TW200927921A - Collagen-containing cell carrier - Google Patents

Description

200927921 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明有關於含膠原蛋白的組成物用於培養生物細胞 的用途、一種用於培養生物細胞的方法、一種用於移植生 5 物材料至一生物的方法以及一種用於增進一組成物在它的 適合性方面供培養生物細胞的方法。 【先前技術】 ❹ 用於培養生物細胞的載體在該技藝中通常是已知的。 1〇 此等載體通常被意指為基質(matrix)或支架（scaffold)。這些 載體提供繁殖場(breeding ground)，或一般在細胞培養中細 胞生長於其上的基礎。 含膠原蛋白的化合物代表細胞載體最為被熟知的類 型。膠原蛋白（如同細胞外基質的一種動物蛋白）屬於硬蛋白 15 (scleroproteins)並且通常是水不溶性的以及在結構上是纖 維的（fibrous)。它在結締組織（例如皮膚、血管、韌帶、腱 ❹ 以及軟骨）的結構中，以及在骨與牙齒的結構中是重要成分 之一。因為這些特質，來自生物來源之以膠原蛋白為基礎 的^物材料現今已被用於醫學上達數年。特別在用於止血 的《•床應用產σ口上，作為用於硬腦膜(dura)或整形外科的不 同7貝，的置換中’膠原蛋白本身能夠建立作為-載體材 料。攻今，這些膠原蛋白之中有28種不同類型已被鐘定出 ,至夕種具有似膠原蛋白領域(collagen-like domains) 的額外蛋白質已被紀錄，顯示在獨立物種之間的些微差 3 200927921 異。因為一個區別鑑定，型態尚未被發現並且因為它們的 以酵素為基礎的降解不會產生任何有毒性的降解產物，膠 原蛋白被§忍為疋生物相容的(bi〇c〇mpatible)。 目前在市場上所供應的膠原蛋白基質在它們的性質上 5 顯示非常大的差異性(variance)。因此，被發現到當被活體 外使用時’某些用於培養生物細胞的膠原蛋白基質會造成 發炎反應’致使異化代謝過程（catab〇lic metabolism processes)。目前可用之膠原蛋白基質的另一個缺點是它們 》 非常厚-通常超過200 μπι_並且它們因此無法在顯微鏡下被 10 檢驗。除此之外，目前被供應於培養生物細胞的膠原蛋白 基質非常昂貴。 用於培養細胞的另一種替代性載體被稱為水凝膠 (hydrogels)。一水凝膠是一種含水但水不溶性的聚合物，其 分子是化學地(例如透過共價或離子鍵）或物理地(例如透過 15 互接聚合物鍵的方式）被連結以生成一種三維網路 (three-dimensional network)。因為整體的親水性聚合物成 &分，它們在水中攝入一相當多體積之後膨脹但並未喪失它 們的材料凝聚(material cohesion)。然而，水凝膠的缺點是， 鑒於它們的保水力（water-retaining capacity)，它們是機械上 2〇 不穩定的。 再者’水凝膠經常在與細胞形成聚落(colonisation)的期 間凝縮（condense)。因此’水凝膠在它們的使用上是非常受 到限制的。 所謂玻尿酸(hyaluronic acid)代表另一種適於與生物細 4 200927921 胞形成聚落的基質。這個基質由軟骨基質的巨分子（呈未經 修飾的形式)所構成，它顯示一個高度的生物相容性。分子 鏈必須被連結以產生一具有足夠機械彈性（mechanical resilience)的適當結構。這是透過與醇的酯化(esterificati〇n) 5 ❹ 10 15 Ο 20 而被完成，其會造成一個在生物相容性上的降低。 所謂藻酸(alginate)代表另一種支架。這涉及一種從褐 藻(brown algae)所獲得的共聚物(COp〇iymer)，該共聚物是由 L-古羅糖搭酸(guluronic acid)以及d_甘露糖酸(mannur〇nic acid)所構成。透過添加EDTA和/或Na-擰檬酸，產物可以 被膠化(gelatinised)或液化(liquefied)，其給予藻酸如同那些 已被描述有關以膠原蛋白為基礎之凝膠的類似性質供培養 細胞，然而帶有經增進的再懸浮可能性供細胞以及分子生 物分析。儘管優於其他載體基質的優點以及活體外材料的 好性質，當被用於活體内時是不成功的。活體内，該物質 難以吸收並且造成相當大的免疫與異物反應（f〇reign_b〇dy reactions)。因此’藻酸還不適於被用作為用於人體移植物 的載體。 另一種用於生物細胞的载體材料是瓊脂(agarose)。它 以種類似於藻酸的方式表現。瓊脂由兩種醣鏈(saccharide chains)所構成並且從紅藻(redalgae)的細胞壁被獲得。就像 是藻酸，當被活體内使用時，它會造成免疫與異物反應以 使得瓊脂不能被用於人類移植物。 其他的支架是纖維蛋白（fibrin)。這涉及一種球狀血漿 蛋白質（globular plasma protein) ’其因為它在其他物質中網 5 200927921 織(meshing)聚合作用的能力而造成血液凝結。然而，迄今 纖維蛋白亦禁不起供活體内使用的試驗。使用纖維蛋白作 為一細胞載體仍有报大一部分是未被開發 被廣泛地評估。再者，纖維蛋白是非常昂貴的。 .5 被用於培養生物細胞的其他基質是以幾丁質或幾丁聚 糖為基礎。幾丁質形成供幾丁聚糖生成的基礎材料。為此 目的，幾丁質的乙醯基基團被化學地或酵素地切去。幾丁 質與幾丁聚糖兩者是無法透過一種明確界定的交越 口 （crossover)而被分離的生物聚合物。通常 丨。為，當去乙醒作用的程度高於侧%且:合 是可溶的。然而，幾丁質與幾丁聚糖在它們的應用性上是 非常有限的並且本身當被用於培養細胞時可能是未經證實 的。幾丁質不是一種在體内被製造的材料，因此，它在生 物體内是一種異物。使用幾丁質作為一細胞載體仍然必須 15 .被根本地研究。 目前，亦有許多合成支架被測試。被包括在這之中的 © 有聚合物聚乳酸交醋（polylactide, PLA)與聚乙交酉旨 (polyglycolide, PGA)還有聚-L乳酸PPLA (亦被意指為生物 玻璃(bioglass))。PLA與PGA的一個特殊特徵是它們在水 20 性介質（aqueous media)中的低溶解度’僅能透過分解聚合物 鍵（亦即水解)成低分子寡聚物(oligomers)或單體(monomers) 而被改善’因此導致這些材料的侵I虫(erosion)。然而，已被 顯示這些聚合物不適於培養生物材料。透過自發性的水 解，可吸收的聚合物分解並生成有機酸。造骨細胞 6 200927921 (osteoblasts)在酸性環境(acid settings)中分化以使得一較高 數量的這些聚合物可以造成骨破壞(bone destruction)而非 造骨(build bones)。

10 15

20 【發明内容】 對照此背景’構成本發明之目的亦提供一種用於培養 生物細胞的新穎組成物，其避免有關該技藝中之細胞載體 所已知的缺點。特別地’一種可以在經濟上大規模並且以 一不變的高品質被製造的組成物被提供。 這個目的是透過使用一用於培養生物細胞而被解決， 包含有下列參數(parameters): 膠原蛋白[wt. -%]: 大約30至80， 醯胺氮[wt. : 大約0.06至0.6， 多元醇[wt. -%]: 大約0至50， 脂肪[wt. : 灰分[wt. -%]: 水[wt. -%]: pH值： 每單位面積重量[g/m2]: 拉力強度[N/mm2]: 大約0至20， 大約0至10， 大約5至40， 大約3至10， 大約10至100， 分別地大約0.5至100，或20 至 100。 此一組成物呈薄膜的形式而由Naturin GmbH &Co. KG, Badeniastrasse 13, Weinheim而變得是商業上可取得的。被 指定為這些藉由Naturin的薄膜的參考編號是例如： 7 200927921 400011899 、 400023747 、 400024203 、 400026193 、 400019485、400000084 以及 400000109。 5

10 這個發現是令人驚訝的。至今，此化合物被專門地使 用在食品工業中，例如在火腿製造的領域中作為一網(net) 與肉之間的分離膜(separating film)。尤其，不被期望的是 此等組成物尤適用於培養生物材料。 依據本發明的組成物可以大規模地並且以一穩定的高 品質被再現。它因為它的優良生物相容性、它們極薄的膜 厚度、它們的相對高透明度（transparency)以及它的高機械 穩定性而為突出的，造成在一廣泛範圍的應用。 再者’被偏好的是當甘油（glycerin)或山梨醇(sorbite) 被用作為多元醇(polyol)，它是以一為〇至50wt._〇/o (甘油）， 和/或0至40 wt.-% (山梨醇）的濃度被提供。 15

這個尺寸(measure)具有的優點是：已特別被證實本身 在特定濃度下作為一潤濕劑（wetting agent)或一水鍵結劑 (water-bonding agent)以預防乾燥的多元醇被使用。 依據一特定的特徵， 膠原蛋白[被-%]: 醢胺氮[wt. -%]: 甘油[Wt. : 脂肪[wt. : 山梨醇[wt. : 灰分[Wt. -%J : 水[wt. -%]: 該組成物包含有下列參數： 大約50至70， 大約0.14至0.4， 大約12至35， 大約3至7， 大約0至20， 大約0.5至3， 大約12至18， 20 200927921 5

10 15 ❹ 20 PH值： 大約5.5至8， 每單位面積重量[g/m2]: 大約20至40， 拉力強度[N/mm2]: 分別地大約5至25，或40至 80 ° 個別成分的濃度以這個方法被進一步最佳化以使得該 組成物在它供培養生物細胞的穩定性上更被增進。 為此目的’被偏好的是脂肪是基本上植物油。 使用植物油來保存依據本發明的組成物已被證明是特 別有利的。因為被增加的彈性(elasticjty)，植物油明確地擴 大戎組成物的應用範圍。使用植物油也可以防止酸敗 (rancidity) ’因此有助於該組成物的製造與貯存。明確的是 殘餘動物脂肪的最低數量不會抵銷植物油的優點。 依據一尤佳的特徵，依據本發明之組成物的值是大 約5.0至8.0 ’較佳地6_8至8.0，更佳地大約7 〇至8，最 佳地7.2至7.5。 如同本案發明人所發現到的，在特定pH值下培養生物 細胞^特別地成功。因此，該組成物顯示—於生理區域中 並且提供-大體上類似於生物細胞的天然環境的邱值 過例如Naturin GmbH & Co. KG而為商業上可取得的組 物通常具有一為大約4 8❾pH值。在此酸性環境中 培養對酸敏感的生物材料是不彳能的。所欲的阳值可以口透 過將該組成物培養在例如含每或鎮_酸鹽緩衝 其他為f於該技藝人士所熟知的習知緩衝= 9 200927921 對照此背景，本發明之另一目的亦有關於一種增進一 具有下列參數之組成物的方法： 5 ❹ 10 膠原蛋白[Wt. -%]: 醯胺氮[wt. -%]: 多元醇[wt. -%]: 脂肪[wt. : 灰分[Wt. -%]: 水[wt. : pH值： 每單位面積重量[g/m2]: 拉力強度[N/mm2]: 大約30至80， 大約0.06至0.6， 大約0至50， 大約0至20， 大約0至10， 大約5至40， 大約3至10， 大約10至100， 分別地大約0.5至100，或20 至 100。 在它用於培養生物細胞的適合性，其包括下列步驟： (1) 提供該組成物，以及 15

(2) 調整pH值至大約5.0至8.0,較佳地至大約6.8至8.0, 較佳地至大約7.0至7.8，最佳地在大約7.2至7.5。 由於此”最佳化方法”，商業上可取得的薄膜像是例如 那些由Naturin GmbH & Co· KG所提供的，顯示一明確被 增進的適合性供用作為細胞培養載體。步驟(2)較佳地像是 在一具有pH值為大約7.2至7.5的緩衝溶液中培養該組成 物而被執行。 最佳化方法較佳地包含一額外的步驟(3)，在該步驟期 間該組成物是被培育以高度脂溶性的物質。 此尺寸具有的優點是，例如脂溶性物質是透過使用 20 200927921 10 0 - %丙酮而被萃取。用於培養生物材料之組成物的品質可 以因此被進一步地增進。 此外’在依據本發明之最佳化方法的期間，被偏好的 是步驟(3)包括一步驟(3.丨），在該步驟期間該組成物於緩衝 溶液中被洗滌。 在步驟(3.1)期間，剩餘之高度脂溶性的物質以及，若 ❹ 10 15 ❹ 20 需要的話，其他污染殘餘物被移除以使得該膜接著能夠使 用或可以被進一步加工或處理。 較佳地，依據本發明的最佳化方法亦包含一額外步驟 (4) ’在該步驟期間該組成物的乾燥發生。 此尺寸具有的優點是它供用於獲得易於操作並且幾乎 可以被無限期地貯存的產物。 依據較佳的特徵，依據本發明的組成物是如同— 膜(flat film)而被裝配。 尺寸，喊組成物是以尤適於供細胞培養應用與 在一生物體内移植生物材料兩者的形式被提供。如同一薄 Τ而被裝配之依據本發明的組成物可以被輕易裁壓 成任何外型或尺寸。 认 雕對照此背景’該組成物較佳地被裝配成分別作為— =物材枓植人—生物體内，較佳地幹細胞或前驅細胞 =疋，細胞。因為它的生物相容性以及它的附著支持 右:择匕可以被用於固定細胞。這在再生醫學的領域中是 阿又相關性，例如在有關動帶、腱、骨與軟骨的細胞培 11 200927921 養物的發育中。再者，然而它也可以被用於其他組織。因 此它亦適用於使用作為一傷口敷料。此外，該組成物可以 被應用在例如化妝品的領域中作為皮膚敷料。再者，因物 膠原蛋白的化學組成物，它特別適用於互接細胞影響成分 (interlinking cell-affecting components)，像是例如生長因子。 一個特定的優點是：事實上依據本發明之平膜在乾燥 之後於無須任何額外協助的情況下附著至平坦的合成表 面。作為一結果，該薄膜(例如與細胞培養的塑膠表面）製造 一無泡泡的單元(bubble-free unit)，即使在低緊張狀態細胞 培養(low-strain cell cultivation)期間維持完整。因此，在細 胞培養中的細胞影響膠合(gluing)以及固定affixing)協助可 以被減低。然而對於特定的應用來說，此鍵結可以使用機 械工具(例如鑷子）在沒有造成損傷的情況下被溶解且該薄 膜可以從細胞培養盤連同生長其上的細胞被移除。 作為一替代物’依據本發明的組成物是如同一管狀腸 衣(tubular casing)而被裝配。 這個形態尤適於使用作為一細胞以及物質貯器供移植 試驗。 在乾燥的環境中，依據本發明的平膜或管狀腸衣包含 有一為大約5至200 μηι的厚度’較佳地1〇至1〇〇 μπι，更 佳地15至30 μπι，更佳地大約20 μπι，以及最佳地大約15 μηι。 這個尺寸具有的優點是：一為透明並且可以在顯微鏡 下被檢驗之極薄的膜或腸衣被提供。這並非有關在目前技 12 5 ❹ 10 15 20 200927921 藝狀態技術中已知之以膠原蛋白為基礎的細胞載體。依據 本發明，厚度在一乾燥的環境中被決定。術語，，乾燥的”在 此處是相同於風乾的（air-dried)以至於一絕對殘餘溼度（一 數量大約為10%至15%)維持著。 依據又一被偏好的發展，該組成物是經輻射滅菌的， 其較佳地透過游離輻射的方式被執行，或更佳地，透過貝 他和/或加馬輻射的方式。 這個尺寸具有的優點是：污染生物被殺死並且要被培 養之生物材料的污染可以被廣泛地避免。輻射滅菌法提供 的優點是：熱敏感性膠原蛋白維持著不受損壞。 對照此背景，依據本發明之最佳化方法包含有額外的 步驟(5)，在其期間化合物的輻射滅菌發生。 再者，被偏好的是依據本發明的組成物亦被配設以一 染料(較佳地一螢光-吸收染料）。 為了活體外的診斷，該組成物可以被差異地染色。在 處理過程中，螢光染色的細胞（其已穿過薄膜)可以在所謂有 關藥理學、生理學或細胞生物測試的穿越測試(penetmti〇n test)期間被建立’因為例如該組成物的一螢光吸收色涵括尚 未穿越的螢光細胞。接著，只有在螢光顯微試驗期間穿過 的細胞發光。 本發明的一主題是一種使用下列步驟供用於培養生物 材料的方法： (1) 提供一適於用作為有關生物材料之載體的組成物， (2) 令該生物材料與該組成物接觸，以及 13 200927921 (3)在培養條件下培育該組成物與該生物材料， 用做1=:依據本發明之應用有關的上述組成物是被 5 ❿ 10 15 ❹ 本I明的另一主題有關於一種將生物材料一 物的方法，包含有下列步驟： 生 (1) 提供一適於用作為有關生物材料之載體的組成物， (2) 令該生物材料與該組成物接觸，以及 (3) 將與該組成物接觸的生物材料導引至一生物體内， 藉此與所述依據本發明之應用有關的上述組成物是被 用做為該組成物。 ~本發明的另一主題是有關於依據本發明之組成物用於 決定腫瘤細胞之侵入與轉移潛力的用途。 有關腫瘤細胞之侵入與轉移潛力的常見活體外試驗方 法是以下列原理為基礎：腫瘤細胞的穿越能力是透過一有 孔與非可降解的合成薄膜而被測量。在活體外試驗中，此 系統，例如作為測量抗致癌藥品在細胞之穿越能力上的效 用。然而腫瘤細胞的侵入性不只仰賴於透過結締組織空隙 (孔）的移動能力還有細胞酵素地降解或重建結締組織之成 分（主要地構成膠原蛋白）的能力。因為它的小的厚度，同質 與榡準化生產，生物膠原蛋白薄膜可以作為發展一種藥學 測試系統供決定被培養之細胞的蛋白分解能力。有關這個 糸統’細胞被培養在雙室系統(two_chamber system)中。該 雙室是使用膠原蛋白薄膜而被分開。要被檢驗的細胞被培 養在膜上的上室之中。在一對應的培養之後，移動通過膠 20 200927921 原蛋白膜至膜的底側上的細胞數目被定量。因此，使用依 據本發明之組成物在活體外診斷方面開啟一個新領域。 依據本發明的組成物也可以被用來決定非腫瘤細胞的 蛋白分解活性以及它們的侵入潛力，例如有關幹細胞的活 5 力試驗。 明確的是：在不偏離本發明範疇的情況下，上述以及 在下面所說明的特徵不僅在個別預定的組合中是可實施 的，在其他組合或在一不同的方法中也是可實施的。 ❹ 10 【實施方式】 1.含膠原蛋白的組成物 發明人使用7種商業上可取得之由NaturinGmbH&Co. KG所製造的薄膜並且發現它們適用於依據本發明的應用。 所測試之商業上可取得的薄膜的參數被列在下面表1中： ❹ 15 200927921 Qο .•fi-Naturin^^^背4|-0^續^^13><^^潑落雜MS ,鳞 ^-rl 1+^ 雕雜_ 厚度[μιη] |ρΗ值 灰 分 [wt.-%] 脂肪 乙醯甘油 [wt.-%] 物油 [wt.-%] 甘 油 [wt.-%] 膠原蛋白 [wt.-%] 穿 參考編號 化合物# Ui I-— 1 私 5； 〇\ 平膜 400011899 »—* 可行 Η—» 1—» 〇 U) i—» 1—ι 1 Η-1 管狀腸衣 0 110 mm 400023747 K> 不可行 Κ) L/% 1 1 1 <1 ίο ίο 管狀腸衣 0 140 mm 1 400024203 U) 螢光 〇〇 Κ> u> H-» »—k 1 h—* to ON §荠 日頦 曰为 400026193 螢光 ON u> H-i Η-» 1 to VO Q娜 日葬 日为 400019485 不可行 Η-* Ο 私 bo Η— 1 管狀腸衣 0 65 mm [_ 400000084 〇\ 螢光 Η-» Η-4 私 bo H-* 1 to -0 管狀腸衣 0 115 mm 400000109 16 200927921 1.1製造依據本發明之薄膜形式的組成物 牛皮片作為用於製造薄膜形式之依據本發明的組成 物’有關它們的追溯性(traceability)以及衛生標準符合在第 853/2004號規定中所指明的條件。 5 ❹ 10 15 ❹ 20 這些牛皮片被粗略地機械地預先裁切並且在某4b方法 步驟中首先以水洗滌並且隨後使用鹼而被分解。分解的释 度可以被改變並且視諸如處理的持續期間、鹼性介質的濃 度(pH值）以及溫度的因素而定。石灰水、氫氧化納溶液戒 這兩種成分的混合物通常被用來建立驗性介質。然而，其 他驗性組合物也可相同地適用。驗性處理在一為例如12.5 的PH值被執行並且可以從範圍例如15小時至超過15〇小 時’視所欲的皮分解強度而定。醯胺氮被證實作為一用於 分析追蹤膠原蛋白組織的分解程度的可行參數：分解越 強’醯胺氮越少。 在達到所欲的分解程度之後，酸被加入並且接著，水 被重複地使用以供濕潤。酸化通常是使用氫氯酸超過一為6 至丨〇小時的期間而被完成，達到一<2的pH值，較佳地〈卜 使用其他的酸也是可行的。pH值接著透過一些使用水的下 游濕澗步驟而從2.6被增加到3.3。 所形成的”膠原蛋白胼胝(collagen callosities)”可以接 著透過切碎(mincing)並且將經切碎的材料壓過(pressing)具 有漸小之孔徑（aperture sizes)的多孔盤(perforated discs)而 被機械性地處理成似凝膠，黏彈性材料。 17 200927921 1.1.1發展成一平膜（組成物編號 此”濃縮的”膠原蛋白塊被轉移至一攪拌器，在該攪拌 器中被添加有甘油、水與酸。同時，pH值被調整至較佳地 2.6-3.2並且乾燥膠原蛋白的百分比被調整至介於1.6 wt._% 與2.5 wt.-%。該混合物接著通過一均質機，被通氣並且接 著通過一有槽噴嘴而被注入一輸送帶，在該輸送帶上所形 成的凝膠薄膜通過一随式乾燥器（tunnel drier)。在進入乾燥 器之前，它較佳地使用氨氣予以蒸薰，因此升高凝膠的pH 值。在乾燥器的末端，經乾燥的薄膜在它被盤繞起來 (wrapped up)之 A 通過一再水合區（re_hydrati〇n z〇ne)。 1.2發展成一管狀腸衣(組成物編號2至7) 來自1.1的黏彈性膠原蛋白塊被轉移至一造模混合器 (moulding mixer#，甘油是根據配方而被加入其中。乾塊 的pH值與百分比在水與酸被加入的同時被調整。 均質塊接著通過一環狀有槽喷嘴而被擠出，藉此製造 無知點管狀腸衣。一後備空氣(SUpp〇rting air)的同時注射 保護管狀腸衣免於蜂掉。 被吹起之管狀腸衣輪送通過擠出管線會詳細地根據要 被製造之腸種類而被差異性地進行。原則上，有可能以不 同順序通過含有化學品的進模（sh〇wers)以及乾燥段。在擠 出管線的末端’經乾燥的管狀腸衣被平臥地擺放在橡皮輥 (squeegees)之間並且在這個狀態中於捲軸上被結束。 所得到的管狀薄膜接著歷經一熱處理（thermal 200927921 treatment) ’藉此它們獲得需求機械穩定性（required mechanical stability)供它們稍後的使用。呈薄膜或管狀形式 之依據本發明的組成物也可以在其他膠原蛋白來源的基礎 上被作出’藉此膠原蛋白凝膠的處理可能在它的細節上是 5 不同於先前描述。依據豬皮膠原蛋白，例如，一適當的方 式必須被找出以降低脂肪含量，其例如被描述在DE 1〇〇 60 643以及EP 1 423 016中。使用天然的腸來製造一膠原蛋白 物是例如被描述在ES 2 017 564中。這些文件被併入本說 〇 明書的揭示内容中以作為參考文獻。 10 1.2調整pH值 pH值是透過使用含鈣與鎂的磷酸鹽緩衝液(具有ca++ 以及Mg++的鱗酸鹽緩衝的食鹽水(pBs)(pAA H15-001))而 被調整’該磷酸鹽緩衝液將以膠原蛋白為基礎的薄膜之pH 15 值調整至PH 7.2至pH 7.5的生理區域。為此目的，膠原蛋 白薄膜透過攪拌的方式以緩衝液系統予以洗滌歷時5天。 © 緩衝液1天被交換2次。 另擇地’膠原蛋白膜也可以被浸潤在含有甘油之具有 一 pH值為7.3的磷酸鹽緩衝液(磷酸鹽緩衝液：15.6 g的 20 KH2P〇4、71.3 g 的 Na2HP04x 2 H20 以及 492.9 g 的甘油被 溶解於7722 g的蒸餾水中）中歷時1小時。之後，經處理的 薄膜被排水並且置放在一拉幅機框架（tenter frame)中，在那 裡它於室溫下乾燥過夜。 19 5 Ο 10 15 Ο 20 200927921 1·3更多選擇性處理 在一於蒸館水中的短暫校正之後，膠原蛋白膜以100% 丙酮予以處理以萃取脂溶性物質並且破壞水溶性蛋白質。 在移除丙_之後，經乾燥的膜在負壓下被洗滌3次歷時1 小時’各次使用含鈣與鎂的磷酸鹽緩衝液（呈g/1: KC10.2 ; KH2P〇4 0.2 ; NaCl 8.0 ; Na2HP04 無水 1.15 ; CaCl2-2H20 配 於 H15-001 0.132 ; MgCl2_2H20 配於 H15-001 0.1)。為了排 除緩衝鹽類，洗滌步驟被重複3次歷時丨小時，各次在蒸 德水中。 1·4乾燥 可取得的膜或薄膜被乾燥。此可以在乾燥櫥（drying cabinet)中於60 C下被完成，藉此一為<5%的澄度值(例如 3/〇)可以被達成。該膜也可以在室溫下透過讓它在空氣 燥而被簡單地錢心於它最祕視誠賴的平衡歷度 (^alancing humidity)來調整它本身至相對空氣溼度(通常相 虽於介於大約8败-%至大約l3wt_%)。 i·5成形與輻射滅菌 所侍到之經乾燥的膠原蛋白膜或薄膜可以任何方式被 刀或，擊(punched)例如成DIN八5大片（sheet)。這些大片 =接著透過貝他或加馬輻射的方式於25 下破滅菌。 y 膠原'蛋白薄膜可以例如被裝配成用於具有任何結構類 20 200927921 型的合成加深杯（deepening cups)的插入物，例如微孔盤 (microtitre plates)或被製造成較佳地具有<2 mm，大約π mm高至數公分直徑的無縫管狀腸衣。高熱熔接(thermal welding)或粘著(gluing)該薄膜也是可行的。 1.6所製造之薄膜形式的依據本發明的組成物的參數 不同平坦膠原蛋白薄膜的參數被呈現在下面表2中， 其是依據被描述在1.1.1中的步驟而被達成，藉此依據13 節中所述的步驟沒有被施行。 樣品 A B C D E F G 膠原蛋白[wt.-%] 58 61 61 61 55 55 55 醯胺氮[mmol/100 g乾燥膠原蛋白] 28 37 37 37 31 31 31 甘油[wt.-%] 16 25 25 25 30 30 30 植物油 [wt-%1 5 0 0 0 0 0 0 山梨醇『wt.-%] 3 0 0 0 0 〇 〇 灰分（600°c); 2 1 1 1 1 1 1 [wt.-%] ι 水含量 16 13 13 13 14 14 14 pH值 5.2 7.0 7.0 7.0 7.1 7 1 7.1 每單位面積重量 [g/m2] 32 38 29 23 30 27.5 25 拉力強度縱向 [N/mm2] 60 67 61 44 59 54 48 拉力強度橫向 [N/mm2l_ 52 54 48 38 52 47 43 滅菌類型與劑量 無 e) (*) (*) (*) (*) 表2 :所生成之以膠原蛋白為基礎的薄膜的參數 21 200927921 (*) 有關每個樣品從1至6，有5個次試驗(sub-tests):沒有滅菌⑻’貝 他輻射25 kGy (b)，貝他輻射50 kGy (c)，加馬輻射25 kGy (d)以及 加馬輻射50 kGy (e) 5 下列分析的方法被施用： 膠原蛋白在羥脯胺酸調節方面/醯胺氮類似物 EP1676595 (Geistlich S5hne AG)/甘油在 HPLC 方面/植物油 透過索式萃取(Soxhlet extraction)/山梨醇在HPLC方面/在 > 於600 °C下烙室爐歷時5小時的焚化之後的重力灰分 ίο (gravimetric ash)/在150°C下乾燥櫥中的乾燥之後的重力水 含量/透過使薄膜形成小片，將小片插入5-% NaCl溶液中 並且在10分鐘之後使用一玻璃電極測量的pH值/藉由秤重 一帶有平衡溼度之10 cm xlO cm薄膜片的每單位面積的重 量/經按壓的樣品本體之於21°C/60%相對濕度與一為1〇〇 15 mm/min之進給速度的空調下’透過UTS通用測試機器（機 型3/205，UTS Testsysteme GmbH)之方式的縱向與横向的 拉力強度（tensile strength)。 2. 培卷生物材料 2〇 2.1組成物的型態 第1圖顯示依據本發明之具有厚度為20 μιη的膠原蛋 白薄膜，作為一插入物被裝配用於細胞培養平台之空腔 (Α)。一管狀腸衣被顯示在局部圖（Β)中，其被圖式地呈現在 局部圖（Β’）中。管狀腸衣被顯示在參考編號1。細胞被顯示 25 在參考編號2，其可以被置放在腸衣的内部。一活性物質'或 22 200927921 生長因子被顯示在參考標號3,其亦可被置放在腸衣中以影 響生物細胞。 2.2人類細胞的增生行為 5 相較於在塑膠培養池(plastic culture basin)中的習知培 養步驟’人類細胞（間質幹細胞MSC與人類細胞株SaQS2) 在依據本發明之膠原蛋白薄膜上的增生行為並未顯示任何 差異；第2圖。細胞被培育在一習知的塑膠培養表面(A)以 ❹ 及在依據本發明之膠原蛋白薄膜(B)上並且以BrdU予以培 10 育歷時1小時。圖式(B，)顯示膠原蛋白薄膜在1，細胞在2， 膠原蛋白纖維在5以及BrdU-陽性細胞在6。BrdU增生分 析(A)以及MTT生命力測試(B)的統計評估被呈現在第3圖 中〇 之後，在依據本發明之膠原蛋白薄膜與習知的塑膠池 15 之間沒有顯著差異性被顯示。 Q 2.3生物相容性 來自腦纖毛帶（cranial calotte)的胚鼠源祖細胞與 hMSCs兩者在骨原性分化條件下被培養在此基質上以供評 2〇 估依據本發明之膠原蛋白薄膜的生物相容性。結果被呈現 在第4圖中。 局部圖（A)顯示依據本發明之一礦質 雜觀，該基質連同瞻s-起在骨原性分:= 養。局部圖（B)顯示在依據本發明之膠原蛋白箔⑴上的2 23 200927921 週培養期間之後’來自腦纖毛帶的胚鼠成骨細胞的驗性構 酸酶活性。局部圖（Α，）以及(Β，）顯示膠原蛋白臈在丨，細胞 在2a以及細胞在細胞鹼性磷酸酶活性的偵測之後在2b。 驗性磷酸酶活性與細胞誘發的礦質化的偵測澄明被培 5 ❹ 10 15 Ο 20 養之細胞的分化潛力，並且因而依據本發明之基質的生物 相容性。 2·4培養三維組織結構 石蠟切片從形成菌落的膠原蛋白薄臈被作出。這些是 被組織化學地分析有關礦質化。結果被呈現在第5圖中。 局部圖（A、Α，)顯示在增生條件下的石蠟切片，局部圖（Β、 Β’)顯示在骨原性分化條件下。i意指膠原蛋白薄膜，2指 細胞以及4指硝酸銀沉積。 另一方面，這個實驗顯示細胞在三維薄膜/基質之中的 同礦質化潛力，以及在另一方面整合能力。在依據本發明 的這個基質協助之下，三維組織結構的培養是可以想像的。 2.5移植 移植實驗在裸鼠與C57/BL6小鼠身上被執行》為此目 的，負载有細胞之依據本發明的腸衣被移植到皮下組織與 腹膜之間的區域。這個實驗的結果被顯示在第6圖中。局 部圖（A)顯示移植以及局部圖（B)顯示在6週之後，裸鼠中之 依據本發明之被移植的基質。拉長的箭頭指向負載有細胞 之依據本發明的管狀腸衣。在夾持點的協助之下，具有被 24 200927921 插入之非生物降解性纖維的管狀腸衣可以在局部圖（B)中 被簡單地定位；虛線。在局部圖(B)中，製備物清楚地顯示 依據本發明之仍存在的管狀腸衣。 —苐7圖’局部圖（A)顯示在移植之前直接地依據本發明 5 的管狀腸衣，其與hMSCs被形成群落歷時1天。局部圖（B) 顾示在6週之後，生長在結締組織之培養的移植物。藉此， 變传十分清楚的是：即使在移植6週之後，管狀腸衣的完 錄維持原封不動，儘f有―破壞吸收過程（indpient 0 absorption process)。 1〇 該移植物已清楚地生長在動物的結締組織中並且被血 管所橫越；亦參見第8圖(A、a，）。圖式(A，)標示勝原蛋白 膜（1) ’細胞(2)，膠原蛋白纖維(5)以及血管（7)。 HE_染色石蠘切片的免疫組織分析顯示細胞已移入依 據本發明的羯中；亦參見第9圖。一血管可以在移植物的 15 區域(A，箭頭）中被清楚地建立。在圖式(A，）中1意指管狀 腸衣，2指細胞’ 5指膠原蛋白纖維，7指血管以及8指結 G 締組織。 3. 結論 本發明可以提供一種含膠原蛋白的組成物 ，例如呈薄 膜或腸衣形式’其在大規模製造上是可再制並且其尤為 適合用於培養以及產生生物材料。 【圖式簡單說明】 25 200927921 本發明現將更為詳細地以有更多本發明之要件與優點 還有特徵的具體例為基礎被說明。參照顯示在下面的所附 圖式： 第1圖顯示一具有厚度為20 μιη的膠原蛋白嵌物供一 具有6室的細胞培養盤(Α)，一依據本發明的管狀腸衣作為 供移植試驗的細胞貯器（Β、Β，）。 第2圖顯示在人類間質幹細胞(hMSC)上的Brdu增生 分析的結果。BrdU-陽性細胞的免疫細胞化學分析。細胞被 培養在一習知的塑膠培養表面(A、A，)上以及在依據本發明 之膠原蛋白薄膜上並且以BrdU予以培育歷時1小時。 第3圖顯示在人類間質幹細胞(hMSC)上Brdu增生分 析(A)以及MTT測試(B)的結果，該等細胞被培養在一膠原 蛋白基質以及一習知的塑膠培養表面上。平均值連同個別 的標準偏差值而被呈現。 第4圖顯示在成骨性分化條件下一礦質化的膠原蛋白 基質（與hMSCs —起被培養）的頂視圖（a、A，）；來自腦纖毛 帶的胚(E18)鼠成骨細胞於2週培養期之後在膠原蛋白基質 上的鹼性磷酸酶活性(B、B，）。 第5圖顯示一穿過膠原蛋白基質的石蠟切片，該膠原 蛋白在增生條件下(A、A’）以及成骨性分化條件(b、B，)下被 培養以來自腦纖毛帶的胚(E18)鼠源袓細胞。圖b以及B， 澄明3維基質的連續礦質化。整合以及穿透能力會視細胞 類型而定。 第6圖顯示一依據本發明之無細胞管狀腸衣的移植物 26 200927921 在C57/BL6-鼠(A)以及在6週之後於裸鼠中的經移植基質 (B)。 第7圖顯示在移植之前直接地依據本發明的管狀薄 膜’其與hMSCs形成群落歷時1天(A)還有在6週之後長 5 入結締組織的經培養移植物(B)。 第8圖顯示在C57/BL6鼠中，以放大表示在培養6週 之後依據本發明的管狀腸衣。滲透膠原蛋白薄膜的血管是 清楚可辨的。 © 第9圖顯示在一石蠟切片（由培養移植物所製成）上的 10 He染色。 【主要元件符號說明】 無

27

Claims (1)

1. 200927921 七、申請專利範圍：

   物用於培養生物細胞的用途，該組成物包含有 5 膠原蛋白[Wt. : 醯胺氮[wt. : 多元醇[wt. : 大約30至80， 大約0.06至0.6， 大約0至50， 大約0至20， 大約0至10， 大約5至40， 脂肪[wt. : 灰分[wt. : © 10 水[wt. -%]: PH值： 大約3至10， 每單位面積重量[g/m2]: 大約至1〇〇 ’ 拉力強度[N/mm2]: 大約〇.5至100。 2.如申請專利範圍第i項的用途，其特徵在於該多元醇是 15

   20 選自於： 甘油[wt. -%]: 山梨醇[wt· -%]: 3.如申請專利範圍第1或2 物包含有下列參數： 膠原蛋白[wt. ·%]: 醯胺氮[wt. -%]: 甘油[wt. -%]: 脂肪[wt. -%] · 山梨醇[Wt. -%]: 灰分[wt. : 大約0至5〇，和/或 大約5至40。 頊的用途’其特徵在於該組成 大約5〇至70， 大約0.14至〇.4， 大約12至35， 大約3至7， 大約0至20， 大約0.5至3， 28 200927921 水[wt. : 大約 12 至 18， pH值： 大約5.5至8， 每單位面積重量[g/m2]: 大約20至40， 拉力強度[N/mm2]: 大約5至25。 5 4.如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於該脂 肪基本上是植物油。 5.如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於pH值 是大約在5.0至8.0，較佳地在6.8至8.0，更佳地在大約 ❹ 7.0至7.8，最佳地在7.2至7.5。 10 6.如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於該組 成物被裝配成一平膜。 7. 如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於該組 成物被裝配成一管狀腸衣。 8. 如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於該組 15 成物在乾燥環境下包括一厚度大約為5至200 μιη。 9. 如申請專利範圍第8項的用途，其特徵在於該組成物在 〇 乾燥環境下包括一厚度為大約5至100 μιη，較佳地10 至30 μιη，最佳地大約15 μιη。 10. 如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於該組 20 成物被裝配成供細胞培養應用的一載體。 11. 如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於該組 成物被裝配成供移植生物材料（較佳地幹前驅細胞）的一 載體至一生物體内。 12. 如前述申請專利範圍中任一項的用途，其特徵在於該組 29 200927921 成物是透過輻射而被滅菌。 13. 如申請專利範圍第12項的用途，其特徵在於該輻射滅菌 是使用游離輻射而被執行。 14. 如申請專利範圍第13項的用途，其特徵在於該游離輻射 5 是貝他和/或加馬輻射。 15. 如前面申請專利範圍任一項的用途，其特徵在於該組成 物含有一染料，較佳地一螢光-吸收染料。 16. —種組成物用以測定腫瘤細胞之侵入與轉移潛力的用 〇 途，其特徵在於所使用的該組成物是使用如申請專利範 10 圍第1至14項中任一項之用途的組成物。 17. —種用於培養生物材料的方法，包含下列步驟： (1) 提供一適於用作為有關生物材料之載體的組成物， (2) 令該生物材料與該組成物接觸，以及 (3) 在培養條件下培育該組成物與該生物材料， 15 其特徵在於所使用的該組成物是使用如申請專利範圍第 1至15項中任一項之用途的組成物。 Ο 18.—種用於將生物材料移植至一生物的方法，包含有下列 步驟： (1)提供一適於用作為有關生物材料之載體的組成物， 20 (2)令該生物材料與該組成物接觸，以及 (3)將與該組成物接觸的生物材料導引至一生物體内， 其特徵在於所使用的該組成物是使用如申請專利範圍第 1至15項中任一項之用途的組成物。 19. 一種增進一供培養生物細胞之組成物適合性的方法，該 30 200927921 組成物含有下列參數： 膠原蛋白[wt. -%]: 醯胺氮[wt. -%]: 多元醇[wt. -°/〇]: 大約30至80， 大約0.06至0.6， 5 脂肪[Wt. : 灰分[Wt. -%]: 水[wt. -%]: pH值： 大約0至50， 大約0至20， 大約0至10， 大約5至40， 大約3至10， 大約10至100， 大約0.5至100， ❹ 每單位面積重量[g/m2] 1〇 拉力強度[N/mm2]: 該方法包含下列步驟： (1) 提供該組成物，以及 (2) 調整pH值在大約5.0至8.0,較佳地大約6.8至8.0, 較佳地在大約7.0至7.8，最佳地在大約7.2至7.5。 15 20.如申請專利範圍第19項的方法，其特徵在於步驟2包含 下列步驟： ❹ （2.1)在具有pH值為大約7.2至7.5的緩衝溶液中培育該 組成物。 21. 如申請專利範圍第19或20項的方法，其特徵在於它包 20 含下列額外步驟： (3) 將該組成物以高度脂溶性的物質培育。 22. 如申請專利範圍第21項的方法，其特徵在於它包含下列 額外步驟： (3.1)於緩衝溶液中洗滌該組成物。 31 200927921 23. 如申請專利範圍第19或21項中任一項的方法，其特徵 在於它包含下列額外步驟： (4) 乾燥該組成物。 24. 如申請專利範圍第18或23項中任一項的方法，其特徵 5 在於它包含下列額外步驟： (5) 輻射滅菌該組成物。

   32