KR101685751B1

KR101685751B1 - 콜라겐을 함유하는 세포 운반체

Info

Publication number: KR101685751B1
Application number: KR1020137020743A
Authority: KR
Inventors: 로타르 주스트; 티모 슈미트; 프란쯔 마제르
Original assignee: 에버하르트-칼스-유니버시타트 투빙겐 유니버시타트스클리니쿰
Priority date: 2007-08-20
Filing date: 2008-08-13
Publication date: 2016-12-12
Also published as: RU2511426C2; US20130122078A1; BRPI0815761A2; EP3098305B1; CY1118101T1; EP2185684B1; RU2577974C2; PL2185684T3; PT2185684T; KR101497173B1; TWI432571B; IL203762A0; DE102007040370B4; RU2013140791A; US20100233140A1; AU2008290857A1; KR20100082763A; EP2185684A2; DE102007040370A1; JP5638950B2

Abstract

본 발명은 생물학적 세포의 배양을 위한 콜라겐을 함유하는 조성물의 용도, 생물학적 세포의 배양 방법, 생물학적 물질의 유기체내로의 이식 방법, 및 조성물의 생물학적 세포의 배양에 대한 적합성 개선 방법에 관한 것이다.

Description

콜라겐을 함유하는 세포 운반체{CELL CARRIER CONTAINING COLLAGEN}

생물학적 세포의 배양을 위한 운반체는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 이러한 운반체는 흔히 매트릭스 또는 스케폴드(scaffold)로 지칭된다. 운반체들은 세포 배양에 있어 세포들이 성장하는 온상 또는, 일반적으로, 기반을 제공한다.

콜라겐을 함유하는 화합물은 세포 운반체의 가장 잘 알려진 유형을 나타낸다. 세포외 기질의 동물성 단백질인 콜라겐은 경단백질에 속하고 통상적으로 수불용성이며 섬유상 구조를 갖는다. 이는 예를 들어 피부, 혈관, 인대, 건, 연골과 같은 결합조직의 구조, 및 뼈와 이의 구조에서 주성분 중 하나이다. 이러한 성질때문에 동물로부터 얻은 콜라겐 기반 생체재료는 의료분야에서 이미 몇 년째 사용되고 있다. 특히 지혈을 위해 임상적으로 적용되는 제품에서는 경질막의 대체물로서, 또는 다른 성형수술 분야에서 콜라겐은 운반 물질로서 자리를 잡을 수 있었다. 지금까지 28개의 다른 종류가 확인되었고 또한 콜라겐 유사 도메인을 갖는 추가적인 단백질이 적어도 10개가 등록된 이러한 콜라겐들은 개개의 종 간에 미미한 차이를 보일 뿐이다. 뚜렷한 식별 패턴이 밝혀지지 않고 효소-기재 분해시 아무런 독성의 분해 생성물을 생성시키지 않는 만큼, 콜라겐은 생체적합적이라고 여겨진다.

지금까지 시판된 콜라겐 매트릭스는 그의 성질에 관해 매우 높은 변동을 보인다. 따라서 생물학적 세포의 배양을 위해 사용되는 콜라겐 매트릭스가 시험관내에서 사용될 때, 일부가 염증 반응을 일으키고 이화대사(catabolic metabolism)과정을 유발한다는 것을 알게 되었다. 현재 입수가능한 콜라겐 매트릭스의 또다른 문제점은 콜라겐 매트릭스가 통상 200 ㎛을 초과하는 정도로 매우 두꺼워서 현미경하에 관찰될 수 없다는 것이다. 이에 추가로, 지금까지 생물학적 세포의 배양을 위해 제공된 콜라겐 매트릭스는 매우 비쌌다.

세포의 배양을 위한 대체 운반체는 이른바 히드로겔이라는 것이다. 히드로겔은 분자들이 화학적 (예를 들면, 공유결합 또는 이온결합을 통하여)으로 또는 물리적 (예를 들면, 중합체 사슬들의 상호 연결에 의해)으로 연결되어 3차원 망상구조를 구현하는, 수분을 함유하나 수불용성인 중합체이다. 전체적인 친수성 중합체 성분들로 인하여 그들은 물에서 상당한 부피의 흡수 아래 팽창하나 그들의 물질 응집성(material cohesion)은 잃지않으면서 팽창한다. 그러나, 히드로겔의 문제점은 그들의 거대한 물 보유 용량을 고려해볼 때 기계적으로 불안정하다는 것이다.

또한, 히드로겔은 세포와 군체형성(colonisation) 동안에 흔히 응축한다. 그러므로 히드로겔은 그 사용에 있어서 매우 제한적이다.

이른바 히알루론산은 생물학적 세포와의 군체형성을 위해 적합한 다른 매트릭스를 나타낸다. 이 매트릭스는 연골의 매트릭스의 거대분자로 이루어졌고 이것이 바로 이가 변형되지 않은 상태에서 높은 생체적합성을 보이는 이유이다. 충분한 기계적 탄력을 갖는 적합한 구조를 만들기 위해서는 분자 사슬들이 연결되어야 한다. 이는 알콜과의 에스테르화의 방법으로 이루어지는데 이는 생체적합성의 저하를 야기시킬 수 있다.

이른바 알기네이트는 또다른 스케폴드를 나타낸다. 이는 갈조류로부터 채취된, L-글루론산과 D-만누론산으로 구성된 공중합체에 관한 것이다. EDTA 및/또는 구연산나트륨을 첨가함으로써, 생성물은 젤라틴화 또는 액화될 수 있고, 이로 인해 알기네이트에게 세포의 배양에 있어서 콜라겐-기재 겔에 있어 이미 기술된 성질들과 유사한 성질을, 그러나 세포 및 분자 생물학적 분석에 있어서 개선된 재현탁 가능성을 가지는 성질을 부여한다. 다른 운반체 매트릭스보다 우월한 장점들 및 시험관내에서의 물질의 좋은 성질에도 불구하고, 생체내에서 사용시 성공적이지 못하였다. 생체내에서 그 물질은 흡수되기 어렵고 상당한 면역 및 이물 반응들을 유발한다. 따라서 알기네이트는 인간 이식을 위한 운반체 물질로서 사용되기에는 아직 적합하지 않다.

생물학적 세포를 위한 또다른 운반체 물질로는 아가로스가 있다. 이는 알기네이트와 유사한 방식으로 거동한다. 아가로스는 2개의 당사슬로 구성되고 홍조류의 세포벽으로부터 채취된다. 알기네이트와 마찬가지로, 생체내에서 사용될시 면역 및 이물 반응들을 유발시켜 아가로스는 인간 이식을 위하여 아직 사용될 수 없다.

다른 스케폴드들은 피브린(섬유소)을 기초로 한다. 이는 그중에서도 특히, "그물망(meshing)" 중합 능력으로 혈액을 응고시키는 구형 혈장 단백질에 관한 것이다. 그러나, 피브린은 또한 현재까지 생체내 사용을 위한 시험을 견뎌내지 못하였다. 세포 운반체로서의 피브린의 사용은 널리 검토되지 않았으며 계속 광범위하게 평가되어야 한다. 또한, 피브린은 매우 비싸다.

생물학적 세포의 배양을 위해 사용되는 다른 매트릭스는 키틴 또는 키토산을 기초로 한다. 키틴은 키토산의 생성을 위한 기초 재료를 형성한다. 이것을 위하여 키틴의 아세틸기들은 화학적으로 또는 효소의 처리로 분리된다(split off). 키틴과 키토산은 양쪽 모두 정확하게 정의된(define) 교차로 분리되지 않는 생물중합체이다. 탈아세틸기반응의 정도가 40 내지 50 %보다 높고 화합물이 유기산에 녹을시에는 통상적으로 키토산이 언급된다. 그러나 키틴과 키토산은 그들의 응용성에서 매우 제한적이며, 마찬가지로 세포의 배양을 위한 사용시 아직 입증되지 않았다. 키틴은 체내에서 생성되는 물질이 아니므로 유기체내에서 이는 계속하여 이물질이 된다. 세포 운반체로서의 키틴의 사용은 계속해서 기본적으로 연구되어야 한다.

현재에는 또한 수많은 합성 스케폴드가 시험되고 있다. 이에 포함되는 것으로는 중합체 폴리락티드 (PLA) 및 폴리글리콜리드 (PGA) 뿐만 아니라 폴리-L-락트산 PPLA ("생체유리(bioglass)"로 지칭되기도 함)도 있다. PLA 및 PGA의 특별한 특징은 저분자량 올리고머 또는 단량체로의 중합체 사슬의 분해 (즉, 가수분해)를 통하여만 개선되고 따라서 이러한 물질들의 부식을 야기하는 그들의 수성 매질에서의 낮은 용해성이다. 그러나 이러한 중합체들은 생물학적 물질의 배양을 위하여 적합하지 않다는 것이 증명되었다. 자연발생적인 가수분해를 통하여 흡수가능한 중합체들은 붕해되고 유기산을 생성한다. 골모세포는 산 환경에서 분화하므로 대량의 이러한 중합체는 뼈를 형성하기보다는 뼈의 파괴를 야기할 수 있다.

이러한 배경에 기대어, 본 발명의 근본적인 목적은 당분야의 세포 운반체에 있어 공지된 문제점을 피하는 생물학적 세포의 배양을 위한 새로운 조성물을 제공하는 것이다. 특히, 경제적으로 대량 및 일정한 양질로 생성될 수 있는 조성물이 제공되어야 한다.

본 목적은 생물학적 세포의 배양을 위한 하기의 변수를 포함하는 조성물의 사용을 통하여 해결된다:

콜라겐 [중량%]: 약 30 내지 80,

아미드질소 [중량%]: 약 0.06 내지 0.6,

폴리올 [중량%]: 약 0 내지 50,

지방 [중량%]: 약 0 내지 20,

회분 [중량%]: 약 0 내지 10,

수분 [중량%]: 약 5 내지 40,

pH값: 약 3 내지 10,

단위면적 당 중량 [g/㎡]: 약 10 내지 100,

인장 강도 [N/㎟]: 약 0.5 내지 100, 또는 20 내지 100.

상기의 조성물은 이미 나투린 게엠베하 &코. 카게(Naturin GmbH &Co. KG, Badeniastrasse 13, Weinheim)에 의해 필름 형태로서 시판되었다. 나투린에 의해 이 필름들에 부여된 참조번호는 예를 들면 400011899, 400023747, 400024203, 400026193, 400019485, 400000084 및 400000109가 있다.

이러한 발견은 놀라웠다. 지금까지 본 화합물은 예를 들면 햄 제조 분야에서 망과 고기 사이 분리필름으로서와 같이 식품산업계에서만 오로지 사용되었다. 무엇보다도 상기 조성물이 생물학적 물질의 배양에 특히 적합하다는 것이 예상되지 않았었다.

본 발명에 따른 조성물은 대량으로 재현될 수 있고 일정한 양질을 갖는다. 이것은 좋은 생체적합성, 매우 얇은 필름 두께, 비교적 높은 투명도 및 높은 기계적 안정성으로 인해 두드러져서 폭넓은 범위의 응용분야를 발생시킨다.

또한 폴리올로는 0 내지 50 중량% (글리세린) 및/또는 0 내지 40 중량% (소르바이트)의 농도로 제공되는 글리세린 또는 소르바이트가 사용되는 것이 바람직하다.

상기 조치는 명시된 농도에서 건조를 예방하는 습윤제 또는 수분 결합제로서 특히 입증된 폴리올이 사용된다는 장점을 갖는다.

특정 구성에 따르면, 조성물은 하기의 변수를 포함한다:

콜라겐 [중량%]: 약 50 내지 70,

아미드질소 [중량%]: 약 0.14 내지 0.4,

글리세린 [중량%]: 약 12 내지 35,

지방 [중량%]: 약 3 내지 7,

소르바이트 [중량%]: 약 0 내지 20,

회분 [중량%]: 약 0.5 내지 3,

수분 [중량%]: 약 12 내지 18,

pH값: 약 5.5 내지 8,

단위면적 당 중량 [g/㎡]: 약 20 내지 40,

인장 강도 [N/㎟]: 약 5 내지 25, 또는 40 내지 80.

생물학적 세포의 배양을 위한 적합성에 있어서 상기 조성물이 더욱 개선되도록 이러한 방법으로 개개의 성분의 농도가 추가로 최적화되었다.

이를 위하여, 상기 지방이 본질적으로 식물성유인 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 조성물을 보존하기 위한 식물성유의 사용은 특히 유리한 것으로 밝혀졌다. 증가된 탄성에 기인하여 식물성유는 명백히 조성물의 응용분야 범위를 확대시킨다. 식물성유의 사용은 또한 산패를 예방할 수 있으므로 조성물의 제조와 저장을 용이하게 한다. 극히 적은 양의 잔류 동물성 지방이 식물성유의 장점을 상쇄하지 않는다는 것은 명백하다.

특히 바람직한 구성에 따르면, 본 발명에 따른 조성물의 pH값은 약 5.0 내지 8.0, 바람직하게는 약 6.8 내지 8.0, 보다 바람직하게는 약 7.0 내지 8, 가장 바람직하게는 약 7.2 내지 7.5이다.

발명자들이 알아낸 것과 같이, 생물학적 세포의 배양은 명시된 pH값에서 특히 성공적이다. 그러므로, 상기 조성물은 생리적 범위내에 있는 pH값을 보이고 따라서 생물학적 세포의 자연환경을 대체로 닮은 환경을 제공한다. 예를 들어 나투린 게엠베하 & 코. 카게가 시판하는 조성물은 통상적으로 약 4.8의 pH값을 갖는다. 상기의 산성 환경에서는, 예를 들면, 산에 감수성이 있는 생물학적 물질의 배양은 가능하지 않다. 요망하는 pH값은 예를 들면 칼슘 또는 마그네슘 함유 인산염 완충액 (당업자에게 공지된 다른 전통적인 완충액도 동등하게 적합함)내 조성물의 인큐베이션을 통해 조정될 수 있다.

이러한 배경에 기대어, 본 발명의 다른 목적은 또한

(1) 조성물을 제공하는 단계, 및

(2) pH값을 약 5.0 내지 8.0, 바람직하게는 약 6.8 내지 8.0, 보다 바람직하게는 약 7.0 내지 7.8, 가장 바람직하게는 약 7.2 내지 7.5로 조정하는 단계

를 포함하는, 하기의 변수를 갖는 조성물의 생물학적 세포의 배양에 대한 적합성 개선 방법에 관한 것이다:

콜라겐 [중량%]: 약 30 내지 80,

아미드질소 [중량%]: 약 0.06 내지 0.6,

폴리올 [중량%]: 약 0 내지 50,

지방 [중량%]: 약 0 내지 20,

회분 [중량%]: 약 0 내지 10,

수분 [중량%]: 약 5 내지 40,

pH값: 약 3 내지 10,

단위면적 당 중량 [g/㎡]: 약 10 내지 100,

인장 강도 [N/㎟]: 약 0.5 내지 100, 또는 20 내지 100.

이러한 "최적화 방법" 덕분에, 예를 들면 나투린 게엠베하 & 코. 카게가 제공하는 것과 같은 시판중인 필름이 세포 배양 운반체로서의 사용에 있어 분명히 개선된 적합성을 보인다. (2)단계는 바람직하게 약 7.2 내지 7.5의 pH값을 갖는 완충 용액내에서 조성물의 인큐베이션으로 수행된다.

최적화 방법은 바람직하게 강한 지용성 물질과 함께 조성물을 인큐베이션하는 추가적인 (3)단계를 포함한다.

상기 조치는, 예를 들면, 100 % 아세톤을 사용하여 지용성 물질이 추출된다는 장점을 갖는다. 생물학적 물질의 배양을 위한 조성물의 품질은, 따라서, 더욱 개선될 수 있다.

추가로, 본 발명에 따른 최적화 방법 동안에는 (3)단계가 완충 용액에서 조성물을 세척하는 (3.1)단계를 포함하는 것이 바람직하다.

이러한 (3.1)단계에서는 남아있는 강한 지용성 물질 및, 필요시 다른 오염 잔류물들이 제거되어 막이 사용준비될 수 있거나 또는 추가로 가공 또는 처리될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 최적화 방법은 또한 조성물의 건조를 실시하는 추가적인 (4)단계를 포함한다.

상기 조치는 취급이 간단하고 거의 무기한으로 저장될 수 있는 생성물을 수득하는데 기여한다는 장점을 갖는다.

바람직한 구성에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 평면 필름으로 형성된다.

상기 조치 덕분에, 조성물은 세포 배양 용도 및 유기체로의 생물학적 물질의 이식 모두에 있어 특히 적합한 형태로 제공된다. 본 발명에 따른 필름으로 형성된 조성물은 임의의 형태 또는 크기로 용이하게 절단되거나 가압될 수 있다.

이러한 배경에 기대어, 조성물은 바람직하게 각각 세포 배양 용도를 위한 운반체 또는 매트릭스 또는 "스케폴드"로서, 또는 생물학적 물질의, 바람직하게 줄기세포 및 전구체 세포 또는 특이적 조직 세포의 유기체내로의 이식을 위한 운반체로서 형성된다. 이의 생체적합성과 유착지지 성질 (adherence supporting properties)들로 인하여, 이는 세포를 고정화하는데 사용될 수 있다. 이는 예를 들면 인대, 건, 뼈 및 연골을 위한 세포 배양의 개발과 같이 재생의학 분야에서 큰 관련성이 있을 수 있다. 그러나 이 뿐만 아니라, 이는 또한 다른 조직들을 위해 사용될 수도 있다. 따라서 이는 상처 드레싱으로의 사용에도 또한 적합하다. 추가적으로 상기 조성물은 예를 들어 피부 드레싱과 같이 미용 분야에서도 사용될 수 있다. 뿐만 아니라 콜라겐의 화학 조성에 기하여, 이는 예를 들어 성장인자와 같이 세포에 영향을 미치는 성분들을 상호 연결하는데 특히 적합하다.

두드러진 장점으로는 본 발명에 따른 평면 필름이 어떠한 특별한 도움이 없이도 건조 후 평면 합성표면상에 유착한다는 사실이다. 그 결과, 필름, 예를 들면 세포 배양의 플라스틱 표면의 경우는, 저변형(low strain) 세포 배양 동안에도 온전한 상태로 남아있는 기포가 없는 유닛을 생성한다. 그러므로 세포 배양에서 세포에 영향을 미치는 접착(gluing) 및 고착(affixing) 보조물이 제거될 수 있다. 그러나 특이적 용도에서는 이러한 결합은 예를 들면 핀셋과 같은 기계적 도구를 사용하여 손상을 시키지 않으면서 용해될 수 있고 필름은 그 위에 증식하고 있는 세포와 함께 세포배양 접시로부터 분리될 수 있다.

대안으로서, 본 발명에 따른 조성물은 관형 케이싱으로 형성된다.

상기 형상은 이식 시험을 위한 세포 및 물질 저장고로서의 사용에 특히 적합하다.

건조한 조건에서 본 발명에 따는 평면 필름 또는 관형 케이싱은 약 5 내지 200 ㎛, 바람직하게는 10 내지 100 ㎛, 보다 바람직하게는 15 내지 30 ㎛, 보다 바람직하게는 약 20 ㎛, 및 가장 바람직하게는 약 15 ㎛의 두께를 포함한다.

상기 조치는 투명한 특히 얇은 필름 또는 케이싱이 제공되고 또한 현미경하에 관찰될 수 있다는 장점을 갖는다. 현재의 최첨단 기술(분야)에서 공지된 콜라겐 기재의 세포 운반체에서는 그렇지 않다. 본 발명에 따르면 두께는 건조된 조건에서 결정된다. 여기에서의 "건조"이라는 용어는 절대 잔류습도가 약 10 내지 15 %에 이르러 유지되도록 공기 건조된 것과 동등하다.

바람직한 추가적 개발에 따르면 상기 조성물은 바람직하게 전리 방사선 또는 보다 바람직하게 베타 및/또는 감마 방사선에 의해 수행되는 방사선에 의해 멸균된다.

상기 조치는 오염 유기체들은 사멸시키고 배양될 생물학적 물질의 오염을 대략적으로 방지한다는 장점을 갖는다. 상기 방사선 멸균 방법은 감열성 콜라겐이 손상되지 않게 한다는 장점을 제공한다.

이러한 배경에 기대어, 본 발명에 따른 최적화 방법은 화합물의 방사선 멸균이 실시되는 추가적인 (5)단계를 포함한다.

뿐만 아니라, 본 발명에 따른 조성물에는 또한 염료, 바람직하게는 형광 흡수 염료가 제공되는 것이 바람직하다.

시험관내의 진단 목적을 위해서 본 조성물은 다르게 염색될 수 있다. 언급된 과정에서, 예를 들면, 조성물의 형광 흡수 색은 투과하지 않은 형광 세포를 덮기 때문에 필름을 투과한 형광 염색된 세포들이 약리학적, 생리학적 또는 세포생물학적 시험을 위한 소위 투과 시험 동안에 정착될 수 있다. 그러면, 오직 투과한 세포들만이 형광현미경 시험 동안에 빛을 내게 된다.

본 발명의 다른 주제는 기술된 본 발명에 따른 용도와 관련하여 전술된 조성물이 조성물로서 사용되어

(1) 생물학적 물질을 위한 운반체로서의 사용에 적합한 조성물을 제공하는 단계,

(2) 생물학적 물질을 조성물과 접촉하는 단계, 및

(3) 배양 조건들하에 조성물을 생물학적 물질과 인큐베이션하는 단계

를 이용하는 생물학적 물질의 배양 방법이다.

본 발명의 다른 목적은 기술된 본 발명에 따른 용도와 관련하여 전술된 조성물이 조성물로서 사용되어

(2) 생물학적 물질을 조성물과 접촉하는 단계, 및

(3) 조성물과 접촉된 생물학적 물질을 유기체에 도입하는 단계

를 포함하는 생물학적 물질의 유기체내로의 이식 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 주제는 종양세포의 침윤 및 전이 가능성을 판단하기 위한 본 발명에 따른 조성물의 사용에 관한 것이다.

종양세포의 침윤 및 전이 가능성의 통상적인 시험관내 시험 방법은 종양 세포의 투과용량을 천공되어있고 난해성인 합성 필름을 통해 측정하는 원리에 근거한다. 시험관내 시험에서 본 시스템은 예를 들면 세포의 투과용량에 대한 항암약품의 효과를 측정하는데 사용된다. 그러나 종양세포의 침윤성은 결합조직의 간극을 통한 이동 용량에만 의존하지않고 주로 콜라겐으로 구성되는 결합조직의 성분을 효소로 처리하여 분해하거나 혹은 재형성하는 세포의 능력에도 또한 의존한다. 그의 얇은 두께, 균일성 및 표준화된 생성으로 인하여, 생물학적 콜라겐 필름은 배양된 세포의 단백질 분해 용량을 측정하기 위한 새로운 제약-시험 시스템 (pharma-test system)을 개발하는데 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 경우, 세포들은 두개의 챔버 시스템(two chamber system)에서 배양된다. 이 두개의 챔버는 콜라겐 필름을 사용하여 분리된다. 관찰될 세포들은 필름 위 상부 챔버에서 배양된다. 상응하는 배양 기간후에, 콜라겐 막을 통해 막의 하단측으로 이동한 세포의 수를 정량화한다. 그러므로, 본 발명에 따른 조성물의 사용은 시험관내 진단분야에서 있어 새로운 영역을 연다.

본 발명에 따른 조성물은 또한 비종양(non-tumor) 세포의 단백질 분해활성 및 그의 침윤 가능성을 측정하는데, 즉 줄기세포의 생명력 시험으로 사용될 수 있다.

상기 언급되었고 다음에 설명될 특징들은 주어진 각각의 조합에서만 적용되는 것이 아니라 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위내에서의 다른 조합들 또는 독립된 접근법에도 역시 적용된다는 것은 분명하다.

본 발명은 이제 본 발명의 추가적인 기준 및 장점뿐만 아니라 특징이 나타나는 실시양태들을 기반으로 보다 상세하게 설명된다. 첨부된 각 도면은 다음과 같다:

도 1은 6개의 공동을 갖는 세포배양 패널에 있어서 20 ㎛의 두께를 갖는 콜라겐 인레이(collagen inlay)(A), 이식시험을 위한 세포 저장고로서의 본 발명에 따른 관형 케이싱(B, B')을 보여준다.
도 2는 인간 간엽줄기세포(hMSC)에 대한 BrdU 증식분석의 결과를 보여준다. BrdU-양성 세포들의 면역세포화학적 분석. 상기 세포들은 종래의 합성 배양표면(A, A')상에서 및 본 발명에 따른 콜라겐 매트릭스(B, B')상에서 배양되었고 1 시간 동안 BrdU와 함께 인큐베이션되었다.
도 3은 콜라겐 매트릭스 및 종래의 합성 배양표면상에서 배양된 인간 간엽줄기세포(hMSC)에 대한 BrdU 증식분석(A) 및 MTT 시험(B)의 결과를 보여준다. 평균값들은 각각의 표준편차와 함께 제시된다.
도 4는 골형성 분화 조건하에 hMSC들과 함께 배양된 광물화 콜라겐 매트릭스의 상면도(A, A'); 콜라겐 매트릭스 상의 2주 배양 단계 후, 두개 상반구(cranial calotte)의 태생기 (E18) 쥐 골모세포의 알칼리성 인산염 활성의 상면도(B, B')를 보여준다.
도 5는 증식 조건(A, A') 및 골형성 분화 조건(B, B')하에서 두개 상반구의 태생기 (E18) 쥐 골모세포의 전구세포와 함께 배양된 콜라겐 매트릭스를 통한 파라핀 단면도를 보여준다. 도 B 및 B'는 3-차원 매트릭스의 연속적인 광물화를 명확히한다. 통합 및 투과 능력은 세포 유형에 의존한다.
도 6은 C57/BL6-쥐에서의 본 발명에 따른 무세포(cell-free) 관형 케이싱의 이식(A) 및 무모 쥐(nude murine)에서의 6주 경과 후의 이식된 매트릭스(B)를 보여준다.
도 7은 hMSC와 함께 하루 동안 군체형성된, 이식 바로 직전의 본 발명에 따른 관형 필름(A) 및 6주 경과 후의 결합조직내로 성장된 체외이식된 이식물(B)을 보여준다.
도 8은 C57/BL6-쥐에서의 체외이식 6주 경과 후의 본 발명에 따른 관형 필름을 확대하여 보여준다. 콜라겐 필름 구석 구석에 퍼진 혈관들을 명백히 인지할 수 있다.
도 9는 체외이식된 이식물로부터 생긴 파라핀 조각(cut)상의 He-착색을 보여준다.

<실시양태>

<1. 콜라겐 함유 조성물>

발명자들은 나투린 게엠베하 & 코. 카게가 시판중인 7개의 필름을 사용하여 이들이 본 발명에 따른 용도에서 적합하다는 것을 발견하였다. 시험된 시판중인 필름들의 변수들이 하기의 표 1에 열거되어 있다:

<1.1 본 발명에 따른 필름 형태의 조성물의 생성>

추적가능성(traceability) 및 위생 기준과 관련하여 규정 (EC) 제853/2004호에 명시된 요건들을 충족시키는 우내피조각(Bovine hide splits)이 필름 형태로 본 발명에 따른 조성물을 생성하는데에 있어 출발 물질로서 사용된다.

상기 우내피를 대충 기계적으로 예비-절단하고, 여러 방법단계들에서 처음에는 물로 세척하고 뒤이어 알칼리를 사용하여 분해한다. 분해의 정도를 달리할 수 있고 이는 처리지속 기간, 알칼리성 매질의 농도 (pH값) 및 온도와 같은 요소들에 의존한다. 석회수, 수산화나트륨 용액 또는 이러한 두 성분들의 혼합물이 상기 알칼리성 매질을 설정하는데 일반적으로 사용된다. 그러나, 그 외의 알칼리성 조합들도 동등하게 적합하다. 상기 알칼리성 처리는 예를 들어 12.5의 pH값에서 수행하며 이는 목표로하는 상기 우내피의 분해의 강도에 따라 예를 들면 15시간에서 150시간 이상까지 걸릴 수 있다. 아미드질소가 콜라겐 조직의 분해정도의 분석추적(analytical tracing)에 있어서 가능성 있는 변수임이 입증되었다: 분해가 더욱 강렬할수록, 아미드질소(수치)가 낮아진다.

희망하는 분해의 정도에 도달한 후, 산을 첨가하고, 뒤이어, 물을 수차례 사용하여 헹군다. 산성화는 일반적으로 6시간에서 10시간의 기간에 걸쳐 염산을 사용하여 이루어져 2 미만의, 바람직하게는 1 미만의 pH값에 도달된다. 그 외 산의 사용도 또한 가능하다. 뒤이어 pH값을 물을 사용한 수많은 하류 헹굼 절차로 2.6으로부터 3.3까지 증가시킨다.

생성된 "콜라겐 못(callosity)"을 그 다음, 잘게 썰고 및 잘게 썰린 물질을 점차적으로 작아지는 개구 크기를 갖는 천공된 디스크를 통하여 겔-유사 점탄성적 물질로 가압하는 수단으로 기계적으로 처리한다.

<1.1.1 평면 필름으로의 개발 (조성물 번호 1)>

상기 "농축된" 콜라겐 덩어리를 글리세린, 물 및 산이 첨가된 진탕기내로 이동시킨다. 동시에, pH값을 바람직하게 2.6 내지 3.2로 조정하고 건조 콜라겐의 백분율을 1.6 중량% 내지 2.5 중량%로 조정한다. 상기 혼합물을 뒤이어 균질화기를 통과시키고, 통기시키며(aerated) 이어서 슬릿 노즐을 통하여 컨베이어 벨트상에 붓고, 그 위에 생성된 겔 필름을 터널 건조기를 통과시킨다. 건조기에 진입시키기전, 바람직하게 암모니아 기체를 사용하여 훈증시켜 상기 겔의 pH값을 높인다. 건조기의 끝부분에서, 건조된 필름을 랩핑하기 전에 재수화 구역을 통과시킨다.

<1.1.2 관형 케이싱으로의 개발 (조성물 번호 2 내지 7)>

1.1의 점탄성적 콜라겐 덩어리를 성형(moulding) 혼합기내로 이동시키고 배합처방(formula)에 따라 글리세린을 첨가한다. 물 및 산을 첨가함과 동시에 pH값 및 건조 물질의 백분율을 조정한다.

상기 균일한 덩어리를 이어서 고리형 슬롯이 있는 노즐을 통해 압출함으로써 끝없는 관형 케이싱을 생성한다. 보조(supporting) 공기의 동시 주입에 의해 관형 케이싱이 붕괴(collapse)되는 것이 방지된다.

압출 라인을 통한 블로운 관형 케이싱의 이동은 생산될 장(intestine)의 유형에 따라 세부적으로 상이하게 진행된다. 원칙적으로, 가변 순서로 화학물질-함유 샤워(shower) 및 건조 구획을 통과하는 가능성이 있다. 상기 압출 라인의 끝부분에서, 건조된 관형 케이싱을 고무롤러(squeegee)들의 사이에서 평평하게 하고 이 상태에서 실패(spools)상에 권취한다.

수득된 상기 관형 필름은 그 다음 열적 처리를 거치고 이에 따라 이들의 나중의 용도에 있어서 요구되는 기계적 안정성을 습득하게 된다. 필름 또는 관형 형태인 본 발명에 따른 조성물들은 또한 그 외 다른 콜라겐 공급원을 기반으로 하여 제조될 수 있고 이럴 경우 콜라겐 겔의 처리는 전술된 바와 세부적으로 다를 수 있다. 예를 들어 돈피(pig hide) 콜라겐에 기초할 경우, 예를 들면 DE 100 60 643 및 EP 1 423 016에 기술된 바와 같이 지방 함유량을 낮추는 적당한 방법이 발견되어야 한다. 콜라겐 물질을 생산하기 위한 천연 장(natural intestine)의 사용은, 예를 들어, ES 2 017 564에 기술되어 있다. 이러한 문헌들은 본 출원의 명세서에 참고문헌으로 도입되어 있다.

<1.2 pH값의 조정>

pH값은 pH 7.2 내지 pH 7.5의 생리적인 범위내에서 콜라겐-기재 필름의 pH값을 조정하는 칼슘 및 마그네슘-함유 인산염 완충액 [Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺ (PAA H15-001)을 갖는 인산염완충식염수 (PBS)]의 사용을 통하여 조정한다. 이를 위하여, 콜라겐 필름을 상기 완충액 시스템과 함께 5일 동안 교반함으로써 세척한다. 상기 완충액은 1일 2회 교환한다.

다르게는, 콜라겐 막을 또한 7.3의 pH값을 갖는 글리세린 함유 인산염 완충액 (인산염 완충액: 15.6 g의 KH₂PO₄, 71.3 g의 Na₂HPO₄ x 2H₂O 및 492.9 g의 글리세린이 7722 g의 증류수에 용해된다)내에서 1시간 동안 침지시킬 수 있다. 그 후, 처리된 필름을 정치시켜 배수하고 텐터기(tenter frame)내 배치하여, 실온에서 밤사이에 건조시킨다.

<1.3 추가적인 선택 처리공정>

증류수에서의 짧은 평형화 후, 지용성 물질들을 추출하고 수용성 단백질들을 분해하기 위해 100% 아세톤으로 콜라겐 막을 처리한다. 아세톤을 제거한 후, 상기 건조된 막을 매회 칼슘 및 마그네슘 함유 인산염 완충액 (g/l의 단위: KCl 0.2; KH₂PO₄ 0.2; NaCl 8.0; Na₂HPO₄ 무수 1.15; H15-001 중 CaCl₂-2H₂O 0.132; H15-001 중 MgCl₂-2H₂O 0.1)을 사용하여 1시간 동안 3회 음압에서 세척한다. 완충액 염(Buffer salt)을 제거하기 위해, 세척 절차를 증류수내에서 매회 1시간 동안 3회 반복한다.

<1.4 건조>

상기 입수된 막 또는 필름을 건조한다. 이는 5 % 미만의, 예를 들어 3 %의 습도값을 달성할 수 있는, 60 ℃의 건조 캐비넷내에서 이루어질 수 있다. 상기 막을 또한 단순히 공기중에서 건조되도록 방치하여 일반적으로 8 중량% 내지 약 13 중량%에 이르는 상기 막 또는 필름의 균형 습도에 따라서 막이 최종적으로 공기의 상대습도에 맞추어지도록 함으로써 실온에서 건조시킬 수 있다.

<1.5 성형 및 방사선 멸균>

수득된 상기 건조 콜라겐 막 또는 필름을 임의의 방법으로 절단하거나 또는 예컨대 DIN A5 시트로 타공(punch)시킬 수 있다. 이러한 시트들을 그 다음 25 kGy 또는 50 kGy에서의 베타 또는 감마 방사선에 의해 멸균시킨다.

예를 들어 상기 콜라겐 필름은 예컨대 마이크로타이터 판(microtitre plates)과 같은 임의의 구조체(construction type)의 합성 디프닝 컵(deepening cup)의 삽입물로 완성하거나 또는 바람직하게 2 mm 미만의 직경을 갖는 (약 12 mm에서 최대 수 cm의) 이음매가 없는 관형 케이싱들로 생성할 수 있다. 필름의 열적 용접 또는 접착도 또한 가능하다.

<1.6 필름 형태로 생성된 본 발명에 따른 조성물의 변수들>

1.3에 따라 기술된 단계들은 수행되지 않고 1.1.1에 기술된 절차들에 따라 달성된, 상이한 평면 콜라겐 필름들의 변수들이 하기의 표 2에 나타나 있다.

하기의 분석방법이 적용되었다:

콜라겐은 히드록시프롤린 규정(hydroxiproline regulation) / 아미드화 질소 유사체는 EP1676595 (Geistlich Soehnne AG) / 글리세린은 HPLC / 식물성유는 속슬렛 추출을 통하여 / 소르바이트는 HPLC / 회분의 중량계량은 600 ℃에서 5시간 동안 머플 노(muffle furnace)에서 소각 후 / 수분함량의 중량계량은 150 ℃에서 건조 캐비넷내에서 건조 후 / pH값은 필름을 작은 조각으로 자르고 조각들을 5-% NaCl용액내로 넣고 10분 후 유리전극(glass electrode)을 사용하여 측정 / 단위 면적당 질량은 균형 습도(balancing humidity)의 필름 10 cm x 10 cm 조각을 중량측정 / 세로 및 가로의 인장강도는 21 ℃에서 공기조화 후 UTS 보편적인(universal) 시험기계 (모델 3/205, UTS Testsysteme GmbH)를 사용하여 / 타공된 샘플 몸체의 60% 상대습도 및 100 mm/분의 횡단 속도.

<2. 생물학적 물질의 배양>

<2.1 조성물의 형상>

도 1에는 20 ㎛의 두께를 갖고, 세포 배양 패널의 공동(cavity)에 대한 삽입물으로 형성된 본 발명에 따른 콜라겐 필름 (A)을 보여준다. 관형 케이싱은 부분 삽화(illustration) (B)에서 보여지며, 이는 부분 삽화 (B')에서 도식적으로 보여진다. 상기 관형 케이싱은 도면 부호 (1)로 나타나 있다. 상기 케이싱의 내부에 배치될 수 있는 세포들은 도면 부호 (2)로 나타나 있다. 생물학적 세포에 영향을 주기 위하여 또한 상기 케이싱내 배치될 수 있는 활성제 또는 성장인자는 도면 부호 (3)으로 나타나 있다.

<2.2 인간 세포의 증식 거동>

본 발명에 따른 콜라겐 필름상의 인간 세포, 간엽줄기세포 MSC 및 인간 세포주 SaOS2의 증식 거동은 플라스틱 배양조에서의 종래 배양 절차들과 비교시 아무런 차이점을 보이지 않았다; 도 2. 세포를 종래 플라스틱 배양 표면 (A) 및 본 발명에 따른 콜라겐 필름 (B)상에서 배양하였고 1시간 동안 BrdU와 함께 인큐베이션하였다. 모식도 (B')에서는 (1)의 콜라겐 필름, (2)의 세포들, (5)의 콜라겐 섬유, 및 (6)의 BrdU-양성 세포들이 보여진다. BrdU 증식 분석 (A) 및 MTT 생명력 시험 (B)의 통계적 평가가 도 3에서 보여진다.

나중에, 본 발명에 따른 콜라겐 필름과 종래 플라스틱조 사이에 의미있는 차이점을 보이지 않는다.

<2.3 생체적합성>

두개 상반구의 태생기 쥐 전구세포 및 hMSC 모두를 본 발명에 따른 콜라겐 필름의 생체적합성을 평가하기 위하여 골형성 분화 조건(osteogenic differentiation condition)하에 상기 매트릭스상에서 배양하였다. 그 결과는 도 4에 나타나 있다.

부분 삽화 (A)는 골형성 분화 조건아래 hMSC와 함께 배양된 본 발명에 따른 광물화된 콜라겐 매트릭스에 대한 개요를 보여준다. 부분 삽화 (B)는 본 발명에 따른 콜라겐 박편(foil)상에서 2주의 배양 기간이 지난 후의 두개 상반구의 태생기 쥐 골모세포의 알칼리성 인산염 활성을 보여준다. 부분 모식도 (A') 및 (B')은 (1)의 콜라겐 막, (2a)의 세포들, 그리고 (2b)의 세포의 알칼리성 인산염 활성을 검출한 후의 세포들을 보여준다.

세포-유도 광물화 및 알칼리성 인산염 활성의 검출은 배양된 세포의 분화 잠재성을 명확하게 하고, 따라서, 본 발명에 따른 매트릭스의 생체적합성을 명확하게 한다.

<2.4 3차원 조직 구조의 배양>

파라핀 단면을 군체형성된 콜라겐 필름으로부터 생성하였다. 이것을 광물화에 대해 조직화학적으로 분석하였다. 그 결과는 도 5에 나타나 있다. 부분 삽화 (A, A')는 증식 조건하의 파라핀 단면을, 부분 삽화 ( B, B')는 골형성 분화 조건하의 파라핀 단면을 보여준다. (1)은 콜라겐 필름을 나타내고, (2)는 세포들을 나타내며, 그리고 (4)는 질산은 침착물(deposit)을 나타낸다.

본 실험은 3차원 필름/매트릭스내에서, 한편으로는 높은 광물화 잠재성을, 다른 한편으로는 세포의 통합능력(integration ability)을 보여준다. 본 발명에 따른 이 매트릭스의 도움으로, 3차원 조직 구조의 배양을 생각해낼 수 있다.

<2.5 이식>

이식 실험을 무모 및 C57/BL6 생쥐를 대상으로 수행하였다. 이를 위하여, 본 발명에 따른 세포가 부하된 관형 케이싱을 피하조직 및 복막 사이의 부위에 이식하였다. 이 실험의 결과는 도 6에 보여진다. 부분 삽화 (A)는 이식을 보여주고 부분 삽화 (B)는 6주 후의 무모 생쥐에서의 본 발명에 따른 이식된 매트릭스를 보여준다. 실선의 화살표는 본 발명에 따른 세포가 부하된 관형 케이싱을 가리킨다. 고정 점들의 도움으로, 삽입된 생물분해성이 아닌 필라멘트를 갖는 관형 케이싱은 또한 부분 삽화 (B)에서 용이하게 찾아질 수 있다; 점선의 화살표. 부분 삽화 (B)에서, 제제는 여전히 존재하는 본 발명에 따른 관형 케이싱을 명확히 보여준다.

도 7의 부분 삽화 (A)는 hMSC와 함께 하루 동안 군체형성된, 이식 바로 직전의 본 발명에 따른 관형 케이싱을 보여준다. 부분 삽화 (B)는 6주 경과 후의 결합조직에서 성장된 체외이식된 이식물을 보여준다. 그렇게 함으로써, 이식후 6주가 경과하여도 관형 케이싱의 일체성(integrity)이 초기(incipient) 흡수 과정에도 불구하고 온전한 상태로 남는다는 것이 명백해진다.

이식물은 명백하게 동물의 결합 조직에서 성장했고 혈관들에 의해 교차(cross)되었다; 또한 도 8 (A, A') 참조. 모식도 (A')는 콜라겐 막 (1), 세포들 (2), 콜라겐 섬유 (5) 및 혈관들 (7)을 표시한다.

HE로 착색된 파라핀 조각의 면역-조직학적 분석은 본 발명에 따른 박편으로 이동한 세포를 보여준다; 또한 도 9 참조. 혈관이 이식물의 부위에서 명백하게 형성될 수 있다 (A, 화살표). 모식도 (A')에서 (1)은 관형 케이싱, (2)는 세포들, (5)는 콜라겐 섬유, (7)은 혈관, 그리고 (8)은 결합 조직을 나타낸다.

<3. 결론>

발명자들은 대규모의 제조업에서 재현될 수 있고 생물학적 물질의 배양 및 생성에 특히 적합한, 예를 들어, 필름 또는 케이싱 형태의 콜라겐-함유 조성물을 공급할 수 있다.

Claims

(1) 세포를 위한 운반체로서 사용되는 조성물을 제공하는 단계,
(2) 세포를 상기 조성물과 접촉하는 단계,
(3) 상기 조성물을 배양 조건하에 상기 세포와 함께 인큐베이션하는 단계, 및
(4) 동물로의 이식을 위해서, 세포와 함께 배양된 상기 조성물을 회수하는 단계
를 포함하고, 세포를 위한 운반체로서 사용되는 조성물이 하기의 변수를 포함하는 것인, 세포를 동물로 이식하기 위한 이식물의 제조 방법.
콜라겐 [중량%]: 50 내지 70,
아미드질소 [중량%]: 0.14 내지 0.4,
글리세린 [중량%]: 12 내지 30,
지방 [중량%]: 3 내지 7,
소르바이트 [중량%]: 0 내지 20,
회분 [중량%]: 0.5 내지 3,
수분 [중량%]: 12 내지 18,

pH값: 5.5 내지 8,
단위면적당 중량 [g/㎡]: 20 내지 40,
인장 강도 [N/㎟]: 5 내지 25.