TW200916576A - Genetically modified strains for biotransformations in anthracycline production - Google Patents

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200916576 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於經改良之微生物菌株，且係關於其在改良 蒽環黴素抗腫瘤抗生素，尤其泛艾黴素（epirubicin)及艾達 黴素（idarubicin)產量之生物轉形方法中之用途。 【先前技術】 道諾黴素類（Daunomycins)為由諸如波賽鏈黴菌（& peucetius)天蘭淡紅鍵徽菌（& coerw/orwMc/wi)、灰色鍵 ( 黴菌（S.的卿小鏈黴菌C5(加奶⑽少_ sp_ 〇)、波賽鏈 黴菌青灰變種（& pewcehw var. c此们.⑽）及二裂鏈黴菌（& 条干鏈黴菌種（汾sp )產生之一群抗 廬瘤抗生素。該群之基本化合物為道諾黴素（DiMarc〇等 人’ 1964)。道諾黴素可由通式I描述：

</ OH«4, 其最重要之衍生物如表1所示 133759.doc 200916576 表1 R4 Rl4 其他 CAS No. 道諾紅菌素(Paunorubicin) och3 Η 20830-81-3 泛艾黴素 och3 OH 4'差向異構物 56420-45-2 表道諾紅菌素(Epidaunorubicin) och3 Η 4'差向異構物 56390-08-0 13-DHED och3 Η 4'差向異構物R13=OH 艾達黴素 Η Η 58957-92-9 道諾紅菌素、泛艾黴素及艾達黴素之半合成衍生物可歸 類為非天然蒽環黴素抗生素，因為天然存在之菌株並不產 生該等蒽環黴素。泛艾黴素在臨床上用於多種癌症。由於 其與阿黴素（doxorubicin)競爭，故市場正在增長。新穎調 配物、接合物及與其他癌症藥物之新穎組合亦擴大泛艾黴 素之用途。泛艾黴素藉由以下方法製備，該方法包含藉由 醱酵產生道諾紅菌素及合成改造苷元及糖部分，例如美國 專利5,874,550中所揭示。 艾達黴素（4-脫曱氧基-道諾紅菌素）用於治療某些類型之 癌症，包括白血病、淋巴瘤及其他骨髓疾病。據稱與阿黴 素相比，其產生較小副作用。然而，可能由於其極高價格 之故，艾達黴素之全球年度銷售不超過20 kg，該極高價 格係歸因於極複雜之製造方法。艾達黴素酮 (Idarubicinone)由藉由醱酵道諾紅菌素，隨後進行酸性水 解獲得之道諾黴素酮（daunomycinone)開始製造。道諾紅菌 素酮（Daunorubicinone)可進一步合成改造為艾達黴素_。 如（例如）美國專利第4,325,946號中所述，藉由複雜合成反 應系列連接糖殘基（道諾胺（daunosamine))。 133759.doc 200916576 在礙酵產生諸如道諾紅菌素及表道諾紅菌素之重要蒽環 薇素過程中’中間物在醱酵肉湯中積累。在兩種情況中之 〆、玄·中間物均為ε_羅多新酮（e_rh〇d〇niyCinone)(strohl等 人’ 1989) °然而’由於表道諾紅菌素可藉由使用基因改 把菌株進打醱酵產生，故13-二氫-表道諾紅菌素（稱為13-DHED)同時積累於酿酵肉湯中。-般而言，認為該等代謝 物為廢棄物。美國專利第5,652，125號揭示使用ε•羅多新網 ζ-, 來產生道諾紅菌素，且Dickens等人（1997)已描述將13-二 氫-蒽環黴素氧化為其13_酮形式。未曾發現描述非天然蒽 裱黴素方法中生物轉形作用之公開案。 σ人已發現藉由利用醱酵產生道諾黴素及表道諾紅菌素 中所獲仔之副產物以較低成本獲得較高產量的商業上重要 之非天然恩環黴素泛艾黴素及艾達黴素之新穎方法。 【發明内容】 ;本發明係關於一種微生物菌株，其將蒽環黴素代謝物 【 （諸如表道諾紅菌素、13_二氫表道諾紅菌素、表-領地徽 素（feudomycin)及ε-羅多新酮）轉化為非天然蒽環黴 素抗生素（諸如泛艾黴素及艾達黴素卜較佳地，該等菌株 係選自鏈黴菌屬（genera加柳町⑽），更佳選自物種波賽 鏈黴菌’且最佳選自亞種波賽鏈黴菌青灰變種。在本發明 之車乂佳實她例中，該菌株包含自物種黑胡桃鍵徽菌 (汾"卬⑽…/如以）分離之異源抗性基因⑽。 本發明亦係關於—種使用本發明之微生物菌株將葱環徽 素代謝物（13-二氫表道諾紅菌素及^羅多新嗣）轉化為非天 133759.doc 200916576 然蒽環黴素抗生素（諸如泛艾黴素及艾達黴素）之方法 本發明之-較佳實施例中，在該方法巾在任何 較：選自由離子型及非離子型吸附劑組成之群，更：選自 聚苯乙烯，且最佳選自由XAD-7及D—n HP-20組成之群 之樹脂來吸附蒽環黴素代謝物或蒽環黴素抗生素。 【實施方式】 ” >本發明係關於改良之鏈黴菌菌株，其能夠將改造之蒽環 黴素中間物轉化為重要抗腫瘤蒽環黴素藥物艾達黴素及泛 艾黴素。該菌株適用於將蒽環黴素代謝物轉化為最終產物 之方法。 口此，本發明之一目的在於提供一種改良之鏈黴菌菌 株’其經改造以能夠將4-脫氧_ε_羅多新酮以高比率穩定轉 化為艾達黴素。阻斷產生道諾紅菌素之該菌株係來源於實 例1中所述之菌株G001(DSM 12245)(菌株G〇〇i係由野生型 波賽鏈黴菌青灰變種ATCC 27952突變誘發所衍生）。該來 源於菌株G001之改良突變株能夠將4_脫氧+羅多新嗣轉化 為艾達黴素，但重複性差。為改良轉化，將抗性基因引入 該菌株中。 基因係自黑胡桃鏈黴菌（ATCC 27952)分離，且提 出該基因負責針對諾加拉黴素（nogalamycin)之抗性 (Torkkell 2001)。基於序列分析，基因產物^以〇為產生抗 生之多功能基因產物，其具有用於切除修復蛋白11”八及 ABC轉運體Ατρ_結合蛋白之域。在青紫鏈黴菌^ hvda?u)TK24中之異源表現顯示該基因保護該菌株免受所 133759.doc 200916576 有jk式之不同蒽環黴素、諾加拉黴素、阿柔比星及道諾紅 菌素影[將基因引入來源於G〇〇k改良菌株提供 新穎生物轉形菌株，其展現對艾達黴素之抗性增強。令^ 驚訝地，當ππΟ於大腸桿菌（Ε· coli)載體中引入來源於 ⑽1之改良菌株中時，其改良該轉化率且使該菌株穩定地 維持該轉化在± 1G%内，即使在六次連續培養的情況下。 該新穎生物轉形菌株可饋以天然蒽環黴素中間物（諸如 阿克拉菌酮(aklavinone)h'羅多新_)，形成天然墓環黴 素道諾徵素。 令人驚訝地，該菌株能夠進行非天然代謝物之轉化且 饋以非天然4-脫氧-ε'羅多新酮得以形成艾達黴素。此外， 該菌株能夠將13-DHED轉化為表道諾紅菌素。呈現ε_羅多 新酮合成轉化為4-脫氧-ε-羅多新酮。根據本發明，隨後4_ 脫氧-ε-羅多新酮由上述新顆生物轉形菌株生物轉變為艾達 黴素，其並不產生道諾黴素代謝物。13-DHED進一步使用 相同突變株藉由生物轉形作用轉化為表道諾紅菌素。 適用於本發明之生物轉形菌株之重要態樣為： i)接受天然及非天然受質以供轉化； 該菌株對於天然及非天然蒽環黴素具有增強之抗性； U1)該菌株實現轉化所需之必需功能，及 iv)該菌株不積累可偵測量之天然道諾黴素。 可使用任何合適菌株來將4_脫氧_半合成中間物生物轉 形為艾達黴素H g株具有用於以下反應之内源性或 所轉移可表現基因很關鍵：改造葡萄糖以形成道諾胺， 133759.doc -10-

i. 200916576 醋酶活性以移除甲基以及所關聯之ι〇·脫羧酶活性，ι3_ 加氧酶及合適糖基轉移酶活性。此外，生物轉形作用之後 的後續方法具有成本效益，除非在生物轉形作用中用作宿 主之菌株不積累天然蒽環黴素代謝物或積累少量天然蒽環 黴素代謝物。 有利地使用在道諾黴素生物合成早期阻斷之波賽鏈黴菌 月灰.支種犬變株；較佳地，阻斷最小PKS之突變株（最小聚 酮合成酶催化第一反應，蒽環黴素中之聚酮組裝及其他π 型聚酮路徑）。 來源於上述野生型波賽鏈黴菌青灰變種ATCC 27952之 新穎生物轉形菌料高度較佳之菌才朱，但任何具有以下特 徵之菌株適合於本發明之轉化方法。 1.阻斷道諾黴素之早期路徑。基於相應基因之補充實驗 破壞最小PKS之办基因（資料未展示）。 不產生可债测里之道諾黴素’而在固體培養基上積累 酸性黃色物質。該化合物之結構未知，但其並非葱環徽素 3_在 ISP4+tsr·及 ISP2+tsr_平皿上 形成孢子且形成無色氣生菌絲。 4. 由於卿^之功能料干不同蒽環黴素表現抗性。 5. 將4_脫氧-ε-羅多新酮辕 轉化為兩種主要產物：艾達黴素 及1 3 - 一氣艾達黴素。 物。 冬現·^ ϊ某些其他艾達黴素代謝 本發明另外係關於—種藉 由利用支路產物（醱酵產生道 133759.doc 200916576 諾黴素及表道諾徽素中所形成之s-羅多新鋼及撥酵產生表 道諾徽素中所形成之13·麵D)產生非天然葱環黴素抗生 素泛艾黴素及艾達黴素之方法。 因此本發明之另一目的在於提供一種使用本發明之經改 良、、田菌信主菌株藉助於生物轉形作用製備商業上有用之菜 %黴素抗生素之方法。較佳地，該宿主菌株為上述來源於 鏈黴菌屬，較佳來源於波赛鍵徽菌青灰變種之 形菌株。 、土御得 ::(例如)美國專利第7,053，191號所述，在此項技術中已 知义達徽素嗣可藉由複雜化學合成系列轉化為艾達黴素。 1本發明之方法中，較佳使用將4_脫氧·i多新酮轉化為 ^徵素的細菌菌株之内源生物合成反應系列。已知生物 2以圖！所示之序列進行。將阿克拉菌酮（數 之典型前驅體川-經基化以形紅羅多新綱’將卜羅= 嗣糖基化。位置丨〇上之改造雨 殘基，諸如羅多胺㈣。, 式’儘管其他糖 羅夕胺（rh〇d〇Samine)為接受之 :二τ氧合作用且道諾黴素生物合成之最二 為C-4處之"基化。令人驚訝地，即使 最終10-及改造以及糖基化仍獲得成功。使用八=物 轉形菌株使4-脫氧阿克拉菌 °、生物 為艾達黴素n” 脫氧-ε'羅多新酮均轉化 =達1 ,然而，㈣改造之基因產物需要 其中CM0處之取代基為c〇〇CH3_基團。 又貝 將作為支路產物藉由道_素代謝物 卜羅多新酮藉由合成化學加工為 酵方法獲传之 脫虱-ε-羅多新酮。各種 133759.doc -12- 200916576 合成路徑可能自ε-羅多新酮之位置4移除羥基。然而五 人優選藉由經縮酮化保護C7及⑽基開始進行’四個反:、 系列。此後，進行C4處之0H基團之三苯曱基化，繼而還 原以移除C4處之取代基。各步驟之後’藉由沈澱/結晶分 離或純化產物，且獲得>20%，較佳>3〇%，最佳⑽/⑽ 體產率。該方法中所獲得之4_脫氧+羅多新_之純度為 观’較佳观，最佳>9〇%’為用於生物轉 適受質。 σ ε'羅多新酮通常在醱酵肉湯中大量積累且藉由習知方法 純化獲得成功。s'羅多新，之合成轉化提供>2〇%，較佳 >3 0% ’最佳>4G%之純4•脫氧_ε_羅多㈣，將其饋至波赛 鏈黴菌青灰變種之非產生突變株。4_脫氧免羅多新_生物 轉形為艾達黴素之效率>2〇%，較佳>30%，最佳>4〇%。可 將超過1〇〇 mg之半合成中間物饋至一公升生物轉形菌株培 養物中。饋人中間物之時間並不重要。可❹任何允許鍵 黴菌生長及次級代謝之_條件’然而使㈣培養基，且 溫度範圍為25-3rc，pH值介於6至8之間為有利的。 自培養物回收艾達黴素可以任何合適方法（諸如離心、 過幻或It由合適離子型或非離子型吸附劑進行。為敌入 艾達黴素’可使用任何水溶性有機溶劑，其中酸 f。制酸性萃取移除苦元’之後，以高PH值將㈣自水 、 視化5物在蒸發最終萃取物之後的 概況而定，最終將艾这谢冬M丄 曰 -.，、糟由結晶或較佳藉由層析及結 曰曰來純化。使用二氧化矽管柱純化為有利的。 133759.doc 200916576 使13-DHED轉化為表道諾紅菌素 眾所周知13-二氫-蒽環黴素與13_酮基形式一起積累於醱 酵肉湯中U，13-DHED在商業上並不有肖，且基於其 細胞毒性性質，其應作為毒性廢棄物處理。出乎意外地， 儘官該代謝物不為天然、代謝物，但其藉由生物轉形菌株以 適用比率（例如>20%，較佳>30%，最佳>4〇%)轉化為表道 諾紅菌素。

表道諾紅菌素醱酵中之副產物13_DHED易於藉由層析繼 而結晶與糖苷部分分離’同時分離表道諾紅菌素。可將 13-DHED吸附至添加至（且尤其在後期步驟）具有道諾黴素 〇成月b力之鏈黴菌菌株培養肉湯中的樹脂上。儘管任何菌 株均合適，但使用早期生物合成路徑阻斷且不能積累道諾 黴素代謝物之菌株為有利的。 在本發明之—較佳實施例中，將來源錢黴菌屬，較佳 來源於波赛鏈黴菌青灰變種之新賴生物轉形菌株用於生物 轉形作用將13-DHED轉化為表道諾紅菌素。

在根據本發明產生表道諾黴素所述之條件下轉化率為 >2〇%，較佳>3G%，最佳>4G%e以此方式獲得之表道諾红 菌素可藉由任何用於蒽環黴素回收之習知方法由結合於樹 脂之其他代謝物純化’但較佳使用層析法且尤其逆相 法提供適當純化之表道諾紅菌素用於合成。 S 表道諾紅菌素轉化為泛艾黴素 使用粗表道諾紅菌素（純度>6〇%，較佳>8〇% >90%)作為合成化學之起始物質，謂得泛艾徽素 最佳 其為 133759.doc -14- 200916576 常用之癌症藥物。杯矜人a a i4_經基化。 m生物催化反應㈣可用於 可菌素轉化為其14-經基化形式泛艾黴素有幾種 ""b 内源基因產物14·經化酶在培養條件下並不且 有足夠活性來將所有报 成表道諾紅菌素轉化為泛艾黴 素仏e在i口養肉湯中發 (資料未展示卜即使高複Γ: 根據吾等實驗 使间複本數之14_羥化酶基因，仍不能完 成泛艾黴素產生之说1 ^ ' 過程。然而，兩個美國專利美國 攻，及美國6,210,930揭示藉由而以之基因產物低量道 =紅菌素轉化為阿黴素。顯然，該生物轉化高度依賴於條 件，吾人未能成功重複該方法。 類似於自道諾紅菌素合成阿黴素’ 一個羥基加入完整表 道諾紅菌素之C-14有各種可能性。 在由合成混合物萃取泛艾黴素之後，泛艾黴素之純化係 藉由層析及/或藉由結晶來進行。然而，為達成活性藥物 成伤斤要求之σσ質，層析分離必需提供>97%純度之 黴素。 以下實例給予本發明之更詳細描述。 對於熟習此項技術者顯“見’隨著技術進步，本發明 構思可以多種方式實施。本發明及其實施例並不限於下文 所述之實例’而且可在中請專利範圍範•内變化。 囷h @示道諾紅菌素之生物合成路徑。巴龍徽素 (BaUmyCin)係由道諾紅菌素形成。該生物合成路徑 分化為⑴阿黴素及（ii)道諾紅菌素之後巴龍徽素。 133759.doc 200916576 該等步驟在圖中未展^干 圖lb 揭示用於圖1丑中匚-了趟.,,, τι /-糖基化之dTDP-道諾胺之生物 合成路徑。 囷2 揭示生物轉形方法之流程。 圖3⑮不展不生物轉形菌株在饋以脫氧+羅多新嗣 之後之產生概況之層析圖。 實例 實例1生物轉形菌株之建構 將藉由突變誘發來源於野生型波賽鏈黴菌青灰變種 ATCC 27952之突變誘發菌株〇〇〇1在25〇 ml錐形瓶中之5〇 ml TSB-培養基中培養。所有用於突變誘發之燒瓶在燒瓶 底部含有線以在培養期間傳播菌絲。在3(rc下且在震盪器 中以330 rpm進行培養兩日。將i ml培養物進一步接種於含 有50 ml TSB之後續瓶中且繼續培養一曰（3〇。〇，bo rpm)。將該較年輕之培養物以Na〇H調整為鹼性pH值且添 加NTG以在>3 0°C下作用於細胞2〇分鐘。將該菌株之經突 變誘發培養物分為兩管’且藉由離心（3〇〇 rpm，10分鐘）糰 粒化。使用經組合糰粒接種50 ml TSB培養基。一曰 (30°C ’ 330 rpm)之後，藉由將合適稀釋液（亦即ι:1〇_ 1:100000)塗鋪於ISP4-平皿上來測定細胞懸浮液之滴定 度。將經突變誘發培養物菌落與野生型相比較且選擇彼等 展現與野生型不同之特徵之菌落用於進一步表徵。 在ISP4瓊脂平皿上基於深紅色著色野生型中之淺色選擇 出突變體。 133759.doc -16- 200916576 將基因MwO(T〇rkkell，2001)以大腸桿菌載體pCNB3〇33 引入突變體中。提出利用attP位點進行整合。如實例5中所 詳述，所獲得之經改良生物轉形菌株提供將>2〇%，較佳 >30% ’ |佳>4()%之所饋人4•脫氧_ε_羅多新酮轉化為艾達 黴素代謝物之重複轉化率。 實例2料生物轉形菌株以用於產纟葱環徽素代謝物及 用於生物轉形作用 將如實例！中所述選擇之合適突變體在5〇 W補充有吸附 樹脂（15 g/I)之以培養基中培養。（E1 :每公升自來水：葡 萄糖20 g;可溶性澱粉20 g;肽5 g;酵母萃取物25 g; Κ2ΗΡ04·3Η20 h3 g ; MgS〇4.7H2〇 ! g ;3 g ; CaC〇3 3 g ; pH值 7-7.5)。 為測定蒽環黴素代謝物，在培育第十日萃取化合物。為 進行分析’將吸附樹脂以水自一培養燒觀傾析且將經洗務 樹脂以40 ml酸性乙醇萃取，震盪至少3〇如〇。使用 分析樣品。已知在El培養基中使用吸附樹脂在該等條件下 增加蒽環黴素代謝物產生。 在吸附樹脂存在的情況下，在培養結束時未發現菌落形 態變化。 在突變株培養肉湯中未伯測到葱環&素代_ $ L 然而’突變株具有根據圖1之生物合成路徑用於糖基化 及苦元改造之功能性生物合成基因且其由進料實驗示範。 將天然苦元s'羅多新，及阿克拉菌酮饋給突變株⑷公升 培養肉湯至少100 mg苷元）且所饋入苷元在2日内轉化為道 133759.doc 17 200916576 諾黴素代謝物。然而，對突變株饋以4-脫氧-ε-羅多新_未 能提供艾達黴素代謝物之重複轉化。提出失敗原因係由斜 所饋入或所形成之產物的不良抗性所致。 如所預期，經改良生物轉形菌株能夠轉化天然苷元ε-羅 夕新_及阿克拉菌酮。如下文實例4中所述，其亦將非天 然類似生物合成中間物4-脫氧-ε-羅多新酮及13-DHED轉化 為艾達黴素及表道諾紅菌素。 實例3使ε-羅多新鲖合成轉化為4_脫氧_ε羅多新輞 對於合成4·脫氧-ε-羅多新酮使用具有>60%，較佳 >80% ’最佳>9〇%層析純度之經純化ε—羅多新酮。心脫氧_ ε-羅多新_之合成由四個步驟組成：Α)保護，Β)三笨曱基 化’ C)還原及D)去保護。 在各步驟之後，將產物藉由沈澱/自氯仿_甲醇混合物中 結晶分離。以TLC監測合成反應。 Α)保護 將ε-羅多新酮在室溫下溶解於氣仿中。將2當量曱氧基 丙烯添加至混合物中繼而添加i當量TMSC卜反應之後繼 而進行TLC。當如TCL板上所偵測反應完成時，使混合物 冷卻且將沈澱物收集及乾燥用於下一步驟。 B)三苯甲基化 將來自保護步驟之起始物質溶解於氯仿中。添加 NMP(N_曱基吡咯啶酮）及二-異丙基乙基胺（DlpEA)且最後 添加PhNTf2。以TLC監測反應。藉由向混合物中添加水及 檸檬酸使化合物沈澱。將沈澱物過濾且以KHs〇4洗滌。將 133759.doc 200916576 晶體過渡且在真空下乾燥。 c)還原 將來自三苯曱基化之物質在氬氣下懸浮於ACN中。添加 (Ph3P)4Ph繼而添加（乙基）3n及HCOOH。將反應混合物加 熱且反應之後繼而進行TLC。1 h之後反應完成。將反應混 合物冷卻且濾出產物。 D)去保護 ^ 將來自還原之產物溶解於氣仿中且在室溫下添加1當量 1 TsOHxH2〇。反應在〇.5 h内進行。將溶液以1 μ NaHC03洗 務’以MgS〇4乾燥且蒸發至乾燥。 4-脫氧-ε-羅多新酮純化 將去保護反應混合物（CHCl3/Ts〇H X η20)以氣仿稀釋且 以1 M NaHC〇3洗滌。將氯仿部分以無水MgS〇4乾燥，過 濾且蒸發至乾燥。自氣仿_甲醇進行結晶。將晶體過濾且 在真空下乾燥。 ( 實例4自來源於波赛鏈黴菌青灰變種之產生表道諾紅菌

素之突變株的培養肉湯中回收13_DHED 用於產生表道諾紅菌素之醱酵肉湯以以下次序含有三種 主要代謝物：表道諾紅菌素、13_DHED及表_領地徽素（參 考P專利申W案）。將吸附於樹脂上之取代物自獲自醱酵 之〇 Λ升ίσ養肉湯傾析。將樹脂藉由水洗蘇以移除細胞碎 片。將糰粒以乙醇萃取—至五次。藉由向經組合乙醇萃取 物中外加氣仿以氣仿卒取苦元。分離溶劑及水層。以微驗 性ΡΗ值將水相中之糖*萃取至氣仿中且以飽和NaHC〇3穩 133759.doc 19- 200916576 疋PH值。藉由以水洗滌移除鹽。最終，將氯仿相經由筒式 過濾器過濾。 進行夕膝層析法以分離代謝物。將經過據之氯仿泵入二 氧化矽官柱且使用氣仿_甲醇溶液作為移動相藉由層析法 純化。收集三種代謝物各自之純溶離份，且彙集各產物之 溶離份以供結晶。將13_DHED之溶離份藉由乙醇·水溶液 結晶。將晶體過濾且吸附於吸附樹脂。 實例5使4-脫氧_ε_羅多新酮及相關代謝物生物合成轉化 為艾達黴素 藉由將生物轉形菌株在兩個具有4〇〇 mj[ Ε丨培養基之燒 瓶中培養三日來製備菌種培養物。將培養物組合且使用 800 ml培養肉湯接種2〇公升補充有XAD 72Ei培養基。以 2〇么升體積，在30 C之溫度，350 rpm下且以1〇 i/min通氣 進行酸酵8日。pH值須保持微§复性，此4保所饋人4_脫氧_ ε-羅多新酮更穩定轉化為艾達黴素。自接種之後24小時開 始以於EtOH中之至少5 mg/ml 4_脫氧_卜羅多新嗣將脫 氧-ε-羅多新嗣連續饋入4日。戶斤饋入4-脫氧-ε•羅？新酮之 量為至少100 mg/1。 在以突變株生物轉形期間，自所饋人4_脫氧·卜羅多新明 產生兩種主要次級代謝物：亦即艾達黴素及13_二氫-艾達 黴素。其他次要代謝物為艾達黴素酮、13-二氫艾達黴素 _、巴龍黴素及13_脫氧_艾達黴素及其皆元。艾達徽素之 穩定滴定度為>20 mg/L，此外產生>2〇琳之先前中間物 巴龍徽素可藉由在酸性條件 1 3-DHI ;因此總量 >40 nig/L。 133759.doc •20· 200916576 下加熱（+45。(：，1小時）水解為艾達黴素。 自生物轉形菌株獲得之產物的層析圖展示於圖3中。 實例6使13_DHED生物合成轉化為表道諾紅菌素 如實例5中所詳述，進行生物轉形菌株之預培養。 一曰之後將吸附於樹脂之相當於至少5〇 mg/1培養肉湯之 13-DHED添加至培養物中且繼續培養四日。在含有別如 Εΐίσ養基之燒瓶中’在34C下，以3〇〇rpm進行酸酵。 一 根據層析分析’ 50%之13-DHED轉化為表道諾紅菌素。 1 偵測到少量（介於<10%之範圍内）泛艾黴素。

實例7苷元及蒽環黴素之分析量測 TLC 1 · 0.5 MQ-水

2. 0.1 HCOOH

3. 25 MeOH 4. 75 CHC13 ’與溶液1、2及3小心混合

, HPLC 1 . 設備：屬於1100系列之具有二極體陣列偵測器之 Hewlett-Packard層析設備。 管柱：Zorbax，SB-C8，Agilent，4,6x150 5 μπι 所用溶劑：0.05 % TFA及1:1 MeCN-四氫呋喃 管柱溫度：30°C 流速：1 ml/min 偵湏ll : 254±8 nm，參考波長 600 nm±50 nm 注射體積：5 μΐ 133759.doc 21 200916576 壓力：最小20巴，最大300巴 所用參數：

時間(min) 0.05% TFA之量的百分比 MeCN_THF之量的百分比 0 76.0 24.0 0.1 76.0 24.0 13.0 32.0 68.0 16.0 1.0 99.0 19.0 1.0 99.0 20.0 76.0 24.0 24.0 76.0 24.0 參考文獻清單

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Claims (1)

1. 200916576 十、申請專利範圍： 1.種微生物菌株，其將蒽環黴素（anthracycline)代謝物轉 化為非天然蒽環黴素抗生素。 2·如請求項！之菌株，其中該等蒽環黴素代謝物係選自由 表道諾紅菌素（epidaun〇rubicin)、13_二氫表道諾紅菌 素、4 _表_領地黴素（t-epi-feudomycin)及ε_羅多新酮（ε-rhodomycinone)組成之群。 3. 如請求項1至2中任一項之菌株，其中該等非天然蒽環黴 素抗生素係選自由泛艾黴素（epirubicin)及艾達黴素 (idarubicin)組成之群。 4. 如請求項1之菌株，其中該菌株係選自鏈黴菌屬（genera 少 Ceiy)。 5. 如吻求項4之菌株，其中該菌株較佳選自菌種波賽鏈黴 菌(Streptomyces peucetius)。 6·如μ求項5之菌株，其中該菌株更佳選自亞種波赛鏈黴 菌月灰1種（沿广6/^〇所少ceipewce""*? var. cae以·《>?) 〇 7. 如請求項1之菌株，其包含異源抗性基因 8. 如明求項7之菌株，其中該基因係自鏈黴菌屬分離。 9·如請求項8之菌株’其中該基因較佳自菌種黑胡桃鍵徽 菌如）分離。 戈口明求項i之菌株，其中該菌株提供>2〇〇/。之該等蒽環黴 素代謝物轉化為該等非天然蒽環黴素抗生素之轉化率。 11.如叫求項10之菌株，其中該菌株提供較佳>3〇%之該等蒽 環黴素代謝物轉化為該等非天然蒽環黴素抗生素之轉化 133759.doc 200916576 率。 12.如凊求項U之菌株，其中該菌株提供最佳>40%之該等貧 ^黴素代謝物轉化為該等非天㈣環黴素抗生素之轉化 準〇 13·=用微生物菌株將葱環黴素代謝物轉化為葱環黴素 抗生素之方法。 Μ:請求項::之方法，其中該等葱環黴素代謝物係選自由 s ®素13· —氫表道^紅菌素、4,·表領地徽素 及ε-羅多新酮組成之群。 15·如請求項13至14中 項之方法，其中該等蒽環黴素抗 生素係選自由泛艾徽素及艾達黴素組成之群。 16·如:求項13之方法’其中該菌株係選自鏈黴菌屬。 17_如印求項16之方法，其中該菌株較佳選自波赛鏈黴菌 種0 18.如请求項17之方法，其中該菌株更佳選自亞種波赛鍵徽 卤青灰變種。 如叫求項13之方法’其中該菌株係經基因改造。 月求項1 3之方法’其中該菌株提供>2G%之該等蒽環黴 素^謝物轉化為該等非天環黴素抗生素之轉化率。 π :长項2G之方法’其中該方法提供較佳>3㈣之該等蒽 衣黴素代謝物轉化為該等非天然蒽環黴素抗生素之轉化 率。 ^求項21之方法’其中該菌株提供最佳>4〇%之該等葱 衣黴素代謝物轉化為該等非天然蒽環黴素抗生素之轉化 133759.doc 200916576 率。 23.如請求項13之方法，其中用於生物轉形作用之粗蒽環黴 素代謝物之純度為>60%。 24.如請求項23之方法，其中用於生物轉形作用之粗蒽環黴 素代謝物之純度較佳為>80〇/〇。 25·如明求項24之方法，其中用於生物轉形作用之粗蒽環黴 素代謝物之純度最佳為>9〇〇/0。 26.如％求項13之方法，其中在任何時間使用樹脂來吸附該 等蒽環黴素代謝物或蒽環黴素抗生素。 27’如清求項26之方法’其中該樹脂係選自由離子型及非離 子型吸附劑組成之群。 28·如請求項27之方法，其中該樹脂係選自聚苯乙稀之群。 29.如睛求項28之方法’其中該樹脂係選自由XAD-7及 Diai〇n ΗΡ-20組成之群。 3 0·如凊求項26之方法 加。 3 1.如請求項3 〇之方法 加。 其中該樹脂係以1_100 g/l之量添 其中該樹脂較佳以10_50 g/1之量添 3 2 ·如清求項3 1之方沐 ^ , 加。 方心其中該樹脂最佳以15jg/1之量添 33. 一種表道諾紅菌素 徽素或ε-羅多新網之用^紅菌素、4'_表-領地 蒽環黴素抗生素。 …、使用微生物菌株轉化為 133759.doc