MX2009001366A

MX2009001366A - Proteinas semejantes a interferon humano recombinante.

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Publication number: MX2009001366A
Application number: MX2009001366A
Authority: MX
Inventors: Haitao Wang; Yong Du; Rui Zhang; Jing Xu; Longbin Liu; Chunsheng Mao; Jizhi Li; Ling Wang
Original assignee: Novagen Holding Corp
Priority date: 2007-06-18
Filing date: 2007-06-22
Publication date: 2009-04-17
Also published as: TW200900504A; US9982028B2; JP2016117753A; US20100099612A1; KR20130027043A; ZA200901680B; CA2692358A1; US20170015723A1; US20200369741A1; KR101384307B1; HK1171048A1; BRPI0716948A2; US20130189226A1; JP5439189B2; JP6099095B2; US7867482B2; EP2078082A4; EP2465935A2; AU2007355415A1; PT2465935T

Abstract

Esta solicitud se relaciona con proteínas semejantes a interferón humano recombinante. En una modalidad una proteína recombinante creada mediante tecnología de mezclado de gene se describe que tiene actividades antivirales y antiproliferantes mejoradas en comparación con interferónalfa 2b humano que ocurre naturalmente (HulFN-a2b). La invención abarca un polinucleótido que codifica la proteína y vectores recombinantes y células huésped que comprenden al polinyucleótido. De preferencia el polinucleótido se selecciona del grupo de polinucleótidos cada uno teniendo una secuencia cuando menos 93% idéntica a SEC ID No: 1 y la proteína se selecciona del grupo de preoteínas cada una teniendo una secuencia de aminoácido cuando menos 85% idéntica de SEC ID No. 2. las proteínasy composiciones que comprenden las proteínas se pueden usar para tratamiento de condiciones que responden a terapia de interferón, tal como enfermedades virales y cáncer.

Description

PROTEÍNAS SEMEJANTES A INTERFERÓN HUMANO RECOMBINANTE Campo de la Invención Esta solicitud se relaciona con proteínas recombinantes que tienen actividades biológicas semejantes a interferón humano. Antecedentes En esta solicitud la nomenclatura de interferón (IFN) publicada en Nature (1) se ha adoptado. Los interferones humanos (HulFNs), que se descubrieron por Isaacs y Lindenmann en 1957 (2), son una familia bien conocida de citoquinas secretadas por una variedad grande de células eucarióticas durante la exposición de diversos estímulos, tales como infección viral o exposición a mitógeno. Los IFNs pueden producir muchos cambios en el comportamiento celular, incluyendo efectos sobre crecimiento celular y diferenciación y modulación del sistema inmune (3-7) . Los HulFNs se han clasificado en seis subgrupos, a decir, IFN-ot, IFN-ß, IFN-?, IFN-?, IFN-C e IFN-K. HulFN-a (interferón derivado de leucocito) se produce en células de leucocito humano y, junto con cantidades menores de HulFN-ß (interferón derivado de fibroblasto) , en células linfoblastoides . Los HulFNs se han clasificado adicionalmente por sus características químicas y biológicas en dos categorías generales, a decir, Tipo I y Tipo II- El Tipo I consiste de los subgrupos IFN- e IFN-ß así como los subgrupos recientemente descubiertos IFN-?, IFN-G e IFN-?. El Tipo II solamente tiene un miembro: IF -? (interferón inmune) . Los diferentes subgrupos de interferón tienen diferentes características estructurales y biológicas. HulFN-ß es una glicoproteína N-enlazada (8, 9) que se ha purificado a homogeneidad y caracterizado. Es heterogéneo con respecto a tamaño, probablemente debido a su fracción de carbohidrato. Sin embargo, solamente ha un gene de IFN-ß humano, que codifica una proteína de 166 aminoácidos. El IFN-ß tiene baja homología a IFN-a, compartiendo alrededor de 30-40% de identidad. En contraste a la calidad única del gene de IFN-ß, HulF -a es un subgrupo, que consiste de una familia de multigenes de 14 genes en esencia. Las variantes menores hechas de una o dos diferencias de aminoácido cuentan para los múltiples alelos (10) . Excluyendo el pseudogene IFNAP22, hay 13 genes, que codifican 13 proteínas. Cada proteína comprende 165-166 aminoácidos. La proteína codificada por el gene IFNA13 es idéntica a la proteína IFNA1. De esta manera hay 12 proteínas interferón alfa individuales: IF A1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA14, IFNA16, IFNA17 e IFNA21. La identidad de secuencia de aminoácido entre los subtipos IFN-a tiene generalmente 80-85% de homología (11) . El IFN-? maduro muestra 6% de homología de secuencia de nucleótido a la familia de especie IFN- pero es más largo por 6 aminoácidos en su terminal C, IFN-? está más distantemente relacionado con interferón-ß (comparte alrededor de 30% de homología de secuencia) . El IFN-? humano no se clasifica en el grupo de IFN-a debido a que es antigénicamente distinto de IFN-or y difiere en su interacción con el receptor de IFN-a Tipo I (12) . El IFN-? se secreta por leucocitos infectados con virus como un componente principal de interferonas de leucocito humano. La proteína madura de IFN-€ contiene 185 aminoácidos, que comparten alrededor de 33% y 37% de homología de secuencia a IFN-a2 e IFN-ß respectivamente (13, 14) . La función y propiedades biofísicas de IFN-e no se han caracterizado significativamente en detalle; sin embargo, funciona como interferones Tipo I. El IFN-e también puede tener un papel en la función reproductora (15) . IFN-K, una citoquina humana de 180 aminoácidos, es una IF Tipo I recientemente identificada. La secuencia de codificación de IFN-? es -30% idéntica a otros interferones Tipo I encontrados en humanos. Una particularidad distintiva de IFN-K es la expresión constitutiva detectable de su transcripción en células no inducidas, particularmente queratinocitos . IFN-? puede jugar un papel en la regulación de funciones inmunes sistémicas o locales a través de su efecto en células del sistema inmune innato (16) . Sin embargo, IFN-? exhibe baja actividad anti-viral (17) . El interferón Tipo I humano parece enlazar dos subunidades receptoras. IFNAR-1 y 2, que se distribuyen ampliamente en la superficie de célula de varios tipos de célula. El involucramiento de ligando conduce a la inducción de la fosforilación de cinasas de tirosina TYK2 y JAK-1, que están acopladas a finar-1 Y -2 respectivamente. Una vez fosforiladas, las proteínas STAT se liberan del receptor y forman homodímeros así como heterodimeros (18, 19) . Una vez liberados, los dímeros de STATA asociados con el Factor 9 Sensible a interferón (iRF-9), una proteína de enlace de ADN, que forma un complejo de factor-3 de gene simulado de IFn (isgf-3) , que migra hacia el núcleo. A continuación, el complejo ISGF-3 se enlaza a un elemento de ADN que existe en la corriente arriba de todos los genes de IFN inducible. Esto es la llamada trayectoria de transacción de señal "clásica".

Nuevos modos; de acción y trayectorias bioquímicas reguladas por IFNs Tipo I se están descubrimiento continuamente. Por ejemplo, corriente debajo de P13K en la trayectoria de transacción de señal, factor nuclear kappa-B (NF-kB) = y PKC-d, están asociados con efectos contra apoptóticos observaos en neutrófilos incubados con IFN-ß (20) . Más de 100 genes, llamados genes inducidos por interferón, responden al tratamiento de IFN. Las proteínas de IFN más estudiadas son aquellas con propiedades antivirales. Por ejemplo, la enimz de la familia 2, 5oligosintetasa (OAS-1 y -2) caaliza la síntesis de oligoadenilatos cortos, que enlazan y activan Rancel, una enzima que separa los RNAs virales y celulares, inhibiendo de esta manera la síntesis de proteína. La cinasa de proteína activada por DsRNA (PKR) fosforila el factor de iniciación de traslación elF2a, resultando también en la inhibición de síntesis de proteína viral y celular. Más recientemente, la PKR también se encontró que se requiere para la activación de actor de transcripción NF-??, un actor central en inducción de citocina inflamatoria, modulación inmune, y apoptosis. Las proteínas Mx (myxovirus-resistance) inhiben la répoica de los virus de RNA ya sea previniendo el transporte de partículas virales dentro de la célula, o transcripción de RNA viral. La deaminasa de adenosina especifica de RNA (ADAR) convierte la adensina en inopina, causando de esta manera hipermutación de los genomas de RNA virales (21) . Los HulFNs poseen un espectro amplio de actividades biológicas, incluyendo funciones antivirus, antitumor y de imunorregulación. Los potenciales clínicos de interforonas humanas se han explorado ampliamente, y se resumen abajo. Con respecto a aplicaciones antitumor, HulFNs pueden mediar los efectos antitumor ya sea indirectamente regulando las respuestas inmunomodulatoria y antiangiogénia o afectando directamente la proliferación o diferenciación celular de células de tumor (22) . La terapia de interferón se ha usado en el tratamiento de varias leucemias (23), por ejemplo, leucemia de célula peluda (24), leucemia mieloide aguda y crónica (25-27), osteosarcoma (28), carcinoma de célula basal (29), glioma (30), carcinoma de célula renal (31),mieloma múltiple (32), mel noma (33), sarcoma de Kaposi (23) enfermedad de Hodgkin (34) . La terapia de combinación de IFN- con citarabina (ara-C) , 5-FÜ, hidroxiura e H-2 están bien estudiadas mostrando en su mayoría resultados significativamente mejores que la HulFN-a sola (3) . El tratamiento sinérgico de cáncer avanzado con una combinación de HulFNS y temozolomida también se ha reportado 835) . Con respecto á aplicaciones antivirus, las HulFNs se han usado clínicamente para terapia antiviral, por ejemplo, en el tratamiento de SIDA (36) , hepatitis viral incluyendo hepatitis B crónica, heptatitis C 837, 38), infección de virus de papiloma (39) , infección de virus de herpes 840), encefalitis viral (41) y en la profilaxis de infecciones de rinitis y respiratorias (40) . Las HulFNs también se han usado clínicamente para terapia antibacteriana (42), por ejemplo, HulFN-? (43) y HulFN-a se han usado en pacientes con tuberculosis pulmonar resistente a múltiples drogas (44) . HulFN-? se ha usado en el tratamiento de tuberculosas resistente a múltiples drogas en el cerebro (45) . HulFNs también se han usado clínicamente para terapia de inmunomodulación, por ejemplo, para prevenir rechazo de injerto contra huésped, o para cortar la progresión de enfermedades autoinmunes, tales como esclerosis múltiple (46, 47) y síndrome de Sjogren (48) . IFN-ß está aprobada por la FDA en los Estados Unidos para el tratamiento de esclerosis múltiple. Recientemente se ha reportado que pacientes con esclerosis múltiple han disminuido la producción de ínterferonas Tipo I e interleucina-2 (49) .

Además, la inmunomodulación con HulFN-a parece ser una terapia efectiva en pacientes de leucemia mieloide crónica (CML) reincidiendo después de trasplante de médula de hueso (50) . Con respecto a ayuda de vacuna, HulFNs se ha usado clínicamente como un adyuvante en el tratamiento de melanoma (51) y también se ha usado como un adyuvante o coadyuvane para mejorar o simular la respuesta imune en asos de vacunación profiláctica o terapéutica para muchas otras enfermedades (52) . HulFN-or2a fue el primer inhibidor de angiogenesis en usarse en pruebas clínicas y fue efectivo en nios para el tratamiento de hemangiomas que amenazan la vida (53, 54) . Otra indicación clínica es el tumor de célula gigante del hueso, Kaban y col reportaron la regresión dramática de tumor de célula gigante recurrente, que crece rápidamente, grande, en la mandíbula (55) . Aún cuando HulFNs tienen muchas aplicaciones clínicas importantes no exhiben efectos laterales significativos y otras limitaciones. La mayoría de las citocinas, incluyendo HulFNs, tienen vidas medias de circulación relatiamente cortas puesto que se producen en vivo para actuar5 localmente y de manera transiente. Puesto que se administran típicamente como terapéuticos sistémicos, las HulFNs necesitan administrarse frecuentemente y en dosis relativamente grandes. Las administraciones parenterales frecuentes son inconvenientes y dolorosas. Además, efectos laterales tóxicos asociados con la administración de HulFNs frecuentemente son tan severos que algunas personas no pueden tolerar el tratamiento. Estos efectos laterales están probablemente asociados con administración sistémica de dosificaciones elevadas. Además, en estudios clínicos se ha encontrado que algunos pacientes producen anticuerpos a rHulFN, que neutraliza su actividad biológica (56) . Claramente, el desarrollo de proteínas de interferón novedosas con potencia mejorada se necesita urgentemente para' numerosas aplicaciones, v.gr., terapias contra cáncer, así como antiviral, inmunoterapia, antiparasítica, antibacteriana, o cualquier condición médica o situación en donde la actividad de interferón aumentada y/o efectos laterales reducidos se requieren. Sobre todo, es altamente probable que las HulFNs jugarán un papel importante en la siguiente generación de terapias novedosas contra tuor y antivirales (10) . Es bien sabido en el ramo que los medios más eficientes para mejorar las propiedades farmacéuticas de drogas de citocina es mutar la propia proteína de citocina. Diversas estrategias y técnicas para mutar péptidos de ínterferón han evolucionado durante el tiempo. Generalmente, tres estrategias se usan actualmente para crear mutantes de HulFN-a. La primera estrategia es hacer híbridos de IFN. Algunos investigadores han aprovechado la presencia de sitios de separación de endonucleasa de restricción (RE) que ocurren naturalmente dentro de las secuencias de codificación de IFN para colocar juntos fragmentos de codificación homólogos (57, 58) . La producción de un número de IFNs híbridos fue revisada por Horisberger y Di Marco (11) ; este artículo proporciona una vista general del proceso de construcción de dichas moléculas. Ejemplos específicos de métodos para la construcción de interferones híbridos se describen. Algunos investigadores han aprovechado la amplificación de PCR para construir IFN-as mutantes para de esta manera crear fragmentos de ácido nucleico específicamente deseados y entonces ganan el potencial de colocar juntas nuevas piezas de diferentes IFNs (59). La patente de EÜA No. 6,685,933 (60) también describe técnicas de amplificación de PCR para hacer híbridos de IFN humanos . Los híbridos de interferón se pueden crear dentro de un subgrupo de interferón, tal como se describe en la Patnete de EOA No. 5,137,720 (61) y Patente de EUA No. 6,6585,k933 (60). Además. Los genes originales del híbrido pueden venir de una especie (en su mayoría de humano) , or ejemplo, híbridos entre HulFN-a y HulFN-?, o de más de una especie animal, por ejemplo, híbridos entre interferón- s humano y murino (63) . Una segunda estrategia para construir mutantes de interferón es usar mutagénesis de punto dirigido en sitio introduciendo cambiso de unao o más nucleótidos en moléculas de IFN ADN 864) . Recientemente, métodos de mutación y computación sistemáticos se usan como una gujía para mutagénesis de proteína (65) . Una tercera estrategia para la construcción de HulFNs Tipo I es mezclar fragmentos de gene IFN que se crean mediante digestión de RE, amplificación de PCR, síntesis química o digestión de DNase, seguida por PCR para colocar aleatoriamente loa fragmentos untos y luego amplificarlos. Los productos de PCR resultantes de hecho están en un estanqu de fragmentos de gene de alfa interferón redispuestos que se pueden uar4 para construir una librería de ADN, de la que los clones de ADN con fenotipos deseados se pueden aislar (66) . Por ejemplo, Chang y col ha descrito un método para construir y tamizar una libería de mezclado de HulFN para identificar derivados de HulFN con actividades antivirales y de antiproliferación aumentadas en células de ratón (67) . El alfacón-1 de Interferón humano (consensur interferón) es un HulFN-a que no ocurre naturalmente, recombinante, con 166 aminoácidos. Se ha generado determinando los aminoácidos más altamente conservados en cada región correspondiente basada en las secuencias de HulFN-a clonadas conocidas. Tiene 89% de homología de secuencia a nivel de aminoácido a HulFN- 2b y una actividad antiviral especifica de aproximadamente 109 Iü/mg. El alfacón-1 de Interferón humano fue aprobado para el tratamiento de inección de HCV crónica en pacientes de 18 años o mayores con enfermedad de hígado compensada (68). Aún cuando algunas proteínas de interferón recombinante son conocidas en el ramo anterior, existe una necesidad de nuevas proteínas semejantes a interferón y composiciones de proteína que tengan actividades biológicas mejoradas . Compendio de la Invención De conformidad con la invención, un polinucleítido aislado que codifica una proteína que tiene actividades biológicas semejantes a interferón humano se describe. En una modalidad el polinucleótido comprende una secuencia de ncleótido cuando menos 93% idéntica a SEC ID No: 1. En otras modalidades, la secuencia de nucleótido es cuando menos 95% idéntica o cuando menos 98% idéntica a SEC ID No: 1. En una modalidad, la invención comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste en proteínas cada una teniendo una secuencia de aminoácido cuando menos 85% idéntica a SEC ID No: 2. De preferencia, la proteína no ocurre naturalmente y tiene actividad antiviral y antiproliferante mejoradas en comparación con interferón humano alfa 2b (HulFN-a2b) . Por ejemplo, la proteína puede tener actividad antiviral cuando menos 10 veces mayor que HulFN-a2b. En modalidades particulares, la secuencia de aminoácido de proteína es cuando menos 90% idéntica o cuado menos 95% idéntica a SEC ID No. 2. La invención abarca vectores recombinantes que comprenden la secuencia del polinucleótido y células huésped que contienen los vectores. La invención también abarca fragmentos de polipéptido que exhiben actividades biológicas semejantes a interferón humano. La invención además incluye construcciones de proteína y otras composiciones que exhiben actividades biológicas semejantes a interferón tales como conjugados que comprenden la proteína y otra fracción, tal como un polímero inorgánico. La invención incluye además métodos y usos de la proteína y las composiciones para propósitos terapéuticos, por ejemplo como agentes antivirales y contra cáncer. La invención también se puede usar para tratamiento de otras condiciones que responden a terapia de interferón. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra una secuencia de ADN completa que codifica una proteína novedosa de la invención referida en la presente como Novaferon" (SEC ID No.l) (A). La Figura 1 también muestra la secuencia de aminoácido predicha de Novaferon (SEC ID No:2) (B) , y el alineamiento de la secuencia de aminoácido de Novaferon con la secuencia (C) de ADN de Novaferon. El primera minoácidOo, cisteína, en la proteína de Novaferon madura se designa como residuo 1. La Figura 2 muestra alineamiento de secuencia de nucleótido del gene Novaferon con el gene HulFN-al4 (Genebank número: NM_002172) (A) y alineamiento de secuencia de aminoácido de la proteína Novaferon con la proteína HulFN- l4 (traducida Genebank número: NM_002172) (B) . El primer aminoácido, cisteína, en la proteína novaferon madura se designa como residuo 1. El Novaferon comparte aproximadamente 93% de identidad de secuencia (462/498) con HulFN-al4 en el nivel de nucleótido y aproximadamente 87% de identidad de secuencia (144/166) en el nivel de aminoácido. Los nucleótidos divergentes se indican por un molde en la linea media . La Figura 3 muestra alieamiento de secuencia de nucleótido del gene Novaferon con el gene HulFN-a2b (Genebank número: N _000505) (A) y alineamiento de secuencia de aminoácido de la proteina Novaferon con la proteina HulFN- 2b (traducida de gene HulFN-a2b con Genebank número: NM_0' 00605) (B) . El primer aminoácido, cisteina, , en la proteina Novaferon madura se designa como residuo 1. El Novaferon comparte aproximadamente 89% de identificad de secuencia (455/498) con HulFN-a2b en el nivel de nucleótido y aproximadamente 81% de identidad de secuencia (135/166) en el nivel de aminoácido. Los nucleótidos divergentes se indican por un molde en la linea media. La Figura 4 es una gráfica que muestra inhibición antiproliferante in Vitro de células de Daudi mediante Novaferon en comparación con HulFN- 2b. La Figura 5 es una gráfica que muestra los efectos contra tumor in vivo de Novaferon y HulFN-a2b en ratón desnudo con xenoinjertos de PC3- de cáncer de próstata humano. La Figura 6 es una gráfica que muestra los efectos de contra tumor en vivo de Novaferon y HulFN-a2b en ratones desnudos con xerografías de Hpe-G2 de cáncer de hígado humano. La Figura 7 es una gráfica que muestra los efectos contra tumor in vivo de Novaeron y HulFN- 2b en ratones desnudos con xenoinjertos de melanoma A-375 humano. La Figura 8 es una gráfica que muestra los efectos contra tumor in vivo del Novaferon y HulFN-a2b en ratones desnudos con xenoinjertos de cáncer de colon LS 180. La Figura 9 es una gráfica que muestra los efectos contra tumor in vivo de Novaferon y HulFN- 2b en ratones desnudos con xenoinjertos de leucemia humana HL 60 (S). Descripción Detallada A través de la siguiente descripción, se exponen detalles específicos a fin de proporcionar un entendimiento más completo de la invención. Sin embargo, la invención se puede practicar sin estos particulares. En algunos casos, elementos bien conocidos no se han mostrado ni descrito con detalle para evitar oscurecer innecesariamente la invención. Consecuentemente, la especificación y dibujos deben considerarse en un sentido ilustrativo, más bien que uno restrictivo. Definición de Términos Antes de describir la presente invención con detalle, se debe entender que esta invención no está limitada a las moléculas de proteína particulares, metodología, protocolos, líneas de célula, vectores y reactivos descritos ya que tales pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que se limitará únicamente por las reivindicaciones anexas. A fin de hacer que la invención descrita en la presente se entienda más completamente, se emplean los siguientes términos, y se pretende que se definan como se indica bajo. Se debe entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no se pretende limitar el alcance de la presente invención que se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen los mismos significados como se entienden comúnmente por uno de experiencia ordinaria en el ramo al que pertenece esta invención. Todas las publicaciones mencionadas en la presente se incorporan en la presente por referencia con él propósito de describir y exponer las lineas de célula, vectores, y metodologías que se reportan en las publicaciones y que se pueden usar en conexión con la invención. Nada en la presente se debe considerar como una admisión de que la invención no tiene derecho a antefechar dichas exposiciones en vista de invención anterior. El término "interferón" se refiere a una familia de proteínas secretadas producidas por una variedad de células eucarióticas durante exposición a diversos estímulos ambientales, incluyendo infección de virus o exposición a un mitógeno. Además de tener propiedades antivirales, los infeferones han mostrado que afectan una amplia variedad de funciones celulares. Todas las unidades de interferón se expresan en la presente con referencia a normas internacionales WHO 94/786 (consenso de rHulFNa) y 95/650 (rHuFN-a2a) . El término "semejante a interferón" se refiere a particularidades funcionales y/o estructurales exhibidas por o similares a interferones conocidos o análogos de interferón. Por ejemplo, "actividades biológicas semejantes a interferón" incluye actividades antivirales y antiproliferantes. Otros ejemplos de actividades biológicas semejantes a interferón se describen en la presente y se entenderán por una persona experta en el ramo. El término plural "actividades" incluye el término singular "actividad"; es decir, la invención abarca proteínas recombinantes u otras construcciones de proteína o composiciones que exhiben cuando menos una actividad semejante a interferón. El término "interferón de consenso" se refiere a un tipo de interferón sintético que tiene una secuencia de aminoácido que es un promedio aproximado de las secuencias de todos los subtipos de interferón alfa humano conocidos . Se ha reportado que interferón de consenso tiene una actividad superior (alrededor de 5 veces) antiviral, de antiproliferación y activación de célula NK ue cualquier subtipo de IFN-a humano natural. El término "aislado" como se usa en la presente se refiere a moléculas, tales como ADN o RNA, que se ha removido de su ambiente nativo. Por ejemplo, las moléculas de ADN recombinantes contenidas en un vector se consideran aisladas para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de moléculas de ADN aisladas incluyen moléculas de ADN recombinantes mantenidas en células huésped heterólogas o moléculas de ADN purificadas (parcial o substancialmente) en solución. ADN asilado también incluye moléculas de ADN recuperados de una librería que puede contener fragmentos de ADN naturales o artificiales de interés, asi como ácidos nucleicos químicamente sintetizados. Los ácidos nucleicos aislados, por lo tanto se pueden producir de manera recombinante. El término "secuencia de nucleótido" se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende un oligonucleótido, polinucleótido o molécula de ácido nucleico, y fragmentos o porciones de los mismos. En el caso de una molécula de ADN, la secuencia puede comprender una serie de deosiribonucleótidos y en el caso de una molécula de RNA la secuencia puede comprender una serie de ribonucleótidos correspondientes. El oligonucleótido, polinucleótido o molécula de ácido nucleico pueden ser de hebra sensilla o doble, y la secuencia de nucleótido puede presentar la hebra de sentido o contrasentido. El término "fragmento de oligonucleótido" o un "fragmento de polinucleótido", "porción", o "segmento" o "sonda" o "imprimador" se usan intercambiablemente y hacen referencia a una secuencia de residuos de nucleótido que son cuando menos alrededor de 5 nucleótidos de longitud. De preferencia, los fragmentos se pueden usar para hibridizar a una secuencia de ncuelótido de meta. Un imprimador sirve como un punto de inicio para polimerización de nucleótido catalizada por ya sea polimerasa de ÁDN, polimerasa de RNA o transcriptasa de reversa. Un fragmento o segmento puede identificar de manera única dada secuencia de polinucleótido de la presente invención. De preferencia el fragmento comprende una secuencia substancialmente similar a SEC ID NO: 1. Los términos "proteina" o "péptido" u "oligopéptido" o "polipéptido" se refieren a moléculas que ocurren naturalmente o sintéticas que comprenden una secuencia de aminoácidos. El termino "cuadro de lectura abierta" u ORF, significa una serie de tripletas de nucleótido que codifican por aminoácidos in ningún codón de terminación y usualmente denota una secuencia trasladable hacia una proteina. El término "secuencia de codificación de proteina madura" se refiere a una secuencia que codifica una proteina péptido sin una señal o secuencia delantera. La proteina puede haber sido producida procesando en la célula que elimina cualquier secuencia delantera/de señal. La proteina se puede producir sintéticamene o usando un polinucleótido que codifica solamente la secuencia de codificación de proteina madura. Los términos "purificado" o "substancialmente purificado" como se isan en la presente significa que la proteina indicada está presente en ausencia substancial de otras macromoléculas biológicas, v.gr., otras proteínas, polipéptidos y lo semejante. La proteína se purifica de manera que constituye cuando menos 95% en peso de las macromoléculas biológicas indicadas presentes (pero agua, tampones, y otras moléculas pequeñas, especialmente moléculas que tienen un peso molecular de menos de 1000 daltons, pueden estar presentes) . El término "vehículo o vector de expresión recombinante" se refiere a un plásmido o fago o virus o vector, para expresar una proteína de una secuencia de ADN (RNA) . Un vehículo de expresión puede comprender una unidad de transcripción que comprende n conjunto de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en expresión de gene, por ejemplo, promotores o mejoadores, (2) una secuencia estructural o de codificación que se transcribe hacia mRA y se traslada a proteína, y (3) secuencias de inicio y terminación de transcripción apropiadas. Las unidades estructurales pretendidas para uso en levadura o sistemas de expresión eucariótica de preferencia incluyen una secuencia delantera que permite la secreción extracelular de proteína trasladada por una célula huésped. Alternativamente, cuando la proteina recombinante se expresa sin una secuencia delantera o de transporte, puede incluir un residuo de metionina amino terminal. Este residuo puede ser o no subsecuentemente separado de la proteina recombinante expresada para proporcionar un producto final. El término "similitud substancial" se refiere a ácido nucleico o fragmento del mismo que tiene un grado elevado de identidad de secuencia con otro ácido nucleico cuando se alinea de manera óptima con el otro 'cido nucleico o su hebra complementaria. La identidad de secuencia u homología se puede determinar usando software de análisis de secuencia, por ejemplo, BLASTIN. Un primer ácido nucleico se considera que es substancialmente similar a un segundo ácido nucleico si muestran identidad de secuencia de cuando menos alrededor de 85 - 95% o mayor cuando están alineados de manera óptima. Por ejemplo, para determinar identidad u homología de secuencia entre dos ácidos nucleicos diferentes, el BLASTIN que programa "2 secuencias BLAST" se usa. Este programa está disponible para uso público del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (69) . Por vía de ejemplo no limitativo, estas comparaciones se pueden hacer usando el software ajustado para ajustes de falla (esperar=10, filtro=falla, espacio abierto = 5, espacio de extensión = 2 penalidades, espacio x caida = 50) - Asimismo, una primera proteina o polipéptido se considera que es substancialmente similar a una segunda proteina o polipéptido si muestran identidad de secuencia de cuando menos alrededor de 85%-95% o mayor cuando se alinean de manera óptima y se comparan usando software BLAST (blastp) usando ajustes de falla. Por vía de ilustración adicional, un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido cuando menos, por ejemplo 95% "idéntica" a una secuencia de nucleótido de referencia que4 codifica una proteina, significa que la secuencia de nucleótido del polinucleótido es idéntico a la secuencia de referencia, excepto que la secuencia de polinucleótido puede incluir hasta cinco mutaciones de punto por cada 100 nucleótidos. De la secuencia de nucleótido de referencia que codifica la proteína. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótido cuando menos 95% idéntica a una secuencia de nucleótido de referencia, hasta 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede omitir o substituir con otro nucleótido. O un número de nucleótidos hasta 5% e los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar hacia la secuencia de referencia. Los términos "complementario" o "complementariedad" como se usan en la presente, se refieren al enlace natural de polinucleótidos bajo condiciones permisibles de sal y temperatura mediante emparejamiento de base. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" se liga a la secuencia complementaria "T-C-A". La complementariedad entre dos moléculas de hebra sencilla puede ser "parcial", en donde solamente algunos de los ácidos nucleicos se enlazan, o puede ser completa cuando la complementariedad total existe entre las moléculas de hebra única. El grado de complementariedad entre hebras de ácido nucleico tiene efectos significativos sobre la eficacia y resistencia de hibridización entre hebras de ácido nucleico. Esto es de importancia particular en reacciones de amplificación, que dependen del enlace entre ls hebras de ácido nucleico. El termino "transformación" significa introducir ADN en un organismo de modo que el ADN sea replicable, ya sea como un elemento extracromosomal, o mediante integración de cromosoma. El término "transfección" se refiere a la toma de un vector de expresión por una célula huésped apropiada, ya sea o no que cualesquiera secuencias de codificación están de hecho expresadas. Los términos "tratamiento", "tratar" y equivalentes gramaticales de los mismos, se usan en el sentid más amplio e incluyen tratamiento terapeútico, prevención, profilaxis y mejora de ciertos síntomas o condiciones no deseados. El . termino "actividad biológi9ca" y "actividades biológicas" como se usan en la presente, se refieren a funciones estructurales, reguladoras, químicas u otras biológicas en sistemas vivos, por ejemplo similares o idénticas a moléculas que ocurren naturalmente o no naturalmente. El término "anti-proliferación" y "antiproliferante" como se usan en la pressnte se refieren a hacer lento y/o prevenir el crecimiento y división de células que resulta en la reducción del número total de células y/o reducción del porcentaje de las células de meta en cualquier5a o todas las fases de ciclo de célula. Las células se puede especificar adicionalmente como siendo arrestadas en una etapa de ciclo de célula particular: GI (Espacio 1) fase S (síntesis de ADN) , G2 (Espacio 2) o fase M (mitosis) . El término "actividad anti-proliferante" como se usan en la presente se refiere a la actividad de una proteína, construcción de proteína, o composición que inhibe la proliferación de célula, especialmente célula neoplástica proliferante, v.gr., células de cáncer, ya sea in Vitro o in vivo .

El término "IC50", o la "concentración inhibitoria máxima media", representa la concentración de un inhibidor, tal como una proteína, que se requiere para 50% de inhibición de crecimiento de célula in Vitro. Los términos "antiviral" y "antivirus" · como se usan en la presente se refieren a hacer lento y/o prevenir infección de virus de células o interferir con la réplica de virus en células in Vitro y/o in vivo, resultando en reducción de velocidad o detención de propagación de virus, o reducción en el numero total e partículas de virus. La actividad "antiviral" como se usa en la presente significa la actividad de una proteína, construcción de proteína o composición que inhibe las infecciones virales o interfiere con réplica viral, ya sea in Vitro y/o in vivo. Proteína Novaferón La presente invención se relaciona con la preparación y caracterización de una proteína semejante a interferón humano novedosa, referida en la presente como "Novaferón"101, Como se describe con detalle abajo, la proteína Novaferón exhibe actividades biológicas antivirales y antiproliferantes mejoradas en comparación con HulFN- 2b que ocurre naturalmente como se mide en pruebas in Vitro convencionales. En particular, la proteina Novaferón muestra un aumento de 12.5 veces en actividad antiviral cuando se prueba en un sistema Wish-VSV, y alrededor de 400 veces de mejora en una inhibición antiproliferante de crecimiento de célula Daudi en comparación con HulFN-a2b en los mismos sistemas de prueba. En una modalidad, la proteina Novaferon se codifica mediante un polinucleótido que consiste de 498 nucleitods como se muestra en SEC ID No: 1 y la Figura 1(A). La proteina Novaferon madura consiste de 266 aminoácidos como se muestra en SEC ID No: 2 y Figura 1(B). Las secuencias de polinucleótido y aminoácido y variantes de las mismas que están abarcadas por al invención se describen con mayor detalle abajo. Para propósitos de comparación, la homología de Novaferon con HulFNs que ocurre naturalmente se exploró por los inventores. Las investigaciones de BLAST revelaron que Novaferon tiene la homología más elevada a HulFN-al4 en ambos niveles de nucleótido y aminoácido. Como se muestra en la Figura 1, la secuencia de polinucleótido (SEC ID No. 1) que codifica Novaferon tiene una homología de aproximadamente 93% (462/498) a HulFN-al4 y la secuencia de aminoácido tiene una homología de aproximadamente 87% (144/166) a HulFN-al4. En comparación a Holón-a2b, el producto de interferón humano más ampliamente usado, la homología es aproximadamente 89% en el nivel de nucleótido (445/498) y aproximadamente 81% (135/166) en el nivel de aminoácido, como se muestra en la figura 3. Con respecto a IFN alfacon-1 (interferón de consenso) . El Novaferon tiene aproximadamente 91% de identidad de secuencia en el nivel de nucleótido (453/498) y aproximadamente 84% de identidad de secuencia e el nivel de aminoácido (140/166) . Como se describe con detalle en la sección experimental abajo, la secuencia de polinucleótido (SED ID No. 1) se selección de una librería dee mezclado de ADN de interferón humano Tipo I. brevemente, la proteína Novaferon se produjo mediante transfección de células huésped con un vector recombinante que contiene la secuencia de polinucleótido completa de SEC ID No. 1. La proteína Novaferon contenida en el sobrenadante de la línea de célula huésped se purificó y mostró exhibir actividades biológicas semejantes a interferón humano, tales como funciones antivirales y antiproliferantes. Polinucleótido y variantes La secuencia de polinucleótido noveosa/molécula de ácido nucleico de la presente invención consiste de 498 nucleótidos como se muestra en la Figura 1 (SEC ID No. 1) .

Usando la información proporcionada en la presente, dicha secuencia de nucleótido, una molécula de ácido nucleico e la presente invención que codifica una proteina Novaforma (SEC ID No. 2) se puede obtener mediante expresión recombinante, síntesis química o usando otros procedimientos de biología molecular convencionales, tales como aquellos para mutagénesis de ADN. La invención, además de la molécula de ácido nucleico aislada (SEC ID No. 1) también incluye moléculas de ADN que son diferentes de la secuencia de ADN descrita en SEC ID No. 1, pero, debido a la degeneración del código genético, todavía codifican la misma o substancialmente la misma secuencia de aminoácido de la proteína Novaferon (SEC ID no. 2) . Los códigos genéticos y especies de preferencias de codón específicas son bien conocidas en el ramo. De esta manera, sería rutina para un experto en el ramo generar las variantes de degeneración de secuencias de ADN diferentes a la secuencia de ADN de SEC ID No. 1, por ejemplo, para optimizar la expresión de codón para un huésped particular (v.gr., para cambiar codones en el mRNA humano a aquellos preferidos por un huésped bacteriano tal como E. coli) . La invención proporciona además una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de nucleótido mostrada en la Figura 1 (SEC ID No. 1), de una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria a la secuencia de ácido nucleico en SEC ID No. 1. La presente invención también proporciona información acerca y se relaciona con los vectores recombinantes, que incluyen las moléculas de ácido nucleico aisladas de la presente invención, y las células huésped que contienen los vectores recombinantes, así como los métodos para hacer dichos vectores y crear células huésped que expresan la proteína Novaferon, y usar las células huésped para la producción de Novaferon mediante técnicas recombinantes. Basado en la secuencia de ácido nucleico de la presente invención (SEC ID No. 1, Figura 1(A), la invención abarca moléculas de ácido nucleico que son substancialmente ^ similares a las mismas, tales como ácidos nucleicos que tienen cuando menos alrededor de 85 - 95% o identidad de secuencia mayor a SEC ID No. 1 cuando se alinean de manera óptima. Por ejemplo, en un aspecto los ácidos nucleicos que t5ienen 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de nucleótido mostrada en SEC ID No. 1 están dentro del alcance de la invención, independientemente de si codificación proteínas o polipéptidos que tienen actividades biológicas similares a Novaferon (dichas actividades incluyen pero no están limitadas a funciones mejoradas antivirales, antiproligerantes y contra tumor en comparación con HulFNs) . Estas moléculas de ácido nucleico se podrían usar, por ejemplo, como sondas para la detección de mRNA en células ya transfectadas con un vector que contiene la secuencia de nucleótido de la presente invención para la producción de Novaferon. En otras palabras, estas secuencias de ácido nucleico cuando menos alrededor de 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a la secuencia mostrada en SEC ID No. 1 s3e podrían usar como marcadores para determinar la expresión de los genes heterologos en una célula huésped. Además. L invención incluye un polinucleótido que comprende cualquier porción de cuando menos alrededor de 30 nucleótidos contiguos, de preferencia cuando menos alrededor de 50 nucleótidos contiguos, de SEC ID No. 1. Más generalmente, este invención incluye y cubre los fragmentos de cualquiera y todas las moléculas de ácido nucleido aisladas que son idénticas a la ( ) secuencias parciales de la secuencia de nucleótido mostrada en la figura 21 (SEC ID No. 1) . En una modalidad dichos fragmentos pueden ser cuando menos alrededor de 15 nucleótidos de longitud y son útiles como sondas de diagnóstico e imprimadores como se discute en la presente- Además, esta invención incluye y cubre fragmentos mayores que son aproximadamente 50 nucleótidos o más largos en longitud. Además de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID No. 1 que codifica la proteina Novaferon, la presente invención también incluye pero no está limitada a secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácido de la proteina Novaferon completa junto con aminoácidos extra/péptidos/polipéptidos, por ejemplo, una secuencia conductora de secreción añadida. También se incluyen en la invención las secuencias de ácidos nucleicos que tienen la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID No. 1 asi como secuencias de no codificación adicionales, incluyendo, por ejemplo, pero no limitado a, intrones e secuencias 5' y 3' de no codificación, tal como las secuencias transcritas, no trasladadas que juegan un papel en la transcripción, procesamiento de mRNA (es decir, división y señales de poliadenalinación, enlace de ribosoma y estabilidad de mRNA) , y secuencias de codificación adicionales que codifican aminoácidos adicionales con o sin funcionalidades . La presente invención se relaciona además con las variantes de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención (SEC ID No. 1), que codificación porciones, análogos o derivados de la proteína Novaferon. Las variantes se pueden obtener tamizando una libraría de mezclado de interferón o usando técnicas de mutagénesis y/o otras técnicas conocidas descritas en el ramo. Como se explica arriba, estas variantes pueden incluir aquellas producidas por inserciones, omisiones o substituciones de nucleótido. Las inserciones, omisiones o substituciones pueden involucrar uno o más nucleótidos . Estas mutaciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótido de referencia o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, interpuesta ya sea individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. Las alteraciones pueden producir substituciones, omisiones o adiciones de aminoácido conservadoras o no conservadoras. Especialmente preferida entre estas están las substituciones, adiciones y/u omisiones silenciosas, que no alteran las propiedades y actividades de la proteína Novaferon o porciones de la misma. También especialmente preferidas a este respecto son substituciones conservativas . ün aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende un polinucleótido que t6iene una secuencia de nucleótido cuando menos 93% idéntica y más preferentemente al menos 95%, 96%, 97%, 989% o 99% idéntica a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de: (a) una secuencia de nucleótido que codifica la proteina Novaferon que tiene la secuencia de aminoácido completa en SEC ID No. 2 (es decir, posiciones 1-166 de SEC ID No. 2); y (b) una secuencia de nucleótido que codifica un fragmento biológicamente activo de la proteina de (a) ; y (c) una secuencia de nucleótido complementaria a cualquiera de las secuencias de nucleótido en (a) i (b) anteriores. Debido a la degeneración del código genético, uno con experiencia ordinaria en el ramo reconocerá inmediatamente que un número grande de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de cuando menos alrededor de 93%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de ácido nucleico de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 1 (sec id No: 1) codificará una proteina que tiene actividad similar o idéntica a la proteina Novaferon. De hecho, puesto que las variantes de degeneración codificarán la misma proteina, esto será evidente al artesano experto aún sin realizar un ensayo de comparación. Se reconocerá además en el ramo que para dichas moléculas de ácido nucleico que no degeneran variantes , un número razonable también codificará una proteina que tiene actividades biológicas semejantes a interferón. Esto es debido a que el artesano experto conoce completamente las substituciones de aminoácido que son ya sea menos probables y no probables de afectar significativamente la función de proteina (v.gr., reemplazar un aminoácido alifático con un segundo aminoácido alifático) , como se describe adicionalmente más adelante. Por ejemplo, la gui8a relacionada con como hacer substituyentes de aminoácido fenotipicamente silenciosos se proporciona por Ho le y col (70), en donde los autores indican que muchas proteúnas son tolerantes de substituciones de aminoácido. Variantes y construcciones de proteina y polipéptido La presente invención abarca la proteína Novaferon de SEC ID 2 y proteínas o variantes de polipéptido que son substancialmente similares a las mismas, tales como proteínas que no ocurren naturalmente que tienen cuando menos 85 - 95Q% o más de identidad de secuencia de aminoácido a SEC ID No. 2. Por ejemplo las proteínas que no ocurren naturalmente que tienen cuando menos alrededor de 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido mostrada en SEC ID No: 2 están dentro del alcance de la invención. Además, la proteína Novarferon de la invención se puede modificar estructuralmente fundiéndola a otras proteínas o fragmentos de proteína u otras moléculas para el propósito de mejorar sus funciones y propiedades. Los ejemplos incluyen pero no están limitados a fundirla a otras proteínas/fragmentos de proteína para aumentar su expresión o para estabilizar adicionalmente la proteína Novaferon. En una modalidad, la secuenci8a de ácido nucleico que codifica Novaferon y/o proteínas de Novaferon de la invención se pueden etiquetar con ja etiqueta distinta a la entablillada. "Etiquetada" en la presente significa que un compuesto de la secuencia de ácido nucleico (SEC ID No: 1) o la proteína Novafreron (SEC ID No: 2) se ha fijado con cuando menos un elemento, isótopo u otros químicos (etiquetas) para permitir la drección del compuesto. En general, las etiquetas quedan en tres clases. A) etiquetas isotópicas, que pueden ser radioactivas o isótopos pesados, b) etiquetes inmunes, que pueden ser anticuerpos o antígenos; y c) tintes coloreados o fluorescentes. Las etiquetas se pueden incorporar en el compuesto en cualquier posición. Una vez hecha, la proteína Novaferon también se puede modificar covalentemente. Un tipo de modificación covalente incluye tratar la proteína Novaferon con un agente de derivación orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas de los residuos N- o C-terminales de la proteina Noveferon. La derivación con agentes bifuncionales es útil, por ejemplo, para reticular la proteina Novaferon a una matriz de soporte sinoluble en agua o superficie para uso en la purificación de anticuerpos contra novaferon o ensayos de tamizado. Los agentes de reticulación com' unmente usados incluyen 1,1-bis (diazoacretil) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida (por ejemplo, ésteres con ácido 4-azodosalicilico) , imidoésteres homobiuncionales incluyendo ésteres de disuccinimidilo tal como 3,k3'-ditiobis (succinimidilfropionato) , maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano y agentes tales como metil-3- ( [ (p-azidofenil)ditio]propiolmidato. Otras modificaciones de la proteina Novaferon incluyen: desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo a los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente; hidroxilación de prolina y lisina; fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo; mutilación de los grupos -amino de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina (71) ; acetilación de amina N-terminasl; y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Otro tipo de modificación covalente de la proteian Novarferon de la presente invención comprende alterar el patrón de glicosilación nativo de la proteína. Esto se puede lograr, por ejemplo, (1) omitiendo y/o añadiendo una o más fracciones de carbohidrato encontradas en la secuencia nativa de la proteína Novaferon, o (2) añadiendo y/u omitiendo uno o más sitios de glicosilación que no existen en la secuencia nativa de la proteína Novaferon. La adición de sitios de glicosilación a proteína Novaferon se puede lograr alterando la secuencia de aminoácido de la proteína Novaferon. La alteración se puede hacer, por ejemplo, mediante la adición de, o substitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia nativa de la ptoteína Novaferon (los sitios de glicosilación enlazados a O) . La alternación de la secuencia de aminoácido de la proteína Novaferon se podría lograr a través de cambios en el nivel de ADN, particularmente mutando la secuencia de ADN que codifica la proteína Novaferon en bases de nucleótido previamente seleccionadas de modo que los codones alterados se traduzcan a los aminoácidos deseados. Otro medio para aumentar los números de fracciones de carbohidrato en la proteína Novaferon es mediante copulación química o enzimática de glicósidos a la proteína. Estos métodos se describen en el ramo, por ejemplo, tan temprano como 1981. Aplin JD y Wriston JC Jr describieron la preparación, propiedades y aplicaciones de conjugtados de carbohidrato de proteínas y lípidos (72) . La remoción de fracciones de carbohidrato presentada en la proteína Novaferon se puede lograr química o enzimáticamente o mediante substitución de mutación de los codones que codifican los residuos de aminoácido que sirven como metas para glicosilacion. Las técnicas de desglicosilación química son conocidas en el ramo y se describen, por ejemplo, por Edge AS y col. (73) . La separación enzimática de fracciones de carbohidrato en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedade de endo- y exo-glicosidasas como se describe por Thotakura y col. (74). Estas construcciones derivadas pueden incluir fracciones que mejoran la solubilidad, absorción, permeabilidad a través de la arrera de cerebro de sangre, vida media biológica, etc. Estas fracciones o mdoficiaciones de proteína Novaferon alternativamente pueden eliminar o atenuar cualesquiera efectos laterales indeseables posibles de la proteína y lo semejante. Las fracciones capaces de mediar estos efectos se describen, por ejemplo, en Remingtpn: The Science and Practice of Pharmacy. (75) . Otro tipo de modificación covalente de Novaferon comprende enlazar la proteína Novaferon a uno e una variedad de polímeros no proteináceos, v.gr., polietilenglicol, polipropilenglicol, o polioxialquilenos, por ejemplo en la forma expuesta en las Patentes de EUA Nos. 4,640,835(76), 4,496,689(77); 4,791,192(78) o 4, 179, 337 (79) . Además, la proteína Novaferon de la presente invención también se puede modificar en una manera para formar moléculas quiméricas que comprenden una proteina Novaferon fundida a otro polipéptido heterólogo o secuencia de aminoácido. En una modalidad, dicha molécula quimérica comprende un compuesto de fusión de una proteína Novaferon con un polipétido de etiqueta que proporciona un epítope al que un anticuerpo contra etiqueta se puede ligar selectivamente. La etiqueta de epítope generalmente se coloca en el término amino o carboxilo de la proteína Novaferon. La presencia de dichas formas etiquetadas de epítope forma una proteína Novaferon que se pude detectar usando un anticuerpo contra el polipéptido de etiqueta. Asimismo, la provisión de la etiqueta de epítpe permite a la proteína Novaferon ser purificada fácilmente mediante purificación de afinidad usando un anticuerpo contra etiqueta u otro tipo de matriz de afrinidad que se liga a la etiqueta de epitope. En una modalidad alternativa, la molécula quimérica puede comprender un compuesto de fusión de una proteina Noaferon con una inmunoglobulina o una región/fragmjento particular de una inmunoglobulina. Por ejemplo, para formar una forma bivalente de la molécula quimérica, la proteina Novaferon se podria fundir a la región gFe de una molécula IgG. Varios polipéptidos de etiqueta y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en el ramo. Ejemplos incluyen poli-hisitidna (poli-his) o etiquetas de poli-histidina-ñglicina (poli-his-gly) ; el plipéptido de etiquta flu HA y su antiuerpo 12CA5 (80) ; los anticuerpos de etiqueta c-myc y los 8F9,k 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E19 a la misma (81); y la etiqueta D (gD) ( de glicoproteina de virus de Herpes Simplex y su anticuerpo (82) . Otros polipéptidos de etiqueta incluyen la Bandera-péptido (83); péptido de epitope de tubulina (84) yt la etiqueta de péptido de 10 proteina de %7 gene (85) . Adicionalmente, la proteina Novaferon de la presente invención se puede producir mediante procedimientos sintéticos químicos conocidos por aquellos de experiencia ordinaria en el ramo. Por ejemplo, los polipéptidos hasta alrededor de 80-90 residuos de aminoácido en longitud se pueden producir en un modelo 433a sintetizador de péptido comercialmente disponible (Applied Biosystems, Inc., Foster, City, CA EÜA) . Ademés los péptidos químicamente sintetizados más largos de hasta 120 residuos también están comercialmente disponibles, por ejemplo, de Bio-synbthesis, Inc. Lweisville, TX EUA) . De esta manera, como se apreciará fácilmente, la proteína Novaferon madura de longitud completa se pede producir sintéticamente (por ejemplo, en fragmentos que luego se pueden conectar juntos. Por lo tanto, la proteína Novaferon de la presente invención (SEC ID No: 2) incluye todas las preparaciones de proteína y polipéptido y construcciones que tiene la misma secuencia de aminoácido descrita en SEC ID No: 2, a pesar de si estas proteínasw Novaferon y derivados de proteína se producen mediante procedimientos químicamente sintéticos, y/o mediante técnicas recombinantes de células huésped procarióticas o eucarióticas u otras células y huéspedes, incluyendo pero no limitado a células baterianas, levaduras, plantas, insectos y de mamífero. Dependiendo de los huúespedes empleados en un método de reproducción de recombinante, las proteínas de la presente invención pueden ser glicosadas o no glicosadas, pegiladas o no pegiladas. Además, las proteínas de la invención tambié pueden incluir un residuo de metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de procesos mediados por huésped. De esta manera, es bien sabido en el ramo que la metionina N-terminal codificada por el codón de iniciación de traslación generalmente se remueve, con eficiencia elevada, de cualesquiera proteínas después de la traslación en todas las células eucarióticas . Mientras que la metionina N-terminal en la mayoría de las proteínas también se remueve eficientemente en la mayoría de las procariotas, para algunas proteínas este proceso de remoción procariótica es ineficiente, dependiendo de la naturaleza del aminoácido al que la metionina N-terminal está covalentemente enlazada. Producción La presente invención también se relaciona con los vectores recombinantes que consisten de las moléculas de ADN aisladas de la presente invención, a células huésped que se hacen/transfectan genéticamente con los vectores recombinantes, y con la producción de la proteína Novaferon o fragmentos de la misma mediante técnicas recombinantes . El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, fago, vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser réplica competente o réplica defectuosa. En el último caso, la propagación viral generalmente ocurrirá solo en células huésped de complemento. Los ejemplos que describen en la producción de Novaferon se exponen abajo. Los vectores preferidos para la expresión de la proteina Novaferon de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, vectores que comprenden regiones de control de accionamiento cis efectivas para expresión en un huésped operativamente enlazado al polinucleótido que se va a expresar. Los factores de accionamiento trans apropiados se suministran ya sea por el huésped, por un vector de complemento o por el propio vector durante introducción al huésped. La secuencia de ácido nucleico descrita en la presente invención (SEC ID No:l) se puede enlazar operativamente a un promotor apropiado. "Promotor" en la presente significa cualesquiera secuencias de ácido nucleico capaces de enlazar polimerasa de NA e iniciar una transcripción extrón (usualmente en la corriente abajo (3' ) ) de la secuencia de codificación para la proteina Novaferon hacia mRNA. Un promotor bacteriano tiene una región de inicio que usualmente se coloca próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación. Esta región de inicio de transcripción típicamente' incluye un sitio de enlace de polimerasa RNA y un sitio de inicio de transcripción. Las secuencias que codifican enzimas de trayectoria metabólica proporcionan secuencias promotoras particularmente útiles. Ejemplos incluyen secuencias promotoras derivadas de enzimas de metabolización de azúcar, tales como galactosa, lactosa y maltosa, y secuencias derivadas de enzimas biosintéticas tales como triptofán. Los promotores de bacteriófago también se pueden usar y son conocidas en el ramo. Además, los promotores sintéticos y promotores híbridos también son útiles; por ejemplo, el promotor tac es un híbrido de las secuencias de promotor trp y lac. Además, un promotor bacteriano puede incluir promotores que ocurren naturalmente de origen no bacteriano que tienen la capacidad de enlazar polimerasa RNA bacteriana e iniciar transcripción. Los promotores de bacteria preferidos incluyen, pero no están limitados a, E. coli laci, trp, phoA y lacZ, los promotores T3 y T7, el promotor gpt, los promotores lambda PR, PL y el promotor trp. Los promotores eucarióticos tienen una región de inicio de transcripción, que usualmente se coloca próxima al extremo 5' de la secuencia de codificación, y una caja TATA, usualmente colocada 25-30 pares de base (bp) corriente arriba del sitio de inicio de transcripción. La caja TATA se piensa que dirige la polimerasa II de RNA para empezar la síntesis de RNA en el sitio correcto- ün promotor de mamífero también contiene un elemento promotor de corriente arriba (elemento mejorador), típicamente colocado dentro de 100 a 200 pares de base corriente arriba de la caja TATA. Un elemento promotor de corriente arriba determina el régimen al que se inicia la transcripción y puede actuar en cualquier orientación. Son de uso particular como promotores mamíferos los promotores de genes virales de mamífero, puesto que los genes virales frecuentemente son altamente expresados y tienen una escala amplia de huésped. Ejemplos incluyen el promotor temprano SV40, promotor de LTR de virus de tumor mamario de ratón. Los promotores de célula animal preferidos incluyen, pero no están limitados a, promotor tardía principal de adenovirus, promotor de vgirus de herpes simples, y el promotor CMV. Entre los promotores eucarióticos apropiados a este respecto se encuentran el promotor temprano inmediato de CMV, el promotor de factor 1 alfa de alargamiento (EF1A) , el promotor de cinasa de timidina HSV, los promotores temprano y tardío SV40, y los promotores de Lars retrovirales, tales como aquellos del virus de sarcoma de Rous ("RSV") . Las secuencias promotoras preferidas para expresión en levadura incluyen el promotor inducible GAL1710, los promotores de deshidrogenasa e alcohol, enolasa, glucocinasa, isomerasa e glucosa-6- fosfato, gliceraldehido-3-fosfrato-deshidrogenasa, hexaocinasa, fosfofructocinasa, mutasa de 3-fosfoglicerado, cinasa de piruvato, y el gene de fosfatasa ácida. Los vectores para propagación y expresión generalmente también inclu8yen uno o más marcadores seleccionables. Estos marcadores pueden ser apropiados para amplificación o los vectores pueden contener marcadores adicionales para este propósito. A este respecto, los vectores de expresión de preferencia contienen uno o más genes marcadores seleccionables parta proporcionar trazo fenotipico para la selección de las células huésped transíectadas, aún cuando aquellos expertos en el ramo reconocerán que ciertos marcadores seleccionables por sistema se pueden proporcionar en vectores separados. Los marcadores preferidos incluyen, por ejemplo ampicilina (Amp) , tetraciclina (Tet) o genes de resistencia de higromicina (HYG) para cultivar en E. coli y otras bacterias. Los marcadores seleccionables por leadura incluyen ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 y ALG7, que confieren resistencia a tunicamicina; el gene de fosfotransferasa de neomicina, que confiere resistencia a G418; y el gene CUP1, que permite que la levadura crezca en presencia de iones de cobre. Los marcadores seleccionables por célula animal incluyen gene de reductasa de dihidrofolato (DHFR), genes de resistencia a neomicina (Neo) o higromicina (HYG) . Además, los vectores para propagación y expresión comúnmente contienen uno o más sitios para inicio de transcripción, terminación y, en la región transcrita, un sitio de enlace de ribosoma para traslación. La porción de codificación de los transcriptos expresados por las construcciones de preferencia incluye un codón de inicio de traslación al principio y un codón de terminación (UAA, UGA o ÜAG) apropiadamente colocados en el extremo de la secuencia de ADN que se va a trasladar. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño de rutina dentro del nivel de experiencia ordinaria en el ramo. Muchos de estos elementos se describen en la literatura y están disponibles a través de proveedores comerciales. Los siguientes vectores están comercialmente disponibles, y se prefieren para uso en bacterias: pBV220 (86) y sus derivados de CShaghai Sangon: serie pQE de Qiagen: vectores pET de Qiagen; vectores pBS, vectores de Fagoescripto, vectores Bluescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A de Stratagene; y ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos se encuentran los vectores pCI de Promega, vectores pcAD de Invitrogen, pSV2CAT, pOG4 , pXTl y pSG de Stratagene; y pSVK3, Pbpv, Pmsg Y Psvl DE Pharmacia. Estos vectores se enumeran únicamente como ejemplos para demostrar que muchos vectores comercialment5e disponibles y bien conocidos están disponibles a aquellos de experiencia en el ramo para uso en la producción de la proteina Novaferon descrita en la presente invención mediante métodos genéticos/recombinantes . En ciertas modalidades preferidas a este respecto, los vectores proporcionan medios para expresión especifica. Esta expresión especifica puede ser expresión injducible o expresión solamente en ciertos tipos de células o pueden ser ambos inducibles y específicos de célula. Particularmente preferidos entre los vectores inducibles están los vectores que se pueden inducir para expresar mediante factores ambientales que son fáciles de manipular, tales como temperatura y aditivos nutrientes. Una variedad de vectores apropiados para esta aplicación, incluyendo vectores consti5tutivos y de expresión inducible para uso en huéspedes procarióticos y eucarióticos son bien conocidos y se emplean rutinariamente por aquellos de experiencia en el ramo. El vector que contiene la secuencia de ADN descrita en SEC ID No: 1, por ejemplo, asi como un promotor apropiado, y otras secuencias de control apropiadas, se pueden introducir, usando una variedad de técnicas conocidas en el ramo, hacia una célula huésped apropiada para la expresión de una proteina deseada. Repreent6ativos de estos huéspedes apropiados incluyen células bacterianas, tales como E. coli, Bacillus subtilis, células de Streptomyces; células de levadura, tales como células de Pichia pastoris; células de insecto, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células de mamífero tales como CHO y COS; y células de planta. Los huéspedes para una gran variedad de construcciones de expresión son bien conocidos, y aquellos de experiencia en el ramo serán capaces, con la información descrita en la presente invención, seleccionar fácilmente un huésped para expresar la proteina Novaferon descrita en SEC ID No. 2. Las células huésped se pueden hacer genéticamente para incorporar polinucleótidos de codificación de Novaferon y expresar proteínas Novaferon de la presente invención. Por ejemplo, los polinucleótidos de codificación de Novaferon se pueden introducir en las células huésped usando técnicas de transfección conocidas en el ramo. Estos métodos se describen en muchos manuales de laboratorio convencionales, tales como aquellos discutidos por Kingston (87) . Los polinucleótidos que codifican Novaferon se pueden introducir/ (transfectar solos o con otros polinuycleótidos . Estos otros polinucleótidos se pueden introducir independientemente, cointroducir o introducir conjuntamente con polinucleótidos de codificación de Novaferon descritos en SEC ID No. 1. Por ejemplo, los polinucleótidos de codificación de Novaferon de la invención se pueden transfectar en células huésped junto con un polinucleótido separado que codifica un marcdador seleccionable para co-transfección y selección del marcador en células de mamífero. Alternativamente, los polinucleótidos que codifican Novaferon se pueden incorporar en un vector que contiene una secuencia de ADN de codificación de marcador seleccionable para inducir la propagación de las células huésped. Las células huésped hechas transíectadas con los vectores que contienen el olinucleótido que codifica novaferon se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales que se pueden modificar específicamente para activar promotores, seleccionar transformadores o amplificar los genes de meta. Las condiciones de cultivo tales como temperatura, pH, etc., se ajust6an y son apropiados para las células huésped seleccionadas para expresar la proteína Novaferon de la presente invención.

Las señales de secreción apropiadas se pueden incorporar y co-expresar con la proteina Novaferon para promover la secreción del polipéptido de proteina tr4asladado hacia el lumen del retículo endoplásmico, hacia el espacio periplásmico o hacia el ambiente extracelular. Purificación Un tipo de célula huésped apropiado usualmente se selecciona para la expresión de la proteína recombinante de meta, dependiendo de la naturaleza de la proteína de meta y la consideración de otras condiciones, tales como los costos de producción, ya sea llevados fácilmente a escala, tamaño de producción industrial, etc. Los clones de las células transfectadas que expresan la proteína de meta con el rendimiento más elevado luego se seleccionan, y el clón final con la expresión óptima se llama la línea de célula que expresa proteína de meta y se usa para la producción de la proteína de meta. La línea de célula que expresa la proteína de meta se desarrolla en un medio que contiene varios nutrientes. Para crecimiento óptimo de las células y/o expresión óptima de la proteína de meta, diversos agentes o condiciones se usan para inducir al promotor selectivo incorporado con la secuencia de cADN de la proteína de meta en el vector transíectado. Si el tipo de célula huésped/sistema de expresión es bacteria, las células cultivadas se cosechan del medio, típicamente mediante centrifugación. Los cuerpos de las células cosechadas se rompen por medios físicos o químicos, y los extractos crudos cosechados, que contienen la proteína de meta sintetizada, se retienen para purificación adicional de la proteína. Los métodos aplicados a la disrupción de las células microbianas incluyen, pero no están limitados a ciclos de congelación-descongtelacion, sonicación, disrupción mecánica o uso de agentes de lisado de célula. Estos métodos son bien conocidos a aquellos expertos en el ramo. Los inventores usaron la bacteria E. coli, como la célula huésped para la expresión de proteína Novaferon recombinante. Como se describe abajo, E. coli se transfectó con el vector que contenía la secuencia de polinucleótido de codificación de Novaferon, y una cepa de E. coli, que tenía la expresión óptima de la proteína Novaferon se seleccionó para la producción de proteína Novaferon. Una vez sintetizada, la proteína se puede retener en el citoplasma como gránulos insolubles, o se puede secretar hacia el citoplasma en forma soluble. En el primer casol, los gránulos se recuperan después de la lisis de los cuerpos de célula, y se desnaturalizan usando, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El nuevo doblado del polipéptido desnaturalizado/proteína Novaferon se obtiene luego diluyendo el desnaturalizado con solución diluida excesiva o mediante diálisis contra uan solución de urea y una combinación de glutationa reducida y oxidada, seguido por diálisis contra una solución de salina tamponada. En el último caso, la proteína se puede recuperar directamente, sin desnaturalizar, del espacio periplásmico en la forma soluble y funcional después de la disrupción de las células cosechadas. Evitando la desnaturalización y los procedimientos de nuevo doblado, la proteína Novaferon soluble no se daña y · no contiene moléculas de proteína deformadas o mal dobladas. Los inventores encontraron que una porción significativa de la proteína Novaferon sintetizada producida en la línea de célula de E. coli se secretó hacia el ditoplasma. Esta porción luego se purificó como se describe abajo. Ensayos de Actividad y Usos Médicos Como se indica arriba, la proteína Novaferon muestra homología de secuencia a muchos miembros de la familia de interferón, en particular a la proteína de interferón trasladada por el mRNA de HulFN-al4 (Figura 2) . HulFN- se ha mostrado que tiene una amplia variedad de actividades biológicas incluyendo actividades antivirales, antiproliferantes y de inmunomodulación (10) . Con dicha homología a HulF -a, el Novaferon se esperaría que exhibiera funciones biológicas similares que HulFN-a, incluyendo, pero no limitado a, la inhibición de proliferación de tumor, actividades antivirales, activación de célula NK y modulación de sistema inmune. Es de importancia particular no solamente la retención de las propiedades funcionales semejantes a HulFN- sino también la potencia mejorada de estas funcionesbiológicas de la proteína novaferon en comparación con HulFN-a. Para verificar y determinar la potencia de sus propiedades funcionales, las actividades biológicas de proteína Novaferon se determinaron de esta manera usando los ensayos in Vitro clásicos y de rutina diseñados para detectar las propiedades antivirales y antiproliferantes. Como se describe en la sección experimental abajo, la potencia in vivo de propiedades antiproliferantes de la proteína Novaferon se observó adicionalmente en modelos animales de varios tipos de cáncer humano y se compararon con HulFN-a así como con un agente contra cáncer químico en algunos experimentos. Muchos ensayos apropiados para determinar las actividades de HulFN son bien conocidos en el ramo. Los inventores emplearon los sistemas de ensayo basados en célula in Vitro para determinar las actividades antivirales y antiproliferantes- Los mismos ensayos in Vitro se usaron para todos los procedimientos y experimentos relacionados con la presente invención, que incluyen pero no están limitados a tamizados de librería de mezclado de gene de interferón Tipo I humano, seleccionando el Novaferon de las proteínas expresadas de la librería de mezclado de gene de interferón de Tipo I humano, y la determinación de las actividades biológicas de la proteína Novaferon recombinante pura. Hay muchos ensayos que miden las actividades antivirales' de las muestras/agentes de prueba oservando el grado de resistencia de células a virus (88) . Tres bioensayos principales se han usado para medir las actividades antivirales de HulFN y sus híbridos. Se clasifican de conformidad con los métodos para determinar los diversos aspectos de virus en células cultivadas. El ensayo para determinar la inhibición de efectos citopáticos inducidos por virus mide el grado de reducción de efectos citopáticos líticos inducidos por virus en las células cultivadas con tratamiento previo de IFN. Este ensayo se puede realizar en placas de 96 pozos (89) , y se ha usado ampliamente para HulFN-a recombinante puesto que proporciona un método sencillo para el tamizado de un número grande de muestras. La inhibición de formación de placa de virus es otro método para cuantificar las actividades antivirales de HulFN en cultivos de tejido. Los resultados de un ensayo de reducción de placa son independientes de la multiplicidad de infección. Además, una reducción del 50% en formación de placa se puede medir con precisión elevada. Usando el virus de estomatitis vesicular ubicuo (VSV) para inducir la formación de placa, por ejemplo, podría determinar el perfil de actividad de especie cruzada de un IFN recombinante particular tamizando un número de lineas de célula de diferentes especies animales (90) . El tercer ensayo se basa en la determinación de la reducción de rendimiento de virus. La producción de virus se mide, usualmente durante un ciclo de crecimiento de célula sencillo, mediante la cantidad de virus liberado. Este ensayo es particularmente útil pa5ra probar las actividades antivirales de IFN contra virus que no ocasionan efectos citopátcos, o que no construyen placas en cultivos de célula de meta. En esta prueba, sin embargo, la multiplicidad de infección afecta el grado de protección inducida por una concentración fija de IFN (91) .

Las actividades antivirales de Novaferon se midieron mediante un ensayo de inhibición de efecto citopático convencional usando células WISH y vgirus de estomatitis vesicular (VSVG) . Las actividades antivirales se determinaron y calibraron usando las muestras de referencia convencionales de normas internacionales WHO : 95/650 (rHulFN- ) y 94/786 (consenso de rHulFN-a)(. Una unidad de actividad antiviral se define como la cantidad de proteina necesaria para lograr 50% de inhibición de los efectos citopáticos de VSV en células cultivadas. Como se describe adicionalmente abajo, la actividad de proteina Novaferon fue 2.5 X 109 Iü/mg, que es alrededor de 12.5 veces mayor que aquella de HulFN-or2b. Estas pruebas demuestran que las propiedades antivirales de Novaferon se mejoran grandemente en comparación con HulFN- 2b. Esta potencia aumentada contra virus, exhibida por la proteina Novaferon, proporciona la ase para una predicción de efectos contra virus mejorados en vivo en humanos. Basados en la naturaleza de HulFNs, es razonable esperar un perfil contra virus muy amplio para Novaferon. En otras palabras, el Novaferon debe ser más potente hacia una amplia escala de virases que el HulFNs natural. La potencia contra virus aumentada de Novaferon se puede traducir en mejores efectos contra virus o mejores efectos terapéuticos en ajuste clínico para pacientes con diversas enfermedades virales . Como se explicó arriba, los IFNs también inhiben la proliferación de célula y exhiben efectos contra tumor potentes a través de una variedad de mecanismos. Varias pruebas de anti-proliferación in vivo se han establecido usando sistemas de cultivo de célula, y están bien descritas en el ramo- La proliferación de célula en estos ensayos se puede medir contando los números de célula; bioensayos de violeta de cristal (92, 93); quimiosensibilidad a tinte rojoneutro (94-96); incorporación de nucleótidos radioetiquet6ados (97); incorporación de 5-bromo-2'-deoxiuridina (Brdü) en el ADN de células de proliferación (98); uso de sales de tetrazolio (99, 100). La línea de célula Daudi limfoblastoide humana es muy sensible al efecto contra proliferación de HulF -a, y su crecimiento en cultivos de suspensión facilita la cuantificación de sus números de célula (101).l Esta línea de célula se ha usado para medir la actividad contra proliferación de HulFN-a e híbridos durante muchos años (102) . Otras líneas de células también se usan para probar la actividad contra proliferación de un agente de prueba. Las actividades anti-proliferantes de proteínha Novaferon se observaron en vivo observando la inhibición del crecimiento de masa de tumor mediante administración de Novaferon a modelos de animal con diversos xenoinjertos de tumor humano. Los efectos contra tumor in vivo de Novaferon se compararon con HulFN-a2b y en algunos modelos de xenoinjerto, con agente contra tumor químico también. Como se describe con detalle abajo, los inventores encontraron que la actividad anti-proliferante in vivo de Novaferon, medida usando método de célula Daudi convencional, fue 400 veces más potentes que el HulFN-a2b natural, que exhibe probablemente las actividades anti-proliferantes más potentes entre todos los HulFNs naturales. La potencia antiproliferante de Novaferon fue amplia y universal, ya que exhibió inhibición más potente o mejorada, que el HulFN-a2b, de todas las líneas de célula de cáncer humana que los inventores probaron in Vitro. Esto indica que la inhibición potente de cáncer humano mediante Novaferon no es selectiva. Aún cuando el grado de sus actividades conhtra-proliferantes mejoradas hacia todos los tipos probados de líneas de célula de cáncer humano variaron, , Novaferon tiene el potencial de ser un agente contra cáncer amplio en instalación clínica. Esto es una ventaja significativa sobre los agentes contra cáncer químicos, anticuerpos monoclonales y otros agentes contra cáncer específicos de meta. Los experimentos de modelo animal de xenoinjerto abajo escritos establecen adicionalmente que: (1) Los dos efectos de anti-proliferación in vivo de Novaferon se mejoraron grandemente o más potentes en comparación con HulFN-a2b (2) Los efectos de anti-proliferación in vivo de Novaferon, a dosis muy inferiores, fueron mejores que el agente químico probado, 5-Fluorouracilo (5FU) en el mismo modelo de xenoinjerto. (3) El novaferon fue capaz de lograr más de 90% de inhibición de crecimiento de cáncer en los modelos de xenoinjerto, pero no indujo pérdida de peso, cambios de actividad y otros efectos laterales negativos en los animales tratados, que fue un contraste agudo con la pérdida de peso significativa y reducción de actividad en los animales tratados con 5-FU. Estos resultados indican que las propiedades antiproliferantes in Vitro e in vivo de Novaferon se mejoran grandemente, comparando con HulFN-a2b natural. La potencia anti-proliferante aumentada de Novaferon se traduce en inhibición efectiva (>90%) de crecimiento de tumor humano en un modelo de animal de ratón, y esta inhibiión parece trabajar muy ampliamente a todos los tipos de cánceres humanos probados y mejores que el agente contra cáncer químico clásico, 5FU. Estos resultados también indican que la potente inhibición de crecimiento de célula de cáncer5 por Novaferon es muy específica hacia la célula de cáncer pero no hacia las células normales como se sustenta por la observación de comida y comportamiento de actividad normales y ninguna pérdida de peso en animales tratados con Novaferon. El Novaferon de esta manera tiene el potencial de trabajar en todos o la mayoría de los cánceres humanos. En una modalidad preferida, la molécula (s) completa o parcial de proteína Novaferon (SEC ID No:2), hecha mediante tecnologías recombinantes usando la secuencia de polinucleótido de SEC ID No. l o químicamente sintetizado se podría aplicar al tratamiento y/o prevención de cualquiera y/o todos los tumores y cánceres de origen humano u origen no humano, en humanos y/o especies no humanas. Estos tumores, por ejemplo, incluyen pero no están limitados a sarcoma osteogénico mieloma múltiple; enfermedad de Hodgkin; linfoma diferenciado de manera baja, nodular; leucemia linfocítica aguda; leucemia mieloide aguda; carcinoma de pecho; melanoma; papiloma; y carcinoma nasofaríngea, cáncer de colon, cáncer de hígado y melanoma. En otra modalidad, la molécula (s) completa o parcial de proteína Novaferon (SEC ID No:2), hecha mediante tecnologías recombinantes usando secuencia de polinucleótido de SEC ID No. .1, o químicamente sintetizada, se podría aplicar al tratamiento y/o prevención de cualquiera y/o toas las enfermedades virales en humanos y/o especies no humanas . Los ejemplos de infecciones virales susceptibles incluyen, pero no están limitadas a, encefalomiocarditis viral, influenza y otras infecciones virales de tracto respiratorio, rabias y otras enfermedades animales virales, e infecciones de arbovirus, así como queratitis de herpes simples, conjuntivitis hemorrágica aguda, zoster varicela, y hepatitis B y C, SARS e influenza de ave, síndrome de inmunodeficiencia humana (SIDA, HIV) . En otra modalidad, la molécula8s) completa o parcial de proteína Novaferon (SEC ID No. 2), hecha mediante tecnologías recombinantes usando la secuencia de polinucleótido de SEC ID No. 1 o químicamente sintetizada, se podría aplicar al tratamiento y/o prevención de cualquiera y/o todos los desórdenes relacionados con sistema inmune en humanos. Ejemplos de los desórdenes inmunes incluyen pero no están limitados a artritis reumática, esclerosis múltiples y diabetes de síndrome de Sjogren. La proteína Novaferon también se puede aplicar para prevenir rechazo de injerto contra huésped también. En otra modalidad, la molécula (s) completa o parcial de proteína Novaferon (SEC ID No. 2), hecha mediante tecnologías recombinantes usando la secuencia de polinucleótido de SEC ID No: l o químicamente sintetizada, se podría aplicar al tratamiento y/o prevención, como un inmunoadyuvante, para cualquiera y/o todas las enfermedades de angiogenesis . Ejemplo de las enfermedades de angiogenesis incluyen, pero no están limitados a hemangiomas, neovasculatura inducida por tumor, degeneración macular relacionada con la edad y retinopatía diabética. La proteína Novaferon, sola o junto con cualesquiera otr4as proteínas/materiales portadores u otras construcciones, se pueden administrar a humanos y/o especies no humanas en cualesquiera preparaciones/formulaciones farmacéuticamente aceptables en cualesquiera trayectorias/métodos de administración/entrega, que incluyen pero no están limitados a la toma oral, inhalación, aspersión intranasal, inyección intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intralesional o subcutánea. Las preparaciones/formulaciones farmacéuticas que contienen la proteina Novaferon como el ingrediente activo se podrían hacer mediante incorporación de un portador sólido o líquido apropiado, en las formas de líquido, sólido, semisólido y/o cualesquiera otras formas clínicamente aceptables, tales como tabletas, pildoras, polvos, soluciones o suspensiones líquidas, liposomas, supositorios, soluciones inyectables e infusibles. Las preparaciones que contienen Novaferon se podrían hacer usando los portadores, materiales, métodos convencionales que se describen en el ramo o generalmente aceptadas por la práctica de la industria farmacéutica. Las preparaciones/formulaciones que contienen Novaferon podrían también hacerse usando los métodos no convencionales, materiales que no se han descrito en el ramo ni usado por la industria farmacéutica. Por ejemplo, las formulaciones parenterales son usualmente fluidos inyectables que consisten de los materiales farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, salina fisiológica, otras soluciones de sal balanceadas, dextrosa acuosa, glicerol, etc. Además, los fluidos inyectables también podrían contener, además de la proteína Novaferon, otras proteínas como portadores, tales como albúmina de suero humano o preparaciones de plasma. Las preparaciones/formulaciones farmacéuticas también pueden contener cantidades inferiores de substancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o de emulsificación, conservadores y agentes de tampón de pH (por ejemplo acetato de sodio o monolaurato de sorbitán) . Los métodos de formulación son bien conocidos en el ramo y se describen, por ejemplo, en Remington: The science and Practice of Pharmacy. Pharmaceutical Sciences (75) . La preparaciones/formulaciones de proteina Novaferon particulares se determinarían por las aliaciones clínicas pretendidas y/o métodos de administración, y se podrían hacer por cualquiera experto en el ramo usando técnicas conocidas. Por ejemplo, además de fluidos inyectables, formulaciones tópicas y orales se pueden emplear. Las preparaciones tópicas pueden incluir pero no están limitadas a gotas para los ojos, ungüentos y aspersiones. Las formulaciones orales incluyen pero no están limitadas a las formas de líquido (v.gr., jarabes, soluciones o suspensiones), o sólidas (v.gr., polvos, pildoras, tabletas, o cápsulas) . Para preparaciones/formulaciones sólidas, portadores sólidos no tóxicos convencionales incluyen pero no están limitados a los grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, o estearato de magnesio. Los procedimientos reales y/o métodos para hacer estas preparaciones/formulaciones son conocidas, o serán evidentes a aquellos expertos en el ramo (75) . Las preparaciones/formulaciones farmacéuticamente aceptables de la proteina Novaferon se pueden administrar a humanos y/o especies no humanas en una varidad de formas que incluyen, pero no están limitadas a entrega oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, transdérmica, intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, rectal o intraocular, y en el tratamiento de heridas, aplicadas localmente de manera directa. Las concentraciones7cantidades de la proteina Novaferon en las preparaciones/formulaciones pueden variar de >0 a 1.0 molar y/o >0 a 1005 (peso/peso) dependiendo de la práctica clínica. La dosis exacta, intervalos de administración, y la duración de tratamiento de cada una y/o todas las preparaciones/formulaciones de Novaferon se determinarán mediante pruebas clínicas, condiciones de enfermedad, estado de paciente y proveedores de cuidado de salud. En una modalidad preferida, debido a la degradación de proteína, la entrega sistemémica contra localizada, y régimen de nueva síntesis de proteasa, así como la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración interacción de droga y la severidad de la condición, etc., los ajustes a la administración de Novaferon incluyendo pero no estando limitada a las dosis individuales y/o totales, intervalos de administración, la duración de tratamiento, y cursos de tratamiento necesarios, pude ser necesario, y se asegurará con experimentación de rutina por aquellos expertos en el ramo. En una modalidad preferida, la vida media de circulación de proteina Novaferon después de la administración a los cuerpos de humanos y/o especies no humanas se puede alterar. Las alteraciones incluyen pero no están limitadas a la extensión o acortamiento de la vida media de Novaferon in vivo. La extensión de la vida medida in vivo de la proteina Novaferon se puede lograr de diversas maneras, que incluyen pero no están limitadas a: (1) . Formación de complejo entre una molécula de novaferon y un anticuerpo monoclonal. Dicho anticuerpo de preferencia conectarla la proteina novaferon en sitios que no dañan materialmente sus funciones terapéuticas (103) . (2) . Complejo de fusión de Novaferon con otras proteinas/polipéptidos . La molécula de novaferon se puede fundir récom inantemente a otras proteinas/polipéptidos, tal como un fragmento de la región constante de una inmujnoglobulina (Fe) (104) . (3) . Conjugación de proteína Novaferon. Por ejemplo, la proteína Novaferon se puedee conjugar con polímeros no antígenos, tales como polietilenglicol o fracciones de polialquilenglicol relacionadas (105-108) . En otra modalidad preferida, un compuesto terapéutico se podría conjugar a un anticuerpo, de preferencia un anticuerpo de proteína de anti-Novaferon. El compuesto terapéutico puede ser un agente citotóxico. En este método, los agentes citotóxicos se pueden dirigir, mediante el enlace del anticuerpo conjugado a moléculas de Novaferon, para tejido o células de tumor, destruyendo de esta manera y la reducción del número de células afligidas para lograr reducción de síntomas de cáncer. Los agentes citotóxicos incluyen, ' pero no están limitados a, drogas citotóxicas, toxinas o fragmentos activos de dichas toxinas, y radioquímicos . Las toxinas apropiadas y sus fragmentos correspondientes incluyen cadena de difeteria A, cadena de exotoxinas A, cadena de reciña A, cadena de abrina A, curcina, crotina, fenomicina, neomicina y los semejantes. En una modalidad preferida, la secuencia de completa, secuencias parciales, y/o secuencia reguladora de la secuencia de polinucléotido que codifica proteina Novaferon (SEC ID No: 1) se puede usar en administración relacionada con terapia de gene mediante cualquier experto en el ramo. La aplicación de antisentido, basada en la secuencia de polinucléotido que codifica proteina Novaferon (SEC ID No.l) también se puede usar ya sea como terapia de gene (es decir, para incorporación en el genoma) o como composiciones de contrasentido, como se apreciará por aquellos expertos en el ramo. En aplicaciones de terapia de gene, los genes se introducen en células para lograr la síntesis in vivo de las proteínas de meta codificadas por estos genes. La terapia de gene convencional logra los efectos terapéuticos sostenidos mediante un solo tratamiento o administración repetida de un ADN o mRNA terapéuticamente efectivo. Por otra parte, los N¡ nas y ADNs de antisentido también se pueden usar como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha mostrado que los oligonucleótidos de contrasentido cortos se pueden entregar en células en donde actúan para inhibidores (109) . En una modalidad preferida, la secuencia de polinucléotido que codifica proteína Novaferon (SEC ID No:l), en longitud completa o longitud parcial, se puede usar como vacunas de ADN. Las vacunas de ADN desnudas se conocen generalmente en el ramo (110) . Los métodos para las aplicaciones del gene que codifica Novaferon (SEC ID No:l), de longitud completa o longitud parcial, como vacunas de ADN son bien conocidas con uno de experiencia ordinaria en el ramo, e incluyen pero no están limitadas a colocar el gene o porción de Novaferon del gene de Novaferon bajo el control de un promotor para la expresión de la longitud completa o longitud parcial de la proteina Novaferon en humanos y/o especias no humanas. Ejemplos Los siguientes ejemplos sirven para describir más completamente la manera de usar la invención arriba descrita, asi como también exponen los mejores modos contemplados para llevar a cabo diversos aspectos de la invención. Se entiende que estos ejemplos de ninguna manera sirven para limitar el verdadero alcance de esta invención, sino más bien se presentan para propósitos ilustrativos. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan expresamente por referencia en su totalidad. Ejemplo 1. Amplificación de PCR de genes de IFN- humano de cAD s de leucocito humano El mRNA total se extrajo de leucocitos de sangre periférica humana. La preparación de cADN se realizó usando el Equipo Advantage"* RT&-para PCR (Clontech, Mountain View, CA, EÜA) y un imprimador de síntesis de cADN (oligo dT18) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. La amplificación de cADNs IFN-a se hizo mediante tecnología de PCR en un aparato cíclico térmico MJ PTC, usando las siguientes condiciones: 2.5 ul de tampón de amplificación 10x pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA, EÜA), 0.75 UL DE DntpS 10 Mm, 0.5 ÜL 25 Mm DE MgS0 0.25 ÜL Platinum pfx ADN Polimerasa 8.5 ü/ul; Invitrogen, Carlsbad, CA, EÜA), 0.75 ul cADN, 0.75 ul imprimador 5' (10 uM; IFNa05: 5'-TGGTGCTCAGCT (A/G) CAAGTC-3' ) (SEC ID No:3) 0.75 ul mezcla de imprimador 3' (1.7 uM, cada uncIFNAa03-l: 5' -AATCATTTCCATCTTGH (1>/G)ACAG-3' (SEC ID No:4), IFNAa03-2: 5' -AATCATTTCCCGGTTGTACCAG-3' (SEC ID No.5); IFNa03-3: 5' -AATCATTTCCATGTTGAAACAG-3' (SEC ID No.6); IFNa03-4: 5' -AATCATTTCAAGATGAGCCCAG-3' (SEC ID No.7); IFNAa03-5: 5' -AATGATTTTCATGTTGAACCAG-3' (SEC ID No: 8); IFNa03-6: 5' -AATCATTT (C/G) (C/G) ATGTTGAACAG-3' (sec id No: 9) ; IFNa03-7: 5' -GATCATTTCCATGTTGAATGAG-3' (SEC ID No: 10); IFNa-03-8: 5' -GAGTCGTTTCTGTGTTGGATCAG-3' (SEC ID No.11). Los productos PCT amplificados se sometieron a electoforesis en un gen de agarosa al 1.0%, se cortaron, purificaron con gel, y se clonaron' en vector pCRII-TOPO o pCR-4-???? (Invitrogen, Carlsbad, CA, EÜA) de conformidad con las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo secuencia automatizada en una mezcla de Terminación de Tinte de Reacción Lista de Prisma en un aparato de secuencia automatizado ABI (PE Applied Biosystems, CA, EÜA) . Puesto que no se desean insertos para las secuencias de codificación de IFNa6, IFNa/ e IFNal6 se encontraron en los clones anteriores, se condujeron PCRs nuevamente bajo las condiciones anteriores con la excepción de imprimadores específicos de tipo. Para amplificación específica de IFNa6, los imprimadores 5' y 3' fueron IFNa05: 50-TGGTGCTCAGCT (A7G) CAAGTC-3' (SEC ID No:3), e IFNa03-8: 5 " -gagtcgtttctgtbttggatcag-3' (sec id No. 11) respectivamente. Para amplificación específica de IFNa7, los imprimadores 5' y 3' fueron IFNa7UO: 5'-AFGCCCCTGTCCTTTTCTTTAC-3' (SEC ID No.12) y una mezcla molar igual de IFNa03-5 e IFNa03-6, respectivamente. Para amplificación específica de IFNal6, los imprimadores 5' y 3' usados fueron IFNa7U0 e IFNa03-7; 5' -GATCATTTCCATGTTGAATGAG-30 (SEC ID No: 10) respectivamente. Los fragmentos amplificados se clonaron en vector pCR-TOPO o pCR-4-???? y se puso en secuencia como arriba. Toso los genes IFN-alfa humanos Tipo I clonaron se alinearon individualmente con aquellas secuencias de ADN en Genebank. Los números de acceso de nucleótido de GeneBank para estos generes mencionados en la presente son NM_024013(IFN-al) , NM_000605 ( IFN-a2b) , NM_01050 (IFN-a4 ) , NM_010505(IF - 5) , NM_008335 (IF -a6) , NM_008334 (IFN-a7 ) , NM_008336(IF -a8) , N _002171 (IFN- ??) , N _002172 (IFN-al4 ) , NM_002173 (IFN-al6) , NM_021268 (IFN-al7) , NM_002175 ( IFN-a21 ) . Ejemplo 2. construcción de librerías de mezclado de plásmidos ), NM_010505 (IFN- 5) , que contienen HulFN Tipo I Para construir plásmidos que contienen la secuencia de codificación de uno de los IFN-ors humanos Tipo I, 15 pares de oligonucleótidos, con sitios de restricción BamHl y EcoRl, se sintetizaron (Genentech, South San Francisco, CO, EÜA) , basados en la región de codificación de cADN inbdividual para proteínas IFN Tipo I humanas maduras. Los números de acceso de nucleótido de BeneBank para estas proteínas mencionadas en la presente son: N _024013 (IFN-al) , NM_000605 (IFN-a2) , NM-010504 (IF -a4) , NM_010505 (IFN-a5) , NM_008335 (IFN-a6) , NM_008334 (IFN-a7) , NM 008336 (IFN- 8) , NM_002171 (IFN- lO) , NM_002172 (IF -al4) , NM_002173 ( IFN-al6) , NM_021268 ( IFN-al7 ) , NM 002175 (IFN-a21) . Los imprimadores y plásmidos construidos en el Ejemplo 1 como plantillas se usaron en un PCR convencional (111) · Los productos resultantes se separaron con endonucleasas de restricción (Res) BamHl y EcoRl y se clonaron en vector de expresión de E.coli pBVB, que es un plásmido de expresión derivado de pBV220 (86) que contiene un sitio BamHl y un sitio de Ncori en su región de clonación múltiple. Estas construcciones finales fueron todas verificadas mediante análisis de secuencia de ADN (PE Applied Biosystems, EUA) . Los fragmentos de ADN que contienen IFN ORF humano se amplificaron mediante PCR usando un par de oligonucleótidos BVF4 : 5' -AGGGCAGCATTAAAGCAG-3' (SEC ID No: 13) y BVR3: 5' -TCAYGACCGCTTCTGGCGTCTG-3' (SEC ID No.14), y usando plásmidos que contienen HulFN Tipo I construidos previamente. Los productos resultantes se mezclaron en cantidades iguales y se sometieron a digestión DNase 1 y conjunto de PCR de conformidad con el procedimiento descrito por Stemmer (112) . Los productos PCR ensamblados se amplificaron adicionalmente mediante un par de imprimadores: BVF: 5' GAAGGCTTTGGGGTGTGTG-3' (SEC ID" No.15) y BVR: 5'-AATCTTCTCTCATCCGC-3' (SEC ID No.16), se3guido por di8gestión de BamHl y EcoRl y se clonaron nuevamente en vector de expresión de E. coli pBVB separados con Res BamHI y Ncori. Estas construcciones finales se verificaron todas mediante análisis de secuencia de ADN. Los genes HulFN-a mezaclados que contienen plásmido se transformaron en céluilas competentes DH5a de E. coli. En todos los procedimientos PCR anteriores, ya sea amplificación de PCR o cojunto de PCR, polimerasa de ADN regular (New England Biolab, MA, EÜA) , en lugar de polimerasa de ADN de alta fidelidad, se usó. Ejemplo 3. Tamizado de las librerías mezcladas Célulcas DH5a de E. coli recientemente transformadas se desarrollaron durante la noche en una placa I.B a 37°C. Colonias sencillas se recogieron individualmente y se inocularon en 100 ul de medio I.B que contiene 50 ug/ml de ampicilina en placas de 96 pozos. Las placas originales (llamas placas de material) se almacenaron temporalmente a 4°C. Las células en placas duplicadas se desarrollaron a 30°C hasta que OD600 se hicieron 0.4 y luego se indujeron mediante 42°C. Después de inducción de calor de 4 horas, los cultivos de bacterias se movieron directamente en un congelador -80°C para iniciar el ciclo de congelación-descongelación. Después de 2 ciclos de congelación-descongelación, la suspensión/lisado de bacterias se diluyó a una concentración deseada y se expusieron haia cultivo de célula Daudi para una prueba contra pliferación (101) o cultivo de célula Wish para una prueba antiviral (113) . En cada vuelta de pasos de tamizado, 20,000 colonias se tamizaron principalmente y alrededor de 100 colonias con las actividades anti-proliferantes o antivirales más elevadas se seleccionaron para prueba de confirmación adicional. Los cultivos bacterianos seleccionados en placas de material se rayaron en placas LB que contienen 50 ug/ml de ampicilina. Las colonas sencillas se desarrollaron durante la noche a 37°C, se recogieron e inocularon en 1 mi de medio LB que contiene 50 ug/ml de ampicilina en tubos de prueba. Los bacterias en tubos se desarrollaron durante la noche a 30°C con agitación a ' 250 rpm. Luego 40 ul de bacterias desarrolladas se inocularon una a otro juego de tubos que contienen 1 mi de LB con ampicilina 850 ug/ml) . Las muestras luego se sometieron a los pasos de expresión de inducción, cosecha de cultivo de célula, tratamiento de ciclo de congelación-descongelación y prueba antiproliferante o antiviral como se describe arriba con respecto a los pasos de tamizado primarios. En cada vuelta de pasos de tamizado, alrededor de 20 colonias con la actividad antiproliferante o antiviral más elevada se seleccionan después de prueba de conformación para hacer plásmidos y sus inserciones se formaron en secuencia automáticamente. Las inserciones que tienen una secuencia de ADN única se amplificaron adicionalmente usando un par de imprimadores PCR BVBF: 5' -ACCATGAAGTGACGCTC-3' (sec id No:17); y BVR: 5' -AATCTTCTCTCATCCGC-3' (SEC ID No:16), que son secuencias de flanco en corriente arriba y corriente debajo de múltiples sitios de clonación de vector de pBVB respectivamente- Los productos PCR amplificados se usaron para la siguiente vuelta de construcción de librería mezclada . Se realizaron cinco ciclos de pasos de tamizado basados en el aumento de ya sea actividad antiproliferante o antiviral . Ejemplo 4. Expresión y purificación de proteina Novaferon recombinante en E.coli La proteina Novaferon (SEC ID No: 2) se expresó en E. coli- El marco de lectura de SEC ID No:l cdon una adiciónb artificial de codón de inicio ATG se clonó hacia el vector pBVB inducible por temperatura bajo control del promotor APRPL (114) . El plásmido de expresión de Novaferon, pBVBNF, se transformó en células DH5 . Colonias sencillas se recogieron individualmente y se inocularon en 2 mi de medio LB que contiene 50 ug/ml de ampicilina y se incubó a 30°C durante 8 horas. Luego los 2 mi de bacterias cultivadas se incubaron adicionalmente con 50 mi de medio que contiene 50 ug/ml de ampicilina durante la noche a 30°C con agitación. La siguiente mañana, las bacterias cultivadas durante la noche se sembraron a una relación de 1:10-1:20 en un volumen grande de medio LB que contiene 50 ug/ml de ampicilina, y se incubaron a 30°C con agitación. Cuando los cultivos hubieron alcanado la fase de medio registro de crecimiento (A550 =0.5-0.6), la temperatura de incubación se elevó rápidamente hasta 42°C y se mantuvo durante 4 horas a fin de inducir la expresión de Novaferon. Después de inducción de calor de 4 horas, las células de bacterias se centrifugaron y lavaron con PBS (137 mM naCl, 2.7 mM de KC1, lOmM de Na2HP04, 2 mM de KH2PO4) 3 veces, luego se almacenaron a -80°C hasta proseguir a purificación. La mayoría de las moléculas de proteína Novaferon fueron solubles en el sistema de producción de E. coli descrito en la presente, aún cuando se sobreexpresaron en el citoplasma. De esta manera se interrumpieron mediante digestión de lisozma en tampón de Lisis de Célula (50 mM de Tris-Cl (pH8.0), 1 mM de EDTA (pH8.0), 100 mM de NaCl) (115). El lisado se sonicó adicionalmente a fin de interrumpir las células intactas restantes y rebanar moléculas de ADN. Luego el lisado se centrifugó. Las moléculas de proteina Novaferon solubles en los sobrenadantes se purificaron en secuencia mediante cromatografía de intercambio de iones, hidrofóbica y filtración de gel. Primero, los sobrenadantes se cargaron hacia y se pasaron a través de la Columna de Flujo Rápido de Fenil Sefarosa (GE Healthcare, EUA) . En segundo lugar, las fracciones que contienen proteína Novaferon se aplicaron a columna POROS 50 D (Applied Biosystems, EUA) . En tercer lugar, las fracciones que contienen moléculas de Novaferon se sometieron a la purificación mediante POROS 50 HSColumna (Appli8ed Biosystems, EUA) , Y FINALMENTE, LAS MOLÉCULAS DE Novaferon Recogidas se purificarton adicionalmente mediante HiLoad 26/100 Superdex 75 pg (Amersham, EUA) . La pureza de la proteína Novaferon se verificó mediante análisis de SDS-PAGE al 15%. La proteína Novaferon recombinante pura mostró como una sola banda con un peso molecular (MW) de 19-20 DKa. El análisis de espectrometría de masa indicó que la pureza de la mol'ñecula Novarferon purificada fue >98%, y el peso molecular fue 19313 dalton, que fue idéntico con el peso molecular predicho 19315 dalton de su secuencia de aminoácido.

Ejemplo 5: Expresión y purificación de HulFN-a2b recombinante en E. coli El plásmido de expresión de HulFN-a2b, pBV2b, contiene la región de codificación cADN para la proteina madura de HulFN- 2b (número de acceso de nucleótido de GeneBank: ??_0 0605) , que 'está bajo el control de promotor APRPL inducible por calor. La expresión de HulFN-a2b se realizó siguiendo los protocolos descritos por Joseph S y David WR (116) . El plásmido de expresión, pBV2bF, se transformó en células DH5- . Las colonias sencillas se recogieron individualmente y se inocularon en 2 mi de medio LB que contiene 50 ug/ml de ampicilina y se incubaron a 30°C durante 8 horas. Luego los 2 mi de bacterias cultivadas se incubaron adicionalmente con 50 mi de medio que contiene 50 ug/ml de ampicilina durante la noche a 30°C con agitación. La siguiente mañana, el cultivo de bacteria se sembró a una relación de 1:10-1:20 en un volumen grande de medio LB que contiene 50 ug/ml de ampicilina, y se incubó a 301C con agitación. Cuando los cultivos hubieron alcanzado la fas de crecimiento de registro medio (A550 = 0.5-0.6), la temperatura de incubación se elevó rápidamente a 42°C y se mantuvo durante 4 horas a fin de inducir la expresión de HulFN-a2b. Después de inducción por calor durante 4 horas, las células se sometieron a centrifugación y se lavaron con PBS (137 M de NaCl, 2.7 mM de KC1, 10 mM de Na2HP04, 2 mM de KH2P04) 3 veces, luego se almacenó a -801C hasta preseguir a purificación. La proteina HulFN- 2b se expresó insolublemente en el sistema de expresión de E. coli descrito en la presente, y de esta manera la recuperación de cuerpo de inclusión y procedimientos de lavado se condujeron de conformidad con los protocolos descritos en Molecular Cloning (115) . Brevemente, las células bacterianas cosechadas se resuspendieron en tampón de Lisis de Célula 850 mM de Tirs-Cl (pH8.0). 1 mM de EDTA (pH8.0), 100 mM de NaCl) y se lisaron mediante lisozima y sonicación. Los cuerpos de inclusión se lavaron 3 vees con tampón 11 de Lisis de Célula fría hiero (tampón de lisis de célula 1 suplementado con 0.5% (v/v) de Tritón X-100) . Los cuerpos de inclusión recuperados se rompieron suspendiendo en u7N de guanidina a temperatura ambiente con agitación durante 4 horas. Después de una centrifugación de 15 minutos a 4°C, la proteina desnaturalizada se redobó en 0.15 M pH 9.5 de tampón de Bórex durante 48 horasw a 4°C. El pH se ajusto a 7.4 mediante HC1 en el último paso de redoblado.

La solución que contiene HulFN-a2b luego se purificó mediante cromatografía de intercambio de iones, hidrofóbica y filtración de gel. Primero, la solución se cargó hacia y se pasó a través de Columna de Flujo Rápido de Fenil Sefarosa 6 (GE Healthcare, EUA) . En segundo lugar, las fracciones que contienen HulFN-a2b se aplicaron a columna POROS 50 D (Applied Biosystems, EUA) . En tercer lugar, las fracciones que contienen HulFN-a2b se sometieron a la purificación mediante Columna POROS 50 HSC (Applied Biosystems, EUA) . Finalmente, las moléculas de HulFN- 2b recogidas se purificaron adicionalmen e mediante HiLoad 267100 Superdex 75 pg (Amersham, EUA) . La proteína HulFN- 2b pura mostró como una sola banda mediante análisis de SDS-PAGE al 15% y su pureza fue >98% como se confirmó mediante espectrometría de masa. Ejemplo 6. Determinación de actividad antiviral de Novaferon Se determinó la actividad antiviral usando el sistema WISH-VSV como se describe en los protocolos clásicos descritos por Armstrong JA (113) . En el primer día, las células WISH (ATCC, catálogo No. CCL 259 se sembraron en placas de 96 pozos a una densidad de 14,000 células/pozo y se incubaron a 37°C. 24 horas más tarde, Novaferon diluido en serie 2 veces, HulFN- 2b, normas internacionales IFN humanas WHO o medio de cultivo de molde se añadieron en cada pozo, y se incubaron a 371C durante otras 24 horas. En el tercer dáa, el medio se removió, y se reemplazó con medio que contiene 1,000 PFÜ de Virus de Estomatitis Vesicular (VSV, ATCC, catálogo No. VR-1421) . Las células se incubaron nuevamente durante 24 horas a 37°C y luego se lavaron con 0.85% e NaCl para remover las células muertas. A continuación, las placas de cultivo se empaparon en solución de fijador de tinta (0.5% de violeta de cristal, 5% de formalina (V/V) , 50% de Etnol. (V/V), y 0.85% de NaCL) durante 21 hora. La solución de fijador de tinte luego se decantó, y las microplacas se enjuagaron copiosamente con agua corriente y se dejaron secar. Las células manchadas se disolvieron mediante 0.2 mi de 2-metoxietanol . Las placas se leyeron a 550 nm en un Modelo Opsys MR (Thermo Labsystems, EÜA) para bioensayos de violeta de cristal. Todos los experimentos realizados en triplicado y las muestras de Novaferon y HulFN- 2b se probaron en la misma placa. Las actividades antivirales de Novaferon y HulFN-a2b preparadas en la presente se ensayaron en paralelo y las unidades antivirales (unidad internacional, o Iü) se determinaron con referencia a las normas internacionales WHO, 94/786 (consenso de rHulFN-a y 95/650 (rHulFN-a2a) , que se compraron del National Institute for Biological Standrds and Control (NIBSC, EUA) - La actividad antiviral medida de proteina Novaferon purificada contra VSV en WISH fue 2.xl09IU/mg mientras que la actividad antiviral de HulFN- 2b es 2.0xl08 Iü/mg. Este dato indica que la actividad antiviral de la proteina Novaferon es alrededor de 12.5 veces más fuerte que HulFN-a2b. Ejemplo 7. Actividad antiproliferante de Novaferon El ensayo de actividad antiproliferante se realizó básicamente como se describe por Evinger y Pestka (101) . A. Cultivo de célula de lineas de célula de tumor humano Lineas de célula de tumor humano se compraron de diferentes organizaciones (Cuadro 21, abajo) , a decir, ATCC (American Type Culture Collection, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, EUA) , dsmz (Germán National Resource Centre for Biological Material, Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Alemania) , JCRB (Japanese Collection or Research Bioresources-Cell Bank, nacional Institute of Biomedial Innovation, 7-6-8 Saito-Asagi, Ibaraki-shi, Osaka 567-0085, Japón) . Cuadro 1. Lineas de célula de Tumor Humano Líneas de Célula Tumores Códigos Organizaciones A-375 Melanoma CRL1619 ATCC IGR-1 Melanoma Acc 236 DSMZ IGR-37 Melanoma Acc 237 DSMZ IPC-298 Melanoma Acc 251 DSMZ HCT-8 Adenocarcinoma colorrectal CCL-244 ATCC SW1116 Adenocarcinoma colorrectal CCL-233 ATCC LS 180 Adenocarcinoma colorrectal CL-187 ATCC DLD-1 Adenocarcinoma colorrectal CCL-221 ATCC LS174T Adenocarcinoa colorrectal CL-188 ATCC Hep G2 Carcinoma hepatocelular HB-8065 ATCC Hep3B Carcinoma hepatocelular HB-8064 ATCC HuH-7 Hepatoma 0403 JCRB PLC/PRF/5 Hepatoma CRL-8024 ATCC HL60(S) Linfocítico 0163 JCRB Daudi Linfoma de Burkitt , CCL-213 ATCC L-428 Linfoma de Hodgkin Acc 197 DSMZ Dü 145 Carcinoma de próstata HTB-81 ATCC PC-3 Carcinoma de próstata Acc 197 DSMZ MKN 1 adenocarcinoma gástrico 0252 JCRB KYSE 30 Carcinoma de esófago 0188 JCRB A5 9 Carcinoma de pulmón CCL-185 ATCC HeLa Adenocarcinoma de cérviz CC1-2 ATCC C-33A Carcinoma de cérviz HTB-31 ATCC * DS Z: Germán National Resourcde Centre for Biological Material (Deutsche Sammlung von Midroorganismen und Zellkulturen) Alemania ATCCD: American Type Culture Collection, EUA JCRB<: Japanese Collection of Research Bioresources-cell Bank, Japón. Todas las células usadas en prueba de actividad antiproliferante se cultivaron a 37°c en una atmósfera humedecida que contiene 5% de C02. Las células se desarrollaron de conformidad con el manual de desarrollo de cada célula, en medio de crecimiento basal, tal como DMEM, MEM, F12K y 1640 o 1640 más F12 (todos de Gibco BRL, EUA) , suplementado con 5-205 de suero bovino fetal FBS inactivado con calor, de ibco BRL, EÜA. El medio de crecimiento basal para cada linea de célula individual se enumera en el Cuadro 2 abajo. Todas las lineas de célula se examinaron diariamente en placas de cultivo bajo un microscopio invertido. Las células se cosecharon y usaron para experimentos en su fase de crecimiento logarítmico con viabilidades excediendo 90% como se determina por la exclusión de tinta azul de bandeja de prueba. Las cuentas de célula y viabilidades se examinaron en hematocitómetro convencional Cuadro 2. Métodos de Cultivo y Medición de Lineas de Célula de Tumor Humano Linea de Medio de Célula Cultivo Células/Pozo Métodos de medida IGR-1 DMEM 5000 Bioensayo de violeta de cristal IGR-37 DMEM 2000 bioensayo de violeta de cristal IPC-298 1640 2000 bioensayo de violeta de cristal HCT-8 1640 500 bioensayo de violeta de cristal LS 180 MEM 3000 bioensayo de violeta de cristal DLD-1 1640 1500 bioensayo de violeta de cristal Hep G2 MEM 1000 bioensayo de violeta de cristal Hep 3B MEM 800 bioensayo de violeta de cristal HuH-7 DMEM 4000 bioensayo de violeta de cristal PLC/PRF/5 MEM 6000 bioensayo de violeta de cristal KYSE 30 1640+F12 1000 bioensayo de violeta de cristal Dü 145 MEM 1000 bioensayo de violeta de cristal PC-3 1640 2000 bioensayo de violeta de cristal MKN 1 1640 2000 bioensayo de violeta de cristal A549 F12K 400 bioensayo de violeta de cristal SW 1116 1640 1000 bioensayo de violeta de cristal LS174T MEM 4000 bioensayo de violeta de cristal HeLa MEM 500 bioensayo de violeta de cristal C-33A MEM 1000 bioensayo de violeta de cristal A-375 DMEM 200 bioensayo de violeta de cristal HL 60 (S) 1640 800 bioensayo de violeta de cristal Daudi 1640 400 cuenta directa de célula L-428 1640 800 cuenta directa de célula B. Procedimiento para ensayo antiproliferante Las lineas de célula con fase de crecimiento logarítmico se suspendieron suavemente en medio caliente (36°C) a una densidad de 2 x 103 - 6 x 104 células/ml (vaiando con linea de célula, verCuadro 2). 100 ul de suspensión de célula se sembraron en cada pozo de plaa de 96 pozos, seguido por incubar durante 6-8 horas a 37°C.Luegto volúmenes iguales 8100 ul) de Novaferon o HulFN-a2b diluido en medio se cultivo se añadió a los pozos . en triplicado. Las placas se agitaron suavemtne durante 4-5 segundos para mezclar los contenidos, y se incubaron a 37°C durante 6 días. Las muestras de Novaferon y HulFN-a2b se probaron en la misma placa a fin de garantizar la capacidad de comparación. Se usaron dos métodos para determinar el núcleo de células en un pozo de células y para calcular las actividades antiproliferantes de Novaferon y HulFN-or2b de conformidad con los números de célula Se uso un méto de cuenta de célula directa para determinar el número de célula de célula de suspensión. Después de y6 días de cultivo, los cultivos de célula en suspensión se diluyeron con azul de bandeja de prueba 8concentración final: 0.02%), y los números de célula se contaron directamente usando hematocitómetro. Se usó el método de bioensayos de violeta de cristal para determinar el número de célula de las células adhesivas 893) . Después de 6 dias de cultivo, las células muertas se removieron pipetando PBS arriba y abajo en los pozos de cultivo. A continuación, los pozos se llenaron con solución fijadora de tinte para manchar las células vivas durante 1 hora. La solución fijadora dé tinte contenia 0.5% de violeta de cristal, 5% de formalina (V/V) , 505 de etanol (V/V) , y 0.85% de NaCl en agua destilada. Luego las microplacas se enjuagaron copiosamente con agua corriente y se dejaron secar. Las célulasmanchadas sedisolvieron mediante 0.2 mi de 2-metoxietanol . La densidad óptica a 550 nm (OD550) (Model Opsys píate reader, ThermoLabsystems, EUA) se midió y uso como el indicador relativo de números de célula. El régimen de inhibición de crecimiento se calculó mediante la siguiente fórmula: % derégimen de inhibición = (1 - (E -B)/(C-B)) X 100, en donde E tiene el número de células o el valor de OD550 en un cultivo de célulaen el dia O; C fue el número de células o el valor de OD550 en pozos no tratados en el día 6. El régimen de inhibición se expresó en conjunción con las concentraciones de compuesto. El IC50 de Novaferon o HulFN-a2b se calculó usando una escala de concentraciones de muestra. Los datos se ajustaron a urva Sigmoidal (117) con inclinación Hill uno: Y=min + (Max-min) / (1+10 ' (IC50X) ) en donde X es las concentraciones de registro de droga; Y es el régimen de inhibición; Min o Max es la placa de régimen de inhibición mínima o máxima. El IC50 de diversos compuestos contra una meta particular se puede comparar, en donde un IC50 inferior indica un compuesto más potente. Las concentraciones de Novaferon y HulFN- 2b y los regímenes de inhibición de crecimiento de célula correspondientes para linea de célula Daudi se presentan en la figura 4. Basados en este dato, el IC50 de Novaferon y HulFN-a2b para inhibir crecimiento de célula Daudi se calcularon como 0.0174 nmol y 6.9550 nmol. De esta manera, el IC50 e Novaferon es alrededor de 1/400 de aquel de HulFN-a2b, que representan un aumento de aproximadamente 400 veces de la potencia antiproliferante e Novaferon en comparación con HulFN-a2b. Las actividades antiproliferantes de Novaferon se determinaron y compararon con aquellas de HuIFN-a2b en 23 lineas de célula de tumor, incluyendo 4 lineas de célula derivadas de melanoma (A-375, IGR-1, IGR-37,K IPC-298), 5 lineas de célula de adenocarcinoma colorrectal (HCT-8, SW1116, LS 1801 DLD-1, LS174T) , 4 lineas de célula de cáncer (Hep G2, Hep 3B, HuH-7, PLC/PRF/5), 3 LÍNEAS DE CÉLULA DELINFOMA (hl-60(s), Daudi, L-428), 2 lineas de célula de carcinoma de próstata (Du 145, PC-3), 2 lineas de célula de cáncer cervical (HeLa, C-33a), una linea de célula de adenocarcinoma gástrica (MKN 1), 1 linea de célula de carcinoma de pulmón (A 549) y una linea de célula de cáncer de esófago (KYSE 30) . El novaferonexhibió actividades antiproliferantes mucho más fuertes que aquellas de HulFN-a2b contra todas las lineas de célula de cáncer. La etensión de aumento de la potencia varió en las lineas de célula de cáncer diferentes, k y dispuestos de 16 a 1134 veces (cuadro 3, abajo) . Cuadro 3. Valores de IC50 de Novaferon y HulFN-a2b y las veces aumentadas de inhibición de célula de tumor mediante Novaferon sobre HulFN-a2b Lineas de IC50 nmol) Veces Célula HulFN-a2b Novaferon (Novaferon/HulFN- sb) PLC/PRF/5 0.0407 0.0025 16 A549 4,27 0.2202 19 DU 145 0.1319 0.0036 36 HepG2 0.1718 0.004 43 HuH-7 0.1474 0.0026 58 Hep3B 4.3934 0.9657 58 IPC-298 0.0516 0.0007 70 LS174T 0.0165 0.002 74 IGR-37 0.6017 0.0055 109 PC-3 1.8777 0.0146 128 Hél-a 0.2364 0.0017 141 C-33A 2.5242 0.0176 143 MKN 1 0.233 0.0011 207 HCT-8 2.9479 0.0139 212 S 1116 0.2278 0.001 222 DLD.1 0.3977 0.0014 282 HL-60 (S) 0.5855 0.0019 306 LS 180 0.7579 0.022 350 Daudi 6.955 0.0174 400 KYSE 30 18.0134 0.0264 683 A-375 1.4134 0.0019 733 IGR-1 6.6718 0.0076 876 L-428 17.2789 0.0152 1134 Ejemplo 8. Experimentos de modelo de tumor in vivo A. Cultivo de célula en modelos de xenoinjerto detumor humano in vivo La linea de célula de cáncer de colon (LS 180), linea de célula de melanoma (A-375) y linea de célula de cáncer de hígado (Hwp G2) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . La línea de célula de cáncer de próstata (PC-3) se obtuvo de Germán National Resource Centre for Biological Material (DSMZ, Deutsche Sammlung von Midroorganismen and Zellkulturen, Alemania) , Línea de célula linfocítica (HL 60 (s) ) se compró de Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank (JCRB, Japó) . Todas las células se cultivaron de conforidad con sus instrucciones (ver Cuadro 1) . Brevemente, LS 180 y Hep G2 se cultivaron en medio MEM. A-375 se cultivó en DMEM. Ambos medios se suplementaron con suero bovino fetal al 10% (FBS) , 2 mM de glutamina, 100 u/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 0.11 mM de aminoácidos no esenciales, y 1.0 mM de pivurato de sodio. Células de PC-3 y HL60(S) se culti8varon en RPM1 1640, k se suplementaron con FBS al 10%, 100 u/ml de penicilina, k y 100 mg/ml de estreptomicina. Todas las células se mantuvieron en atmósfera de C02 al 5% a 37°D. Modelos de xenoinjerto de cáncer humano se establecieron usando los métodos descritos por Beverly y col (118) . Las células de cáncer que crecen en fase de registro se cosecharon de placas de cultivo de tejido, se lavaron, y resuspendieron en salina tamponada con fosfato (PBS, pH=7.5, 20 mM) . Se generaron xenoinjertos de tumor subcutáneo en ratones Balb/c desnudos atimicos de 6 semanas de edad inyectando 6 x 106 células/0.3 mi (PC-3, HepG2) . 4 x 106 células/0.3 mi (LS 1870). 2 x 107 células/0.3 mi (HL 60 (s) ) u 8 x 106 células/0.3 mi (a-375) subcutáneamente en ambos lados de la región de lado. Para cada modelo de tumor in vivo, en el día 6 después de la inoculación de célula de tumor, los ratones que contienen tumor (el volumen de tumor es alrededor de 100 mm3) se dividieron aleatoriamente en 7 u 8 grupos con números iguales de animales en cada grupo, y se comenzó el tratamiento. Se formularon Novaferon y HulFN- 2b con solución de PBS. La inyección subcutánea diaria de PBS sola, varias dosis de Novaferon o HulFN-a2b duraron 30 dias en total (PC-3, HepG2, A-375), 28 dias (7LS 180) o 21 dias (HL 60 (s) ) desde el dia de agrupamiento de ratones. Para el tratamiento de 5-FU, 30 mg/kg de 5-FU se administró intravenosamente una vez cada dos dias por un total de 5 veces. Los grupos y dosis de tratamiento se resumen abajo.

Grupo 1 (Control) : PBS diario. Grupo 2 (dosis bajas de novaferon): 1.25 ug/kg diarios. Grupo 3 (dosis media de Novaferon): 12.5 ug/kg diarios. Grupo 4 (dosis elevada de Novaferon) : 125 ug/kg diarios Grupo 5 (dosis baja de HulFN- 2b) : 1.25 ug/kg diaria. Grupo 6 (dosis media de HulFN-a2h) : 12.5 ug/kg diarios. Grupo 7 (dosis elevada de HulFN-a2b) : 125 ug/kg diarios. Grupo 8 (5-FU) : 30 mg/kg, administración intravenosa una vez cada 2 días durante 5 veces. Una vez comenzado el tratamiento, los tumores se midieron con un calibrador una vez a la semana. Los volúmenes de tumor se calcularon usando la siguiente fórmula: volumen =? 0.5 x (anchura)2 = (longitud). Los ratones se sacrificaron en el día de discontinuación de tratamiento día 30 después del comienzo del tratamiento) . Los tumores sólidos se aislaron, fotografiaron y midieron. El régimen inhibitorio de crecimiento se calculó usando la siguiente fórmula: régimen inhbitorio = [° - T/(C] x 100%, en donde T es el peso de tumor promedio en Novaferon-, HulFN- 2-, o grupos tratados con 5-FU; c es el peso de tumor promedio en grupo de control después del tratamiento. B. Modelo de xenoinjerto de cánmcer de próstata humano Los xenoinjertos PC-3 de cáncer de próstata se trataron con inyección subcutánea de 1.25, 12.5 y 125 ug/kg de Novaferon durante 30 días. El novaferon exhibió inhibición fuerte, dependiente de dosis del crecimiento de tumor PC-3 (P<0.05). Como semuestra en la Figura 5 y cuadro 4 abajo, el crecimiento de tumor de PC-3 en grupos tratados con Novaferon se suprimió grandemente en comparación con el grupo de control de tratamiento de PBS. Por ejemplo, el peso promedio de tumor de xenoinjerto PC-3 en grupo tratado con Novaferon (125 ug7kg) . 0.091+0.081 g se redujo muy significativamente en comparación con animales de control. 1.948+0.081 g se redujo muy significativamente en comparación con animales de control. 1.948+0.567 g ()P<0.001) (cuadro 4). En otras palabras, el tratamiento de 30 días de 125 ug/kg alcanzó 956.3% de inhibición del crecimiento de tumor PC-3 (Cuadro 4) . Cuadro . Peso de tumor y regímenes de inhibición de crecimiento de xenoinjertos PC-3 de cáncer de próstata humano tratados con Novaferon y HulFN-a2b ( (n=10) . Grupo Dosis Peso de Tumor (G=) Régimen de (ug/kg) (medio + SD) inhibición % Control - 1.9480.567 Baja dosis de Novaferon 1.25 1.266+0.457* 35.0 Dosis media de Novaferon 12.5 0.759+0.674*** 61.0 Dosis alta de Novaferon 125 0. 091+0. 081***@@@ 95. 3 HulFN--a2b dosis baja 1.25 1. 284+0. 8u62 34. 1 HulFN--a2b dosis media 12.5 0. 790+3. 91· · · 59. 4 HulFN--ot2b dosis alta 125 0. 476+0. 273· · · 75. 6 Nota: * p<0.05, ***p<0.01; comparada con grupo de control; @@@ p<0.001; comparada con HulFN-a2b grupo de dosis alta. Ratones desnudos Balb/c se trataron con inyección subcutánea diariamente de Novaferon (1.25 ug/kg, 12.5 ug/kg o 125 ug/kg) durante 30 días después de que 6 x 106 células vivas PC3 se introdujeron subcutáneamente en los ratones. Los resultados se expresaron como volumen de tumor promedio (mm3) . La Figura 5 mostró que todas las res dosis de Novaferon exhibieron inhibición dependiente de dosis después de crecimiento de tumor PC-3, en comparación con el grupo control de PBS (P<0.05). 125 ug/kg de Novaferon indujeron inhibición mucho más fuerte, o casi completa de crecimiento de tumor PC-3 que aquel de HulFN-u2b a la misma dosis (95.3% contra 75.6%, P<0.01) (Cuadro 4) Es interesante observar que el tratamiento más prolongado de Novaferon o HulFN- 2b resultó en diferencias mayores en inhibición de crecimiento de tumor en los grupos tratados con dosis elevada (125 ug/kg) . El volumen promedio de masa de tumor PC3 en el grupo tratado con Novaferon fue 107.9+296.6 mm3 en el grupo trat6ado con ulFN- 2b en el dia 28 (P<0.001) y 122.1=1007.7 mm3, contra 691.9+428.3 mm3 en el dia 30 (P<0.001). Este tambié fue el aso cuando el peso- de tumor promedio se consideró después de la terminación de la observación (0.091+0.081 en el grupo de dosificación elevada de Novaferon contra 0.476+0.271 gramo en el grupo de dosificación elevada de HulFN- 2b, PzO.001) . Esto sugirió que el tratamiento más prolongado de Novaferon a esta dosificación puede exhibir inhibición mejor o completa que el crecimiento de tumor PC-3 en este modelo de xenoinjerto. C. Modelo de xenoinjerto de cáncer de hígado humano La actividad contra tumor in vivo de Novaferon también se evaluó en modelo de xenoinjerto Hep G2 de cáncer de hígado. El Novaferon exhihió inhibición dependiente de dosis, efectiva de crecimiento de tumor Hep G2 comparado con el grupo de control (P<0.001). Los volúmenes de tumor promedio en los grupos tratados con Novaferon (diariamente inyección subcutánea de 1.25, 12.5 o 125 ug/kg durante 30 días) fueron 782.24270.0, 459.2+259.3=414.3, y 104.6+56.5 mm3., respectivamente, en comparación con 2125.8+743.1 mm3 en el gruo de control de PBS. El tratamiento de 30 días de 125 ug/kg de Novaferon logró la inhibición más elevada del Hep G2 (96.6%), que fue significativamente mejor que por 125 ug/kg de HulFN-a2b (89.2%, P<0.01). El tratamiento más largo de Novaferon a esta dosis mostró la tendencia de inhibición aún mejor o completa. El peso de tumor promedio al final del periodo de observación fue 0.074+0.083 g en 125 ug/kg para el grupo tratado con Novaferon, significativamente menos que en 125 ug/kg del grupo tratado con HulFN-a2b (0.235+0.199 gramos, PzO.001) (cuadro 5, abajo). Ratones desnudos Barb/c se trataron diariamente con inyección subcutánea de Novaferon (1.25 ug/kg, 12.5 ugh/kg y 125 ug/kg) durante 30 días después de que células Hep G2 6 x 106 se introdujeron subcutáneamente en ratones. Los resultados se expresaron como volumen de tumor promedio (mm3) . La Figura 6 mostró que todas las tres dosis de Novaferon exhibieron inhibición dependiente de dos de crecimiento de tumor Hep G2 en comparación con el grupo de control de PBS (P<0.001), 125 ug/kg de Novaferon indujeron inhibición mucho más fuerta, o casi completa de crecimiento de tumor Hep G2 que aquel de HulFN-a2b a . la misma dosis (96.6% contra 89.2%, Pz0.05) (Cuadro 5).

Cuadro 5. Regímenes de peso y crecimiento de tumor en xenoinjertos de célula Hep G2 de cáncer de hígado humano tratado con Novaferon y HulFN- 2b (n=10) Grupo Dosis Peso de tumor (g) Régimen de (ug/kg) (Medio + SDE) inhibición (%) Control — 2.179+0.578 — Novaferon dosis baja 1.25 0.797+0.397*** 63 .4 Novaferon dosis media 12.5 0.321+0.300*** 85 .3 Novaferon dosis alta 125 0.074+0.0.083***6 96 .6 HulFN-a2b dosis baja 1.25 1.070+0.587** 50 .9 HulFN- 2b dosis media 12.5 0.531+0.287*** 75 .6 HulFN-a2b dosis alta 125 0.235+0.199*** 89 .2 Nota: ** p<0. 01, *¦** p<z0. 001, comparada con grupo de control, @ p<0 .01, comparada con HulFN- 2b grupo de dosis elevada D. Modelo de xenoinjerto de melanoma humano La actividad contra tumor en vivo de Novaferon se evaluó adicionalmente en modelo de xenoinjerto de melanoma maligno A-375. La línea de célula A-375 (ATCC número CRL-1619) se derivo de un tumor sólido maligno humano. El novaferon exhibió inhibición dependiente de dosis efectiva de crecimiento de tumor A-375 comparado con el grupo de grupo (PzO.001). Los regímenes de inhibición en el grupo tratado con Novaferon (inyección subcutánea diariamente de 1.25, 12.5 o 125 ug/kg durante 28 días ( fueron 40.1%, 75.0% y 82.8%, respectivamente en comparación con el grupo de control PBS 8Pz0.001) (Cuadro 6 abajo). El tratamiento de 30 dias de 125 ug/kg de Novaferon logró la inhibiciónb más elevada del A-375 882.8%), que fue significativamente mejor que aquella por 125 ug/kg de HulFN-a2b (69.9%, PzO.001). De manera interesante, el Novaferon exhibió inhibición más efectiva del crecimiento de célula de melanoma A-375 que el agente quimioterapéutico. 5-FU (Cuadro 6) . En el dia 30, por ejemplo, los pesos de tumor medio en los grupos tratados con 12.5 ug/kg o 125 ug/kg de nov<feronb fueron 0.763+0.187 (P<0.001( gramos, mientras que el peso de tumor medio para el grupo tratado con FU-5, 30 mg/kg, fue 1.004+ 0.1095 gramos (Cuadro 6). Esto indica que el Novaferon puede ser más efectivo para el tratamiento de melanoma A-375 humano que el 5-FU. Ratones desnudos Balb/c se trataron con inyección subcutánea diaria de Novaferon (1.25 ug/kg, 12.5 ug/kg y 125 ug/kg) durnte 28 dias después de que 8 x 106 células A-375 se introdujeron subcutáneamente en los ratones. Los resultados se expresan como volumen de tumor promedio (mm3) . La Figura 7 mostró que todas las tres dosis de Novaferon exhibieron inhibición dependiente de dosis de crecimiento de tumor A-375 en comparación con el grupo de control de PBS (P<0.001). 125 ug/kg de Novaferon indujeron inhibición más fuerte de crecimiento de tumor A-375 que aquel por HulFN-a2b en la misma dosis (82.8% contra 6.9%, P<0.001) (Figura 7). Ambos 12.5 ug/kg y 125 ug/kg de Novaferon mostraron mejor supresión (75.0% y 82.8% respectivamente) del crecimiento de tumor que por 5-FU (67.2%, P<0.01 y PzO.001) (Figura 7). Cuadro 6. Regímenes de inhibición de peso y crecimiento de tumor de xenoinjertos de célula A-375 déme1amona humana trataas con Novferon y HulFN- 2b (n=10) . Grupo Dosis Peso de tumor (g) Régimen de (ug/kg) (X +SDE) hibición (%) Control — 13 .057+0.384 Novaferon dosis baja 1.25 1. 830+0.289*** 40 .1 Novaferon media 12.5 0. 763+0.187***&&$$$ 75 .0 Novaferon dosis alta 125 0. 527+0.2149***&&&@@@ 82 .8 HulFN- 2b dosis baja 1.25 1. 890+148*** 38 .2 HulFN- 2b media 12.5 0. 920+132*** 45 .0 HulFN- dosis alta 125 0. 920+139*** 69 .9 5-FU 30,000 1. 004+0.105*** 67 .2 Nota: *** z<0.001, comparada con grupo de control; $$$p<0.001, comparada con HulFN-a2b dosis media (12.5): @@@pz0.01 comparada con HulFN-a2b dosis alta (125); &&: p<0.01, &&&: p<0.001, comparada con grupo 5-Fü. E- Modelo de xsenoinjert6o de cáncer de colon humano. La actividad contra tumor in vivo de Novaferon se evaluó en modelos de xenoinjerto LS 180 de cáncer de colon. La linea de célula LS 180 (ATCC número: CL-187) se derivó de un adenocarcinoma de colon humano. El novaferon exhibió inhibición efectiva, dependiente de dosis de crecimiento de tumor LS180 de cáncer de colon comparado con el grupo de control (P<0.001). Los regímenes de inhibición en los grupos tratados con Novaferon (inyección subcutánea diariamente de 1.25, 12.5 o 125 ug/kg durante 28 dias) fueron 75.05, 80.5% y 92.5%, despectivamente, comparados con el grupo de control de PBS (P<0.001, Cuadro 7, abajuo) . El tratamiento de 28 dias de 125 ug/kg de Novaferon logró la inhibición más elevada de crecimiento de t5umor LS 180 (92.5%), que fue significativamente mejor que por 125 ug/kg de HulFN- 2b (82.3%, PzO.001). Siguiendo 38 días de tratamiento, 12.5 ug/kg de Novaferon inhibió el crecimiento de xenoinjertos de cáncer LS 180 de manera similar a 5-Fü (30 mg/kg) en términos de pesos promedio de tumor, (0.815+0.221 gramos contra 0.758+0.227 gramos) . 125 ug/kg de novaferon inhibió el creamiento de tumor de LS 180 significativamente mejor que 30 mg/kg de 5-Fü (92.5% contra 81.8%, P<0.001) (cuadro 7 y figura 8). Esta observación fue extremadamente interesante, considerando la aplicación clínica de rutina de 5-Fü en la quimioterapia convencional a pacientes con cáncer de colon. La mejor supresión por Novaferon de crecimiento de tumor LS 180 en modelo animal indica que Novaferon tiene el potencial de trabajar como un agente de cáncer contra colon muy efectivo en una instalación clínica. Ratones desnudos Balb/c se trataron con una inyección diaria de Novaferon (1.25 ug/kg, 12.5 ug/kg y 125 ug/kg) durante 28 días después de que 4 x 106 células 11. S 180 se introdujeron subcutáneamente en los ratones. Los resultados se expresaron como volumen de tumor promedio (mm3) . La Figura 8 mostró que todas las tres dosis de Novaferon exhibieron inhibición dependiende -de dosis de crecimiento de tumor 1S180 en comparación con el grupo de control PBS (P<0.001) . 125 ug/kg de novaferon indujo la inhibición más fuerte de crecimiento de tumor LAS180 que aquela de HulFN-a2b a la misma dosis (92.5% contra 82.3%, P<0.001) (cuadro 7). Ambos 1.25 ug/kg y 12.5 ug/kg de Novaferon lograron supresión similar (75.0% y 80.5% respectivamente) del crecimiento de tumor en comparación con -FU (81.8%) (Cuadro 7, Figura 8). Sin embargo, 125 ug/kg de Novaferon exhibió mucho mejor inhibición de crecimiento de tumor LS 180 que por 5-FU (92.5% contra 81.85%, P<0.001). Cuador 7. Regímenes de inhibición de peso y crecimiento de tumor de senoinjertos de célula LS 180 de cáncer de colon humano tratados con Novaferon y HulFN-a2b (n=10) Grupo Dosis Peso de tumor (g) Régimen de (ug/kg) (X + SE) Inhibición (%) Control - 4 .170+3. 409 — Novaferon dosis baja 1.25 1 .043+0. 433*** 75 .0 Novaferon dosis media 12.5 0 .815+0. 221*** 80 .5 Novaferon dosis alta 125 0 .314+0. 086***&&&@@@ 92 .5 HulFN-a2b dosis baja 1.-25 1 .225+0. 565*** 70 .6 HulFN-a2b media 12.5 1 .076+0. 442*** 74 .2 HulFN-o¡2b dosis alta 125 0 .740+0. 310*** 82 .3 -FU 30, 000 0 .758+0. 337*** 81 .8 Nota *** p<0.001, comparada con grupo de control; @@@, p<0.001, comparado con HUlFN- 2b, p<0.001, comparr con grupo de 5-FU F. Modelo de xenoinjerto de leucemia humana La actividad contra tumor in ivo de novaferon también se determinó en modelo de xenoinjerto de leucemia linfocítico HL60(s). El Novaferon exbhibió inhibición dependiente de dosis, efectiva de crecimiento de tumor HL60(s) comparado con grupo de control (PzO.001). Los regímenes de inhibición en los grupos tratados con Novaferon (inyección subcutánea diariamente de 1.25, 12.5 o 125 ug/kg durante 28 días) fueron 43; 8%, 55.2% y 80.4% respectivamente, comparado con el grupo de control de PBS (PzO.001, Cuadro 8 bajao9) . 21 días de tratamiento de 125 ug/kg dé Novaferon alcanzaron la inhibición más elevada de crecimiento de tumor HL60(s) (80.4%), que fue significativamente mejor que por 125 ug/kg de HulFN- 2b (69.8%, p<0.05). Ratones Balb/c se trataron con inyección subcutánea diariamente de Novaferon (1.25 ug/kg, k 125 us/kg y 125 ug/kg) durante 21 días después de qu 2 x 107 de células vivas HL60(s) se introdujeron subcutáneamente en los ratones. Los resultados se expresaron como volumen de tumor promedio (mm3) . La Figura 9 mostró que todas las tres dosis de Novaferon exhibieron inhibición dependiente de dosis de crecimiento de tumor LS180 en comparación con el grupo de control de PBS (P<0.001). 125 ug(kg de Novaferon indujo la inhibición más fuerte de crecimiento de tumor LS 180 q7ue aquel de HulFN- 2b en la misma dosis (80.4% contra 698%, Pz0.05), e inhibición similar comparando con 5-FU (figura 9,k Cuadro 8) .

Cuadro 8. Regímenes de peso y crecimiento de xenoinjertos de Célula LS60(S) de leuemia humana tratados con Novaferon y HulFN-2b (n=10) Grupo Dosis Peso de tumor (g) Régimen de Inti- (ug/kg) (X + SD) bición (%) Control - 3. 723+0.750 — Novaferon dosis baja 1.25 2. 091+0.653*** 43. 8 Novaferon dosis media 12.5 1. 668+0665*** 55. 2 Novaferon dosis alta 125 0. 729+0.332***6 80. 4 HulFN-a2b dosis baja 1.25 2. 401+0.698*** 35. 5 HulFN-a2b dosis media 12.5 1. 870+0.660*** 49. 8 HulFN-a2b dosi8s alta 125 1. 124+0.397*** 69. 8 5-FÜ 30,000 0. 893+0.289*** 76. 0 Nota: *** p<0.001, comparado con grupo de control; @ p<0.05, comparado con grupo de HulFN-o¡2b dosis alta. G. Condición general de los ratones durante el tratamiento con Novaferon Los ratones con los diversos xenoinjertos de cánceres humanos se observaron estrechamente durante el período de Novaferon, HulFN-cx2b o tratamiento con 5-Fü. A diferencia de los grupos tratados con 5-Fu, los ratones en todos los grupos tratados con Novaferon o HulFN- 2b generalmente comieron y se compartaron normalmente, y no tuvieron pérdida. Los ratones tratados con 5-FU mostraron cambios típicos de comida y comportamiento y pérdida de peso. Stas observaciones indican que mientras que muestran potencia contra cáncer similar o mejor que 5-FU en los modelos de animal xenoinjertados, el Novaferon puede ser más espeífico hacia la inhibición de célula de cáncer y tienen muchos menos efectos en las células normal y/o funciones fisiológicas. Estas se pueden traducir en una mejor tolerancia y efectos teraéuticos superiores en aplicaciones humanas. Como será evidente a aquellos expertos en el ramo en la luz de la exposición anterior, muchas alteraciones y modificaciones son posibles en la práctica de la invención sin abandonar el espíritu o alcance de la misma. Consecuentemente, el alcance de la invención se debe considerar de conformidad con la substancia definida por las reivindicaciones aneas.

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Claims

REIVINDICACIONES l.-ün polinuycleótido aislado que codifica una proteina que tiene actividades biológicas semejantes a interferón humano, en donde el polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en polinucleótidos cada uno comprendiendo una secuencia de nucleótido cuando menos 95% idéntica a SEC ID No:l. °
2.- El polinucleótdo de conformidad con la reivindicación 1, en donde la secuencia es cuando menos 97% i8dénticda a SEC ID No: 1.
3. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, en donde la secuencia es cuando menos 98% idéntica a SEC ID No: 1
4. - El polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en done la proteina no ocurre naturalmente .
5. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, en donde la proteina tiene actividades antivirales y antiproliferantes mejoradas en comparación con ingerferon alfa 2b humano (HulFN-a2b) .
6. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, en donde la proteina tiene actividad antiviral cuando menos 2 veces mayor que HulFN- 2bg.
7. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 5, en donde la proteina tiene actividad antiproliferante cuando menos 10 veces mayor que HulFN-a2b.
8. - Un vector recombinante que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.
9. - Una célula huésped que contiene el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 8.
10. - Una proteina que no ocurre naturalmente que exhibe actividades biológicas semejantes a interferón humano, en donde la proteina se selecciona del grupo que consiste en proteínas cada una comprendiendo una secuencia de aminoácido cuando menos 87% idéntica a SEC ID No: 2.
11. - La proteína de conformidad con la reivindicación 10, en donde la secuencia es cuando 90% idéntica a SEC ID No. 2.
12. - La proteína de conformidad con la reivindicación 10, en donde la secuencia es cuando menos 95% idéntica a SEC ID No: 2.
13. - La proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en donde la proteína tiene actividad antividal y antiproliferante mejoradas en comparación con HulFN- 2b,
14. - La proteína de conformidad con la reivindicación 13, en donde la proteina tiene actividad antiviral cuando menos 2 veces mayor que HulFN- 2b.
15. - La proteina de conformidad con la reivindicación 14, en donde la proteina tiene actividad antiviral cuando menos 5 veces mayor que HulFN-a2b,
16. La proteina de conformidad con la reivindicación 15, en donde la proteina tiene actividad antiviral cuando menos 10 veces mayor que HulF - 2b.
17. - La proteina de conformidad con la reivindicación 13, en donde la proteina tiene actividad antiproliferante cuando menos 10 veces mayor que HulFN-a2b.
18. - La proteina de conformidad con la reivindicación 17, en donde la proteina tiene actividad antiproliferante cuando menos 50 eces mayor que HulFN-a2b.
19.- La proteina de conformidad con la reivindicación 18, en donde la proteina tiene actividad antiproliferante cuando menos 100 veces mayor que HulFN- 2b.
20. - La proteina de conformidad con la reivindicación 19, en donde la proteína tiene actividad antiproliferante cuando menos 200 veces mayor que HulFN-cx2b.
21. - La proteína de conformidad con la reivindicación 10, en donde la proteína es recombinante .
22. - La proteína de conformidad con la reivindicación 10, en donde la proteina tiene un peso molecular de 19315 daltons.
23. - La proteina de conformidad con la reivindicación 10, opcionalmente comprendiendo un residuo de metionina en el término N.
24. - Una proteina que no ocurre naturalmente que comprende una secuencia que difiere en 0 a 20 aminoácidos de SEC ID No: 2, en donde la proteina exhibe activgidades biológicas semejantes a interferón humano.
25. - La proteina de conformidad con la reivindicación 24, en donde la proteina tiene actividad antiviral y antiproliferante mejoradas en comparación con HulFN- 2b.
26. - La proteina de conformidad con la reivindicaciónb 25, en donde la proteína tiene actividad antiviral cuando menos 2 veces mayor que HulFN- 2b.
27. - La proteína de conformidad con la reivindicación 25, en donde la proteína tiene actividad antiproliferante cuando menos 10 veces mayor que HulFN- 2b.
28. - La proteína de conformidad con la reivindicación 24, en donde la proteína es un análogo de interferón.
29. - La proteína de conformidad con la reivindicación 24, en donde la proteina es recombinante .
30. - Un polipéptido que comprende un fragmento de la proteina de conformidad con la reivindicación 10, en donde el fragmento exhibe las actividades biológicas semejantes a interferón humano.
31. - Una construcción de proteina que comprende la proteina de conformidad con la reivindicación 10 acoplada a una fracción, en donde la construcción exhibe las actividades biológicas semejantes a interferón humano.
32. - La construcción de proteina de conformidad con la reivindicación 31, en done la proteina está glicosilada .
33. - La construcción de proteina de conformidad con la reivindicación 31, en donde la fracción es un polipéptido.
34. - La construcción de proteina de conformidad con la reivindicación 31, en donde la fracción es un no polipéptido.
35. - La construcción de proteina de conformidad con la reivindicación 34, e3n donde la fracción es una molécula de polímero.
36. - La construcción de proteína de conformidad con la reivindicación 35, en donde la molécula de olímero es un polietilenglicol lineal o ramificado.
37.- La construcción de proteína de conformidad con la reivindicación 31, en donde la fracción es una molécula de etiquetado.
38.- Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente.
39.- Un polinucleótido que codifica una proteína de conformidad con la reivindicación 10.
40.- El uso de la proteína de conformidad con la reivindicación 10 como un agente antiviral.
41. - El uso de la proteína de conformidad con la reivindicación 10, como un agente antiproliferante.
42. - El uso de la proteína de conformidad con la reivindicación 10 como un agente contra cáncer.
43. - El uso de la proteína de conformidad con la reivindicación 10, como un agente de inmunomodulación.
44. - Un método para tratar cáncer que comprende administrar a un sujeto en necesidad de terapia una cantidad terapéutifcamente efectiva de la proteína de conformidad con la reivindicación 10.
45. - Un método para tratar una enfermedad viral, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de teraia una cantidad terapeéutiamente efectiva de la proteina de conformidad con la reivindicación 10.
46.- El método de conformidad con la reivindicación 44 o 45, en donde el sujeto es un ser humano.
47.- El método de conformidad con la reivindicación 44 o 45, en donde la proteína se administra junto con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.
48. - Un método para tratar una condición que responde a terapia de interferón, que comprende administrar a un sujeto en necesidad de tratamiento una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de conformidad con la reivindicación 10.
49. - El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la proteína es terapéuticamente efectiva con respecto a una amplia gama de tipos diferentes de cáncer, el cáncer siendo seleccionado del grupo que consiste en melanoma, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular, hematoma, linfoma, carcinoma de próstata, adenocarcinoma gástria, carcinoma de esófago, carcinoma de pulmón, adenocarcinoma de cérviz y carcinoma de cérviz.
50. - Una proteína que no ocurre naturalmente que exhibe acdtividades biológicas semejantes a interferón humano, en donde la proteína tiene una secuencia de aminoácido cuando menos 95% idéntica a SEC ID No: 2 y en donde la proteína tiene actividades antivirales y antiproliferantes mejoradas en comparación con HulFN-a2b.
51.- Un polinucleótido que codifica la proteína de conformidad con la reivindicación 50.
52. - Una composición que comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 50.
53. - Una proteína que tiene la secuencia de aminoácido de SEC ID No: 2 o un fragmento de la misma que comprende cuando menos 146 aminoácidos que exhiben actividades biológicas semejantes a interferón humano.
54. - Un polinucleótido que codifica la proteína de conformidad con la reivindicación 53.