium p s e u d o t u b e r c ui o s i s)。所有這些細菌物 種具有在巨噬細胞內存活、感染巨噬細胞且在此類宿主細 胞內複製之相同能力。 此典型性質嚴重干擾由屬於巨噬細胞存活性諾卡菌形 放線菌族群之細菌感染所引起的疾病之治療（在此專利說 明書中，用語「疾病（disorder)」係與「疾患（disease)」 相同地使用）。在許多病例中，當臨床症狀實際存在時係 以抗生素治療。然而此爲棘手的，因爲顯著量之細菌存在 於巨噬細胞內且抗生素難以抵達。因此抗生素治療通常需 要長時間的治療，而成敗參半。以諸如人之結核病、魚之 諾卡菌症及幼馬之肺炎這些疾病而言，預防性治療將被優 先考慮。該預防性治療通常依賴包含源自野生型細菌之死 菌或減毒活菌之疫苗的使用。就巨噬細胞存活性諾卡菌形 放線菌而言，死菌疫苗（亦即包含死菌或彼之一或多種次 單位以作爲治療劑之疫苗）已被證明是不成功的。目前一 般認爲需要活菌才能成功地預防性治療巨噬細胞存活性諾 卡菌形放線菌，因爲只有這些活菌具有抵達巨噬細胞及足 夠地模擬野生型細菌以刺激適當免疫反應之能力。事實上 ，爲了要治療結核病，根據與結核分枝桿菌關係非常密切 之牛分枝桿菌的活菌疫苗（BCG，卡介苗）係可獲得的。然 -8- 201036631 而，該保護效果並不起眼。就諾卡菌科諸如馬紅球菌及獅 諾卡菌而言，目前並無可購得之疫苗。就假結核棒狀桿菌 而言，已嘗試利用自體疫苗進行控制，但是結果成敗參半 (RUM A Guidelines, National Office of Animal health, Hertfordshire, United Kingdom, 2006)。 很明顯的有供動物防備由巨噬細胞存活性諾卡菌形放 線菌感染所引起之疾病的適當預防性治療之需求。在此意 〇 義上，治療係指足夠地刺激標靶動物之免疫系統以至少減 少野生型微生物挑戰之負面效應。該目標在於導致對疾病 之防備，也就是該疾病係經預防，或至少該動物之感染程 度或疾病之臨床症狀係經降低，因此疾病之嚴重性亦經降 低。巨噬細胞存活性諾卡菌形放線菌已採取相同策略以在 宿主體內存活之事實，帶來預防性治療防備這些細菌感染 之共同策略的槪念。 在這方面，注意到已有文獻描述膽固醇代謝對諾卡菌 〇 形放線菌於巨噬細胞之存活所扮演之關鍵角色，且可能是 重要的毒性因子（Proceedings of the National Academy of Science, February 6，2007，vol. 104, no. 6，pp 1947-1952) 。該文獻亦建議此代謝提供對抗致病菌株之新穎治療劑（ 也就是用於感染已發生後之治療的藥物）的合理標靶。事 實上，就事後應用而言，有其他證據支持所有巨噬細胞存 活性諾卡菌形放線菌已建立之事實，即膽固醇代謝對於細 菌在宿主巨噬細胞中之存活及持續存在有其作用。舉例來 說，從「伺機性細胞內細菌及免疫性」（“Opportunistic 201036631

Intracellular Bacteria and Immunity’’，by Lois J. Paradise et al (eds.), New York, 1 9 99)之第1 1章可得知，由多種諾 卡菌形放線菌所導致之感染的臨床症狀之間有高度類似性 ，及膽固醇氧化酶被認爲是毒性因子之酶成份。 Veterinary Microbiology, Volume 56， Issue 3-4, June 1 997，269-276顯示，假結核棒狀桿菌與馬紅球菌一起涉 及膽固醇氧化酶過程。 因此，乍看之下利用對膽固醇代謝在這些細菌於巨噬 細胞中之存活所扮演之關鍵角色的認知，以發展供動物防 備巨噬綑胞存活性諾卡菌形放線菌感染所引起的疾病之醫 藥組成物（該組成物亦可被稱爲疫苗）似乎是誘人的。然而 ，一旦了解上述與藥物有關之PN AS文獻（2007文獻）所作 出之建議及因此藉由干擾該等細菌之膽固醇代謝以完全殺 死彼等爲目標，採取該相同策略似乎並不適合活菌疫苗： 若試著藉由阻斷細菌於複製必要位置之存活而使其減毒， 該細菌將無法在宿主動物體內複製及持續存在。事實上， 以藥物治療而言此爲理想狀況。然而，就活菌疫苗而言， 若完全阻斷細菌之存活，預期將類似包含死菌之疫苗。該 等疫苗已經證實無法被成功地用於治療巨噬細胞存活性諾 卡菌形放線菌。但是仍然進行嘗試以評估膽固醇代謝有所 缺陷之活菌於供動物防備野生型致病性諾卡菌形放線菌之 挑戰的醫藥組成物上之用途。該嘗試之實例係以野生型馬 紅球菌103 +菌株之膽固醇氧化酶（ChoE)突變爲基礎之活 菌疫苗（P r e s c 〇 11 i η V e t e r i n a r y M i c r o b i ο 1 〇 g y 1 1 8，2 0 0 6，p p -10- 201036631 240-24 6)。此嘗試並不成功。然而，不是因爲如一般根據 前述 PNAS 文獻之技術揭示（PNAS February 6, 2007，vol. 104，no. 6，1 947- 1 95 2)所預期之未引發保護作用，而是因 爲該突變菌株之毒性仍過高。該突變株仍能以可與野生型 馬紅球菌相比之量在巨噬細胞中存活及複製。同時，此膽 '固醇缺陷突變株之抗原負載似乎可與野生型有機物之抗原 負載比較。因此，該突變株仍能引發疾病。事實上，在同 ¢) 時亦已確立的是，完全無法攝取膽固醇，表示完整的膽固 :醇代謝係經阻斷（至少當膽固醇被用來作爲起始化合物時） 之突變馬紅球菌活菌（由凡德蓋茲等人（Van der Geize et al.)於2008年7月13-16曰於愛丁堡所舉辦之第4屆馬紅 球菌哈福梅爾硏討會所發表之固醇攝取透酶突變; 及 Van der Geize et a 1.: “A novel method to generate unmarked gene deletions in the intracellular pathogen Rhodococcus equi using 5 - f 1 u o r o c y t o s i n e conditional lethality” in Nucleic Acids Research 2008; doi: 10.1093/nar/gkn811，之後亦稱爲 “Van der Geize et al.， 2008”）仍能存活且持續存在於巨職細胞中（Van der Geize . et al·，2008) ’因此毒性仍然過高。爲了使馬紅球菌活菌 減毒’似乎需要具有除膽固醇代謝以外之額外突變效果 (Prescott: Veterinary Microbiology 1 2 5, 2007, 1 00- 1 1 0)° 根據這些結果所得到的結論是，膽固醇代謝本身並不是重 要的毒性因子，無法被用於使這些細菌足夠地減毒。在膽 固醇代謝上具有突變之細菌明顯地與野生型生物體具有相 -11 - 201036631 同或至少可比較之抗原負載，因此雖然能提供適當之保護 作用（也就是如果經該突變細菌之挑戰後該個體動物存活） ，但毒性仍過高以致無法被用於醫藥組成物。因此，以預 防性治療之醫藥組成物爲目標且該組成物包含藉由使涉及 膽固醇代謝之基因去活化而減毒之活菌被認爲是行不通的 【發明內容】 然而，申請人意外發現爲了供動物防備由巨噬細胞存 活性諾卡菌形放線菌感染所引起的疾病，可利用包含諾卡 菌形放線菌物種（通常爲與感染細菌相同之物種或可選擇 的關係非常密切之物種，因此具有許多共同的T細胞表位 諸如結核分枝桿菌與牛分枝桿菌）之活菌及用於乘載該等 細菌之藥學上可接受之載劑的醫藥組成物，該活菌係經藉 由使編碼涉及甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解之蛋白質的基 因去活化而減毒。 在此意義上「減毒」係指無法誘發整套之疾病徵候， 該整套之疾病徵候通常與該減毒細菌之毒性（通常指野生 型）致病性相對菌有關。在本發明之意義上「去活化」係 指基因例如當爲操縱子（意即以功能程度實際表現該蛋白 質所需之該組基因）之部分時被自基因組完全移除或改變（ 藉由任何已知或甚至尙未被設計之技術；見例如 Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A.J. Nair, INFINITY SCIENCE PRESS LLC, 2008, chapter -12- 201036631 13 “Genetic Techniques”，pp 476-496 and chapter 15 “Recombinant DNA Technology”，PP 563-612)以使其不再 編碼該對應之野生型蛋白質，或無法被接近以供完全轉錄 ，或任何其他基因組之改變以使該野生型蛋白質將不由減 毒細菌於活體內製造，至少以相較於其中該基因（或操縱 子若適用）係呈適於支持甲基六氫茚滿二酮丙酸酯正常代 謝之型式的情況不適於支持正常分解代謝之量。在本發明 0 之意義上「編碼蛋白質」係指基因（例如當爲操縱子之部 分）直接編碼蛋白質或該蛋白質之次單位（一起形成酶催化 活性蛋白質之多個次單位），或編碼一或多個直接或經多 個步驟轉化成該蛋白質或彼之次單位（一起形成酶催化活 性蛋白質之多個次單位）之中間物。「藥學上可接受之載 劑」可爲例如藉由除其他外無菌製造之該標靶動物所生理 相容或可接受之任何溶劑、分散基質、包覆劑、抗菌劑、 抗真菌劑、等張劑、吸收延遲劑及該類似物。該搭載基質 Q 之一些實例爲水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、細菌培養液、 葡萄糖、甘油、乙醇及該類似物以及彼等之組合。它們可 依照投予之意圖模式以液體、半固體及固體劑量型式提供 。如一般所知的’搭載基質之存在不是疫苗效能所必須， 但是其可能顯著地簡化該抗原之劑量及投予。除了載劑及 抗原之外’該醫藥組成物可能包含其他物質諸如佐劑、安 定劑、稠度調整劑或依照該組成物之意圖用途或所需性質 而添加之其他成分。 在本發明之醫藥組成物中有活菌存在，該細菌係經突 -13- 201036631 變以使編碼涉及甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解之蛋白質的 基因去活化。眾所周知的是，甲基六氫茚滿二酮丙酸酯（ 亦稱爲HIP或3aa-H-4o:(3’-丙酸）-7α/9-甲基六氫-1，5-茚滿二酮）及5-羥-甲基六氫茚酮丙酸酯（亦稱爲HIL或3a a -H-40： (3’-丙酸）_5α -羥·7α/5 -甲基六氫-1-茚酮-(5 -內酯 )係於放線菌降解膽固醇之期間形成，該放線菌包括巨噬 細胞存活性諾卡菌形放線菌。近來在屬於棒狀桿菌亞目之 細菌物種中，編碼涉及降解HIP之轉移酶α及石次單位的 操縱子（稱爲ipdAB :節滿二酮（indanedione)丙酸醋 (proprionate)降解（degradiation) Alfa + Beta)已被鑑別（見 2008年8月19日提出申請之國際專利共同申請案 PCT/EP2 008/060844 >基於2007年8月21日提出申請之 美國優先權申請案）。該已知之轉移酶基因剔除突變株無 法再降解HIP及HIL (見上述專利申請案之圖3)，也無法 依賴HIP、HIL或4-雄甾烯-3,17-二酮而生長。在任何情 況中，「涉及HIP降解」係指基因剔除突變株無法再依賴 HIP爲唯一之碳及能量來源以生長，或至少無法依賴非突 變細菌可獲得之量的HIP以生長。目前不清楚轉移酶本身 是否分解代謝HIP降解或HIP降解所依賴之反應是否被 催化。不過，HIP降解發生於膽固醇代謝之相對晚期，且 是膽固醇降解途徑中非常專一性之步驟。根據公開可得之 有關膽固醇代謝突變之知識（上述之Prescott參考文獻）， 可預期此突變將導致雖然提供保護作用但毒性仍過高之活 菌。然而令申請人意外的是’該突變株似乎經適當減毒， -14- 201036631 因爲該突變株在巨噬細胞內之存活能力顯著降低。涉及 HIP降解之基因對巨噬細胞內之存活爲何如此重要的原因 仍不清楚。此甚至似乎與習知技藝的結果矛盾，習知技藝 顯示即使完全阻斷膽固醇代謝，減毒效果仍不佳，因爲對 諾卡菌形放線菌於巨噬細胞存活之能力很明顯的沒有影響 。因此，相當意外地發現影響膽固醇分解代謝途徑中之次 要步驟的本突變嚴重阻礙致病性諾卡菌形放線菌於巨噬細 Q 胞內之存活能力。特定地，已經發現該突變活菌仍能進入 巨噬細胞且以非常低的量持續存在其中（因此確保保護性 免疫反應之刺激），此似乎顯著降低彼等之毒性，因此使 彼等可接受地用於預防性治療。 在一實施態樣中，一操縱子中之多個基因係經去活化 。藉由使多個基因去活化，細菌改變成野生型（類似）表現 型之機會將降低。特定地，基因ipdA及ipdB係經去活化 。藉由使這些基因去活化，可提供有效且安全之減毒。在 〇 較佳之實施態樣中，該減毒係藉由經未經標記之基因的刪 除作用刪除至少一個基因而實現。未經標記之突變的優點 在於，其允許在相同菌株中重複導入突變。外來DNA (載 體DNA)在導入突變之過程中被移除。爲了導入第二突變 所新導入之載體DNA因此無法（藉由載體DNA間之同源 重組）整合於先前突變之位置。若載體DNA仍存在於染色 體中一定會發生整合，且將導致大量之僞陽性整合。該系 統使能夠使用單獨之抗生素基因以導入無限數量之突變° 未經標記之突變亦允許於工業上之簡易用途，因爲缺乏異 -15- 201036631 質性DNA允許簡易丟棄醱酵液。藉由基因刪除使基因去 活化能建構穩定、非回復之突變。特別是小型基因（< 5 〇 〇 鹼基對）相較於藉由單一重組整合之基因中斷可更容易地 藉由基因刪除而被去活化。基因刪除突變形成亦可被應用 於使源自基因組之數個基因之群簇去活化。該基因刪除突 變形成策略亦可被應用於基因取代（例如將野生型改變成 突變基因）。 在一實施態樣中，該細菌屬於諾卡菌科 (Nocardiaceae)或分枝桿菌科（Mycobacteriaceae)。較佳的 是，該細菌屬於紅球菌屬（Rhodococcus)、諾卡菌屬 (Nocardia)或分枝桿菌屬（Mycobacterium)且特定地屬於馬 紅球菌egw/)、鯽諾卡菌ier/o/ae) 、結核分枝桿菌（iMftercw/os/s)、潰瘍分枝 桿菌（A// ulcer ans)、牛分枝桿菌 (My cobacterium 6 ο v / s)或禽分枝桿菌副結核亞種 (αν/ww jparaiwAercw/osi’·?)。就這些物種而 言，到目前爲止無法購得適當疫苗。本發明允許提供可被 用來作爲疫苗之醫藥組成物’以防備這些細菌及因此減輕 彼等在動物所造成之對應疾病。 在一實施態樣中’該醫藥組成物係呈適合供口服投予 之型式。除了此爲非常方便之投藥方式之外’特別變得明 顯的是此投予方式係安全的。非經腸投予可能導致膿瘍。 較佳地’該活菌係以每劑介於1 x 1 0 4至1 x 1 0 1 G C F U之濃 度存在。 -16- 201036631 本發明亦關於源自寄存於法國巴黎巴斯德硏究中心之 國立微生物培養保存中心之編號 CNCM 1-4108或 CNCM I - 4 1 0 9的菌株之馬紅球菌及屬於此菌株之細菌。 本發明亦關於一種屬於諾卡菌形放線菌族群之活菌於 製造供動物防備由對應野生型細菌感染所引起的疾病之醫 藥組成物上之用途，該諾卡菌形放線菌具有在該動物之巨 噬細胞內存活之能力，該活菌係經藉由使編碼涉及甲基六 0 氫茚滿二酮丙酸酯降解之蛋白質的基因去活化而減毒。 本發明亦關於一種治療動物以供其防備由屬於諾卡菌 形放線菌族群之細菌感染所引起的疾病之方法，該諾卡菌 形放線菌具有在該動物之巨噬細胞內存活之能力，該方法 包含對動物投予包含諾卡菌形放線菌物種之活菌的醫藥組 成物，該等活菌係經藉由使編碼涉及甲基六氫茚滿二酮丙 酸酯降解之蛋白質的基因去活化而減毒。 〇 【實施方式】 本發明將利用下列實施例進一步說明，該些實施例描 述本發明之特定實施態樣，該些實施態樣分成三個部分： A部分：菌株之鑑別及建構 B部分：作爲活體內減毒模型之巨噬細胞存活性 C部分：突變細菌於防備野生型感染上之效能 A部分：菌株之鑑別及建構 A 1培養基及生長條件 -17- 201036631 馬紅球菌菌株係生長於30°C (200rpm)之由細菌用胰化 蛋白（Bacto-Tryptone)(BD)、酵母菌萃取物（BD)及 1% NaCl (Merck)所組成之路里亞-伯塔尼（LB)培養基或礦物醋 酸培養基中。包皮垢分枝桿菌me2 155 (Snapper et al.， 1 990， Mol. Microbiol. 4:191 1-1919)係生長於 3 7 °C (200rpm)之添加 0.05% Tween80之 BBL胰酶大豆肉湯 (TSB; BD)中。礦物醋酸培養基（MM-Ac)包含 K2HP〇4 (4.65 g/1)、NaH2P04 · H20 (1.5 g/1)、醋酸鈉（2 g/1)、 NH4C1 (3 g/1)、MgS04· 7H20 (1 g/1)、噻胺（40 mg/1，過 濾、滅菌；Sigma)及維希尼克（Vishniac)原液（1 ml/1)。維希 尼克（Vishniac)原液係如下述製備（自Vishniac and Santer, 1 95 7，Rev. 21:195-213 修飾）：EDTA (10 g/1)及 ZnS04 . 7H20 (4_4 g/1)係溶解於蒸餾水（使用2M KOH以達pH 8) 。接著，於 pH 6 按順序添加 CaCl2. 2H20 (1.47 g/1)、 MnCl2 · 7H20 (1 g/1) 、 FeS04 . 7H20 (1 g/1)、 (NH4)6Mo7024 · 4H20 (0.22 g/1)、CuS04 · 5H20 (0.3 1 5 g/1)及 C〇Cl2. 6H20 (0.3 2 g/1)，最後儲存於 pH 4。爲了 生長於固態培養基上，添加細菌用洋菜（1 5 g/1; BD)。5-氟胞嘧啶（Sigma-Aldrich)原液（10 mg/ml)係於蒸餾水中製 備，藉由加熱至5 0 °C以溶解，經過濾滅菌及添加於經高 壓滅菌之培養基。 鯽諾卡菌INS436菌株係例行生長於26°C(2〇〇rpm)之 添力口 Tween80 (0.05 %)之尤剛氏肉湯（Eugon Broth)(BD)中 。爲了生長於固態培養基上，添加細菌用洋菜（1 5 g/i; -18- 201036631 BD)。蔗糖（2%)係添加於該洋菜培養基以進行依賴性 蔗糖篩選。

A2鑑別馬紅球菌103+菌株中之ipdA、ipdB及fadE30與 鯽諾卡菌INS436中之ipdAB 如上所示，紅球菌之β以及基因被發現涉及甲 基六氫茚滿二酮丙酸酯（HIP; 3aa-H-4a(3’-丙酸）-7〇: 0 石-甲基六氫-1，5-茚滿二酮）及5-羥-甲基六氫茚酮丙酸酯 (HIL ; 3aa -Η-4α (3，-丙酸）-5α -羥-7a召-甲基六氫-1-茚 酮-(5 -內酯）之降解。在基因組資料庫中，紅平紅球菌（Λ. ^少（心〇；7〇/4)8(31菌株之1口(1八及1卩(16的蛋白質序列之生 物資訊分析顯示，編碼IpdA及IpdB之基因及彼等之明顯 操縱子組織係保留於馬紅球菌1〇3 +菌株之基因組中（得自 J.F. Prescott， Ontario， Canada 之野生型菌株；見 Veterinary Microbiology 118 (2006) 240-246)。馬紅球菌 Ο 103 +基因組序列已由英國劍橋欣克斯頓桑格（Sanger)硏究 院之馬紅球菌定序小組測定（基因組發表爲103S) 。基因組分析另外顯示i?. equi \Q3+包含ipdA及ipdB之 額外平行同源基因，分別稱爲及。這些基因 係位於膽固醇分解代謝基因簇之外。IpdA、IpdB、IpdA2 及IpdB2之胺基酸序列分別以隨附之序列識別號SEQ ID NO 1、2、3及4表示。具有這些平行同源基因及一些其 他放線菌垂直同源基因之馬紅球菌1 0 3 +的I p d A及I p d B 蛋白之胺基酸序列特性係列於表6。此表提供在諾卡囷形 -19- 201036631 放線菌之其他基因組所識別之基因綜覽，該些基因編碼馬 紅球菌103 +之IpdA及IpdB之垂直同源物。在本發明中 ，這些及其他垂直同源物係稱爲IpdA及IpdB。蛋白質一 致性顯示全長胺基酸序列與馬紅球菌103S之IpdA及 IpdB的一致性百分比。放線菌基因組序列係得自生物技 術資訊國家中心（NCBI)之微生物基因組的基因組BLAST 伺服器。馬紅球菌1 03 +序列資料係由桑格硏究院之馬紅 球菌定序小組產生。103 +菌株之基因組（稱爲103S)被用於 這些識別目的。馬紅球菌之實際工作如以下所例證係以馬 紅球菌RE 1菌株（自罹患馬紅球菌感染所引起肉芽腫性肺 炎之幼馬分離）進行。 涉及甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解之第二個基因係 /以们0。ΖΙ/αΜΜ突變株對於依賴HIL及HIP之生長受 到嚴重阻礙，在培養24小時後幾乎顯示無生長。馬紅球 菌之 基因係藉由在可得自桑格硏究院 (http://www.sanger.ac.uk)之 equi 103 +基因組上所進行 之蛋白質序列類似性搜尋識別。約斯提紅球菌 (及/zoi/ococcws RHA1 菌株之 FadE30 之註解蛋白質 序列（Ro4596, Genbank登錄號ABG96382)係用來作爲蛋白 質序列模板（McLeod et al·，2006，in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1 0 3:1 5 5 82- 1 5 5 8 7; and Van der Geize et al., 2007, iη Proc, Nat 1 · Acad Sc i. U _ S·A . 1 04:1 947 - 1 95 2)。 以Ro 0 4 5 9 6進行資料庫類似性搜尋顯示馬紅球菌1 〇 3 S之 基因，該基因編碼展示與R〇〇4596具有73 %胺基酸序列一 -20- 201036631 致性之蛋白質。此蛋白質被註解爲馬紅球菌1 0 3 S之 FadE30 (SEQ ID NO 43) ’彼之對應基因被稱爲/απΜ。 在其他放線菌中編碼FadE30之垂直同源基因可以類似之 方式被識別。表8列出該些基因之選。 鯽諾卡菌之心5基因組座利用以放線菌4心5基因 座之高度保留性核苷酸序列所發展之寡核苷酸引子，分3 個部份進行PCR放大。這些保留性區域係藉由數種已知 〇 之放線菌基因序列之核苷酸序列排比加以識別。皮 疽諾卡菌之區域的核苷酸基因組序列心 n/a05 090)(DDBJ登錄號ΑΡ00661 8)係用來作爲發展寡核苷 酸PCR引子之初始模板。所使用之引子寡核苷酸序列係 列於表5。獅諾卡菌INS43 6之染色體DNA係用來作爲 PCR之模板。獅諾卡菌之0心5基因係利用引子ipdA-actino-F 及 ipdB-actino-R 放大（PCR 22)，之上游區 域係利用引子 ipd-actino-F2 及 ipdA-actino-R 放大（PCR 〇 23)，及下游區域係利用ipdB-actino-F及ipd-actino-R放 大（PCR 21)。PCR產物被選殖於pGEM-T選殖載體，並測 定該插入物之核苷酸序列。接著根據所獲得之DNA序列 發展不同的引子對，並用於再選殖及再定序該基因座 。此導致獅諾卡菌々以5基因座之涵蓋4,139鹼基對之完 整核苷酸序列。該經定序之DNA片段包含獅諾卡菌之 及基因及彼等之鄰近基因。獅諾卡菌INS436 之IpdA及IpdB之推論蛋白質序列分別顯示於SEQ ID NO 58 及 SEQ ID NO 59。 -21 - 201036631 A3選殖、PCR及基因組DNA分離 大腸桿菌（五5c/zer/c/zia co/ί) DH5〇：係用來作爲所有選 殖程序之宿主。限制酶係得自法瑪塔斯公司（F e r m e n t a s GmbH)。細胞培養之染色體DNA係根據製造商之說明使 用GenElute細菌基因組DNA套組（西格瑪奧德里奇公司 (Sigma-Aldrich))加以分離。 PCR係於由Tris-HCl (10 mM，pH 8)、1倍標準聚合 酶緩衝液、dNTP (0.2 mM)、DMSO (2%)、PCR 引子（各 10 ng/ β 1 1見表5)及高逼真DNA聚合酶（Fermentas)或Pwo DNA聚合酶（羅氏應用科學公司（Roche Applied Science)) 所組成之反應混合物（25 v 1)中進行。以菌落PCR而言， 細胞物質係與100/zl之氯仿及100"1之10 mM Tris-HCl pH 8經劇烈渦流混合及離心（2分鐘，1 4,000 x g)。上層 水相之樣本（1 // 1)接著被用來作爲PCR之模板。標準PCR 包括5分鐘之95°CDNA裂解步驟，接著爲30個循環之 4 5秒9 5 °C變性、4 5秒6 0 °C黏合及1至3分鐘7 2 °C延長 。該使用之延長時間根據預期之PCR增幅子（amplicon)的 長度而定，通常1 kb需要1.5分鐘。 A 4 馬紅球菌、包皮垢分枝桿菌（M. smegmatis)及鯽諾卡 菌之電轉形 馬紅球菌菌株之細胞係藉由基本上如描述之電穿孔進 行轉形（Van der Geize et al.，於上述已接受之NAR文獻 ;Navas et a 1., 200 1，J . Bacteriol. 1 8 3 : 4 7 9 6 - 4 8 0 5 )。簡言 -22- 201036631 之，細胞培養係於5 0 m 1 L B中於3 0 °C生長直到〇 D 6。〇達 0.8-1.0。該細胞經離心沉澱（20分鐘4,500 x g)及以10% 冰甘油清洗二次。使該沉澱細胞重懸於0.5至1 mi冰冷 10%甘油中，並分成200微升等分。 包皮垢分枝桿菌me2 155之細胞係藉由基本上如描述 之電穿孔進行轉形（Jacobs et al.，1991, Methods Enzymol. 204:53 7-5 5 5)。簡言之，細胞培養（250 ml)係於 37°C之 0 丁38培養基+0.05%丁〜“1180中生長直到006。。達〇.8，置 於冰上1.5個小時，經離心（10分鐘5,000 X g)以沉澱該細 胞。以蒸餾水清洗該細胞沉澱二次，重懸於終體積1ml 之10%甘油中，並分成200//1等分。 經 MilliQ 溶析之質體 DNA (5 至 1 0 y 1 ; GenE 1 ute Plasmid Miniprep Kit，Sigma-Aldrich)被添加於 2 暈米間 隙電穿孔管中之200//1細胞。電穿孔係以12.5 kV/cm、 1000Ω及25// F之單一脈衝進行。輕輕混合電穿孔細胞與 Ο 1毫升 LB培養基（馬紅球菌）或1毫升 TSB + 0.05% Tween80 (包皮垢分枝桿菌），允許於37°C及2〇〇 rpm中回 收2小時（馬紅球菌）或5小時（包皮垢分枝桿菌）°該回收 細胞之等分（2 0 0微升）被接種於選擇性洋菜培養基上。馬 紅球菌轉形株係利用包含阿泊拉黴素（aPramycin)(50 # g/ml)之LB洋菜篩選，在經30°C培養2至3天後出現。 包皮垢分枝桿菌轉形株係利用包含卡那黴素 (kanamycin)(10；a g/ml)之 TSB + 0.05% Tween80 洋采言币运 ，在經3 7。(：培養4至5天後出現。 -23- 201036631 以獅諾卡菌而言，INS43 6菌株之預培養（20毫升）係 生長於26〇C(200rpm)之尤剛氏肉湯+0.05% Tween80中5 天（OD6Q() = 6)，且被用於接種100毫升之新鮮尤剛氏肉湯 + 0.05% Tween80培養基（1 : 1 00)。該初始培養係於26°C隔 夜生長20小時直到OD6QG = l .3。 該細胞於4°C離心沉澱（20分鐘4000g) ’並以50毫升 冰冷1 0%甘油清洗二次。使該沉澱細胞重懸於5〇〇微升 1 0 %甘油中，分成2 0 0微升等分後立即用於電轉形。經 MilliQ 溶析之質體 DNA (5 至 1 〇 # 1 ; GenElute Plasmid Miniprep Kit，Sigma-Aldrich)被添加於2毫米間隙電穿孔 管中之200 " 1細胞，混合並置於冰上1分鐘。電穿孔係 以1 _ 7 5 k V/cm、2 0 0 Ω及5 0仁F之單一脈衝進行（脈衝時間 約9.3毫秒）。輕輕混合電穿孔細胞與1毫升添加〇 . 〇 5 % Tween80之尤剛氏肉湯培養基，允許於26°C及220 rpm中 回收3.5小時。該回收細胞之50微升及1〇〇微升等分被 接種於添加0.05% Tween80及卡那黴素（20// g/ml)之選擇 性尤剛氏洋菜培養基上。轉形株在經26 °C培養7天後出 現。 A5利用5-氟胞嘧啶（5-FC)選擇於馬紅球菌中未經標記之 基因刪除 馬紅球菌之未經標記之基因刪除突變株基本上如所述 製備（Van der Geize et al.，2008)。將自野生型或突變細胞 之電穿孔所獲得之馬紅球菌轉形株劃線培養於添加阿泊拉 -24- 201036631 黴素之LB洋菜培養基上以確認阿泊拉黴素抗性（ApraR)。 每次轉形中之4個ApraR轉形株係於30°C及200 rpm於 25毫升LB培養基中隔夜生長（20至24小時），並以100 微升等分之101至1〇3倍MM-Ac培養基稀釋液接種於添 力口 5-FC (100//g/ml)之MM-Ac洋菜培養板上。於30°C培 養3天後出現之5 -FC抗性菌落被重複劃線培養於LB洋 菜板及添加阿泊拉黴素（50"g/ml)之LB洋菜板上以篩選 0 具阿泊拉黴素敏感性（Apra5：^ 5-FC抗性（5-FCR)之菌落。 藉由使用放大基因刪除之基因座的引子（表5)進行菌落 PCR，以測定Apras/5-FCR菌落是否存在該所欲之基因刪 除。基因組DNA係自潛在基因刪除突變株分離，且利用 擴增該或基因座之引子被用來確認該基因 刪除，以及利用表5所述之引子確認該等基因座之上游及 下游區域。

〇 A6建構質體以基因刪除馬紅球菌中之ipdAB及ipdAB2 用於產製馬紅球菌RE 1中操縱子之未經標記 之基因刪除的質體pSelAct-ipdl係如下述建構。基 因之上游（1,368 bp;引子 ipdABequiUP-F 及 ipdABequiUP-R)及下游（1,396 bp;引子 ipdABequiDOWN-F及ipdABequiDOWN-R)側翼區係藉由PCR放大（表5， PCR1及PCR2)。將所獲得之增幅子與經五c〇RV消化之 pBlueSCript(II)KS連接，使分別成爲上游及下游區域之質 體 pEquil4 及 pEquil6。使 pEquil4 之 1.4 kb 5>eI/£coRV -25- 201036631 片段與經印el/fcoRV消化之pEquil6連接以產生pEquil8 。包含以5基因刪除及彼之側翼區的p E q u i 1 8之2.9 k b 片段係經克倫諾（Klenow)片段處理並與經 5mal 消化之 pSelAct 自殺載體連接（Van der Geize et al.， 2008)。該形成之質體被命名爲pSelAct-ipdl以用於建構 /尸心5基因刪除突變株△ ipdAB (亦稱爲RG1 34 1 ) 。此突變株係以編號CNCM 1-4108寄存於法國巴黎巴斯 德硏究中心之國立微生物培養保存中心。 雙基因刪除突變株Λ· ΔίράΑΒΔίράΑΒ】（亦稱 爲RG283 7)係使用質體pSelAct-A ipdAB2以藉由未經標 記之基因刪除及.egw/ △ ipdAB突變株中之操縱 子而產製。質體 pSelAct- △ ipdAB2係如下述建構。 ipdAB2 之上游(1,444 bp ；弓 1 子 ipdAB2equiUP-F 及 ipdAB2equiUP-R)及 下 游（1，3 87 bp ； 引子 ipdAB2equiDO WN-F 及 i p d A B 2 e q u i D Ο WN - R)區域係藉由 使用基因組DNA爲模板之 PCR放大（表 5，PCR6及 PCR7)。該等增幅子係與經5则I消化之pSelAct連接’以 分別形成質體 pSelAct-ipdAB2equiUP 及 pSelAct-ipdAB2equiDOWN。在二個質體經5g/11/以e I消化後，使 pSelAct-ipdAB2equiDOWN 之 1,381 bp 片段與 pSelAct-ipdAB2equiUP連接，以產生用於建構5 2基因刪除 之pSelAct-AipdAB2。該形成之突變株及.Mwz· AipdAB △ ipdAB2係以編號CNCM 1-4 1 09寄存於法國巴黎巴斯德 硏究中心之國立微生物培養保存中心。 -26- 201036631

A7建構質體以基因刪除包皮垢分枝桿菌me2 155中之 ipdAB 用於未經標記之基因刪除包皮垢分枝桿菌1 5 5中 之基因的質體pK18-ipdABsmeg係如下述建構。 基因之上游（ 1,502 bp;引子 ipdABsmegUP-F 及 ipdABsmegUP-R)及下游（1,431 bp ; 弓1 子 ipdABsmegDOWN-F 及 ipdABsmegDOWN-R)側翼區係藉由 0 使用包皮垢分枝桿菌me2 155之基因組DNA作爲模板之 PCR放大（表5，PCR12及PCR13)。將所獲得之增幅子與 經 Swal 消化之 pK18mobsacB 連接（Schafer et al.，1 994, Gene 145:69-73)，以分別形成 pK18-ipdABsmegUP 及 pKl 8-ipdABsmegDOWN。接著，得自經 BamHi/Spel 消化 之 pK 1 8-ipdABsmegUP 的 1 .5 kb D N A 片段係與經 BamUl/Spel線性化之 pK 1 8 - i p d A B s m e gU P連接，導致建 構用於基因刪除之pK18-ipdABsmeg。 〇 A8建構質體以基因刪除馬紅球菌中之fadE30 用於產製未經標記之馬紅球菌RE 1 0基因刪除 株的質體pSelAct-fadE30係如下述建構。之上游 (1，511 bp;引子 fadE30equiUP-F 及 fadE30equiUP-R)及下 游（1，449 bp ； 引子 fadE30equiDOWN-F 及 fadE30equiD〇WN-R)側翼基因組區域係藉由使用高逼真 DNA聚合酶（Fermentas GmbH)之標準 PCR放大（表 5， PCR15及PCR16)。將所獲得之增幅子與pGEM-T選殖載 -27- 201036631 體（普洛麥格公司（Promega Benelux))連接，以形成 pGEMT-fadE30UP 及 pGEMT-fadE30DOWN 。 1.4 kb 5cMl/Sg/II DNA 片段係自 pGEMT-fadE30DOWN 剪切並與 經 ^cwI/5g/II線性化之 pGEMT-fadE30UP連接以形成 pGEMT-fadE30。爲 了建構 p S e 1A c t - f adE 3 0，pGEMT-fadE30係經TVcoI及5cmI消化並由克倫諾（Klenow)片段處 理。攜帶基因刪除之2.9 kb鈍端DNA片段係與經 Smal 消化之 pSelAct 連接（van der Geize et al·，2008)。該 形成之質體被命名爲pSelAct-fadE30且被用於建構突變株 R. e qui AfadESO0

A9建構質體以基因刪除鲫諾卡菌INS436中之ipdAB 用於未經標記之基因刪除獅諾卡菌INS43 6中之 ipdAB基因的質體pKl 8ipdABNser係如下述建構。 基因之上游（1,487 bp ;引子 ipdABNserUP-F 及 ipdABNserUP-R ； PCR 24)及下游（ 1,049 bp ；弓| 子 ipd ABNserDOWN-F 及 i p d A B N s e r D Ο WN - R ; P C R 25)側翼 區係藉由使用獅諾卡菌INS436之基因組DNA作爲DNA 模板之PCR放大（表5)。將所獲得之增幅子與經消 化之 pKl 8mobsacB 連接(Schafer e t al., 1994， Gene 1 45:69-73)，以分別形成 pK18-ipdABNserUP 及 pK18-ipdABNserDOWN。接著，得自經 《Swal/Pwl 消化之 pK18-ipdABNserDOWN 的 1 .07 kb DNA 片段係與已經 Swal/尸Wl 線性化之pK18-ipdABNserUP連接，導致建構用於 -28- 201036631 基因刪除之質體pK18-ipdABNser。 A1 0建構馬紅球菌△ ipdAB及馬紅球菌△ ipdAB △ ipdAB2 突變株 馬紅球菌之未經標記之 (RG1341)及 ipdABipdAB2 (RG2 8 3 7)基因刪除突變株係利用爲馬紅球菌 所發展之5 -氟胞嘧啶反向篩選之二步驟同源性基因重組 策略建構（Van der Geize et al.，2008)。爲了建構馬紅球菌 Δ ipdAB突變株RG1341，將非複製性質體pSelAct-ipdl 藉由電轉形移動至馬紅球菌RE1株。由質體pSelAct-ipdl 與該RE 1基因組間之同源性基因重組所形成之4個ApraR 轉形株接著進行5-FC篩選以選擇導致基因刪除之第二罕 見同源重組事件之發生。使18個隨機挑選之Apras/5FCR 菌落進行菌落PCR，有3個FCR/Apras菌落產生該預期大 小之增幅子（296 bp，表5，PCR5)。基因組DNA係自該3 Q 個」4以5突變株分離，並進行基因座及彼之上下 游側翼區之PCR分析（表5，PCR3及PCR4)。此分析證實 在3個菌株中有2株存在真正之0以5基因刪除，且未顯 示在基因座之異常基因體重組。作爲毒性質體標記 之vapj的存在係由PCR證實（表5，PCR11)。選出1個 5突變株，將其命名爲馬紅球菌RG 1 3 4 1並用於後續 工作。雙基因刪除之突變株RG2 8 3 7係利用基本上如用於 分離單突變株所描述之質體pSelAct- Δ ipdAB2以 自 RG1341菌株建構。以 pSelAct-AipdAB2電穿孔 -29- 201036631 RG 1 3 4 1菌株細胞所得到之4個ApraR轉形株係進行5 -FC 篩選以選擇Apras/5-FCR菌落。對18個八？^3/5邛(：11菌落 之後續P C R分析確認2個菌落具有」5 2基因刪除’ 由利用經發展以放大該操縱子之寡核苷酸所得到 之123 bp增幅子證實（表5，PCR10)。以PCR進一步分析 該0心52基因座之上游及下游區域證實基因刪除 之存在，且顯示並無異常之基因體重組（表5，PCR8及 PCR9)。同樣的，να;?/毒性基因之存在係由PCR證實（表 5，PCR1 1)。選出1個b以5 J 以52雙基因刪除突變 株RG2 8 3 7以用於後續工作。

Al 1建構包皮垢分枝桿菌△ ipdAB突變株 包皮垢分枝桿菌me2 1 5 5之未經標記之基因刪 除突變株係如下述利用反向筛選系統建構（Pelicic et al., 1 996, Mol. Microbiol. 20:9 1 9-92 5; Van der Geize et al.，2001，FEMS Microbiol Lett. 205:197-202)。爲 了建構 包皮垢分枝桿菌m c2 1 5 5之zl 5突變株’將非複製性 質體pK18-ipdABsmeg藉由電轉形移動至包皮垢分枝桿菌 。得到數個轉形株。1個卡那黴素抗性轉形株係於包含 0.05% Tween80之TSB培養基中於37°C非選擇性地生長2 天’接著被接種至包含2%蔗糖之TSB洋菜板以藉由 反向篩選作用篩選卡那黴素敏感性（Kms)及蔗糖抗性 (SucR)雙重組株。在培養3天後出現之菌落被重複劃線於 TSB洋菜板及添加卡那黴素（10/zg/ml)之TSB洋菜板上以 -30- 201036631 篩選Kms/SucR菌落。真正之Kms/SucR菌落以菌落PCR 進一步檢查基因刪除株之存在（表5，PCR14)。基 因組DNA係自3個潛在之0以5突變株分離。PCR分析 證實該〇?以5基因刪除之存在，選出1個突變株以 供後續工作且命名爲包皮垢分枝桿菌△ ipdAB。 A12 建構馬紅球菌AfadESO突變株 0 馬紅球菌RE 1之未經標記之基因刪除株係利 用爲馬紅球菌所發展之5 -氟胞嘧啶反向篩選之二步驟同 源性基因重組策略產製（Van der Geize et al.，2008)。爲了 建構突變株，將非複製性質體PSelAct-fadE30 藉由電轉形移動至馬紅球菌 RE1株。由質體pSelAct-fadE30與該RE1基因組間之同源性基因重組所形成之2 個ApraR轉形株接著進行5-FC篩選以選擇導致基 因刪除之第二罕見同源重組事件之發生。使1 8個隨機挑 〇 選之 Apras/5FCR菌落進行使用引子 fadE3 Ocont-F及 fadE30cont-R 之菌落 PCR (表 5 ; PCR 19)，有 13 個 FCR/Apras菌落產生該預期大小之增幅子（428 bp)。基因 組DNA係自2個潛在」突變株分離，並進行PCR 分析。該基因座之PCR分析使用寡核苷酸引子 fadE30contr-F 及 fadE30contr-R (表 5)，其證實 基 因刪除之存在及野生型基因之不存在。以PCR分 析該上游及下游側翼區分別導致該預期之1.86 kb及1.76 kb產物。該分析證實該二區均有真正之/αΜΜ基因刪除 -31 - 201036631 存在，且顯示在該/αΜΜ基因座並無異常之基因體重組 。作爲毒性質體標記之的存在係由PCR證實。將1 個突變株命名爲馬紅球菌△ fadE30並用於後續工 作。 A13建構鯽諾卡菌△ ipdAB突變株 獅諾卡菌INS43 6之未經標記之0以5基因刪除突變 株係如下述利用反向篩選系統建構（Pelicic et al., 1 996，Mol. Microbiol. 20:9 1 9-925; Van der Geize et al., 200 1, FEMS Microbiol Lett. 205: 1 97-202)。將非複製性質 體pK18-ipdABNser藉由電轉形移動至獅諾卡菌INS436。 數個卡那黴素抗性轉形株接著於包含0.05% Tween80之尤 剛氏肉湯培養基中於26 °C非選擇性地生長7天。接著藉 由接種至包含2%蔗糖之尤剛氏洋菜板上所進行之反 向篩選作用篩選卡那黴素敏感性（Kms)及蔗糖抗性（SucR) 雙重組株。在於26 °C培養7天後出現之菌落被重複接種 於尤剛氏洋菜板及添加卡那黴素（20 μ g/ml)之尤剛氏洋菜 板上以篩選Kms/SucR菌落。真正之Kms/SucR菌落藉由使 用弓丨子ipdABNser-F及ipdABNser-R之菌落PCR進一步 檢查7>以5基因刪除株之存在（表5)。基因組DNA係自3 個潛在之突變株分離。使用引子對ipdABNser-F及 ipdABNser-R 之 PCR 分析（PCR 23)導致 222 bp 之 PCR 產 物及不存在野生型1，634 bp之PCR產物，證實該//7^5 基因刪除株之存在。引子對 IpdABNser-F2 及 -32- 201036631

IpdABNserDOWN-Contr-R (PCR 26)被用於進一步確認該 基因刪除株。此引子對導致以以忍突變株得到 1，148 bp之預期PCR產物，然而2,560 bp之PCR產物僅 由野生型菌株獲得。一個突變株被命名爲鯽諾卡菌△ ipdAB且被選出以供後續工作。 B部分：作爲活體內減毒模型之巨噬細胞存活性 0 B1使用菌株 毒性菌株 菌株RE 1 :野生型親代菌株。此菌株依賴膽固醇生長 〇 菌株RE1」以尸45 :刪除基因。此菌株無法依 賴膽固醇生長。 非毒性菌株 Ο 菌株103-:缺乏80至90 kb之毒性質體，已知對馬 爲非致病性（Takai et al. 2000，Infect. Immun. 68: 684〇- 6 847)。此菌株無法依賴膽固醇生長。 本發明之菌株 菌株RE1 ZW/7以5 (RG134 1):在膽固醇分解簇中之 S基因係經刪除。此菌株無法依賴4 -雄甾烯-3，1 7 -二 酮（AD)生長。 菌株REl』z>^5-AD+:經適應以依賴AD生長之菌 -33- 201036631 株的細菌（若菌株RElzlbW召被以高濃度（ 超過106 CFU/ml)接種且以AD爲唯一碳來源’則可能有 少數菌落確實依賴AD而生長）。 菌株 RE1 Δ ipdAB Δ ipdAB2 (RG283 7)：第二糸且 ipdAB 基因（非膽固醇分解基因簇之部分）亦經刪除。此菌株不依 賴AD生長。

菌株馬紅球菌△ fadE30。此菌株依賴HIP/HIL及AD 之生長嚴重受阻。 B2用於巨噬細胞感染之馬紅球菌基因簇 於巨噬細胞存活性試驗中測試之不同馬紅球菌菌株係 於37°C及1〇〇 rpm之營養肉湯（迪菲可公司（Difco))中隔夜 (17小時）生長，目標爲終濃度1-2 X 108 CFU/ml。只使用 新鮮製備之培養基。在接種巨噬細胞後，進行活菌數測定 (培養板計數）以確認感染力價。 B3用於幼馬挑戰之紅球菌培養 馬紅球菌菌株RE 1、RE 1 J 及RE 1 J AD + 係接種於血液洋菜板及於3 7 °C培養2 4小時。每個培養板 上之細菌係以4毫升之無菌等張PB S收集。細菌懸浮液 係經無菌等張PBS之稀釋，目標爲終濃度4 X 104 CFU/ml 。於環境溫度中運輸；經稀釋之培養液係於製備後4小時 以內使用。在挑戰後，進行活菌數測定（培養板計數）以確 認感染力價。該活菌數分別爲RE1 4.35 X i〇4 cFU/ml、 -34- 201036631 RE 1 Δ ipdAB 7.1 x 1 04 CFU/mlS： ~ΚΈ \ Δ ip dAB- ΑΌ+ 5 . 8 x 104 CFU/ml 。 B4測試系統 巨噬細胞細胞系 細胞系U93 7 (人單核細胞）係用於測試馬紅球菌菌株 之存活性。該單核細胞係於以1 〇mM HEPES爲緩衝並添 0 加200 IU/ml青黴素及鏈黴素與1〇%胎牛血清（FBS)之 RPMI 1 640 + NaHCO3 + NAPYR +葡萄糖培養基（RPMI 1 640 培 養基）中生長。該細胞係於3 7 °C之懸浮液及5 % C 02中生 長。 幼馬 使用8匹幼馬：7匹3至5週齡之幼馬及1匹7週齡 之幼馬（所有均有母馬相伴）。該幼馬被分配至各3、3及2 Q 匹幼馬之3組，各組間之年齡呈平均分布。飼養於獨立房 舍。在實驗期間幼馬吸乳，並按標準程序餵飼母馬。新鮮 自來水可隨意取得。 -35- 201036631 組別 母馬 幼馬編號 出生曰期 性別 RE1 5 977 17 10-05-08 公 9263 18 17-05-08 母 1952 19 19-04-08 公 RE1 zl ipdAB 6095 20 02-05-08 母 3 07 1 2 1 10-05-08 公 9390 22 20-05-08 公 RE1 Δ ipdAB-AO + 87 19 23 09-05-08 公 49 83 24 10-05-08 公 在Τ = 0，所有幼馬利用帶針針筒以100毫升之菌株RE 1、 RE1 zl 或RE1』i>W5-AD +之挑戰培養基經氣管內挑 戰（見上述「用於幼馬挑戰之紅球菌培養」），稱爲經氣管 注射。 B 5實驗程序及參數 巨噬細胞存活性測試 以巨噬細胞存活性試驗而言，使單核細胞如前述生長 數天。該培養基以新鮮培養基替換，該細胞係經6 0 n g /m 1 佛波醇-12豆蔻酸酯-13乙酸酯（pM A)隔夜活化以誘發彼等 之分化成巨噬細胞。 該經分化之細胞係經離心沉澱（5分鐘20〇xg) ’沉澱 物被重懸於新鮮、不含抗生素之10%FBS RPMI 1640培養 基。就受測試之各菌株而言’在含有1 〇 m 1細胞懸浮液（ 約1 0 6細胞/毫升）之試管中’以每個巨噬細胞約1 0個細菌 之感染複數（M01)接種馬紅球菌。 細菌係與巨噬細胞一起培養於3 7 °C及5 % C 〇2中1小 -36- 201036631 時。該培養基以添加10% FBS及100/ig/ml慶大黴素之 10 ml RPMI 1 640培養基更換，再培養1小時以殺死任何 細胞外細菌。該巨噬細胞（含經內化之馬紅球菌）係經離心 沉澱（5分鐘200xg)，該沉澱物被重懸於以lOmM HEPES 爲緩衝並添加 10% FBS及 lO/zg/ml慶大黴素之 40 ml RPMI 1 640培養基中。此懸浮液被分至4個培養瓶（各1〇 毫升），於3 7 °C及5 % C Ο 2中培養。在4、2 8、5 2及7 6小 〇 時後，巨噬細胞（每菌株1個培養瓶）經離心沉澱（5分鐘 2〇〇xg)，以1 ml不含抗生素之RPMI 1640培養基清洗該 沉澱物二次。最後以1 % Triton X-1 00之0 . 〇 1 Μ磷酸鹽緩 衝鹽水（PBS)溶解該沉澱物，然後測定活菌數（培養板計數 幼馬挑戰 1- 直腸溫度：在挑戰前1天、挑戰當天（在挑戰前不 〇 久）及挑戰後每天測量一次直到屍體解剖。 2- 臨床檢查：在挑戰後3週期間，每天檢查該些馬的 臨床症狀。 3- 死後檢查及細菌學檢查：在挑戰後21天，秤量幼 馬的體重，接著以甲苯噻嗪（xylazine)(l〇〇 mg/100 kg)及 克他命（ketamine)(500 mg/100 kg)麻醉並使之流血至死。 秤量肺的重量以計算肺對體重比。進行完整的死後檢查， 特別小心肺及相連之淋巴結。有異常情況時，由病理學家 視需要採取樣本以供組織學檢查。 -37- 201036631 從代表每半邊肺之肺葉的7個標準部位（每一半3個 部位+副葉）切下組織樣本（1 cm3);較佳地選擇各部位若存 在之疾病組織。集合鏡相樣本（各半邊相等肺葉之2個樣 本）以得到每匹幼馬3個樣本+ 1個副葉之樣本。各（集合） 樣本係經均質化、連續稀釋及接種於血液洋菜板上，接著 於3 7°C培養16至24小時。計算紅球菌菌落並以CFU/ml 均質液表示。額外拭抹係自所有其他異常採取。將拭抹劃 線於血液洋菜板，接著於371培養16至24小時。馬紅 球菌最初係由彼之典型非溶血性黏液狀菌落型態識別。進 —步識別係由革蘭氏染色、API/Phoenix及/或PCR進行 B6結果 於巨噬細胞之存活性 二個分開實驗之結果係顯示於表1 (連同圖1)及表2 ( 連同圖2 )。該結果顯示R E 1」s w # 5突變株能在巨噬細胞 中以和野生型親代菌株RE 1類似之方式存活，表示膽固 醇代謝不是巨噬細胞存活性所必須。此與膽固醇代謝本身 對毒性並不重要之辨識一致。相反的，菌株RE 1」化以5 ' M W \ Δ ipdABipdAB2 ' MW REl Δ ipdAB-ΑΌ +A M W 10 3 -於巨噬細胞中之存活係明顯降低。然而應注意該細菌 仍能在巨噬細胞中存活，只是量顯著降低（通常以相較於 野生型之量低100至1000倍之濃度）。菌株103 -缺乏80-至90-kb毒性質體且已知在馬爲無毒性（Takai et al.)。此 -38- 201036631 菌株103-不適合作爲疫苗菌株，因爲其不引發保護性免 疫反應，可能是因爲缺乏該毒性質體。表9 (連同圖4)之 結果顯示突變株馬紅球菌△ fadE3 0與野生型菌株RE1及 菌株RE1 /1 0心5之比較。很明顯地，該fadE3〇突變株具 有可與」5菌株相比擬之存活特徵，也較不能在巨噬 細胞中存活。 在編碼涉及甲基六氫茚滿二酮丙酸酯降解活性之蛋白 0 質的操縱子中具有突變之該等菌株（意即菌株RE 1」5 、REI Δ ipdABipdAB2、RE 1 zl AD+及馬紅球菌△ fadE30)的結果顯示，該等菌株較不能在巨噬細胞中存活 ，特別地，彼等之存活能力係可與非致病性菌株1 03-之 存活能力相比。此已是適當減毒之良好象徵。菌株RE1/3 i;?以5-AD +顯示與菌株RE1 4 相同之巨噬細胞表現 型，這表示完整之操縱子而非完整之膽固醇代謝係 以野生型之量在巨噬細胞存活所必須。該單一之基 〇 因刪除（在膽固醇分解基因簇中）導致受阻之巨噬細胞存活 。額外刪除一套該等基因（在膽固醇分解基因簇以外之 ipdA及ipdB，稱爲ipdA2及ipdB2)在巨噬細胞試驗中並 無進一步之減毒作用。 考慮這些結果，對幼馬經氣管內投予菌株RE1 j 及REl」/paU5-AD+ (=適應依賴AD生長之菌株 RE1」正常挑戰程序），並與野生型親代菌株RE1 比較以測試活體內減毒作用。 -39- 201036631 直腸溫度 表3 (連同圖3)顯示直腸溫度之結果。第1組係接受 野生型RE1菌株之組。第2及3組分別接受RE1 及RE1 /1 z>cL45-AD+。第3至10天之溫度未顯示，因爲 相較於正常直腸溫度並無任何顯著變化。異常溫度以粗體 表示。接受野生型親代菌株RE 1挑戰之3匹幼馬中的2 匹（1 8及1 9號）從挑戰後1 4天起顯示明顯上升之直腸溫度 。在14天後該直腸溫度之上升與臨床症狀之發生一致（見 下述）。21號之幼馬（接受菌株RE1J /尸以忍之挑戰）在挑戰 後1天顯示輕微之溫度上升（39.1 °C )，此極爲可能地與紅 球菌感染無關（在此挑戰模型中培養時間通常> 7天）。在 RE1」或RE1 zl +挑戰幼馬中並無觀察到其 他溫度上升。 挑戰後臨床症狀 從第7至21天之臨床得分事實上顯示，以野生型親 代菌株RE 1挑戰之1 8及1 9號幼馬從挑戰後第1 3天起開 始出現呼吸疾病之症狀。1 7號幼馬（亦爲RE 1挑戰組）在 挑戰後僅顯示輕微之臨床症狀。以突變菌株R E 1」ί p以5 及RE1」+挑戰之幼馬並未顯示呼吸疾病之明顯 症狀。後二組之臨床效應主要是輕微心跳加速，此亦可能 是（部分）因爲操作緊迫所致，因爲此現象在挑戰前亦存在 -40- 201036631 死後檢查 有關肺之死後發現係顯示於表4。在經野生型親代菌 株RE 1挑戰後’該幼馬出現呼吸疾病之症狀（特別是1 8及 1 9號幼馬）。以突變株挑戰之幼馬維持健康。在挑戰後2 i 天’ k寺幼馬被殺死及進f了屍體解剖。所有以野生型菌株 挑戰之幼馬在死後似乎具有典型之化膿性肉芽腫性肺炎， 馬紅球菌自該處被再分離成純培養，並由PCR證實該野 〇 生型菌株之屬性。從18號幼馬之腫大縱隔淋巴結亦分離 出野生型馬紅球菌。 以突變菌株挑戰之幼馬的肺並未顯示肺炎區域，且除 了 20號幼馬之輕微腫大支氣管淋巴結及24號幼馬之健康 肺組織以外未分離到紅球菌。該等分離株之屬性係藉由 PCR及依賴AD洋菜生長而分別被證實爲RE1」及 RE1J z_；?dd5-AD +。 〇 B7 B部分實驗之結論 菌株REl/l/p以召及1^1」/;^乂5-八0 +在巨11遼細胞中 之存活係明顯地受阻，且在幼馬中係經減毒。基因剔除第 2套基因（導致RE1 Z1 0以5沙以52)似乎在巨噬細胞 存活性試驗中不具額外效果，在幼馬亦可能不具額外效應 。綜合菌株 RE 1 ' RE 1 sup A B ' 103- ' RE1 Δ ipdAB RE 1 Zl 心5-AD +於活體內及活體外之結果顯不屬於諾卡囷开夕 放線菌之細菌的巨噬細胞存活量與活體內毒性之間具有良 好相關性。特定地’當突變菌株相較於毒性親代菌株具有 -41 - 201036631 通常顯著降低約2至3個對數級之巨噬細胞存活能力時’ 該突變菌株相較於該親代菌株似'乎經顯著減毒° 根據眾所周知之諾卡菌形放線菌分享感染方式及毒性 因子，因此馬紅球菌通常被用來作爲硏究分枝桿菌之模型 之事實，特別是與巨噬細胞存活性及持續性有關之毒性因 子（見除其他夕 t PN A S, February 6，2007，vol. 10 4, no. 6, PP 1 947- 1 952)，將了解藉由使編碼涉及甲基六氫茚滿二酮 丙酸酯降解之蛋白質的基因去活化而使細菌之存活率下降 對諾卡菌形放線菌之減毒係通用的。 C部分：突變細菌於防備野生型感染上之效能 C1介紹 關於包含本發明之突變活菌之醫藥組成物的療效被認 爲是固有的。此可藉由認知有關膽固醇代謝突變之公開可 得之知識被了解，這些知識清楚地顯示在膽固醇代謝中具 有突變之細菌仍具有與野生型有機體可相比之抗原負載。 在與目前由本發明所提供之知識共相考慮下，該突變活菌 仍能進入巨噬細胞且持續存在其中，毫無疑問地仍確保免 疫反應之剌激。而且申請人已進行實驗以證實此想法。以 此而言’使用包含馬紅球菌活菌之疫苗。就本身而論，仍 然無可得之疫苗以防備此細菌，此使得此試驗在本質上爲 重要。但是更重要的是，此細菌已被公認爲其他諾卡菌形 放線菌之良好模型，特別是結核分枝桿菌。其它證實試驗 (以獲得涵蓋諾卡菌放線菌之完整範圍的確認結果）可舉例 -42- 201036631 來說以獅諾卡菌進行（見第C6頁）。此爲典型的魚病原菌 ,因爲和無適當疫苗以防備其他巨噬細胞存活性諾卡菌形 放線菌相同的原因’而無法獲得防備該病原菌之適當疫苗 C 2實驗設計 1 6匹2至4週齡之幼馬被用於此實驗。該些幼馬被 分爲4組每組4匹馬，並以包含不同劑量之RE 1 Μ β (於無菌等張磷酸鹽緩衝鹽水組成）的1毫升疫苗經口服免 疫接種。第1組以5x1 〇9 CFU免疫接種，第2組以5x1 08 CFU免疫接種，第3組以5xl07 CFU免疫接種及第4組爲 不免疫接種對照組。於T = 0及T = 2週給予免疫接種。於 Τ = 4週所有幼馬以100ml毒性馬紅球菌85F菌株培養液（ 每100毫升劑量包含5x1 06 CFU)經氣管內挑戰。 在挑戰後3週期間臨床評估該些馬。在第一次免疫接 〇 種當天、挑戰當天及屍體解剖當天秤量幼馬體重。在挑戰 後3週（或嚴重臨床症狀病例之更早），使該幼馬秤重及安 樂死’進行完整死後檢查，並特別注意肺及呼吸系統淋巴 結。粹量該肺重量以計算肺對體重比。採取所有肺葉之組 織樣本以供檢查。 C3材料及方法 測試物品 疫苗包含於無菌等張磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)組成之紅 -43- 201036631 球菌RE 1」活菌。該挑戰培養液係如下述製備：馬 紅球菌85F菌株係接種於血液洋菜板上，於37°C培養24 小時。每個培養板上之細菌係以4毫升之無菌等張PBS 收集。細菌懸浮液係經無菌等張PBS之稀釋，目標爲終 濃度4 X 1 04細菌/毫升。於環境溫度中運輸；經稀釋之培 養液係於製備後4小時以內使用。在挑戰後，進行活菌數 測定以確認感染力價。該力價爲5.3 X 104 CFU/ml。 實驗方法及參數 在每次免疫接種前不久及（免疫接種後）第〇、1、2、3 、6、10' 14、15、16、17、20及24天，藉由直腸拭抹 採樣以進行細菌再分離。在τ=0 (第一次免疫接種前不久） 自幼馬採集鼻腔拭抹。該拭抹樣本經生理鹽水溶液連續稀 釋，並接種於血液洋菜板，於3 7°C培養16至24小時。 紅球菌菌落最初係由典型非溶血性黏液狀菌落型態識別、 計算並以CFU/ml表示。在每次分離當日，（自若存在之3 匹不同馬）隨機選擇3個再分離株以用於確認特徵：革蘭 氏染色、API/Phoenix 及 基因之 PCR。 在試驗期間，由生物技術人員每天觀察馬匹之整體健 康及/或行爲有無任何異常。從挑戰前一天開始，每天檢 查馬匹的臨床症狀（直到屍體解剖）。在第一次免疫接種前 不久、挑戰前不久及屍體解剖前不久秤重。如此，可計算 體重增加及肺對體重比。 在挑戰後1 4至20天（或嚴重臨床症狀之例中更早）， -44- 201036631 以甲苯噻嗪 （xylazine)(100mg/100kg)及克他命 (ketamine)(5 00 mg/100 kg)麻醉該些幼馬，接著使之流血 至死。秤量肺的重量以計算肺對體重比。進行完整的死後 檢查。從代表每半邊肺之肺葉的7個標準部位（每一半3 個部位+副葉）切下組織樣本（1 cm3);較佳地選擇各部位若 存在之疾病組織。集合鏡相樣本（各半邊相等肺葉之2個 樣本）以得到每匹幼馬3個樣本+ 1個副葉之樣本。各（集合 0 )樣本係經均質化、連續稀釋及接種於血液洋菜板上，接 著於3 7 °C培養16至 24小時。計算紅球菌菌落並以 CFU/ml均質液表示。每隻動物之肺炎肺分數係藉由建立 肺尖（左+右）、後葉（左+右）及副葉肺結節之實質化百分比 以獲得。加總每隻動物之該些百分比以獲得一個肺得分數 字。如此得到介於〇至5 00之肺得分。 C4結果 Ο 挑戰後結果係摘列於表7。從這些摘要結果，很明顯 的所有4匹對照幼馬出現由馬紅球菌爲唯一病原菌所造成 之化膿性肉芽腫性肺炎的嚴重臨床症狀。二隻經免疫接種 之4及5號幼馬具有與對照組可相比之症狀，但是所有其 他免疫接種幼馬之症狀非常輕微或幾乎沒有症狀。肺重量 百分比（肺炎程度之客觀測量）證實大部分免疫接種動物之 部分保護作用。 2號免疫接種幼馬由非特異性細菌造成肺炎。事實上 此幼馬可被視爲受到保護，因爲雖然經過大量挑戰但未分 -45- 201036631 離到紅球菌。此外，從3匹有肺炎之免疫接種幼馬分離到 混合感染。這些混合感染可能對不同的保護參數具有不良 影響。雖然疫苗之保護效果係明顯的’但未觀察到劑量反 應效應。事實上，最低劑量似乎提供最佳結果。根據此一 結果連同幼馬具有不成熟胃腸道菌叢之事實，認爲最佳劑 量介於lxlO4至1x101qCFU之間。 C 5 C部分實驗之結論 〇 疫苗之所有3種口服劑量似乎對幼馬均爲安全，且誘 發防備嚴重經氣管內挑戰之實質保護作用。在現行實驗中 ’ ipdAB操縱子之基因ipdA及ipdB皆自疫苗中之細菌的 基因組移除。然而很明顯的，其他涉及該相同操縱子之其 他突變可爲同樣有效。舉例來說僅影響一個基因ipdA或 ipdB之突變本身可爲同樣有效。在任何後者之情況中， 相關之轉移酶無法被製備因此達到該相同之表現型。事實 上此亦可自雷根瑞珍（Rengarajan)(pNAS, June 7, 2005， |)

Vol· 102’ No· 23，pp 8327-8332)衍生。在此參考文獻中， 提供另一諾卡菌形放線菌亦即結核分枝桿菌之相關證據·· 使垂直同源ipd基因（分別稱爲rv3 5 5 1及rv3 5 5 2)之任一 者去活化導致相同表現型。 C6證實鯽諾卡菌突變株之疫苗效能 在另一放線菌即魚病原菌鯽諾卡菌重複上述馬紅球菌 之實驗’該菌造成魚之諾卡菌症。在此實驗中，使用如上 -46- 201036631 述A13段所提到之野生型菌株INS43 6及△ ipdAB菌株。 將2 0隻黃尾魚（青甘驂（51 e o / a g w ί π g w e r fl山_ α ί α))之組 經腹腔內注射野生型菌株或突變菌株（以不同濃度）’ 一組 20隻魚作爲對照組。觀察魚的死亡發生率及其他臨床反 應2至3週，以評估該突變菌株之減毒。在此觀察期結束 時，存活之魚以固定劑量之野生型菌株挑戰以評估該突變 菌株作爲疫苗之效能。觀察魚另2週。 0 製備2.25xl08 cfu/ml之野生型菌株接種物。以突變 菌株而言，此爲7.85xl08 cfu/ml (約高出3倍）。製備這 些純接種物之2倍、20倍、200倍及2000倍稀釋液以用 於減毒試驗。該IP挑戰物質包含1 .2x 1 06 cfu/ml。 減毒試驗之結果係顯示於表1〇 (顯示觀察期結束時之 死亡率）。從此表可明顯得知，該突變菌株相較於野生型 菌株係經減毒：雖然該突變菌株之純接種物的cfu/ml高 出3倍，接受該突變菌株之組的死亡率顯著較低。該效能 Q 試驗之結果係顯示於表1 1。雖然無法獲得完全保護作用 ，很明顯的該突變株提供顯著保護作用（考慮在對照組中 60%之魚在觀察期間死亡之事實）。即使在接受2000倍稀 釋之魚的組別中，非常少的魚因爲野生型獅諾卡菌挑戰而 死亡。 因此這些結果顯示，使編碼涉及甲基六氫茚滿二酮丙 酸酯降解之蛋白質的基因去活化，在第二種諾卡菌形放線 菌導致經減毒且具保護性之疫苗菌株。此進一步支持本發 明可應用於全範圍之諾卡菌形放線菌之事實。 -47- 201036631 【圖式簡單說明】 圖1顯示各種馬紅球菌突變株於巨隨細胞中之存活性 〇 圖2亦顯示各種馬紅球菌突變株於巨噬細胞中之存活 性。 圖3顯示在野生型馬紅球菌挑戰後之直腸溫度。 圖4顯示各種馬紅球菌突變株於巨噬細胞中之存活性 -48- 201036631 861013 序列表 <110>英特威特國際股份有限公司 <120>供動物防備由屬於諾卡菌形放線菌族群之細菌感染所引起的疾病之醫藥組成物

<130> 2009.001 EP/PD <140> 09150379,7 - 2107 <141> 2009-01-12 <160> 59 <170> Patentln version 3.4

<210> 1 <211> 296 <212> PRT <213> 馬紅球菌(Rhodococcus equi) <400> 1

Met Ala G]u Lys Arg Asp Lys Arg Arg Ser Leu Asp Glu Ala Val Ala 15 10 15

Gly lie Gin Ser Gly Met Thr lie Gly lie Gly Gly Trp Gly Ser Arg 20 25 30

Arg Lys Pro Met Ala Leu Val Arg Ala Leu Leu Arg Ser Asp Val Lys 35 40 45

Asp Leu Thr Val Val Gly Tyr Leu Gly Pro Asp Leu Gly Leu Leu lie 50 55 60

Ser Ala Gly Lys Val Lys Arg Ala Tyr Tyr Gly Phe Val Ser Leu Asp 65 70 75 80

Ser Ala Pro Phe Tyr Asp Pro Trp Phe Ala Gin Ala Arg Val Ala Gly 85 90 95

Thr lie Glu Ser Arg Glu Met Asp Glu Gly Met Val Lys Ala Gly Leu 100 105 110

Gin Ala Ala Ala Ala Arg Leu Pro Phe Met Pro lie Arg Ala Gly Leu 115 120 125

Gly Ser Asp Ala Gin Thr Val Trp Gly Asp Glu Leu Lys Thr Val Ala 130 135 140

Ser Pro Tyr Pro Asp Ala Asp Gly Arg Thr Glu Thr Leu lie Ala Met 145 150 155 160

Pro Ala Leu Lys Leu Asp Ala Ala Leu Val His Leu Asp Leu Ala Asp 165 170 175

Glu Arg Gly Asn Ala Ala Tyr Thr Gly Val Asp Pro Tyr Phe Asp Asp 180 185 290

Leu Phe Cys Leu Ala Ala Glu Gin Arg lie Leu Ser Ala Asp Lys lie 195 200 205 201036631

Vai Ser 丁hr Glu GIu Leu Vai Lys Ser Va] Pro Asn G]n A]a Leu lie 210 215 220

Leu Asn Arg Ser Met Val Asp Thr Val Thr Glu Ala Pro Asn Gly Ala 225 230 235 240

His Phe Thr Phe Ala Gly Ser Tyr Lys Arg Asp Glu Lys Phe Gin Arg 245 250 255

His Tyr Ala Glu Ser Ala Lys Thr Pro Glu Ala Trp Gin Ala Phe Ala 260 265 270

Asp Thr Tyr Leu Ser Gly Ser Glu Asp Asp Tyr Gin Ala Ala Val Arg 275 280 285

Lys Phe Ala Glu Glu Gin Lys Ser 290 295 <210> 2 <211> 249 <212〉 PR丁 <213> 馬糸工球菌(Rhodococcus equi) <400> 2

Met Thr Glu Val Thr Arg Ala Glu Tyr Cys Ala Val Ala Cys Ala Glu 15 10 15

Leu Phe Ala Asp Ala Gly Glu lie Phe Ala Ser Pro Met Ala Thr Leu 20 25 30

Pro Leu lie Gly Ala Arg Leu Ala Lys Leu Thr Thr Glu Pro Asp Leu 35 40 45 lie lie Thr Asp Gly Glu Ala Leu lie Leu Ala Glu Ala Pro Ala lie 50 55 60

Gly Ala Ser Ala Pro lie Glu Gly Tyr lie Pro Phe Ser Lys Val Phe 65 70 75 80

Asp Val Val Ala Ser Gly Arg Arg His Val Val Met Gly Ala Asn Gin 85 90 95 lie Asp Lys Tyr Gly Asn Gin Asn Leu Ser Ala Phe Gly Pro Leu Asp 100 105 110

Lys Pro Thr Arg Gin Met Phe Gly Leu Arg Gly Ala Pro Gly Asn Thr 115 120 125 lie Asn His Ala Thr Ser Tyr Trp Val Gly Lys His Ser Ser Arg Val 130 135 140

Phe Ala Glu Lys Val Asp Val Val Cys Gly Val Gly Tyr Asp Lys Val 145 150 155 160

Asp Pro Glu Asn Pro Ala Phe Arg Phe Leu Lys Asn His Arg Val Val 165 170 175 201036631

Thr Asn Leu Gly Val Phe Asp Phe Gin Gly Pro Gly Gin Thr Met Arg 180 185 190

Ala Val Thr Leu His Pro Gly Val Thr Ala Glu Asp Val Lys Ala Asn 195 200 205

Thr Ser Phe Glu lie Ala Asp Leu Asp Ser Ala Gly Val Thr Arg Glu 210 215 220

Pro Thr Ala Glu Glu Leu Arg Leu lie Arg Glu Val lie Asp Pro Lys 225 230 235 240

Ser Leu Arg Asp Arg Glu Val Ser Ala 245

<210〉 3 <211> 287 <212> PRT <213〉馬紅球菌（Rhodococcus equi) <400> 3

Leu Ser Asp Lys Arg Met Ser Glu Lys Glu Val Val Gly Arg Leu Arg 15 10 15

Ser Gly Met Thr lie Gly lie Gly Gly Trp Gly Ser Arg Arg Lys Pro 20 25 30

Met Ser Leu Val Arg Glu lie Leu Arg Ser Asp Leu Asp Asp Leu Thr 35 40 45

Val Val Ser Tyr Gly Gly Pro Asp Val Gly Leu Leu Cys Ala Ala Gly 50 55 60

Lys Val Arg Lys Val Val Phe Gly Phe Val Ser Leu Asp Ser lie Pro 65 70 75 80

Leu Asp Pro His Phe Arg Ala Ala Arg Gin Gly Gly Arg Val Glu Val 85 90 95

Ala Glu Tyr Asp Glu Gly Met Leu Gin Trp Gly Leu Tyr Ala Ala Gly 100 105 110 lie Arg Leu Pro Tyr Leu Pro Thr Arg Ala Gly Leu Gly Ser Asp Val 115 120 125

Met Arg Val Asn Pro Glu Leu Arg Thr Val Thr Asp Pro Tyr Gly Asp 130 335 140

Glu Thr Leu Val Ala Met Pro Ala lie Pro Leu Asp Ala Ala Leu Val 145 150 155 160

His Met Asn Arg Ala Asp Val His Gly Asn Ala Gin Tyr Leu Gly Pro 165 170 175

Asp Leu Tyr Phe Asp Asp Leu Phe Cys Met Ala Ala Glu Gin Val Tyr 180 185 190 201036631

Val Ser Cys Glu Arg lie Val Pro Thr Ala Glu Leu Thr Ala Asp Ala 195 200 205

His Pro Ser Thr lie Arg lie Pro Arg Leu Leu Val Ser Gly Val Val 210 215 220

Ala Ala Pro Gly Gly Ala His Phe Thr Ser Cys Val Pro Asp Tyr Ala 225 230 235 240

Arg Asp Glu Ala Phe Gin Arg Giu Tyr Val Thr Ala Ala Lys Asp Pro 245 250 255

Glu Lys Trp Gin Ala Phe Val Asp Arg Tyr Leu Ala Val Pro Glu Ala 260 265 270

Glu Tyr Gin Arg Ala Val Arg Gly Ala Arg Glu Glu Ala Ser Ala 275 280 285

<210> 4 <211> 252 <222> PRT <213> 馬紅球菌(Rhodococcus equi) <400> 4

Met Ser Ala Ala Thr Arg Ala Glu Val Cys Ala Val A3a Cys Ala Glu 15 10 15

Ala Tyr Arg Gly Asn Gly Glu Val lie Ala Ser Ala Phe Gly Thr lie 20 25 30

Pro Ala lie Gly Val Arg Leu Ala Arg His Thr Phe Glu Pro Asp Leu 35 40 45

Val Val Ser Asp Gly Glu Ala Ala Ala Val Arg Gly Thr Trp Ala Val 50 55 60

Gly Gly Pro Ala Asp Gly Glu Val Glu Ala Trp Leu Pro Phe Asn Gin 65 70 75 80 lie Phe Asp Leu Val Trp Asn Gly Lys Arg His lie Met Met lie Pro 85 90 95

Thr Gin Leu Asp Thr Tyr Gly Asn Cys Asn lie Ser Ala lie Gly Asp 100 105 110

His Asp Arg Pro Ser Val Gin Leu Leu Gly Val Arg Gly Ala Pro Gly 1]5 120 125

Asn Thr Val Tyr His Pro Thr Ser Tyr Trp Val Pro Lys His Ser Thr 130 135 140

Arg Val Phe Val Pro Lys Val Asp Met Val Ser Gly Val Gly Asn Asp 145 150 155 160

Asn Ala Arg Lys Ala Gly Pro Ala Ala Thr Arg Tyr His Glu Leu Arg 165 170 175 201036631

Arg Vai Val Thr Asp Leu Ala Val Leu Asp Phe Thr Pro Asp Ser Gly 180 185 190

Arg Leu Arg Leu Val Ser Val His Pro Gly Val Thr Val Asp Asp Val 195 200 205

Val Ala Ala Thr Gly Phe Asp Leu Val lie Pro Asp Ser Val Pro Gin 210 215 220

Thr Arg Ala Pro Ser Ala Glu Glu Leu Glu Leu lie Arg Thr Val lie 225 230 235 240

Asp Pro Arg Asn Leu Arg Asp Lys Glu Val Pro Ala 245 250

<210> 5 <211> 22 <212> DNA <213>人工、 <220> <223>引子 ， <400> 5 22 tgccgctgac ggaggagatc at <210〉 6 <211> 28 <212> DNA <2i3>人工 <220〉 <223>引子 <400> 6 gatatcatac cggcgactgc ctcatcca 28 <210> 7 <211> 27 <212〉 DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 7 27 gatatcgaac cacccgtggt caccaac <210> 8 . <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> 引子' <400> 8 tcgagcagcg aactggcctg aa <210〉 9 <211> 22 <212〉 DNA <213>人工 <220〉 22 201036631 <223>引子 <400> 9 agtccgacga cgatcgagtt ga 22 <210> 10 <211> 22 <232> DNA <2Ϊ3> 入土 <220> <223〉引子-<400> 10 tcacgccgag acctcacggt ca 22

U22DNAAI <210> <211> <212> <213> <220> <223>引子 <400> 11 atggctgaga agcgcgacaa gc 22 usaax <210> <211〉 <212> <213〉 <220> <223>引子 <400> 12 tcgtcgtcgt ctcgcaccag at 22 <210> 13 <211〉 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 13 atggctgaga agcgcgacaa gc 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 14 tcacgccgag acctcacggt ca 22 > > > > 0 12 3 1 11 11 11 2 2 2 2 < < < < mdnaax <220> <223>引子 <400> 15 201036631 tcgaggtggt teatgaegaa ga <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 16 agatctccgg ccgaccacct ctttctcc

h ah 1728DN人 b > > > 012 3 11 1 1A «11 2 2 2 2 vvvV <220> Ο <223>引子 <400> 17 agatctagtg cggaggagct ggaactga <210> 18、 <211〉27、 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 18 actagtgatc t.cgtccgtga cctgatg <210> 19 <211> 22 ' <212> DNA <213>人工. <220> <223>引子 - <400〉19 ' ' ccgacatcac ggtgtcggga tc <210> 20 <211> 22 <212> DNA 、 <213〉人工 <220> <223>引子、 <400> 20 tcacgcggga acctccttgt eg <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> 人工' <220> <223>引子 <400> 21 ttgtcggaca agagaatgtc gg 22201036631 <210> <211> <212> <213〉 ah 2222DN人 <220> <223>引子 <400〉 22 ggtcgtgacg tccgcggtgt tc <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 23 ttgtcggaca agagaatgtc gg 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <400> 24 tcacgcggga acctccttgt eg 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 25 gcagcagtgc gattctcaat ag 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <400> 26 taactccacc ggactggata tg 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 27 ttcgagatgg ccgcgatcga at <210> <211> <212>

A 8 8 N 2 2 D 8 22 201036631 <213>人工 <220> <223>引子 <400> 28 ' actagtgatg gtcatgccgc tctcgata <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213>入工 <220> <223>引子. <400> 29 . actagtcagg tcgccgacaa cacctcgt

<210> 30 <211> 28 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子： <400> 30 aagcttgaat tcgtcgccga cggtgaag <210〉 31 <211> 20 <232> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 31 acgccagcta ccgcatggaa <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400〉 32 atcacctcgc gcagcagctt <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223>引子 <400> 33 * tccattcgcg ccagcgcatt ct <210〉 34 <211> 25 <212> m <213〉人工 <220> 25201036631 <223>引子 <400> 34 agatctcttc gagccattcg cgaat <210> 35 <211> 25 <212〉 DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 35 agatctacgg cggatccaac gagat 25 <210> <211> <212> <213> <220> <223> 3622DNAAI引 <400> 36 aggtcgcgga actcctggtt ac 22 <210> 37 <211〉 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 37 acgatgtacg cacgaccgac ct 22 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 38 gacagcttct cgacggtctc ac 22 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 39 aggcgaggcg gaacctctat ac <210> <211> <212> <213>

40SAAX <220> <223> 引子 <400> 40 -10- 22 201036631 cgtccagaac gatggagagg ta 22 <210〉 41 <211> 22 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <400> 41 aggcgaggcg gaacctctat ac 22 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220>

<223>引子 <400> 42 22 gacagcttct cgacggtctc ac

<210> 43 <211> 403 <212> PRT <213> 馬紅球菌（Rhodococcus equi) <400> 43

Val Asp Val Ser Gin Gly lie Glu Thr Ser Glu Gin Ala Ala Ala Asp 15 10 15

Glu Ala Phe Ala Arg Glu lie Arg Glu Trp Leu Glu Glu Asn Leu Ser 20 25 30

Gly Lys Phe Ala Glu Leu Lys Gly Leu Gly Gly Pro Gly Arg Glu His 35 40 45

Glu Ala Phe Glu Glu Arg Leu Glu Trp Asp Arg His Leu Ala Ala Ala 50 55 60

Gly Trp Thr Cys Leu Gly Trp Pro Lys Glu Tyr Gly Gly Arg Glu Ala 65 Ί0 75 80

Thr Leu Ser Gin Gin lie lie Phe His Gin Glu Tyr Ala Arg Ala Asn 85 90 95

Ala Pro Ala Arg Val Ser His lie Gly Glu Glu Leu Leu Gly Pro Thr 100 105 110

Leu lie Ala Phe Gly Thr Glu Glu Gin Lys Gin Arg Phe Leu Pro Gly 115 120 125 lie Lys Thr Val Thr Glu Leu Trp Cys Gin Gly Tyr Ser Glu Pro Gly 130 135 140

Ala Gly Ser Asp Leu Ala Asn Val Ser Thr Thr Ala Arg Leu Asp Gly 145 150 155 160

Asp Gin Trp Val Val Asn Gly Gin Lys Val 丁rp Thr Ser Leu Ala His 11- 201036631 165 170 175

Leu Ala Asp 丁rp Cys Phe Val Val Ala Arg Thr Glu Pro Gly Ser Ser 180 185 190

Arg His Lys Gly Leu Ser Tyr Leu Leu Val Pro Met Asn Gin Glu Gly 195 200 205

Val Glu Val Arg Pro lie lie Gin Leu Thr Gly Thr Ser Glu Phe Asn 210 215 220

Glu Val Phe Phe Asp Asn Ala Arg Thr Asp Ala Asp Leu Val Val Gly 225 230 235 240

Gly Glu Gly Asn Gly Trp Gly Thr Ala Met Gly Thr Leu Thr Phe Glu 245 250 255

Arg Gly Val Ser Thr Leu Gly Gin Gin lie Gly Phe Ala Arg Glu Leu 260 265 270

Glu Ser lie Val Glu Leu Ala Glu Arg Asn Gly Ala Ala Glu Asn Pro 275 280 285

Ala lie Arg Asn Lys lie Ser Arg Ala Trp Thr Ser Leu Gin Val lie 290 295 300

Arg Ala His Ala Leu Arg Thr Leu Ala Ser Val Asp Ala Ser Ala Asn 305 310 315 320

Gly Gly Glu Ala Ser Val Ala Lys Leu Leu T卬 Ala Asn Trp His Arg 325 330 335

Gly Leu Gly Glu Leu Ala Met Glu Val Gin Gly Ala Ala Ser Leu lie 340 345 350

Gly Val Glu Asn Thr Glu Pro Gly Glu Glu Leu Asn Asp Leu Gin Arg 355 360 365

Leu Trp Leu Phe Thr Arg Ala Asp Thr lie Tyr Gly Gly Ser Asn Glu 370 375 380 lie Gin Arg Asn lie lie Ala Glu Arg Val Leu Gly Leu Pro Arg Glu 385 390 395 400

Ala Arg Pro <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 44 gtggtcgttc gccgccgccg tg 22 -12- 201036631 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>引子 <400> 45 egatgeegat ggtcatgccg ct ah 4626DN人 > > > > 0 12 3 IX 1A li 2 2 2 2 <220> <223>引子 <400> 46 ggcaaccaga acctctccgc cttcgg <210〉 47 <211> 35 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 47 gtgttgccct cgaccaggcc ggcgcgcaac agcat <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400〉 48 agcggcatga ccatcggcat eg Ο

4926DNAAX <210> <211> <212> <213> <220> <223〉引子 <400> 49 ccgaaggcgg agaggttctg gttgcc <210〉 50 <211> 23 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 50 atgcgcgaca agcgaatgag cct

<2l0> 51 <2ll> 22 <2l2> DNA 22201036631 <213>人工 <220> <223> 引子 <400> 51 tcatgccgtc acttccttcc eg <210> 52 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 52 tcctcgtcgc cgtagtgcag gt 22 <210> 53 <211> 27 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 53 cccgggatgg tcatgccgct geggage 27 <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223>引子 <400> 54 cccgggtgig tccgccgacg ag 22 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 引子 <400> 55 ttggcggcca tgatgacctg gg 22 <210> 56 <211> 23 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 引子 <400> 56 atgcgcgaca agegaatgag cct <210> 57 <211〉 22 <212> DNA <213〉人工 -14- <220〉 23 201036631 <223>引子 <400> 57 gccttccacc agaccggctt tg 22

<210> 58 <231> 291 <212> PRT <213> 鲫諾卡菌(Nocardia seriolae) <400> 58

Met Arg Asp Lys Arg Met Ser Leu Asp Glu Val Val Gly Glu Leu Arg 15 10 15

Ser Gly Met Thr lie Gly lie Gly Gly Trp Gly Ser Arg Arg Lys Pro 20 25 30

Met Ala Phe Val Arg Ala Leu Leu Arg Ser Asp Leu Lys Asp Leu Thr 35 40 45

Val Val Thr Tyr Gly Gly Pro Asp Leu Gly Leu Leu Cys Ser Ala Gly 50 55 60

Lys Val Arg Lys Ala Tyr Tyr Gly Phe Val Ser Leu Asp Ser Ala Pro 65 70 75 80

Phe Tyr Asp Pro Trp Phe Ala Lys Ala Arg Thr Glu Gly Ala lie Thr 85 90 95

Val Arg Glu Met Asp Glu Gly Met Val Lys Cys Gly Leu Gin Ala Ala 100 105 110

Ala Ala Arg Leu Pro Phe Leu Pro lie Arg Ala Gly Leu Gly Ser Ala 115 120 125

Val lie Asp Phe Trp Glu Gly Glu Leu Lys Thr Val Gin Ser Pro Tyr 130 135 140

Pro Thr Asp Gly Lys Thr Glu Thr Leu Val Ala Met Pro Ala Leu Asn 145 150 155 160

Leu Asp Ala Ala Phe Val His Leu Asp Leu Gly Asp Lys His Gly Asn 165 170 175

Ala Ala Tyr Thr Gly Val Asp Pro Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Met Leu 180 185 190

Ser Ala Glu Lys Arg Tyr Leu Ser Val Asp Arg Leu Val Glu Thr Glu 195 200 205

Glu Leu Val Lys Ala Val Pro Thr Gin Ala Leu lie Leu Asn Arg Met 210 215 220

Met Val Asp Gly Val Val Glu Ala Pro Gly Gly Ala His Phe Thr Phe 225 230 235 240

Ser Gly Ser Tyr Gly Arg Asp Glu Lys Phe Gin Arg His 丁yr Val Glu 245 250 255 -15- 201036631

Ala Ala Lys Thr Pro Glu Ser Trp Ala Glu Phe Lys Ala Arg Tyr Leu 260 265 270

Asp Val Ser Glu Asp Glu Tyr Gin Ala Ala Val Glu Ala Phe Ala Glu 275 280 285

Glu Gin Lys 290

<210> 59 <211> 252 <212> PRT <213> 鯽諾卡菌(Nocardia seriolae) <400> 59

Met Thr Asp Thr Ala Thr Val Thr Arg Ala Glu lie Cys Val Val Ala 15 10 15

Ala Ala Glu lie Phe Arg Gly Ala Gly Glu lie Met Ala Ser Pro Met 20 25 30

Ser Thr Val Thr Thr lie Gly Ala Arg Leu Ala Arg Leu Thr Phe Glu 35 40 45

Pro Asp Leu Leu Leu Ser Asp Gly Glu Ala Leu Phe Phe Ala Glu Val 50 55 60

Pro Pro lie Gly Gly Lys Ala Pro lie Glu Gly Trp lie Pro Phe Ser 65 70 75 80

Lys Val Phe Asp Val Val Asn Ser Gly Arg Arg His Val Val Met Gly 85 90 95

Ala Asn Gin Leu Asp Arg Phe Gly Asn Gin Asn Leu Ser Ala Phe Gly 100 105 110

Pro Leu Gin Gin Pro Thr Arg Gin Met Phe Gly Val Arg Gly Ala Pro 115 120 125

Gly Asn Thr lie Asn His Ala Thr Ser Tyr Phe Val Pro Lys His Asn 130 135 140

Lys Arg Val Phe Val Asp Gin Val Asp lie Val Ser Gly lie Gly Tyr 145 150 155 160

Asp Lys lie Asp Ser Glu Asn Pro Ala Tyr Arg Phe His His Leu His 165 170 175

Arg Val Val Ser Asn Leu Gly Val Phe Asp Phe Asn Gly Pro Asp His 180 185 190

Thr Met Arg Ala Leu Ser Leu His Pro Gly Val Ser Ala Asp Glu Val 195 200 205

Ala Glu Asn Thr Leu Phe Glu lie Ala Gly Leu Ala Glu Ala Gly Glu 210 215 220 -16- 201036631

Thr Arg Leu Pro Thr Glu Glu Glu Leu Thr lie lie Arg Thr Val Leu 225 230 235 240

Asp Pro Lys Gly Phe Arg Gly Lys Glu Val Thr Ala 245 250

-17-

Claims (1)

1. 201036631 七、申請專利範圍： 1.一種供動物防備由屬於諾卡菌形放線菌族群之細菌 感染所引起的疾病之醫藥組成物，該諾卡菌形放線菌具有 在該動物之巨噬細胞內存活之能力，該醫藥組成物包含諾 卡菌形放線菌之活菌及用於該等活菌之藥學上可接受之載 劑，該等活菌係經藉由使編碼涉及甲基六氫茚滿二酮丙酸 酯降解之蛋白質的基因去活化而減毒。 0 2 .如申請專利範圍第1項之醫藥組成物，其中操縱子 之多個基因係經去活化。 3 .如申請專利範圍第2項之醫藥組成物，其中基因 i p d A及i p d B係經去活化。 4 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物 ，其中去活化係藉由經未經標記之基因的刪除作用刪除至 少一個基因而實現。 5 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物 〇 ，其中該細菌屬於諾卡菌科（Nocardiaceae)或分枝桿菌科 (Mycobacteriaceae) 〇 6 .如申請專利範圍第5項之醫藥組成物，其中該細菌 屬於紅球菌屬（Rhodococcus)、諾卡菌屬（Nocardia)或分枝 桿菌屬（Mycobacterium)。 7 .如申請專利範圍第6項之醫藥組成物，其中該細菌 屬於馬紅球菌egwi·)、獅諾卡菌（JVocari/ίΛ •yer/o/ae)、結核分枝桿菌（co6acrerz’ww 、 潰瘍分枝桿菌（w/cerans)、牛分枝桿菌 201036631 (Mycobacterium 6〇vb)或禽分枝桿菌副結核亞種 (Mycobacterium avium paratuberculosis)。 8. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物 ，其中該醫藥組成物係呈適合供口服投予之型式。 9. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之醫藥組成物 ，其中該活菌係以每劑介於lxl 04至1x1 〇ισ CFU之濃度存 在。 1 〇 · —種馬紅球菌，其係源自寄存於法國巴黎巴斯德 硏究中心之國立微生物培養保存中心之編號CNCM 1-4108 或CNCM 1-4109的菌株。 11.一種馬紅球菌菌株，其係以編號CNCM 1-4108或 CNCM 1-4109寄存於法國巴黎巴斯德硏究中心之國立微生 物培養保存中心。 1 2. —種屬於諾卡菌形放線菌族群之活菌於製造供動 物防備由對應野生型細菌感染所引起的疾病之醫藥組成物 上之用途，該諾卡菌形放線菌具有在動物之巨噬細胞內存 活之能力，該活菌係經藉由使編碼涉及甲基六氫茚滿二酮 丙酸酯降解之蛋白質的基因去活化而減毒。