TW200900504A - Recombinant human interferon-like proteins - Google Patents

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200900504 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域3 發明領域 本申請涉及具有人干擾素樣生物學活性的重組蛋白。 5 【先前技術】 發明背景 在本申請中採用在Nature(l)中公佈的干擾素（iFN)術 語。 人干擾素（HuIFN)由Isaacs和Lindenmann在1957年發現 10 (2)，其是一個熟知的細胞因數家族，所述細胞因數由各種 真核細胞在暴露於各種不同刺激如病毒感染或者接觸促細 胞分裂原後分泌。IFN可以引起細胞行爲的多種變化，包括 影響細胞的生長和分化以及調節免疫系疵(3-7)。HuIFN分 爲6個亞型，即IFN_a，IFN_冷，IFNj，IFN-ω，IFN-e 15和1FN—k。HuIFN-a(白細胞衍生的子擾素）在人白細胞中 産生，而少量HuIFN-/3(成纖維細胞衍生的干擾素）在類淋 巴母細胞中産生。HuIFN根據其化學和生物學特徵進一步 分爲兩大類型，即類型I和類型Η。類蜇I包括1FN- «和IFN-/5亞型以及最近發現的IFN-〇，IFN_5和IFN-λ:亞型。類 20型11只有一個成員：IFN-r (免疫干擾素）。 不同的干擾素亞型具有不同的結搆和生物學特徵。 HuIFN-yS是N—聯糖蛋白（8，9)，其已被純化至具有均一性 並進行了表徵。其大小是不均一的，灯能是由於它的糖部 分。但是，只存在一個人IFN-召基因，其痂碼含166個氨基 5 200900504 酸的蛋白質。IFN- y5與IFN- α的同源性低，共用大約30-40% 的同一性。 與IFN-/5基因的單一性不同，HuIFN-α是由大體上14 個基因的多基因豕族組成的亞型。由一個或兩個氨基酸差 5 異形成的小變體說明了複等位基因的存在（10)。除了假基因 IFNAP22以外’存在13個基因，其編碼13種蛋白質。每種 蛋白質由165-166個氨基酸組成。IFNA13基因所編碼的蛋白 質與IFNA1蛋白相同。因此，存在12種不同的干擾素蛋 白：IFNA 卜 IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、 10 IFNA10、IFNA14、IFNA16、IFNA17和 IFNA21。IFN-α 亞 型之間的氨基酸序列同一性通常爲80-85%(11)。 成熟的IFN- ω與IFN- α種類的家族顯示出60%的核芽 酸序列同源性’但其C-末端長了 6個氨基酸。IFN-ω與干擾 素-/5的相關性更遠（共用大約3〇%的序列同源性）。人IFN_ 15 ω沒有歸類到IFN-α組，這是因爲它在抗原性方面與汪队 «不同’以及在其與I型IFN-α受體的相互作用方面不同 (12) ° IFN- ω由感染了病毒的白細胞分泌，作爲人白細胞干 擾素的主要組分。 成熟的人IFN- ε蛋白含有185個氨基酸，分別與iFH-a 20 2和1FN-万共用大約33%和37%的序列同源性（13，14)。IFn_ ε的功能和生物物理學特性還沒有得到有效的詳細表徵· 但是’它像1型干擾素一樣發揮作用。IFN- ε也可能在生殖 功能上發揮作用（15)。 IFi^/c是含180個氨基酸的人細胞因數，其是一種最近 6 200900504 鑒定的I型IFN。IFN-zc的編碼序列與在人中發現的其他 干擾素具有〜30%的同一性。IFN- /c的一個區別性特徵是· 在未誘導的細胞特別是角質形成細胞中其轉錄物的可檢測 的組成性表達。：IFN-/C可能通過影響先天免疫系統的細胞 5而在調節全身或局部免疫功能中發揮作用（16)。但是，IFN_ 凡表現出低的抗病毒活性（17)。 人I型干擾素看來似乎結合2個受體亞基，即 和-2，它們廣泛分佈在各種細胞類型的細胞表面。配基的 參與誘導了分別耦聯至IFNAR-1和-2的酪氨酸激酶TYK2和 10 JAK-1的鱗酸化。一旦發生填酸化，STAT蛋白就從受體上 釋放出來並形成同源二聚體和異源二聚體（丨8，丨9)。釋放 後，STATA的二聚體結合干擾素應答因數9(IRF_9)(其是一 種DNA結合蛋白），從而形成稱作IFN刺激的基因因數 -3(ISGF-3)的複合物，其遷移入細胞核中。接著，isgf_3 15複合物與在所有1FN可誘導的基因的上游存在的一個DNA 元件相結合。這就是所謂的，，經典的，，信號轉導途徑。 目前不斷發現了受I型IFN調控的新的作用方式和生化 途徑。例如’在所述信號轉導途徑中ρΐ3Κ的下游，核因數 /c -B(NF- /c Β)和PKC-d與在用iFN_冷孵育的嗜中性粒細胞 2〇 中觀察到的抗凋亡效應相關（2〇)。 超過300個基因（稱作干擾素誘導的基因）對吓^處理起 反應。研究最多的IFN蛋白是具有抗病毒特性的那些。例 如，2，5寡腺苷酸合成酶家族的酶催化合成短 的募腺苷酸，其結合並活爲一種切割病毒和細 200900504 胞RNA的酶），從而抑制蛋白質的合成。經滅遍活化的蛋 白激酶(PKR)使翻澤抑制因數eIF2a填酸化，還可導致病毒 和田胞蛋白貝合成的抑制。最近，還發是活化轉錄 因數NF /c B所必需的’脈《B是在炎性細胞因數誘導、免 5疫調節和社中的中心作用物。Mx⑽病毒抗性)蛋白通過 阻止細胞内病毒顆敕的轉運或者病毒RNA的轉錄來抑制 RNA病毒的複製。RNa•特異的腺普脫氨酶(adar)將腺苦 轉化成肌苷，從而造成病毒1?^入基因組的超變(21)。

HuIFN具有廣譜的生物學活性，包括抗病毒、抗腫瘤 10以及免疫調節功能。已經廣泛研究了人干擾素的臨床潛 能，並總結在下面。 在抗腫瘤應用方面，HuIFN可能通過調控免疫調節和 抗血管生成應答而間接地或通過影響腫瘤細胞的增殖或細 胞分化而直接地介導抗腫瘤效應(2 2)。干擾素療法已經用於 15治療各種白血·病（23)，例如多毛細胞白血病（24)、急性和慢 性髓細胞白血病（25-27)、骨肉瘤（28)、基底細胞癌（29)、神 經膠質瘤（30)、腎細胞癌（31)、多發性骨髓瘤（32)、黑色素 瘤（33)、卡波西肉瘤（23)和何傑金氏病（34)。對於IFN-α與 阿糖胞苷（ara-C)、5-FU、羥基脲(hydroxyura)以及IL-2的聯 20 合治療進行了徹底研究，多數都表現出顯著好於單獨的 HuIFN- α的結果(3)。聯合HuIFN和替莫唑胺來協同治療晚 期癌症也已經被報道(35)。 在抗病毒應用方面，HuIFN已經在臨床上用於抗病毒 療法，例如，治療AIDS(36)，病毒性肝炎包括慢性乙型肝 8 200900504 炎、丙型肝炎(37，38)，乳頭瘤病毒感染（39)，皰疹病毒感 染（40)，病毒性腦炎(41)，以及預防鼻炎和呼吸道感染（4〇)。

HuIFN也已經在臨床上用於抗菌療法(42)，例如，霧化 的HuIFN- 7 (43)和HuIFN- α已經用於多藥耐性肺結核患者 5 (44)。HuIFN- 7"已經用於治療多藥耐性腦結核(45)。

HuIFN也已經在臨床上用於免疫調節療法，例如，預 防移植物抗宿主的排斥反應，或減緩自身免疫疾病例如多 發性硬化症(46，47)和斯耶格倫综合征(48)的進展。IFN_^ 在美國已經被FDA批准用於治療多發性硬化症。最近，已 10經有報道指出多發性硬化症患者的I型干擾素和白細胞介 素-2的產生減少（49)。此外，使用HuIFN_a的免疫調節治療 看起來在進行骨髓移植後復發的慢性髓細胞白血病（CML) 患者中是一種有效療法(5〇)。 在疫苗輔佐方面，HuIFN已經作爲佐劑在臨床上用於 15 療黑色素瘤（51)，並且也可以在許多其他疾病的預防或治 療性疫苗接種中用作佐劑或協佐劑以增強或刺激免疫反應 (52)。

HuIFN-〇； 2a是第一種在臨床試驗中使用的血管生成抑 制劑，其對於治療危及生命的血管瘤在兒童中是有效的 (53 54)另一種臨床適應症是骨巨細胞瘤。等人報 C 了下頜月的大的、快速生長的復發性的巨細胞瘤的顯著 消退(55)。 雖然HuIFN有許多重要的臨床應用，但它們也表現出 顯著的副作用和其他限制。大多數細胞因數（包括HuIFN) 9 200900504 具有相對較短的迴圈半賴，這是因爲它們在體内産生從 而局部且短暫地發揮作用。由於它們通常作爲全身性治療 劑進行施用’因此需要頻繁地並且以相對較高的劑量進行 施用。頻繁的腸胃外施用既不方便又痛苦。此外，與Huifn 5施用相關的毒性副作用經常很嚴重，以至於-些患者不能 忍受該；台療。這些副作則艮可能與高劑量的全身施用相 關此外，在匕床研究中已經發現，—些耒老产+斜勒 rHuIFN的抗體，該抗體中和側脈的生物學活性^)。 10 15 很明顯’多種應用（例如，抗癌療法，以及抗病毒療法、 、療法抗寄生蟲療法、抗菌療法，或者任何需要干擾 素活性增強和/或副作料低的醫療狀況或情形）都迫切需 要=展新的、效力增強的干擾素蛋白。總之，HUIFN很有 (=)b在下—代新型抗腫瘤和抗病毒療法中發揮重要作用 ^現有技術中熟知，改善細胞魄藥物㈣物學性質 有效方式是使細胞隨蛋自本輕生錢。隨著時間 用於^變干擾素肽的多種策略和技㈣到發展。一 Α "目剛有3種策略可用於産生HuIFN-a突變體。 TF\r "種策略疋製備㈣雜合體。—些研究者已經利用 編石馬序列中具有天然存在的限制性内切酶㈣酶切位 :k—點來連接同源編碼片段⑺，58)。Η。—和Di 已經對許多雜合劃的産生進行了綜述⑴）；該文

些研究者已經利用PCR =供了構建此類分子的過程的概覽。描述了歸構建雜 口體干擾素的方法的具體實例。 20 200900504 擴增來構建突變型IFN-α，從而產生有特殊需要的核苷酸 片段，進而獲得將不同IFN的新片段進行連接的可能性 (59)。美國專利6,685,933(60)還描述了製備人IFN雜合體的 PCR擴增技術。所述干擾素雜合體可以在一種干擾素亞型 5中產生，例如美國專利5,137,720(61)和美國專利 6,685,933(60)所描述的，或者在至少2種不同的干擾素類別 組之間産生，例如美國專利6174996(62)和美國專利 6,685,933(60)所描述的。此外，雜合體的親本基因可以來自 一個物種（主要來自人），例如HuIFN-α和HuIFN-ω之間的 10 雜合體，或者來自超過一個的動物物種，例如人和鼠干擾 素-α之間的雜合體(63)。 第二種構建干擾素突變體的策略是利用位點定向點誘 變’其通過在IFN的DNA分子中引入一個或多個核苷酸的變 化(64)。最近，將系統突變和電腦方法用作蛋白質誘變的指 15 導(65)。 第三種構建I型HuIFN的策略是將通過RE消化、PCR擴 增、化學合成或DNA酶消化獲得的IFN基因片段進行改組， 隨後進行PCR以將所述片段進行隨機連接，接著進行擴 增。得到的PCR産物事實上是重排的干擾素α基因片段的 20 庫，其可用於構建DNA庫，從中可以分離出具有所需表型 的DNA克隆(66)。例如，Chang等人已經描述了一種構建和 篩選HuIFN改組文庫的方法，以鑒定在小鼠細胞中抗病毒 和抗增殖活性增強的HuIFN衍生物(67)。 人干擾素alfacon-Ι(複合干擾素（consensus interferon)) 11 200900504 是一種重組的非天然存在的HuIFN-α，含166個氨基酸。它 是通過根據已知的經克隆的HuIFN-α序列來評估每段相應 區域中最高度保守的氨基酸而産生的。在氨基酸水平上， 它與HuIFN-α 2b具有89%的序列同源性，和其特異性抗病 5 毒活性爲大約1 〇9 IU/mg。人干擾素alfacon_ 1已經被批准用 於治療18歲或18歲以上的代償性肝病患者的慢性hcv感染 (68)。 儘管現有技術中已知一些重組干擾素蛋白，但仍然需 要生物學活性增強的新型干擾素樣蛋白和蛋白質組合物。 10 【發明内容】 發明概要 根據本發明，公開分離的多核苷酸，，其編碼具有人干 擾素樣生物學活性的蛋白質。在一個實施方案中，所述多 核苷酸包含與SEQ ID No : 1至少93%同一的核苷酸序列。 15在其他實施方案中，所述核苷酸序列與SEQ ID No : 1至少 95%同一或至少98%同一。 在一個實施方案中，本發明所包括的蛋白質選自其令 每個蛋白質具有與SEQ ID No : 2至少85%同一的氨基酸序 列的蛋白質的組。優選地，所述蛋白質不是天然存在的， 20並且具有與人干擾素a 2b(HuIFN-a 2b)相比而言增強的抗 病毒和抗增殖活性。例如，所述蛋白質的抗病毒活性爲 HuIFN-o:2b的至少2倍，和抗增殖活性爲HuIFN_a2b的至 少10倍。在特定的實施方案中，蛋白質氨基酸序列與SEq ID No : 2至少90%同一或至少95%同_。 12 200900504 本發明包括包含所述多核苷酸序列的重組載體以及包 含所述栽體的宿主細胞。本發明還包括表現出人干擾素樣 生物學活性的多肽片段。本發明進一步包括表現出干擾素 樣生物學活性的蛋白質構建體和其他組合物，例如包含所 5 述蛋白質和另一部分例如無機聚合物的綴合物。本發明進 一步包括所述蛋白質和所述組合物用於治療目的的方法和 用途’例如作爲抗病毒劑或抗癌劑。本發明還可用於治療 其他對干擾素療法作出回應的病狀。 圖式簡單說明 10 第1圖描繪了編碼本發明的新型蛋白質的完整DNA序 列（SEQ ID No : 1)，所述新型蛋白質在此稱爲 NovaferonTM(A)。第1圖還顯示了 Novaferon的預期氨基酸序 列（SEQ ID No : 2)(B)，以及Novaferon氨基酸序列和 Novaferon DNA序列的比對(C)。成熟Novaferon蛋白的第一 15 個氨基酸半胱氨酸被指定爲殘基1。 第2圖顯示了 Novaferon基因和HuIFN- 〇： 14基因 (Genebank編號：ΝΜ_002172)的核苷酸序列比對(a)，以及

Novaferon 蛋白和 HuIFN- α 14 蛋白（從 Genebank 編號： NM—002172翻譯的）的氨基酸序列比對(B)。成熟他^^如⑽ 20 蛋白的第一個氨基酸半胱氨酸被指定爲殘基1。Novafenm 與HuIFN- α 14在核苷酸水平上共用大約93%的序列同_性 (462/498)，和在氨基酸水平上共用大約87°/〇的序列同_性 (144/166)。不同的核苷酸用中間線中的空缺來進行桿示。 第3圖顯示了 Novaferon基因和HuIFN- α 2b Α因 13 200900504 (Genebank編號：NM_000605)的核苷酸序列比對(A)，以及 Novaferon蛋白和HuIFN- a 2b蛋白（從Genebank編號爲 NM_000605的HuIFN- a 2b基因翻譯出的）的氨基酸序列比 對(B)。成熟Novaferon蛋白的第一個氨基酸半胱氨酸被指定 5 爲殘基1。Novaferon與HuIFN- a 2b在核苦酸水平上共用大 約89%的序列同一性(445/498)，和在氨基酸水平上共用大 約81%的序列同一性（135/166)。不同的核苷酸用中間線中 的空缺來進行標示。 第4圖的圖顯示了，與HuIFN- a 2b相比，Novaferon對 10 於Daudi細胞的體外抗增殖抑制。 弟5圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 前列腺癌PC-3異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 第6圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 肝癌Hep G2異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 15 第7圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 黑色素瘤A -3 75異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 第8圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有結 腸癌細胞LS 180異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 第9圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 20白金病111^60^異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 【實施方式】 較佳實施例之詳細說明 在以下整個說明書中，提供了具體的細節以便更徹底 地瞭解本發明。但是，本發明的實施可以不受這些特殊說 14 200900504 明的限制。在其他情況下’沒有顯示或詳細描述衆所周知 的元素以避免不必要地使得本發明含糊不清。相應地，本 說明書和附圖應當被認爲具有舉例說明性的而不是限制性 的意義。 5 術語的定義 在詳細描述本發明以前，應當瞭解本發明不限於所述 的特疋蛋白質分子、方法、操作規程、細胞系、載體和試 劑’因爲都可以改變。還應當瞭解，在此使用的術語只在 於描述特定的實施方案，而不希望限制本發明的範圍，本 10 發明的範圍僅由所附的權利要求書來限定。 爲了更完全地瞭解在此描述的本發明，採用以下術 語，它們較義如下所示。應當瞭解，在此使用的術語只 在於描述特定的實施方案，而不希望限制本發明的範圍， 本發明的範圍僅由所附的權利要求書來限定。 15 除非另外定義，在此使用的所有技術和科學術語具有 與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含 義。所有在此提及的出版物引入本文作爲參考，以用於描 述和公開在所述出版物中所報道的細胞系、载體和方法， 其可用於本發明。在此沒有任何事物可被認爲承認了，本 20發明沒有位於依據在前發明的此類公開内容之前的權利。 術語，，干擾素，，指由多種真核細胞在暴露於各種不同的 %境刺激（包括病毒感染或者接觸促細胞分裂原）後產生的 刀泌型蛋白質家族。除了具有抗病毒特性以外，干擾素還 顯示出影響多種細胞功能。所有在此表述的干擾素單位都 15 200900504 參考 WHO 國際標準 ’ 94/786(複合 rHulFN_ α (rHuIFN_ “ consensus))和 95/650(rHuIFN- α 2a)。 術語”干擾素樣”指由已知干擾素或干擾素類似物所表 現的功能和/或結構特徵或與其相似的功能和/或结構特 5徵。例如，”干擾素樣生物學活性”包括抗病毒和抗增殖活 性。干擾素樣生物學活性的其他例子在此處進行了描述， 並且會被本領域技術人員所理解。術語，，活性，，複數形式包 括單數形式；即，本發明包括表現出至少一種干擾素樣活 性的重組蛋白或其他蛋白質構建體或組合物。 10 術語”複合干擾素（consensus interferon)”指一種類型的 合成干擾素，其的氨基酸序列是所有已知人α干擾素亞型 的大致平均的序列。已經報道了，複合干擾素具有比任何 天然人IFN- α亞型更好（約5倍）的抗病毒、抗增殖和啟動ΝΚ 細胞的活性。 15 在此使用的術語”分離的”指已經離開其天然環境的分 子，例如DNA或RNA。例如，根據本發明的目的，包含在 載體中的重組DNA分子被認爲是分離的。分離的DNA分子 的進一步例子包括在異源宿主細胞中維持的重組DNA分子 或在溶液中的（部分或基本上）純化的DNA分子。”分離 2〇 的’’DNA還包括，從含有天然或人工目的DNA片段的文庫中 回收的DNA分子以及化學合成的核酸。因此，分離的核酸 可以重組産生。 術語”核苷酸序列，，指包括募核苷酸、多核苷酸或核苷 酸分子及其片段或部分的一連串核苷酸。在DNA分子的情 16 200900504 況下，所述序列可以包含一系列脫氧核糖核苷酸，而在RN A 分子的情況下’所述序列可以包含相應的一系列核糖核苦 酸。寡核苷酸、多核苷酸或核酸分子可以是單鏈或雙鏈的， 而核苦酸序列可以代表正義鏈或反義鍵。 術語”寡核苷酸片段”或”多核苷酸片段”、，，部八,，、 區段，，或，，探針，，或，，引物，，可互換使用，其是指長戶2 或 約5個核苷酸的一連串核苷酸殘基。優選地 ^'大 、111所述片俨 於與靶核苷酸序列雜交。引物用作DNA聚合酶 用 10 15 20 酶或逆轉錄酶所催化的核苷酸聚合的起始點。片聚合 可唯一地鑒定本發明的每種多核苷酸序列。優選=或區段 片段包含與SEQ ID NO : 1基本上相似的序列。 ’所述 術語，，蛋白質，，或，，肽，，或，，募肽，，或，，多狀，，是才匕勺人 串氨基酸的天然存在的或合成的分子。 3〜連 術語”開放閱讀框”或ORF表示不含任何终 ^ '' > ^ 一系列編碼氨基酸的核苷酸三聯體，並通常表八。'的 蛋白質的序列。 可·譯戍 術語”成熟的蛋白編碼序列”指編碼不含信號序 導序列的蛋白質或肽的序列。所述蛋白質可以通過=或前 任何前導/信號序列的細胞内進行加工來産生。蛋白去除 合成産生，或利用僅編碼成熟蛋白質編碼序列的質可以 來產生。 亥替峻 在此使用的術語”純化的，，或，，基本上純化的，，表示 的蛋白質以基本上不存在其他生物大分子例如其=所示 質、多肽等等的升> 式存在。純化所述蛋白質從 蛋白 ' 其麵成 17 200900504 了所存在的所示生物大分子的至少95重量％(但水、緩衝劑 和其他小分子，尤其是分子量小於1000道爾頓的分子可以 存在）。 術語”重組表達媒介物或載體，，指用於從DNA(RNA)序 5列表達蛋白質的質粒或噬g體或病毒或載體。表達媒介物 可以包含轉錄單元，所述轉錄單元包括（1)在基因表達中具 有調節作用的一個或多個遺傳元件，例如啓動子或增強 子’（2)結構或編碼序列，其被轉錄成mRNA並翻譯成蛋白 貝，以及(3)適當的轉錄起始和終止序列。希望在酵母或真 10核表達系統中使用的結構單元優選地包含前導序列，其使 宿主細胞能夠將翻譯的蛋白質分泌到細胞外。備選地，當 重組蛋白以沒有前導或轉運序列進行表達時，其可以在氨 基末端包含曱硫氨酸殘基。隨後，該殘基可以或可以不從 表達的重組蛋白上切割下來從而獲得最終產物。 15 術語”基本上的相似性”涉及當與其他核苷酸或其互補 鏈進行最佳比對時，與另一個核酸具有高度序列同一性的 核酸或其片段。序列同一性或同源性可以用序列分析軟體 例如BLASTN進行測定。如果第一個核酸與第二個核酸在 進行最佳比對時顯示出至少大約85-95%或更高的序列同一 2〇 性’則認爲兩者是基本上相似的。例如，爲了測定兩個不 同核酸之間的序列同一性或同源性，採用BLASTN程 式”BLAST 2 sequences”。該程式可以通過因特網（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/M2seq/wblast2.cgi)從 National

Center for Biotechnology Information(NCBI)獲得以供公衆 18 200900504 使用（69)。作爲非限制性實例，可以利用默認的軟體設置進 行這種比較（預期=10，篩檢程式=缺省，開放缺口 = 5，延 伸缺口 =2罰分，缺口 X降低=50)。同樣，如果第一個蛋白 質或多肽與第二個蛋白質或多肽在用採用默認設置的 5 BLAST軟體(blastp)進行最佳比對和比較時顯示出至少大約 85-95%或更高的序列同一性，則認爲兩者是基本上相似的。 作爲進一步舉例說明，具有與編碼蛋白質的參考核苷 酸序列至少例如95%’’同一的”核苷酸序列的多核苷酸，表示 所述多核苷酸的核苷酸序列與參考序列是同一的，除了在 10 每10 0個編碼所述蛋白質的所述參考核苷酸序列的核苷酸 中，所述多核苷酸序列可以包含多達5個的點突變。換言 之，爲得到具有與參考核苷酸序列至少95%同一的核苷酸 序列的多核苷酸，參考序列中多達5%的核苷酸可以被刪除 或用另一核苷酸置換，或者高達參考序列總核苷酸的5%的 15 核苷酸數目可以被插入到參考序列中。 在此使用的術語”互補的”或”互補性”指多核苷酸在許 可的鹽和溫度條件下通過域基配對的自然結合。例如，序 列”A-G-T”結合至互補序列”T-C-A”。兩條單鏈分子之間的 互補性可以是’’部分的”，即其中只有一些核酸結合，或者， 20 當單鏈分子之間存在全部互補性時，則可以是完全的。核 酸鏈之間的互補程度對於核酸鏈之間的雜交效率和強度有 顯著的影響。這對於依賴於核酸鏈之間的結合的擴增反應 來說特別重要。 術語”轉化”表示將DNA導入生物體從而使所述DNA能 19 200900504 夠作爲染色體外元件或者通過染色體整合進行複製。術語” 轉染”指表達載體被合適的宿主細胞所吸收，而不管編碼序 列實際上是否表達。 術語”治療”及其語法上的等價詞以最廣泛的含義進行 5 使用，包括治療性處理、阻止、預防和改善某些不希望的 症狀或病狀。 在此使用的術語”生物學活性”指在活系統中的結構、 調控、生化或其他生物學功能，例如與天然或非天然存在 的分子相似或同一。 10 在此使用的術語”抗增殖”和”抗增殖的”指減慢和/或阻 止細胞的生長和分裂，導致細胞總數的減少和/或在任一細 胞周期階段或所有細胞周期階段中靶細胞百分比的降低。 細胞靜止在某一特定的細胞周期時相時，可以進一步分 爲：G1期（Gap 1)，S期（DNA合成），G2期（Gap 2)或Μ期（有 15 絲分裂）。在此使用的術語”抗增殖活性”指蛋白質、蛋白質 構建體或組合物在體外或體内抑制細胞增殖的活性，尤其 是贅生性細胞如癌細胞的增殖。 在此使用的術語”抗腫瘤”或”抗癌”指阻礙或阻止惡性 腫瘤的形成。在此使用的”抗腫瘤活性”或”抗癌活性”指蛋 20 白質、蛋白質構建體或組合物在體外或體内抑制細胞增殖 的活性，尤其是贅生性細胞如癌細胞的增殖。 術語”IC5Q”或”半最大抑制濃度”表示在體外抑制50% 細胞生長所需要的抑制劑例如蛋白質的濃度。 在此使用的術語”抗病毒的”和”抗病毒”指在體外和/或 20 200900504 在體内減缓和/或阻止細胞的病毒感染或者干擾細胞内的 病毒複製，導致病毒繁殖減慢或停止，或者病毒顆粒總數 降低。在此使用的”抗病毒活性”表示蛋白質、蛋白構建體 或組合物在體外或體内抑制病毒感染或干擾病毒複製的活 5 性。

Novaferonl 白 本發明涉及製備和鑒定新型人干擾素樣蛋白，其在此 稱爲’’Novaferon”™。正如下面所詳細描述的，根據在標準 體外測試中所測量的，Novaferon蛋白表現出相比天然存在 10 的HuIFN-a 2b而言增強的抗病毒和抗增殖生物學活性。特 別地，在相同測試系統中，與HuIFN- a 2b相比，Novaferon 蛋白顯示出當在Wish-VSV系統中進行測試時抗病毒活性 增加至12.5倍’和Daudi細胞生長的抗增殖抑制提高至大約 400倍。 15 在一個實施方案中，Novaferon蛋白由多核普酸編碼， 所述多核苷酸由498個核苷酸組成，如SEQ ID No: 1和第1 (A) 圖所示。成熟的Novaferon蛋白由166個氨基酸組成，如SEQ ID No : 2和第1(B)圖所示。本發明所包括的多核苷酸和氨 基酸序列及其變體在下面進一步詳細描述。 2〇 爲了比較’發明者對Novaferon和天然存在的HuIFN的 同源性進行了研究。BLAST檢索表明，Novaferon在核苷酸 和氨基酸水平上與HuIFN-α 14均具有最高的同源性。如第2 圖所示，編碼Novaferon的多核苷酸序列（SEQ ID No : 1)與 HuIFN-a 14具有大約93%(462/498)的同源性，而氨基酸序 21 200900504 列與HuIFN-α 14具有大約87%(144-166)的同源性。與最廣 泛使用的人干擾素產品HuIFN-a2b相比，核苷酸水平上的 同源性爲大約89%(445/498)，而氨基酸水平上的同源性爲 大約81%(135/166)，如第3圖所示。 5 對於合成的IFN alfacon-1 (複合干擾素），Novaferon在核 苷酸水平上具有大約91%的序列同一性(453/498)，而在氨 基酸水平上具有大約84%的序列同一性（140/166)。 正如下面實驗部分所詳細描述的，多核苷酸序列（SEQ ID No : 1)選自I型人干擾素的DNA改組文庫。簡言之， 10 Novaferon蛋白是通過用含有完整的SEQ ID No : 1的多核苷 酸序列的重組載體轉染宿主細胞來産生的。純化在宿主細 胞系的上清液中所含有的Novaferon蛋白，並顯示表現出人 干擾素樣生物學活性，例如抗病毒和抗增殖功能。 多核苷酸和轡體 15 本發明的新型多核苷酸序列/核酸分子由498個核苷酸 組成，如在第1圖（SEQ ID No : 1)中所示的。利用在此提供 的資訊例如核苷酸序列，可以通過重組表達、化學合成或 者通過使用其他標準分子生物學程式例如用於D N A誘變的 那些來獲得本發明的編碼Novaferon蛋白（SEQ ID No : 2)的 20 核酸分子。 除了分離的核酸分子（SEQ ID No : 1)之外，本發明還 包括其序列不同於SEQ ID No : 1中所示DNA序列的DNA分 子，但由於遺傳密碼的簡並性，仍編碼與Novaferon蛋白 (SEQ ID No : 2)相同或基本上相同的氨基酸序列。遺傳密 22 200900504 碼和物種特異的密碼子偏愛在本領域中是已知的。因此， 對於本領域技術人員來說常規的是，產生不同於SEQ出 No : 1的DNA序列的DNA序列簡並變體，以便例如對於特 疋佰主優化畨碼子表達（例如，將人mRNA的密碼子變成細 5菌宿主如大腸桿菌（E. coli)偏愛的密碼子）。

本發明進一步提供了具有第1圖（3£卩1〇^^〇: 1}所示核 苷酸序列的分離的核苷酸分子，或具有與SEQ ID No : 1的 核酸序列互補的序列的核酸分子。本發明還提供了相關資 訊’並涉及包含本發明的分離的核酸分子的重組載體，和 10涉及含有所述重組載體的宿主細胞，以及涉及製備此類載 體和形成表達Novaferon蛋白的宿主細胞以及利用所述宿 主細胞來通過重組技術産生Novaferon的方法。 根據本發明的核酸序列（SEQ ID No : 1，第1(A)圖）， 本發明包括與其基本上相似的核酸分子’例如，當進行最 15佳比對時與SEQ ID No : 1具有至少大約85-95%或更高的序 列同一性的核酸。例如，在一個方面，與SEQ ID No : 1所 示核苷酸序列具有大約93%、95%、96%、97%、98%或99% 序列同一性的核酸在本發明的範圍之内，無論其是否編碼 具有相似於Novaferon的生物學活性的蛋白質或多肽（此類 20 活性包括但不限於，相比HuIFN而言增強的抗病毒、抗增 殖和抗腫瘤功能）。此類核酸分子例如可用作用於檢測細胞 内的mRNA的探針，所述細胞已經用包含本發明核苷酸序 列的載體轉染以產生Novaferon。換言之，這些與SEQ ID No : 1所示序列至少大約93%、95%、96%、97%、98%或99% 23 200900504 同一的核酸序列可用作用於測定宿主細胞中異源基因的表 達的標記。 此外，本發明包括多核苷酸，其包含SEQ ID No : 1的 至少大約30個連續核苷酸，優選地至少大約50個連續核苷 5 酸的任何部分。 更一般地，本發明包括和涵蓋了，與第1圖（SEQ ID No : 1)所示核苷酸序列的部分序列同一的任何及所有分離 的核酸分子的片段。在一個實施方案中，這些片段的長度 爲至少大約15個核苷酸，並可用作在此所討論的診斷探針 10 和引物。此外，本發明包括和涵蓋了更大的片段，其長度 爲大約50個核苷酸或更長。 除了 SEQ ID No : 1中所示的編碼Novaferon蛋白的核酸 序列之外，本發明還包括但不限於編碼完整Novaferon蛋白 的氨基酸序列以及額外的氨基酸/肽/多肽例如所添加的分 15 泌前導序列的核酸序列。 本發明還包括這樣的核酸序列，其具有SEQ ID No : 1 中所示的核酸序列，以及另外的非編碼序列，例如包括但 不限於内含子以及5 ’和3 ’非編碼序列例如轉錄的但不翻譯 的序列（它們在轉錄、mRNA加工（即剪接和多腺苷酸化信 20 號、核糖體結合和穩定mRNA)中發揮作用），和編碼有或無 功能的另外氨基酸的另外的編碼序列。 本發明進一步涉及本發明核苷酸分子（SEQ ID No : 1) 的變體，其編碼Novaferon蛋白的部分、類似物或衍生物。 可通過篩選干擾素改組文庫或者利用誘變技術或/和其他 24 200900504 本領域中所描述的已知技術來獲得變體。 如上所說明的，此類變體可包括通過核苷酸插入、缺 失或置換而産生的那些。插入、缺失或置換可牵涉—個或 多個核普酸。這些突變可發生在參考核苦酸序列的5，或3, 5末端位置或那些末端位置之間的任何地方，單獨地散佈在 參考序列的核《中，或散佈在參考序列内的一個或多個 連續組中。所述變化可産生保守或非保守的氣基酸置換、 缺失或添加。在這些之中尤其優選的是沈默置換、添加和/ 或缺失，其不改變Novaferon蛋白或其部分的性質和活性。 10 在這方面也尤其優選的是保守置換。 本發明還提供了分離的核酸分子，其包含具有與選自 下列的多核苦酸至少93%同一的，更優選地至少大約95〇/。、 96%、97%、98%或99%同一的核苷酸序列的多核苷酸：（a) 編碼具有SEQ ID No : 2中的完整氨基酸序列（即SEq m 15 No : 2的1-166位）的Novaferon蛋白的核苷酸序列；和⑼編 碼(a)的蛋白質的生物學活性片段的核苷酸序列；和(c)與上 面（a)或(b)中任一核苷酸序列互補的核苷酸序列。 由於遺傳密碼的簡並性，本領域普通技術人員將會馬 上認識到’大量其序列與第1圖所示核酸序列（SEQ ID No : 20 1)至少大約93%、95%、96%、97%、98%或99%同一的核酸 分子將編碼具有與Novaferon蛋白相似或相同活性的蛋白 質。實際上，由於簡並變體都編碼相同蛋白質，這對於本 領域技術人員來說是清楚的，即使沒有進行比較測定法。 在本頜域中將進一步認識到，對於不是簡並變體的此類核 25 200900504 酸分子，也有相當數目將編碼具有干擾素樣生物學活性的 蛋白質。這是因爲本領域技術人員完全知道較不可能或不 可能顯著影響蛋白質功能的氨基酸置換(例如，用另一個脂 肪族氨基酸置換-個脂職氨基酸），如下面所進_步描述 5的。例如，Bowie等人(70)提供了關於如何進行表型沈默氨 基酸置換的指導，其中作者指出許多蛋白質都耐受氨基酸 置換。 蛋白和多狀變體和構建體 本發明包括SEQIDNo: 2的Novaferon蛋白以及與其基 10本上相似的蛋白質或多肽，例如與SEQ ID No : 2具有至少 大約8 5 -9 5 %或更高的氨基酸序列同一性的非天然存在的蛋 白質。例如，與SEQ ID No : 2所示氨基酸序列具有至少大 約 85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的 非天然存在的蛋白質在本發明範圍之内。此外，爲了增強 15其功能和性質，本發明的Novaferon蛋白可通過將其融合至 其他蛋白質或蛋白質片段或其他分子來進行結構修飾。例 子包括但不限於將其融合至其他蛋白質/蛋白質片段以增 加其表達或進一步穩定Novaferon蛋白。 在個貝施方案中’本發明的編碼Novaferon的核酸序 20列和/或Novaferon蛋白可利用除支架以外的標記物進行標 記。此處，”經標記的”表示核酸序列（SEQ ID No : 1)或 Novaferon蛋白（SEQ ID No : 2)的化合物已附著有至少一種 元素、同位素或其他化學物質（標記物）以使得能夠檢測所述 化合物。一般而言，標記物分爲三類：勾同位素標記物， 26 200900504 其可以是放射性同位素或重同位素；b)免疫標記物，其可 以是抗體或抗原；和c)有色或熒光染料。標記物可以摻入 到所述化合物的任何位置。 一旦制得，Novaferon蛋白還可以進行共價修飾。共價 5 修飾的一種類型包括用能夠與Novaferon蛋白的所選侧鏈 或者N-或C-末端殘基進行反應的有機衍生化劑 (derivatizing agent)處理Novaferon蛋白。用雙功能試劑進行 衍生化可用於例如將Novaferon蛋白與水不溶性支援基質 或表面交聯，以用於純化抗Novaferon抗體或篩選測定法。 10 通常使用的交聯劑包括U-雙（重氮乙酰基)-2-苯基乙烷，戊 二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯（例如，與4-疊氮基水揚酸形成 的酯），同基雙功能亞氨酸酯，包括二琥珀酰亞氨基酯例如 3,3’-二硫代雙(琥珀酰亞氨基丙酸酯），雙功能馬來酰亞胺例 如二-N-馬來酰亞胺基-1,8-辛烷，以及諸如曱基-3-[(p-疊氮 15 基苯基)聯硫基]propioimidate的試劑。

Novaferon蛋白的其他修飾包括：穀氨酰胺酰和天冬酰 胺酰殘基分別脫酰氨成榖氨酰和天冬氨酰殘基；脯氨酸和 賴氨酸的羥基化；絲氨酰和蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化； 賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈的氨基的甲基化(71);將N-20末端胺的乙酰化；和將任何C-末端羧基的酰胺化。 本發明Novaferon蛋白的另一種類型的共價修飾包括 改變所述蛋白質的天然的糖基化模式。這例如可以通過以 下方式達到：（1)刪除和/或添加一個或多個在Novaferon蛋 白的天然序列中發現的糖部分’或者(2)添加和/或刪除一個 27 200900504 或多個在Novaferon蛋白的天然序列中不存在的糖基化位 點。 向Novaferon蛋白添加糖基化位點可通過改變 Novaferon蛋白的氨基酸序列來完成。例如，通過在 5 Novaferon蛋白的天然序列中添加或置換爲一個或多個絲 氨酸或蘇氨酸殘基來達到這種改變（對於〇_聯糖基化位 點）。Novaferon蛋白的氨基酸序列的改變可通過DNA水平上 的變化來達到，特別是通過在預選擇的核苷酸域基處突變 編碼N〇vaferon蛋白的DNA序列，從而改變的密碼子可以翻 10 譯成所需的氨基酸。 增加N〇vaferon蛋白中糖部分的數目的另一種方式是 將糖苦通過化學或酶促的方式偶聯到所述蛋白質上。此類 方法在現有技術中已有描述，例如，早在年，ApHn jd 和Wdston JC Jr已經描述了蛋白質和脂質的糖綴合物的製 15備、性質和應用（72)。 去除N〇Vaferon蛋白中存在的糖部分可通過化學或酶 促的方式來完成，或者通過突變置換編碼用作糖基化乾標 的吼基酸殘基的密碼子來完成。化學去糖基化技術在現有 技術中疋已知的，並例如由EdgeAS等人⑺)進行了描述。 2〇對多肽上的糖部分的酶促切割可以通過使用多種内切和外 切糖苦酶來達到，如Thotakum等人所描述的（74)。 此類衍生的構建體可包括改善溶解性、吸收、穿過血 腦屏障的渗透性、生物學半健㈣部分。N〇Vafe_蛋白 的此類部分或修韩可二者擇一地清除或減弱所述蛋白質的 28 200900504 任何可能的不希望的副作用等等。已經公開了能夠介導此 類效應的部分，例如在 Remington : The Science and Practice 〇fPharmacy(75)中。

Novaferon的另一種類型的共價修飾包括，例如以 5 U.S.Pat.Nos.： 4,640,835 (76) ； 4,496,689 (77) ； 4,791,192 (78) 或4，179,337 (79)中所示的方式，將Novaferon蛋白連接至各 種非蛋白質聚合物之一上，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚 氧化稀。 此外’還可修飾本發明的Novaferon蛋白，以形成包含 10融合至另一個異源多肽或氨基酸序列的；Novaferon蛋白的 嵌合分子。在一個實施方案中，這樣的嵌合分子包含 Novaferon蛋白與標簽多肽的融合化合物，所述標簽多肽提 供抗標簽抗體能夠選擇性地結合的表位。該表位標簽通常 位於Novaferon蛋白的氨基或缓基末端。Novaferon蛋白的此 15類加有表位標簽的形式的存在可以用抗該標簽多肽的抗體 進行檢測。此外’表位標簽的提供使得N〇vaferon蛋白能夠 容易地通過親和純化進行純化，所述親和純化使用抗標簽 抗體或與所述表位標簽結合的另一類型的親和基質。在一 個備選的實施方案中，所述喪合分子可包含N〇vaferon蛋白 20與免疫球蛋白或免疫球蛋白的特定區域/片段的的融合化 合物。例如’爲了形成二價形式的嵌合分子，可將N〇vafer〇n 蛋白融合至IgG分子的Fc區。 多種標簽多狀和它們各自的抗體在現有技術中是熟知 的。例子包括聚級氨酸（poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸 29 200900504 (poly-his-gly)標簽；flu HA標簽多肽及其抗體12CA5(80); c-myc標簽及針對其的讣9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗 體（81);以及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體 (82)。其他標簽多肽包括nag_肽(83);微管蛋白表位肽(84); 5和T7基因1〇蛋白肽標簽(85)。 此外，本發明的Novaferon蛋白可通過本領域普通技術 人員已知的化學合成程式來産生。例如，在商購可得的433A 型號肽合成儀(Applied Biosystems，Inc.’Foster City，CAUS) 上可産生長度爲高達大約80-90個氨基酸殘基的多肽。此 10外’高達120個殘基的更長的化學合成的肽也是商購可得 的’例如，從Bio-synthesis，Inc. Lewisville，TX USA獲得。 因此，很谷易理解，全長的成熟Novaferon蛋白能夠合成產 生（例如，先合成片段，然後將所述片段連接在一起）。 因此’本發明的Novaferon蛋白（SEQ ID No : 2)包括所 15有具有與8£卩ID No : 2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列 的蛋白質和多肽製備物和構建體，無論這些N〇vafer〇n蛋白 和蛋白質衍生物是否是通過化學合成程式産生，和/或通過 重組技術攸原核或真核宿主細胞或其他細胞和宿主（包括 但不限於細菌、酵母、植物、昆蟲和哺乳動物細胞）中産生。 20根據重組産生方法中所採用的宿主，本發明的蛋白質可以 疋糖基化或非糖基化的、PEG化或非PEG化的。此外，本發 明的蛋白質還可包括起始的經修飾的甲硫氨酸殘基，在某 些情況下這是宿主介導的加工的結果。因此，現有技術中 熟知，由翻譯起始密碼子編碼的N—末端甲硫氨酸通常在所 30 200900504 有真核細胞中於翻譯後從任何蛋白上被高效去除。在大夕 數原核生物中，大多數蛋白質的N—末端甲硫^也被= 去除’而對於某些蛋白質，這種原核絲過程是無效的: 5 10 15 20 這依賴於&末端T硫氨酸所共價連接的氨錢的性質。 產生. 貝 本發明還涉及包含本發明的分離的DNA分子的重組載 體，用所述重組載體進行遺傳工程改造/轉染的宿主纟沪 以及通過重組技術産生N〇vaferon蛋白或其片段。載體可以 是，例如，質粒、嗟菌體、病毒或逆轉錄病毒栽體。= 錄病毒載體可以是能夠複製的或複製缺關。在後一種产 況下，病毒繁殖通常只發生在補充性宿主細胞中。詳細= 述Novaferon產生的例子如下。 ，田 用於表達本發明的NGvaf_蛋白的優選戟體包括作 不限於，包含有效連接至待表達的多核㈣㈣式:用二 控區的載體，所述順式仙調控區對於在宿主中的表達β 有效的。合適較式作„數由宿域供，由補充^ 提供’或在導人宿主後由所述制本身提供。 个/η*公開的核 M V V 層.i)可以有效遠 接至合適的㈣子。歧，，軸子，，麵_^RNA聚人 每亚起始NGVafen)n蛋白的編碼序制外顯子（ : (3’=錄從而轉錄成mRNA的任何核酸序列。細菌啓動子呈 有通常接近編碼序列的5，末端的轉錄起始區 奸 通常包括峨聚合酶結合位點和轉錄起始位點。= 途位酶的序列可提供㈣有用的啓動子序列。例子包括= 31 200900504 自糖代謝酶例如半乳糖、乳糖和麥芽糖代謝酶的啓動子序 列，以及源自生物合成酶例如色氨酸合成酶的序列。還可 以利用來自噬菌體的啓動子，這些啓動子在本領域中是已 知的。此外，合成啓動子和雜合啓動子也是有用的；例如， 5 tac啓動子是trp和lac啓動子序列的雜合體。此外，細菌啓動 子可包括天然存在的非細菌來源的啓動子，其具有結合細 菌RNA聚合酶並起始轉錄的能力。優選的細菌啓動子包括 但不限於，大腸桿菌1aci、trp、phoA和lacZ啓動子，T3和 T7啓動子，gpt啓動子，λ pR、pL啓動子，和冲啓動子。 1〇 隸啓動子具有通常接近編碼序賴5,末端的轉錄起 始區，通常位於轉錄起始位點上游25 3〇個域基對作的的 TATA盒。TATA盒被認爲指導RNA聚合酶邮正確的位點開 始RNA的合成。哺乳動物的啓動子還含有上游啓動子元件 (增強子元件）’其通常位於TATA盒上游丨⑻至細個域基對 5以内上;轉動子元件決定轉錄起始的速率並能在任一方 向發揮作用。特別可用作哺乳動物啓動子的是來自哺乳動 物赫基因的啓動子，因爲病毒基因通常高表達並具有廣 =宿主範圍。例子包括s早期啓動子、小鼠乳腺腫瘤病 毋LTR啓動子。優選的動物細胞啓動子包括但不限於，腺 病毋主要晚期啓動子 '單純炮療病毒啓動子和啓動 子在已知的真核啓動子中，適合這方面的是CMV即時早 〇動子L伸因數1 α (EF1A)啓動子、HSV胸普激酶啓動 子SV40早期和晚期啓動子、以及逆轉錄病毒·的啓動 + B _ _病毒(“Rsv”)的那些。用於在酵母中進行表 32 200900504 達的優選啓動子序列包括 乙醇脫氣酶、__1^_L1/1G啓動子，來自 甘油酸_3韻脫氫酶、己糖葡糖_6·魏異構酶、 ,, 激每、果糖磷酸激酶、3-磷酸 5 10 15 /文變位酶、丙_酸_和酸㈣酸酶基因的啓動子。 =殖和表達的載體還通常包括一個或多個選擇標 相= 於擴增，或相述賴爲此目的含有另 擇尸在1^方面’表達载體優選地含有—個或多個選 ΓΓ 而爲選擇轉染的宿主細胞提供表型性狀，雖 =領域技術人員會識別到某㈣統選擇標記可以由分開 的載體提供。對於在大腸桿菌和其他細菌中進行培養，優 記包L氨f青徽素(Amp)、四環素㈣或潮徽 (Gm性基因。酵母選擇標記包括細、腦、 LEU2、TRP1和ALG7，其賦讀於錢素的抗性；新徽素 碟酸轉移酶基因，其賦予對於G418的抗性；以及cup^ 因，其使酵母能夠在銅離子存在的條件下生長。動物細胞 選擇標記包括二氫葉酸還原酶(卿R)基因、新黴素㈣） 或潮黴素(HYG)抗性基因。 此外，用於增殖和表達的載體通常含有一個或多個用 於轉錄起始、終止的位點，以及在經轉錄的區域中含有用 加於翻譯的核糖體結合位點。由構建體表達的轉錄物的編碼 部分優選地在開始處含有翻譯起始密碼子，以及包含合適 地位於待翻譯的DNA序列的末尾處的終止密碼子⑴AA， UGA或UAG)。啓動子、終止子、選擇標記、載體和其他元 件的選擇是在本領域技術人員能力範圍之内的常規設計問 33 200900504 題。許多此類元件在文獻中有描述並能通過商業供應商獲 得。 下列載體是商購可得的’並優選地在細菌中使用：來 自 Shanghai Sangon的pBV220(86)及其衍生物；來自 Qiagen 5 的pQE系列；來自Qiagen的pET載體；來自Stratagene的pBS 載體、Phagescript載體、Bluescript載體、pNH8A、pNH16a、 pNH18A、pNH46A ;以及來自 Pharmacia 的 ptrc99a、 pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5。其中優選的真核 載體爲來自Promega的pCI載體；來自Invitrogen的pcDNA載 10 體；來自 Stratagene的pSV2CAT、p〇G44 ' pXTl和pSG ;以 及來自 Pharmacia的pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。單獨列 出這些載體作爲例子來證明，本領域技術人員可以獲得許 多商購可得的熟知的載體以用於通過遺傳/重組方法産生 本發明所公開的Novaferon蛋白。 15 在這方面的某些優選的實施方案中，載體提供特異表 達的手段。此類特異表達可以是可誘導的表達或只在某些 細胞類型中的表達，或者可以是可誘導的且細胞特異的。 其中特別優選的可誘導的載體是能夠被容易操控的環境因 素例如溫度和營養添加物绣導進行表達的載體。多種適合 2〇於錢用的載體是熟知的並被本領域技術人員經常採用， 包括在原核和真核宿主巾使用的組成型和料型表達載 體。 利用各種本領域已知的技術，例如可以將包含卿1〇 No . 1所示DNA序列以及合適的啓動子和其他合適的調控 34 200900504 序列的載體導入合適的宿主細胞中，所述宿主細胞適合於 表達所需蛋白。此類合適的宿主的代表包括細菌細胞，例 如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌（Baciuus subtilis)、鍵黴菌 (Streptomyces)細胞；酵母細胞，例如巴斯德畢赤酵母(pichia 5 Past〇ris)細胞，昆蟲細胞，例如果繩(Drosophila)S2和灰翅 夜峨（Spodoptera)Sf9細胞；哺乳動物細胞，例如ch〇和 COS ;以及植物細胞。用於各種各樣的表達構建體的宿主 是熟知的，利用本發明所公開的資訊，本領域技術人員能 夠谷易地選取用於表達SEQ ID No : 2所示的Novaferon蛋白 10 的伯主。 可以遺傳工程改造宿主細胞以整合編碼Novaferon的 多核普酸和表達本發明的Novaferon蛋白。例如，可利用本 領域中已知的轉染技術將編碼Novaferon的多核普酸導入 宿主細胞中。此類方法描述於許多標準實驗手冊中，例如 15 Kingston所論述的那些（87)。編碼Novaferon的多核苷酸可以 單獨地或與其他多核苷酸一起導入/轉染。這樣的其他多核 苷酸可以獨立地導入，或與SEQ ID No : 1所示的編碼 Novaferon的多核苷酸共導入或聯合導入。 例如，對於在哺乳動物細胞中的共轉染和標記的選 20 擇，本發明的編碼Novaferon的多核普酸可以與分開的編碼 選擇標記的多核苷酸一起轉染到宿主細胞中。備選地，對 於誘導宿主細胞中的增殖，編碼Novaferon的多核苦酸可以 整合到含有編碼選擇標記的DNA序列的載體中。 用含有編碼Novaferon的多核苷酸的載體轉染的、經改 35 200900504 造的宿主細胞可以在常規營養培養基中進行培養，所述挺 養培養基可爲了啟動啓動子、選擇轉化體或擴增乾基因進 行特殊的修飾。調整培養條件例如溫度、pH等，以適a於 所選的宿主細胞表達本發明的Novaferon蛋白。 5 爲了促進翻澤的蛋白質多狀分泌到内質網的内腔、^ 質空間或細胞外環境中，可以將合適的分泌信號$ Novaferon蛋白合併和共表達。 純化 通常根據靶蛋白的性質並考慮其他條件例如生產成 10本、擴大生産是否容易、工業生産的規模等等，來選擇人 適的宿主細胞類型用於表達重組無蛋白。然後，選擇出以 最高産率表達把蛋白的經轉染的細胞克隆，並且將具有最 佳表達的最終克隆命名爲表達靶蛋白的細胞系並用於生産 靶蛋白。表達靶蛋白的細胞系生長在含有各種營養物質的 15培養基中。爲了獲得細胞的最佳生長和/或靶蛋白的最佳表 達’利用多種試劑或條件來誘導選擇性啓動子，其與靶蛋 白的cDNA序列一起整合在轉染載體中。如果宿主細胞類型 /表達系統爲細菌，通常通過離心從培養基中收穫培養的細 胞。通過物理或化學手段來破裂收穫的細胞體，保留收獲 20的、含有合成的靶蛋白的粗提物，以用於所述蛋白質的進 一步純化。應用於破裂微生物細胞的方法包括但不限於冷 凍-解凍迴圈、超聲處理、機械破裂或使用細胞裂解劑。此 類方法對於本領域技術人員來說是熟知的。 本發明者利用大腸桿菌這種細菌作爲用於表達重組 36 200900504

如下所述，用含有編碼 N〇vafe❹核《序觸餘轉染大腸耗，並選取具 有Novaferon蛋白最佳表達的_接丄ηβ _ 菌，並選取具

稀釋變性劑， 或者逆尿素與還原型和氧化㈣胱甘肽組合 10的溶液進行透析，隨後逆緩衝鹽水溶液進行透析。在後一 種情況下，所述蛋白質能夠在破裂收穫的細胞後直接從周 質空間中以可溶的且有功能的形式回收，而無變性。通過 避免變性和重折疊過程，可溶的Novaferon蛋白沒有遭到破 壞並不含變形或錯誤折疊的蛋白質分子。 15 本發明者發現，在大腸桿菌細胞系中産生的合成 N〇Vaferon蛋白的很大部分被分泌到細胞質中。然後，如以 下所描述的，純化該部分。 ϋ牲分析和醫學用途 如上所示，Novaferon蛋白與干擾素家族的許多成員顯 20示出序列同源性，特別是與由HuIFN-a 14的mRNA所翻譯 的干擾素蛋白（第2圖）。HuIFN-a已經顯示出寬範圍的生物 學活性’包括抗病毒、抗增殖和免疫調節活性（1〇)。 因爲與HuIFN- a的同源性’預期Novaferon能表現出與 HuIFN-a相似的生物學功能’包括但不限於，抑制腫瘤的 37 200900504 增殖、抗病毒活性、啟動NK細胞、以及調節免疫系統。特 別重要的是不僅保留了 HuIFN- α樣功能特性，而且與 HuIFN- α相比，Novaferon蛋白的這些生物學功能的效力增 強。爲了驗證和確定其功能特性的效力，因而用標準的常 5 規體外測定法來測定Novaferon蛋白的生物學活性，所述、則 定法被涉及用於檢測抗病毒和抗增殖特性。如以下實驗部 分中所描述的，在一些實驗中，進一步在各種人癌症類型 的動物模型中觀察Novaferon蛋白的抗增殖特性的體内效 力，並與HuIFN-α以及化學抗癌劑進行比較。 15 20 …用於測定HUIFN活性的合適測定法是本領域中、 知的。本發明者採聽於細胞的體外測定㈣統來測定= 病毒和抗增航性。相同的體外測定法用於财與本^ 相關的程絲實驗’㈣但殘_以㈣干擾素基因改 組文庫’從人1型干歸基料蚊庫的所表賴蛋白質中 — ’以及财純的重組N_f_蛋白的生物與 有許多通過觀察細胞對病毒的抗性程度來測量受 品湖的抗病毒活性_定法(88)。已經有罐主要物 測定法用於測量Η戲和它們的雜交體的抗病毒活性^ 據用於峡病毒對於培養的細胞料方 乂 將它們進行分類。 々凌， 、^於敎病毒料的致細胞病變效應的抑制的測 測用IF Ν預處理的培養的細财病毒料的裂解性 細胞病變效制減少錢。軸定奸以在％孔板中進行 38 200900504 (89) ’並已經廣泛用於重組HuIFN_a，因爲它爲篩選大量 樣品提供了一種簡便方法。 病毒噬斑形成的抑制是另一種定量H u IF N在組織培養 物中的抗病毒活性的方法。噬斑減少測定法的結果不依賴 5於感染複數。此外，以高精確度可檢量到噬斑形成的50% 減少。例如利用普遍存在的水泡性口膜炎病毒(VSV)來誘導 噬斑形成，能夠通過篩選大量來自不同動物物種的細胞系 來測定特定重組IFN的跨物種活性的特性（90)。 第三種測定法基於測定病毒産量的減少。通常在單個 10 細胞生長周期内，通過釋放的病毒數量來測量病毒的産 生。該測定法特別可用於測試IFN對於不引起致細胞病變效 應的病毒或在靶細胞培養物中不形成噬斑的病毒的抗病毒 活性。但是，在該測試中，感染複數影響由固定濃度的IFN 所誘導的保護的表觀程度(91)。 15 使用WISH細胞和水泡性口膜炎病毒(VSV)，通過標準 的致細胞病變效應一抑制測定法來測量Novaferon的抗病 毒活性。使用WHO國際標準的標準參考樣品： 95/650(rHuIFN-a2a)和94/786(複合rHuIFN-α)，來測定並 校準抗病毒活性。1個單位的抗病毒活性定義爲，對於達到 20 50%抑制VSV對培養的細胞的致細胞病變效應時所需要的 蛋白質量。正如下面進一步描述的’ Novaferon蛋白的活性 爲2.5xl〇9 IU/mg，這爲HuIFN-a:2b的活性的大約12_5倍。 這些測試表明，與HuIFN-α 2b相比’ Novaferon的抗病毒特 性極大增強。Novaferon蛋白表現出這種增強的抗病毒效 39 200900504 力，這爲預測在人體内的增強的抗病毒效應提供了基礎。 基於HuIFN的性質，預期N〇vafer〇n具有非常廣的抗病毒特 性是合理的。換言之，對於寬範圍的病毒，N〇vafer〇n應當 比天然的HuIFN更有效。N〇vaferon的增強的抗病毒效力可 5以轉化爲在臨床情況下對於具有多種病毒疾病的患者的更 好的抗病毒效應或更好的治療效應。 正如上面所解釋的，Ϊ F N還通過多種機制來抑制細胞增 殖和表現出潛在的抗腫瘤效應。利用細胞培養系統，已經 建立了幾種體外抗增殖測試，這在現有技術中進行了充分 10描述。在這些測定法中，可以通過下列方式來測量細胞增 殖：細胞計數；結晶紫生物測定法(92，93);對中性紅染料 的化學敏感性(94〜96);整合經放射性標記的核苷酸(97); 將5-溴-2，-脫氧尿苷整合入正在增殖的細胞的DNA中（98); 使用四唑鑌鹽（99，1〇〇)。 15 人類淋巴母細胞Daudi細胞系對於HuIFN- α的抗增殖 效應是非常敏感的，並且它的懸浮培養生長有助於定量其 細胞數目（101)。該細胞系用於測量HuIFN-α和雜交體的抗 增殖活性已經有很多年了（102)。其他細胞系也可用於測試 受試試劑的抗增殖活性。 20 通過觀察由於向具有各種不同人腫瘤異種移植物的動 物模型施用Novaferon而引起的腫瘤塊生長的抑制，而在體 内觀察到Novaferon蛋白的抗增殖活性。將Novaferon的體内 抗腫瘤效應與HuIFN-a2b進行比較，並在一些異種移植模 型中還與化學抗腫瘤試劑進行比較。 40 200900504 正如下面所詳細描述的，本發明者發現，用標準0如出 細胞方法測得的Novaferon的體外抗增殖活性的效力爲天 然 HuIFN- a 2b 的 400倍’在所有天然 huifn 中，HuIFN- a 2b 可能表現出最有效的抗增殖活性。Novaferon的增強的抗增 5殖效力疋廣泛的和普遍的，因爲它對於本發明者在體外所 測試的所有人癌症細胞系都表現出比天然HuifN- a 2b更有 效或增強的抑制。這表明，Novaferon對人癌症的有效抑制 沒有選擇性。雖然Novaferon對於所有受試類型的人癌症細 胞系的增強的抗增殖活性程度不同，但它具有成爲臨床情 10 況下的廣譜抗癌劑的潛力。這是超過化學抗癌劑、單克隆 抗體和其他把特異性抗癌劑的顯著優點。 下面所描述的異種移植動物模型進一步確立了： (1)與天然HuIFN-a 2b相比，Novaferon的體内抗增殖 效應極大地增強或更有效。 15 (2)在相同的異種移植模型中，劑量低得多的

Novaferon的體内抗增殖效應比受試化學試劑5_氟尿嘧啶 (5-FU)更好。 (3)在異種移植模型中，Novaferon能夠達到癌症生長 的超過90%的抑制，但在受試動物中不引起體重減少、活 20 力改變和其他消極的副作用，這與在經5-FU治療的動物中 顯著的體重減少和活力降低形成鮮明對比。 這些結果表明，與天然HuIFN-α 2b相比，Novaferon的 體外和體内抗增殖特性極大增強。Novaferon的增強的抗增 殖效力被轉化成小鼠動物模型中人腫瘤生長的有效抑制 41 200900504 (>90%)，並且這種抑制似乎非常廣泛地作用於所有受試人 癌症類型，並且比傳統的抗癌劑5FU更好。這些結果還表 明，Novaferon對於癌細胞生長的有效抑制對於所述癌細胞 是非常特異的，而不針對正常細胞，其支援依據是，在經 5 Novaferon治療的動物中觀察到正常飲食和動作行爲並且 體重沒有減少。因此，Novaferon具有在所有或大部分人癌 症中發揮作用的可能性。 在一個優遠的實施方案中，完整的或部分的N〇vaferon 蛋白（SEQ ID No : 2)分子(使用SEQ ID No : 1的多核苷酸序 10列通過重組技術製備或化學合成），可在人和/或非人物種中 用於治療和/或預防任何和/或所有人來源或非人來源的腫 瘤和癌症。這些腫瘤例如包括但不限於，骨原性肉瘤；多 發性骨髓瘤；何傑金病；結節性低分化淋巴瘤；急性淋巴 細胞白血病，急性髓細胞白血病；乳腺癌；黑色素瘤；乳 15頭瘤；以及鼻咽癌，結腸癌，肝癌和黑色素瘤。 在另一個實施方案中，完整的或部分的N〇vafer〇n蛋白 (SEQ ID No . 2)分子(使用SEQ ID No : 1的多核苷酸序列通 過重組技術製備或化學合成），可在人和/或非人物種中用於 治療和/或預防任何和/或所有病毒疾病。易感的病毒感染的 20例子包括但不限於，病毒性腦心肌炎，流行性感冒和其他 呼吸道病毒感染，狂犬病和其他病毒性動物傳染病，和蟲 媒病毒感染，以及單純皰疹性角膜炎，急性出血性結膜炎， 水痘帶狀皰療’和乙型和丙型肝炎，SARS*禽流感，人免 疫缺陷綜合征(AIDS，HIV)。 42 200900504 I另個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白 (SEQlDN〇 : 2)分子(使用SEQIDNo : 1的多核苷酸序列通 過重組技術製備或化學合成），可在人中用於治療和/或預防 任何和/或所有免疫系統相關的病症。免疫病症的例子包括 4不限於風濕性關節炎、多發性硬化症和斯耶格倫綜合征 糖尿病。NOVafer〇n蛋白還可以用於預防移植物抗宿主的排 斥反應。 在另一個實施方案中，完整的或部分的Novaferon蛋白 (SEQIDNo : 2)分子(使用SEQIDNo : 1的多核苷酸序列通 10過重組技術製備或化學合成），可作爲免疫佐劑用於治療和 /或預防任何和/或所有血管發生疾病。血管發生疾病的例子 包括但不限於血管瘤、腫瘤誘導的新血管系統、與年齡相 關的黃斑變性以及糖尿病性視網膜病。

Novaferon蛋白可以單獨地或與任何其他蛋白質/載體 15材料或其他構建體一起，以任何藥學上可接受的製劑/配 劑，通過任何施用/遞送途徑/方法，施用給人和/或非人物 種’所述施用/遞送途徑/方法包括但不限於口服攝取、吸 入、鼻内喷霧、腹膜内、靜脈内、肌内、損傷内或皮下注 射。 20 包含N〇vaferon蛋白作爲活性成分的藥物學製劑/配劑 可通過摻入合適的固體或液體載體來製備，其形式有液 體、固體、半固體和/或任何其他臨床上可接受的形式，例 如片劑、丸劑、粉末、液體溶液或懸浮液、脂質體、栓劑、 可注射溶液和可輸注溶液。含Novaferon的製劑/配劑可通過 43 200900504 本㈣中^述的或制藥卫業實踐所普遍接受的常規載 體、材料、方法史电】供 . 表備。SN〇Vaferon的製劑/配劑還可通過 使用本7員域中還沒有描述的或制藥工業還沒有使用的非常 規方法、材料來製備。 5 3 Μ如’腸胃外配劑通常拉射液，其由藥物學和生理 學上可接受的材料組成，例如水、生理鹽水、其他平衡的 鹽溶液、含水葡萄糖、甘油等。此外，除了Ν〇ναί>_蛋白 外庄射液還可以包含其他蛋白質，如載體，例如人血清 白蛋白或血t製品。藥物學製劑/配劑還可以包含少量無毒 |·生的輔助物質’例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑和pH緩衝劑 (例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸SI)。配製方法在現有 技術中是熟知的，並例如描述在RemingtGn:The %⑶⑶⑽d

Practice of Pharmacy· Phamaceutical Sciences(75)中。 具體的N〇vaferon蛋白製劑/配劑可以由所期望的臨床 15應用和/或使用方法來決定，並且可以由任何一個本領域技 術人員使用已知技術來製備。例如，除了注射液之外，還 了以採用局部和口服配劑。局部製劑可包括但不限於滴眼 劑、軟膏劑和噴霧劑。口服配劑包括但不限於液體形式(例 如糖漿劑、溶液或懸浮液），或固體形式（例如粉末、丸劑、 20片劑或膠囊）。對於固體製劑/配劑，常規的無毒性固體載體 包括但不限於制藥級別的甘露醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。 製備這些製劑/配劑的實際過程和/或方法是已知的，或者對 於本領域技術人員來說將會顯而易見的(75)。 可通過各種途徑將藥學上可接受的Novaferon蛋白的 44 200900504 製劑/配劑施用給人和/或非人物種，所述途徑包括但不限於 口服、皮下、靜脈内、鼻内、經皮、腹膜内、肌内、肺内、 陰道、直腸或眼内遞送，以及在治療傷口時，直接局部用 藥0 5 根據臨床實踐，Novaferon蛋白在製劑/配劑中的濃度/ 數量可以爲從>〇至1.0 Μ和/或從>〇至100%(重量/重量）。每 一個和/或所有Novaferon製劑/配劑的確切劑量、施用間隔 和治療持續時間由臨床試驗、疾病狀況、患者狀態和衛生 保健提供者決定。在一個優選的實施方案中，由於蛋白質 10降解、全身與局部遞送的差異、合成新蛋白酶的速率、以 及年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、 藥物相互作用和病狀的嚴重性等等，可能需要調整 Novaferon的施用，包括但不限於單次和/或總劑量、施用間 隔、治療持續時間和必需的療程，並且可由本領域技術人 15 員通過常規實驗來確定。 在-個優選的實施方案中，在施用至人和/或非人物種 的體内後，Novaferon蛋白的迴圈半衰期可發生改變。這些 改變包括但不限於Novaferon體内半衰期的延長或縮短。

Novaferon蛋白的體内半衰期的延長可通過多種途徑來獲 20 得，包括但不限於： & ⑴N_f_分子和單克隆抗體之—複合物形成。 此類抗體優選地在不從本質上削弱其治療功能的位點上與 Novaferon蛋白連接（1 〇3)。 (2) Novaf刪與其他蛋白f /多肽％融合複合物。 45 200900504

Novafercm分子可以重組融合於其他蛋白質/多肽，例如免疫 球蛋白的恒定區片段(Fc)(104)。 (3) Novaferon蛋白的綴合。例如，N〇vafer〇n蛋白可以 綴合有非抗原性聚合物，例如聚乙二醇或相關的聚亞烷基 5 二醇部分（105-108)。 在另一個優選的實施方案中，治療性化合物可綴合至 抗體，優選抗Novaferon蛋白抗體。所述治療性化合物可以 是細胞毒性試劑。在該方法中，通過經綴合的抗體與 Novaferon分子的結合，細胞毒性試劑可以被靶向腫瘤組織 10或細胞，從而破壞患病細胞並減少患病細胞的數目以達到 癌症症狀的降低。細胞毒性試劑包括但不限於，細胞毒性 藥物’毋素或此類毒素的活性片段，和放射性化學試劑。 合適的毒素及其相應片段包括白喉毒素A鏈、外毒素a鏈、 II麻毒素A鍵、相思豆毒蛋白A鍵、麻風樹毒蛋白、巴豆毒 15 蛋白、酚黴素、伊諾黴素等等。 在一個優選的實施方案中，編碼N〇vaferon蛋白的多核 苷酸序列（SEQ ID No : 1)的全長序列、部分序列和/或調控 序列可由任何一個本領域技術人員用於基因療法相關的施 用。基於編碼Novaferon蛋白的多核苷酸序列（SEQ ID No : 2〇 1)的反義應用也可作爲基因療法（即整合到基因組中）或作 爲反義組合物進行使用，這是本領域技術人員將會意識到 的。 在基因療法應用中，將基因導入細胞，從而獲得由這 些基因編碼的把蛋白的體内合成。常規基因療法通過單次 46 200900504 治療或重復施用治療有效的DNA或01111^八來獲得持續的療 效。另-方面’反義RNA和DNA還可用作治療劑，以在體 内阻斷某些基因的表達。已經表明，可以將短的反義募核 苷酸遞送至細胞，在那裏它們作爲抑制劑發揮作用（1〇9)。 5 在—個優選的實施方案中’全長或部分長度的編碼

Novaferon蛋白的多核苷酸序列（SEQ ID N〇 :丨）可用作dna 疫苗。裸露的DNA疫苗在本領域中一般是已知的（11〇)。本 領域普通技術人員熟知將全長或部分長度的編碼 Novaferon的基因（SEQ ID No :丨）作爲DNA疫苗進行應用的 10方法，包括但不限於，將Novaferon基因或部分N〇vaferon 基因置於啓動子的調控之下，以用於在人和/或非人物種中 表達全長或部分長度的Novaferon蛋白。 實施例 下列實施例用於更完整地描述施用上述發明的方式， 15以及闡明考慮用於實現本發明的各種不同方面的最佳模 式。應當瞭解’這些實施例決不限制本發明的真正範圍， 而只是爲了舉例說明目的而給出。所有在此引用的參考文 獻作爲整體引入本文作爲參考。 實施例1 .從人白細胞cDNA中PCR擴增出人IFN- α基因 20 從人外周血白細胞中提取總mRNA。使用Advantage™ RT-for-PCR試劑盒(ciontech，Mountain View，CA，US)以 及廠家推薦的cDNA合成引物(〇lig〇 dT18)來製備cDNA。 在MG PTC熱迴圈儀上通過PCR技術進行人IFN-α cDNA的擴增，採用以下條件：2.5/z 1 lOxpfx擴增缓衝液 47 200900504 (Invitrogen，Carlsbad，CA，US)，0.75 // 1 10mM dNTP，0.5 // 1 25mM MgS〇4，0.25 // 1 Platinum pfx DNA聚合酶（2.5 U/ # 1 ; Invitrogen，Carlsbad，CA，US)，0.75 μ 1 cDNA，0.75 #1 5,引物（10/zM ; IFNa05 : 5'-TGGTGCTCAGCT(A/G) 5 CAAGTC-3')(SEQ IDNo : 3))，0.75/zl 3’引物混合物（每個 1.7 μ Μ ; IFNa03-l : 5’-AATCATTTCCATGTTG (A/G) ACCAG-3’ (SEQ ID No ： 4) ； IFNa03 -2 ： 5，- AATCATTTCCCGGTTGTACCAG -3' (SEQ ID No ： 5)； IFNa03-3 ： 5'-AATCATTTCCATGTTGAAACAG-3'(SEQ ID 10 No ： 6) ； IFNa03-4 ： 5'- AATCATTTCAAGATGAGCCCAG-3' (SEQ ID No ： 7) ； IFNa03 -5 ： 5'- AATGATTTTCATGTTGAACCAG-3' (SEQ ID No ： 8)； IFNa03-6 ： 5'-AATCATTT (C/G) (C/G) ATGTTGAACCAG -3' (SEQ ID No : 9) ; IFNa03-7 ： 5'- 15 GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3' (SEQ ID No : 10)； IFNa03-8 ： 5'- GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3' (SEQ ID No : 11))。 將擴增出的PCR産物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳， 切取條帶，進行凝膠純化，並根據廠家推薦克隆入 20 pCRII-TOPO 或 pCR-4-TOPO 載體(Invitrogen，Carlsbad， CA，US)中。在 ABI 自動測序儀(PE Applied Biosystems， CA，US)上，在 Prism Ready Reaction Dye Termination混合 物中進行自動測序。 由於在以上克隆中沒有發現所希望的關於IFNa6、 48 200900504 IFNa7和IFNal 6編碼序列的插入片段，所以在以上條件下再 次進行PCR，除了類型特異引物外。對於特異性地擴增 IFNa6 ， 5'和3'引物分別爲IFNa05 :

5，-TGGTGCTCAGCT(A/G)CAAGTC-3’(SEQ ID No : 3)，和 5 IFNa03-8： 5'-GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3'(SEQ ID

No : 11)。對於特異性地擴增IFNa7，5’和3'引物分別爲 IFNa07U0 ： 5'-ATGCCCCTGTCCTTTTCTTTAC-3'(SEQ ID No : 12)，和IFNa03-5與IFNa03-6的等摩爾混合物。對於特 異性地擴增IFNal6，所用5'和3'引物分別爲IFNa7UO和 10 IFNa03-7 ： 5'-GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3'(SEQ ID No : 10)。將擴增出的片段克隆入pCRII-TOPO或 pCR-4-TOPO載體中，並如上進行測序。 將所有克隆的I型人IFN- α基因單獨地與Genebank中 的那些DNA序列進行比對。本文所涉及的這些基因的 15 GeneBank 核苷酸登錄號爲：NM_024013(IFN- α 1)， ΝΜ一000605(IFN- α 2)，NM_010504(IFN- α 4)， NM_010505(IFN- a 5)，NM_008335(IFN- a 6)， NM_008334(IFN- a 7)，NM_008336(IFN- a 8)， NM_002171(IFN- a 10)，NM—002172(IFN- a: 14)， 20 NM—002173(IFN- a 16)，NM_021268(IFN- a 17)， NM_002175(IFN-a21) 〇 實施例2 .構建攜帶有zshwfn的質粒的改組文庫 爲了構建攜帶有I型人IFN- a之一的編碼序列的質 粒，基於成熟人I型IFN蛋白的單獨cdna編碼區，合成了具 49 200900504 有BamHI核EcoRI限制性酶切位點的15個域基對的寡核苦 酸(Genentech ’ South San Francisco，CA，US)。本文所涉 及的這些蛋白質的GeneBank核苷酸登錄號爲： NM_024013(IFN- α 1)，NM_000605(IFN- α 2)， 5 NM_010504(IFN- a 4)，NM_010505(IFN- a 5)， NM_008335(IFN- a 6)，NM_008334(IFN- a 7)， NM_008336(IFN- a 8) ，NM_002171(IFN- a 10) > NM_002172(IFN- a 14) ，NM_002173(IFN- a 16)， NM_021268(IFN-a 17)，NM—002175(IFN-a21)。將在實施 10 例1中構建的質粒作爲模板，和引物一起用於標準 PCR(lll)。得到的產物用限制性内切酶(RE)BamHI和EcoRI 進行酶切，並克隆入大腸桿菌表達載體pBVB中，這是 pBV220的衍生表達質粒，其在它的多克隆區域中含有 BamHI位元點和EcoRI位點（86)。這些最終構建體都通過 15 DNA序列分析進行驗證(PE Applied Biosystems，US)。 使用一對寡 核苷酸 BVF4 ： 5’-AGGGCAGCATTCAAAGCAG-3' (SEQ ID No : 13)和 BVR3 ： 5'-TCAGACCGCTTCTGCGTTCTG-3'(SEQ ID No ： 14)，以及使用前面構建的攜帶有I型HuIFN的質粒，通過 20 PCR來擴增含有人IFN ORF的DNA片段。將得到的產物等量 混合並用DNA酶I進行消化，並根據Stemmer(112)所描述的 程式進行PCR組裝。 組裝的PCR産物進一步通過一對内部引物進行擴增： BVF ： 5'-GAAGGCTTTGGGGTGTGTG-3'(SEQ ID No ： 15) 50 200900504 和 BVR : 5，-AATCTTCTCTCATCCGC-3，(SEQ ID No : 16)， 接著用BamHI和EcoRI進行消化，並重新克隆入經re BamHI和EcoRI酶切的大腸桿菌表達載體pBVB中。這些最 終構建體都通過DNA序列分析進行驗證。將攜帶有改組的 5 HuIFN- α基因的質粒轉化入大腸桿菌DH5 α感受態細胞 中〇 在以上所有PCR程式中，無論PCR擴增還是PCR組裝， 都使用常規的DNA聚合酶(New England Biolab，ΜΑ，US)， 而不是局保真DNA聚合酶。 10 實施例3.篩選改組文庫 讓新轉染的大腸桿菌DH5a細胞在LB平板上於37。(：培 養過夜。分別挑取單個菌落，並接種於在96孔板中的丨00// 1含50/zg/ml氨苄青黴素的LB培養基之中。菌落在3〇。〇以 250rpm搖動。在培養過夜後，將10//1細菌培養物一式兩份 15地接種於在96孔板中的1〇〇 含50#g/ml氨苄青黴素的 LB培養基之中。最初的平板(所謂的原種板(st〇ck plate))暫 時保存在4°C。將一式兩份的板中的細胞在3〇。〇下培養，直 到OD600變爲〇_4，然後用42t誘導。經4小時熱誘導後，將 細菌培養物直接轉移到_8(TC冷凍室中以開始冷凍_解凍迴 20圈。2個迴圈的冷凍-解凍後，將細菌懸浮液/裂解産物稀釋 至所需濃度，並在將其暴露於Daudi細胞培養物以進行抗擗 殖測試（101)或暴露於wi s h細胞培養物以進行抗病毒測試 (113)。 在每一輪篩選步驟中，將2〇,〇〇〇個菌落進行初步筛 51 200900504 選’並挑選出大約100個具有最南抗增殖或抗病毒活性的菌 落以用於進一步的驗證性測試。將在原種板上的所挑選出 的細菌培養物在含有50" g/ml氨苄青黴素的lb平板上劃 線。單個菌落在37t下培養過夜，挑取之，並接種於在試 5管中的1龃含5〇//8/1111氨苄青黴素的LB培養基之中。試管 中的細菌在3(TC下以250rpm搖動培養過夜。然後，將4〇以1 經培養的細菌接種在另一組試管之一中，所述試管含有1 ml具有氨苄青黴素（5〇# g/ml)的LB。然後，按上文中關於 初步篩選步驟時所描述的，讓樣品經歷以下步驟：誘導表 10 達，收集細胞培養物，冷凍-解凍迴圈處理，和抗增殖或抗 病毒測試。 在每一輪篩選步驟中，在驗證性測試後挑選出大約20 個具有最高抗增殖或抗病毒活性的菌落，以對質粒及其插 入片段進行自動測序。具有獨一無二的DNA序列的插入片 15 段用一對PCR引物進一步擴增，即BVBF : 5'-ACCATGAAGGTGACGCTC-3'(SEQ ID No : 17);和 BVR : 5’-AATCTTCTCTCATCCGC-3，(SEQ ID No : 16)，它 們分別是pBVB載體的多克隆位點上游和下游的側翼序 列。擴增出的PCR産物用於下一輪改組文庫的構建。 2〇 基於抗增殖或抗病毒活性的增加，進行5個迴圈的篩選 步驟。 實施例4 .在大腸桿菌中表達並純化重組Novaferon蛋白 在大腸桿菌中表達Novaferon蛋白（SEQ ID No : 2)。將 人工添加了起始密碼子ATG的SEQ ID No : 1的閱讀框克隆 52 200900504 入溫度可誘導的pBVB載體中從而置於λ PRPL啓動子的調 控之下（114)。將Novaferon表達質粒pBVBNF轉化到DH5a 細胞中。分別挑取單個菌落，接種於2 ml含5〇//g/ml氨节青 黴素的LB培養基中，並在3〇°c下培養8小時。然後，取2 mi 5培養的細菌，進一步用50 ml含50# g/ml氨苄青黴素的培養 基在30°C下攪動培養過夜。第二天早上，將過夜培養的細 菌按1:10〜1:20的比例接種於含50# g/ml氨苄青黴素的大 體積的LB培養基中’並於30。(：攪動培養。當培養物達到生 長對數中期時(A550 = 0.5-0.6)，將培養溫度快速升高至42 10 C並維持4小時，以便誘導Novaferon的表達。經4小時的熱 誘導後’將細菌離心並用PBS (137 mMNaa , 2.7 mM KQ， 10 mM Na2HP04，2 mM ΚΗ2Ρ〇4)洗滌3次，然後保存在-80 °C直至進行純化。 大多數Novaferon蛋白分子在此處描述的大腸桿菌生 15産系統中是可溶的，儘管它們在細胞質中過表達。因此， 通過細胞裂解緩衝液I (50 mM Tris-Cl(pH8.0)，1 mM EDTA (ρΗ8·0) ’ 100 mM NaCl)中的溶菌酶消化來破裂細胞。裂解 産物進一步進行超聲處理以破裂剩餘的完整細胞並剪接 DNA分子。然後將裂解産物離心。 20 上清液中的可溶性Novaferon蛋白分子依次通過疏 水、離子交換層析和凝膠過濾進行純化。首先，將上清液 載入到Phenyl Sepharose 6快速流動柱(GE Healthcare，US) 上並通過其。其次，將含有Novaferon蛋白的級分施加至 POROS 50 D柱(Applied Biosystem，US)上。第三，將含有 53 200900504

Novaferon 分子的級分用 POROS 50 HS 柱（Applied Biosystems，US)進行純化。最後，將收集的Novaferon分子 進一步用 HiLoad 26/100 Superdex 75pg(Amersham，US)進 行純化。 5 純的Novaferon蛋白的純度通過15% SDS-PAGE分析進 行驗證。純的重組Novaferon蛋白顯示爲單一的條帶，分子 量(MW)爲19-20 KDa。質譜法分析表明，純化的Novaferon 分子的純度>98%，分子量爲19313道爾頓，這與從其氨基 酸序列推測的19315道爾頓的分子量相一致。 10 實施例5 .在大腸桿菌中表達並純化重組HuIFN-α 2b

HuIFN- a 2b的表達質粒pBV2b包含成熟HuIFN- a 2b蛋 白的cDNA編碼區（GeneBank核苷酸登錄號：nm_000605)， 其處於熱可誘導的；I PRPL啓動子的控制之下。HuIFN-q： 2b的表達根據joseph S和David WR所描述的操作規程來進 15 行（116)。 將表達質粒pBV2bF轉化到DH5a細胞中。分別挑取單 個菌落，接種於2 ml含50/zg/ml氨苄青黴素的lb培養基 中，並在3(TC下培養8小時。然後，取2 ml培養的細菌，進 一步用50 ml含50 /z g/ml氨苄青黴素的LB培養基在3〇°c下 2〇授動培養過夜。第二天早上，將細菌培養物按1:1 〇〜1:2〇 的比例接種於含50/z g/ml氨苄青黴素的大體積的lb培養基 中，並於30。(：攪動培養。當培養物達到生長對數中期時 (A550 = 0.5-0.6)，將培養溫度快速升高至42。(：並維持4小 時’以便誘導HuIFN-α 2b的表達。經4小時的熱誘導後，將 54 200900504 細胞離心並用 PBS (137 mM NaQ，2.7 mM KCl，i〇 mM Na2HP04，2 mM KH2P04)洗滌3次，然後保存在-80〇c直至 進行純化。

HuIFN- a 2b在此處描述的大腸桿菌表達系統中以不溶 5 形式表達，因此根據Molecular Cloning(115)所描述的操作 規程來進行内含體的回收和洗滌程式。簡言之，將收獲的 細菌細胞重懸在細胞裂解緩衝液I(50 mM Tris-Cl(pH8.〇>，1 mMEDTA(pH8.0)，lOOmMNaCl)中，並通過溶菌酶和超聲 處理來進行裂解。内含體用冰冷的細胞裂解緩衝液Η(補充 10 有〇.5%(v/v)Triton Χ-100的細胞裂解緩衝液I)洗滌3次。 通過在室溫下伴隨攪動在7N胍中懸浮4小時來破裂回 收的内含體。在4°C離心15分鐘後，使變性的蛋白質在〇.15 M pH9.5 Borex緩衝液中於4°C再折疊48小時。在最後一步 再折疊時，用HC1將pH調整到7.4。 15 然後’通過疏水、離子交換層析和凝膠過濾來純化含 有經折疊的HuIFN-α 2b的溶液。首先，將溶液載入到phenyl Sepharose 6快速流動柱(GE Healthcare，US)上並通過其。 其次，將含有HuIFN-fl：2b的級分施加至POROS 50 D柱 (Applied Biosystem，US)上。第三，將含有HuIFN-α 2b的 20 級分用 POROS 50 HS柱（Applied Biosystems，US)進行純 化。最後，將收集的HuIFN- a2b分子進一步用HiLoad 26/100 Superdex 75pg(Amersham，US)進行純化。在 15% SDS-PAGE分析中’純的HuIFN- a 2b蛋白顯示爲單一的條 帶，並且通過質譜法證實其純度爲>98%。 55 200900504 實施例6 .測定Novaferon的抗病毒活性 使用在Armstrong JA(113)所描述的傳統操作規程中的 WISH-VSV系統來測定抗病毒活性。第一天，將WISH細胞 (ATCC，目錄號CCL25)以14,000個細胞/孔的密度接種於96 5 孔板中，並於37°C孵育。24小時後，在每孔中加入2倍系列 稀釋的1^(^3£61'〇11、1111吓]^-〇:215、\¥110人圧>1國際標準品或 空白培養基，並於37°C再孵育24小時。第三天，去除培養 基，替換成含有1，000 PFU的水泡性口膜炎病毒(VSV， ATCC，目錄號VR-1421)的培養基。細胞再次在37°C孵育24 10 小時，接著用0.85%的NaCl洗滌以去除死細胞。然後，將培 養板在染料固定溶液(dye-fixer solution)(0.5%結晶紫，5% 福馬林(V/V)，50%乙醇（V/V)，和0.85% NaCl)中浸泡1小 時。接著，輕輕倒出染料固定溶液，並用自來水充分漂洗 微量培養板並讓其乾燥。用0.2 ml 2-甲氧基乙醇來溶解染色 15 的細胞。對於結晶紫生物測定法，在Model Opsys MR(Thermo Labsystems，US)中於550 nm讀取平板。 所有實驗重復3次，Novaferon和HuIFN- a 2b樣品在同 一塊平板中測試。對於在此製備的Novaferon和HuIFN- a 2b 的抗病毒活性作平行分析，參照WHO國際標準品94/786(複 20 合rHuIFN-α )和95/650(rHuIFN-a 2a)來測定抗病毒單位（國 際單位或IU) ’這些WHO國際標準品可從National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC，USA)購得。 測得的經純化的Novaferon蛋白在WISH中針對VSV的 抗病毒活性爲2.5xl09 IU/mg，而HuIFN-α 2b的抗病毒活性 56 200900504 爲2.0xl08 IU/mg。該資料表明，Novaferon蛋白的抗病毒活 性爲&1^^-〇:21)的大約12.5倍。 實施例7 . Novaferon的抗增殖活性 抗增殖活性分析基本上如Evinger和Pestka所述的來進 5 行(101)。 A ·人腫瘤細胞系的細胞培養 人腫瘤細胞系從不同機構購買得到（下表1)，即 ATCC(American Type Culture Collection，P.O. Box 1549， Manassas，VA 20108，USA)，DSMZ(German National 10 Resource Centre for Biological Material ， Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH » Mascheroder Weg lb，38124 Braunschweig，Germany)， JCRB(Japanese Collection of Research Bioresources-Cell Bank，National Institute of Biomedial Innovation，7-6-8 15 Saito-Asagi，Ibaraki-shi，Osaka 567-0085 ’ Japan)。 20 57 200900504 表1 .人腫瘤細胞系

細胞系 腫瘤 代碼 機構* A-375 黑色素瘤 CRL1619 ATCC IGR-1 黑色素瘤 Acc 236 DSMZ IGR-37 黑色素瘤 Acc 237 DSMZ IPC-298 黑色素瘤 Acc 251 DSMZ HCT-8 結腸直腸腺癌 CCL-244 ATCC SW1116 結腸直腸腺癌 CCL-233 ATCC LS 180 結腸直腸腺癌 CL-187 ATCC DLD-1 結腸直腸腺癌 CCL-221 ATCC LS174T 結腸直腸腺癌 CL-188 ATCC Hep G2 肝細胞癌 HB-8065 ATCC Hep3B 肝細胞癌 HB-8064 ATCC HuH-7 肝癌 0403 JCRB PLC/PRF/5 肝癌 CRL-8024 ATCC HL60(S) 淋巴細胞的 0163 JCRB Daudi 伯基特淋巴瘤 CCL-213 ATCC L-428 何傑金淋巴癌 Acc 197 DSMZ DU145 前列腺癌 HTB-81 ATCC PC-3 前列腺癌 Acc 465 DSMZ MKN 1 胃腺癌 0252 JCRB KYSE 30 食管癌 0188 JCRB A549 肺癌 CCL-185 ATCC HeLa 子宮頸腺癌 CCL-2 ATCC C-33A 子宮頸癌 HTB-31 ATCC

* DSMZ :德意志微生物保藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) * Germany ATCC :美國典型培養物保藏中心（American Type Culture 5 Collection)，USA 、 JCRB ： Japanese Collection of Research Bioresources-Cell Bank >

Japan 於37°C在含有5% C02的潮濕氣氛中培養所有用於抗 10 增殖活性測試的細胞。細胞根據每種細胞的生長手冊，在 基礎生長培養基中進行生長，例如DMEM、MEM、F12K和 1640或者1640加上F12(所有均來自Gibco BRL，US)，其補 充有5-20%來自Gibco BRL，US的熱滅活胎牛血清FBS。每 種細胞糸的基礎生長培養基列在下表2中。所有細胞系每天 58 200900504 在培養板中用倒置顯微鏡進行檢查。在其對數生長期（通過 台盼藍染料排除法測得生存力超過90%)時，收穫細胞並用 於實驗。在標準血細胞計數器中檢查細胞數和生存力。 5 表2 .人腫瘤細胞系的培養和測量方法 細胞系 培養基 細胞/孔 測量方法 IGR-1 DMEM 5000 結晶紫生物測定法 IGR-37 DMEM 2000 結晶紫生物測定法 IPC-298 1640 2000 結晶紫生物測定法 HCT-8 1640 500 結晶紫生物測定法 LS 180 MEM 3000 結晶紫生物測定法 DLD-1 1640 1500 結晶紫生物測定法 Hep G2 MEM 1000 結晶紫生物測定法 Hep 3B MEM 800 結晶紫生物測定法 HuH-7 DMEM 4000 結晶紫生物測定法 PLC/PRF/5 MEM 6000 結晶紫生物測定法 KYSE 30 1640+F12 1000 結晶紫生物測定法 DU 145 MEM 1000 結晶紫生物測定法 PC-3 1640 2000 結晶紫生物測定法 MKN 1 1640 2000 結晶紫生物測定法 A549 F12K 400 結晶紫生物測定法 SW 1116 1640 1000 結晶紫生物測定法 LS174T MEM 4000 結晶紫生物測定法 HeLa MEM 500 結晶紫生物測定法 C-33A MEM 1000 結晶紫生物測定法 A-375 DMEM 200 結晶紫生物測定法 HL 60(S) 1640 800 直接細胞計數 Daudi 1640 400 直接細胞計數 L-428 1640 800 直接細胞計數 B·抗增殖分析的程式 將對數生長期的細胞系輕輕地懸浮在溫熱的（3 6 °C )培 養基中，密度爲2xl03-6xl04個細胞/ml(隨細胞系而變化，見 10 表2)。在96孔板的每個孔中接種入100 // 1細胞懸浮液，接著 在37°C孵育6-8小時。然後，一式三份地向孔中加入相同體 59 200900504 積（100/^l)的在培養基中稀釋的Novaferon或HuIFN-α2b。 輕輕搖動培養板4-5秒以混合内容物，並在37°C孵育6天。 在同一平板中測試Novaferon和HuIFN- a 2b樣品以保證可 比性。 5 使用兩種方法來測定細胞孔中的細胞數目，並根據細 胞數目來計算Novaferon和HuIFN-a2b的抗增殖活性。 使用直接細胞計數法來測定懸浮細胞的細胞數目。培 養6天後，用台盼藍（終濃度：0.02%)稀釋懸浮細胞培養物， 並用血細胞計數器直接對細胞數目進行計數。 1〇 結晶紫生物測定法用於測定粘著細胞的細胞數目 (93)。培養6天後，通過在培養孔中吹吸PBS來去除死細胞。 接著，在孔中注滿染料固定溶液以使活細胞染色1小時。染 料固定溶液在蒸餾水中含有0.5%結晶紫，5%福馬林 (V/V)，50%乙醇(V/V)，和0_85%NaCl。然後，用自來水充 15 分漂洗微量培養板並讓其乾燥。用0.2 ml 2-甲氧基乙醇來溶 解染色的細胞。測量在550 nm處的光密度(OD550)(Model Opsys平板閱讀器，Thermo Labsystems，US)，並用作細胞 數目的相對指標。 通過以下公式計算生長抑制率：抑制率 2〇 %=(1-(E-B)/(C-B))xl00，其中E爲在第6天在經Novaferon或 HuIFN-a2b處理的孔中的細胞數或〇D55Q值；B爲培養細胞 在第0天在細胞培養物中的細胞數或〇D550值；C爲在第6天 在未處理的孔中的細胞數或OD550值。 抑制率與化合物的濃度一起表示。通過使用一系列樣 60 200900504 品濃度來估算Novaferon或HuIFN- a 2b的IC5Q。將所述資料 擬合成S形曲線（117)，其具有Hill斜率方程：Y = Min+(Max-Min)/(l + l〇D(IC50-X))，其中 X 爲藥物濃度的對 數；Y爲抑制率；Min或Max爲最小或最大抑制率平臺。可 5 以比較各種不同化合物對於某一特定靶的IC50，其中IC50越 低表不化合物越有效。

Novaferon和HuIFN- d 2b的濃度和相應的對於Daudi細 胞系的細胞生長抑制率在第4圖中給出。根據該資料，計算 得到Novaferon和HuIFN- a 2b抑制Daudi細胞生長的IC50爲 10 0.0174 pmol 和 6.9550 pmol。因此，Novaferon 的 IC5〇 是

HuIFN- a 2b的大約1/400，這表示Novaferon的抗增殖效力爲 HuIFN- a 2b 的大約 400倍。 在23種腫瘤細胞系中，評估Novaferon的抗增殖活性， 並與HuIFN-α 2b的抗增殖活性進行比較，所述23種腫瘤細 15 胞系包括4種源自黑色素瘤的細胞系（A-375，IGR-1， IGR-37，IPC-298)，5種結腸直腸腺癌細胞系（HCT-8， SW1116，LS 180，DLD-1，LS174T)，4種肝癌細胞系（Hep G2 ’ Hep 3B，HuH-7 ’ PLC/PRF/5)，3種淋巴瘤細胞系 (HL-60(S)，Daudi ’ L-428)，2種前列腺癌細胞系（DU 145， 20 PC-3)，2種子宮頸癌細胞系（HeLa，C-33A)，1種胃腺癌細 胞系（MKN 1)，1種肺癌細胞系（A549)和1種食管癌細胞系 (KYSE 30)。針對所有受試癌細胞系，NovafeiOn表現出比 HuIFN-α: 2b強得多的抗增殖活性。效力的增加程度在不同 的癌細胞系中有變化’從16到1134倍（下表3)。 61 200900504 表3 . Novaferon和 HuIFN-a2b 的 IC50值 以及Novaferon相對於HuIFN- a 2b的腫瘤細胞抑制增加倍數 細胞系 IC5〇(pmol) HuIFN- a 2b Novaferon 倍數 (Novaferon/HuIFN- a 2b) PLC/PRF/5 0.0407 0.0025 16 A549 4.27 0.2202 19 DU 145 0.1319 0.0036 36 HepG2 0.1718 0.004 43 HuH-7 0.1474 0.0026 58 Hep3B 4.3934 0.0758 58 IPC-298 0.0516 0.0007 70 LS174T 0.0165 0.0002 74 IGR-37 0.6017 0.0055 109 PC-3 1.8777 0.0146 128 HeLa 0.2364 0.0017 141 C-33A 2.5242 0.0176 143 MKN 1 0.233 0.0011 207 HCT-8 2.9479 0.0139 212 SW 1116 0.2278 0.001 222 DLD-1 0.3977 0.0014 282 HL-60(S) 0.5855 0.0019 306 LS 180 0.7579 0.0022 350 Daudi 6.955 0.0174 400 KYSE 30 18.0134 0.0264 683 A-375 1.4134 0.0019 733 IGR-1 6.6718 0.0076 876 L-428 17.2789 0.0152 1134 實施例8 .體内腫瘤模型實驗 5 A·細胞培養和體内人腫瘤異種移植模型 結腸癌細胞系（LS 180)、黑色素瘤細胞系（A-375)和肝 癌細胞系（Hep G2)從美國典型培養物保藏中心（ATCC， Rockville，MD)獲得。前列腺癌細胞系（PC-3)從德意志微生 物保藏中心(DSMZ ，Deutsche Sammlung von 10 MikiOorganismen and Zellkulturen，Germany)獲得。淋巴 細胞系（HL 60 (S))從Japanese Collection of Research 62 200900504

Bioresources Cell Bank(JCRB，Japan)購買得到。所有細胞 根據它們的規程（見表1)進行培養。簡言之，LS 180和Hep G2 培養在MEM培養基中。A-375培養在DMEM中。兩種培養 基都補充有10%胎牛血清(FBS)、2 mM縠氨酰胺、1〇〇 U/ml 5青黴素、l〇〇mg/ml鏈黴素、0.1 mM非必需氨基酸和l.OmM 丙酮酸鈉。PL-3和HL60(S)細胞培養在RPMI 1640中，其補 充有10% FBS、100 U/ml青黴素和100 mg/ml鏈黴素。所有 細胞都於37°C維持在5%C02氣氛中。 用Beverly等人描述的方法（118)建立人癌症移植模 10 型。從組織培養板上收穫對數生長的癌細胞，洗滌，並重 懸浮在磷酸鹽缓衝鹽水(PBS，pH=7.5，20 mM)中。在6周 齡無胸腺Balb/c裸鼠的兩脅，通過皮下注射6χ106個細胞/0.3 ml(PC-3，HepG2)，4χ106個細胞/0.3 ml(LS 180)，2χ107個 細胞/0.3 ml(HL60(s))或8χ106個細胞/0.3 ml(A-375)，産生了 15 皮下腫瘤移植物。對於每種體内腫瘤模型，在腫瘤細胞接 種後第6天，將攜帶有腫瘤的小鼠（腫瘤體積爲大約100 mm3) 隨機分成7或8組，每組有相同數目的動物，並開始治療。 將Novaferon和HuIFN-a2b用PBS溶液配製。每天皮下 注射單獨的PBS，各種不同劑量的Novaferon，或HuIFN-a 20 2b，從小鼠分組當天開始，共持續30天（PC-3，HepG2， A-375)、28天(LS 180)或21 天(HL60(s))。對於5-FU的治療， 每兩天一次靜脈内施用30 mg/kg的5-FU，共5次。組和治療 劑量概括在下面： 63 200900504 組1(對照）：每天PBS。 組2(低劑量Novaferon):每天 1.25//g/kg。 組3(中等劑量Novaferon):每天 12.5" g/kg。 組4(高劑量Novaferon):每天 125// g/kg。 5 組5(低劑量HuIFN-a2b):每天l_25#g/kg。 組6(中等劑量HuIFN- a 2b):每天 12.5 /z g/kg。 組7(高劑量HuIFN-a2b):每天 125/zg/kg。 組8(5-FU) : 30 mg/kg，每2天一次靜脈内施用，共5次。 10 —旦開始治療，腫瘤用測徑器每周測量一次。使用以 下公式計算腫瘤體積：體積=〇.5χ寬度2X長度。在治療停止 當天（治療開始後第30天），將小鼠處死。分離實體瘤，照相， 並測量。 使用以下公式計算生長抑制率：抑制率=[1-T/C]x 15 100%，其中 T爲Novaferon、HuIFN-a 2b或5-FU治療組中腫 瘤的平均重量；C爲在治療後對照組中腫瘤的平均重量。 B·人前列腺癌異種移植模型 前列腺癌PC-3異種移植物通過皮下注射1.25、12.5或 125/zg/kg Novaferon來進行治療，持續30天。Novaferon表 20 現出強的、劑量依賴性的對於PC-3腫瘤生長的抑制 (P<0.05)。如第5圖和下面的表4中所示，與PBS治療的對照 組相比，Novaferon治療組的PC-3腫瘤生長被大大抑制。例 如，Novaferon治療組（125/zg/kg)中PC-3異種移植腫瘤塊的 平均重量爲0.091±0.081g，這與對照組動物的1.948±0.567g 64 200900504 相比，具有非常顯著的降低(p<0 001)(表句。換言之，以125 #§/1^治療30天，獲得了？(：-3腫瘤生長的95.3%抑制（表4)。 表4 ·用Novaferon和HuIFN- 〇： 2b治療的人前列腺癌pc_3 異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率(n=l〇) 組 劑量 (β g/kg) 腫瘤重量（g) (平均值±呂〇) 抑制率 (%) 對照 - 1.948±0.567 低劑量Novaferon 1.25 1.266±0.457* 35.0 中等劑量Novaferon 12.5 0.759±0.574*** 61.0 高劑量Novaferon 125 0.09110.〇81***@@@ 95.3 低劑量HuIFN-a2b 1.25 1.284±0.862 34.1 中等劑量HuIFN-α 2b 12.5 0.790+0.391*** 59.4 高劑量HuIFN-α 2b 125 0.476+0.271*** 75.6 注：*ρ<0·05 ’ ***ρ<0·001 :與對照組相比；@@@p<0 00〗：與高劑 量HuIFN- a 2b組相比。 在將6χ10ό個活PC-3細胞皮下導入小鼠後，Balb/c裸鼠 10 通過每天皮下注射Novaferon(1.25/z g/kg，12.5# g/kg或 125 μ g/kg)來治療30天。結果表示爲平均腫瘤體積(mm3)。第5 圖顯示，與PB S對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表 現出劑量依賴性的PC-3腫瘤生長抑制（P<〇.〇5)。125 μ g/kg 的Novaferon誘導比相同劑量的HuIFN- a 2b強得多或幾乎 15 完全的PC-3腫瘤生長抑制（95.3%對75.6%，P<0_01)(表4)。 有意義的是注意到，更長時間的Novaferon或HuIFN-α 2b治療可導致在高劑量（125 // g/kg)治療組中腫瘤生長抑 制的更大差異。第28天，Novaferon治療組中的PC-3腫瘤塊 的平均體積爲1〇7.9±68.7 mm3,而HuIFN-a2b治療組中爲 65 200900504 620.7±296.6 mm3(P<0.001)，第 30天分別爲 122.1±100.7 mm3 和691.9±428.3 mm3(P<0.001)。這還發生在觀察結束後考慮 平均腫瘤重量（在高劑量Novaferon組中爲0.091±0.081g，而 在高劑量HuIFN-a2b組中爲0_476±0.271g，P<0.001)時。這 5 表明，在該異種移植模型中，該劑量Novaferon的更長時間 治療可展現出更好或完全的PC-3腫瘤生長抑制。 C·人肝癌異種移植模型 還在肝癌Hep G2異種移植模型中評價Novaferon的體 内抗腫瘤活性。與對照組相比，Novaferon表現出有效的、 10 劑量依賴性的Hep G2腫瘤生長抑制(Ρ<0·001)。在Novaferon 治療組（每天皮下注射1.25、12.5或125// g/kg，持續30天） 中的平均腫瘤體積分別爲783.2±270.0、459_3±414.3和104.6 ±56.5 mm3，而在PBS對照組中爲2125.8±743.1 mm3。用 125 "g/kg的Novaferon治療30天，達到了 Hep G2的最高抑制 15 (96.6%)，這顯著好於125 " g/kg HuIFN- a 2b的抑制率 (89.2%，P<0.01)。該劑量Novaferon的更長時間治療顯示 出，更加好或完全的抑制趨勢。在觀察期結束時，對於 Novaferon治療組在125 # g/kg的情況下平均腫瘤重量爲 0.074±0.083g，這顯著低於 125//g/kg HuIFN-α 2b治療組的 20 平均腫瘤重量（0.235±0.199g，P<0.001)(下表5)。 在將6xl06個活Hep G2細胞皮下導入小鼠後，Balb/c裸 鼠通過每天皮下注射Novaferon(1.25 // g/kg，12.5 // g/kg和 125# g/kg)來治療30天。結果表示爲平均腫瘤體積(mm3)。 第6圖顯示’與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon 66 200900504 都表現出劑量依賴性的Hep G2腫瘤生長抑制(p<〇 〇〇1)。125 // g/kg的Novaferon誘導比相同劑量的HuIFN- a 2b強得多或 幾乎完全的Hep G2腫瘤生長抑制（96.6%對89.2%， P<0.05)(表 5)。 表5 ·用Novaferon和HuIFN- a 2b治療的人肝癌細胞Hep G2 異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率（n=l〇) 組 劑量 (β g/kg) 腫瘤重量(g) (平均值±80) 抑制率 (%) 對照 - 2.179±0.578 - 低劑量Novaferon 1.25 0.797±0.397*** 63.4 中等劑量Novaferon 12.5 0.321±0.300*** 85.3 高劑量Novaferon 125 0.074+0.083***@ 96.6 低劑量HuIFN- a 2b 1.25 1.070±0.587** 50.9 中等劑量HuIFN-α 2b 12.5 0.531+0.287*** 75.6 高劑量HuIFN- a 2b 125 0.235±0.199*** 89.2 注：**ρ<0·01，"*p<0_001 :與對照組相比；@p<0.01 :與高劑量 HuIFN- a 2b組相比。 10 D·人黑色素瘤異種移植模型 進一步在惡性黑色素瘤A-375異種移植模型中評價 Novaferon的體内抗腫瘤活性。a-375細胞系（ATCC編號： CRL-1619)來源於人惡性實體瘤。與對照組相比，Novaferon 15表現出有效的、劑量依賴性的A-375腫瘤生長抑制 (P<0.001)。在Novaferon治療組(每天皮下注射丨.25、12.5或 125# g/kg，持續28天）中的抑制率分別爲4〇 1%、75 〇%和 82.8%，這與PBS對照組形成對比(p<〇 〇〇1)(下表6)。用125 /z g/kg的Novafemn治療30天，達到了 Α·375的最高抑制 67 200900504 (82.8%)，這顯著好於125 // g/kg HuIFN- a 2b的抑制率 (69.9%，Ρ<0·001)。 有意義的是，Novaferon表現出相比化療劑5-FU而言更 有效的黑色素瘤細胞A-375生長抑制（表6)。例如，在第30 5 天，在用12.5 // g/kg或125 /z g/kg Novaferon進行治療的組中 平均腫瘤重量爲 0.763 ± 0_187g(P<0.01)和 0.527 土 0_149g(P<0.001)，而用30 mg/kg 5-FU治療的組的平均腫瘤 重量爲1.004±0.105g(表6)。這表明，對於治療人黑色素瘤 A-375，Novaferon可能比5-FU更有效。 10 在將8x 106個A-375細胞皮下導入小鼠後，Balb/c裸鼠通 過每天皮下注射Novaferon(1.25" g/kg，12.5" g/kg和 125# g/kg)來治療28天。結果表示爲平均腫瘤體積(mm3)。第7圖 顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表現 出劑量依賴性的A-375腫瘤生長抑制（P0.001)。125# g/kg 15 的Novaferon誘導比相同劑量的HuIFN- a 2b更強的A-375腫 瘤生長抑制（82.8%對69.9%，Ρ<0·001)(第 7圖）。12.5//g/kg 和125 # g/kg Novaferon所顯示出的腫瘤生長抑制（分別爲 75.0%和82.8%)均比5-?1；(67_2%，？<0.01和？<0.0〇1)更好 (第7圖）。 20 68 200900504 表6 .用Novaf_和HuIFN-db治療的人黑色素瘤細胞八_375 異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率(n= i〇) 組 劑量 (H g/kg) 腫瘤重量（g) ___(X+SD) 抑制率 (%) 對照 - 3.057±0.384 低劑量Novaferon 1.25 ^830+0.289*** 40.1 中等劑量Novaferon 12.5 〇.763±〇.i87*** && $$$ 75.0 高劑量Novaferon 125 0.527+0.149***&&&(2)(5)(5) 82.8 低劑量HuIFN- a 2b 1.25 1-890+0.148*** 38.2 中等劑量HuIFN-a2b 12.5 1-681+0.132*** 45.0 南劑量 HuIFN· 2b 125 0-920+0.139*** 69.9 5-FU 30,000 1.004土 0.105*** 67.2 注：***ρ<0·001，與對照組相比；$$$p<〇 〇〇1 :與中等劑量 (12.5)仙1?1^-〇;21)相比；@@@?<〇_〇〇1:與高劑量（125)151111^_ a 2b組相比；: ρ<〇·〇ι ’ : ρ<〇·〇〇1，與5_fu組相比。 E·人結腸癌異種移植模型 在結腸癌LS 180異種移植模型中評價Novaferon的體内 抗腫瘤活性。LS 180細胞系（ATCC編號：CL-187)來源於人 10 結腸腺癌。與對照組相比，Novaferon表現出有效的、劑量 依賴性的結腸癌LS 180腫瘤生長抑制（P<0.001)。在 Novaferon治療組(每天皮下注射][25、12.5或125//g/kg，持 續28天）中的抑制率分別爲75.0%、80.5%和92.5%，與PBS 對,日忍組形成對比（ρ<〇.〇〇1，下表7)。用125 " g/kg的Novaferon 15 治療28天’達到了 LS 180腫瘤生長的最高抑制（92.5%)，這 顯著好於125 # g/kg HuIFN- a 2b的抑制率（82.3%， Ρ<0·001)。 治療28天後，在平均脸瘤重量方面，12.5 /z g/kg Novaferon對LS 180癌症異種移植物生長的抑制與5-FU(30 69 200900504 mg/kg)相似（0.815±0.221g 對 0.758±0.227g)。125/zg/kg Novaferon對LS 180腫瘤生長的抑制顯著好於30 mg/kg 5_FU(92.5%對81.8%，P<0.001)(表7和第 8圖）。考慮到5-FU 在結腸癌患者的標準化療中的常規臨床應用，這些觀察結 5 果是非常有意義的。Novaferon在動物模型中對於LS 180腫 瘤生長的更好的抑制表明，Novaferon具有成爲在臨床情況 下非常有效的抗結腸癌試劑的潛力。 在將4xl06個活LS 180細胞皮下導入小鼠後，Balb/c裸 鼠通過每天注射>1〇¥3【61'〇11(1.25/^/]<;§，12.5/(/§/1^和125// 10 g/kg)來治療28天。結果表示爲平均腫瘤體積(mm3)。第8圖 顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的Novaferon都表現 出劑量依賴性的LS 180腫瘤生長抑制（P<0.001)。125 /z g/kg 的Novaferon誘導比相同劑量的HuIFN- a 2b更強的LS 180 腫瘤生長抑制（92.5%對82.3%，Ρ<〇.〇〇1)(表7)。1.25"g/kg 15 和 12.5/z g/kg Novaferon都獲得與5-FU(81.8%)相似的腫瘤 生長抑制（分別爲75.0%和80.5%)(表7，第8圖）。但是， # g/kg Novaferon表現出比5-FU好得多的LS 180腫瘤生長 抑制（92.5%對81.8%，Ρ<〇·〇〇1)。 20 70 200900504 表7 ·用Novafercm和HuIFN-a2b治療的人結腸癌細胞^ 18〇 異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率（11=1〇) | —— 組 劑量 (U g/kg) 腫瘤重量（g) (X+SD) 抑制率 (%) 對照 - 4.170±3.409 低劑量Novaferon 1.25 1.043±0.433*** 75.0 中等劑量Novaferon 12.5 〇.815±0.221*** 80.5 高劑量Novaferon 125 〇-314±0.〇86***&&&〇/(S/® 92.5 低劑量HuIFN-a2b 1.25 1.225±0.565*** 70.6 中等劑量HuIFN-a2b 12.5 1.076±0.442*** 74.2 高劑量HuIFN-a2b 125 0.740±0.310*** 82.3 5-FU 30,000 0.758+0.227*** 81.8 @@@，ρ<〇.〇〇1 :與高劑量 HuIFN-與5-FU組相比。 注：***ρ<0·001，與對照組相比； a 2b相比；&&&，ρ<0·001， 5 F·人白血病異種移植模型 還在HL 60(s)淋巴細胞白血病異種移植模型中評價 Novaferon的體内抗腫瘤活性。與對照組相比，N〇vafer〇n 表現出有效的、劑量依賴性的HL 60(s)腫瘤生長抑制 10 (Ρ<〇·〇〇1)。在Novaferon治療組（每天皮下注射丨25、12 5或 125//g/kg，持續28天）中的抑制率分別爲43 8%、55 2%和 80.4%，與PBS對照組形成對比（p<〇 〇〇1，下表8)。用J25" g/kg的Novaferon治療21天，達到了 HL 6〇⑷腫瘤生長的最高 抑制（80.4%) ’這顯著好於125//g/kg HuIFN-a2b的抑制率 15 (69.8%，P<0.05)。 在將2xl07個活HL 60(s)細胞皮下導入小鼠後，Balb/c 小鼠通過每天皮下注射1^€^【61*〇11(1.25//§/]<:§，12.5"§/1^ 和125 // g/kg)來治療21天。結果表示爲平均腫瘤體積 (mm3)。第9圖顯示，與PBS對照組相比，所有3個劑量的 71 200900504

Novaferon都表現出劑量依賴性的HL 60(s)腫瘤生長抑制 (P<0.001)。125 // g/kg 的 Novaferon 誘導比相同劑量的 HuIFN- a 2b更強的HL 60(s)腫瘤生長抑制（80.4%對 69.8%，P<0.05)，和誘導與5-FU相似的抑制（第9圖，表8)。 5 表8.用Novaferon和HuIFN- a 2b治療的人白血病細胞HL 60(S) 異種移植物的腫瘤重量和生長抑制率（n=10) 組 劑量 (β g/kg) 腫瘤重量（g) (X+SD) 抑制率(％) 對照 - 3.72310.750 - 低劑量Novaferon 1.25 2.091+0.653*** 43.8 中等劑量Novaferon 12.5 1.668+0.665*** 55.2 高劑量Novaferon 125 0.729±0.332***@ 80.4 低劑量HuIFN-a2b 1.25 2.401+0.698*** 35.5 中等劑量HuIFN-a2b 12.5 1.870±0.660*** 49.8 高劑量HuIFN- a 2b 125 1.124±0.397*** 69.8 5-FU 30,000 〇.893±0.289*** 76.0 注：***ρ<〇·〇〇1，與對照組相比；@ρ<〇·〇5 :與高劑量（i25)HuIFN-α 2b組相比。 10 G ·小鼠在Novaferon治療期間的總體狀態 在Novaferon、HuIFN-α 2b或5-FU治療期間，密切觀察 具有各種不同的人癌症異種移植物的小鼠。不同於在5_FU 治療組中，在所有Novaferon或HuIFN- a 2b治療組中的小鼠 15通常正常地飲食和行爲，並且沒有體重減少。經5-FU治療 的小鼠顯示出典型的飲食和行爲變化，並且體重減少。這 些觀察結果表明，雖然在異種移植動物模型中顯示出與 5-FU相似或更好的抗癌效力，但N〇vaferon在關於腫瘤細胞 的抑制方面可能更特異，並且對正常細胞和/或生理功能的 72 200900504 影響少得多。這些在人的應用中可轉化成更好的财受性和 優異的治療效果。 正如依據前面的公開内容本領域技術人員將會清楚 的，在實踐本發明中可能進行許多改變和修飾，而不背離 5 本發明的範圍和精神。因此，應根據所附權利要求書中所 限定的實質來確立本發明的範圍。 【圖式簡單說明】 第1圖描繪了編碼本發明的新型蛋白質的完整DNA序 列（SEQ ID No : 1)，所述新型蛋白質在此稱爲 10 Novaferon™(A)。第1圖還顯示了 Novaferon的預期氨基酸序 列（SEQ ID No : 2)(B) ’以及Novaferon氨基酸序列和 Novafei*on DNA序列的比對(C)。成熟Novaferon蛋白的第一 個氨基酸半胱氨酸被指定爲殘基1。 第2圖顯示了 Novaferon基因和HuIFN- α 14基因 15 (Genebank編號：ΝΜ_002172)的核皆酸序列比對(a)，以及 Novaferon 蛋白和 HuIFN- α 14 蛋白（從 Genebank編號： NM_002172翻譯的）的氨基酸序列比對(B)。成熟Novaferon 蛋白的第一個氨基酸半胱氣酸被指定爲殘基1。Novaferon 與HuIFN-a 14在核苷酸水平上共用大約93%的序列同一性 20 (462/498)，和在氨基酸水平上共用大約87%的序列同一性 (144/166)。不同的核苷酸用中間線中的空缺來進行標示。 第3圖顯示了 Novaferon基因和HuIFN- a 2b基因 (Genebank編號：NM_000605)的核苷酸序列比對(a)，以及 Novaferon蛋白和HuIFN_ α 2b蛋白（從Genebank編號爲 73 200900504 NM_000605的HuIFN- 〇: 2b基因翻譯出的）的氨基酸序列比 對(B)。成熟Novaferon蛋白的第一個氨基酸半胱氨酸被指定 爲殘基1。Novaferon與HuIFN-a2b在核皆酸水平上共用大 約89%的序列同一性(445/498)，和在氨基酸水平上共用大 5 約81%的序列同一性（135/166)。不同的核苷酸用中間線中 的空缺來進行標示。 第4圖的圖顯示了，與HuIFN- a 2b相比，Novaferon對 於Daudi細胞的體外抗增殖抑制。 第5圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 10前列腺癌PC-3異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 第6圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 肝癌Hep G2異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 第7圖的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 黑色素瘤A-375異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 15 第8圖的圖顯示了 ’ Novaferon和HuIFN- a 2b在具有結 腸癌細胞LS 180異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 第9圓的圖顯示了，Novaferon和HuIFN- a 2b在具有人 白血病HL 60(S)異種移植物的裸鼠中的體内抗腫瘤效應。 【主要元件符號說明】 (無） 74 200900504 參考她 1. 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Cys Asn Leu Ser Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Lys Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 10

Leu Leu Ala Gin Met Gly Lys lie Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 30 15 Arg His Asp Phe Glu Phe Pro Gin Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gin Phe 35 40 45

Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Leu De Gin Gin Thr 20 50 55 60

Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Glu Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Gly 65 70 75 80 25

Leu Leu Asp Lys Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Arg Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95 30

Glu Ala Cys Met Met Gin Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 35 Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gin Arg lie Thr 115 120 125

Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val 40 130 135 140

Arg Val Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gin Lys 145 150 155 160 2 45 200900504

Arg Leu Arg Gly Lys Asp 165 5 <210> 3 <211> 19 <212〉DNA <213> 人工序列 10 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 <400> 3 15 tggtgctcag ctrcaagtc 19

<210> 4 <211> 22 20 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 25 <400〉 4 22 aatcatttcc atgttgracc ag 30 <210> 5 <211> 22 <212〉DNA <213> 人工序列 35 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 <400> 5 aatcatttcc cggttgtacc ag 22 <210> 6 <211> 22 3 40 200900504 <212> DNA <213> 人工序列 <220> 5 <223>化學合成的核苷酸序列 <400〉 6 aatcatttcc atgttgaaac ag 22 10 <210> 7 <211> 22 <212〉DNA <213> 人工序列 15 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 <400> 7 20 aatcatttca agatgagccc ag 22

<210〉 8 <211> 22 25 <212〉DNA <213> 人工序列 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 30 <400〉 8 aatgattttc atgttgaacc ag 22 35 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 40 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 <400〉 9 aatcatttss atgttgaacc ag 22 4 200900504 5 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> 人工序列 10 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 <400> 10 gatcatttcc atgttgaatg ag 15 / <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> 人工序列 20 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 25 <400> 11 gagtcgtttc tgtgttggat cag 30 1 <210> 12 <211> 22 <212〉DNA <213> 人工序列 35 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 <400〉 12 atgcccctgt ccttttcttt ac 40 <210> 13 <211> 19 <212> DNA <213> 人工序列 45 <220〉 200900504 <223>化學合成的核苷酸序列 <400> 13 5 agggcagcat tcaaagcag <210> 14 <211> 21 <212> DNA 10 <213> 人工序列 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 15 <400〉14 tcagaccgct tctgcgttct g <210> 15 20 <211> 19 <212〉DNA <213> 人工序列 <220> 25 <223>化學合成的核苷酸序列 <400〉 15 gaaggctttg gggtgtgtg 30 <210> 16 <211〉 17 <212> DNA <213> 人工序列 35 <220> <223>化學合成的核苷酸序列 <400> 16 40 aatcttctct catccgc <210> 17

<211> 18 45 <212> DNA 200900504 <213> 人工序列 <220> 5 <223>化學合成的核苷酸序列 <400〉 17 accatgaagg tgacgctc

Claims (1)

1. 200900504 十、申請專利範圍： 1. 一種分離的多核苷酸，其編碼具有人干擾素樣生物學活 性的蛋白質，其中所述多核苷酸選自其中每個多核苷酸 包含與SEQ ID No : 1至少93%同一的核苷酸序列的多核 5 皆酸的組。 2. 如申請專利範圍第1項的多核苷酸，其中所述序列與 SEQ ID No : 1 至少 95% 同一。 3. 如申請專利範圍第2項的多核苷酸，其中所述序列與 SEQ ID No : 1 至少 98% 同一。 10 4.如申請專利範圍第1至3項中任一項的多核苷酸，其中所 述蛋白質不是天然存在的。 5.如申請專利範圍第4項的多核苷酸，其中所述蛋白質具 有相比人干擾素a 2b(HuIFN- a 2b)而言增強的抗病毒 和抗增殖活性。 15 6.如申請專利範圍第5項的多核苷酸，其中所述蛋白質的 抗病毒活性爲HuIFN-a2b的至少2倍。 7. 如申請專利範圍第5項的多核苷酸，其中所述蛋白質的 抗增殖活性爲HuIFN- a 2b的至少10倍。 8. —種重組載體，其包含如申請專利範圍第1項的多核苷 20 酸。 9. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第8項的重組載 體。 10. —種表現出人干擾素樣生物學活性的非天然存在的蛋 白質，其中所述蛋白質選自其中每個蛋白質包含與SEQ 1 200900504 ID No : 2至少85%同一的氨基酸序列的蛋白質的組。 11. 如申請專利範圍第10項的蛋白質，其中所述序列與SEQ ID No : 2至少 90% 同一。 12. 如申請專利範圍第10項的蛋白質，其中所述序列與SEQ 5 ID No : 2至少 95% 同一。 13. 如申請專利範圍第10至12項中任一項的蛋白質，其中所 述蛋白質具有相比HuIFN-a2b而言增強的抗病毒和抗 增殖活性。 14. 如申請專利範圍第13項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 10 病毒活性爲HuIFN- a 2b的至少2倍。 15. 如申請專利範圍第14項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 病毒活性爲HuIFN- a 2b的至少5倍。 16. 如申請專利範圍第15項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 病毒活性爲HuIFN- a 2b的至少10倍。 15 17.如申請專利範圍第13項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 增殖活性爲HuIFN-α 2b的至少10倍。 18. 如申請專利範圍第17項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 增殖活性爲HuIFN-a2b的至少50倍。 19. 如申請專利範圍第18項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 20 增殖活性爲HuIFN- <2 2b的至少100倍。 20. 如申請專利範圍第19項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 增殖活性爲HuIFN- a 2b的至少200倍。 21. 如申請專利範圍第10項的蛋白質，其中所述蛋白質是重 組的。 2 200900504 22. 如申請專利範圍第10項的蛋白質，其中所述蛋白質的分 子量爲大約19315道爾頓。 23. 如申請專利範圍第10項的蛋白質，其可選地在N-末端包 含甲硫氨酸殘基。 5 24. —種包含與SEQ ID No : 2具有0至25個氨基酸差異的序 列的非天然存在的蛋白質，其中所述蛋白質表現出人干 擾素樣生物學活性。 25.如申請專利範圍第24項的蛋白質，其中所述蛋白質具有 相比HuIFN- a 2b而言增強的抗病毒和抗增瘦活性。 10 26.如申請專利範圍第25項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 病毒活性爲HuIFN-o;2b的至少2倍。 27. 如申請專利範圍第25項的蛋白質，其中所述蛋白質的抗 增殖活性爲HuIFN- a 2b的至少10倍。 28. 如申請專利範圍第24項的蛋白質，其中所述蛋白質是干 15 擾素類似物。 29. 如申請專利範圍第24項的蛋白質，其中所述蛋白質是重 組的。 30. —種包含如申請專利範圍第10項的蛋白質的片段的多 肽，其中所述片段表現出所述人干擾素樣生物學活性。 20 31. —種蛋白質構建體，其包含與另一部分偶聯的如申請專 利範圍第10項的蛋白質，其中所述構建體表現出所述人 干擾素樣生物學活性。 32.如申請專利範圍第31項的蛋白質構建體，其中所述蛋白 質是糖基化的。 3 200900504 33. 如申請專利範圍第31項的蛋白質構建體，其中所述部分 是多肽。 34. 如申請專利範圍第31項的蛋白質構建體，其中所述部分 是非多肽。 5 35.如申請專利範圍第34項的蛋白質構建體，其中所述部分 是聚合物分子。 36. 如申請專利範圍第35項的蛋白質構建體，其中所述聚合 物分子是線性或分枝的聚乙二醇。 37. 如申請專利範圍第31項的蛋白質構建體，其中所述部分 10 是標記分子。 38. —種組合物，其包含如申請專利範圍第10項的蛋白質和 藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。 39. —種編碼如申請專利範圍第10項的蛋白質的多核苷酸。 4 0.如申請專利範圍第10項的蛋白質作爲抗病毒劑的用途。 15 41.如申請專利範圍第10項的蛋白質作爲抗增殖劑的用途。 42. 如申請專利範圍第10項的蛋白質作爲抗癌劑的用途。 43. 如申請專利範圍第10項的蛋白質作爲免疫調節劑的用 途。 44. 一種治療癌症的方法，包括向需要治療的受試者施用治 20 療有效量的如申請專利範圍第10項的蛋白質。 45. —種治療病毒疾病的方法’包括向需要治療的受試者施 用治療有效量的如申請專利範圍第10的蛋白質。 46. 如申請專利範圍第44或45項的方法，其中所述受試者是 人類。 4 200900504 47. 如申請專利範圍第44或45項的方法，其中所述蛋白質與 藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑一起施用。 48. —種治療對干擾素療法作出回應的病狀的方法，包括向 需要治療的受試者施用治療有效1的如申請專利範圍 5 第10項的蛋白質。 49. 如申請專利範圍第44項的方法，其中所述蛋白質就寬範 圍的不同類型的癌症來說是治療上有效的，其中所述癌 症選自黑色素瘤、結腸直腸腺癌、肝細胞癌、肝癌、淋 巴瘤、前列腺癌、胃腺癌、食管癌、肺癌、子宮頸腺癌 10 和子宮頸癌。 50. —種表現出人干擾素樣生物學活性的非天然存在的蛋 白質，其中所述蛋白質具有與SEQ ID No : 2至少95%同 一的氨基酸序列，並且其中所述蛋白質具有相比HuIFN-α 2b而言增強的抗病毒和抗增殖活性。 15 51. —種編碼如申請專利範圍第50項的蛋白質的多核苷酸。 52. —種包含如申請專利範圍第50項的蛋白質的組合物。 53. —種具有SEQ ID No : 2的氨基酸序列或其片段的蛋白 質，其表現出人干擾素樣生物學活性。 54. —種編碼如申請專利範圍第53項的蛋白質的多核苷酸。 20 55. —種多核苷酸，其選自SEQ ID No : 3-17的多核苷酸。 5