PT2078082E - Proteínas recombinantes semelhantes a interferão humano - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PROTEÍNAS RECOMBINANTES SEMELHANTES A INTERFERÃO HUMANO"

Domínio da Invenção

Este pedido diz respeito a proteínas recombinantes com actividades biológicas semelhantes às de interferão humano.

Estado da Técnica

Neste pedido adoptou-se a nomenclatura de interferões (IFN) publicada na Nature (1) .

Os interferões humanos (HuIFN), que foram descobertos por Isaacs e Lindenmann em 1957 (2), são uma família bem conhecida de citoquinas segregadas por uma grande variedade de células eucarióticas quando expostas a diversos estímulos, tais como uma infecção virai ou uma exposição a mitogénio. Os IFN podem provocar diversas alterações no comportamento celular, incluindo efeitos sobre o crescimento celular e a diferenciação bem como a modulação do sistema imunológico (3-7). Os HuIFN foram classificados em seis subgrupos, nomeadamente IFN-a, IFN-β, IFN-γ. IFN-ω, IFN-ε e IFN-κ. 0 HuIFN-α (interferão derivado 2 de leucócitos) é produzido em células leucócito humanas e, em conjunto com quantidades muito mais pequenas de HuIFN-β (interferão derivado de fibroblastos), em células linfoblastóides. Os HuIFN foram também classificados pelas suas caracteristicas quimicas e biológicas, em duas categorias gerais, nomeadamente o Tipo I e o Tipo II. 0 Tipo I é constituído pelos subgrupos IFN-α e INF-β bem como pelos subgrupos recentemente descobertos IFN-ω, IFN-ε e IFN-k. 0 Tipo II tem apenas um membro: IFN-γ (interferão imunológico).

Os diferentes subgrupos de interferão têm diferentes características estruturais e biológicas. 0 HuIFN-β é uma glicoproteína ligada por N (8,9) que já foi purificada à homogeneidade e caracterizada. Ela é heterogénea no tocante à dimensão, presumivelmente devido à sua espécie hidrato de carbono. No entanto, existe apenas um gene humano IFN-β, que codifica para uma proteína com 166 aminoácidos. 0 IFN-β tem uma pequena homologia com o IFN-α, partilhando cerca de 30-40 % da identidade.

Em contraste com a unicidade do gene de IFN-β, o HuIFN-α é um subgrupo, constituído por uma família multigene essencialmente com 14 genes. Variantes menores constando de diferenças em um ou dois aminoácidos explica, os múltiplos alelos (10) . Excluindo o pseudogene IFNAP22, existem 13 genes, codificando para 13 proteínas. Cada proteína inclui 165-166 aminoácidos. A proteína codificada pelo gene IFNA 13 é idêntica à proteína IFNA 1. Deste modo, 3 existem 12 proteínas interferão alfa individuais: IFNA 1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA6, IFNA17, e IFNA21. A identidade das sequências de aminoácidos entre os subtipos de IFN-α tem em geral uma homologia de 80-85 % (11). O IFN-ω maduro tem 60 % de homologia de sequência de nucleótidos com a família das espécies IFN-α mas que tem mais 6 aminoácidos de comprimento no seu terminal C. O IFN-ω é relacionado mais distantemente com o interferão-β (partilha cerca de 30 % de homologia das sequências). O IFN-ω humano não é classificado no grupo IFN-α porque é antigenicamente distinto do IFN-α e difere na sua interacção com o receptor de IFN-α de Tipo I (12) . O IFN-ω é segregado por leucócitos infectados por vírus como principal componente de interferões de leucócitos humanos. A proteína madura de IFN-ε humano contém 185-aminoácidos, partilhando cerca de 33 % e 37 % de homologia das sequências com o IFN-oí2 e com o IFN-β, respectivamente (13,14) . A função e as propriedades biofísicas do IFN-ε não foram caracterizadas significativamente em pormenor; no entanto, ele funciona como os interferões de Tipo I. O IFN-ε também pode desempenhar um papel na função reprodutora (15) . O IFN-k, uma citoquina humana com 180 aminoácidos, é um IFN de Tipo I recentemente identificado. A sequência de codificação do IFN-κ tem uma identidade em 4 ~30 % às dos outros interferões de Tipo I que se encontram em seres humanos. Uma característica distintiva do IFN-κ é a expressão constitutiva detectável do seu transcrito em células não induzidas, em especial em queratinócitos. 0 IFN-κ pode desempenhar um papel na regulação das funções imunológicas sistémicas ou locais através do seu efeito no sistema imunológico inato (16) . No entanto, o IFN-κ exibe pouca actividade anti-viral (17). 0 interferão humano de Tipo I parece ligar-se a subunidades de dois receptores, IFNAR-1 e IFNAR-2, que estão amplamente distribuídos à superfície das células de diversos tipos. 0 envolvimento do ligando leva à indução da fosforilação das tirosina quinases TYK2 e JAK-1, que estão acopladas respectivamente aos IFNAR-1 e IFNAR-2. Uma vez fosforiladas, as proteínas STAT são libertadas do receptor e formam homodímeros bem como heterodímeros (18,19). Uma vez libertados, os dímeros de STATA associam-se a Factor Reagindo ao Interferão 9 (IRF-9), uma proteína que se liga ao ADN, formando um complexo denominado factor genético 3 estimulado por IFN (ISGF-3), que migra para dentro do núcleo. Em seguida, o complexo ISGF-3 liga-se a um elemento do ADN que existe a montante em todos os genes de IFN induzíveis. Este é o assim designado caminho de transdução de sinal "clássico".

Estão continuamente a ser revelados novos modos de acção e caminhos bioquímicos regulados pelos IFN de Tipo I. Por exemplo, a jusante de P13K no caminho de transdução 5 de sinal, o factor nuclear kapa-B (NF-kB) e o PKC-d, estão associados a efeitos anti-apoptóticos observados em neutrófilos incubados com IFN-β (20).

Mais do que 300 genes, denominados genes induzidos por interferão, reagem ao tratamento com IFN. As proteínas IFN mais estudadas são as que têm propriedades anti-virais. Por exemplo, os enzimas da família da 2,5-oligosintetase (OAS-1 e -2) catalisam a síntese de oligoadenilatos de pequenas dimensões, que se ligam à e activam a RNAse, um enzima que cliva ARN virais e celulares, inibindo deste modo a síntese proteica. A proteína quinase activada por DsRNA (PKR) fosforila o factor de iniciação da tradução eIF2a, originando também a inibição das sínteses de proteínas virais e celulares. Mais recentemente, verificou-se que também a PKR era necessária para a activação do factor de transcrição NF-κΒ, um actor central na indução de citoquinas inflamatórias, na modulação imunológica, e na apoptose. As proteínas Mx (de resistência ao mixovírus) inibem a replicação de vírus a ARN quer evitando o transporte de partículas virais dentro da célula, quer a transcrição do ARN virai. A adenosina desaminase específica para ARN (ADAR) transforma a adenosina em inosina, provocando deste modo uma hipermutação dos genomas dos vírus de ARN (21).

Os HuIFN possuem um largo espectro de actividades biológicas incluindo funções anti-vírus, anti-tumor, e de regulação imunológica. Os potenciais medicinais dos 6 interferões humanos têm sido largamente explorados, e são resumidos adiante.

No que toca às aplicações anti-tumorais, os HuIFN podem mediar efeitos anti-tumor quer directa, quer indirectamente, por regularem as respostas imunomodulatória e anti-angiogénica, ou directamente por afectarem a proliferação ou a diferenciação celular de células de tumor (22) . A terapia com interferão tem sido utilizada no tratamento de diversas leucemias (23), por exemplo, leucemia de células pilosas (24), leucemia mielóide aguda e crónica (25-27), osteossarcoma (28), carcinoma de células basais (29), glioma (30), carcinoma de células renais (31), mieloma múltiplo (32), melanoma (33), sarcoma de Kaposi (23) e doença de Hodgkin (34) . Estão bem estudadas as terapias de combinação com lFN-α e citarabina (ara-C), 5-FU, hidroxiureia e IL-2, denotando resultados significativamente melhores resultados do que a utilizando HuIFN-α por si só (3) . O tratamento sinergistico de cancro avançado com uma combinação de HuIFN e temozolomido também foi descrito (35).

No que toca à aplicações anti-virus, os HuIFN têm sido utilizados medicinalmente para terapia anti-viral, por exemplo no tratamento da SIDA (36), da hepatite virai incluindo hepatite B crónica, hepatite C (37,38), na infecção com virus papiloma (39), na infecção com vírus herpes (40), na encefalite virai (41), e na profilaxia da rinite e nas infecções respiratórias (40). 7

Também se têm utilizado medicinalmente os HuIFN em terapia anti-bacteriana (42) , por exemplo, têm sido utilizados aerossóis contendo HuIFN-γ (43) e HuIFN-α em doentes com tuberculose pulmonar resistente a múltiplos fármacos (44) . Tem sido utilizado o HuIFN-γ no tratamento de tuberculose cerebral resistente a múltiplos fármacos (45) .

Os HuIFN também têm sido utilizados medicinalmente em terapia de imunomodulação, por exemplo para evitar a rejeição do enxerto pelo hospedeiro, ou para obviar à progressão de doenças auto-imunes, tais como esclerose múltipla (46,47) e sindrome de Sjogren (48). 0 IFN-β está aprovado pela FDA nos Estados Unidos para o tratamento da esclerose múltipla. Recentemente foi descrito que doentes com esclerose múltipla têm uma produção diminuída de interferões de Tipo I e de interleuquina 2 (49) . Além disto, a terapia de imunomodulação com HuIFN-a parece ser uma terapia eficaz em doentes com leucemia mielóide crónica (CML) apresentando recaídas após transplantação de medula óssea (50).

No que toca a acção adjuvante de vacinas, têm sido utilizados HuIFN medicinalmente como adjuvantes no tratamento do melanoma (51) e também podem utilizar-se como adjuvantes ou coadjuvantes para aumentar ou para simular a reacção imunológica nos casos de vacinação profiláctica ou terapêutica contra muitas outras doenças (52). - 8 - 0 HuIFN-a2a foi o primeiro inibidor de angiogénese utilizado em ensaios clínicos e era eficaz em crianças no tratamento de hemangiomas com riscos de morte (53,54). Outra indicação medicinal é o tumor ósseo de células gigantes. Kaban et al. reportaram a regressão espectacular de um tumor grande, com crescimento rápido, recorrente, de células gigantes na mandíbula (55).

Embora os HuIFN tenham muitas aplicações medicinais importantes, eles exibem efeitos colaterais significativos e outras limitações. A maior parte das citoquinas, incluindo os HuIFN, têm vidas médias relativamente curtas na circulação uma vez que são produzidos in vivo para actuar localmente e transitoriamente. Uma vez que são tipicamente administrados em terapêuticas sistémicas, é necessário administrar os HuIFN frequentemente e em doses relativamente grandes. As administrações parentéricas frequentes são inconvenientes e dolorosas. Além disto, os efeitos colaterais de toxicidade associados à administração de HuIFN são amiúde tão severos que algumas pessoas não conseguem tolerar o tratamento. Estes efeitos colaterais estão provavelmente associados à administração sistémica de dosagens elevadas. Além disto, verificou-se em estudos clínicos que alguns doentes produzem anticorpos contra os rHuIFN, que neutralizam a sua actividade biológica (56). 9

Claramente, o desenvolvimento de novas proteínas interferão com mais potência é urgentemente necessário para muitas aplicações, por exemplo, terapias contra o cancro, bem como anti-virais, imunoterapias, anti-parasíticas, anti-bacterianas, ou em qualquer situação ou estado medicinal em que uma maior actividade de interferão e/ou menores efeitos colaterais sejam necessários. Globalmente, é extremamente provável que os HuIFN desempenhem um papel primordial na próxima geração de novas terapias anti-tumorais e anti-virais (10).

Sabe-se bem na técnica que o meio mais eficiente de melhorar as propriedades farmacêuticas dos fármacos citoquina é através de mutações da própria proteína citoquina. Ao longo do tempo, têm-se desenvolvido diversas estratégias e técnicas para mutar péptidos interferão. Em geral, estas estratégias são correntemente utilizadas para criar mutantes de HuIFN-a. A primeira estratégia é fabricar híbridos de IFN. Alguns investigadores utilizaram vantajosamente a presença de locais ocorrendo naturalmente de clivagem por endonuclease de restrição (RE) nas sequências de codificação para IFN, para colocar em conjunto diversos fragmentos de codificação homólogos (57,58). A produção de um número determinado de IFN híbridos foi alvo de uma revisão por Horisberger e Di Marco (11); este artigo proporciona uma visão geral do processo de construção destas moléculas. São descritos exemplos específicos de 10 métodos de construção de interferões híbridos. Alguns investigadores utilizaram as vantagens da amplificação por PCR para construir IFN-α mutantes e deste modo criar fragmentos de ácido nucleico especificamente pretendidos, e depois ganhar o potencial de montar novas peças de IFN diferentes (59) . A Patente U.S. N2 . 6.685.933 (60) também descreve técnicas de amplificação por PCR para fabricar IFN híbridos. Os interferões híbridos podem ser criados adentro de um subgrupo de interferão, tal como se descreve na Patente U.S. N2. 5.137.720 (61) e na Patente U.S. N2. 6.685.933 (60) ou entre pelo menos dois grupos diferentes da classificação dos interferões, tal como se descreve na Patente U.S. N2 . 6.174.996 (62) e na Patente U.S. N2. 6.685.933 (60). Além disto, os genes parentes de um híbrido podem provir de uma espécie (maioritariamente de humanos), por exemplo, híbridos de HuIFN-α e HuIFN-ω, ou de mais de uma espécie animal, por exemplo híbridos de interferão-a humano e murino (63).

Uma segunda estratégia para construir mutantes de interferão é utilizar mutagénese pontual dirigida a um local, através da introdução de alterações em um ou mais nucleótidos nas moléculas de ADN para IFN (64) . Recentemente, são utilizados a mutação sistemática e métodos computacionais como guias para a mutagénese proteica (65).

Uma terceira estratégia para a construção de HuIFN do Tipo I é baralhar fragmentos de gene de IFN que 11 sejam criados por digestão com RE digestão, amplificação por PCR, síntese química ou digestão com ADNase, seguidos por PCR para montar aleatoriamente os fragmentos em conjunto e depois amplificar o resultado. Os produtos de PCR obtidos são de facto uma reserva de fragmentos de gene de interferão alfa que se pode utilizar para construir uma biblioteca de ADN, a partir da qual se podem isolar clones de ADN com fenótipos pretendidos (66) . Por exemplo, Chang et al. descreveram um método para construir e para despistar uma biblioteca de HuIFN baralhados para identificar derivados de HuIFN com actividades anti-virais e antiproliferativas aumentadas, em células de murganho (67) . 0 Interferão Humano alfacon-1 (interferão de consenso) é um HuIFN-α recombinante que não ocorre naturalmente, com 166 aminoácidos. Ele foi gerado avaliando os aminoácidos mais fortemente conservados para cada região, com base nas sequências conhecidas de HuIFN-a clonados. Ele apresenta 89 % de homologia de sequência a nível dos aminoácidos, com o HuIFN-a2b, e uma actividade anti-viral específica de cerca de 109 IU/mg. 0 Interferão Humano alfacon-1 foi aprovado para tratamento de infecção crónica com VHC em doentes com 18 anos de idade ou mais, com a doença hepática compensada (68).

No W002/095.067 descreve-se uma variante de interferão-14 com uma actividade anti-viral pelo menos 2 vezes maior do que a do HuIFN-a2b, e com uma actividade 12 anti-proliferativa pelo menos 5 vezes maior que a do HuIFN-cx2b.

Embora algumas proteínas interferão recombinantes já sejam parte do estado da técnica, existe uma necessidade de novas proteínas semelhantes a interferão e composições de proteínas com maiores actividades biológicas.

Descrição Resumida da Invenção A invenção presente proporciona um polinucleótido isolado codificando para uma proteína com actividades biológicas do tipos das do interferão humano, em que o polinucleótido referido seja seleccionado de entre o conjunto constituído por polinucleótidos que incluam uma sequência de nucleótidos que seja pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID No: 1, e em que a proteína possua uma actividade anti-proliferativa pelo menos 10 vezes maior do que a do interferão alfa humano 2b (HuIFN-a2b). Noutras concretizações, a sequência de nucleótidos é pelo menos 98 % idêntica à SEQ ID No: 1.

Numa concretização, a invenção inclui uma proteína que exibe actividades biológicas semelhantes às do interferão humano, em que a proteína referida seja seleccionada de entre o conjunto constituído por proteínas que incluam uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID No: 2, em que a proteína tenha uma actividade anti-proliferativa pelo menos 10 vezes maior do 13 que o interferão alfa humano 2b (HuIFN-a2b) . Preferivelmente a proteína tem uma maior actividade anti-viral e anti-proliferativa, quando comparada com a do interferão alfa humano 2b (HuIFN-a2b). Por exemplo, a proteína pode ter uma actividade anti-viral pelo menos 2 vezes maior que a do HuIFN-a2b e uma actividade anti-prolif erativa pelo menos 10 vezes maior do que a do HuIFN-a2b. Em concretizações específicas a sequência de aminoácidos da proteína é pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID No: 2 A invenção também inclui fragmentos polipeptídicos que exibem as referidas actividades semelhantes às do interferão alfa humano. A invenção inclui além disto construções proteicas e outras composições que exibem as referidas actividades biológicas semelhantes às do interferão, tais como conjugados que incluam a proteína e outra espécie, tal como um polímero inorgânico. A invenção inclui ainda métodos e utilizações da proteína e das composições com objectivos terapêuticos tais como os de agentes anti-virais ou anti cancro.

Breve Descrição das Figuras A Fig. 1 representa uma sequência completa de ADN codificando para a nova proteína da invenção, que se refere neste documento como Novaferon™ (SEQ ID No:l) (A) . A Fig. 1 também mostra a sequência de aminoácidos prevista para 14

Novaferon (SEQ ID No:2) (B) , e o alinhamento da sequência de aminoácidos de Novaferon com a sequência de ADN de Novaferon (C) . 0 primeiro aminoácido, cisteina, na proteína Novaferon madura, é designado como resíduo 1. A Fig. 2 mostra o alinhamento da sequência de nucleótidos do gene de Novaferon com o gene de HuIFN-al4 (número no Genebank: NM_002172)(A) e o alinhamento da sequência de aminoácidos da proteína Novaferon com a da proteína HuIFN-al4 (traduzida, número Genebank: NM_002172) (B). 0 primeiro aminoácido, cisteina, na proteína Novaferon madura, é designado como resíduo 1. A Novaferon partilha cerca de 93 % da identidade de sequência (462/498) com a de HuIFN-al4 a nível dos nucleótidos, e cerca de 87 % de identidade de sequência (144/166) ao nível dos aminoácidos. Os nucleótidos divergentes estão indicados por um espaço em branco na linha média. A Fig. 3 mostra o alinhamento da sequência de nucleótidos do gene de Novaferon com o gene de HuIFN-a2b (número no Genebank: NM_000605)(A) e o alinhamento da sequência de aminoácidos da proteína Novaferon com a da proteína HuIFN-a2b (traduzida, número Genebank: NM_000605) (B) . 0 primeiro aminoácido, cisteina, na proteína 15

Novaferon madura, é designado como resíduo 1. A Novaferon partilha cerca de 89 % da identidade de sequência (445/498) com a de HuIFN-a2b a nível dos nucleótidos, e cerca de 81 % de identidade de sequência (135/166) ao nível dos aminoácidos. Os nucleótidos divergentes estão indicados por um espaço em branco na linha média. A Fig. 4 é um gráfico mostrando a inibição anti-proliferativa in vitro de células Daudi por Novaferon, em comparação com HulFN-a2b. A Fig. 5 é um gráfico mostrando os efeitos anti-tumor in vivo de Novaferon e de HuIFN-a2b em murganhos nus com xenotransplantes de cancro da próstata humano PC-3. A Fig. 6 é um gráfico mostrando os efeitos anti-tumor in vivo de Novaferon e de HuIFN-a2b em murganhos nus com xenotransplantes de cancro hepático humano Hep G2. A Fig. 7 é um gráfico mostrando os efeitos anti-tumor in vivo de Novaferon e de HuIFN-a2b em murganhos nus com xenotransplantes de melanoma humano A-375. 16 A Fig. 8 é um gráfico mostrando os efeitos anti-tumor in vivo de Novaferon e de HuIFN-a2b em murganhos nus com xenotransplantes de cancro do cólon humano LS 180. A Fig. 9 é um gráfico mostrando os efeitos anti-tumor in vivo de Novaferon e de HuIFN-a2b em murganhos nus com xenotransplantes de leucemia humana HL 60 (S) .

Descrição Pormenorizada

Ao longo de toda esta especificação, incluem-se pormenores específicos para proporcionar uma compreensão mais complete da invenção. No entanto, pode praticar-se a invenção sem estes pormenores específicos. Noutros casos, não se mostraram elementos bem conhecidos nem se descreveram em pormenor, para evitar obscurecer não necessariamente a invenção. Deste modo, a especificação e os desenhos devem ser considerados num sentido ilustrativo, e não restritivo.

Definição de Termos

Antes de descrever a invenção presente em pormenor, deve entender-se que esta invenção não se limita às moléculas de proteína específicas, à metodologia, aos protocolos, às linhas de células, aos vectores, e aos reagentes descritos, uma vez que eles podem variar. Deve 17 entender-se também que a terminologia utilizada neste documento se destina ao propósito de ilustrar apenas algumas concretizações especificas, e não pretende limitar o âmbito da invenção presente que será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Para se fazer compreender melhor a invenção descrita neste documento, empregam-se os seguintes termos, que se pretende sejam definidos tal como se indica adiante. Deve entender-se que a terminologia utilizada neste documento tem o objective de descrever apenas concretizações especificas, e não pretende limitar o âmbito da invenção presente que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. O termo "interferão" refere-se a uma família de proteínas segregadas produzidas por uma série de células eucarióticas aquando da exposição a diversos estímulos ambientais, incluindo infecções por vírus ou exposição a um mitogénio. Para além de terem propriedades anti-virais, os interferões têm demonstrado afectar uma grande variedade de funções celulares. Todas as unidades de interferão são exprimidas neste documento por referência aos padrões internacionais da OMS, 94/786 (rHuIFN-a de consenso) e 95/650 (rHuIFN-a2a). O termo "semelhante a interferão" refere-se a aspectos funcionais e/ou estruturais exibidos por ou semelhantes aos de interferões conhecidos ou aos seus 18 análogos. Por exemplo, "actividades biológicas semelhantes às do interferão" inclui actividades anti-virais e anti-proliferativas. Outros exemplos de actividadews biológicas semelhantes às do interferão são descritos neste documento e seriam entendidas pelos indivíduos com conhecimentos da técnica. 0 termo plural "actividades" inclui o termo singular "actividade"; isto é, a invenção inclui proteínas recombinantes ou outras construções ou composições proteicas que exibam pelo menos uma actividade semelhante à do interferão. 0 termo "interferão de consenso" refere-se a um tipo de interferão sintético com uma sequência de aminoácidos que é uma média aproximada das sequências de todos os subtipos de interferão alfa humano. Foi descrito que o interferão de consenso tem uma actividade anti-viral, anti-proliferação e de activação de células NK maior (cerca de 5 vezes) do que qualquer subtipo de IFN-α natural humano. 0 termo "isolado/a" tal como se utiliza neste documento refere-se a moléculas, tais como ADN ou ARN, que tenham sido removidas do seu ambiente nativo. Por exemplo, as moléculas de ADN recombinante contidas num vector são consideradas como isoladas para os objectivos da invenção presente. Incluem-se nos exemplos adicionais de moléculas de ADN isoladas as moléculas de ADN recombinante mantidas em células heterólogas de hospedeiros ou as purificadas (em parte ou substancialmente) em solução. 0 ADN "Isolado" 19 também inclui moléculas de ADN recuperadas de uma biblioteca que possa conter fragmentos de ADN natural ou artificial com interesse, bem como ácidos nucleicos sintetizados quimicamente. Os ácidos nucleicos isolados podem portanto ser produzidos de uma forma recombinante. 0 termo "sequência de nucleótidos" refere-se a uma sequência de nucleótidos que inclua um oligonucleótido, polinucleótido ou molécula de ácido nucleico, e aos seus fragmentos ou porções. No caso de uma molécula de ADN, a sequência pode incluir uma série de desoxirribonucleótidos e no caso de uma molécula de ARN, a sequência pode incluir uma série correspondente de ribonucleótidos. 0 oligonucleótido, polinucleótido ou molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia singela ou de dupla cadeia e a sequência de nucleótidos pode representar a cadeia de sentido directo ou a de sentido reverso.

Os termos "fragmento de oligonucleótido" ou um "fragmento de polinucleótido", "porção" ou "segmento" ou "sonda" ou "iniciador" são utilizados a titulo intercambiável e referem uma sequência de resíduos de nucleótido que tenha pelo menos cerca de 5 nucleótidos de comprimento. Preferivelmente os fragmentos podem ser utilizados para se hibridizarem a uma sequência de nucleótidos alvo. Um iniciador serve como ponto de início para uma polimerização de nucleótidos catalisada quer por ADN polimerase, por ARN polimerase ou por transcriptase reversa. Um fragmento ou segmento pode identificar de forma 20 única cada sequência de polinucleótido da invenção presente. Preferivelmente o fragmento inclui uma sequência substancialmente semelhante à SEQ ID NO: 1.

Os termos "proteína" ou "péptido" ou "oligopéptido" ou "polipéptido" referem-se a moléculas que ocorram na natureza ou sintéticas que incluam uma sequência de aminoácidos. O termo "quadro de leitura aberto" ou ORF, significa uma série de tripletes de nucleótidos que codifica para aminoácidos, sem nenhum codão de terminação, e denota em geral uma sequência que pode ser traduzida por uma proteína. O termo "sequência de codificação para uma proteína madura" refere-se a uma sequência que codifica uma proteína ou um péptido, sem uma sequência de sinalização ou líder. A proteína pode ter sido produzida por processamento na célula que remove qualquer sequência líder/de sinalização. A proteína pode ser produzida por via sintética ou utilizando um polinucleótido que apenas codifica para a sequência de codificação da proteína madura.

Os termos "purificado/a" ou "substancialmente purificado/a", tal como utilizados neste documento, significam que a proteína indicada está presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas, 21 por exemplo, outras proteínas, polipéptidos e outras semelhantes. A proteína é purificada de modo a que constitua pelo menos 95 % em peso das macromoléculas biológicas indicadas presentes (podendo estar presentes água, tampões, e outras moléculas pequenas, em particular moléculas com massa molecular inferior a 1.000 Dalton). O termo "veículo ou vector de expressão recombinante" refere-se a um plasmídeo ou fago ou vírus ou vector, para expressar uma proteína a partir de uma sequência de ADN (ARN). Um veículo de expressão pode incluir uma unidade de transcrição que inclua uma montagem de (1) um elemento ou elementos genéticos com um papel regulador na expressão de genes, por exemplo, promotores ou incrementadores, (2) uma sequência estrutural ou de codificação que seja transcrita no mARN e traduzida em proteína, e (3) sequências apropriadas para iniciar e terminar a transcrição. As unidades estruturais que se destinam a ser utilizadas em sistemas de expressão de levedura ou eucarióticos incluem preferivelmente uma sequência líder que torna possível a secreção extracelular de uma proteína traduzida por uma célula hospedeira. Em alternativa, quando uma proteína recombinante for expressa sem uma sequência líder ou de transporte, pode incluir um resíduo terminal do aminoácido metionina. Este resíduo pode ser subsequentemente clivado, ou não, para a proteína recombinante expressa proporcionar um produto final. 22 0 termo "semelhança substancial" refere-se a um ácido nucleico ou a um seu fragmento que tenham um grau elevado de identidade de sequência com outro ácido nucleico quando estiverem optimamente alinhados com outro ácido nucleico ou com a sua cadeia complementar. A identidade ou homologia entre sequências pode ser determinada utilizando programas de análise de sequências, por exemplo, o BLASTN. Considera-se que um primeiro ácido nucleico é substancialmente semelhante a um segundo ácido nucleico quando eles demonstram uma identidade de sequências de pelo menos cerca de 85 - 95 % ou mais, quando estão optimamente alinhados. Por exemplo, para determinar a identidade ou homologia de sequências entre dois ácidos nucleicos diferentes, utiliza-se o programa BLASTN "BLAST 2 sequencies". Este programa encontra-se disponível para utilização pelo público no Nacional Centre for Biotecnologia Informativo (NCBI) recorrendo à Internet (http://http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b!2seg/wblast2.eg i_) (69) . A título de um exemplo não limitativo, pode fazer-se estas comparações utilizando o programa com os seus parâmetros ajustados por defeito (expecta=10, filtre=Renault, open gap =5, extensivo gap=2 penalties, gap x dropoff=50) . De um modo semelhante, uma primeira proteína ou polipéptido é considerada como sendo substancialmente semelhante a uma segunda proteína ou polipéptido caso mostre identidade de sequências de pelo menos 85c %-95 % ou maior, quando optimamente alinhadas e comparadas utilizando o programa BLAST (blastp) com os parâmetros de de3feito. 23 A título de ilustração suplementar, um polinucleótido que tenha uma sequência de nucleótidos com pelo menos, por exemplo, 95 % de "identidade" com uma sequência de nucleótidos de referência codificando para uma proteína, significa que a sequência de nucleótidos do polinucleótido é idêntica à sequência de referência excepto que a sequência do polinucleótido pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência de nucleótido de referência que codifica para a proteína. Por outras palavras, para se obter um polinucleótido com uma sequência de nucleótidos com pelo menos 95 % de identidade com uma sequência de nucleótidos de referência, até 5 % dos nucleótidos na sequência de referência podem ser eliminados ou substituídos por outro nucleótido, ou podem inserir-se diversos nucleótidos até 5 % do total de nucleótidos na sequência de referência, na sequência de referência.

Os termos "complementar" ou "complementaridade", tal como se utilizam neste documento, referem-se á ligação natural dos polinucleótidos em condições favoráveis de sais e de temperatura, por emparelhamento de bases. Por exemplo, a sequência "A-G-T" liga-se à sequência complementar "T-C-A". A complementaridade entre duas moléculas de cadeia singela pode ser "parcial", na qual apenas alguns dos ácidos nucleicos se ligam, ou pode ser completa quando existir complementaridade total entre as moléculas de cadeia singela. O grau de complementaridade entre cadeias de ácido nucleico tem efeitos significativos sobre a eficiência e a força da hibridização entre cadeias de ácido nucleico. Isto tem uma importância especifica nas reacções de amplificação, que dependem da ligação entre cadeias de ácidos nucleicos. 0 termo "transformação" significa introduzir-se ADN nu organismo de modo a que este ADN seja replicável, quer a titulo de um elemento extracromossómico, quer por integração num cromossoma. 0 termo "transfecção" refere-se à entrada de um vector de expressão para dentro de uma célula hospedeira adequada, quer sejam ou não de facto expressas quaisquer sequências de codificação.

Os termos "tratamento", "tratando" e os seus equivalentes gramaticais, são utilizados com a máxima latitude no seu sentido e incluem tratamento terapêutico, prevenção, profilaxia e melhoria de determinados sintomas ou estados indesejáveis.

Os termos "actividade biológica" e "actividades biológicas", tal como utilizados neste documento, referem-se a funções estruturais, reguladoras, bioquímicas ou outras em sistemas vivos, por exemplo semelhantes ou idênticas às de moléculas que ocorram naturalmente ou não. 0 termo "anti-proliferação" e "anti-proliferativo", tal como utilizado neste documento, refere-se a tornar mais lento e/ou evitar o crescimento e a divisão de células, resultando na diminuição do número total de células e/ou na diminuição da percentagem das 25 células alvo em qualquer uma ou em todas as fases do ciclo. Podem especificar-se mais as células como sendo paradas numa determinada fase do ciclo celular: G1 (Gap 1), fase S (síntese de DNA) , G2 (Gap 2) ou fase M (mitose) . 0 termo "actividade anti-proliferativa", tal como utilizado neste documento, refere-se à actividade de uma proteína, construção proteica, ou composição, que iniba a proliferação, em particular proliferativa de células neoplásicas, por exemplo, células de cancro, quer in vitro, quer in vivo. 0 termo "anti-tumor" ou "anti-cancro", tal como utilizado neste documento, refere-se a actuar contra ou a evitar a formação de tumores malignos. A "actividade anti-tumor" ou a "actividade contra o cancro", quando utilizadas neste documento, referem-se à actividade de uma proteína, de uma construção proteica, ou de uma composição, que iniba a proliferação celular, e em particular a proliferação de células neoplásicas, por exemplo, de células cancerosas, quer in vitro, quer in vivo, 0 termo "IC50", ou "concentração para metade da inibição máxima", representa a concentração de um inibidor, tal como uma proteína, que é necessária para inibir a 50 % o crescimento celular in vitro.

Os termos "anti-viral" e "anti-vírus", tal como utilizados neste documento, referem-se a tornar mais lenta e/ou evitar a infecção das células por vírus ou a 26 interferir com a replicação de vírus em células in vitro e/ou in vivo, resultando numa propagação mais lenta do vírus ou na sua paragem, ou na diminuição do número total de partículas do vírus. A "actividade anti-viral", tal como utilizada neste documento, significa a actividade de uma proteína, uma construção proteica, ou composição que iniba infecções virais ou interfira com a replicação virai, quer in vitro e/ou in vivo.

Proteína Novaferon A invenção presente diz respeito à preparação e â caracterização de uma nova proteína humana semelhante a interferão, referida neste documento com "Novaferon"™. Tal como se descreve adiante em pormenor, a proteína Novaferon exibe actividades biológicas, anti-viral e anti-proliferativa, em comparação com as de HuIFN-a2b de ocorrência natural, tal como determinadas em testes padrão in vitro. Em especial, a proteína Novaferon denota um aumento de 12,5 vezes na actividade anti-viral quando testada num sistema Wish-VSV, e uma melhoria de cerca de 400 vezes na inibição anti-proliferativa do crescimento de células de Daudi, em comparação o HuIFN-a2b nos mesmos sistemas de teste.

Numa concretização, a proteína Novaferon é codificada por um polinucleótido constituído por 498 nucleótidos tal como ilustrado na SEQ ID No: 1 e na Figura 1 (A) . A proteína Novaferon madura é constituída por 166 27 aminoácidos tal como se ilustra na SEQ ID No: 2 e na Figura 1(B). As sequências de polinucleótido e de aminoácidos e as suas variantes que estão incluídas na invenção são descritas adiante em mais pormenor.

Para os objectivos de comparação, a homologia da Novaferon com os HuIFN com ocorrência natural foi explorada pêlos inventores. Pesquisas BLAST revelaram que a Novaferon tem a sua máxima homologia com HuIFN-oí14, tanto ao nível de nucleótidos como de aminoácidos. Tal como se ilustra na Figura 2, a sequência do polinucleótido (SEQ ID No: 1) codificando para Novaferon tem uma homologia de cerca de 93 % (462/498) com HuIFN-al4 e a sequência de aminoácidos tem uma homologia de cerca de 87 % (144/166) com a de HuIFN-al4. Em comparação com o HuIFN-a2b, produto de interferão humano mais utilizado, a homologia é de cerca de 89 % ao nível dos nucleótidos (445/498) e de cerca de 81 o o (135/166) ao nível dos aminoácidos, como se ilustra na

Figura 3.

Em relação ao referido IFN alfacon-1 (interferão de consenso) , a Novaferon tem cerca de 91 % de identidade de sequência a nível de nucleótidos (453/498) e cerca de 84 % de identidade de sequência ao nível de aminoácidos (140/166).

Tal como se descreve em pormenor na secção experimental adiante, a sequência do polinucleótido (SEQ ID No: 1) foi seleccionada de uma biblioteca de ADN baralhado 28 de interferão humano de Tipo I. Em suma, a proteína Novaferon foi produzida por transfecção de células hospedeiras com um vector recombinante contendo a sequência completa do polinucleótido da SEQ ID No: 1. A proteína Novaferon contida no sobrenadante da linha de células foi purificada e demonstrou-se que exibia actividades semelhantes às do interferão humano, tais como as funções anti-viral e anti-proliferativa.

Polinucleótido e variantes A nova sequência de polinucleótido/molécula de ácido nucleico da invenção presente é constituída por 498 nucleótidos tal como se ilustra na FIG. 1 (SEQ ID No: 1) . Utilizando a informação proporcionada neste documento, tal como a sequência de nucleótidos, pode obter-se uma sequência da molécula de ácido nucleico da invenção presente codificando para a proteína Novaferon (SEQ ID No: 2) por expressão recombinante, síntese química ou utilizando outros processos padrão em biologia molecular, tal como os de mutagénese de ADN. A invenção, para além da molécula de ácido nucleico isolada (SEQ ID No: 1), também inclui moléculas de ADN com sequências que são diferentes da sequência de ADN descrita na SEQ ID No: 1 mas, devido à degenerescência do código genético, ainda codificam para a mesma, ou substancialmente para a mesma sequência de aminoácidos da proteína Novaferon (SEQ ID No: 2). Os códigos genéticos e 29 as preferências de codões específicas para as espécies são bem conhecidas na técnica. Deste modo, seria rotina para um indivíduo com conhecimentos da técnica gerar as variantes degeneradas das sequências de ADN diferentes da sequência do ADN na SEQ ID No: 1, por exemplo, para optimizar a expressão de um codão para um hospedeiro específico (por exemplo, mudar os codões no mARN humano para os preferidos por um hospedeiro bacteriano tal como E. cóli). A invenção proporciona também uma molécula de ácido nucleico isolado com a sequência de nucleótidos ilustrada na FIG 1 (SEQ ID No: 1), ou uma molécula de ácido nucleico com uma sequência complementar da sequência do ácido nucleico com a SEQ ID No: 1. A invenção presente também proporciona informação acerca de, e relaciona-se com vectores recombinantes, nos quais se incluem as moléculas de ácido nucleico isolado da invenção presente, e com células hospedeiras contendo os vectores recombinantes, bem como com os métodos de produzir esses vectores e de criar células hospedeiras que expressem a proteína Novaferon, e a utilização das células hospedeiras para a produção de Novaferon por técnicas recombinantes.

Com base na sequência de ácido nucleico da invenção presente (SEQ ID No:l, Fig. 1(A), a invenção inclui moléculas de ácido nucleico que são substancialmente semelhantes a ele, tais como ácidos nucleicos com pelo menos 95 % ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID No: 1, quando optimamente alinhadas. Por exemplo, num 30 aspecto, os ácidos nucleicos com cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade de sequência com a sequência ilustrada na SEQ ID No: 1 estão dentro do âmbito da invenção.

Essas moléculas de ácido nucleico poderiam ser utilizadas, por exemplo, como sondas para a detecção de mARN em células já transfectadas com um vector contendo a sequência de nucleótidos da invenção presente para a produção de Novaferon. Por outras palavras, estas sequências de ácido nucleico idênticas em pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % à sequência constante da SEQ ID No: I poderiam ser utilizadas para determinar a expressão dos genes heterólogos numa célula hospedeira.

Para além da sequência de ácido nucleico descrita na SEQ ID No: 1 codificando para a proteína Novaferon, a invenção presente também inclui mas não se limita a sequências de ácido nucleico que codificam para a sequência de aminoácidos da proteína Novaferon completa em conjunto com aminoácidos/péptido(s)/polipéptido (s) adicionais, por exemplo uma sequência líder de secreção adicionada.

Também se incluem na invenção as sequências de ácidos nucleicos que tenham a sequência de ácido nucleico descrita na SEQ ID No: 1, bem como sequências não codificantes adicionais incluindo, por exemplo mas sem que se limitem a, intrões e sequências 5' e 3' não codificantes, tais como as sequências transcritas, não 31 traduzidas, que desempenham um papel na transcrição, no processamento de mARN (isto é, emendas e sinais d epoliadenilação, ligação ao ribossoma e estabilidade do mARN), e sequências codificantes adicionais que codifiquem para aminoácidos adicionais, com ou sem funcionalidades. A invenção presente também diz respeito às variantes das moléculas de ácido nucleico da invenção presente (SEQ ID No: 1), que codificam para porções, análogos ou derivados da proteína Novaferon. Podem obter-se variantes através do despiste numa biblioteca de baralhar de interferão ou utilizando técnicas de mutagénese ou/e outras técnicas conhecidas e descritas.

Tal como se explica acima, estas variantes podem incluir as produzidas por inserções, eliminações ou substituições de nucleótidos. As inserções, eliminações ou substituições podem envolver um ou mais nucleótidos. Estas mutações podem ocorrer nas posições terminais 5' ou 3' terminal da sequência de referência do nucleótido ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, distribuídas quer individualmente entre os nucleótidos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos na sequência de referência. As alterações podem originar inserções, eliminações ou substituições conservadoras ou não conservadoras de inserções, eliminações ou substituições de aminoácidos. São especialmente preferidas entre estas as inserções, eliminações e/ou substituições silenciosas, que não alteram as propriedades e as actividades da proteína 32

Novaferon nem de porçoes dela. Sao também especialmente preferidas neste aspecto as substituições conservadoras.

Devido à degenerescência do código genético, um indivíduo com conhecimentos médios da técnica reconhecerá imediatamente que um grande número das moléculas de ácido nucleico que tenham uma sequência idêntica em pelo menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % à sequência de nucleótidos do ácido nucleico representada na FIG. 1 (SEQ ID No: 1) , codificarão para uma proteína que terá actividade semelhante ou idêntica à proteína Novaferon. De facto, uma vez que as variantes degeneradas codificam todas para a mesma proteína, isto será claro para o especialista mesmo sem ter que levar a cabo um ensaio de comparação. Será além disto reconhecido também na técnica que, para essas moléculas de ácido nucleico que não sejam variantes degeneradas, um número razoável delas também codificará para uma proteína com actividades biológicas semelhantes às do interferão. Isto é porque o especialista da técnica está completamente consciente das substituições de aminoácidos que têm quer menos probabilidade ou não têm probabilidade de afectar significativamente a função da proteína (por exemplo, substituir um aminoácido alifático por um segundo aminoácido alifático), tal como se descreve melhor adiante. Por exemplo, pode encontrar-se um guia acerca de como fazer substituições de aminoácidos fenotipicamente silenciosas em Bowie et al. (70), em que os autores indicam que muitas proteínas são tolerantes para substituições de aminoácidos. 33

Construções e variantes de proteínas e polipéptidos A invenção presente inclui a proteína Novaferon com a SEQ ID:2 e proteínas ou polipéptidos variantes que são substancialmente semelhantes a ela, tais como proteínas com pelo menos cerca de 90 % ou mais de identidade de aminoácidos com a SEQ ID No: 2. Por exemplo, as proteínas com pelo menos cerca de 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de indentidade de sequência em relação à sequência de aminoácidos ilustrada na SEQ ID No: 2 encontram-se no âmbito da invenção. Além disto, a proteína Novaferon da invenção pode ser estruturalmente modificada fundindo-a com outras proteínas ou fragmentos de proteína ou outras moléculas com o objectivo de incrementar as suas funções e propriedades. Incluem-se nos exemplos mas não se limitam a fundi-la com outras proteínas/fragmentos proteicos para aumentar a sua expressão ou para estabilizar mais a proteína Novaferon.

Numa concretização, pode marcar-se a sequência de ácido nucleico codificando para Novaferon e/ou as proteínas Novaferon da invenção com um marcador diferente do andaime. "Marcada" neste documento significa que um composto da sequência de ácido nucleico (SEQ ID No: 1) ou da proteína Novaferon (SEQ ID No: 2) foi ligado a pelo menos um elemento, isótopo ou outros produtos químicos (marcadores) para permitir a detecção do composto. Em geral, os marcadores pertencem a uma de três classes: a) marcadores 34 isotópicos, que podem ser radioactivos ou isótopos pesados; b) marcadores imunológicos, que podem ser anticorpos ou antigénio; e c) agentes corantes ou fluorescentes. Podem incorporar-se os marcadores no composto em qualquer posição.

Uma vez produzida, a proteína Novaferon também pode ser modificada covalentemente. Um tipo de modificação covalente inclui tratar-se a proteína Novaferon com um agente derivatizante orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou com os resíduos do terminal N ou do terminal C da proteína Novaferon. É útil uma derivatização com agentes bifuncionais, por exemplo, para estabelecer ligações cruzadas entre a proteína Novaferon e uma matriz de suporte insolúvel em água ou uma superfície, para utilização na purificação de anticorpos anti-Novaferon ou em ensaios de despiste. Incluem-se nos agentes de estabelecimento de ligações cruzadas habitualmente utlizados o 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, o glutaraldeído, os ésteres de N-hidroxissuccinimida (por exemplo, ésteres com o ácido 4-azidosalicílico), imido ésteres homobifuncionais incluindo ésteres dissuccinimidilo tais como 3,3'- ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidas bifuncionais tais como bis-N-maleimido-1,8-octano e agentes tais como 3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato de metilo.

Incluem-se em outras modificações da proteína Novaferon: desamidação de resíduos glutaminilo e 35 asparaginilo, respectivamente aos correspondentes resíduos glutamilo e aspartilo; hidroxilação da prolina e da lisina; fosforilação dos grupos hidroxilo de resíduos serilo ou treonilo; metilação dos grupos amino das cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (71); aceptilação da amina do terminal N; e amidação do grupo carboxilo do terminal C.

Outro tipo de modificação covalente da proteína Novaferon da invenção presente inclui alterar-se o perfil de glicosilação nativa da proteína. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por (1) eliminar e/ou adicionar uma ou mais espécies hidrato de carbono existentes na sequência nativa da proteína Novaferon, ou (2) eliminar e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não existem na sequência nativa da proteína Novaferon. A adição de locais de glicosilação à proteína Novaferon pode ser conseguida alterando a sequência de aminoácidos da proteína Novaferon. Pode fazer-se a alteração, por exemplo, por adição de, ou por substituição por, um ou mais resíduos de serina ou de treonina na sequência nativa da proteína Novaferon (para locais de glicosilação ligados por 0) . A alteração das sequências de aminoácido da proteína Novaferon poderia ser conseguida por alterações ao nível do ADN, em especial mutando a sequência de ADN codificando para a proteína Novaferon em bases nucleótido previamente seleccionadas de modo a que os codões alterados se venham a traduzir nos aminoácidos pretendidos. 36

Outra maneira de aumentar o número de espécies hidrato de carbono da proteína Novaferon é pelo acoplamento químico ou enzimático de glicósidos à proteína. Este tipo de métodos está descrito na técnica, por exemplo, já desde 1981, em que Aplin JD e Wriston JC Jr. descreveram a preparação, as propriedades, e as aplicações de conjugados de hidratos de carbono com proteínas e com lípidos (72). A remoção das espécies hidrato de carbono apresentadas pela proteína Novaferon pode ser conseguida por via química ou enzimática ou por substituição mutacional dos codões que codificam para os resíduos de aminoácido que servem como alvos na glicosilação. São conhecidas na técnica metodologias de desglicosilação química que estão descritas, por exemplo, por Edge AS et al. (73) . A clivagem enzimática das espécies hidrato de carbono nos polipéptidos pode ser conseguida utilizando uma série de endo-glicosidases e de exo-glicosidases tal como descrito por Thotakura et ai. (74).

Estas construções derivatizadas podem incluir espécies que melhorem a solubilidade, a absorção, a permeabilidade através da barreira sangue- cérebro, a vida média biológica, etc. Estas espécies ou modificações da proteína Novaferon podem em alternativa eliminar ou atenuar quaisquer efeitos colaterais possíveis e indesejáveis da proteína, e outros semelhantes. São descritas espécies 37 capazes de mediar estes efeitos, por exemplo, no Remington: The Science and Practice of Pharmacy. (75).

Outro tipo de modificação covalente de Novaferon inclui ligar-se a proteína Novaferon a um de uma série de polímeros não proteaginosos, por exemplo, polietilenoglicol, polipropilenoglicol, ou polioxialquilenos, por exemplo do modo decreto nas Patentes U.S. Nos. : 4.640.835(76); 4.496.689 (77); 4.791.192 (78) o u 4.179.337(79).

Além disto, também se pode modificar a proteína Novaferon da invenção presente de um modo que se formem moléculas quiméricas que incluam uma proteína Novaferon fundida a outro polipéptido heterólogo, ou sequência de aminoácidos. Numa concretização, uma tal molécula quimérica inclui um composto de fusão de uma proteína Novaferon com um polipéptido marcador que proporcione um epítopo ao qual um anticorpo anti-marcador se possa ligar selectivamente. 0 epítopo marcador é em geral colocado no terminal amino ou no terminal carboxilo da proteína Novaferon. A presença de formas de uma proteína Novaferon marcadas deste modo pode ser detectada utilizando anticorpos contra o polipéptido marcador. Além disto, proporcionar-se um marcador com epítopo permite uma purificação fácil da proteína Novaferon recorrendo a uma purificação por afinidade utilizando um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade que se ligue ao epítopo do marcador. Numa concretização alternativa, a molécula quimérica pode 38 incluir um composto de fusão de uma proteína Novaferon com uma imunoglobulina ou com uma determinada região/fragmento de uma imunoglobulina. Por exemplo, para se obter uma forma bivalente da molécula quimérica, poderia fundir-se a proteína Novaferon à região Fc de uma molécula de lgG. São bem conhecidos na técnica diversos polipéptidos marcadores e os seus anticorpos. Incluem-se nos exemplos os marcadores poli-histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly), o polipéptido marcador flu HA e o seu anticorpo 12CA5 (80); o marcador c-myc e os seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (81); e a glicoproteína D do vírus Herpes Simplex, (D), e o seu anticorpo (82). Incluem-se em outros polipéptidos marcadores o péptido Flag (83); o epítopo do péptido tubulina (84) e o péptido marcador da proteína T7 do gene 10 (85) .

Além disto, a proteína Novaferon da invenção presente pode ser produzida por processos de síntese química conhecidos dos indivíduos com conhecimentos médios da técnica. Por exemplo, podem produzir-se polipéptidos com até 80-90 resíduos de aminoácidos de comprimento num sintetizador de péptidos comercialmente disponível, modelo 433A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, US) . Além disto, os péptidos mais longos comercialmente sintetizados com até 120 resíduos de comprimento também se encontram comercialmente disponíveis, por exemplo, junto da Bio-synthesis, Inc. Lewisville, TX, USA). Deste modo, tal como 39 se entenderá facilmente, a proteína madura de comprimento inteiro Novaferon pode ser produzida sinteticamente (por exemplo, em fragmentos que se podem em seguida ligar uns aos outros).

Portanto, a proteína Novaferon of a invenção presente (SEQ ID No: 2) inclui todas as preparações de proteínas e de polipéptidos, e construções, que tenham a mesma sequência de aminoácidos que se descreve na SEQ ID No: 2, independentemente de se estas proteínas Novaferon e derivados de proteína são produzidos por processos de síntese química, e/ou por técnicas recombinantes em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas ou noutras células e hospedeiros, incluindo mas não se limitando a células de bactérias, leveduras, plantas, insectos e de mamíferos. Consoante os hospedeiros utilizados num método de produção recombinante, as proteínas da invenção presente podem ser glicosiladas ou não glicosiladas, peguiladas ou não peguiladas. Além disto, as proteínas da invenção também podem incluir um resíduo inicial de metionina modificado, em alguns casos em resultado de processos mediados por hospedeiros. Deste modo, sabe-se bem na técnica que a metionina do terminal N codificada pelo codão de iniciação na tradução, é em geral removida, com elevada eficiência, de quaisquer proteínas e após a tradução, em todas as células eucarióticas. Embora a remoção da metionina do terminal N da maior parte das proteínas também seja eficientemente removida na maior parte das procarióticas, para algumas proteínas este processo de remoção é 40 ineficiente nas procarióticas, dependendo da natureza do aminoácido ao qual a metionina do terminal N se encontra covalentemente ligada.

Produção A invenção presente também diz respeito aos vectores recombinantes constituídos pelas moléculas de ADN isolado da invenção presente, a células hospedeiras que sejam geneticamente modificadas/transfectadas com os vectores recombinantes, e à produção de uma proteína Novaferon ou dos seus fragmentos por técnicas recombinantes. O vector pode ser, por exemplo, um plasmídeo, fago, ou um vector virai ou retroviral. Os vectores retrovirais podem ser competentes do ponto da vista da sua replicação ou não. No último caso, a propagação virai ocorrerá em geral apenas na complementação das células hospedeiras. Incluem-se adiante exemplos descrevendo em pormenor a produção de Novaferon.

Os vectores preferidos para a expressão de uma proteína Novaferon da invenção presente incluem, mas não se limitam a, vectores que incluam regiões de controlo actuando em cis eficazes para a expressão num hospedeiro operativamente ligado ao polinucleótido que se pretende expressar. Os factores apropriados actuando em trans são fornecidos quer pelo hospedeiro, por um vector complementante ou pelo próprio vector quando se introduz no hospedeiro. 41

As sequências de ácido nucleico descritas na invenção presente (SEQ ID No: 1) podem estar operativamente ligadas a um promotor apropriado. "Promotor", neste documento, significa quaisquer sequências de ácidos nucleicos capazes de se ligar a ARN polimerase e de iniciar um extrão na transcrição (em geral a jusante (3')) da sequência de codificação para uma proteína Novaferon num mARN. Um promotor bacteriano tem uma região de iniciação da transcrição que em geral está localizada próximo do terminal 5' da sequência de codificação. Esta região de iniciação de transcrição inclui tipicamente um local de ligação a ARN polimerase e um local de iniciação da transcrição. As sequências que codificam para enzimas do percurso metabólico proporcionam sequências promotoras especialmente úteis. Incluem-se nos exemplos as sequências promotoras derivadas de enzimas metabolizando açúcares, tais como galactose, lactose e maltose, e sequências derivadas de enzimas biossintéticos tais como triptofano. Também se podem utilizar promotores de bacteriófago e elas são conhecidas na técnica. Além disto, também são úteis promotores sintéticos e promotores híbridos; por exemplo, o promotor tac é um híbrido das sequências promotoras trp e lac. Além disto, um promotor bacteriano pode incluir promotores com ocorrência natural que tenham uma origem não bacteriana mas que tenham a capacidade de se ligar a ARN polimerase bacteriana e de iniciar a transcrição. Os promotores bacterianos preferidos incluem, mas não se limitam a, os promotores E. coli laci, trp, phoA e lacZ, os 42 promotores T3 e T7, o promotor gpt, o lambda PR, os promotores PL e o promotor trp.

Os promotores eucarióticos possuem uma região de iniciação da transcrição, localizada em geral próximo da extremidade 5' da seguência de codificação, e uma caixa TATA, localizada em geral a 25-30 pares de bases (bp) a montante do local de iniciação de transcrição. Crê-se que a caixa TATA dirija a ARN polimerase II para iniciar a síntese de ARN no local correcto. Um promotor de mamífero também contém um elemento promotor a montante (elemento de aumento), localizado tipicamente a entre 100 e 200 pares de bases a montante da caixa TATA. Um elemento promotor a montante determina a taxa à qual se inicia a transcrição, e pode actuar em qualquer orientação. São especialmente utilizados como promotores de mamíferos os promotores de genes virais de mamíferos, uma vez que os genes virais são amiúde fortemente expressos, e que têm uma gama larga de hospedeiros. Inclui-se nos exemplos o promotor precoce SV40, promotor do vírus LTR do tumor mamário do murganho. Incluem-se nos promotores preferidos de células animais, sem que se limitem a, o principal promotor tardio do adenovírus, o promotor do vírus herpes simplex, e o promotor do CMV. Entre os promotores eucarióticos conhecidos adequados a este respeito encontram-se o promotor imediato precoce do CMV, o promotor alfa do factor de alongamento 1 (EF1A), o promotor da timidina quinase do HSV, os promotores SV40 precoce e tardio, e os promotores de LTR retrovirais, tais como aqueles do vírus do sarcoma 43 de Rous ("RSV"). Incluem-se nas sequências promotoras preferidas para expressão em levedura o promotor induzivel GAL1/10, os promotores da álcool desidrogenase, da enolase, da glucoquinase, da glucose-6-fosfato isomerase, do gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, da hexoquinase, da fosfofrutoquinase, da 3-fosfoglicerato mutase, da piruvato quinase, e o gene da fosfatase ácida.

Os vectores para propagação e expressão também incluem em geral um ou mais marcadores seleccionáveis. Estes marcadores podem ser adequados para amplificação ou os vectores podem conter marcadores adicionais para este objectivo. A este respeito, os vectores de expressão contêm preferivelmente um ou mais genes marcadores seleccionáveis para proporcionar um traço fenotipico para a selecção das células hospedeiras transfectadas, embora os especialistas da técnica entendam que podem ser proporcionados determinados marcadores seleccionáveis pelo sistema em vectores em separado. Incluem-se nos marcadores preferidos, por exemplo, genes de resistência a ampicilina (Amp), tetraciclina (Tet) ou higromicina (HYG) para culturas em E. coli e noutras bactérias. Incluem-se nos marcadores seleccionáveis para leveduras, ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, e ALG7, que conferem resistência à tunicamicina; o gene de neomicina fosfotransferase, que confere resistência a G418; e o gene CUPl, quer permite que a levedura cresça na presença de iões cobre. Incluem-se nos marcadores seleccionáveis para células animais o gene da dihidrofolato 44 redutase (DHFR), e os genes de resistência à neomicina (Neo) ou à higromicina (HYG).

Além disto, os vectores para propagação e para expressão contêm em geral um ou mais locais para iniciação da transcrição, para a terminação e, na região transcrita, um local de ligação ao ribossoma para a tradução. A porção codificante dos transcritos expressos pelas construções inclui preferivelmente um codão de iniciação da tradução no inicio, e um codão de terminação (UAA, UGA ou UAG) posicionado de modo apropriado no final da sequência de ADN que se vai traduzir. A selecção dos promotores, terminadores, marcadores seleccionáveis, vectores e outros elementos é um assunto de rotina na concepção ao alcance de um indivíduo com conhecimentos médios da técnica. Estão descritos muitos elementos destes na literatura e encontram-se disponíveis junto de fornecedores comerciais.

Os vectores que se seguem estão comercialmente disponíveis, e são preferidos para utilização em bactérias: pBV220 (86) e os seus derivados da Shanghai Sangon; a série pQE da Qiagen; os vectores pET da Qiagen; os vectores pBS, os vectores Phagescript, os vectores Bluescript, os vectores pNH8A, pNH16a, pNHl8A, pNH46A da Stratagene; e os vectores ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 da Pharmacia. Entre os vectores eucarióticos preferidos encontram-se os vectores pCI da Promega, os vectores pcDNA da Invitrogen, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG da Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL da Pharmacia. Listam-se estes 45 vectores apenas como exemplos para demonstrar que estão disponíveis muitos vectores comercialmente e são conhecidos dos indivíduos com conhecimentos da técnica, para utilização na produção de uma proteína Novaferon descrita na invenção presente por métodos genéticos/recombinantes.

Em algumas concretizações preferidas a este respeito, os vectores proporcionam meios para expressões particulares. Uma tal expressão particular pode ser uma expressão induzível ou uma expressão apenas em determinados tipos de células, ou pode ser tanto induzível como específica para determinadas células. São especialmente preferidos entre os vectores induzíveis os vectores que possam ser induzidos para expressar através de factores ambientais que sejam fáceis de manipular, tais como a temperatura e os aditivos nutrientes. São bem conhecidos e empregues em rotina pelos especialistas da técnica diversos vectores adequados para esta aplicação, incluindo vectores de expressão constitutivos e induzíveis para utilização em hospedeiros procarióticos e eucarióticos. 0 vector contendo a sequência de ADN descrita na SEQ ID No: 1, por exemplo, bem como um promotor adequado, e outras sequências de controlo adequadas, pode ser sido produzido utilizando uma série de metodologias conhecidas na técnica, numa célula hospedeira apropriada para a expressão de uma proteína pretendida. Incluem-se como representativos de tais hospedeiros adequados células bacterianas, tais como as de E. coli, Bacillus subtilis, 46

Streptomyces; células de leveduras, tais como as de Pichia pastoris; células de insecto, tais como as S2 de Drosophila e as Sf9 de Spodoptera; células de mamífero tais como as CHO e COS; e células de plantas. São bem conhecidos hospedeiros para uma série de construções de expressão, e os especialistas da técnica serão capazes, com a informação descrita na invenção presente, de seleccionar facilmente um hospedeiro para expressar uma proteína Novaferon descrita na SEQ ID No: 2.

Podem em geral modificar-se geneticamente as células hospedeiras de modo a incorporarem polinucleótidos codificando para Novaferon e para expressar as proteínas Novaferon da invenção presente. Por exemplo, podem introduzir-se polinucleótidos codificando para Novaferon em células hospedeiras utilizando as metodologias de transfecção conhecidas na técnica. Estes métodos estão descritos em muitos manuais padrão para laboratório, tais como os descritos por Kingston (87) . Podem introduzir-se/transfectar-se polinucleótidos codificando para Novaferon por si sós, ou com outros polinucleótidos. Esses outros polinucleótidos podem ser introduzidos independentemente, co-introduzir-se ou introduzir-se em conjunto com os polinucleótidos codificando para Novaferon descritos na SEQ ID No: 1.

Por exemplo, podem transfectar-se os polinucleótidos codificando para Novaferon da invenção em células hospedeiras em conjunto com um polinucleótido em 47 separado codificando para um marcador seleccionável para transfecção e selecção do marcador em células de mamífero. Em alternativa, os polinucleótidos codificando para Novaferon podem ser incorporados num vector contendo um marcador seleccionável codificando uma sequência de ADN para induzir a propagação nas células hospedeiras.

As células hospedeiras modificadas geneticamente transfectadas com os vectores contendo o polinucleótido que codifica para Novaferon podem ser cultivadas em meios nutrientes convencionais que podem ser modificados em particular para activar promotores, para seleccionar transformantes ou para amplificar os genes alvo. Ajustam-se s condições de cultura tais como a temperatura, o pH, etc. para serem adequadas para as células hospedeiras seleccionadas expressarem proteína Novaferon da invenção presente.

Podem incorporar-se sinais de secreção adequados, e co-expressar-se com a proteína Novaferon para promover a secreção do polipéptido proteico traduzido no lúmen do retículo endoplásmico, para o espaço periplásmico ou para o ambiente extracelular.

Purificação

Selecciona-se em geral um tipo de célula hospedeira adequado para a expressão da proteína recombinante alvo, dependendo da natureza da proteína alvo 48 e de outras condições levadas em consideração, tais como os custos de produção, se é fácil aumentar de escala, a dimensão da produção industrial, etc. Os clones das células transfectadas que expressam a proteína alvo com o maior rendimento são então seleccionados, e o clone final com a expressão óptima é denominado como linha de células alvo para expressão da proteína e utilizado para a produção da proteína alvo. A linha de células expressando a proteína alvo é cultivada num meio contendo diversos nutrientes. Para o crescimento óptimo das células e/ou para a expressão óptima da proteína-alvo, utilizam-se diversos agentes ou condições para induzir o promotor selectivo incorporado com a sequência de cADN da proteína alvo no vector transfectado. Quando o tipo de células hospedeiras/sistema de expressão envolve bactérias, recolhem-se as células cultivadas do meio, tipicamente por centrifugação. Lisam-se os corpos das células colhidas por meios físicos ou químicos, guardando-se os extractos em bruto recolhidos, que contêm a proteína alvo sintetizada, para uma maior purificação da proteína. Os métodos aplicados para quebrar as células microbianas incluem mas não se limitam a ciclos de congelação/descongelação, sonicação, quebra mecânica, ou a utilização de agentes de lise de células. Estes métodos são bem conhecidos dos especialistas na técnica.

Os inventores utilizaram bactérias E. coli, a título de célula hospedeira para a expressão de proteína recombinante Novaferon. Tal como se descreveu acima, transf ectou-se o E. coli com o vector que continha a 49 sequência de polinucleótido codificando para Novaferon, e seleccionou-se uma estirpe de E. coli. que manifestava a expressão óptima de uma proteína Novaferon para a produção da proteína Novaferon. Uma vez sintetizada, pode manter-se a proteína no citoplasma sob a forma de grânulos insolúveis, ou pode segregar-se no citoplasma sob forma solúvel. No primeiro caso, recuperam-se os grânulos depois da lise dos corpos das células, e desnaturam-se utilizando, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou ureia. Obtém-se então a dobragem de novo do polipéptido desnaturado/proteína Novaferon diluindo o sobrenadante a uma solução excessivamente diluída, ou por diálise contra uma solução de ureia e uma combinação de glutationa oxidada e reduzida, seguindo-se uma diálise contra uma solução salina tamponizada. No segundo caso, pode recuperar-se a proteína directamente, sem desnaturação, a partir do espaço periplásmico, sob a sua forma solúvel e funcional após a ruptura das células recolhidas. Evitando os processos de desnaturação e de renaturação, a proteína Novaferon obtida não sofre danos e não contém moléculas de proteína deformadas ou mal dobradas.

Os inventores verificaram que uma porção significativa da proteína Novaferon sintetizada produzida na linha de células de E. coli era segregada para o citoplasma. Esta porção foi então purificada tal como se descreve adiante.

Ensaios de Actividade e Utilizações Medicinais 50

Tal como se indica acima, a proteína Novaferon denota homologia de sequência com muitos membros da família interferão, em especial com a proteína interferão traduzida pelo mARN de HuIFN-al4 (FIG. 2). Demonstrou-se que o HuIFN-α tem um largo espectro de actividades biológicas incluindo actividades anti-virais, anti-proliferativas, e de imunomodulação (10).

Atenta esta homologia com HuIFN-α, esperar-se-ia que a Novaferon exibisse funções biológicas semelhantes às de HuIFN-α, incluindo mas não se limitando a, a inibição de proliferação de tumores, actividade anti-viral, activação de células NK, e modulação do sistema imunológico. É especialmente importante não só o manterem-se as propriedades funcionais como as de HuIFN-α, mas também o aumento de potência destas funções biológicas na proteína Novaferon em comparação com HuIFN-α. Para verificar e determinar a potência das suas propriedades funcionais, determinaram-se então as actividades biológicas da proteína Novaferon utilizando os ensaios clássicos e rotineiros in vitro, concebidos para detectar as propriedades anti-viral e anti-proliferativa. Tal como se descreve na secção experimental adiante, a potência in vivo das actividades anti-proliferativas da proteína Novaferon foi também observada em modelos de diversos tipos de cancro humano em animais, e comparada com a de HuIFN-α bem como com a de um agente químico contra o cancro em algumas experiências. 51 São bem conhecidos na técnica muitos ensaios para determinar as actividades do HuIFN. Os inventores empregaram o sistemas de ensaio in vitro baseados em células para determinar as actividades anti-viral e anti-proliferativa. Utilizaram-se os mesmos ensaios in vitro para todos os processos e em todas as experiências relacionadas com a invenção presente, que incluíam mas não se limitavam a despistar na biblioteca dos genes sujeitos a embaralhamento, de interferão humano do Tipo I, seleccionando a Novaferon a partir das proteínas expressas da biblioteca dos genes de interferão humano de Tipo I, e à determinação das actividades biológicas da proteína Novaferon pura recombinante.

Existem muitos ensaios que medem as actividades anti-virais das amostras/agentes em teste observando o grau de resistência das células a vírus (88). Utilizaram-se principalmente três bioensaios para medir as actividades anti-virais de HuIFN e dos seus híbridos. Eles são classificados de acordo com os métodos de determinar os vários aspectos dos vírus em células de cultura. 0 ensaio para determinar a inibição de efeitos citopáticos induzidos por vírus mede o grau de diminuição dos efeitos citopáticos de lise induzidos por vírus nas células em cultura, com tratamento prévio por IFN. Pode levar-se a cabo este ensaio em placas de 96 poços (89), e ele tem sido largamente utilizado para HuIFN-α recombinante 52 uma vez que proporciona um método simples para despistar um grande número de amostras.

Outro método de quantificar as actividades anti-virais de HuIFN em culturas de tecidos é a inibição da formação de uma placa de virus. os resultados do ensaio de diminuição das placas são independentes da multiplicidade da infecção. Para além disto, pode medir-se com elevada precisão uma diminuição de 50 % na formação de placas. Utilizando o virus da estomatite vesicular ubíquo (VSV) para induzir a formação de placas, por exemplo, consegue determinar-se o perfil da actividade através das espécies para um IFN recombinante específico despistando uma série de linhas de células provenientes d animais de diferentes espécies ( 90) . O terceiro ensaio é baseado na determinação da redução do rendimento em vírus. A produção de vírus é medida, em geral durante um único ciclo de crescimento de células, pela quantidade de vírus libertada. Este ensaio é especialmente útil para testar as actividades anti-virais de IFN contra os vírus que não provocam efeitos citopáticos, ou que não dão placas nas culturas com células alvo. Neste teste, no entanto, a multiplicidade da infecção afecta o grau aparente de protecção induzido por uma concentração fixa de IFN (91) . AS actividades anti-virais da Novaferon foram medidas por um ensaio padrão de inibição do efeito 53 citopático utilizando células WISH e o vírus da estomatite vesicular (VSV). Determinaram-se as actividades anti-virais e calibraram-se utilizando as amostras de referência padrão dos padrões internacionais da OMS: 95/650 (rHuIFN-a2a) e 94/786 (rHuIFN-α de consenso). Uma unidade (UI) de actividade anti-viral é definida como a quantidade de proteína necessária para conseguir 50 % de inibição dos efeitos citopáticos do VSV em células em cultura. Tal como se descreve mais em pormenor adiante, a actividade da proteína Novaferon era de 2,5 X 109 Ul/mg, o que é cerca de 12,5 mais do que a do HuIFN-a2b. Estes testes demonstram que as propriedades anti-virais da Novaferon são muito maiores em comparação com as de HuIFN-a2b. Este aumento de potência contra vírus, exibido pela proteína Novaferon, constitui a base para se preferem maiores efeitos anti-vírus in vivo em seres humanos. Com base na natureza dos HuIFN, é razoável esperar um perfil anti-vírus muito alargado para Novaferon. Por outras palavras, a Novaferon deve ser mais potente em relação a uma larga gama do que os HuIFN naturais. A maior potência anti-vírus da Novaferon poderia traduzir-se em melhore efeitos anti-vírus ou em melhores efeitos terapêuticos em situações medicinais, para doentes com diversas doenças virais.

Tal como se explicou acima, os IFN também inibem a proliferação celular e exibem efeitos anti-tumorais potentes através de uma série de mecanismos. Foram estabelecidos diversos testes de anti-proliferação in vitro utilizando sistemas de cultura de células, e estão bem 54 descritos na técnica. Pode medir-se a proliferação celular nestes ensaios contando os números de células; através do bioensaio com violeta de cristal (92,93); pela quimiossensibilidade ao corante vermelho neutro (94-96); pela incorporação de nucleótidos radiologicamente marcados (97); pela incorporação de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) no ADN das células em proliferação (98); e pela utilização de sais de tetrazólio (99, 100). A linha de células linfoblastóide humanas Daudi é muito sensível ao efeito anti-proliferação de HuIFN-α, e o seu crescimento em culturas em suspensão facilita a quantificação do número de células envolvidas (101) . Tem-se utilizado esta linha de células para medir a actividade anti-proliferação de HuIFN-α e de híbridos há já muitos anos (102) . Utilizam-se também outras linhas de células para testar a actividade anti-proliferação de agentes.

Observaram-se as actividades anti-proliferativas da proteína Novaferon in vivo observando a inibição do crescimento da massa tumoral por administração de Novaferon em modelos em animais, com diversos xenotransplantes de tumores humanos. Os efeitos anti-tumor in vivo da Novaferon foram comparados com os de HuIFN-a2b, e em alguns modelos de xenotransplante, também com os de agente químico anti-tumor.

Tal como se descreve adiante em pormenor, os inventores verificaram que a actividade anti-proliferativa 55 in vitro da Novaferon, medido utilizando o método padrão com células de Daudi, era 400 vezes mais potente do que o de HuIFN-a2b natural, que é o que exibe provavelmente as actividades anti-proliferativas mais potentes de entre todos os HuIFN naturais. A maior actividade anti-proliferativa da Novaferon era de largo espectro e universal, uma vez que exibia uma inibição mais potente ou aumentada, do que o HuIFN-a2b natural, para todas as linhas de células de cancro humano que os inventores testaram in vitro. Isto indica que a inibição potente do cancro humano pela Novaferon não é selectiva. Embora a extensão das suas maiores actividades anti-proliferativas aos diversos tipos de todas as linhas de células de cancro humano fosse variável, a Novaferon tem o potencial de ser um agente anti-cancro com largo espectro em condições medicinais. Isto é uma vantagem significativa em relação aos agentes químicos anti-cancro, aos anticorpos monoclonais e a outros agentes anti-cancro com alvos específicos.

As experiências de xenotransplantes em modelos em animais que se descrevem adiante em mais pormenor estabelecem ainda que: (1) . Os efeitos anti-proliferação in vivo da Novaferon eram muito maiores, ou mais potentes, em comparação com os de HuIFN-a2b natural. (2) . Os efeitos anti-prolif eração in vivo da Novaferon, a doses muito mais pequenas, eram melhores do que os do agente químico testado, 5- 56 fluorouracilo (5-FU) no mesmo modelo de xenotransplante. (3) . A Novaferon era capaz de conseguir 90 % de inibição do crescimento do cancro nos modelos de xenotransplante, mas não induzia perda de massa corporal, alterações de actividade e outros efeitos colaterais negativos nos animais tratados, o que contrastava marcadamente com a perda significativa de massa corporal e a diminuição de actividade nos animais tratados com 5-FU.

Estes resultados indicam que as propriedades anti-proliferativas in vitro e in vivo da Novaferon são muito maiores, em comparação com as do HuIFN-a2b natural. A maior potência anti-proliferativa da Novaferon traduz-se numa inibição eficaz (>90 %) do crescimento de tumor humano num modelo animal em murganho, e esta inibição parece aplicar-se a um largo espectro de tipos de cancro humano testados sendo melhor que o agente químico clássico anti-cancro, o 5-FU. Estes resultados também indicam que a potente inibição do crescimento de células de cancro pela Novaferon é muito específica em relação á célula cancerosa e não em relação às células normais, o que é suportado pela observação de comportamentos normais de alimentação e de actividade e pela ausência de perda de massa corporal em animais tratados com Novaferon. A Novaferon tem portanto o potencial de funcionar em todos ou na maioria dos cancros humanos. 57

Numa concretização preferida, as moléculas completas ou parciais da proteína Novaferon (SEQ ID No: 2), feitas por técnicas recombinantes utilizando a sequência d epolinucleótido SEQ ID No. 1 ou sintetizadas por via química, poderiam ser aplicadas no tratamento e/ou na prevenção de qualquer e/ou todos os tumores e cancros com origem humana ou com origem não humana, nos humanos e/ou nas espécies não humanas. Estes tumores, por exemplo, incluem mas não se limitam a, sarcoma osteogénico; mieloma múltiplo; doença de Hodgkin; linfoma nodular, pouco diferenciado; leucemia linfocítica aguda; leucemia mielóide aguda; carcinoma da mama; melanoma; papiloma; e carcinoma nasofaringeal, cancro do cólon, cancro hepático e melanoma.

Noutra concretização, as moléculas completas ou parciais da proteína Novaferon (SEQ ID No: 2), feitas por tecnologias recombinantes utilizando a sequência de polinucleót ido da SEQ ID No: I ou sintetizadas por via química, poderiam ser aplicadas para o tratamento e/ou a prevenção de qualquer uma e/ou todas as doenças virais nos seres humanos e/ou em espécies não humanas Incluem-se nos exemplos das infecções virais susceptíveis, sem que se limitem a estas, encefalomiocardite virai, gripe e outras infecções virais do tracto respiratório, raiva e outras zoonoses virais, e infecções por arbovírus, bem como queratite por herpes simplex, conjuntivite hemorrágica aguda, varicela zoster, e hepatite B e C, SARS e gripe 58 aviária, sindrome de deficiência imunológica humana (SIDA, VIH) .

Noutra concretização, as moléculas completas ou parciais da proteína Novaferon (SEQ ID No: 2), feitas por tecnologias recombinantes utilizando a sequência de polinucleót ido da SEQ ID No: I ou sintetizadas por via química, poderiam ser aplicadas para o tratamento e/ou a prevenção de qualquer uma e/ou todas as patologias relacionadas com o sistema imunológico em seres humanos. Incluem-se nos exemplos de patologias imunológicas sem que elas se limitem a estas, artrite reumática, esclerose múltipla, e sindrome Sjogren, diabetes. Também se pode aplicar a proteína Novaferon para evitar a rejeição de enxerto vs. hospedeiro.

Noutra concretização, as moléculas completas ou parciais da proteína Novaferon (SEQ ID No: 2), feitas por tecnologias recombinantes utilizando a sequência de polinucleótido da SEQ ID No: I ou sintetizadas por via química, poderiam ser aplicadas para o tratamento e/ou a prevenção, a título de imunoadjuvante, de qualquer uma e/ou todas as doenças de angiogénese. Incluem-se nos exemplos das doenças de angiogénese sem que elas se limitem a estas, hemangiomas, neovasculatura induzida por tumor, degeneração da mácula relacionada com a idade e retinopatia diabética. A proteína Novaferon, por si só ou em conjunto com quaisquer outras proteínas/materiais veiculantes ou 59 outras construções, pode ser administrada a seres humanos e/ou a espécies não humanas em quaisquer preparações ou formulações aceitáveis do ponto de vista farmacêutico para quaisquer métodos de administração/caminhos de entrega/métodos, incluindo mas não se limitando à via oral, inalação, aspersão intranasal, injecção intraperitoneal, endovenosa, intramuscular, intralesional, ou subcutânea.

Poderiam fabricar-se preparações/formulações farmacêuticas contendo a proteína Novaferon a título de ingrediente activo incorporando um veículo apropriado sólido ou líquido, sob as formas de líquido, sólido, semi-sólido, e/ou quaisquer outras formas medicinalmente aceitáveis, tais como comprimidos, pílulas, pós, soluções ou suspensões líquidas, lipossomas, supositórios, soluções injectáveis e para infusão. As preparações/formulações contendo Novaferon poderiam ser feitas utilizando veículos, materiais, métodos convencionais e que estão descritos na técnica ou são em geral aceites na prática da indústria farmacêutica. As preparações/formulações contendo Novaferon também poderiam ser feitas utilizando os métodos, materiais não convencionais que não tenham sido descritos na técnica ou não sejam utilizados pela indústria farmacêutica.

Por exemplo, as formulações parentéricas são em geral fluidos injectáveis constituídos pelos materiais aceitáveis dos pontos de vista farmacológico e farmacêutico tais como água, soro salino fisiológico, outras soluções de sais equilibradas, dextrose aquosa, glicerol, etc. Além 60 disto, os fluidos injectáveis também poderiam conter, para além da proteína Novaferon, outras proteínas a título de veículos, tais como albumina de soro humano ou preparações de plasma. As formulações/preparações farmacêuticas também podem quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxica, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, conservantes, e agente para tamponizar o pH (por exemplo acetato de sódio ou monolaurato de sorbitan) . São bem conhecidos na técnica os métodos de formulação e estão descritos, por exemplo, no Remington: The Science and Practice of Pharmacy and Phamaceutical Sciences (75) .

As preparações/formulações específicas da proteína Novaferon poderiam ser determinadas pelas aplicações medicinais e/ou métodos de administração, a que se destinem, e poderiam ser fabricadas por qualquer indivíduo com conhecimentos da técnica, utilizando metodologias conhecidas. Por exemplo, par além de fluidos injectáveis, podem empregar-se formulações tópicas e orais. Podem incluir-se nas preparações tópicas embora não se limitem a estas, as gotas oculares, unguentos, e aspersões. Incluem-se nas formulações orais, embora elas não se limitem a estas, as formas líquidas (por exemplo, xaropes, soluções ou suspensões), ou sólidas (por exemplo, pós, pílulas, comprimidos, ou cápsulas). Para as preparações/formulações sólidas, incluem-se nos veículos sólidos convencionais não tóxicos sem que se limitem a estes, manitol, lactose, amido, ou estearato de magnésio, todos em grau de pureza farmacêutico. São conhecidos os 61 processos e/ou métodos de facto para produzir estas preparações/formulações, ou eles serão aparentes aos especialistas da técnica (75).

Podem administrar-se as preparações/formulações aceitáveis do ponto de vista farmacêutico da proteina Novaferon a seres humanos e/ou a espécies não humanas por uma diversidade de meios que incluem mas não se limitam a, administração oral, subcutânea, endovenosa, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal, ou intraocular, e no tratamento de feridas, podem ser directamente aplicadas no local.

As concentrações/quantidades da proteina Novaferon nas preparações/formulações podem variar entre >0 e 1,0 molar e/ou >0 a 100 % (em massa) consoante a prática medicinal. Os valores exactos das doses, intervalos entre administrações, bem como a duração do tratamento com qualquer uma e/ou todas as preparações/formulações de Novaferon será determinada nos ensaios clínicos, pelos estados da doença, e do doente, bem como pelos responsável pelo tratamento. Numa concretização preferida, devido à degradação proteica, à veiculação sistémica em relação à localizada, e à taxa de síntese de novas proteases, bem como à idade, massa corporal, estado geral de saúde, sexo, dieta, altura da administração, interacção com fármacos e à severidade do estado, etc., podem fazer-se ajustamentos à administração de Novaferon incluindo mas não se limitando 62 às doses individuais e/ou totais, aos intervalos de administração, à duração do tratamento, e aos decursos necessários para o tratamento, podem ser necessários, e ser avaliados mediante experimentação de rotina pelos indivíduos com conhecimentos da técnica.

Numa concretização preferida, a vida média em circulação da proteína Novaferon após administração aos corpos de seres humanos e/ou de espécies não humanas, pode ser alterada. Incluem-se nas alterações, sem que se limitem a estas, as do prolongamento ou encurtamento da vida média de Novaferon in vivo. Pode conseguir-se o prolongamento da vida média in vivo da proteína Novaferon de diversos modos, que incluem mas não se limitam a: (1) . Formação de complexos entre a molécula de Novaferon e um anticorpo monoclonal. Um anticorpo deste tipo ligar-se-ia preferivelmente à proteína Novaferon em locais que não impeçam materialmente as suas funções terapêuticas (103) . (2) . Complexos de fusão de Novaferon com outras proteínas/polipéptidos. Pode fundir-se de modo recombinante a molécula de Novaferon a outras proteínas/polipéptidos, tais como um fragmento da região constante de uma imunoglobulina (Fc) (104) . (3) . Conjugação da proteína Novaferon. Por exemplo, pode conjugar-se a proteína Novaferon 63 com polímeros não antigénicos, tais como polietilenoglicol ou espécies polialguilenoglicol relacionadas (105-108).

Noutra concretização preferida, poderia conjugar-se um composto terapêutico com um anticorpo, preferivelmente um anticorpo anti proteína Novaferon. O composto terapêutico pode ser um agente citotóxico. Neste método, os agentes citotóxicos podem ser alvejantes, por ligação do anticorpo conjugado às moléculas de Novaferon, a tecido tumoral ou às suas células, destruindo deste modo e diminuindo o número, das células doentes, para conseguir diminuir uma diminuição dos sintomas do cancro. Incluem-se nos agentes citotóxicos, mas não se limitam a, fármacos citotóxicos, toxinas ou fragmentos activos dessas toxinas, e produtos químicos radiológicos. Incluem-se nas toxinas adequadas e nos seus fragmentos correspondentes a cadeia A da difteria, a cadeia A da exotoxina, a cadeia A da ricina, a cadeia A da abrina, curcina, crotina, fenomicina, enomicina e outras semelhantes.

Exemplos

Os exemplos seguintes servem para descrever mais por completo o modo de se utilizar a invenção descrita acima, bem como para descrever os melhores modos contemplados para levar a cabo diversos aspectos da invenção. Entende-se que estes exemplos não servem de modo nenhum para limitar o verdadeiro âmbito desta invenção, mas 64 em vez disso são apresentados com objectivos de ilustração. Todas as referências citadas neste documento são expressamente incorporadas por citação, por completo.

Exemplo 1. Amplificação por PCR de genes humanos IFN-α a partir de cADN de leucócitos humanos

Extraiu-se o mARN total de leucócitos de sangue periférico humano. Levou-se a cabo a preparação de cADN utilizando um estojo de PCR para RT Advantage™ (Clontech, Mountain View, CA, US) e um iniciador de síntese de cADN (oligo dT18) e seguiram-se as recomendações do fabricante.

Levou-se a cabo a amplificação dos cADN de IFN-a humano por tecnologia de PCR 40 num ciclizador térmico MJ PTC, utilizando as condições seguintes: 2,5 pL de lOxtampão de amplificação pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, US), 0,75 pL de dNTP 10 mM, 0,5 pL de MgS04 25 mM, 0,25 pL de Platinum pfx DNA Polymerase (a 2,5 U/pL; Invitrogen, Carlsbad, CA, US) , 0,75 pL de cADN, 0,75 pL d iniciador 5' (10 pM; IFNa05: 5'-TGGTGCTCAGCT(A/G)CAAGTC-3'),(SEQ ID No:3), 0,75 pL de mistura de iniciadores 3' (cada um a 1,7 pM;

IFNa03-l: 5'-AATCATTTCCATGTTG(A/G)ACCAG-3'(SEQ ID

No:4);

IFNa03-2: 5'-AATCATTTCCCGGTTGTACCAG-3'(SEQ ID

No:5);

IFNa03-3: 5'-AATCATTTCCATGTTGAAACAG-3'(SEQ ID

No:6); 65 IFNa03-4 No :7); IFNa03-5 No:8); IFNa03-6 3'(SEQ ID No:9); IFNa03-7 No:10); IFNa03-8 No:11).

5'-AATCATTTCAAGATGAGCCCAG-3'(SEQ ID

5'-AATGATTTTCATGTTGAACCAG-3'(SEQ ID 5'-AATCATTT(C/G)(C/G)ATGTTGAACCAG-

5'-GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3'(SEQ ID

5'-GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3'(SEQ ID

Submeteram-se a uma electroforese os produtos de amplificação por PCR sobre um gel de agarose a 1,0 %, recortaram-se, purificaram-se por gel, e clonaram-se em vectores pCRII-TOPO ou pCR-4-ΤΟΡΟ (Invitrogen, Carlsbad, CA, US) seguindo as recomendações do fabricante. Levou-se a cabo a sequenciação automatizada numa mistura Prism Ready Reaction Dye Termination, ou num sequenciador automatizado ABI (PE Applied Biosystems, CA, US).

Uma vez que não se encontraram inserções pretendidas para as sequências de codificação para IFNa6, IFNa7 e IFNal6 nos clones acima, levaram-se a cabo PCR mais uma vez nas mesmas condições que acima com excepção do tipo de iniciadores específicos. Para amplificação específica de IFNa6, os iniciadores 5' e 3' utilizados foram respectivamente IFNa05: 5 '-TGGTGCTCAGCT(A/G)CAAGTC-3' (SEQ ID No:3), e IFNa03-8: 5'-GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3'(SEQ ID No:11). Para amplificação específica de IFNa7, os 66 iniciadores 5' e 3' utilizados foram respectivamente IFNa7U0: 5'-ATGCCCCTGTCCTTTTCTTTAC-3'(SEQ ID No:12) e uma mistura de igual número de moles de IFNa03-5 e IFNa03-6. Para amplificação especifica de IFNal6, os iniciadores 5' e 3' utilizados foram respectivamente IFNa7U0 and IFNa03-7: 5'-GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3'(SEQ ID No:10). Clonaram-se os fragmentos amplificados em vectores pCRII-TOPO ou pCR-4-TOPO e sequenciaram-se tal como acima.

Todos os genes de IFN-α de Tipo I humanos clonados foram individualmente alinhados com as sequências de ADN no Genebank. Os números de acessão no GeneBank para estes genes referidos neste documento são: NM_024013(IFN-al), NM_0 0 0 605 (IFN-a2), NM_010504 (IFN-a4), NM_010505 (IFN- a5), NM_0 0 8335 (IFN-a6), NM_008334 (IFN-a7), NM_0 0 8 33 6 (IFN-a8), NM_002171 (IFN-alO), NM_002172 (IFN-al4), NM_0 0217 3 (IFN-al6), NM_021268 (IFN-al7), NM_002175 (IFN-a21).

Exemplo 2. Construção de bibliotecas de embaralhamento de plasmideos contendo HuIFN de Tipo I

Para construir plasmideos contendo a sequência de codificação de um dos IFN-α de Tipo I humanos, sintetizaram-se 15 pares de oligonucleótidos, com locais de restrição BamHI e EcoRI (Genentech, South San Francisco, CA, US) , com base na região individual de codificação de cADN para proteínas IFN maduras de Tipo I humanas. Os números de acessão de nucleótidos no GeneBank para estas 67 proteínas referidas neste documento são: NM_024013(IFN-al), NM_00 0 6 0 5 (IFN- a2) , NM_010504 (IFN- a4), NM_010505 (IFN- a5), NM_0 0 8335 (IFN- a6) , NM_008334 (IFN- a7), NM_008336 (IFN- a8) , NM__002171 (IFN- alO), NM_002172 (IFN- al4),

NM_0 0217 3 (IFN- al6), NM_021268 (IFN-al7), NM_002175 (IFN a21) . Utilizaram-se os iniciadores e os plasmídeos construídos no Exemplo 1 como matrizes num PCR padrão (111) . Clivaram-se os produtos resultantes com endonucleases de restrição (RE) BamHI e EcoRI, e clonaram-se no vector de expressão do E. coli pBVB, que é um plasmídeo de expressão derivado de pBV220 (86) contendo um local BamHI e um local EcoRI na sua região de clonagem múltipla. Estas construções finais foram todas elas verificadas por análise de sequência de ADN (PE Applied Biosystems, US) .

Amplificaram-se fragmentos de ADN contendo ORF de IFN por PCR utilizando um par de oligonucleótidos, BVF4: 5'-AGGGCAGCATTCAAAGCAG-3' (SEQ ID No:13) e BVR3: 5'-TCAGACCGCTTCTGCGTTCTG-3' (SEQ ID No:14), e utilizando os plasmídeos contendo HuIFN de Tipo I previamente construídos. Misturaram-se os produtos resultantes em quantidades iguais e submeteram-se a uma digestão com DNase I e uma montagem por PCR seguindo o processo descrito por Stemmer (112).

Amplificaram-se mais os produtos montados por PCR com um par de iniciadores internos: BVF: 5'- GAAGGCTTTGGGGTGTGTG-3' (SEQ ID No:15) e BVR: 5'- 68 AATCTTCTCTCATCCGC-3' (SEQ ID No:16), seguindo-se digestão com BamHI e EcoRI e uma nova clonagem no vector de expressão de E. coli pBVB clivado com os RE BamHI e EcoRI. Verificaram-se todas estas construções finais por análise de seguência de ADN. Transformaram-se os genes de HuIFN-a embaralhados contendo plasmídeo em células competentes de E. coli DH5oí.

Em todos os procedimentos por PCR acima, tanto na amplificação por PCR como na montagem por PCR, utilizou-se ADN polimerase regular (New England Biolab, MA, US), em vez da ADN polimerase de alta-fidelidade.

Exemplo 3. Despiste das bibliotecas de embaralhamento

Cultivaram-se células frescas de E. coli DH5a de um dia para o outro numa placa LB a 37 °C. Obtiveram-se colónias individuais e inocularam-se em 100 pL de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina, em placas de 96 poços. Agitaram-se as colónias a 250 rpm a 30 °C. Depois de se fazer a cultura de um dia para o outro, inocularam-se em duplicado 10 pL das culturas bacterianas em 100 pL de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina, em placas de 96 poços. As placas originais (denominadas placas de reserva) foram temporariamente armazenadas a 4°C. Cultivaram-se as células em placas em duplicado a 30°C até a D060o ser 0,4 e depois induziram-se a 42°C. Ao fim de uma indução térmica durante 4 horas, as culturas de bactérias foram directamente 69 colocadas num congelador a -80°C para iniciar o ciclo de congelação e descongelação. Depois de 2 ciclos de congelação e descongelação, diluiu-se a suspensão/lisado de bactérias até uma concentração pretendida e expôs-se a uma cultura de células de Daudi para um teste anti-proliferação (101) ou a um acultura de células de Wish para um teste anti-viral (113) .

Em cada série de testes de despiste, fez-se o despiste primário de 20.000 colónias e seleccionaram-se cerca de 100 colónias com as maiores actividades anti-proliferativa ou anti-viral para testes adicionais de confirmação. Plaquearam-se riscas das culturas bacterianas seleccionadas em placas LB contendo 50 pg/mL de ampicilina. Cultivaram-se colónias singelas de um dia para o outro a 37 °C, recolheram-se, e inocularam-se em 1 mL de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina em tubos de teste. Cultivaram-se as bactérias em tubos de um dia para o outro a 30°C agitando a 250 rpm. Em seguida inocularam-se 40 pL das bactérias resultantes dentro de outro conjunto de tubos contendo 1 mL de LB com ampicilina (a 50 pg/mL) . Submeteram-se então as amostras aos passos de indução da expressão, de recolha das células das culturas, de tratamento por ciclos de congelação e descongelação e de testes anti-proliferativos ou anti-virais tal como se descreveram acima a respeito dos passos do despiste primário. 70

Em cada série de passos de despiste, seleccionaram-se cerca de 20 colónias com as actividades anti-proliferativa ou anti-viral maiores depois de testes de confirmação, para se fazerem plasmídeos e as suas inserções foram automaticamente sequenciadas. Amplificaram-se mais as inserções contendo uma sequência de ADN única utilizando um para de iniciadores para PCR BVBF: 5'-ACCATGAAGGTGACGCTC-3' (SEQ ID No:17).; e BVR: 5'-AATCTTCTCTCATCCGC-3' (SEQ ID No:16), que flanqueiam sequências respectivamente a montante e a jusante de locais de clonagem múltiplos do vector pBVB. Utilizaram-se os produtos amplificados por PCR para a série seguinte de construção da biblioteca de embaralhamento.

Levaram-se a cabo cinco ciclos de passos de despiste com base no aumento quer da actividade anti-proliferativa, quer da actividade anti-viral.

Exemplo 4: Expressão e purificação de proteína recombinante Novaferon em E. coli

Expressou-se a proteína Novaferon (SEQ ID No:2) em E. coli. O quadro de leitura da SEQ ID No: 1 com uma adição artificial do codão de iniciação ATG foi clonado no vector pBVB induzível pela temperatura sob controlo do promotor ÀPRPL (114). Transformou-se o plasmídeo de expressão de Novaferon, pBVBNF, em células DH5oí. Colheram-se individualmente colónias únicas e inocularam-se em 2 mL de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina e incubaram-se a 71 30°C durante 8 horas. Em seguida incubaram-se de novo os 2 mL de cultura de bactérias com 50 mL de meio contendo 50 pg/mL de ampicilina de um dia para o outro a 30 °C sob agitação. Na manhã seguinte, semearam-se as bactérias da cultura de um dia para o outro a uma razão de 1:10-1:20 num grande volume de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina, e incubou-se a 30°C sob agitação. Quando as culturas tinham atingido a parte média da fase logarítmica de crescimento (A550 =0,5-0,6), aumentou-se rapidamente a temperatura de incubação até 42°C e manteve-se durante 4 horas para se induzir a expressão de Novaferon. Passadas as 4 horas de indução térmica, centrifugaram-se as células das bactérias e lavou-se com PBS (137 mM em NaCl, 2,7 mM em KC1, 10 mM em Na2HP04, 2 mM em KH2P04) por 3 vezes, e depois armazenou-se a -80°C até se levar a cabo a purificação. A maior parte das moléculas da proteína Novaferon eram solúveis no sistema de produção de E. coli descrito neste documento, embora elas estivessem sobre-expressas no citoplasma. Deste modo, quebraram-se as células por digestão com lisozima em tampão 1 de lise celular (50 mM em Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM em EDTA (pH 8,0), 100 mM em NaCl) (115) . Sonicou-se também o lisado para quebrar as células intactas remanescentes e emendar as moléculas de ADN. Depois centrifugou-se o lisado.

As moléculas de proteína Novaferon solúveis nos sobrenadantes foram purificadas subsequentemente por cromatografia hidrofóbica, de permuta iónica e por 72 filtração sobre gel. Em primeiro lugar, carregaram-se os sobrenadantes sobre e passaram-se através de, uma coluna Fast Flow de Fenil Sefarose 6 (GE Healthcare, US) . Em segundo lugar, as fracções contendo proteína Novaferon foram aplicadas sobre uma coluna POROS 50 D (Applied Biosystems, US) . Em terceiro lugar, as fracções contendo proteína Novaferon foram submetidas a uma purificação através da coluna POROS 50 HS (Applied Biosystems, US) , e por último, as moléculas de Novaferon recolhidas foram mais purificadas com HiLoad 26/100 Superdex 75pg (Amersham, US).

Verificou-se a pureza da proteína Novaferon pura por análise de SDS-PAGE a 15 %. A proteína recombinante

Novaferon pura aparecia como uma única banda com uma massa molecular (MW) de 19-20 KDa. Uma análise por espectroscopia de massa indicava que a pureza da molécula purificada de Novaferon era de > 98 %, e que a massa molecular era de 19.313 Dalton, o que era idêntico à massa molecular prevista a partir da sua sequência de aminoácidos, de 19315 Dalton.

Exemplo 5: Expressão e purificação de HuIFN-a2b recombinante em E. coli O plasmídeo de expressão de HuIFN-a2b, pBV2b, contém a região de codificação de cADN para a proteína madura de HuIFN-a2b (número de acessão do nucleótido no GeneBank: NM_000605), que se encontra sob o controlo do promotor termicamente induzido λ PRPL. A expressão de 73

HuIFN-a2b foi levada a cabo seguindo os protocolos descritos por Joseph S e David WR (116) .

Transformou-se o plasmideo de expressão, pBV2bF, em células DH5-a. Colheram-se individualmente colónias únicas e inocularam-se em 2 mL de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina e incubou-se a 30 °C durante 8 horas. Em seguida incubaram-se mais os 2 mL de cultura de bactérias com 50 mL de meio contendo 50 pg/mL de ampicilina de um dia para o outro a 30 °C sob agitação. Na manhã seguinte, semeou-se a cultura de bactérias a uma razão de 1:10-1:20 num grande volume de meio LB contendo 50 pg/mL de ampicilina, e incubou-se a 30°C sob agitação. Quando as culturas tinham atingido a parte média da fase de crescimento logarítmico (A550 =0,5-0,6), aumentou-se rapidamente a temperatura de incubação para 42°C e manteve-se durante 4 horas para se induzir a expressão de HuIFN-a2b. Passadas as 4 horas de indução térmica, centrifugaram-se as células e lavou-se com PBS (137 mM em NaCl, 2,7 mM em KC1, 10 mM em Na2HP04, 2 mM em KH2P04) 3 vezes, e depois armazenou-se a -80°C até se proceder à purificação.

Expressou-se a proteína HuIFN-a2b de forma insolúvel no sistema de expressão de E. coli descrito neste documento, e deste modo conduziram-se a recuperação do corpo de inclusão e os procedimentos de lavagem consoante protocolos descritos no Molecular Cloning (115) . Em suma, voltaram a suspender-se as células bacterianas em tampão de lise celular I (50 mM em Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM em EDTA (pH 74 8,0), 100 mM em NaCl) e lisou-se por lisozima e sonicação. Lavaram-se os corpos de inclusão 3 vezes com tampão de lise celular II (tampão de lise celular I suplementado com 0,5 % (em volume) de Triton X-100).

Quebraram-se os corpos de inclusão suspendendo-os em guanidina 7 N à temperatura ambiente sob agitação durante 4 horas. Depois de uma centrifugação a 4°C durante 15 minutos, voltou a dobrar-se a proteína desnaturada em tampão Borex 0,15 M a pH 9,5 Borex durante 48 horas a 4°C. Ajustou-se o pH a 7,4 com HC1 no último passo da renaturação. tal como se confirmava por

Purificou-se a solução contendo o HuIFN-a2b renaturado por cromatografia hidrofóbica, de permuta iónica e por filtração sobre gel. Em primeiro lugar, carregaram-se os sobrenadantes sobre e passaram-se através de, uma coluna Fast Flow de Fenil Sefarose 6 (GE Healthcare, US) . Em segundo lugar, as fracções contendo HuIFN-a2b foram aplicadas sobre uma coluna POROS 50 D (Applied Biosystems, US) . Em terceiro lugar, as fracções contendo HuIFN-a2b foram submetidas a uma purificação através da coluna POROS 50 HS (Applied Biosystems, US), e por último, as moléculas de HuIFN-a2b recolhidas foram mais purificadas com HiLoad 26/100 Superdex 75pg (Amersham, US). A proteína pura HuIFN-a2b denotava uma única banda na análise por SDS-PAGE a 15 % e a sua pureza era >98 %, espectrometria de Massa. 75

Exemplo 6. Determinação da actividade anti-viral de Novaferon

Determinou-se a actividade anti-viral utilizando o sistema WISH-VSV como descrito nos protocolos clássicos descritos por Armstrong JA (113) . No primeiro dia, semearam-se células WISH (ATCC, N2 de catálogo CCL 25) em placas de 96 poços a uma densidade de 14.000 células/poço e incubaram-se a 37°C. 24 horas mais tarde, adicionou-se

HuIFN-a2b diluído em série a padrões internacionais humanos da OMS para IFN ou meio de cultura em branco a cada poço, e incubou-se a 37°C durante mais 24 horas. No terceiro dia, removeu-se o meio, e substituiu-se por meio contendo 1.000 PFU de Vírus de Estomatite Vesicular (VSV, ATCC, N2 catálogo VR-1421). Incubaram-se de novo as células durante 24 horas a 37°C e depois lavaram-se com NaCl a 0,85 % para remover células mortas. Em seguida, embeberam-se placas de cultura em solução de fixação de corantes (0,5 % de violeta de cristal, 5% de formalina (em volume), 50 % de etanol (em volume), e NaCl a 0,85 %) durante 1 hora.

Decantou-se então a solução de fixação de corantes, e lavaram-se copiosamente as microplacas com água da torneira e deixaram-se secar. Dissolveram-se as células coradas com 0,2 mL de 2-metoxietanol. Leram-se as placas a 550 nm num Modelo Opsys MR (Thermo Labsystems, US) para o bioensaio de Violeta de Cristal.

Levaram-se a cabo todas as experiências em triplicado e testaram-se na mesma placa as amostras de 76

Novaferon e de HuIFN-a2b. Avaliaram-se as actividades anti-virais de Novaferon e de HuIFN-a2b preparados neste documento em paralelo, e determinaram-se as unidades anti-virais (unidade internacional, ou UI) por referência aos padrões internacionais da OMS, 94/786 (rHuIFN-α de consenso) e 95/650 (rHuIFN-a2a), que se adquiriram junto do National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, USA). A actividade anti-viral da proteína Novaferon purificada contra VSV ou WISH era de 2,5xl09 Ul/mg enquanto a actividade anti-viral de HuIFN-a2b era de 2,0xl08 Ul/mg. Estes dados indicam que a actividade anti-viral da proteína Novaferon é cerca de 12,5 vezes maior do que a de HuIFN-a2b.

Exemplo 7 Actividade anti-proliferativa de

Novaferon O ensaio de actividade anti-proliferativa foi levado a cabo basicamente tal como descrito por Evinger e Pestka (101) . A. Cultura de células de linhas de células tumorais

Compraram-se as linhas celulares de células de tumores humanos junto de diferentes organizações (Tabela 1, adiante), nomeadamente, ATCC (American Type Culture 77

Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, EUA), DSMZ (Centro Nacional de Recursos para Material Biológico, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha), JCRB (Japanese Collection of Research Bioresources-Cell Bank, National Institute of Biomedial Innovation, 7-6-8 Saito-Asagi, Ibaraki-shi, Osaka 567-0085, Japão).

Tabela 1. Linhas de Células de Tumores Humanos ! Linhas de células Tumores Códigos | Organizações* | A-375 Melanoma CRL1619 | ATCC i 1 IGR-1 Melanoma j Acc 236 | DSMZ IGR-37 Melanoma Acc 237 I DSMZ IPC-298 Melanoma j Acc 251 | DSMZ | HCT-8 Adenocarcinoma colo-rectal j CCL-244 | ATCC | SW1116 Adenocarcinoma colo-rectal j CCL-233 | ATCC | | LS180 Adenocarcinoma colo-rectal j CL-187 | ATCC | DLD-1 Adenocarcinoma colo-rectal j CCL-221 | ATCC | LS174T Adenocarcinoma colo-rectal | CL-188 | ATCC | Hep G2 carcinoma hepatocelular HB-8065 | ATCC | Hep3B carcinoma hepatocelular HB-8064 | ATCC i HuH-7 Hepatoma 0403 | JCRB l PLC/PRF/5 Hepatoma CRL-8024 | ATCC | HL60(S) linfocítico íj 0163 | JCRB | Daudi linfoma de Burkitt ii CCL-213 | ATCC | L-428 linfoma de Hodgkin Acc197 | DSMZ | DU 145 Carcinoma da próstata HTB-81 j ATCC | PC-3 Carcinoma da próstata Acc 465 j DSMZ | MKN 1 Adenocarcinoma gástrico 0252 ! JCRB | KYSE 30 Carcinoma do esófago 0188 | JCRB j A549 Carcinoma do pulmão j CCL-185 j ATCC j 78 Linhas de células HeLa

C-33A

Tumores Adenocarcinoma do Cérvix Adenocarcinoma do Cérvix Códigos CCL-2 HTB-31

Organizações* ATCC ATCC * DSMZ: German National Resource Centre for Biological Material (Deutsche \ Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) Alemanha j ATCC: American Type Culture Collection, EUA | JCRB: Japanese Collection of Research Bioresources-Cell Bank, Japão j

Todas as células utilizadas no teste de actividade anti-proliferativa foram cultivadas a 37 °C sob uma atmosfera humidificada contendo 5 % de CO2. Cultivaram-se as células consoante o manual para o crescimento de cada uma delas, num meio de crescimento basal, tal como DMEM, MEM, F12K e 1640 ou 1640 mais F12 (todos da Gibco BRL, EUA) , suplementado com 5-20 % de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, FBS, da Gibco BRL, EUA. O meio de crescimento basal para cada uma das linhas de células individuais está listado na Tabela 2, adiante. Todas as linhas de células foram examinadas diariamente em placas de cultura, sob um microscópio invertido. Recolheram-se as células e utilizaram-se para experiências, nas suas fases de crescimento logarítmicas e com viabilidades maiores do que 90 %, tal como determinadas por exclusão com o corante azul de tripano. As contagens e as viabilidades celulares foram examinadas num hematocitómetro padrão.

Tabela 2. Métodos de Cultura e Medição de Linhas de Células de Tumores Humanos 79

Linha de células iMeio de cultura |Células/Poço (Métodos de medição ( ! IGR-1 ÍDMEM (5000 (bioensaio de violeta de cristal | | IGR-37 (DMEM (2000 | bioensaio de violeta de cristal | i IPC-298 11640 |2000 | bioensaio de violeta de cristal j | HCT-8 (1640 (500 | bioensaio de violeta de cristal j ÍLS180 (mem |3000 | bioensaio de violeta de cristal ( DLD-1 (1640 11500 | bioensaio de violeta de cristal ( Hep G2 (MEM |iooo | bioensaio de violeta de cristal j Hep 3B (mem (800 I bioensaio de violeta de cristal I HuH-7 ÍDMEM (4000 | bioensaio de violeta de cristal | PLC/PRF/5 (mem (6000 I bioensaio de violeta de cristal ( |KYSE 30 (1640+F12 (1000 | bioensaio de violeta de cristal j ÍDU145 (mem Hooo | bioensaio de violeta de cristal ( jPC-3 |1640 Í2000 | bioensaio de violeta de cristal ( MKN 1 (1640 (2000 Í bioensaio de violeta de cristal | A549 (F12K (400 (bioensaio de violeta de cristal \ SW 1116 (1640 Hooo (bioensaio de violeta de cristal ( LS174T (mem :4000 | bioensaio de violeta de cristal ( HeLa (mem (500 | bioensaio de violeta de cristal ( J C-33A (mem (1000 | bioensaio de violeta de cristal | A-375 (dmem (200 | bioensaio de violeta de cristal ( HL 60(S) (1640 (800 (contagem directa de células ( Daudi (1640 (400 (contagem directa de células ( L-428 11640 (800 (contagem directa de células ( B. Processo para o ensaio anti-proliferativo

Suspenderam-se suavemente as linhas de células na fase de crescimento logarítmico em meios aquecidos (36°C) a uma densidade de 2xl03 - 6 x 104 células/mL (variando com a linha de células, veja-se a Tabela 2) . Semearam-se 100 pL de suspensão de células em cada poço de uma placa de 96 80 poços, e em seguida incubou-se durante 6-8 horas a 37°C. Depois adicionaram-se volumes iguais (100 pL) de Novaferon ou de HuIFN-a2b diluídos em meio de cultura aos poços, em tripl içado. Agitaram-se suavemente as placas durante 4-5 segundos para misturar os conteúdos, e incubaram-se a 37°C durante 6 dias. Testaram-se as amostras de Novaferon e de HuIFN-a2b na mesma placa para se garantir que era possível a comparação

Utilizaram-se dois métodos para determinar os números de células num poço de células e para calcular as actividades anti-proliferativas de Novaferon e de HuIFN-a2b m função do número de células.

Utilizou-se um método de contagem directa de células para se determinar o número de células na suspensão de células. Passados 6 dias de cultura, diluíram-se as culturas de células com azul de tripano (concentração final: 0,02 %) , e contaram-se directamente os números de células utilizando um hematocitómetro.

Utilizou-se o método de bioensaio de violeta de cristal para determinar os números de células das células adesivas (93) . Passados 6 dias de cultura, removeram-se as células mortas pipetando PBS para cima e para baixo nos poços de cultura. Em seguida, encheram-se os poços com uma solução de fixação de corante para contrastar as células vivas, durante 1 hora. A solução de fixação de corante continha 0,5 % de violeta de cristal, 5 % de formalina (em 81 volume), 50 % de etanol (em volume), e 0,85 % de NaCl em água destilada. Depois lavaram-se as microplacas copiosamente com água da torneira e deixaram-se secar. Dissolveram-se as células contrastadas em 0,2 mL de metoxietanol. Mediu-se a densidade óptica a 550 nm (DO550) (leitor de placas Modelo Opsys, Thermo Labsystems, EUA) e utilizou-se o valor como indicador relativo do número de células.

Calculou-se a taxa de inibição de crescimento pela seguinte fórmula: taxa de inibição % = (1-(E-B)/(C-B)) X 100, em que E era o número de células ou o valor da DO550 nos poços tratados com Novaferon ou com HuIFNa2b no dia 6; B era o número de células ou o valor da OD550 numa cultura de células no dia 0; C era o número de células ou o valor da OD550 nos poços não tratados no dia 6.

Exprimiu-se a taxa de inibição em conjunto com as concentrações em compostos. Estimaram-se os valores de IC50 do Novaferon ou do HuIFN-a2b utilizando uma gama de concentrações de amostras. Ajustaram-se os dados a uma curva Sigmoidal (117) cujo coeficiente angular um de Hill era: Y=min + (Max-min) / (1 + 10 (IC5cTx)) em que X são os logaritmos das concentrações do fármaco; Y é a taxa de inibição; Min ou Max são os valores mínimo ou máximo no planalto da taxa de inibição. Os valores de IC50 de diversos compostos em relação a um determinado alvo podem ser comparados, correspondendo um menor valor de IC50 a um composto mais potente. 82

As concentrações em Novaferon e em HuIFN-a2b e as correspondentes taxas de inibição de crescimento celular para a linha de células Daudi estão apresentadas na Fig. 4. Com base nestes dados, o valor de IC50 de Novaferon e de HuIFN-a2b para inibirem o crescimento de células de Daudi foram calculados como 0,0174 pmol e 6,9550 pmol. Portanto o valor de IC50 de Novaferon é cerca de 1/400 do de HuIFN-a2b, representando um aumento de 400 vezes da potência anti-proliferativa de Novaferon, em comparação com a de HuIFN-a2b.

Avaliaram-se as actividades anti-proliferativas de Novaferon e comparam-se com as de HuIFN-a2b para 23 linhas de células tumorais, incluindo 4 linhas de células derivadas de melanoma (A-375, IGR-1, IGR-37, IPC-298), 5 linhas de células de adenocarcinoma colo-rectal (HCT-8, SW1116, LS 180, DLD-1, LS174T), 4 linhas de células de cancro hepático (Hep G2, Hep 3B, HuH-7, PLC/PRF/5), 3 linhas de células de linfoma (HL-60 (S), Daudi, L-428), 2 linhas de células de carcinoma da próstata (DU 145, PC-3), 2 linha de células de cancro cervical (HeLa, C-33A), 1 linha de células de adenocarcinoma gástrico (MKN 1), 1 linha de células de carcinoma de pulmão (A 549) e uma linha de células de cancro do esófago (KYSE 30) . O Novaferon exibia actividades anti-proliferativas muito maiores do que as de HuIFN-a2b contra todas as linhas de células de cancro que se testaram. A extensão do aumento da potência variava 83 nas diferentes linhas de células cancerosas, na gama de entre 16 e 1134 vezes (Tabela 3, adiante).

Tabela 3. Valores de IC50 de Novaferon e de HuIFN-cx2b e o aumento do número de vezes da inibição das linhas de células tumorais por Novaferon em relação a HuIFN-a2b. | ICso (pmol) | Número de vezes Linhas de células | HulFN-cr2b | Novaferon j (Novaferon/HulFN-cr2b) PLC/PRF/5 I 0,0407 ] 0,0025 | 16 A549 ] 4,27 j 0,2202 | 19 | DU 145 | 0,1319 | 0,0036 | 36 HepG2 I 0,1718 ! 0,004 | 43 HuH-7 l 0,1474 j 0,0026 | 58 Hep3B | 4,3934 I 0,0758 | 58 IPC-298 I 0,0516 i 0,0007 | 70 LS174T | 0,0165 j 0,0002 | 74 IGR-37 | 0,6017 I 0,0055 | 109 | PC-3 | 1,8777 | 0,0146 I 128 HeLa I 0,2364 j 0,0017 | 141 C-33A | 2,5242 j 0,0176 | 143 MKN I | 0,233 | 0,0011 I 207 HCT-8 | 2,9479 j 0,0139 | 212 SW 1116 | 0,2278 j 0,001 | 222 DLD-1 I 0,3977 | 0,0014 I 282 HL-60(S) I 0,5855 I 0,0019 I 306 LS 180 | 0,7579 j 0,0022 | 350 Daudi I 6,955 j 0,0174 ! 400 KYSE 30 I 18,0134 j 0,0264 I 683 A-375 | 1,4134 j 0,0019 | 733 IGR-1 i 6,6718 j 0,0076 | 876 L-428 | 17,2789 ! 0,0152 ! 1134 84

Exemplo 8. Experiências modelo de tumores in vivo A. Cultura de células e modelos de xenotransplantes de tumores humanos in vivo

Obtiveram-se a linha de células de cancro do cólon (LS 180), a linha de células de melanoma (A-375) e a linha de células de cancro hepático (Hep G2) junto da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . Obteve-se a linha de células de cancro da próstata (PC-3) junta do Centro Nacional de Recursos para Material Biológico da Alemanha (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen, Alemanha). Adquiriu-se a minha de células linfocitica (HL 60(s)) junto da Banco de Células da Colecção Japonesa de Bio-recursos (JCRB, Japão). Todas as células foram cultivadas consoante as instruções dos fornecedores (veja-se a Tabela 1) . Em suma, LS 180 e Hep G2 foram cultivadas em meio MEM. A-375 foi cultivada em DMEM. Ambos os meios tinham um suplemento de 10 % de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM em glutamina, com 100 U/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina, 0,1 mM em aminoácidos não essenciais, e 1,0 mM em piruvato de sódio. As células PC-3 e HL 60 (S) foram cultivadas em RPMI 1640 com um suplemento de 10 % de FBS, 100 U/mL de penicilina, e 100 mg/mL de estreptomicina. Mantiveram-se todas as células sob uma atmosfera com 5 % de C02 a 37°C. 85

Estabeleceram-se modelos de xenotransplante de cancros humanos utilizando os métodos descritos por Beverly et al. (118) . Recolheram-se células cancerosas na sua fase de crescimento logarítmica a partir de placas de cultura de tecidos, lavaram-se, e voltaram a suspender-se em soro salino tamponizado com fosfato (PBS, pH=7,5, 20 mM). Geraram-se xenotransplantes tumorais subcutâneos em murganhos atímicos nus Balb/c com 6 semanas de idade injectando 6 χ 106 células/0,3 mL (PC-3, HepG2) , 4 χ 106 células/0,3 mL (LS 180), 2 χ 107 células/0,3 mL (HL 60 (s)) ou 8 χ 106 células/0,3 ml (A-375) subcutaneamente em ambos os lados de na região do flanco. Para cada modelo de tumor in vivo, no dia 6 após a inoculação com células de tumor, repartiram-se os murganhos portadores de tumor (o volume do tumor é de cerca de 100 mm3) por 7 ou 8 grupos com números iguais de animais em cada grupo, e iniciou-se o tratamento.

Formularam-se Novaferon e HuIFN-a2b com solução de PBS. A injecção diária subcutânea de PBS por si só, diversas doses de Novaferon, ou de HuIFN-a2b, durou 30 dias no total (PC-3, HepG2, A-375), 28 dias (LS 180) ou 21 dias (HL 60 (s)) a partir do dia do agrupamento dos murganhos. Para o tratamento com 5-FU, 30 mg/kg de 5-FU foram administrados por via endovenosa dia sim, dia não e ao todo 5 vezes. Os grupos e as alturas de tratamento estão resumidos adiante:

Grupo 1 (Controlo): PBS diariamente. 86

Grupo 2 (dose pequena de Novaferon): 1,25 pg/kg diariamente.

Grupo 3 (dose média de Novaferon): 12,5 pg/kg diariamente.

Grupo 4 (dose elevada de Novaferon) : 125 pg/kg diariamente.

Grupo 5 (dose pequena de HuIFN-a2b): 1,25 pg/kg diariamente.

Grupo 6 (dose média de HuIFN-a2b): 12,5 pg/kg diariamente.

Grupo 7 (dose elevada de HuIFN-a2b) : 125 pg/kg diariamente.

Grupo 8 (5-FU): 30 mg/kg, administração endovenosa dia sim, dia não, por 5 vezes.

Uma vez iniciado o tratamento, mediram-se os tumores semanalmente com um paquímetro. Calcularam-se os volumes dos tumores usando a fórmula seguinte: volume = 0,5 x (largura)2 χ (comprimento). Sacrificaram-se os animais no dia em que se parou o tratamento (dia 30 depois do início do tratamento). Isolaram-se os tumores sólidos, fotografaram-se, e mediram-se.

Calculou-se a taxa de inibição do crescimento usando a seguinte fórmula: taxa de inibição = [1-T/C] χ 100 %, em que T é a massa média dos tumores para os grupos tratados com Novaferon, HuIFN-a2b, ou 5-FU; C é a massa média dos tumores no grupo de controlo após o tratamento. 87 B. Modelo do xenotransplante de cancro da próstata humano

Trataram-se xenotransplantes de cancro da próstata PC-3 com injecção subcutânea de 1,25, 12,5 ou 125 pg/kg de Novaferon durante 30 dias. A Novaferon exibia uma inibição forte, dependente da dose do crescimento do tumor PC-3 (P<0,05). Tal como se ilustra na Fig. 5 e na Tabela 4, adiante, o crescimento do tumor PC-3 nos grupo tratado com Novaferon estava fortemente suprimido em comparação com os dos grupos de controlo tratados com PBS. Por exemplo, a massa média do tumor PC-3 xenotransplantado no grupo tratado com Novaferon (125 pg/kg) foi de 0,091±0,081 g, muito significativamente diminuída em comparação com a dos animais de controlo, l,948±0,567g (P<0,001) (Tabela 4). Por outras palavras, um tratamento durante 30dias com 125 pg/kg conseguia uma inibição em 95,3 % do crescimento do tumor PC-3 (Tabela 4). 88

Tabela 4. Massa do tumor e taxa de inibição do crescimento de xenotransplantes de cancro da próstata PC-3 humano por tratamento com Novaferon e com HuIFN-a2b (n= 10)

Grupo ÍDose Massa do tumor (g) Taxa de | (Mg/kg) (médiaiDP) inibição (%) Controlo I - 1,948±0,567 - Novaferon a dosagem baixa 1125 1,266±0,457* 35,0 Novaferon a dosagem média j 12 g 0,759±0,574*** 61,0 Novaferon a dosagem L^. elevada \ 0,091 ±0,081 ***@@@ 95,3 HulFN-a2b a dosagem baijca 11 25 1,284±0,862 34,1 HulFN-a2b a dosagem média |i2i5 0,790±0,391** 59,4 HulFN-a2b a dosagem elevada j 0,476±0,271*** 75,6 nota: * p<0,05, ***p<0,001: em comparação com o grupo de controlo; @@@ p<0,001: j comparação com o grupo a dose elevada de HulFN-a2b \

Trataram-se murganhos nus Balb/c diariamente por injecção subcutânea com Novaferon (a 1,25 pg/kg, a 12,5 pg/kg ou a 125 pg/kg) durante 30 dias depois de se lhes haverem introduzido por via subcutânea 6 χ 106 células PC-3 vivas. Exprimiram-se os resultados sob a forma de volume médio do tumor (mm3) . A Fig. 5 mostravam que todas as diferentes doses de Novaferon exibiam uma inibição dependente da dose do crescimento do tumor PC-3 em comparação com o grupo de controlo, a PBS (P<0,05). A dose de 125 pg/kg de Novaferon originava uma inibição muito mais forte, ou quase completa, do crescimento do tumor PC-3, 89 mito maior do que o HuIFN-p2b à mesma dose (95,3 % vs. 75,6 %, P<0,01) (Tabela 4). É interessante reparar que um tratamento mais longo com Novaferon ou com HuIFN-a2b originava doenças maiores na inibição do crescimento de tumor para os grupos tratados com a dose elevada (125 pg/kg). 0 volume médio da massa do tumor de PC no grupo tratado com Novaferon foi de 107,9±68,7 mm3 em comparação com 620,7±296,6 mm3 para o grupo tratado com HuIFN-a2b, no dia 28 (P<0,001) e 122,1±100,7 mm3 em comparação com 691,9±428,3 mm3 no dia 30 (PcO.OOl). Este também foi o caso quando se considerava a massa do tumor depois de se terminar a observação (0,091±0,081 g para o grupo a alta dosagem de Novaferon em relação a 0,476±0,271 g para o grupo a alta dosagem de HuIFN-a2b, P<0,001). Isto sugeria que um tratamento mais longo com Novaferon a esta dose pode exibir uma inibição melhor ou completa do crescimento do tumor PC-3 neste modelo de xenotransplante. C. Modelo de xenotransplante de cancro hepático humano A actividade anti-tumor in vivo de Novaferon foi também avaliada num modelo de xenotransplante de cancro hepático Hep G2. A Novaferon exibiu uma inibição eficaz, dependente da dose, do crescimento do tumor Hep G2 em comparação com a observada num grupo de controlo (P<0,001). Os volumes médios de tumor nos grupos tratados com 90

Novaferon (injecção por via subcutânea, diariamente, de 1,25, 12,5 ou 125 pg/kg durante 30 dias) foram respectivamente de 783,2±270,0, 459,3+414,3, e 104,6±56,5 mm3, em comparação comum volume médio de 2125,8±743,1 mm3 para o grupo de controlo a PBS. O tratamento durante 30 dias com 125 pg/kg de Novaferon conferiu a mais forte inibição de crescimento do Hep G2 (96,6 %), que era significativamente melhor do que o que se conseguia com 125 pg/kg de HuIFN-a2b (89,2 %, P<0,01). Um tratamento mais prolongado com Novaferon a esta dose denotava uma tendência para uma inibição ainda melhor, ou completa. A massa tumoral média no final do período de observação foi de 0,074±0,083 para o grupo tratado com 125 pg/kg de Novaferon, significativamente menos do que o do grupo tratado com 125 pg/kg de HuIFN-a2b (0,235±0,199 g, P<0,001) (Tabela 5, adiante).

Trataram-se murganhos nus Balb/c com injecções diárias subcutâneas de Novaferon (a 1,25 pg/kg, 12,5 pg/kg e 125pg/kg) durante 30 dias, depois de se lhes haverem introduzido por via subcutânea 6 χ 106 células Hep G2 vivas. Exprimiram-se os resultados como volume médio do tumor (mm3) . A Fig. 6 mostrava que todas as doses diferentes de Novaferon exibiam uma inibição do crescimento de tumor de Hep G2 dependente da dose em comparação com o grupo de controlo a PBS (P<0,001). A 125 pg/kg a Novaferon induzia uma inibição muito mais forte ou quase completa, do crescimento do tumor de Hep G2 em comparação com o HuIFN-a2b à mesma dose (96,6 % vs. 89,2 %, P<0,05) (Tabela 5) . 91

Tabela 5. Massa de tumor e taxas de inibição de crescimento de xenotransplantes de cancro de fígado humano Hep G2 tratados com Novaferon e com HuIFN-a2b (n=10)

Dose (MQ/kg) | Massa de tumor (g) |(Média±DP) Taxa de inibição (%) - |2,179±0,578 - 1,25 |0,797±0,397*** 63,4 12,5 10,321 ±0,300*** 85,3 125 |0,074±0,083***@ 96,6 1,25 11,070±0587** 50,9 12,5 10,531 ±0,287*** 75,6 125 j0,235±0,199*** 89,2 Nota: p<0,01 ,***p<0,001, em comparação com o grupo de controlo, @ p<0,01, em \ comparação com o grupo a dosagem elevada de HulFN-a2b \

Grupo

Controlo

Novaferon a baixa dosagem

Novaferon a dosagem média

Novaferon a dosagem elevada

HulFN-o2b a baixa dosagem

HulFN-cr2b a dosagem média

FlulFN-a2b a dosagem elevada D. Modelo de xenotransplante de melanoma humano

Avaliou-se a inda a actividade anti-tumoral in vivo de Novaferon em xenotransplantes de melanoma maligno A-375. A linha de células A-375 (número na ATCC: CRL-1619) era derivada de um tumor sólido maligno humano. A Novaferon exibia uma inibição eficaz, dependente da dose, do crescimento do tumor de A-375 em comparação com o grupo de controlo (P<0,001). As taxas de inibição nos grupos tratados com Novaferon (injecção subcutânea diária de 1,25, 92 12,5 ou 125 pg/kg durante 28 dias) foram respectivamente de 40,1 %, 75,0 % e 82,8 %, em comparação com o grupo de controlo a PBS (P<0,001) (Tabela 6, adiante). O tratamento durante 30 dias com 125 pg/kg de Novaferon conseguia a maior inibição do crescimento de A-375 (82,8 %) , que era significativamente melhor do que o obtido com 125 pg/kg de HuIFN-a2b (69,9 %, P<0,001).

De uma forma interessante, a Novaferon exibia uma inibição mais eficaz do crescimento da célula de melanoma A-375 do que o agente quimioterapêutico, 5-FU (Tabela 6) . No dia 30, por exemplo, as massas tumorais médias nos grupos tratados com 12,5 pg/kg ou com 125 pg/kg de Novaferon eram respectivamente de 0,763±0,187 (P<0,01) e de 0,527±0,149 (P<0,001) gramas, enquanto a massa média de tumor para o grupo tratado com 5-FU, a 30 mg/kg, era de 1,004±0,105 grama (Tabela 6). Isto indica que a Novaferon pode ser mais eficaz para o tratamento do melanoma A-375 humano do que o 5-FU.

Trataram-se murganhos nus Balb/c por injecção subcutânea diária de Novaferon (a 1,25 pg/kg, 12,5 pg/kg e 125 pg/kg) durante 28 dias depois de se lhes haverem introduzido 8 χ 106 células A-375 por via subcutânea. Exprimem-se os resultados como volume tumoral médio (mm ) . A Fig. 7 mostrava que qualquer uma das três doses de Novaferon exibia uma inibição do crescimento do tumor de A-375, de um modo dependente da dose, em comparação com o grupo de controlo a PBS (P<0,001) . O tratamento com 125 93 pg/kg de Novaferon induzia uma inibição mais pronunciada do crescimento do tumor de A-375 do que o tratamento com HuIFN-a2b à mesma dose (82,8 % vs. 69,9 %, P<0,001) (Figura 7). Tanto 12,5 pg/kg como 125 pg/kg de Novaferon denotavam uma melhor supressão (respectivamente 75,0 % e 82,8 %) do crescimento do tumor do que se conseguia com 5-FU (67,2%, P<0,01 e P<0,001) (Figura 7).

Tabela 6. Massa de tumor e inibição da taxa de crescimento de xenotransplantes de células de melanoma humano A-375 tratados com Novaferon e com HuIFN-a2b (n=10)

Grupo Dose M9/kg) | Massa de tumor (g) (Média±DP) jTaxa de| | inibição (%) | Controlo - 3,057±0,384 \ - | Novaferon a baixa dosagem 1,25 | 1,830±0,289*** | 40,1 | Novaferon a dosagem média 12,5 0,763±0,187*** && $$$ | 75,0 | slovaferon a dosagem elevada 125 0,527±0,149***&&&@@@ | 82,8 | HulFN-a2b a baixa dosagem 1,25 | 1,890±0,148*** I 38,2 | HulFN-a2b a dosagem média 12,5 | 1,681 ±0,132*** | 45,0 | HulFN-a2b a dosagem elevada 125 | 0,920±0,139*** | 69,9 | 5-FU 30,000 | 1,004±0,105*** | 67,2 i nota: *** p<0,001, e m comparação com o grupo de controlo; $$$ p<0,001,emj jcomparação com grupo de HulFN-a2b a dosagem média (12,5); @@@ p<0,001 emj | comparação com grupo de HulFN-a2b a dosagem elevada (125); &&: p<0,01, j

| &&&: p<0,001 ,em comparação com o grupo a 5-FU I 94 E. Modelo de xenotransplante de cancro do cólon humano

Avaliou-se a actividade anti-tumoral in vivo de Novaferon no modelo de xenotransplante de cancro do cólon LS 180. A linha de células LS 180 (número na ATCC: CL-187) foi derivada de um adenocarcinoma do cólon humano. A Novaferon exibia uma inibição eficaz, dependente da dose, do crescimento do tumor de cancro do cólon LS 180 em comparação com o do grupo de controlo (P<0,001). As taxas de inibição nos grupos tratados com Novaferon (injecção diária subcutânea de 1,25, 12,5 ou 125 pg/kg durante 28 dias) foram respectivamente de 75,0 %, 80,5 % e 92,5 % em comparação com a do grupo de controlo a PBS (P<0,001,

Tabela 7, adiante) . O tratamento durante 28 dias com 125 pg/kg de Novaferon conseguia a mais forte inibição do crescimento do tumor LS 180 (92,5 %), que era significativamente melhor do que a conseguida com 125 pg/kg de HuIFN-a2b (82,3 %, P<0,001).

Após o tratamento de 28 dias, 12,5 pg/kg de

Novaferon inibia o crescimento dos xenotransplantes de cancro do cólon LS 180 a uma taxa semelhante à conseguida com 5-FU (a 30 mg/kg) em termos das massas tumorais médias, (0,815±0,221 grama vs. 0,758±0,227 grama). Com 125 pg/kg de Novaferon inibia-se o crescimento do tumor de LS 180 significativamente melhor o que com 30 mg/kg de 5-FU, (92,5 % vs. 81,8%, P<0,001) (Tabela 7 e Fig. 8). Esta observação era extremamente importante, considerando a aplicação 95 medicinal rotineira de 5-FU na quimioterapia padrão dos doentes com cancro do cólon. A melhor supressão pela Novaferon, do crescimento de tumor LS180 num modelo em animais, indica que a Novaferon tem o potencial de funcionar como um agente muito eficaz contra o cancro do cólon em circunstâncias medicinais.

Trataram-se murganhos nus Balb/c com uma injecção diária de Novaferon (a 1,25 yg/kg, 12,5 yg/kg e 125 yg/kg) durante 28 dias depois de se lhes haverem introduzido 4 χ 106 células LS 180 por via subcutânea. Exprimem-se os resultados através dos volumes médios dos tumores (mm3) . A Fig. 8 mostrava que todas as três doses de Novaferon exibiam uma inibição dependente da dose do crescimento do tumor LS180, em comparação com os do grupo de controlo a PBS (P<0,001). A 125 yg/kg, a Novaferon induzia uma inibição mais forte do crescimento do tumor LS 180 do que o HuIFN-a2b à mesma dose (92,5 % vs. 82,3 %, P<0,001) (Tabela 7). Tanto as doses de 1,25 yg/kg como 12,5 yg/kg de Novaferon conseguiam uma supressão do crescimento tumoral semelhante (respectivamente de 75,0 % e de 80,5 %) , em comparação com o 5-FU (81,8 %) (Tabela 7, Figura 8) . No entanto, a 125g yg/kg a Novaferon exibia uma inibição muito melhor do crescimento do tumor LS 180 do que o 5-FU (92,5 % vs. 81,8 %, P<0,0011) .

Tabela 7. Massa de tumor e taxas de inibição do crescimento de xenotransplantes de cancro do cólon humano LS 180 tratados com Novaferon e com HuIFN-a2b (n=10) 96 96 Grupo Dose (pg/kg) Massa de tumor (g) (MédiaiDP) Taxa de inibição! (%) | Controlo - 4,170±3,409 | Novaferon a baixa dosagem 1,25 1,043±0,433*** 75,0 | Novaferon a dosagem média 12,5 0,815±0,221*** 80,5 I | Novaferon a dosagem elevada 125 0,314±0,086*** &&& @@@ 92,5 | HulFN-cr2b a baixa dosagem 1,25 1,225±0,565*** 70,6 | | HulFN-a2b a dosagem média 12,5 1,076±0,442*** 74,2 | HulFN-a2b a dosagem elevada 125 0,740±0,310*** 82,3 5-FU 30,000 0,758±0,227*** 81,8 | I Note: *** p<0,001, em comparação com o grupo de controlo; @@@, p<0,001, em| |comparação com o grupo a dosagem elevada de HulFN-a2b; &&&, p<0,001, emj | comparação com o grupo a 5-FU j F. Modelo de xenotransplante de leucemia humana

Também se avaliou a actividade anti-tumor in vivo de Novaferon num modelo de xenotransplante de leucemia linfocítica 1HL 60 (s) . A Novaferon exibia uma inibição eficaz, dependente da dose, do crescimento do tumor HL 60 (s) em comparação com o grupo de controlo (P<0,001) . As taxas de inibição nos grupos tratados com Novaferon (injecção diária subcutânea de 1,25, 12,5 ou 125 pg/kg

durante 28 dias) foram respectivamente de 43,8 %, 55,2 % e 80,4 %, em comparação com o grupo de controlo a PBS (P<0,001, Tabela 8, adiante). O tratamento durante 21 dias com 125 pg/kg de Novaferon conseguia a inibição mais forte do crescimento do tumor HL 60 (s) (80,4 %) , que era 97 significativamente melhor do que a conseguida com 125 yg/kg de HuIFN-y2b (69,8 %, P<0,05).

Trataram-se murganhos nus Balb/c por injecção diária subcutânea de Novaferon (a 1,25 yg/kg, 12,5 yg/kg e 125 yg/kg) durante 21 dias depois de se lhes haverem introduzido 2 χ 107 cédulas HL 60 (s) vivas por via subcutânea. Exprimiram-se os resultados como volume médio dos tumores (mm3) . A Fig. 9 mostrava que todas as três doses de Novaferon exibiam uma inibição dependente da dose do crescimento do tumor LS180 em comparação com o do grupo de controlo a PBS (P<0,001) . A 125 yg/kg de Novaferon induzia-se uma inibição mais forte do crescimento do tumor LS 180 do que com HuIFN-a2b à mesma dose (80,4 % vs. 69,8 %, P<0,05), e uma inibição semelhante em comparação com o 5-FU (Figura 9, Tabela 8). 98

Tabela 8. Massa de tumor e taxas de inibição de crescimento de xenotransplantes de células de leucemia LS 60(S) tratados com Novaferon e com HuIFN-a2b (n=10)

Grupo Dose (MQ/kg) Massa de tumor (g) (Média±DP) Taxa de inibição I (%) S Controlo - 3,723±0,750 \ Novaferon a baixa | dosagem 1,25 2,091 ±0,653*** 43,8 | | Novaferon a dosagem | média 12,5 1,668±0,665*** 55,2 | | Novaferon a dosagem elevada 125 0,729±0,332***@ 80,4 | HulFN-ar2b a baixa dosagem 1,25 2,401+0,698*** 35,5 | j HulFN-cr2b a dosagem média 12,5 1,870±0,660*** 49,8 I | HulFN-a2b a dosagem elevada 125 1,124±0,397*** 69,8 | 5-FU 30,000 0,893±0,289*** 76,0 | i Nota: *** p<0,001, em comparação com o grupo de controlo; i comparação com o grupo a HulFN-a2b a dosagem elevada (125) @ p<0,05, emj G. Estado geral dos murganhos durante o tratamento com Novaferon

Observaram-se muito bem os murganhos com os diversos xenotransplantes de cancros humanos durante o período de tratamento por administraçao de Novaferon,

HuIFN-a2b ou 5-FU. Ao contrário do que sucedia nos grupos em tratamento com 5-Fu, os murganhos de todos os grupos tratados com Novaferon ou com HuIFN-a2b em geral, comiam e comportavam-se normalmente, e não denotavam perda de massa 99 corporal. Os murganhos tratados com 5-FU denotavam as alterações típicas na alimentação e no comportamento, bem como diminuição de massa corporal. Estas observações indicam que esse por um lado se consegue uma potência contra o cancro melhor ou igual à conseguida com 5-FU nos modelos de xenotransplante em animais, a Novaferon pode ser mais específica em relação á inibição do crescimento da célula cancerosa, e pode ter muito menos efeitos sobre células normais e/ou funções fisiológicas. Estes podem traduzir-se por uma melhor tolerância e efeitos terapêuticos superiores nas aplicações em seres humanos.

REFERÊNCIAS 1. Interferon nomenclature. Nature. 1980: 286 (5769):110 2. Isaacs A and Lindenmann J. Production of virai interfering substance. Pat US No: 369922. 17 de Outubro de 1972 3. Jonasch E and Haluska FG. Interferon in oncological practice: review of interferon biology, clinicai applications, and toxicities. Oncologist. 2001; 6(1):34-55 4. Lengyel P. Biochemistry of interferons and their actions. Annu. Rev Biochem. 1982; 51: 251-282 5. Gresser I e Tovey MG. Antitumor effects of interferon. Biochim. Biophys. Acta. 1978; 516(2): 231-247 100 6. Samuel CE. Antiviral actions of interferons. Clin. Microbiol. Rev. 2001; 14(4):778-809 7. Theof ilopoulos AN, et al. Type I interferons (alpha/beta) in immunity and autoimmunity. Annu. Ver. Immunol. 2005; 23: 307-336 8. Uze G, et al. Alpha and beta interferons and their receptor and their friends and relations. J. Interferon Cytokine Res. 1995; 15(1): 3-26 9. Knight E Jr. Interferon: purification and initial characterization from human diploid cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1976; 73(2): 520-523 10. Pestka S, et al. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunol. Rev. 2004; 202: 8-32 11. Horisberger MA e Di Marco S. Interferon-alpha hybrids. Pharmacol Ther. 1995; 66(3): 507-534 12. Horton HM, et al. Antitumor effects of interferon-omega: in vivo therapy of human tumor xenografts in nude mice. Câncer Res. 1999; 59 (16) : 4064-4068 . 13. Hardy MP, et al. Characterization of the type I interferon locus and Identification of novel genes. Genomics 2004; 84(2): 331-345. 14. Chen J. et al. Human interferon-ε: a type I interferon. Pat US No: 6569420. 27 de Maio de 2003 101 15. Pestka S, et al. Interleukin-10 and releated cytokines and receptors. Annu. Ver. Immunol. 2004, 22: 929-979 16. Nardelli B, et al. Regulatory effect of IFN-kappa, a novel type I IFN, on cytokine production by cells of the innate immune System. J. Immunol. 2002; 169(9): 4822-4830 17. LaFleur DW, et al. Interferon-kappa, a novel type I interferon expressed in human keratinocytes. J. Biol. Chem. 2001; 276(43): 39765-39771 18. Subramaniam PS, Johnson HM. The IFNA subunit of the type I IFN receptor complex contains a functional nuclear localization sequence. FEBS Lett. 2004; 578(3): 207-210 19. Goodboum S, et al. Interferons: cell signalling, immune modulation, antiviral response and virus countermeasures. J. Gen. Virol. 2000; 81 (Pt 10): 2341-2364 20. Wang K, et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-delta, and NF-kappa B signaling pathways. J. Immunol. 2003; 171(2): 1035-1041 21. Katze MG Interferon, PKR, virology, and genomics: what is past and what is next in the new millennium? J. Interferon Cytokine Res. 2002; 22 (3) : 283-286 102 22. Chawla-Sarkar M, et al. Apoptosis and interferons: role of interferon-stimulated genes as mediators of apoptosis. Apoptosis. 2003; 8 (3) : 237-249 23. Kirkwood J. Câncer immunotherapy: the interferon-alpha experience. Semin. Oncol. 2002; 29(3 Supl. 7): 18-26 24. Hofmann V, et al. Hairy cell leukemia: an interferon deficient disease? Câncer Treat. Rev. 1985; Supl. B: 33-37 25. Stone RM, et al. Recombinant human gamma interferon administered by continuous intravenous infusion in acute myelogenous leukemia and myelodysplastic syndromes. Am. J. Clin. Oncol. 1993; 16(2): 159-163 26. Talpaz M, et ai. Human leukocyte interferon to control thrombocytosis in chronic myelogenous leukemia. Ann. Intern. Med. 1983; 99(6): 789-792 27. Talpaz M, et al. Changes in granulocyte-monocyte colony-forming cells among leukocyte-interferon-treated chronic myelogenous leukemia patients. Exp. Hematol. 1986; 14(7): 668-671 28. Strander H, et ai. Long-term adjuvant interferon treatment of human osteosarcoma. A pilot study. Acta Oncol. 1995; 34(6): 877-880 29. Dogan B, et al. Intralesional alfa-2a interferon therapy for basal cell carcinoma. Câncer Lett. 1995; 91(2): 215-219 103 30. Fetell MR, et ai. Intratumor administration of beta-interferon in recurrent malignant gliomas. A phase 1 clinicai and laboratory study. Câncer. 1990; 65(1): 78-83 31. Muss HB. The use of interferon in renal cell carcinoma. Eur. J. Câncer. 1991; 27 (Supl 4) : S84-87 32. Peest D, et al. Cytokine therapy in multiple myeloma. Br. J. Haematol. 1996; 94(3): 425-432 33. Ikic D, et ai. Local interferon therapy for melanoma patients. Int. J. Dermatol. 1995; 34 (12) : 872-874 34. Rybak ME, et ai. Interferon therapy of relapsed and refractory Hodgkin's disease: Câncer and Leukemia Grupo B Study 8652. J. Biol. Response Mod. 1990; 9(1): 1-4 35. Kaufmann R, et al. Temozolomide in combination with interferon-alpha versus temozolomide alone in patients with advanced metastatic melanoma: a randomized, phase III, multicenter study from the Dermatologic Cooperative Oncology Grupo. J. Clin. Oncol. 2005; 23 (35) : 9001-9007 36. Lane HC. The role of alpha-interferon in patients with human immunodeficiency virus infection. Semin. Oncol. 1991; 18 (Supl. 7): 46- 52 104 37. Woo MH e Brunakis TG. Interferon alfa in the treatment of chronic virai hepatitis B and C. Ann. Pharmacother. 1997; 31(3): 330-337 38. Gibas AL. Use of interferon in the treatment of chronic virai hepatitis. Gastroenterologist. 1993; 1(2): 129-142 39. Levine LA, et ai. Treatment of subclinical intraurethral human papilloma virus infection with interferon alfa-2b. Urology. 1996; 47(4): 553-557 40. Ho M. Interferon for the treatment of infections. Annu. Ver. Med. 1987; 38: 51-59 41. Wintergerst U e Belohradsky BH. Acyclovir monotherapy versus acyclovir plus beta-interferon in focal virai encephalitis in children. Infection. 1992; 20(4): 207-212 42. Bogdan C, et ai. The role of type I interferons in non-viral infections. Immunol. Rev. 2004; 202: 33-48 43. Condos R, et ai. Treatment of multidrug-resistant pulmonary tuberculosis with interferon-gamma via aerosol. Lancet. 1997; 349(9064): 1513-1515 44. Giosue S, et ai. Aerosolized interferon-alpha treatment in patients with multi-drug-resistant pulmonary tuberculosis. Eur. Cytokine Netw. 2000; 11(1): 99-104 45. Raad I, et ai. Use of adjunctive treatment with interferon-gamma in an immunocompromised 105 patient who had refractory multidrug-resistant tuberculosis of the brain. Clin. Infect. Dis. 1996; 22: 572-574 46. Fernandez O, et al. Treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis with natural interferon beta: a multicenter, randomized clinicai trial. Mult. Scler. 1995; Supl. 1: S67- 69; 47. Freedman MS, et al. Randomized study of once-weekly interferon beta-la therapy in relapsing multiple sclerosis: three-year data from the OWIMS study. Mult. Scler. 2005; 11(1): 41-45 48. Shiozawa S, et al. Single-blinded controlled trial of low-dose oral IFN-alpha for the treatment of xerostomia in patients with Sjogren's syndrome. J. Interferon Cytokine Res. 1998; 18 (4) : 255-262 49. Wandinger KP, et al. Diminished production of type-1 interferons and interleukin-2 in patients with multiple sclerosis. J. Neurol. Sei. 1997; 149 (1) : 87-93 50. Steegmann JL, et al. Interferon alpha for chronic myeloid leukemia relapsing after allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplant. 1999; 23(5): 483-488 51. Kirkwood JM, et al. High dose Interferon alfa 2b significantly prolongs relapse free survival compared with GM2-KLH/QS-21 vaccine in 106 patients with resected stage IIB-111 melanoma: Results of Intergrupo Trial E1694/S9512/C509081. J. Clin. Oncol. 2001; 19: 2370-2380 52. Bonnem EM, alpha Interferon: the potential drug of adjuvant therapy: past achievements and future challenges. Eur J. Câncer. 1991; 27 Supl 4: S2-6 53. Folkman J. Successful treatment of an angiogenic disease. N. Engl. J. Med. 1989; 320: 1211-1212 54. Clifford JL, et al. Retinoids and interferons as antiangiogenic câncer drugs. Em: Teicher BA, ed. Antiangiogenic Agents in Câncer Therapy. Totowa, NJ: Humana Press Inc.; 1999; 355-370 55. Kaban LB, et ai. Antiangiogenic therapy of a recurrent giant cell tumor of the mandible with interferon alfa-2a. Pediatrics. 1999; 103: 1145-1149 56. Sleijfer S, et ai. Side effects of interferon-alpha therapy. Pharm. World Sei. 2005; 27 (6) : 423-431 57. Bell L. et al. Structure and properties of modified Interferons. Pat US No: 4914033. 3 de Abril de 1990 58. Meyer F. et al. Hybrid Interferons. Pat US No: 5071761. lo de Dezembro de 1991 107 59. Streuli M, et al. Target cell specificity of two species derived from them. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1981; 78(5): 2848-2852 60. Zoon K. et al. interferon alpha hybrids. Pat US No: 6685933. 3 de Fevereiro de 2004 61. Gangemi JD. Antiviral combination, and method of treatment. Pat US No: 5137720 11 de Agosto de 1992 62. Johnson HM. et al. Hybrid interferon tau/type) I interferon polypeptides Pat US No: 6174996. 16 de Janeiro de 2001 63. Raj, NB, et al. Synthesis, antiviral activity, and conformational characterization of mouse-human α-interferon hybrids. J. Biol. Chem. 1988; 263(18): 8943-8952 64. Mark DF, et ai. Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1984; 81(18): 5662-5666 65. Bentzien J. et al. Recombinant interferon-beta mutants. Pat US No: 651-4729. 4 de Fevereiro de 2003 66. Stemmer WPC. Methods for in vitro recombination. Pat US No: 5605793, 25 de Fevereiro de 1997 67. Chang CC, et al. Evolution of a cytokine using DNA family shuffling. Nat. Biotechnol. 1999; 17 (8) : 793-797 68. Blatt LM, et al. The biologic activity and molecular characterization of a novel synthetic 108 interferon-alpha species, consensus interferon. J. interferon cytokine Res. 1996; 16: 489-499 69. Tatusova TA and Madden TL. BLAST 2 Sequences, a new tool for comparing protein and nucleotide sequences. FEMS Microbiol. Lett. 1999; 174 (2) : 247-250 70. Bowie JU, et al. Deciphering the Message in

Protein Sequences: Tolerance to Amino acid Substitutions. Science 1990; 247(4948): 1306- 1310 71. Creighton TE. Posttranslational covalent modification of polypeptide chains. Em Proteins: Structure and Molecular Properties. Ed por Creighton TE. W. H. Freeman & Co. 1993; págs.

78-99. São Francisco, US 72. Aplin JD e Wriston JC Jr. Preparation, properties, and applications of carbohydrate conjugates of proteins and lipids. CRC Crit. Rev. Biochem. 1981; 10(4): 259-306 73. Edge AS, et al. Deglycosylation of glycoproteins by trifluoromethanesulfonic acid. Anal. Biochem. 1981; 118(1): 131-137 74. Thotakura NP e Bohl OP. Enzymatic deglycosylation of glycoproteins. Meth. Enzymol. 1987; 138:350-359 75. Peck GE, et al. Pharmaceutical manufacturing. Em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a ed. Editado por University of the Sciences in Philadelphia 109

(USIP), Lippincott Williams and Wilkins. 2006, páginas: 691-1094. PA, US 76. Shimizu K. et al. Plasminogen activator derivatives, Pat US No: 4640835. 3 de Fevereiro de 1987 77. Mitra G. Covalently attached complex of alpha-l-proteinase inhibitor with a water soluble polymer. Pat US No: 4496689, 29 de

Janeiro de 1985 78. Nakagawa Y. et ai. Chemically modified protein with polyethyleneglycol Pat US No: 4791192, 13 de Dezembro de 1988 79. Davis F. et al. Non-immunogenic polypeptides

Pat US No: 41799337, 18 de Dezembro de 1979 80. Field J, et al. Purification of a RAS- responsive adenylyl cyclase complex from

Saccharomyces cerevisiae by use of an epitope addition method. Mol. Cell Biol. 1988; 8(5): 215921-2165 81. Evan GI, et al. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product. Mol. Cell Biol. 1985; 5(12): 3610-3616 82. Paborsky LR, et al. Mammalian cell transient expression of tissue factor for the production of antigen. Protein Eng. 1990; 3(6): 547-553 83. Einhauer A and Jungbauer A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. J. 110

Biochem. Biophys. Methods. 2001; 49(1-3) : 455- 465 84. Skinner H, et al. Use of the Glu-Glu-Phe C-terminal epitope for rapid purification of the catalytic domain of normal and mutant ras GTPase-activating proteins. J. Biol. Chem. 1991; 266(22): 14163-14166 85. Lutz-Freyermuth C, et al. Quantitative determination that one of two potential RNA-binding domains of the A protein component of the UI small nuclear ribonucleoprotein complex binds with high affinity to stem-loop II of UI RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1990; 87(16): 6393-6397 86. Zhang ZQ. et al. Construction and application of a high levei expression vector containing PRPL promoter. Chinese J. of Virol. 1990: 2: 18-23 87. Kingston RE, et al. Introduction of DNA into mammalian cells. Em Current Protocols In Molecular Biology editado por Ausubel FM, et al. 2003; páginas: 9.0.1-9.15.20, John Wiley & Sons,

Inc. US 88. McNeill TA. Interferon assay. J. Immunol. Methods. 1981; 46(2): 121-127 89. Rubinstein S, et al. Convenient assay for interferon. 1. Virai. 1981; 37: 755-758 90. Horisberger MA e de Staritzky K. A recombinant human interferon-α B/D hybrid with a 111 broad hostrange. J. Gen. Virol. 1987; 68: 945-948 91. Stitz L and Schellekens H. Influence of input multiplicity of infection on the antiviral activity of interferon. J. Gen. Virol. 1980; 46: 205-210 92. Yeo EY, et al. Effect of short-term ethanol on the proliferative response of Swiss 3T3 cells to mitogenic growth factors, Exp. Mol. Med. 2000: 32: 161-169 93. Vignesh RC, et al. Effect of ethanol on human osteosarcoma cell proliferation, differentiation and mineralization. Toxicology. 2006; 220 (1) : 63-70 94. Cavanaugh PF Jr, et al. A semi-automated neutral red based chemosensitivity assay for drug screening. Investigational New Drugs. 1990; 8(4): 347-354 95. Raines EW and Ross R. Purification of human platelet-derived growth factor. Methods Enzymol. 1985; 109: 749-773 96. Wahl AF, et al. Gene expression of human DNA polymerase alpha during cell proliferation and the cell cycle. Mol. Cell. Biol. 1988; 8(11): 5016-5025 97. Cook JA e Mitchel JB. Viability measurements in mammalian cell Systems. Anal. Biochem. 1989; 179(1): 1-7 112 98. Porstmann T, et al. Quantitation of 5-bromo-2-deoxyuridine incorporation into DNA: an enzyme immunoassay for the assessment of the lymphoid cell proliferative response. J. Immunol. Methods. 1985; 82(1): 169-179 99. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods. 1983; 65(1-2): 55-63 100. Scudiero DA, et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in culture using human and other tumor cell lines. Câncer Res. 1988; 48 (17) : 4827-4833 101. Evinger M And Pestka S. Assay of growth inhibition in lymphoblastoid cell cultures. Methods Enzymol. 1981; 79(Pt B): 362-368 102. Meister A, et al. Biological activities and receptor binding of two human recombinant interferons and their hybrids. J. Gen. Virol. 1986; 67(Pt 8): 1633-43 103. Frincke J, et al. Interferon antibody compositions having an extended serum half-life. Pat US No: 5055289, 8 de Outubro de 1991 104. Chang T e Yu L. Hybrid with interferon-beta. and an immunoglobulin Fc joined by a peptide linker. Pat US No: 5908626, 1 de Junho de 1999 113 105. Nieforth KA, et al. Use of an indirect pharmacodynamic stimulation model of MX protein induction to compare in vivo activity of interferon alfa-2a and a polyethylene glycol-modified derivative in healthy subjects. Clin. Pharmacol. Ther. 1996; 59(6): 636-646 106. Ekwuribe NN. Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, deliven and diagnostic formulations comprising same. and method of making and using the same. Pat US No: 5681811, 28 de Outubro de 1997 107. Gilbert CW e Cho M-O. Interferon polymer conjugates. Pat US No: 5711944, 27 de Janeiro de 1998 108. Greenwald R e Gilbert CW. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same. Pat US No: 5738846, 14 de Abril de 1998 109. Letsinger RL, et al. Cholesteryl-conjugated oligonucleotides: synthesis, properties, and activity as inhibitors of replication of human immunodeficiency virus in cell culture. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989; 86(17): 6553-6556 110. Brower V. Naked DNA vaccines come of age. Nat. Biotechnol. 1998; 16(13): 1304-1305

111. Coen DM. The polymerase chain reaction. Em Current Protocols in Molecular Biology. Editado por Ausubel FM. 2001, página: 15.01-15.7.8. John Wiley & Sons, Inc. US 114 112. Stemmer WP. DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolution. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1994; 91(22): 10747-10751 113. Annstrong JA. Cytopathic effect inhibition assay for interferon: microculture plate assay. Methods Enzymol. 1981; 78 (pt A): 381-387

114. Sambrook J and Russell DW. em Molecular Cloning. 2001; páginas: 15.25-15.35, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US

115. Sambrook J and Russell DW. em Molecular Cloning. 2001; página: 15.51-15.52, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US

116. Sambrook J e Russell DW. em Molecular Cloning. 2001; páginas: 15.25-15.29 e 15-49-15-53, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, US 117. Chou TC, et al. Reversal of anticancer multidrug resistance by the ardeemins. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1998; 95(14): 8369-8374 118. Corbell T, et al. In vivo methods for screening and preclinical testing: use of rodent solid tumors for drug discovery. em Anticancer Drug Development Guide: preclinical screening, clinicai trails, and approval. Editado por Teicher BA e Andrews PA. 2004; páginas: 79-124. Humana Press, New Jersey, US.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS 115 <110> Novagenetics Inc. <120> PROTEÍNAS RECOMBINANTES SEMELHANTES A INTERFERÃO HUMANO <130> N240 0005/TWB <160> 17 <170> Patente na versão 3.4

<210> 1 <211> 498 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Sequência de nucleótidos sintetizada quimicamente <4 0 0> 1 tgtaatctgt ctcaaaccca cagcctgggt agcaagagga ccttgatgct cctggcgcag 60 atggggaaaa tctccctttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttga atttccccag 120 gaggaatttg atggcaacca gttccagaaa gctcaagcca tctctgtcct ccatgagctg 180 atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggaatcat ctgctgcttg ggatgagggc 240 ί Lv.%. Luyu>wu 33Ή·ΓΓ(ΊΓ3(" uu l i_ v_ y rnaartrtar ^.yuuv. L· cggcagctaa atgacttgga agcctgtatg 300 atgcaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg cggactccat cctggctgtg 360 aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgatggaga agaaatacag cccttgtgcc 420 tgggaggttg tcagagtaga aatcatgaga tccctctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa 480 agattaaggg ggaaggat 498 <210> 2 <211> 166 116

<212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> sequência de aminoácidos sintetizada quimicamente <400> 2 cys Asn Leu Ser Gin Thr Hl S Ser Leu Gly Ser Lys Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gin Met Gly Lys lie Ser Leu phe Ser Cys Leu Lys Asp 20 25 50 Arg His Asp phe Glu phe Pro Gin Glu Glu phe Asp Gly Asn Gin Phe 55 40 45 Gin Lys Al a Gin Ala Ile Ser Vai Leu Hi s Glu Leu Ile Gin Gin Thr 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Glu Ser Ser Al a Ala Trp Asp Glu Gly 65 70 75 80 Leu Leu Asp Lys Phe Arg Thr Glu Leu Tyr Arg Gin Leu Asn Asp Leu 85 90 95 Glu Ala Cys Met Met Gin Glu Vai Gly Vai Glu Glu Thr Pro Leu Met 100 105 110 Asn Ala Asp Ser lie Leu Ala vai Lys Lys Tyr Phe Gin Arg Ile Thr 115 120 125 Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Al a Trp Glu Val val 150 155 140 Arg Vai Glu lie Met Arg Ser Leu Ser Phe ser Thr Asn Leu Gin Lys 145 150 155 160 Arg Leu Arg Gly Lys Asp 165 <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial 117 <22 0> sintetizada <223> sequência de nucleótidos quimicamente <400> 3 tggtgctcag ctrcaagtc 19

<210> 4 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <400> 4 aatcatttcc atgttgracc ag 22

<210> 5 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> sequência de nucleótidos quimicamente 118 <4Ο0> 5 aatcatttcc cggttgtacc ag 22

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> sequência de nucleótidos quimicamente <400> 6 aatcatttcc atgttgaaac ag 22

<210> 7 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <400> 7 aatcatttca agatgagccc ag 22 <210> 8 <211> 22 119

<212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <400> 8 aatgattttc atgttgaacc ag 22

<210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <400> 9 aatcatttss atgttgaacc ag 22

<210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial 120 <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <4 0 0> 10 gatcatttcc atgttgaatg ag 22

<210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <4 0 0> 11 gagtcgtttc tgtgttggat cag 23

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> sequência de nucleótidos quimicamente <4 0 0> 12 121 atgcccctgt ccttttcttt ac 22

<210> 13 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <4 0 0> 13 agggcagcat tcaaagcag 19

<210> 14 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> sequência de nucleótidos quimicamente <4 0 0> 14 tcagaccgct tctgcgttct g 21

<210> 15 <211> 19 <212> ADN 122 <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente <4 0 0> 15 gaaggctttg gggtgtgtg 19

<210> 16 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> sequência de nucleótidos quimicamente <4 0 0> 16 aatcttctct catccgc 17

<210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> sintetizada <223> Sequência de nucleótidos quimicamente 123 <4 Ο 0> 17 accatgaagg tgacgctc 18

Lisboa, 18 de Novembro de 2014.

Claims (14)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido isolado codificando para uma proteína com actividades biológicas semelhantes às do interferão humano, em que o referido polinucleótido seja seleccionado de entre o conjunto constituído por polinucleótidos que contenham uma sequência de nucleótidos pela menos 95 % idêntica à SEQ ID No: 1, e em que a proteína tenha uma actividade anti-proliferativa pelo menos 10 vezes maior do que a do interferão alfa 2b humano (HuIFN-a2b).

2. Uma proteína que exiba actividades biológicas semelhantes às do interferão humano, em que a proteína referida seja seleccionada de entre o conjunto de proteínas que incluam uma sequência de aminoácidos pelo menos 90 % idêntica à SEQ ID No: 2, em que a proteína possua uma actividade anti-proliferativa pelo menos 10 vezes maior do que a do interferão alfa 2b humano (HuIFN-a2b) .

3. A proteína tal como se definiu na reivindicação 2, em que a sequência referida seja pelo menos 95 % idêntica à SEQ ID No: 2.

4. A proteína tal como se definiu na reivindicação 3, em que a referida proteína possua actividades anti-virais e anti-proliferativas. 2 5. 0 polinucleótido tal como se definiu na reivindicação 1, em que a sequência referida seja pelo menos 98 % idêntica à SEQ ID No: 1. 6. 0 polinucleótido tal como se definiu na reivindicação 1 ou a proteína tal como se definiu na reivindicação 2, em que a proteína apresente uma actividade anti-viral pelo menos 2 vezes maior do que a de interferão alfa 2b humano (HuIFN-a2b).

7. A proteína tal como se definiu na reivindicação 2, em que a referida proteína seja recombinante.

8. Um polipéptido que inclua um fragmento da proteína tal como se definiu na reivindicação 2, em que o referido fragmento exiba as referidas actividades biológicas semelhantes às do interferão humano.

9. Uma construção proteica que inclua a proteína tal como se definiu na reivindicação 2 acoplada a outra espécie, em que a construção referida exiba as referidas actividades biológicas semelhantes às do interferão humano.

10. A construção proteica tal como se definiu na reivindicação 9, em que: 3 (1) a referida proteína seja glicosilada; (2) a espécie referida seja um polipéptido; (3) a espécie referida não seja um polipéptido tal como uma molécula de um polímero, por exemplo, um polietilenoglicol linear ou ramificado; ou (4) a espécie referida seja uma molécula marcadora.

11. Uma composição gue inclua a proteína tal como se definiu na reivindicação 2 e um veículo, diluente ou excipiente aceitável do ponto de vista farmacêutico.

12. Um polinucleótido codificando para uma proteína tal como se definiu na reivindicação 2 ou na reivindicação 3.

13. A utilização da proteína tal como se definiu na reivindicação 2 no fabrico de um medicamento para o tratamento do cancro ou de uma doença virai.

14. Uma proteína tal como se definiu na reivindicação 2 para utilização no tratamento do cancro ou de uma doença virai.

15. Uma proteína que tenha a sequência de aminoácidos da SEQ ID No: 2 ou um seu fragmento que exiba actividades biológicas semelhantes às do interferão humano, em que a proteína ou o seu fragmento possua uma actividade 4 anti-proliferativa pelo menos 10 vezes maior do que a do interferão alfa 2b humano (HuIFN-a2b)

16. Um polinucleótido codificando para a proteína da reivindicação 15. Lisboa, 18 de Novembro de 2014.