TW201028474A - Laccase and DNA sequence encoding thereof - Google Patents

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Po-Ting Chen
Chii-Gong Tong
Tuan-Hua Ho
Su-May Yu
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061Laccase (1.10.3.2)

Description

201028474 1 I W4/Z4KA * 六、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明是有關於一種蛋白質及編碼其之單離核酸,且 特別是有關於—種具有漆酶活性的蛋白質及編碼其之早 離核酸。 【先前技術】 漆酶(苯二酚:氧氣氧化還原酶;benzenediol: oxygen 0乂丨〇1〇「6<^1^3363,日〇1.10.3.2)廣泛地存在於自然界中, 最早是從日本漆樹(Rht/s \/e/7?/c/fera)的汁液裡被發現的 (Yoshida,1883)。漆酶是一種含有多個銅離子的氧化還原 酵素,可以氧化眾多有機或無機化合物(包括二酚、多酚、 取代酚、二胺及芳香族胺化物),並同時將氧氣還原成水分 子(Thurston,1994)。漆酶大量存在於高等植物、真菌昆 蟲以及細菌體内(Arias et al., 2003; Givaudan et al.,1993; Martins et al., 2002; Mayer and Staples, 2002; Suzuki et al_,2003; Thurston,1994)。在昆蟲生長方面,漆酶似乎 扮演表皮蛋白質鞣化(sclerotization)過程中的關鍵角色 (Andersen et al·,1996; Kramer et al.,2001)。在細菌方 面’漆酶涉及黑化作用(Fatureetai·,1994)、孢子色素生 成(Martins et al·,2002)、或具有膽紅素氧化酶活性 (Sakasegawa et a丨·,2〇〇6)或其他活性(s〇丨咖封a丨, 2〇〇1)。在真菌和植物方面’漆酶分別涉及降解木質素 (Thurston, 1994)以及生合成木質素(〇,Ma丨丨#以3丨.,1993) 201028474 1 W ~T / 等作用。上述酵素都是與銅藍抗壞血酸氧化(CerU|〇pasmjn ascorbate oxidase)結構類似,可作為研究多銅離子氧化 酶結構與功能相關性的模型。此外,漆酶具有氧化幕多種 類的工業相關受質的能力,其應用於工業領域極具潛力 (Abadulla et al., 2000; Breen and Singlston, 1999; Collins et al_, 1996; Reid,1998)。這些特質使得生物觸媒 可以廣泛地應用至各種工業上微生物處理流程,包括生物 製漿、生物漂白、生物整治、食品加工以及工業廢水處理 ❿ 等(Xu,1999)。 在工業應用方面,首推發現具有不同受質專一性以及 較佳穩定性的漆酶為重要目標(Barbosa et al·,1996)。可 產生漆酶之微生物的篩選方式有下列兩種:觀察内含有顏 色指示劑的固體培養基上的脫色狀況(L.-L. Kjiskjnen, 2004) ’或是測量液體培養基内的酵素活性。前者不需要 另外製備樣品以及執行測量步驟,是較為簡單的作法。 近年來,漆酶基因序列發表自各種不同的真菌物種 ® (Hw丨nzk丨丨丨andMwssener,1997)。許多漆酶係由不同的基 因家族所編碼,在某些狀況下,一個基因家族可能組成至 少五個不同的漆酶基因(Hoshida et al_, 2〇〇1)。此外,漆 酶基因在轉錄過程中受到許多因子調控,例如酸驗值、基 質狀況、真菌的新陳代謝等等。由分析真菌產生的漆酶及 其基因序列可以觀察到一個普遍的現象,僅管在功能上具 有多樣性的漆酶,往往在其基因序列上只有些微差異。、 漆酶是一種可以在前處理過程中降解木質素的酵 201028474
TW4724PA 素用以增加纖維水解酵素接觸到植物纖維的機率。在將 f貝纖維素Μ過生物轉化變成可醋酵糖類的前處理過程 中’由木質素降解過程中衍生的紛類化合物會抑制在後續 (Saccharomyces cerevisiae)^j ^ 長然而’以漆酶處理減少發酵混合物中的盼類化合物之 後’酵母菌的生質能以及酒精產量則會增加(J0nss〇n封 al_’ 1998, Larsson et al·, 2001; Larsson et al·,1999)。這 些研究顯示漆酶不只可以在前處理過程中降解木質素,還 可以在後續酒精醱酵過程中去除抑制物的毒性。 —漆酶可以廣泛地應用於各種工業,再加上目前研究者 飞選出的漆麵基因的表現活性仍然有限,因此尋找高活性 之漆酶及編碼其之核苷酸序列實屬本技術領域的重要課 題。 【發明内容】 本發明係有關於一種具有漆酶活性的蛋白質、編碼其 之單離核酸、包含該單離核酸的载體、包含該載體的轉型 株以及生產漆酶的方法。 根據本發明之目的’提出·一種早離核酸,包含核:g:酸 序列SEQ id NO : 1或核苷酸序列SEQ ID NO : 3。 根據本發明之目的,又提出一種單離核酸,其編碼下 列蛋白質(a)或(b) : (a)—種由胺基酸序列SEQ丨D NO : 2 所構成之蛋白質;(b)—種界定於(a)之胺基酸序列其中一 或夕個胺基酸被取代、刪除、插入或添加後所衍生具有漆 201028474 1 γν·»/^ηι rx 酶活性之蛋白質。 其係由上述 根據本發明之目的,再提出一種蛋白質 單離核酸所編碼之蛋白質。 其包含上述單 根據本發明之目的,另提出一種載體, 離核酸。 根據本發明之目的,另提出一種轉型株, 之載體。 、包3上μ
根據本發明之目的’另提出一種生產漆酶的方法,包 括:將具有前述單離核酸的一細胞,於漆酶可適告表現的 條件下培養於一培養基質中;以及由該培養基質^收集具 有漆酶活性之蛋白質。 為讓本發明之上述内容能更明顯易懂,下文^寺舉/較 佳實施例’並配合所附圖式,作詳細說明如下. 【實施方式】 根據L_-L· Kiiskinen的方法’在馬铃薯翁灶a m 香匍萄糖瓊脂 髎(Potato Dextrose Agar, PDA)固體培養基内添加 〇 〇4% RBBR(Remazol Brilliant Blue R)或岡丨J果紅(Congo red)指 示劑,用以初步篩選出可以產生漆酶的真菌(L__L. Kiiskinen,2004)。將真菌在3CTC下培養5-7天後,可以 產生漆酶的菌體周圍將會出現一個清楚的透明環。透明環 尺寸較大的菌株,表示其活性較高或是產量較大。在篩選 的過程中發現,在同樣的培養條件下本土的白腐真菌—小 孔硬孔菌(尺爪⑴s)產生的透明環尺寸最 201028474
TW4/24PA 大,因此,本研究將進一步地探討本株小孔硬孔菌體的漆 酶之蛋白質特性、基因序列及其推得之胺基酸序列。 篩選出透明環尺寸最大的菌株,大量培養並透過精製 或分離流程取得數量充足的蛋白質。例如是利用溶解性差 異的鹽沈版法或溶媒沈殿法、利用分子量差異的透析法、 過濾法、凝膠過濾法或SDS-PAGE電泳法方法、利用電 荷差異的離子交換層析法、利用疏水性差異的疏水層析法 或逆向層析法方法、利用等點電差異的等電點電泳法等 等。在本發明中,僅透過簡單的鹽沈澱法、透析法與濃縮 步驟即取得足量蛋白質。純化後之蛋白質經分析顯示,分 子量為55kDa,等電點為3.98。 核酸(nucleic acid)包含核糖核酸(RNA)以及去氧核 糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA),去氧核糖核酸包 括互補去氧核糖核酸(cDNA),基因體去氧核糖核酸 (genomic DNA)以及化學合成或修飾的去氧核糖核酸。核 酸可肖b疋雙股或早股’早股核酸可能為正義(sense strand) 反義(antisense)。单離核酸(isolated nucleic acid)為一段 核酸嵌入非自然序列中,例如是載體、病毒、非同源體染 色體或任思插入同源體染色體内。因此,核酸序列可能不 包括或包括部分或全部的5’端非編碼區序列(例如是啟動 子)。因此’單離核酸包括重組核酸,重組去氧核糖核酸 (recombinant DNA)可以是將核酸插入可自行複製的載體 或病毒,或是插入原核或真核生物的體染色體内,或者是 以分離分子的形式存在(例如是cDNA,genomic DNA片段 201028474 ί * t · I * Λ. Λ %. 以PCR增幅或以限制酶處理)。單離核酸也包括重組基 因,包含編碼其他蛋白質序列的重組的DNA或RNA。此 外’單離核酸也包括在自然界中不存在以及無法單獨以片 段存在的核酸分子。 一般來說,在單離編碼某一特定蛋白質之基因時,會 先決定蛋白質之部分胺基酸序列,然後用簡併密碼子組成 之混合养核苷酸作為探針,自基因庫單離目標基因,最後 利用公知方法(如自動鹼基序列決定器)取得全序列。本發 • 明之編碼漆酶的基因係由後述實驗步驟被選殖出來,並以 全長序列SEQ ID NO : 1以及cDNA序列SEQ |D N〇 : 3 為具體實施例。本技術領域具有通常知識者當可明瞭本發 明並不限定於此’編碼漆酶的核酸片段較佳地是從硬孔菌 屬(R/gf/doponys sp.)真菌中選殖出來,更佳的是從寄存於 生物資源保存及研究中心之小孔硬孔菌(寄存編號為 巳0^〇35318)獲取阳1^八建立〇0^基因庫,並由其中 單離得到’詳細作法請參照分子選殖:實驗手冊(Sambrook, ® Maniatis et al·,Cold Spring Harbour Laboratory
Press(1989))等記載之方法。此外,本發明之編碼漆酶之 核酸除了包含SEQ ID NO : 1以及SEQ ID NO : 3所示之 核苷酸序列外,亦包括僅是在簡併密碼子上不同但仍編碼 同一蛋白質之簡併異性體。 編碼含有等價胺基酸序列之核苷酸序列可利用部位 特異性突變誘發法(如:Kunkel法或缺口雙倍體等)製得, 例如是利用部位特異性突變誘發法導入變異用之套組 201028474
l W4724PA it P二克拉公司的突變體-K或突變體_G套組)或者使用 LAPCR試管内突變誘發系列套組導入變異。 —旦編碼漆酶之核苷酸序列(如SEQ ID N〇:1以及 SEQlDN〇: 3所示)已確立,特別是第176號至第2400 酸序列被確立’熟悉此技藝可藉由化學合成以開 =碼區5,端及3,端之核純序列作為引子且以體染色體 ID =版進行PCR、或者以序列SEQ |D N〇:]以及s£q 之核心探針進行雜交等公知方式,以得到編碼漆酶 i孩甘酸序列。 八I f得Μ的是’本技術職具有通常知識者亦可根據 刀于選殖:實驗手冊(Samb「〇〇k,Maniatjs et a| c〇|d SP^ng Harbour Laboratory Press(1989))f 舻他公知方法將本發明之編碼漆酶的核苷酸序列插入載 (/、··表現載體)内,然後將載體導入宿主細胞,目標基 本=Γ在佰主細胞内複製及表現使得宿主細胞可以生產 知乃之漆酶。
另一方面,將全長的核苷酸序列與cDNA比對之後可 丨 基酸序列SEQ ID N〇 : 2 ’本發明之漆酶包括s£Q 2所示之胺基酸序列或者含有其等價序列之多胜 ^等價序列係指在啦❿⑽^所示之胺基酸序列中 > 一個胺基酸被取代、刪除、插入或添加後所衍生仍且 =酶活性之蛋白質,且與SEqidn〇:2所示之胺基酸 户歹〗之蛋白質在相同條件下維持大約相同的活性。本技術 7貝域具有通常知識者在參酌胺基酸序列SEQ ID NO : 2後 201028474 1 W4* /ΖΗΓ/Λ. 可毫無困難的選殖或製造出等價序列。 再者,申請人另揭露本發明之漆酶的受質動力學參 數、電泳圖譜、最適酸驗度、安定酸驗度、最適溫度範圍、 抑制因子、分子量、等電點等特徵,藉由此些物理化學特 徵可以更為清楚明白的定義本發明之漆酶。 以下係舉出幾組具體實施例並配合圖表詳細說明,然 而本技術領域具有通常知識者當可明瞭此些實施例僅為 本發明之發明精神下的幾種實施方式,本發明並不限定於 • 此些文字、圖示及序列,本發明之欲保護範圍當以申請專 利範圍揭露内容為準。 實施例1 一菌體培養 本實驗選用之小孔硬孔菌(尺/fif/c/oport/s m/croporws) 購自台灣新竹的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center)(寄存編號為 BCRC 35318)。生產漆酶時所用的基礎培養基每公升包括10g ⑩ 葡萄糖(glucose)、 0.22g 酒石酸銨(ammonium tartrate)、 0.9g磷酸氫二鉀(K2HPO4)、0.1g磷酸二氫鉀 (KH2P〇4)、〇.〇5g 含水硫酸鎂(MgSO4*7H2O)、0.5g 氣 化鈣(CaCI2)、0.01g 鹽酸噻胺(Thiamine HCI)以及 10ml 微量元素溶液(trace elements solution),每公升微量元素 溶液包括 0.08g CuS04 · 5H2〇、〇 〇7g MnS04 · 4H20、 4.3g ZnS04 · 7H2〇 以及 〇 〇5g FeSCU · 7H20。培養基的 酸鹼度調整至pH 6。將菌體培養於PDA培養基上八天後’ 201028474
1 W4724FA 取五個佈滿菌絲的培養基小塊圓盤(直徑約8mm)接種於 250ml的錐形瓶内,錐形瓶内備有50m丨基礎培養基,在 某些實驗會添加誘導劑,最後置於30°c且轉速為125rpm 的旋轉震盪器内培養,並定期取樣做酵素活性測試。 實施例2—蛋白質活性測試
漆酶活性測定方法如下所述。以ABTS (2,2-azinobis(3-ethylbenzathiazoline-6-sulf〇nic acid))或 SGZ(N,N,-bis(3,5-dimethoxy-4-hydroxybenzylidene) hydrazine, Syringaldazine)作為受質,每毫升反應液中包 括 0.5 ml ABTS(2mM)或 0.5 ml SGZ(1 mM)、0.49ml 缓衝 液(50mM)及〇.〇1ml酵素溶液,反應過後以分光光度計測 量受質殘留量,用以計算酵素活性。每單位活性(Unit, U) 定義為每分鐘可分解ΙμιτιοΙ受質的能力。 實施例3—不同化合物對漆酶產量的影響 為了提高漆酶產量,本實驗於基礎培養基内加入各種 不同的化合物,例如:藜蘆醇(veratryl alcohol)、4-經苯 甲酸(4-hydroxybenzoic acid)、阿魏酸(ferulic acid)或稻米 粉末(rice straw) ’用以測試何種化合物可以較為有效地增 加漆酶產量。實驗結果請參照第1圖,當培養基中添加4_ 經笨甲酸時,可有效誘導菌體產生大量的漆酶,相較於沒 有添加任何誘導劑的培養基,將菌體培養於添加4-經苯甲 酸的培養基可以產生的漆酶數量高達10.5倍。其他誘導 201028474 I 零, e 9 Λ λ λ 劑也可以不同程度地增進漆酶產量,稻米粉末可以提高8 倍漆酶產量,藜蘆醇可以提高3 4倍漆酶產量,阿魏酸則 可以提高2.4倍的漆酶產量。 實施例4—蛋白質純化 用過滤設備(Nalgene過據器以及滤液接收器)及孔徑 為55mm與0_45Mm的濾紙(臈)將培養液過濾,收集 200ml的培養上清液之後’以伽%硫酸銨沈澱,並重新 • 懸浮於40ml的醋酸鈉緩衝液(10mM,pH6)中。將上述酵 素溶液裝入透析袋内,以4公升醋酸鈉緩衝液(10 mM, pH 6)透析整夜,藉此去除硫酸銨。酵素溶液以濃縮過濾離心 管濃縮至4ml,(搭配分子量限制為1〇 kDa 超濾膜,兩者 皆購自美國Amicon公司),濃縮過後的蛋白質溶液活性達 289.8 U/m卜回收率為55%。所有的蛋白質純化步驟都是 在4°C下操作。 ❹ 實施例5—蛋白質膠體電泳以及膠體内活性分析 根據Laemmli的操作步驟,將濃縮後的蛋白質溶液 經十二烧基硫酸納·聚丙稀酿胺膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate polyscrylamide gel electrphoresis, SDS-PAGE) 分析’用以決定漆酶分子量及其活性。濃縮後的漆酶溶液 先以樣品緩衝液處理,樣品緩衝液包括1% SDS及2.56 %2-酼基乙醇(2- mercaptorthanol,2-ME),在 100°c 下加 熱 3 分鐘,SDS-PAGE 以 0.1%coomassie blue 溶液染 11 201028474 色。另外,將原態-聚丙烯醯胺膠體電(natjve_pAGE)在室 溫下浸泡在ABTS(1mM,PH 3)料巾,藉此敎膠體内漆 酶活性。 SDS -PAGE結果顯示在膠體上只有一個主要條帶 (band)’其分子量約為55kDa(請參照第&圖),估計盆代 表純度大約為90% 〇ABTS覆蓋染色實驗結果顯示在原態 PAGE上存在單-個具有漆酶活性條帶(請參照第2b圖之 齡2) ’經過coomassie blue染色之後在相同位置也出 現-個主要的蛋白質條帶(請參照第2b圖之搁位υ。三項春 實驗結果說明了在培養液中的主要蛋白質為漆酶。 實施例6—等電點 濃縮後的漆酶被裝填入聚丙烯醯胺膠體等電聚膠電 泳(isoelectric focusing- polyscrylamide gel electrphoresis,IEF-PAGE)的膠體内,操作的酸驗度梯度 介於pH3至pH9之間(Phastgel gradient),操作設備為 GE Healthcare公司的儀器PhastSystem。請參照第3圖 ❹ 的電泳結果,以PhastGel Blue R染色呈現—個蛋白質條 帶,與p/ marker比對之後估計本實驗之漆酶的等電點約 為 3.98。 實施例7—漆酶基因之選殖 將上述經特性分析為漆酶的蛋白質交由明欣生物科 技公司(台北,台灣)執行蛋白質N端定序,其鐘定出n端 12 201028474 的九個胺基酸序列為SVGPVADIP。 接著’利用逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription-Polymerase chain reaction, RT-PCR)單離 cDNA。真菌培養於添加誘導劑的基礎培養基,八天後收 集菌絲體並以Bio-Rad tota丨RNA mini kit抽取總核酸 (total RNA)。總核酸為模版,RT_p〇lyT作為引子(primer), 將總核酸逆轉錄為互補去氧核糖核酸(cDNA)。逆轉錄反應 液包括20 μΜ引子以及2 pg總核酸(total RNA)為模版, ❹ 反應溫度為42°C,反應時間為1小時。為了取得編碼漆酶 的cDNA,根據N端胺基酸序列GPVADIP設計出簡併引 子(degenerate primer)Lcc35-2,連同引子 RT_anchor,進 行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)。 PCR反應液中包括10μΜ引子及2μ丨逆轉錄產物作為模 版,並以下述溫度條件循環35次:DNA模版分離溫度 (denaturatj〇n)94°C3 分鐘,引子結合溫度(annealing)58 °C 1分鐘’引子延長(extension)溫度72°C 5分鐘》最後, ⑩ 從電泳結果觀察到PCR反應後得到單一個條帶(band), 長度大約為17〇〇bp的DNA分子。 之後,應用反向聚合酶鍵式反應(inverse PCR)選殖 出編碼漆酶的全長基因序列。使用Promega公司的產品 Wizard Genomic DNA purification kit 抽取染色體去氧核 糖核酸(genomic DNA),使用限制酶部分將其切 成片段,加入DNA連接酶(Τ4 DNA ligase,Promega)在 15°C反應18小時’讓切開的去氧核糖核酸片段的兩端自 13 201028474
i w^/z^rA 己黏合在一起。以1 μ丨黏合的去氧核糖核酸片段做為模 版’取 15pMLcc35inverse一5’ 引子以及 Lcc35inverse_3, 引子進行PCR。PCR反應以下述溫度條件循環35次:DNA 模版分離溫度(denaturation)94°C3分鐘、引子結合溫度 (annealing)55°C1 分鐘,引子延長(extension)溫度 72°C5 分鐘,35次循環結束之後再以72°C加熱1〇分鐘。最後, 從電泳結果觀察到PCR反應後得到單一個條帶(band), 長度大約為1700bp的DNA分子。上述RT-PCR、PCR 與inverted-PCR使用的引子序列係列於下表。 引子 序列 RT—polyT ggttcttgccacagtcacgacttttttttttttttttt RT anchor ggttcttgccacagtcacgac Lcc35-2 ggcccngtngcngayathcc Lcc35inverse_5' actcgtaccactgttctcgcaggtggaac Lcc35inverse_3, gaaaccatctggagagaggttagcgttg 漆酶基因的染色體DNA(genomic DNA)全長為2222 個驗基對(base pairs, bp),揭示於SEQ ID NO : 1核苷酸 序列中第176號至第2400號鹼基對。本實驗之漆酶基因 命名為 /cc35 (EMBL/GenBank no. FJ002275),蛋白質命 名為Lcc35。/cc35 cDNA(漆酶基因的互補核甘酸分子)全 長為1545 bp,揭示於SEQ ID NO : 3核苷酸序列中第1 201028474 1 νν τ / ζ,-ri η. 號至第1545號鹼基對。/cc35 cDNA編碼的蛋白質具有 515個胺基酸,揭示於SEQ ID NO : 2,其中包括21個胺 基酸構成的訊息胜肽(signal peptide),以及494個胺基酸 構成的成熟形式的蛋白質。/cc35 cDNA與全長的/CC35染 色體DNA比對結果顯示,全長的/cc35染色體DNA序列 包括13段表現序列.(exon)以及12個插入序列(jntron)。 鹼基對的數量分別介於56-200 bp以及50-71 bp之間, 所有的表現序列與插入序列的剪接點均符合GT-AG法 則,全長的/cc35核苷酸序列與推得的胺基酸序列共同列 於第4A-4C圖。
Lcc35漆酶蛋白質包括5個可能的醣化區域 (Asn-X,Ser/Thr) (Gavel and Heijne,1990),分別位於第 35、154、162、228及452個推定的胺基酸上。與NCBI 資料庫裡的其他漆酶蛋白質比對,Lcc35可能含有兩個雙 硫架橋:分別為 Cys106-Cys504 以及 Cys138-Cys225。 ❿ Cys469為配位子(ligand),可以結合至單核形-1銅離子結 構域的中心(mononuclear trype-1 copper domain center)(請參照第4圖)。經過NCBI資料庫的BLAST 比對結果顯示,本實施例演繹的胺基酸序列SEQ ID NO : 2 為新穎的。最近似 R A7?/c/O/?orus laccase (EMBL/GenBank database accession no. AA038869)的胺基酸序列相似度 (identity)只有 73%,同源性(homology)為 84%。除了序 列不同之外,漆酶(EMBLNo. AA038869)的各項蛋白質性 15 201028474 1 W4 UWPl 質也與本實施例不同。根據期刊内容趣_ AA038869)的最適酸驗度範圍與本* $ ’漆酶(EMBLN〇· 、 莱不同,以重组蛋白質 (recombinant protein)形式生產漆酶 '、 、 9.6 U/m卜❿*較佳實施例之漆酶的狀^下活性只有 protein)形式測量時活性則已經具古、粗萃蛋白(crude ......D. . . . βο /οχ ^ 1〇·5 U/ml (ΑρρΙ.
Microbiol. Biotechnol. 63 (2),174-ίq一 (2003))。由 基因推得的胺基酸序列與其他漆酿& )} ® 啊序列的比對结果以演 化樹(phylogenetic tree)的形式表示 。訂…禾以决 %第5圖。 實施例8—最適溫度與酸鹼度及兩者對於對& 響 '、於 穩定度的影 ❹ 在pH 2至pH 8酸鹼度範圍内,? ^ 25匚至90。(:溫度範 圍内測量漆酶活性’找出活性最佳的操作溫度與酸驗度。 分別以下列酸驗度範圍各不相同的溶液甘氨酸鹽酸(pH 2 - pH 3)、醋酸鈉(pH 4 _ pH 6)以及磷酸鈉(pH 7 _ pH 8) 作為反應緩衝液,反應前後以分光光度計分別測量〇d42〇 (ABTS)以及OD53〇 (SGZ),計算酵素活性。另外,為了測 ❿ 定酵素在最適酸鹼度下的穩定性,將酵素濃縮液在個別不 同酸鹼度與30°C下混合反應20小時後’再將酵素置於最 適酸鹼度的環境下測量活性,並與為處理過的酵素活性比 較其殘留活性。測定酵素熱穩定性的方法則是將酵素溶液 在30°C至70°C之間加熱10分鐘、30分鐘以及6〇分鐘之 後,測量殘留的酵素活性。
以ABTS為受質時,漆酶最適酸鹼度為pH 5;以SGZ 16 201028474
1 WH 與人造木質素為受質時,漆酶最適酸驗度為pH 6(請參照 第6a圖)。以ABTS測定酵素活性時,再次確認其最適酸 驗度為pH 5(請參照第6b圖)。j_cc35漆酶在pH 6.0與30 C處理21小時,展現相當高的穩定度(請參照第7圖)。雖 然Lcc35漆酶在酸驗度pH6的環境下具有很高的穩定 度,但是分解不同受質時酵素的最適酸鹼度是不同的。 本實驗操作在酸驗度為PH5的環境下,分別測試酵 素於20 C〜90 C各溫度條件下的活性,以溫度7〇〇c時的 ❹活性最高(請參照第8圖)。當酵素在不同溫度條件下分別 靜置10、30、60分鐘之後,靜置於5〇。〇以下的漆酶都很 穩定’但是當溫度超過6『c時,酵素穩定度則驟降(請參 照第9圖)。因此’若兼顧穩定度與活性兩項參數,本實施 例之Lcc35漆酶較佳的操作溫度係低於,更佳的是 操作於40°C〜50。(:。 實施例9一酵素動力性質 漆轉的初始反應速率測定條件:溫度70°C, 酸驗度為pH5.Q(雙質為ABTs)pH6 Q(受質為sGZ)。酵素 活性與受質濃度的關係屬於MichaeNs Menten _模 式酵素對於又質SG2 # Km值比較小,只有酵素對於 Z ABTS士的Km值的七分之一,表示心35漆酶對於木 μ 1目。近二構的文質(e.g.SGZ)具有高度的親和力(請參 照第1 〇圖)。 17 201028474 ·
1 W4/^4FA 實施例10—抑制活性
NaN3、EDTA、DTT 以及 L-cysteine 分別與 icc35 漆酶在30 C下共培養10分鐘。以ABTS為受質,反應緩 衝液之酸驗度為pH 5且包含上述化合物,測定酵素活性。 第11圖列出各種選定的化合物對於I_cc35漆酶活性 的影響’特別是觀察此些化合物對於酵素活性是否產生抑 制效果。只有乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA;屬於一種金屬離子螯合物)沒有任何的抑制效 果,對於其他的化合物,L-半胱氨酸(L-cysteine)及二硫蘇 ❹ 糖醇(1,4-小化丨〇比阳^〇丨,0丁丁)只有輕微的抑制效果,而疊 氮化鈉(sodium azide)則可以強烈地抑制漆酶活性。 一般用於生質能源產業的水解木纖維質酵素的工作 溫度介於40-5CTC且酸鹼度介於pH 5.0〜6.0。綜合上述 蛋白質活性測試結果顯示,本發明提出之Lcc35漆酶蛋白 質可以適應上述的工作環境,且可以分解或修飾各種不同 的受質(包括ABTS、RBBR、剛果紅、人造木質素以及 SGZ) 〇 相較於 τ厂ameies vers/co/or 的漆酶(commercial ® enzyme, Fluka co.),本實施例之Lcc35漆酶蛋白質對於 受質ABTS以及SGZ都展現大約2-3倍的高分解活性(請 參照第12圖)。因此,本實施例之Lcc35漆酶蛋白質具有 極高的潛力應用於生質能源產業及其他產業。 產業上利用之可能性 漆酶是一種含有銅離子的氧化還原酵素,對於酚類物 18 201028474 質與木質素具有古 包含生物、環^度降解能力。漆酶應用範_當廣泛, 等方面領域。在、樹脂材料、化學材料、物理材料、醫战 種類繁多’使:生出的原; ’進而,壤境造成相當大的衝擊。漆C與 =利:::水與廢棄物的毒性。在造紙:¾ 不但可有效提^仃生物4理來取代1^污染的化學⑼ 在生質能源ίΐ的品質’也可降低對環境的衝擊, ;降在原料前:理::可==::,序 高醱酵產物之生產量。在食σ工業中,^抑制物來提 可除,匕合物的干擾,進而提高食二品;於果汁中 ❹ 核酸、活性的蛋白質、^漆酶的單離 有及早離核酸之栽體、含有該載 這生產方法。本技術領域具有通常知識者可以Γ以及 2露内容及公知實驗知識輕易地 根據上 標基因可以在内’㈣體導μ主細胞,讓目 生產大*且高活性漆::宿主細_ 織工業,業、食品4=:的卓,業、紡 19 201028474 1 WH /ΖΗΓ/\ 綜上所述,雖然本發明已以一較佳實施例揭露如上, 然其並非用以限定本發明。本發明所屬技術領域中具有通 常知識者,在不脫離本發明之精神和範圍内,當可作各種 之更動與潤飾。因此,本發明之保護範圍當視後附之申請 專利範圍所界定者為準。
20 201028474 【圖式簡單說明】 第1圖列出於基礎培養基加入不同誘導劑對漆酶產 量的影響。 第2圖為本發明一較佳實施例之|_CC35漆酶之(a)十 二烧基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)結果及 (b)ABTS覆蓋染色結果;M :蛋白質分子量標誌,在(⑴及 (b)中之攔位1皆代表由小孔硬孔菌R /77/croponysBCRC 35318分泌之濃縮漆酶;在(b)中之攔位2代表上述欄位1 • 之濃縮漆酶,並以1mM ABTS作為活性染劑。 第3圖為小孔硬孔菌尺·⑺/c/Ojoort/s BCRC 35318培 養液之濃縮上清液的等電聚膠電泳結果,操作的酸鹼度梯 度介於pH3至pH9之間(Phastgel gradient),操作設備為 GE Healthcare公司的儀器phastSystem,電泳膝體以 PhastGel Blue R染色;μ :各種等電點蛋白質標誌。 第4Α-4Β圖為本發明一較佳實施例之尺 BCRC 35318 /cc35基因的體染色體核苷酸序列與演繹的 ⑩胺基酸序列’訊息胜肽以灰色區塊標示,插入序列以小寫 字母表示’可能醣化區域以底線標示。數字(1, 2, 3)分別 代表出三種不同的銅離子結合形式且標示於結合的胺基 酸下方’其他與酵素活性相關的胺基酸以黑底白字標示。 第5圖為本發明一較佳實施例之Lcc35漆酶與其他 真菌之漆酶的演化關係,以(:;1_113丁八1_程式(1\/1日〇八4)進行 分析。
第6圖為本發明一較佳實施例之|_cc35漆酶於30〇C 27 201028474 ' * 1 WH/z^r^ 下之最適酸鹼度測試結果(a)以不同受質進行反應ABTS #; SGZ ▲及人造木質素▼ (b)以RBBR脫色狀況為測量 指標。 第7圖為不同酸鹼度(30°C處理20小時)對Lcc35漆 酶活性的影響。 第8圖為本發明一較佳實施例之Lcc35漆酶於不同 操作溫度下的活性表現。 第9圖為不同溫度(處理至多1小時)對Lcc35漆酶穩 定度的影響,·,30°C;〇,4CTC; ▼,50°C; △,60°C; ,❿ 70°C。 第10圖說明本發明一較佳實施例之Lcc35漆酶的受 質動力學參數。 第11圖列出不同化合物對於Lcc35漆酶活性的抑制 效果。 第12圖為Lcc35漆酶與市售漆酶活性之比較。 【主要元件符號說明】 Ο 無 28
201028474 序列表 <110>中央研究院 <120具有漆酶活性的蛋白質及其編碼單離核酸 <140>(本案申請案號) <141>(本案申請曰) <160>3 <170> Patentln Version 2.0 <210> 1
® <211〉2606 <212>DNA <213> '丨、孔硬孔菌(Higidoporus microporus) <220〉 <221>CDS <222> (176)...(2400) <223>包含編碼漆酶的單離核酸 <400> 1 gatcctagca tggttccttc ctctcccaaa catgtcgttc ccaattcata ccaagttgta cttgcacaac tggcattgat ggcgcacgta taagagggat ggggtgtgaa tccgtctccc tcatcccgct tcttcaactc gggctactcc attgcattcg accaccagtt gagacatgcc ttctttctca accctctctg cctttgtgac tgtcgccctc gctcttgggg catttgcctc cgtcgggccc gtggctgaca ttcccattgt caacgctaac ctctctccag atggtttcac tcgtaccact gttctcgcag gtggaacctt ccctggaccc ctcatcgtcg gaaataaggt cggtccatat gaccgctact ttcctcagga gaaattttga cttcttgcgc gcacagggcg ataacttcaa acttaatgtc gtagaccaac tcaccgatgc caatcaactg aagaccacaa ccattgtagg ttttgcattg ttccctcagc ttcgtgtctc atttcctctc gttagcactg gcacggtttc ttccgacacg gcaccaactg ggcggatggg cccgcattcg taaaccagtg cccgatcgct tctggtaact ccttcttgta cgatttctcc gctgccgacc aagctggtaa gtctggcaca atgccagagc cgaggtaggc aagccgagct gaccatcttc acacaggcac 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 21 720 201028474 i
❹ attctggtac cacagtcatc tttcgacgca gtactgcgat ggtttgcgtg gggccttcgt 780 ggtgtacgat cccagtgacc ccaatgcgag cttgtatgac gtcgataatg gtacgaactt 840 ttcttcatac cccttcccga acaccgttga ccgtccatac ttcttttcag agagcactga 900 tattaccctt gcggattggt atcacacctt ggcacggttg ggtgctaggt tcccgtgagt 960 cacatgttcg cgttcccctg tggtttatgt cattcatcat tcttttccca ggactcctga 1020 ctcaactttg atcaatggcc tcgggcggtt tgctggagga cctgcttcgg acttgtccgt 1080 cattactgtg gaatcgggta aacggtatgt ttatgatgtg taccttgaac acaaaataag 1140 cattgattca acccatcctt tcttacctca tttagatatc gtttccgtct tgtatccatc 1200 tcttgcgatc ccaattatac attctccatt gatggtcacg acatgacaat cattgaagtc 1260 gatggtatta accacgacgc attgtctgtt gattcgatcc aaatattcgc cggtcaacgg 1320 tactccttcg tggtatgtcc cccacgctcc cttcataact ctcttattca catgatcatt 1380 ctcagctcaa tgcaaaccaa gccgtgggca actactggat ccgcgccaac cccaacatcg 1440 gtaccagagg gttctcgggc ggcattaact cggccattct ccgatatgtc ggtgccgacg 1500 cagtcgaacc cacaacttct caaggtacca gcaccaaacc tctcgtcgaa accaacttgc 1560 atcccagcca aaacccgggt gctgtaagtc ccaagcgtta tctccttgtt ttcggaagtc 1620 ctcatctatt gttttgtagg tcgggtctcc cactccaggt ggtgtcgacc ttgctttgaa 1680 cttggccctt ggattcgtac gtacacattt tatccagttc ctggatgtgt tcctcatctt 1740 ccgtttaggc cggaggatca ttcaccatca acggcgctac cttcacttct cccaccgttc 1800 ctgtccttct ccaaattctc agtggtgcac aatcagcgac agatttgctt ccgtcaggca 1860 gtgtcttcac tcttccagga gattctacca tcgagatcag catgcctgct ggtgtcgctg 1920 gtggtcccca tcccttccac ttgcatggtg taggtccctc aattattcat acttcctaat 1980 gctcacgaat ccttctccag cacgctttcg acgtcgttcg cgcctccggt agctcaactt 2040 acaactacgc taatcctgtt cgccgtgatg ttgtctccct tggtgccgct ggtgacaatg 2100 ttacgatcag attcaaggta agctgataga tggatcctcg ggtggcttcg cttgctggcg 2160 aagtgagcag accgacaacc cgggaccttg gttcctccat tgtcacattg actggcatct 2220 cgaagccgga ttggccattg tctttgctga agacacgccc aacactgccg cgataaaccc 2280 agttccacgt acgttccgtt ttaccgagcg cacgttcttc tctcattgtt tacttctccc 2340 acagaggctt ggagtgacct gtgccccatc tataatgctc ttgctgagtc tgatcattaa 2400 atcagaagaa caagggttac agacgagaca aggactaaaa tgaataccta ctctctcctt 2460 gcgattctat ctattcttct atttactctt tatctttttg gttttgacca actgtggaaa 2520 22 201028474 1 W*t /Ζ-ΗΓΛ. 2580 2606 ttggtcatgc aatttttctt gtctcgaaat cggaacaatg tgtaagtagc tacttgaaat gaaaatcctg tccagaatgt tgcact
<210>2 <211>515 <212〉PRT <213>小孔硬孔菌(/mcrcipoms) <220〉 <221>PEPTIDE <222> (1)...(494)
<223>漆酶的訊息胜肽及成熟蛋白質的胺基酸序列 <400> 2
Met Pro Ser Phe Ser Thr Leu Ser Ala Phe Val Thr Val Ala Leu Ala -20 —15 -10
Leu Gly Ala Phe Ala Ser Val Gly Pro Val Ala Asp lie Pro lie Val -5 -11 5 10
Asn Ala Asn Leu Ser Pro Asp Gly Phe Thr Arg Thr Thr Val Leu Ala 15 20 25
Gly Gly Thr Phe Pro Gly Pro Leu lie Val Gly Asn Lys Gly Asp Asn 30 35 40
Phe Lys Leu Asn Val Val Asp Gin Leu Thr Asp Ala Asn Gin Leu Lys 45 50 55
Thr Thr Thr lie His Trp His Gly Phe Phe Arg His Gly Thr Asn Trp 60 65 70 75
Ala Asp Gly Pro Ala Phe Val Asn Gin Cys Pro lie Ala Ser Gly Asn 80 85 90
Ser Phe Leu Tyr Asp Phe Ser Ala Ala Asp Gin Ala Gly Thr Phe Trp 95 100 105
Tyr His Ser His Leu Ser Thr Gin Tyr Cys Asp Gly Leu Arg Gly Ala 110 115 120
Phe Val Val Tyr Asp Pro Ser Asp Pro Asn Ala Ser Leu Tyr Asp Val 125 130 135
Asp Asn Glu Ser Thr Asp lie Thr Leu Ala Asp Trp Tyr His Thr Leu 140 145 150 155
Ala Arg Leu Gly Ala Arg Phe Pro Thr Pro Asp Ser Thr Leu lie Asn 160 165 170 23 201028474 1 W^l IZWPl
Gly Leu Gly Arg Phe Ala Gly Gly Pro Ala Ser Asp Leu Ser Val lie 175 180 185
Thr Val Glu Ser Gly Lys Arg Tyr Arg Phe Arg Leu Val Ser lie Ser 190 195 200
Cys Asp Pro Asn Tyr Thr Phe Ser lie Asp Gly His Asp Met Thr lie 205 210 215 lie Glu Val Asp Gly lie Asn His Asp Ala Leu Ser Val Asp Ser lie 220 225 230 235
Gin lie Phe Ala Gly Gin Arg Tyr Ser Phe Val Leu Asn Ala Asn Gin 240 245 250
Ala Val Gly Asn Tyr Trp lie Arg Ala Asn Pro Asn lie Gly Thr Arg 255 260 265
Gly Phe Ser Gly Gly lie Asn Ser Ala lie Leu Arg Tyr Val Gly Ala 270 275 280
Asp Ala Val Glu Pro Thr Thr Ser Gin Gly Thr Ser Thr Lys Pro Leu 285 290 295
Val Glu Thr Asn Leu His Pro Ser Gin Asn Pro Gly Ala Val Gly Ser 300 305 310 315
Pro Thr Pro Gly Gly Val Asp Leu Ala Leu Asn Leu Ala Leu Gly Phe 320 325 330
Ala Gly Gly Ser Phe Thr lie Asn Gly Ala Thr Phe Thr Ser Pro Thr 335 340 345
Val Pro Val Leu Leu Gin lie Leu Ser Gly Ala Gin Ser Ala Thr Asp 350 355 360
Leu Leu Pro Ser Gly Ser Val Phe Thr Leu Pro Gly Asp Ser Thr lie 365 370 375
Glu lie Ser Met Pro Ala Gly Val Ala Gly Gly Pro His Pro Phe His 380 385 390 395
Leu His Gly His Ala Phe Asp Val Val Arg Ala Ser Gly Ser Ser Thr 400 405 410
Tyr Asn Tyr Ala Asn Pro Val Arg Arg Asp Val Val Ser Leu Gly Ala 415 420 425
Ala Gly Asp Asn Val Thr lie Arg Phe Lys Thr Asp Asn Pro Gly Pro 430 435 440
Trp Phe Leu His Cys His lie Asp Trp His Leu Glu Ala Gly Leu Ala 445 450 455 lie Val Phe Ala Glu Asp Thr Pro Asn Thr Ala Ala lie Asn Pro Val 460 465 470 475
Pro Gin Ala Trp Ser Asp Leu Cys Pro lie Tyr Asn Ala Leu Ala Glu 24 201028474 480 485 490
Ser Asp His 494
<210>3 <211> 1548 <212〉cDNA <213> 小孔硬孔菌(Rigidoporus microporus) <220> <221>CDS <222> (4)...(1548) <223>包含編碼漆酶的單離核酸
<400〉3 atgccttctt gcctccgtcg ttcactcgta aagggcgata accacaacca gcattcgtaa gccgaccaag ttgcgtgggg gataatgaga gctaggttcc cctgcttcgg gtatccatct attgaagtcg ggtcaacggt gccaacccca tatgtcggtg gtcgaaacca ggtgtcgacc ggcgctacct tctcaaccct ggcccgtggc ccactgttct acttcaaact ttcactggca accagtgccc ctggcacatt ccttcgtggt gcactgatat cgactcctga acttgtccgt cttgcgatcc atggtattaa actccttcgt acatcggtac ccgacgcagt acttgcatcc ttgctttgaa tcacttctcc ctctgccttt tgacattccc cgcaggtgga taatgtcgta cggtttcttc gatcgcttct ctggtaccac gtacgatccc tacccttgcg ctcaactttg cattactgtg caattataca ccacgacgca gctcaatgca cagagggttc cgaacccaca cagccaaaac cttggccctt caccgttcct gtgactgtcg attgtcaacg accttccctg gaccaactca cgacacggca ggtaactcct agtcatcttt agtgacccca gattggtatc atcaatggcc gaatcgggta ttctccattg ttgtctgttg aaccaagccg tcgggcggca acttctcaag ccgggtgctg ggattcgccg gtccttctcc ccctcgctct ctaacctctc gacccctcat ccgatgccaa ccaactgggc tcttgtacga cgacgcagta atgcgagctt acaccttggc tcgggcggtt aacgatatcg atggtcacga attcgatcca tgggcaacta ttaactcggc gtaccagcac tcgggtctcc gaggatcatt aaattctcag tggggcattt tccagatggt cgtcggaaat tcaactgaag ggatgggccc tttctccgct ctgcgatggt gtatgacgtc acggttgggt tgctggagga tttccgtctt catgacaatc aatattcgcc ctggatccgc cattctccgg caaacctctc cactccaggt caccatcaac tggtgcacaa 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 25 201028474 '
1 W4/Z^rA tcagcgacag atttgcttcc gtcaggcagt gtcttcactc ttccaggaga ttctaccatg 1200 agatcagcat gcctgctggt gtcgctggtg gtccccatcc cttccacttg catggtcacc 1260 gctttcgacg tcgttcgcgc ctccggtagc tcaacttaca actacgctaa tcctgttcgc 1320 cgtgatgttg tctcccttgg tgccgctggt gacaatgtta cgatcagatt caagaccgac 1380 aacccgggac cttggttcct ccattgtcac attgactggc atctcgaagc cggattggcc 1440 attgtctttg ctgaagacac gcccaacact gccgcgataa acccagttcc acaggcttgg 1500 agtgacctgt gccccatcta taatgctctt gctgagtctg atcattaa 1548
O 26

Claims (1)

  1. 201028474 A T* -f / Λ,-TL· ί ». 七、申請專利範圍: 1 · 一種單離核酸,包含核苦酸序列SEQ ID NO : 1 或核苷酸序列SEQ ID NO : 3。 2_如申請專利範圍第1項之單離核酸,其中該單離 核酸係分離自硬孔菌屬(R/g/dopoms)之生物。 3.如申請專利範圍第2項之單離核酸,其中該硬子L 菌屬(Rfgidoporus)之主物為小孔硬孔菌(Rig丨doporus microporus) ° • 4. 一種單離核酸,其編碼下列蛋白質(a)或(b): (a) —種由胺基酸序列SEQ ID NO : 2所構成之蛋白 質; (b) —種界定於(a)之胺基酸序列其中一或多個胺基酉楚 被取代、刪除、插入或添加後所衍生具有漆酶活性之蛋自 質。 5·如申請專利範圍第4項之單離核酸,其中該單離 核酸係分離自硬孔菌屬(尺丨g/cfoporus)之生物。 ❹ 6.如申請專利範圍第5項之單離核酸,其中該硬孔 菌屬(β丨gidoporus)之支物為小孔硬孔菌(Rigidoporus microporus) ° 7. —種蛋白質,其係包含下列蛋白質(a)或(b): (a) —種由胺基酸序列SEQ ID NO : 2所構成之蛋白 質; (b) —種界定於(a)之胺基酸序列其中一或多個胺基酸 被取代、刪除、插入或添加後所衍生具有漆酶活性之蛋白 29 201028474 i W^/Z41"A 質。 8. —種蛋白質,其係由核苦酸序列SEQ ID N〇 : 1 或核苷酸序列SEQ ID NO : 3所編碼,且具有漆酶活性。 9. 一種載體’其係包含下列單離核酸(a)、(⑴或(C): (a) —單離核酸,包含核苷酸序列SEQ ID NO : 1或 核苷酸序列SEQ丨D N0 : 3 ; (b) —單離核酸,可編碼成胺基酸序列SEQ ID NO : 2 構成之蛋白質; (c) 一單離核酸,可編碼界定於(b)之胺基酸序列其中 ❹ 一或多個胺基酸被取代、刪除、插入或添加後所衍生具有 漆酶活性之蛋白質。 10. —種轉型株,其包含申請專利範圍第9項之載 體。 11· 一種生產漆酶的方法,包括: 將具有一單離核酸的一細胞,於漆酶可適當表現的條 件下培養於一培養基質中,其中該單離核酸係包含下列單 離核酸(a)、(b)或(c) : Q (a) —單離核酸,包含核苷酸序列SEQ丨D N〇 : j 或核苷酸序列SEQ ID NO : 3 ; (b) -單離核酸’可碥碎由胺基酸序列旧 NO : 2構成之蛋白質; ⑹-單離核酸’可,界定於⑹之胺基酸序列其 中-或多個胺基酸被取代、删除、插入或添加後所衍生具 有漆酶活性之蛋白質;以及 30 201028474 由該培養基質中收集具有漆酶活性之蛋白質。 12.如申請專利範圍第彳彳項所述之方法,其中該細 胞為!孔硬孔函mfcr〇p〇ruS)。 J3·如申請專利範圍第11項所述之方法,其中該細 胞為前述申請專利範圍第10項之轉型株。 14.如申請專利範圍第11項所述之方法,其中該細 胞包括前述申請專利範圍第9項之载體。 15·如申請專利範圍第11項所述之方法更包括: 添加一誘導劑於該培養基質中。 16.如申請專利範圍第11項所述之方法,其中該誘 導劑包括藜蘆醇、4-羥苯曱酸、阿魏酸或稻草粉末其中至 少一者。
    31
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