TW200817678A - Use of ADAMTS4 gene and protein polymorphisms - Google Patents

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200817678 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於單核苷酸多形現象(SNPs)及蛋白質多形 現象用於鑑定心血管及周邊血管病變風險增加之用途，以 及關於適合於作為該用途之引子及核酸。此外，本發明係 關於ADAMTS4 (具有凝血因子結構域之去整合素及全屬 蛋白酶)作為找出預防及治療心血管及周邊血管病變有效 【先前技術】 一西方料中，心金管及周邊血管病變，不論於男女均 數位mm括所有影響心臟功能之病 、交]寸別包括心臟組織及心臟血管之病變。周邊血管病變 15 外部任何動脈、靜脈、抓靜脈或淋巴病變之閉 基性或功此性特徵，該術語亦包括如周邊血管疾病 (PVD)。PVD係、動脈粥狀硬化斑於心臟外部血管之堆積。 冠心病，特以冠狀動脈病，可視為心血管病變主要原 Γ:= 交痛’亦稱狹心症’係胸腔暫時性疼痛或壓力 心二肌供乳不足時。當冠狀動脈狹窄或堵塞， 心肌血⑽法增加以達制_供應量，可 起該疼痛（如該心絞痛）。一妒山 、 m 又心絞痛由冠狀動脈 病&成’惟亦可由其它冠心病引起。 均造之疼痛或壓核。該類型之心肌缺 心絞痛之心肌缺血，係視為無症狀缺血。無症_血之ί 20 200817678 險性，在於心肌之傷害未為受影響之個體察覺。因 患或主治醫生常未能察覺心臟組織之可能損宝， 病 損害最終造成錢梗塞。基於該·，診斷方° =該 祭覺血管及心臟之退化屬迫切需要，因其 、以 並導入治療。 、及早構成診斷 高血壓（動脈高血壓）係收縮及/或舒張血壓 (收縮血壓14〇mmHg以上（含）及/或舒張血壓卯瓜瓜^ 以上（含）），可為原發性或繼發性。原發性高血^m H§ 因目前未知；可確定者為其並非由單一因素引起，^ ^ 易感因素，與如環境及營養等因素共同作用。繼二古…、 壓係關於特定類型之腎病或其它病變，如特定之^爾t 周未/σ療之兩血壓早期可極度增加左心室心衰竭、肌 二知礙血及其它可能致命疾病之風險。心肌梗塞係不 可逆之、脱組織壞死，其由長期之組織缺血引起。,、 15 ^ 中風係腦之血液供應突發性崩潰（腦部缺血），其通常 曰細之部分區域並造成神經病變，其性狀與受影響之腦 區j有關。瞬發性缺血發作（TIA)，係與中風具相似病因之 暫=性神經病變，惟其症狀通常具完全可逆性。TIA為時 里至數小日寸（定義為最長24小時）並預示中風發作之 可志（51%於一年内發作，21%於數月内發作）。延長之可逆 缺血性神經缺陷（PRIND)係腦之血液供應持續延滯之障 礙’其症狀通常發生於24至28小時内。PRIND發生後中 風叙作之可能性將增加，類同於TIA。 20 200817678 由於心血管及周邊血管疾病，與社經及個人之重擔相 關’因而極度需要早期診斷及治療該病變。 【發明内容】 從而，本發明之目的係提供改良之診斷及治療心血管 及周邊血管病變之方法。 根據本發明，該等目的之達成，可藉由利用自待檢驗 個體取得之生物樣本内一或多項之ADAMTS4基因單核苷 酸多形現象（SNPs)或ADAMTS4蛋白質多形現象，以之 鑑別心血管及周邊血管病變，或所增加心血管及周邊血管 病變發病之風險。 達成該目的可藉由分析ADAMTS4核酸或蛋白質於 ADAMTS4 核酸序列之位置 635、820、835、2564 及 10570 中之一或多處出現單核苷酸多形現象，及/或於ADAMTS4 蛋白質位置77及720中之一或多處出現蛋白質多形現 象，或分析蛋白質或ADAMTS4之mRNA出現於所採樣本 之量。 ADAMTS4核酸或蛋白質内任何相關位置之核苷酸 或胺基酸類型，可於此以普遍之方法測定。藉由得知特定 位置核苷酸或胺基酸之類型，熟練工作者可迅速測定樣本 所屬個體之風險組別。 ADAMTS4屬於細胞外蛋白酶類之家族，至少包括14 個成員，且亦可視為聚蛋白多醣酶_1(Aggrecanase-1)。 7 200817678 ADAMTS4之基因位於染色體Iq21-q23具編碼837個胺 • 基酸之蛋白質，其由訊號序列、前導肽區（domain)、似去 整合素區及具有型I凝血因子結構域之c·終端區所組成。 ADAMTS4之基質包括細胞外基質蛋白聚集蛋白聚醣 5 (Aggrecan)、分泌型短蛋白聚醣(Brevican)及多功能蛋白聚 醣（Versican) (Int J· Biochem.細胞 Biol. 33(1): 33_44, 2001; Curr Opinion in Pharmacol 2: 322_329, 2002)。目前，聚蛋 白多醣酶ADAMTS4之作用及功能，已於關節病背景下研 究，由於其具有聚集蛋白聚醣之蛋白酶作用，該等醣類於 1〇 關節軟骨内之流失及退化會直接與其病理生理之後續反 應相關。ADAMTS4之表現可於轉錄及/或後轉錄層次調 節，且其於刺激時之表現具鑑別性。ADAMTS4功能之活 化劑包括TGFp、IL-卜TNF阿伐、纖維連結蛋白片段（概 要見 Curr Opinion in Pharmacol 2: 322-329, 2002 及其所 15 引用參考資料）及糖基磷脂醯基肌醇-錨定膜型4-金屬蛋 白酶（MT4-MMP，MMP-17; JBC 2004，Vol. 279，ρ· 10042-1 0051)。該等物質可藉由調節ADAMTS4表現或於 本質上製造之ADAMTS4蛋白質之活化（經由抑制 ADAMTS4抑制劑之表現或功能或活化ADAMTS4活化 2〇 劑之表現或功能）而作用，如Ahrthritis & Rheumatism，2003,

Vol.48，pi 19-133所示之IL-1。IL-l明顯發揮其於 ADAMTS4之調節作用，在於影響ADAMTS4之c_端加 工，其對ADAMTS4蛋白酶活性之專一性與活性具有作用 (JBC 2004, Vol· 279, 15 ρ·10190-10119)。ADAMTS4 之聚 8 200817678 蛋白多醣酶活性受MT4-MMP之C-端加工，以及 • ADAMTS4活化形式與於Syndecan-Ι醣蛋白上之石荒酸軟骨

素或硫酸乙醯肝素殘基結合所正面影響（JBC 2004，Vol. 279, ρ· 10042-10051)。現已自人類腦部cDNA資料庫原始 5 分離出ADAMTS4之基因，並原始命名為KIAA0688 (DNA

Res.5: 169-176, 20 1998) 〇 ADAMTS4基因之序列已知於此技術中。基因 ADAMTS4序列之一部份可自NCBI核苷酸資料庫之編 號NM一005099.2 (SEQIDNo.l)取得。完整之該基因編碼核 1〇 酸序列可由編號AY044847.1 (SEQ ID Νο·2)取得。所衍生 之蛋白質序列（SEQIDNo.3)可自NCBI核苷酸資料庫中 編號 NM一005099.3 下取得，而 mRNA 序列（SEQIDNo.16) 亦可相同於編號NM—005099.3下取得。NCBI為生物資訊 國家中心（郵政地址：National Center for Biotechnology 30 15 Information, National Library of Medicine, Building 38A?

Bethesda，MD 20894，USA;網址.www.ncbLnhm.nih.gov)。 相互有關之本批發明係基於對ADAMTS4基因於一組 臨床病患之染色體層次之研究’其由發明者實施以預測 ADAMTS4基因及/或蛋白質之變異於臨床所造成之影 2〇 響，以及預測帶有該等變異體之攜帶者之表現型圖像。 單核苷酸多形現象(SNPs)為含有在個別位置的取代之 特定核苷酸序列之變異體，並為熟習該項技術之工作者所 熟知。此處所用之蛋白質多形現象一語包括任何蛋白質之 9 200817678 初級結構（即胺基酸序列）、次級結構（即蛋白折疊）及/或三 =結構（即來自相異多肽次單元之蛋白質組合）之任何改 變’且較佳為包括由編碼蛋白質的基因之一或多項SNp引 起之改變；例如胺基酸交換、胺基酸缺損或蛋白質截斷。 、，ADAMTS4基因之相異單核普酸多形現象(SNp)已知於先 前技術中且可於NCBI資料庫公開取得，如 http.//www.ncbi.nlm.nih.q〇v/SNP/snp ^叫1?1。〇181(1=9507。 然而，目前本發明所根據之ADAMTS4基因之基因多 形現象，以及該多形現象之ADAMTS4與發展為心血管及 周邊血管病變之素因之間之關聯尚屬未知。 本發明者所進行實驗已初次證實，於ADAMTS4基因 之特疋變異，將以具統計學顯著性之頻率發生於罹患心血 官及周邊血管病變之人類中。為評估SNp其中之可能關 係，或ADAMTS4基因或蛋白質於疾病開始發生及發展時 之變異體，已細部分析ADAMTS4之基因變異體，且已於 洋細疋義之病患組別中進行基因型-表現型關係分析。結果 驚奇地發現，ADAMTS4多形現象與心血管及周邊血管病 變之素因相關。ADAMTS4基因之多形現象與該等疾病之 素因之相關性先前從未經發現，且鑑於ADAMTS4已知與 關節病相關之功能，新發現可視作全新驚喜。 本發明之不同面向，可應用於所有動物或人類。較優 之代表物可用於哺乳類及/或人類。據此而論， ADAMTS4 (代表核酸、蛋白質、多形現象等等）一語表示 10 200817678 來自任何物種之動物或人類之ADAMTS4。ADAMTS4較 • 叙之代表物表示來自哺乳類及/或人類之(hs) ADAMTS4。 - 從而本發明之另一面向，係ADAMTS4蛋白質或核酸 或其功能性片段，作為自待檢驗個體取得之生物樣本鑑定 5 心血管及周邊血管病變，或作為鑑別發展心血管及周邊血 管病變風險增加之用途。 下列最常見、出現於特定ADAMTS4基因及/或核酸或 蛋白質中之位置之核苷酸或胺基酸，代表最頻繁變異體或 「野生型」。因此，若本案中提及之於AdAMTS4基 ίο 因及/或核酸或蛋白質内部位上核苷鹼基或胺基酸之 取代或突變，或ADAMTS4基因及/或核酸或蛋白質之較不 頻繁變異體，其係關於野生型以外之核苷鹼基或胺基酸或 最頻繁變異體於ADAMTS4基因、核酸或蛋白質内之給定 位置之存在。 15 ADAMTS4-G635G描述組別之人，相關於ADamTS4 基因之一對對偶基因上之參照序列NM—005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置635均具有鳥苷（G)。該等多形現象造成 相關於參照序列SEQ ID 3 (自ΝΜ一005099.3衍生之蛋白 質序列）之位置77具有丙胺酸（Ala或A)胺基酸（Ala77) 2〇 之ADAMTS4蛋白質。該組別之人相關於該ADAMTS4 變異體係為同型合子。如表5所示，核普酸g係 ADAMTS4基因之位置635之最頻繁變異體，且胺基酸丙 胺酸係ADAMTS4蛋白質之位置77之最頻繁變異體。 11 200817678 ADAMTS4-G635A描述組別之人，於ADAMTS4之對 - 偶基因之一相關於參照序列NM_005099.2 (SEQ ID No.l) . 中位置635具有鳥苷（G)，導致相關於相應蛋白質位置77

之胺基酸丙胺酸（Ala或A)。該組人於ADAMTS4基因 5 之另一個對偶基因相關於參照序列NM_005099.2 (SEQ ID No· 1)中位置635上具有一腺苷(A)，導致ADAMTS4蛋 白質中位置77 (Thr77)之胺基酸蘇胺酸（Thr或T)。該等 人相關於該ADAMTS4變異體係為異型合子。

ADAMTS4-A635A描述組別之人，於ADAMTS4基因 if) 之對偶基因二者相關於參照序列NM_005099.2 (SEQ ID # No·1)之位置635上具有一腺苷（A)，導致ADAMTS4蛋白 質位置77(Thr77)之胺基酸蘇胺酸（Thr或T)。該等人相 關於該ADAMTS4變異體係為同型合子。

ADAMTS4_G820G描述組別之人，於ADAMTS4基因 15 之對偶基因二者相關於參照序列NM—005099.2 (SEQ ID

No· 1)之位置820上具有一鳥苷（g)。該多形現象導致 ADAMTS4蛋白質相關於參照序列SEqID3(衍生自nm 005099.3之蛋白質序列）之位置i31 (ThrB1)具有胺基酸蘇 胺酸（Thr或T)。該等人相關於該adAMTS4變異體係為 20 同型合子。如表3所示，核苷酸T係ADAMTS4基因位 置820之最頻繁變異體。 ADAMTS4 -G820A描述組別之人，於ADAMTS4基

因對偶基因之一相關於參照序列NM—005099.2 (SEQ ID 12 200817678

No· 1)之位置820上具有一鳥苷（g)，導致相關於相應蛋 * 白質位置131 (Thrl81)之胺基酸蘇胺酸（Thr或τ)。該組人 . 於ADAMTS4基因之另一對偶基因相關於參照序列 NM—005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置 820 上具有一腺苷 5 (Α)。於ADAMTS4蛋白質位置131之胺基酸維持相同。 該等人相關於該ADAMTS4變異體係為異型合子。 ADAMTS4 -A820A描述組別之人，於ADAMTS4基 因之二對偶基因相關於茶照序列NM_005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置820上具有一腺苷（A)。該等人相關於該 10 ADAMTS4變異體係為同型合子。 ADAMTS4 -C835C描述組別之人，於ADAMTS4基因 之二對偶基因相關於參照序列NM—005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置835上具有一胞核苷（C)。該多形現象導致 ADAMTS4蛋白質相關於參照序列 SEQ ID 3 (自 15 NM—005099.3所衍生蛋白質序列）之位置136 (Prol36)具有 胺基酸脯胺酸（Pro或P)。該等之人相關於該ADAMTS4 變異體係為同型合子·如表2所示核苷酸C係ADAMTS4 基因位置835之最頻繁變異體。

ADAMTS4-C835T描述組別之人，於ADAMTS4基因 2〇 對偶基因其中之一相關於參照序列NM_005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置835具有一胞核苷（C)，導致相關於相 應蛋白質於位置136 (Prol 36)之胺基酸脯胺酸（Pro或Ρ)。 該組人於ADAMTS4基因之另一對偶基因相關於參照序列 13 200817678 NM—005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置 835 具有胸腺，咬 • ⑺。ADAMTS4蛋白質位置说之胺基酸維持相同。該等人相 ^ 關於該ADAMTS4變異體係為異型合子。

ADAMTS4-T835T描述組別之人，於ADAMTS4基因 5 之一對偶基因相關於參照序列NM 005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置835均具有一胸腺嘧啶（τ)。該等人相關於該 ADAMTS4變異體係為同型合子。 ADAMTS4 -C2564C描述組別之人，於ADAMTS4基 因之二對偶基因上相關於參照序列NM 005099.2 (SEQ ίο ID Ν0·1)之位置2564均具有一胞核苷（c)。該多形現象 導致ADAMTS4蛋白質相關於參照序列SEq id 3 (ΝΜ_005099·3所衍生之蛋白質序列）之位置wo (pr〇72〇) 具有胺基酸脯胺酸(Pro或P)。該等人相關於該adAMTS4 變異體係為同型合子。如表1所示，核苷酸C係ADAMTS4 15 基因位置2564之最頻繁變異體，且胺基酸脯胺酸為 ADAMTS4蛋白質位置720之最頻繁變異體。 ADAMTS4-C2564G描述組別之人，於ADAMTS4基 因對偶基因其中之一相關於參照序列NM_005099.2 (SEQ ID No.l)之位置2564具有一胞核苷（〇，導致相關於相應 20 蛋白質於位置720(Pro720)之胺基酸脯胺酸（pro或P)。該 組人於ADAMTS4基因之另一對偶基因相關於參照序列 NM-005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置 2564 具有一鳥苷（G)， 導致相關於相應蛋白質位置720 (Ala 720)之胺基酸丙胺酸(Ala 14 200817678 或A)。該等人相關於該ADAMTS4變異體係為異型合子。 * ADAMTS4 -G2564G描述組別之人，於ADAMTS4基

、 因之二對偶基因相關於參照序列NM_005099.2 (SEQ ID Νο·1)之位置2564上具有一鳥苷（G)。該多形現象導致 5 ADAMTS4蛋白質相關於參照序列SEQ ID 3 (自 ΝΜ__005099·3衍生蛋白質序列）之位置720具有胺基酸丙 胺酸（Ala或A)。該等人相關於該ADAMTS4變異體係為 同型合子。

ADAMTS4-A10570A描述組別之人，於ADAMTS4基 10 因之二對偶基因相關於參照序列AY044847.1 (SEQ ID Νο·2)之位置10570上具有一腺苷（A)。該等人相關於該 ADAMTS4變異體係為同型合子。由於位置1〇57〇位於 3’ -UTR (未轉譯區）内，其對ADAMTS4蛋白質之胺基酸 序列不造成任何影響。如表4所示，核苷酸A係ADAMTS4 15 基因位置10570之最頻繁變異體。 ADAMTS4 -A1 0570G 描述組別之人，於 ADAMTS4 基因之對偶基因相關於參照序列AY044847.1 (SEQ ID Νο·2)之位置10570具有鳥苷（G)，且ADAMTS4基因之另 一對偶基因相關於參照序列ΑΥ044847.1 (SEQ ID Νο.2) 20 之位置10570具有腺苷（Α)。該等人相關於該ADAMTS4 變異體係為異型合子。 ADAMTS4 -G10570G 描述組別之人，於 ADAMTS4

基因之二對偶基因相關於參照序列Αγ〇44847·1 (SEQ ID 15 200817678 Νο·2)之上位置10570具有一鳥苷（G)。該等人相關於該 • ADAMTS4變異體係為同型合子。 • ADAMTS4基因内之基因變異可被偵測，例如： a) 於染色體DNA層次進行基因變異之直接檢測，其對 5 可含該基因變異（此處特指ADAMTS4基因之參照序 歹)J NM—005099.2 位置 635、820、835、2564 或參照 序列AY044847.1位置10570等區域）之ADAMTS4 基因進行分子生物分析。 b) 經由測量ADAMTS4 mRNA表現之债測。 c) 經由偵測ADAMTS4蛋白質之蛋白質多形現象，此處 特指ADAMTS4多胜肽鏈之位置77及/或720。 d) 間接偵測，其經由蛋白質-化學方法測定ADAMTS4 蛋白質出現於細胞、組織或體液之量及/或活性。 可於核酸層次（此為染色體DNA)偵測ADAMTS4基 5 因内於以上爹照序列内以上位置之一之基因變異或多形 現象，例如： 1)以ADAMTS4基因内該區域之核酸序列定序為基礎之 方法（如焦磷酸測序，使用幅射標記或螢光染色標記 標定之核普酸定序，或使用質譜儀分析該核酸序列 2〇 2)以ADAMTS4基因内該區域之核酸序列雜交為義礎之 方法（如以「DNA微陳列」）； ^ 3)以ADAMTS4基因内a亥£域之核酸序列之增幅產物八 16 200817678 析為基礎之方法（如TaqMan分析）。 亦可以核酸層次（此為染色體DNA),偵測ADAMTS4 基因内相關於以上參照序列之一之以上位置之一或多處 之基因變異或多形現象，例如以測量表現之ADAMTS4 5 mRNA為基礎，經由： I) 以ADAMTS4基因内核酸序列雜交為基礎之方法方法 (如以「DNA微陣列」、北方墨點法）； 2) 以ADAMTS4基因内核酸序列之增幅產物分析為基礎 之方法（如TaqMan分析、差別性RNA顯示法、代 10 表性差異分析）。 另外，可經由分析ADAMTS4蛋白質之量及/或活性 偵測以上參照序列之一之以上位置之一或多處之基因變 異或多形現象基因變異或多形現象。例如，可以下列方 法為基礎，偵測ADAMTS4蛋白質之量及/或活性： 15 0 以ADAMTS4蛋白質量之定量偵測為基礎之方法 (如西方墨點分析法、ELISA測試） 2) 以經由體外測試系統，例如於人類細胞、動物細胞、 細菌及/或酵母細胞中進行之ADAMTS4蛋白質活性 之功能性偵測為基礎之方法。 20 ADAMTS4蛋白質相關於參照序歹ij ΝΜ_005099·3 (SEQ ID Νο·3)之位置77或720内一或二者之蛋白質多 形現象可以分辨例如ADAMTS4蛋白質内位置77之丙胺 17 200817678 酸或蘇胺酸或位置720之脯胺酸或丙胺酸之專一性抗體而 • 偵測。 、 ADAMTS4基因内上述位置之一之基因變異或多开> 現 象之偵測可用作，例如（a)評估心血管及周邊血管病變風險 5 之基因標遠’如·周邊血官疾病、高血壓、中風 /PRIND/TIA、不穩定型心絞痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞 及/或冠心病（b)作為心血管及周邊血管病變之預防性治療 之標諸，如：相應基因變異體之攜帶者内之周邊血管疾 病、高血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定型心絞痛、早期心 ίο 肌梗塞、心肌梗塞及/或冠心病之標誌、（c)調節用於心血管 及周邊血管病變之藥學活性物質之投與劑量之標誌，如： 周邊血管疾病、高血壓、中風/PRIND/TIA、不穩定型心絞 痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞及/或冠心病、（幻用於測定 心血管及周邊血管病變之藥學活性物質鑑定之高效能篩 15 檢策略之標誌、’如：周邊血管疾病、高血壓、中風 /PRIND/TIA、不穩定型心絞痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞 及/或冠心病（e)用以鑑定臨床研究之相關個人或病患之標 誌、，以測试心血管及周邊血管病變藥用物質之適用性、安 全性及效力’如：周邊血管疾病、高血壓、中風 20 /PRIND/TIA、不穩定型心絞痛、早期心肌梗塞、心肌梗塞 及/或冠心病，以及（f)發展以DNA、RNA或蛋白質層次 以分析ADAMTS4基因内基因變異之測試系統之基礎。 發明者之上述分析第一次顯示ADAMTS4多形現象 與發展心血管及周邊血管病變之素因間之相關性。 18 200817678 從而，本發明之另一面向係著重ADAMTS4蛋白質 或核酸或其片段之用途’其用以自待測者所採得生物樣 本，鑑定心血管及周邊血管病變或發展心血管及周邊血管 病變之風險增加。 5 10 15 然而本發明之其它面向係著重用以鑑定個體之心血 管及周邊血管病變或發展心血管及周邊血管病變之風險 增加之方法，其包括檢驗自個體所採得樣本之核苷酸類 型，其出現於ADAMTS4基因之對偶基因之一或二中位置 635、82〇、835、2兄4及10570之一或多處，出現於該一 或多處位置之核苷酸類型，對該個體罹患或發展心血管及 周邊血管病變之風險具指標性。 從而’本發明亦係關於用以鑑定個體心血管及周邊血 官病、交或發展心血管及周邊血管病變之風險增加之方 法’其包括檢驗自個體所採得樣本出現於aDAMTS4蛋白

質多胜肽鏈位置77 u L 、直77及720中之一或二者之胺基酸類型， 出現於^或多處位置之胺基酸類型對該個體罹患或發 展〜血&及周邊血管病變之風險具指標性。 岡、真具體實例’本發0㈣錢於鑑定個體心血管及 #、、&， 次1展〜血管及周邊血管病變之風險增加 mRNA夕二匕括檢驗自個體取得之樣本，其ADAMTS4 考樣本中樣本中出現之_，是否與—或多項參 參考樣本可為 取自具有一或多項以下基因及/或蛋白 19 20 200817678 質變異體之一或 飞夕個體之樣本： i·腺苷以外之核苷酸， 基因之對偶式因，且較優為鳥苷，位於ADAMTS4 序列位置63^5 •中之一或二者上ADAMTS4基因組 b·腺苦以外之核_ 基因之對偶基因 敎優為鳥芽，位於ADAMTS4 序列位置82二·中之一或二者上ADAMTS4基因組 c· 胸腺嘧啶以外之4 10

ADAMTM Λΐϋ#/苷酸，且較優為胞核苷，位於 組序列位置偶基因之二者上ADAMTS4基因 d. 美因斟他=核苷馱’且較優為胞核普，位於AD AMTS4 基因之—或二者上—4 列 位置2564 ; e ^ X外之核苦酸，且較優為腺芽，位於ADAMTS4 土口對偶基因之—或二者上ADAMTS4基因組序列 位置10570; f·丙月安酸以外之胺基酸，且車交優為蘇胺酸，位於 ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置77 ; g·膽胺酸以外之胺基酸，且較優為丙胺酸，位於 ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置wo ; 出現不同之量係顯示該個體罹患或發展心血管及周邊血管 病變之風險增加。ADAMTS4量之改變，如ADAMTS4層 20 20 200817678 次之改變，可由於所有層次之表現（轉錄、轉譯、剪接）之 • 影響、轉譯後調控、蛋白質或原蛋白質之運輸、或蛋白質 、 穩定性之影響，以及訊號轉導路徑於ADAMTS4表現作用 之影響所引起。 5 本發明之其它面向係著重測定罹患心血管及周邊血 官病變風險之方法，包括分析自個體分離之樣本中前述 SNPs或蛋白質多形現象中一或多項之存在，並計算根據病 患年齡’及核苷酸類型或胺基酸出現於ADAMTS4基因位 置 635、820、835、2564 及 10570，或於 ADAMTS4 蛋白 1〇 吳位置77或720之一或多處之預計風險。風險測定之基 礎係表1至1〇、圖8至12之結果，且亦可根據實施例中 描述組別之分析所得額外之數據。 本發明之任何具體實例或面向中之心血管或周邊血 ，病受可為如周邊血管疾病、南血壓、中風/PrINd/tia、 15 不穩定型心絞痛、心肌梗塞、早期心肌梗塞及任何病理陳 述，其需要進行冠狀動脈成形手術者。 此處所標示之核苷酸位置表示參照序列 NM—005099.2 ISEQ ID No.l、NM—005099.3/SEQ ID No 16 或AY044847.1/SEQ ID Νο·2中核苷酸之位置。至於 20 ADAMTS4胺基酸序列，胺基酸位置代表或代表圖3•之參 照序列ΝΜ一005099.3/SEQIDN〇.3。位置自1即參照序列 之第一個胺基酸或核苷酸開始，除非核苷酸序列上核苷酸 之號碼前為a +或a -，於該情況下核苷酸位置係以相關於 21 200817678 轉譯位置所給予。 • 以下將使用標準縮寫，與核苷酸及胺基酸之用法(如三 - 字母或一字母之簡碼）同義。 核酸可為任何寡或多核苷酸’「寡核皆酸」一語著重 5 於2至25核皆酸之核酸’而「多核苷酸」一語表示具有 26及更多核苷酸之核酸。 本申請案中，蛋白質序列、胺基酸序列及多胜肽序列 等語可以同義使用。 與人類ADAMTS4變異體相關之臨床效應數據目前 10 未有揭露。令人驚訝地，本發明者之研究已能緊密聯結不 同ADAMTS4變異體之存在，特別為ADAMTS4基因之 G635A、A635A、G820A、A820A、C835T、C2564G、 G2564G、A10570G及G10570G變異體與心血管及周邊 血管病變之素因之關係。 5 ADAMTS4基因之基因多形現象之债測，特別是 G635A、A635A、G820A、A820A、C835T、C2564G、 G2564G、A10570G及G10570G變異體中之一或多項，且 特優以 A635A、A820A、C835T、G2564G 及 G10570G 變 異體中之一或多項，可作為（例如）預防性治療及預防性 10 措施（用樂、生活型態）之基因標記，用以（a)延後甚或預防 心血管及周邊血管病變之發生，諸如周邊血管疾病、高血 壓、中風/PRIND/TIA (PRIND為延長性缺血發作；ΉΑ為 瞬發性缺血發作）、不穩定型心絞痛、心肌梗塞、早期心肌 22 200817678 梗塞，及任何病理陳述，其需要進行冠狀動脈成形手術， • 或用以緩和或阻止之後更加嚴重之病程進行及病理後發 病，或者(b)作為調整投藥之基因標記，或者(c)作為基因 標記以設計監控用藥，或者(d)作為鑑定及於適用處選擇特 5 定病患進行治療或用藥研究之基因標記。 本發明之方法可早期發現心血管及周邊血管病變之 素因，因而使典型症狀，如組織損害所致之疼痛感發生 前，可能進行早期預防性或具療效治療措施：具備技巧之 主事工作者鑑別出本發明之多形現象或ADAMTS4層次穩 1〇 態之改變，將予治療或檢驗臨床醫師一明確之辨認標記， 用以監控已發生之血管或心臟組織持續性損害，或用以投 ，與預防性用藥，甚或於相應損害或疼痛發生前即用以建議 生活型態之改變。 此外，該等變異體與心血管及周邊血管病變之素因間 15 關聯之新穎發現可允許使用更有效之治療，其藉由暗示特 定用藥劑量之改變或改變對不具該等ADAMTS4基因突變 病患之治療需要而得。 據此，本發明亦係關於： a)ADAMTS4基因内一或多單核苷酸多形現象（SNP5)， 2〇 b) ADAMTS4蛋白質或核酸或其功能性片段， 用於調整用藥之劑量以預防及/或治療心血管及周邊血管 病變。 23 200817678 更有甚者，本發明係關於調整用藥劑量之方法，以預 防及/或冶療個體之心血管及周邊血管病變，其方法包括檢 . 驗自個體取得之樣本之 a) 核苷酸類型，其出現於ADAMTS4基因對偶基因一或 5 二者位置635, 820, 835, 2564及10570中之一或多處， 及/或 b) 出現於ADAMTS4蛋白質内位置77及720—或二者之 胺基酸類型， 該劑量依出現於一或多處該位置之核苷酸或胺基酸類型調 10 整。 一具體實例包括檢驗自個體取得之樣本中，是否 ADAMTS4基因對偶基因中一或二者具有一或多項以下 SNP ： a)腺苷於ADAMTS4基因序列之位置635; 一5 b)腺苷於ADAMTS4基因序列之位置820 ; c) 胸腺嘧啶於ADAMTS4基因序列之位置835 ; d) 鳥苷於ADAMTS4基因序列之位置2564; e) 鳥苷於ADAMTS4基因序列之位置10570; 於該等多形現象之一或多項存在之情形下，用藥劑量可減 20 少或增加。 其它具體實例包括檢驗自個體取得之樣本中，是否 ADAMTS4基因對偶基因中之一或二者，於上列位置之一 24 200817678 或多處具有以上所列核苷酸之外者，於其它核苷酸存在之 • 情形下，用藥劑量可為減少或增加。另一核苷酸較優為： a) 鳥苷於ADAMTS4基因序列之位置635及/或820， b) 胞核苷於ADAMTS4基因序列位置835及/或2564或， 5 c)腺苷於ADAMTS4基因序列位置1〇570。 根據本發明之另一代表方法，調整治療及/或預防個體 心血官及周邊血管病變用藥劑量之方法包括檢驗自個體取 得之樣本，ADAMTS4 mRNA之數量及/或該樣本中出現之 蛋白質，是否與一或多項參考樣本出現者不同。參考樣本 10 可為如自個體所採得具有一或多項以下基因及/或蛋白質 變異體之樣本： a·腺苷以外之核苷酸，且較優為鳥苷，於ADAMTS4基 因序列位置635,於ADAMTS4基因對偶基因之一或 二者； 5 b·腺苷以外之核苷酸，且較優為鳥苷，於ADAMTS4基 因序列位置820,於ADAMTS4基因對偶基因之一或 二者； c·胸腺嘧啶以外之核苷酸，且較優為胞核苷，於 ADAMTS4基因之二對偶基因，ADAMTS4基因序列 2〇 位置835 ; d·鳥苷以外之核苷酸，且較優為胞核苷，於AD AMTS4 基因序列位置2564，於ADAMTS4基因對偶基因之 25 200817678 一或二者； e· 鳥苷以外之核苷酸，且較優為腺苷，於ADAMTS4基 因序列位置10570，於ADAMTS4基因對偶基因之一 或二者； 5 10

f· 蘇胺酸以外之胺基酸，且較優為丙胺酸，於ADAMTS4 蛋白質多胜肽鏈之位置77 ; g·丙胺酸以外之胺基酸，且較優為脯胺酸，於ADAMTS4 蛋白質多胜肽鏈之位置720 ; 該劑量調整依據為於自個體採得樣本之蛋白質及/或 mRN A罝是否與自具有一或多項上述a至g變異體之一或 多個體採得之參考樣本者不同。 ADAMTS4基因變異體之存在，尤其是ADAMTS4 G635A、A635A、G820A、A820A、C835T、C2564G、 G2564G、A10570G及/或G10570G變異體之存在，具有指 標性功能。先前已知治療或預防^血管及周邊血管病變之 用藥具多重性。由於並非所有用藥對所有患有相同疾病之 病患均具相f效應，初次、冶療之病患通常必須「適應」所 使用之心^管用藥’如治療之臨床醫師事實上須測試病患 们體何等^里、何種用藥具有所需效用，且同時副作用 處之缺陷’係未預先得知是否病㈣ 二=用=所定劑量)緩和或停止。其亦未能預先正 疋忒病患將罹患不希望得到之副作用。 本文内合中，辨別出病患具有特定ADAMTS4基因變 26 20 200817678 異體或具有相當量之ADAMTS4核酸或蛋白質，與治療前 罹患心血管或周邊血管病變之特定可能性間之關聯，可增 進一特定用藥治療成功之可預測性：特定ADAMTS4基因 之變異體，與心血管及周邊血管病變之發生之關聯，表示 此等ADAMTS4變異與個體體内最終對「該個體較其它個 體罹患心血管及周邊血管病變之可能性高或低」具效應之 生理改變同時發生。於不同個體之各種用藥各異之效力須 置於不同病患個體生理條件之背景觀之。指定一個體屬於 一組特定生理背景之病患，將使已經臨床研究證明之特定 用藥得以達到特定效用，以便較佳使用，且可避免使用相 較於不具該變異體之病患’對該組病患效用較小，或易產 生非必需副作用之用藥。 一般而言，於治療前對該等病患個體進行分類為不可 能。惟本發明之多形現象關聯於心血管疾病發生之知識使 此事成為可能。從而，於臨床研究中具有相同基因變異體 之各組病患之治療，表現良好成功率之用藥可較佳地使用 於ADAMTS4基因具有〆變異之病患；反之，於^病時， 將避免使用相較於具不同基因變異體之病患組，對該病患 組所具效用較小或對發生非必需副作用具高可能性之用 藥。此舉將降低病患原需「適應」藥物使用之風險並增加 成功治療之可能性。 因此，本發明之進一步面向係關於： a) ADAMTS4基因内一或多單核苷酸多形現象(SNp)， 27 200817678 b) —或多項ADAMTS4蛋白質内多形現象及/或， c) ADAMTS4蛋白質或核酸或其片段， 用於鑑別對治療及/或預防心血管及周邊血管病變之用藥 具有反應之個體。 5

10 15 該等鑑別之進行，可經由（例如）檢驗自個體採得樣 本是否： a. ADAMTS4基因對偶基因之一或二者具有一或多項以 下變異體，該核苷酸之存在為樣本所屬個體對用藥具有 反應之指標： 1·腺苷於ADAMTS4基因組序列位置635 2·腺苷於ADAMTS4基因組序列位置82〇 3·胸腺嘴咬於ADAMTS4基因組序列位置835 4.鳥音於ADAMTS4基因組序列位置2564 5·鳥皆於ADAMTS4基因組序列位置ίο;?。 b. ADAMTS4基因對偶基因之—或二者具有一或多項以 下變異體，其存在成為樣本所屬個體對用藥具有反應之 指標： …、 〜 1·腺苷以外之核苷酸，且較優為鳥苷於ADAMTS4 基因序列位置635 2·腺苷以外之核苷酸，且較優為鳥苷於ADAMTS4 基因序列位置820 28 20 200817678 3· 胸腺嘧啶以外之核苷醅，η ^ π 甘黾，且較優為胞核苷於 ADAMTS4基因序列位置 4· Μ以夕卜之核普酸’且較優為胞料於adA·% 基因序列位置2564 5· 卜un且較優為料於adamts4 基因序列位置10570 C·樣本中ADAMTS4mRNA及/或蛋白質之量不同於一或 多件比較/參考樣本者’例如自一或多具有相關於 ADAMTS4基因（如之一或多項多形現象）已知 10 基因背景之參考個體取得者，不同量之出現為樣本所屬 個體對用藥具有反應之指標。 d· ADAMTS4蛋白質具有多形現象Ala 77、Thr 77、pr〇 720或Ala720中'一或多項。 以其它鑑定方法及程序為之亦屬可信。 本發明不同面向之核苷酸類型之測定可根據已知方 法進行。可藉由（例如）以下方法達成：

a) 提供包括基因DNA之分離生物樣本，或提供分離基 因之DNA b) 以PCR反應增幅核酸，使用可增幅包括adamTS4 基因組序列位置635、820、835、2564及/或10570 之核酸之一或多處之引子 c) 疋序b)定義之核酸。 29 20 200817678 其它測定核普酸類型之可能方法為（例如）··

a) 提供包括基SDNA之分離生物樣本或提供分離之基 因DNA b) 固定基因之DNA於適用之支撐物上； 5 10 C)與固定之-❹個DNA探針雜交，雜針於標準狀 況下，可與具ADAMTS4(基因組)序列之核酸作專一 性結合，且該探針對ADAMTS4基因位置635、82〇、 835、2564及/或10570之一或多處之特定核苷酸具專 一性0 根據其它方法’核苦酸類型亦可以上述二方法為基礎 測定，惟使用自RNA產生之cDNA代替基因dna。 mRNA之量可以（例如）下列方法測定： a.提供包括m職之絲生物縣或提供自a)樣本分 離之mRNA ; ά b.以Rt-pcr增幅核酸，使用可增幅自 mRNA取得之核酸之引子； ADAMTS4 將所增幅核酸之定| | 夂心疋里亚與自至少一件參考樣本增幅 (如陽性及/或陰性触樣本)之核酸比較。 陽性或陰性對照用於驗證任何时 學、生化或化學）反應結果之概念，為具有技巧之工作者 熟知。其包括（例如）與原始分析性實驗侧之方式= 反應’惟缺乏一或多經定義成分（如缺之ADAMTS4蛋 30 20 200817678 白質或mRNA或缺乏專一性ADAMTS4抗體等），以自所 謂“背景，，訊號（固定分析性方法造成之人工訊號）（陰性對 =組）中分辨出專一性訊號之結果。其亦包括與原始:析性 實驗相同之方式進行之反應，惟使用額外之成分，其將形 成已知訊號，以便於一般情形（陽性對照組）下驗證該反應 狀況。 μ 10 a·b. c·d. 另一測定mRNA之量之可能方法係： 提供包括mRNA之±物#本錢供絲恤财; 將mRNA轉移至適合之支撐物； 以至少一種適合之探針偵測並定量於支 ADAMTS4 mRNA ； 撐物上之 15 a· b. c· 與一或多件參考樣本(如陽树及 性及/或陰性對照樣本）比較 ADAMTS4 mimA < i。 u 4 八。平乂 然而其它可能之方法包括： 提供個體之組織樣本；以與適合之mRNA控处、任"私丄ADAMTS4 m職之^ 乂反應之方式债測 里偵測並刀析經雜交之探針量； 與-❹件參麵、雜及/ ADAMTS4 mRNA 之量。 丁，、、、布水本）1；(^乂 之鑑別可藉由以 蛋白質之量測定，或蛋白質多形現象 下方式達成： 白質 a.提供待檢驗個體之生物樣本，其包括蛋 31 20 200817678 b·較優為自a)之樣本分離出蛋白質； c·將蛋白質轉移至一適合之支撐物； d.以至v種抗體專一性或專_於特定—舰似蛋 白質多形現象之ADAMTS4蛋白質偵測蛋白質；並 5 e·㈣號定量並將之與自至少-件參考樣本（如陰性對 照組及/或陽性對照組樣本)取得之訊號比較。 其它可能測定蛋白質量或鑑別特定蛋白f多形現象 之方法包括： • a. 提供個體之組織樣本； 10 b·以與適合之ADAMTS4抗體之結合反應偵測 ADAMTS4蛋白質之量，偵測並定量該量； c·與一或多件參考樣本(如陽性及/或陰性對照樣本）比較 ADAMTS4蛋白質之量。 特定蛋白質多形現象之測定可藉由使用對抗 15 ADAMTS4蛋白質之抗體達成： a· 相對於多胜肽鏈位置77具其它胺基酸，尤其丙胺酸之 ADAMTS4蛋白質，於多胜肽鏈位置77具蘇胺酸之 ADAMTS4蛋白質具有可偵測較高結合親和力，及/ 或 2〇 相對於位置720具其它胺基酸，尤其脯胺酸之ADAMTS4 蛋白質，於多胜肽鏈位置720具丙胺酸之ADAMTS4蛋 白質，具有可偵測較高結合親和力。 32 200817678 於此關聯中，「J：装士 十「拉P ^ 木η本」或彳木传或分離樣本」一語表 示自病患取得之生物材料。生物材料尤其可包括：細胞或 其製備品或組織或H官或體液（如淋巴液、唾液、血液、 皮膚、結締組織等組織)之—部分，或細胞，較優為容易移 除之細胞，例如黏膜細胞。此類生物材料可以一般方法取 得，諸如棉棒採樣、採血、組織穿刺或手術技術(如切片生 檢）。樣本較優為組織檢體，細胞製備品、細胞（例如黏膜 細胞）、細胞組織、純化DNA、mRNA或蛋白質或體液（如 唾液、淋巴液或血液）或其該樣本之抽出液或製備品。細 胞或組織之自然存在分子之純化，及細胞或組織抽出液之 製備’為具備技術者所熟知（亦可見下列標準文獻之例）。 DNA/RNA或蛋白質製備品可由彼以一般技術取得。 由於ADAMTS4多形現象已為本申請案初次鑑別為 與心血管及周邊血管病變有關，本批相關之發明亦著重 ADAMTS4蛋白質或核酸或其功能性片段，作為尋找治療 及/或預防心血管及周邊血管病變有效物質之用途。 根據本發明不同面向之一具體實例，ADAMTS4、其衍 生物或其片段可作為分離之分子使用。 於本發明之内容中，「分離分子」一語，尤其關於 ADAMT4S ’表示自天然來源純化（如自其天然環境移除） 之ADAMTS4核酸或多胜肽或其片段以及純化之重組分 子（其中「純化」一語包括部分純化以及完整純化）。核酸 之分離已為熟知（亦可見以下標準實驗室程序文獻）。天然 33 200817678 來源蛋白質或重組蛋白質之分離方法亦屬已知。自天然來 源產生可溶、具活性之聚蛋白多醣酶之方法亦已揭露於 JBC 1999 Vol· 274, P· 6594-6601。 本發明之用途可鑑別預防及/或治療心血管及周邊金 管病變之新穎物質。本發明之用途包括鑑定物質所需之特 性以及物質之進一步特性描述，業經鑑別為具心血管預防 及/或治療功效（如本發明之用途具（例如）化合物監控以 及化合物輪廓描述功效）。 用於本發明不同面向之物質可為任何生物或化學物質 或天然產物抽出液，無論純化、部分純化、合成或以生化 或分子生物學方法製造。 於本發明之不同面向被認為具預防或治療心血管及周 邊血管病變活性之物質，可為具有影響生物系統内 ADAMTS4功能或表現、量或穩態層次之任何物質。 為此目的’該等物質可調節任何ADAMTS4功能（如 業經上述定義或此後定義者）°ADAMTS4蛋白質活性調 郎’可以該等物質經直接交互作用，及干擾ADAMTS4多 胜狀/蛋白質或其片段功能為之。該等物質亦可（例如）於 轉錄（起始、延長、終結）轉錄-或轉譯_處理（尤其前原-或 原-蛋白質轉為具活性形態之後轉譯處理，其亦可包括缺乏 j肽區之完整-長度蛋白質之c-端子截斷）、轉錄-或轉譯穩 ^性或轉譯等層面，調節ADAMTS4之表現。其尚且可調 即ADAMTS4之後轉譯處理、調控、蛋白質折疊等。物質 34 200817678 可直接或間接表現出上述效用（間接表示（例如）以對 ADAMTS4功能/蛋白質活性/表現等具影響之天然訊號串 正向或負向干擾）。ADAMTS4功能之内生性抑制劑包括 (例如）金屬蛋白酶-3 (TIMP-3; J Biol Chem 2001，276: 12501-12504)或阿伐-2-巨球蛋白（阿伐 2M; Curr Opinion in Pharmacology 2002, 2:322-329)之組織抑制子。可能對 ADAMTS4聚蛋白多醣酶功能發揮正面效應之内生性訊號 分子包括（例如）細胞介素（如IL—丨、TNF a、IL-6、 IL-17)、視網酸及纖維連結蛋白片段；反之η-3脂肪酸於 IL-1刺激時似乎對聚蛋白多醣酶功能發揮負向影響（概要 見 Curr Opinion in Pharmacology 2002, 2:322-329 及其引 用參考資料）。該等物質尚且亦可模擬ADAMTS4活性（如 接管其功能/作用）。 ADAMTS4之片段可為任何短於其相應野生型之多胜 肽或核酸，如根據SEQ ID No· 1或2, 16短於智慧人（hs) ADAMTS4之核酸或根據SEQIDNo· 3或之多胜肽。短於 ADAMTS4之功能性片段係任何片段（無論多胜肽或核 酸），其展現至少一種ADAMTS4之功能（如下列）。 ADAMTS4結構之概要可得自例如Curr Opinion in Pharmacology 2002, 2:322_329 或 J Biol Chem 1999, Vol. 274: 23443-23450, esp· ρ·23446。功能性片段之例為包括或 由一或多處ADAMTS4之不同區（約自位置1至位置212 之原區、自位置213至位置436之觸媒區、自位置437至 位置520之去整合素區、自位置521至位置576之凝血因 35 200817678 子區、自577至685之半胱胺酸_富含區及自位置686至 位置 837 之間隔子區（見 J· Biol. Chem. 2002，277: 42775-42780)組成之片段’諸如··包含一可能之半胱胺酸 開關、觸媒區或似凝血因子結構域或其與聚集蛋白聚醣 5 GAG鏈之結合相關聯之部分之原肽區（見j. Biol Chem 2000, 275·· 25791-25797)，特別是代表Tsp結構域的之胜 肽，或 J· Biol· Chem· 2002, 277: 42775_42780 中含有存在 於ADAMTS4的半胱胺酸_富含間隔子區之一致性gaG-結 合序列(GSKKKFDKCM，SFRKFRYG，LRRRPWAGRK)之 10 胜肽。 15 ADAMTS4或ADAMTS4片段之衍生物可為 ADAMTS4核酸、多胜肽或其片段之任何修飾物。衍生物 包括（例如）胺基酸或核苦酸序列調控或其它任何種類調 控，諸如（例如）導致多胜肽或核酸之穩定（諸如硫代填 酸調控或核酸主鏈或胺基酸之間鍵之互換等其它種類調控） 之化學或生物學調控，或使多胜肽或核酸對特定细2二‘ :定:票或促進其進入或為細胞攝取（諸如細胞浸潤構 肽、鄰位成對細胞-浸潤肽載體，例如基於觸足複人 膜肽、TAT，及訊號-肽基礎序列；或伴隨專—σ 輸入子之配位子各部分）。 别艺 「ADAMTS4之功能性衍生物一在 ADAMTS4(無論多胜肽或核酸)天然態任何上 叩包括 至少具有ADAMTS4功能之-。本發明之調控，其 片段之功能性衍生物。 ”包括ADAMTS4 36 20 200817678 ADAMTS4功能包括以上該功能，例如ADAMTS4蛋 ~ 白質或蛋白質片段可結合並蛋白分解式裂解其它蛋白質或 • 蛋白質-片段之能力，如可結合及/或裂解聚集蛋白聚醣 (Science 1999, 284·· 1664-1666)，或其與 ADAMTS4 交互作 5 用或為之裂解之片段(如包括部分自殘基Glu373至Ala 374 而來，包含球間區（IGD)，及/或包括四處於球狀（G)區2 及3 (G2及G3)間之軟骨素·硫酸-富含區之ADAMTS4-裂解 點中之一或多處，或包括軟骨素硫酸-富含區全區，及/或 包括_胺聚多富含之C-端子區（the GAG region)之聚 ι〇 集蛋白聚醣片段）、分泌型短蛋白聚醣（J. Biol Chem 2000, 275: 22695-22703)或其與ADAMTS4交互作用或為之裂解 之片段、多功能蛋白聚醣（J· Biol Chem 10 2001，276: 13372-13378)或其與ADAMTS4交互作用或為之裂解之片 段，與組織金屬蛋白酶 3 (TIMP-3，J Biol Chem 2001，276: 15 12501-12504)抑制劑交互作用，及/或結合及/或裂解α_2- 巨球蛋白（α 2Μ; Curr Opinion in Pharmacol 2: 322-329) 或受其抑制。與ADAMTS4核酸或其片段相關之 ADAMTS4-功能包括（例如）與其它分子交互作用之能力， 諸如專一性雜交引子或探針、控制下游編碼序列之轉錄之 2〇 能力、編碼製造ADAMTS4蛋白質等。ADAMTS4功能一 般亦包括ADAMTS4 (蛋白質或核酸)或其片段與其它分子 (包括，惟非限於蛋白質或蛋白質片段(如聚集蛋白聚醣、 分泌型短蛋白聚醣、多功能蛋白聚醣或其片段）、核酸(如 專一與其它核酸雜交之ADAMTS4核酸）、合成分子（如專 37 200817678 一地與合成藥品交互作用之ADAMTS4蛋白質或片段)之 交互作用能力。上列功能亦可見於Curr Opinion in 、 Pharmacol 2: 322-329，尤其頁322右欄第二段至頁323第 一段，及頁323右欄第二段至頁324右欄第二段。 5 具活性物質之鑑別可（例如）以下列一或多種方法鑑 別，諸如： 鑑定預防或治療心血管及周邊血管病變有效物質之方 法包括： a. ADAMTS4蛋白質或功能性片段或其衍生物與測試 ίο 物質接觸；及 b. 測定測試物質是否能調節AD AMTS4蛋白質或功能 性片段或其衍生物之活性。 鑑定預防或治療心血管及周邊血管病變有效物質之方 法包括： i5 a. 以測試物質接觸細胞，其具ADAMTS4或功能性片段 或其衍生物可偵測量或活性； b. 測定測試物質是否能調節細胞中出現之ADAMTS4或 功能性片段或其衍生物之量或活性。 用於本發明之不同面向之物質/測試物質/具活性物 20 質可為任何生物學或化學物質或天然產物抽出液，無論純 化、部分純化、合成或以生化或分子生物學方法製造。 其中能具可偵測性地調節ADAMTS4量或活性之物 38 200817678 質，可認為具預防或治療心血管及周邊血管病變活性之物 • 質。ADAMTS4之可偵測量，可參考可偵測量之ADAMTS4 • 核酸（mRNA、cDNA或基因之DNA)及/或蛋白質（前原/ 原/成熟蛋白質）。可偵測活性指ADAMTS4 DNA/mRNA或 5 蛋白質之轉錄及/或轉譯及/或蛋白質活性。 於本發明之不同面向及代表方法中「調控」一語指活 化或抑制。 其它實例為鑑別預防或治療心血管及周邊血管病變有 效物質之方法，其包括例如： 10 a· 於具轉錄活性之系統中，以測試物質接觸編碼 ADAMTS4蛋白質或功能性片段或其衍生物之核酸； b. 於該物質存在情形下，測定存於該系統，編碼 ADAMTS4蛋白質或功能性片段或衍生物之mRNA 量； 5 c· 於該物質不存在情形下，測定存於該系統，編碼 ADAMTS4蛋白質或功能性片段或衍生物之mRNA 量； d. 測定是否該物質能調控存於該系統，編碼ADAMTS4 蛋白質或功能性片段或衍生物之mRNA量。 2〇 其中能夠調控存在於該系統ADAMTS4 mRNA量之物 質，可認為具預防或治療心金管及周邊血管病變活性之物 質。 39 200817678 具轉錄活性系統係任何生化或細胞系統，其至少具处 力進灯轉錄單TL之轉錄反應。該等系統已為熟知，且包括 • 、細胞（如1實驗室細胞株或細胞系以及真核或原核細胞 之初代培養）以及活體轉錄系統，或可商業化取得之套組 5 (如以、、田胞抽出液為基礎）。於本發明之情形，此可為表現 ADAMTS4 之 mRNA (如根據 NM—005099.3 之 mRNA)^ 表 現編碼為功能性ADAMTS4片段mRNA之生化或細胞^ 統。 '、 卜存於系統中mRNA量之測定，可根據熟知技術進行 10 (等以具幅射活性或螢光標籤直接標幟之產品或使用專一 性引子或探針等债測之產品）。 # 其匕貫例為鑑別預防或治療心血管及周邊企管病變之 有效物質之方法，其包括： a·於具轉譯活性之系統以測試物質接觸編碼ADAMTS4 15 蛋白質或功能性片段或其衍生物之核酸； b·於該物質存在之情形下，測定存於該系統ADAMTS4 蛋白質或功能性片段或其衍生物之量； c· 於該物質不存在情形下，測定ADAMTS4蛋白質或功 能性片段或衍生物存於該系統之量； 2〇 丄測定是否該物質能調控ADAMTS4蛋白質或功能性 片段或衍生物存於該系統之量， 其中能調控ADAMTS4蛋白質、衍生物或片段存於該系統 40 200817678 量之物質可認為具預防或治療心jk瞢另由# 艮久周邊血營波 之物質。 g两變活性 具轉譯活性之系統係任何生化或細胞系統， 有能力可進行轉錄之轉譯反應。該等系統已為1其至少具 括細胞（如一般實驗室細胞株或細胞系以及真热知，且包 胞之初次培養）以及活體轉錄系統（其亦可商^核或原核細 套組）。為活體轉譯核酸’該核酸於適合之载二取彳卞’如 之後多胜肽於適合之緩衝液及細胞抽出液内= 欠選殖， 溶解物(reticulocyte lysate))中表現。载體、所兩狀紅血埭 以及適合之狀況屬已知且可商業化取搵 而式刪及程序 之後多胜肽於適合之緩衝液及細胞抽出液（女3内-人場 溶解物(reticulocyte lysate))中表現。载體 狀紅 以及適合之狀況屬已知且可商業化取得 於本發明内容中，「多胜肽」一語指包括相 合胺基酸之分子，且其包含至少10個以線性模 鏠結 之胺基酸。較短此類分子視為肽。「蛋白質$互成鮮 少-條多胜肽鏈之分子，惟亦可指包括^更至 15 鏈相互關聯或結合之分子。從而，「蛋白所一1才、夕牲狀 貝」一語包括「夕 胜肽」一語。 夕 偵測存在於該系統之ADAMTS4蛋白質，可以熟知 術（如對轉譯物之直接幅射活性或螢光標記或使用專〜 體、蛋白質標籤及其標籤之偵測等）進行。 凡 鑑別預防或治療心血管及周邊血管病變之有效物質之 方法，其它例包括： ' a.提供以核酸載體進行轉染之細胞，該載體包含 ADAMTS4基因之啟動子或其功能性片段，其操作性 41 20 200817678 地與其報導基因或其功能性片段偶聯； • b.提供以對照載體轉染之細胞，該載體包含未與功能性 ， ADAMTS4啟動子操作性偶聯之報導基因或其功能性 片段； 5 c•於測試物質存在下’測定根據a)及b)之細胞的報導基 因活性； d·於測試物質不存在下’測定根據a)及b)之細胞的報導 基因活性。 其中能夠顯著調控（如增加或減少）根據a)之報導 ίο 基因活性而並未顯著調控b)(如能專一地增加ADAMTS4 啟動子活性）之報導基因活性之物質，可認為具預防或治療 心血管及周邊血管病變活性之物質。 顯著調控係任何高於標準差之調控（如增加或減 少）；其較優為至少二倍於標準差。 l5 本發明之以上面向係根據一般熟知之典型報導基因分 析。為此目的’將所選擇啟動子插入適合所選擇宿主細胞 類型之表現載體’其在所選擇報導基因之上游，以於啟動 子具活性時容許報導基因之表現。其構築體隨後引入所選 宿主細胞。合適之轉形或轉染方法以及細胞之培養及報導 20 基因表現之 <貞測等條件已為熟知(如見下列標準文獻）。適 合之條件、載體、報導基因已所周知，所需試劑亦同，且 可商業化取得。 42 200817678

載體係圓環形或線性核酸分子，如DNA質體、噬菌 ‘ 體或質粒，其協助核酸片段（如自其它載體切出或以PCR ' 增巾田並插入選殖之載體）專一地於適合之細胞或微生物中 增幅。表現載體使宿主細胞或微生物内受關注基因（如報導 5 基因）得以異源性表現。細胞或微生物之種類大部份依目的 而疋，且具有技巧之工作者可依知識選擇。適合核酸增幅 之微生物（例如）大部份為高繁殖率之單細胞微生物，例 如細菌或酵母菌。適合之微生物亦可為分離及培養自多細 胞組織之細胞，例如多種微生物（如自草地貪夜蛾取得之 10 SF9細胞等）生產之細胞系。適合之選殖載體屬已知且可自 各生技供應商處商業化取得，供應商如Roche Diagnc)sties， New England Biolabs，Promega，Stratagene 及其它許多。適 合之細胞系可自（例如）美國類型培養集合(ATCC)商業化 取得。 15 為蛋白質或多胜肽之異源性表現，細胞可為任何適合 以核酸載體轉染及表現所關注基因（如報導基因）之原核 或真核細胞。其可能例為原始細胞或培養細胞，較優為真 核細胞培養，其最初自（例如）多細胞微生物或組織（諸 如HeLA，CHO，COS，SF9或3T3)取得，或其本身為單細胞 2〇 微生物，諸如酵母細胞(如真核模式生物裂殖酵母(S. pombe) 或釀酒酵母）或原核細胞培養，或畢赤酵母或大腸桿菌。組 織細胞及樣本可以先前已知技術取得(如採取血液樣本、組 織穿刺或手術技術）。自然製造並於適當處分泌ADAMTS4 之分離細胞（如内泌K細胞）亦適合用於ADAMTS4之 43 200817678 發明，使直接測定某種心血管用藥所製造ADAMTS4量增 • 加或減少之能力成為可能。 • 本申請案内容中，「轉染」一語指將核酸載體引入(原 核或真核）宿主細胞，並因而包括「轉形」一語◦該轉染作 5 用可為穩定性或過渡性且可以一般方法實行。 ADAMTS4啟動子區係ADAMTS4之部分基因，若將 所關注基因之編碼序列選殖至適合之載體中，啟動子/促進 子之功能性下游，並轉染進入適合之宿主細胞，其可控制 所關注基因之轉錄作用。ADAMTS4啟動子之功能性片 1〇 段於特定狀況下亦可控制下游編碼序列之轉錄作用。鑑定 適合之片段依負責熟習此技術者之技術而定。 報導基因可為其基因產物可簡單定量之任何基因。已 知種類繁多之報導基因可用於真核或原核宿主或各種偵測 方法及所需試劑且可商業化取得。其包括（如）貝他内酰 is 胺分解酶基因（lacZ)、螢光素酶、綠或藍螢光蛋白（gfp或 BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1 或 LEU2 或半乳糖甘 酶。該等基因編碼為蛋白質，其可以可視(顏色或螢光）反 應方法簡易偵測（如lacZ，螢光素酶）。其基因產物包括可 以可視(顏色或螢光）反應方法簡易偵測者，或可於表現時 20 賦予抗生素如安比西林或康黴素抗性者。其它報導基因產 物使表現細胞於特定狀況下生長，例如營養缺陷基因。 報導基因之功能性片段，係基因產物可為簡易定量之 特定報導基因之任何片段。 44 200817678 10

本發明以上面向之内容中，對照載體可為任何適合之 載體，其包括報導基因或其功能性片段，惟其中報導基因 表現非受（功能性）ADAMTS4啟動子驅動者。其可（如） 表示報導基因或其功能性片段非與功能性ADAMTS4啟 動子（即無論完全缺乏ADAMTS4啟動子，包括無功能性 ADAMTS4啟動子或啟動子片段，或其中啟動子與報導基 因之配對係非功能性)操作性偶聯。此亦表示報導基因或其 功能性片段可與ADAMTS4啟動子以外之啟動子（如 SV40或其它標準啟動子)操作性偶聯。功能性載體及對照 載體亦可轉染至同一細胞，惟該情形下需不同之報導基因。 本發明之其它面向，係根據上述鑑別具活性物質新穎 方法（該專方法亦稱「鑑定」法）之高效能篩檢法。 分析性方法或分析性系統，即所謂鑑定，其用於測量 經疋義標的分子（所謂標的，大部分為蛋白質或核酸）活性 或濃度作為潛在醫藥化合物之有效性之參數，已所周知。 鑑定包括（如）生化分純紐或系統，其使用分離或部 分分離成分共置於反應混合物於經定義之空間與時間，其 ，潛在藥用化合物之效度可為測試(如以上述方法）。為測 ί蛋白酶活性，其包含（如）測量經標記成員與無標記成 貝間交互作用之放射性同位素或螢光分析(如經標記之基 之蛋白酶間之交互作用，其中於分裂時經標記 ί貝之基貝部分自由分離；從而蛋白酶活性可由經標記成 貝於蚊時_自由分離之量制及定量）。其它分析實例 包括細胞基礎分析(如上述報導基因分析或表現 4 20 200817678 中一物質活性因細胞之表現型改變可為監測）。 不同類型之分析在此技術狀態已廣為周知並可自供應 ' 商處商業化取得。 根據本發明之不同面向之進一步具體實例，使用 5 ADAMTS4核酸，其包括包含位置635、820、835、2564 及10570中一或多處之序列，或使用ADAMTS4多胜肽， 其包括位置77與720中之一或二者。 由於業經鑑別之ADAMTS4基因及蛋白質變異體中， G635A、A635A、G820A、A820A、C835T、C2564G、 ίο G2564G、A10570G 及 G10570G、Thr77 及 Ala 720 極顯著 地關聯於心血管及周邊血管病變之發病，本發明之較優具 體實例係關於上述一或多項多形現象或具一或多項上述多 形現象之ADAMTS4核酸或多胜狀之用途，以實行如一或 多種本發明之方法。 3 —般而言’於所研究基因之野生型序列中，個體 SNPs不列入使用標的基因（「分子標的」）對活性化合物之 監控範圍。由於本申請案已鑑別ADAMTS4變異體為關 聯於心血管及周邊血管病變之發病，此類變異體之用途(特 別於伴隨之細胞特定生理補給背景下）得以創造較高可能 20 性’以尋得適合治療及/或預防心血管及周邊血管病變之活 性化合物。既然事實上，具有此類基因及生理補給之個體 (即具有 G635A、A635A、G820A、A820A、C835T、C2564G、 G2564G、A1 0570G 及 G1 0570G、Thr77 及 Ala 720 中一或 46 200817678 多項）亦較易於罹患心血管及周邊血管病變，此處所尋得 活性化合物中之大部分，係明確以本組病患為標的。另一 方面，ADAMTS4G635G、G820G、C835C、C2564C、 A10570A、Ala77及Pr〇720變異體之用途，應為尋得特 別針對具該基因或蛋白質變異體反應病患之活性化合物。 因此 ADAMTS4 G635G、G820G、C835C、C2564C、 A10570A、Ala77及Pro720變異體之用途相應於本發明之 另一具體實例。 進一步地，ADAMTS4基因中之SNPs，適於使用 ADAMTS4本身以外之標的監控活性化合物··從而可能使 用細胞於細胞鐘定中，以尋找治療及/或預防心金管及周邊 血管病變之活性化合物，其具影響ADAMTS4以外標的之 功能及/或活性及/或量之能力，其影響專一地針對基因組 中ADAMTS4基因具有位置635、820、835、2564及/或 10570等經定義變異體之細胞。以該等方式，可能於如此 基因背景下，專一地監控可預防或治療心血管及周邊血管 病變之活性化合物，甚至亦可專一地監控干擾突變基因以 外基因功能，較優為關聯於待治療疾病之活性化合物。 本發明之進一步面向，係關於以分析自待檢驗個體體 内取得之生物樣本偵測ADAMTS4，診斷心血管及周邊血 管病變，或心血管及周邊血管病變素因之用途。 於該等關聯中，以下變異體中一或多項之存在，較傾 向指出風險之增加：G635A、A635A、G820A、A820A、 47 200817678 C835T、C2564G、G2564G、A10570G、G10570G、Thr77、

Ala720 〇 • 任何適合於生物樣本中偵測ADAMTS4蛋白質或核 酸之方法均可使用於偵測ADAMTS4。

5 偵測方法可為（如）於樣本中偵測ADAMTS4 mRNA 或蛋白質之方法；如樣本中可計量之ADAMTS4mRNA或 蛋白質量（例如適合之引子、探針、抗-ADAMTS4抗體等； 例如在標準狀況下可專一地與ADAMTS4 mRNA或cDNA 雜交之核酸探針，例如用於北方墨點法或微陣列或定量反 1〇 轉錄酶（RT)聚合酶鏈反應（pcR)之引子組）。 其它例係關於測定ADAMTS4基因位置635、820、 835、2564及10570中一或多處核苷酸類型之方法，例如 適合之PCR引子組(如基因組或cDNA引子）可用於（如） PCR定序，探針（可用於如南方墨點法或晶片-或陣列雜交） 15 或專一性抗_DNA抗體可用於（如）免疫（組織）化學、-螢 光或-幅射化學等已知技術。惟其它例係關於測定出現於 ADAMTS4蛋白質内位置77及720中一或二處胺基酸類 型之方法，如特定蛋白質多形現象之專一抗體。 根據一代表之彳貞測方法，其係彳貞測生物樣本中 20 ADAMTS4mRNA 之量，諸如根據 SEQIDNo· 5、6、8、9、 11、12、14及15之一或多種引子。 根據其它代表之偵測方法，其係測定ADAMTS基因 位置635、820、835、2564及10570中一或多處之核普酸 48 200817678 類型，諸如根據 SEQ ID No· 5、6、8、9、11、12、14 及 15之一或多種引子。 設計與合成適用引子屬已知技術；該等引子亦可商業 化取得。根據一較優具體實例，其為根據SEQ ID No· 5、6、 5 8、9、11、12、14及15之引子。核酸係以便利之常態方 法定序，例如使用習用之實驗室機器人，其售於（例如）

Life Technologies，Applied Biosystems，BioRad 等公司。 設計與製備適合之探針亦相類，屬先前已知之技術(如 見所列標準文獻）。 10 於本發明之用途或方法中更優之具體實例，蛋白質量 之改變或ADAMTS4蛋白質内特定蛋白質_多形現象之測 定係經由至少一種抗體之輔助。此處較優之偵測方法為 ELISA、西方墨點法、蛋白質晶片及質譜儀分析方法。 合適之抗體或其功能性片段之製備屬先前已知技術， 15 例如於適合之佐劑（弗式佐劑或氫氧化鋁凝膠，如見

Diamond B.A. et al. (1981) The New England Journal of Medicine·· 1344_1349)存在之情形下，以ADAMTS4蛋白質 或其片段對如兔等哺乳類動物實施免疫。動物體内免疫反 應所衣ie之多株抗體可隨後以已知方法分離並純化，例如 20 管柱色層分析法。單株抗體可以溫特及梅斯坦(Winter，G. &

Milstein，C· (1991) Nature，349, 293-299)等已知方法取得。 適於製備及純化單株抗體之方法屬先前已知技術（見標準 文獻）。已知用於债測ADAMTS4之抗體例如：Santa Cruz 49 200817678

Biotechnology Inc. Cat. No·: sc-25582、sc_l6534 或 Chemicon International Cat.No·: AB19166、AB19165 或 ABCAM Cat.No·: abl 1567 或 Affinity Bioreagents Cat.No··· PA1-1750。 5 於本組發明之内容中，「抗體或抗體片段」一語亦指重 組製造抗體或其抗原結合點，其亦可於適當處修改，諸如 嵌合抗體、人類化抗體、多功能抗體，雙-或寡專一抗體或 F(ab)或 F(ab)2 片段(如見 EP-B1-0 368 684、US 4,816,567、 US 4,816,397、WO 88/01649、WO 93/06213 或 WO ίο 98/24884) 〇 用於偵測抗體反應之傳統免疫化學或免疫幅射邏輯方 法為熟習該項技術者所熟知。一般方法係基於（例如）專 一性初次抗體與抗原之結合鑑別、二次抗體之結合，其通 常可辨認初次抗體上之種別-專一性抗原決定基。該二次抗 15 體之結合可於此可利用以產生可偵測之訊號（例如使用幅 射標幟之二次抗體時產生之幅射活性訊號或使用螢光偶聯 二次抗體時之螢光訊號，或如使用酵素偶聯二次抗體時之 比色分析可測定訊號等）亦可見下列依標準方法所列文獻。 本組相互有關之發明亦係進一步關於偵測心血管及周 20 邊血管病變素因之診斷套組，其包括至少一種偵測生物樣 本内ADAMTS4之方法。 於本啦明内谷中，「套組」（各部分組成一套）一語代表 任何組合此處所鑑別成分佔有空間並功能性之結合單元， 50 200817678 可進行扣疋工作（於此如診斷心血管及/或周邊血管病變 . 或其素因），其可進一步包括更多部分。 * 根據本發明之診斷套組包括至少-種偵測生物樣本内 ADAMTS4之方法。合適地，其可進一步包括更多適合之 5 緩衝液及/或更深入偵測ADAMTS4及/或製備或改進樣 本之試劑且亦包括於適當處實行特定偵測方法之說明。水 根據本發明用途或方法之一較優具體實例， ADAMTS4基因内一或多項變異體之存在可以pCR且隨後 於適當處定序或使用基因之核酸探針偵測。 1〇 PCR ’或以適用探針雜交（例如於適合支撐物（如膜或 晶片）上之固定基因DNA)之適當程序及試劑屬已為周知 之技術。 若二分子之單股形態可於適合之反應條件（周圍介質 之溫度及離子濃度）相互附著以形成一全新雙股核酸分 ：5 子，核酸分子即可與另一核酸分子「雜交」。為實行雜交， 相互附著之核酸分子必須具備互補序列。然而，依所選擇 之嚴格條件，鹼基之錯誤配對亦屬可能，附著作用仍可進 行。「嚴格性」描述反應條件，其影響二單股核酸分子相 互附著時之雜交專一性，並從而亦決定錯誤配對之多寡或 20 二分子於附著期間容忍錯誤配對之強度。其嚴格性並從而 於此亦稱反應專一性，其於其它事物之外，有賴於溫度及 緩衝條件。二核酸分子間附著之足夠嚴格_狀況亦賴於核酸 分子之長度、類型及其互補程度。該等參數及特定分析性 51 200817678 方法適合條件之確定已為熟習該項技術者熟知，且亦可見 於寺示準貝至方法文獻（如「Current pr〇t〇c〇is in Molecular BWogy」，John Wiley & Sons，Ν·Υ· (1989)，6·3·1-6·3·6)取 得0 10 15 根據本組相互關聯發明之一較優具體實例，一個體係 赉生葡萄糖代謝病變之病患，較優為糖尿病病患且，更優 為第II型糖尿病之病患。進一步地，個體亦可為高血壓及 /或可已罹患心肌梗塞。心血管疾病較優為冠心病 狹窄）、冠狀動脈疾病、心肌梗塞、早期心肌梗塞、急性冠 狀動脈症候群或心絞痛（特別為不穩定型心絞痛）。 、 、本發明之方法、用途或測試套組所用之分離樣本較停 為人類樣本，且待檢驗個體較優為人類。該樣本可為特^欠 組織樣本、切片樣本、細胞（如黏膜細胞）、細胞抽出^、疋· 細胞組織、體液，較優為血液、唾液、淋巴液或尿液液、 本發明係進一步關於根據SEQIDNo. 1、2咬16 列之分離ADAMTS4核酸或其片段，且包括_或夕工之序 SNP ： 一夕項以下 a·腺苷於位置635ADAMTS4之基因組序列， b·腺苷於位置820ADAMTS4之基因組序列， c·胸腺嘧啶於位置835ADAMTS4之基因組序％， d·鳥苷於位置2564ADAMTS4之基因組序列及/$ e·鳥苷於位置10570ADAMTS4之基因組序列。 52 20 200817678 本發明更係關於具以下蛋白質多形現象中一或二項之 • 分離ADAMTS4蛋白質： a·蘇胺酸於ADAMTS4蛋白質多胜狀鍵之位置77; b·丙胺酸於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置720 ; 5 根據申請專利範圍90，具有根據SEQ ID No. 3、17 或18序列之分離ADAMTS4蛋白質。 本發明之其它面向係著重一或多種根據SEQ1D No. 5、6、8、9、11、12、14及15引子或引子組，或一或多 種根據SEQ ID No· 4、7、10或13 (例如其可作為核酸探針） ίο 之核酸。 以下將以實施例結合圖表進一步詳細示範本發明，惟 不應以其為限·· 參考文獻： 實驗室方法之標準文獻： 15 (除非另有聲明，此處所述之實驗室方法係或可為根據下列 標準文獻實行。）

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Induction of Aggrecanase 1 (ADAMTS4) by Interleukin-1 ίο Occurs Through Activation of Constitutively Produced

Protein; Pratta，Μ·Α·，Scherle，Ρ·Α·，Yang，G·，Lui，R，Q·，

Newton, R.C·，2003，Arthritis&Rheumatism; Vol.48，p· 119-133; /5 表1 :人類ADAMTS4基因參照序列NMJ)05099.2 (ADAMTS4 - C2564G)位置2564基因變異體於所分析同 齡群病患之頻率及分布。可自該表看出，最頻繁變異體係 C2546C。 表2 :人類ADAMTS4基因參照序列NMJ305099.2 20 (ADAMTS4 - C835T)位置835基因變異體於戶斤分析同齡 群病患之頻率及分布。可自該表看出，最頻繁變異體係 C835C;於所分析同齡群病患未發現變異體T835T。 56 200817678 表3 ·人類ADAMTS4基因參照序列nm 005099.2 (ADAMTS4-G820A)位置820基因變異體於所分析同齡群 病患之頻率及分布。可自該表看出，最頻繁變異體係 G820G 〇 5 表4 ·人類ADAMTS4基因茶照序列ay〇44847 1 (ADAMTS4 A10570G)位置10570基因變異體於所分析 同齡群病患之頻率及分布。可自該表看出，最頻繁變異體 係 A10570A 〇 表5 ·人類ADAMTS4基因參照序列nm 005099.2 10 (ADAMTS4_G635A)位置635基因變異體於所分析同齡群 病患之頻率及分布。可自該表看出，最頻繁變異體係 G635G。 表 6 ·· ADAMTS4 參考序列 NM—005099.2 (ADAMTS4 -C2564G)位置2564基因型，於周邊血管病變、高血壓（收 〒 縮血壓>=140mmHg及/或舒張血壓>=90mmHg)及/或中風 /PRIND/TIA(PRIND=延長性可逆缺血神經缺陷；TIA=瞬發 性缺血發作）等之發病，對所分析同齡群病患產生之影響。 可自該表看出，具G2564G基因型之病患罹患周邊血管病 變、高血壓及/或中風/PRIND/TIA之可能性，顯著較高於 20 另二基因型之一之病患。具C2564G基因型之病患罹患周 邊a管病變、高血壓及/或中風/PRInD/tia之可能性，稍 高於C2564C基因型之病患。 表 7 : ADAMTS4 參考序列 NM—005099.2 (ADAMTS4 57 200817678 -C835T)值置835基因型，於不穩定型心絞痛及/或早期心 肌梗基（乃人年齡<=55歲及女人年齡<=60歲）等之發病，對 所刀析同齡群病患產生之影響。可自該表看出，具C835T 基因型之病患罹患不穩定型心絞痛及/或早期心肌梗塞之 5 可能性，顯著較高於C385C基因型之病患。 表 8 : ADAMTS4 參考序列 NM—005099.2 (ADAMTS4 -G820A)位置820基因型，於已經歷血管_冠狀動脈-成形 術，及/或心肌梗塞及/或早期心肌梗塞（男人年齡<=55歲 及女人年齡<二60歲）之發病，對所分析同齡群病患產生之 10 影響。可自該表看出，具A820A基因型之病患，羅患心肌 梗塞及/或早期心肌梗塞及/或曾承受冠狀動脈成形手術之 可能性’顯著地較南於其他兩種基因型之病患，且G820A 基因型病患之可能性稍高於具最頻繁變異體G820G之病 患。 15 表 9 ·· ADAMTS4 參考序列 AY044847.1 (ADAMTS4 -A10570G)位置10570之基因型，於周邊血管病變之發病， 對所分析同齡群病患產生之影響。可自該表看出，具 G10570G基因型之病患罹患周邊血管疾病之可能性，顯著 較高於具另二基因型之一之病患，且具A10570G基因型之 2〇 病患稍高於具頻繁變異體A10570A之病患。 【實施方式】 貫驗· 58 200817678

1·定序並分析定序結果以偵測SNP l.a) ADAMTS4基因内DNA區之增幅 用於DNA增幅之寡核苷酸（引子）： 為偵測出現於ADAMTS4基因内位置635之核苷酸， 5 使用以下引子： 引子 1 : 5’- TCGTGTTTCCAGAGAAGCTCAAC-3’(SEQ ID Νο·14、參照序列 NM一005099.2 位置 588-610) 引子 2: 5，- CTGCAAGCGGCACAACAG-3，(SEQ ID Νο·15、參照序列 NM—005099.2 位置 664-647) 10 為偵測出現於ADAMTS4基因内位置820之核苷酸， 使用以下引子： 引子 1: 5、CTGGCACCATCAATGGAGATC -3’（SEQ IDNo.8、參照序列 NM-005099.2 位置 792- 812) 引子 2: 5，- CCGATAflGTAACACGCCTACAG -3,（SEQ 15 IDNo.9、參照序列 ΝΜ_005099·2 位置 874- 851) 為偵測出現於ADAMTS4基因内位置835之核苷酸， 使用以下引子： 引子 1: 5’- CTGGCACCATCAATGGAGATC -3’（SEQ ID Νο·8、參照序列 ΝΜ—005099.2 位置 792- 812)

20 弓丨子 2: 5，- CCGATATTGTAACACGCCTAACAG -3’(SEQ ID Νο·9、參照序列 ΝΜ_005099·2 位置 874-851) 59 200817678 為偵測出現於ADAMTS4基因内位置2564之核苷酸， '使用以下引子： 引子 1: 5，_ GGGCCACCCACATTCTTGT -3’（SEQ ID Νο·5、參照序列 ΝΜ_005099·2 位置 2529- 2547)

5 引子 2·· 5，- CAGCTTCAGGGCCMGTAGATG -3，(SEQ ID ΝΟ·6、參照序列 NM—005099.2 位置 2599-2578) 為偵測出現於ADAMTS4基因内位置10570之核苷 酸，使用以下引子： 引子 1: 5’- CACTCTCCATATGCACTTGAAGGT -3’ 10 (SEQ ID No· 11，參照序列 ΑΥ044847.1 位置） 引子 2: 5’- GAACGGACCCTGAGGATAAJAGG -3’ (SEQ ID No· 12、參照序列 AY044847.1 位置 10607-10586) PCR增幅步驟： 15 所用試劑係來自 Applied Biosystems (Foster City， USA): 20 ng基因組DNA ; TaqGold DNA聚合酶1單位；1 x Taq 聚合酶緩衝液；500 μΜ dNTPs ; 2.5 mM MgCl2 ;每增 幅引子對200 nM (1·Α下之序列）；加H20至5μ卜 20 用於基因型鑑定之PCR增幅程序： 95〇C 10 min x 1 循環 60 200817678 95〇C 30 s 70°C 30 s x 2循環； 95〇C 30s 5 65〇C 30 s x 2循環； 95〇C 30 s 60°C 30 s x 2循環； ίο 95〇C 30 s 56〇C 30 s 72〇C 30 s x 40循環； 72〇C 10 min 15 4°C 30 s SNP鑑定 x 1循環； SNP微型定序及偵測程序 所有試劑均來自 Applied Biosystems (Foster City， USAV2pl純化PCR製品、1·5μ1之BigDye終止子套組、 20 200 nM之定序引子（見1.A下序列）、H20加至10μ；1。 61 200817678 用於定序之增幅程序： 96〇C 2 min x 1 循環； 96〇C 1〇 s 5 55〇C l〇s 65〇C 4 min x 30 循環 s; 72〇C 7 min 4°C 30 s x 1 循環； 10 定序產物之分析： 該等序列先以「Sequenz分析Software」（Applied Bio 系統，Foster City，USA)分析以獲得原始數據，隨後並以「弗 转、組裝、多弗筒及校對」（Phred，Phrap，Polyphred and Consed)修正。「弗芮、組裝、多弗芮及校對」係華盛頓 15 大學之菲格林所寫軟體 (httni/Zwww· genome·washington.edu) ° 實施例2:經鑑別SNP之統計性分析 將新經鑑別之ADAMTS4參照序列NMJ)05099及 2〇 ΑΥ044847·1多形現象分析其與約1400名病患之臨床參數 間關係。不同之經鑑別多形現象，其頻率及分布可見表1 62 200817678 至5。所分析病患組參照序列νμ_005099位置635、820、 835、2564及參照序列ΑΥ〇44847.1位置10570之經鑑別 * 變異體G/A ’與臨床端點之關係可見圖8至12及表6至 10。所有統計性分析係以SAS 8.2版（SAS Institute GmbH, 5 Heidelberg，Germany)進行。 P值係所觀察關係統計顯著性之參數，RR值（風險比) 係關於具有特定ADAMTS4多形現象病患所標臨床端點出 現之風險增加參數。計算RR值並以病患組之年齡、性別、 吸於者、血壓及膽固醇層面調整之。 基因型ADAMTS4-G2564G之病患之周邊血管病變 早期發病，相較於ADAMTS4-G2564C及ADAMTS4-C2564C之病患，所分析病患組顯露年齡依賴關係之統計 顯著性（圖8)。而且，於ADAMTS-G2564G基因型攜帶者 中，罹患周邊血管病變、高血壓及中風/PRIND/TIA之風險 15 相較於 ADAMTS4-G2564C 及 ADAMTS4- C2564C (圖 8) f 者顯著增加。 基因型ADAMTS4-A820A攜帶者中，初次心肌-梗塞 及初次PTCA出現，年齡顯著地小於ADAMTS4-G820A或 ADAMTS4-G820G基因型（圖9)攜帶者，尚且該等病患具 20 需進行PTCA手術（其為冠狀動脈退化/病變之徵兆）之統 計顯著較高風險，且其早期心肌梗塞及心肌梗塞發生率， 相較於另二基因型者為高。

ADAMTS4_A635A基因型病患生命中需進行PTCA 63 200817678 手術顯著地早於ADAMTS4-G635A或ADAMTS4· 25 • G635G基因型者（圖11)。 ADAMTS4-G10570G基因型病患周邊血管病變發病 顯著地早於 ADAMTS4-G10570A 或 ADAMTS4_A10570A 5 基因型者（圖12)。 ADAMTS4-C835T基因攜帶者罹患不穩定型心絞痛 及早期心肌梗塞相較於ADAMTS-C835C基因攜帶者具有 統計顯著較高風險（圖12)〇ADAMTS4- T835T攜帶者無法 於所分析同齡群病患中偵測出，思及ADAMTS4-C835T基 ίο 因型之相對較強影響，其可-或許-造成本基因型特別嚴重 表現型之效應。 口亥研九之結果可為，—般性陳述： ADAMTS4基因對偶基因之一或二者於ADAMTS4基 因序列位置635之腺苷，表示罹患或發展需接受冠狀動脈 5 成形手術之病變之風險增加，於生命中特別早於未具腺苷 之個體，尤其相較於ADAMTS4基因序列位置635具有鳥 苷之個體。 ADAMTS4基因對偶基因之一或二者於aDAmts4基 因序列位置820之腺苷，表示經歷心肌梗塞及/或必需接受 20 虺狀動脈成形手術之病變之風險，於生命中罹患一或多項 該等病變特別早於未具腺苷之個體，尤其相較於 ADAMTS4基因序列位置82〇具有鳥苷之個體。 於ADAMTS4基因對偶基因其中之一，於ADANrrs4 64 200817678 基因序列位置835之胸腺π密咬，表示罹患不穩定型心絞痛 及/或心肌梗塞之風險增加，且於生命中經歷一或二項該等 病欠彳寸別早於不具胸腺嘧啶之個體，尤以ADAMTS4基因 位置835具有胞核脊者為然。 於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者，ADAMTS4 基因序列位置2564之鳥普，表示罹患周邊血管疾病及/或 心肌梗基及/或南血>1及/或中風/PRIND/TIA之風險增加， 且於生命中經歷- < 多項該等病變特別早於不具鳥普個 體，尤以ADAMTS4基因位置2564具有一胞核苷者為然。 於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者，ADAMTS4 基因序列位置10570之鳥苷表示罹患周邊血管疾病之風險 增加，且於生命中罹患周邊血管疾病特別早於不具鳥苷個 體，尤以ADAMTS4基因位置1〇57〇具有腺苷者為然。 於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置77之蘇胺酸表 示罹患需接受冠狀動脈成形手術之病變之風險增加，且於 生命中罹患該等病變特別早於不具蘇胺酸個體，尤以蛋白 質多胜肽鏈位置77具有丙胺酸者為然。 於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置72〇之丙胺酸 表示罹患周邊血管疾病及/或心肌梗塞及/或高血壓及/或中 風之風險增加，且於生命中罹患一或多項該等病變特別早 於不具丙胺酸個體，尤以蛋白質多胜肽鏈位置72〇具脯胺 酸者為然。 ADAMTS4核酸及/或蛋白質之臨床端點與基因變異 65 200817678 間關係為清晰之暗示ADAMTS4之基因變異體對心血管及 周邊血管病變發病之影響，諸如冠心病、血管止血功能不 全及傾向閉塞之血管病變。此處初次展示ADAMTS4之 變異體與該臨床端點發生間之統計顯著相關性，從而為本 5 發明提供具意義之基礎。 66 200817678 表1

ADAWITS4-C2564G ADAMTS4C2564C ADM/ITS4 C25S4G I ADAMTS4“G2SS4(5 η % n I % I n % 1208 Β5,01 ! 202 | 14,22 I 11 〇p77 I 表2 ADAMlrS 參C835T ADAMTS4-C33SC ADAMTS4-C8 35T o % n %……. 1354 94,95 n i -m». 5,05 5 表3

ADAMTS冬G820A ADAWITS4-GB20G ADAMTS4.820A ADAMTS4-A820A n % n % n % 901 83,87 445 32,16 ； m 4f1T 表4 ADAMTS4-A10570G ADAWTS4-A10570A ADAMTS4-A10570G ADAWITS4-G105T0G n % n % n I % 116i B4M 202 14,33 12 1 0,85 ίο 表5 ADAMTS44363SA ADAMTS4^G635G 1 ADAMTS4^G635A ADAMTS4-A635A n % n % n. % 1148 81,1a 253 17,89 13 0592 67 200817678 表6

Perlpliara vaskullra Krankhait Bfuthoohdrydc Scli!apnfaH/PRIND/TtA /mmrsA ADAMTS4-C2564C AOAMTS4-C2^4G ADA^TS4-G2564G ο % π % n % 94 7JB 837 52,73 | m im 21 10f40 tm 51f9S 17 8,42 4 38,35 10 90,91 3 27,27 ΎΓΓ 表7 ADAMTS4 ADAyTS4-C835C ADAMTS4-C835T n % n % Instable Angina 413 30,5 1 31 43,03 fryhzeiiger Herzinfsrkt 248 18,31 20 2T；78 表8 ADAMTS4 ADAMTS4»G820G _TS 冬 G820A TS4M20A n % 0 % FI % Kor^arangioplastie 224 25,11 111 25,28 25 43,86 Herzinfarkt 348 38,62 im 45,27 30 50,85 fr0hzaitlgv®r Herzinfarkf 162 17f98 80 19,78 19 32?2 ^Wert ^>0069^ 表9 I ADAMTS4 川 ADAyTS4-A10570A ADAMTS‘A10570G ADAyTS4-G10570G n % π % n % Periphere vaskulSre Krankheit ] 93 7 73 21 1040 4 33,33 10 【圖式簡單說明】 圖 1 : NCBI 編號 NM 005099.2 (SEQID ΝΟ·1)之部份 人類ADAMTS4基因核酸序列。 圖 2 : (2a) NCBI 編號 ΑΥ044847.1 (SEQ ID Νο·2)之人 類ADAMTS4編碼序列，及(2b)NCBI編號NMJ)05099·3 15 (SEQ ID Νο.16)之人類 ADAMTS4 mRNA 序列。 68 200817678 圖3 : 3a) NCBI編號ΝΜ_005099·3，自具蘇胺酸於位置77 ' 及脯胺酸於位置720(ADAMTS4 Thr77Pro720)之核酸序列 衍生而來之人類ADAMTS4蛋白質序列（SEQ ID Νο·3)。 5 3b) NCBI編號ΝΜ_005099·3，自具丙胺酸於位置77 及脯胺酸於位置720 (ADAMTS4 AIa77Pro720)之核酸序 列衍生而來之人類ADAMTS4蛋白質序列。 3c) NCBI編號NM_005099.3，自具羥丁胺酸於位置 77及丙胺酸於位置720 (ADAMTS4 Thr77AIa720)之核酸 10 序列衍生而來之人類ADAMTS4蛋白質序列。 3d) NCBI編號ΝΜ_005099·3，自具有丙胺酸於位置 77及位置720 (ADAMTS4 Ala77Ala720)之核酸序列衍生 而來之人類ADAMTS4蛋白質序列。 圖4 ··人類ADAMTS4基因之序列延展（位置 5 2529-2599、SEQ ID ΝΟ·4)，包括參照序列 NM—005099.2 (ADAMTS4 -C2564G)位置2564之基因變異體C->G。為分 析基因内之此區，使用含有啟動子SEQ ID Νο·5及6引子 之引子組。 圖5 :人類ADAMTS4基因之序列延展（位置 2〇 792-874 ; SEQ ID ΝΟ·7)，包括參照序列 ΝΜ—005099.2 (ADAMTS4 -G820A)位置820之基因變異體G—A及/ 或參照序列 ΝΜ_005099·2 (ADAMTS4 -C835T)位置 835 之基因變異體C—T。為分析ADAMTS4基因内之此區，使 69 200817678 用含有啟動子SEQ IDNo.8及9引子之引子組。 圖6 :人類 ADAMTS4基因之序歹ij延展（位置 10535-1 0607; SEQ ID NO. 10)，包括參照序列 AY044847.1 (ADAMTS4 -A10570G)位置 10570 之基因變 5 異體A—G。為分析人類ADAMTS4基因内之此區，使用 含有SEQIDNo.ll及12引子之引子組。 圖7:人類ADAMTS4基因之序列延展(位置588-664; SEQ ID NO· 13)，包括參照序列 ΝΜ_005099·2 (ADAMTS4 -G635A)位置635之基因變異體G->A。為分析基因内之 ίο 此區，使用含有SEQIDNo.14及15引子之引子組。 圖 8 : ADAMTS4 參照序列 NM—005099.2 (ADAMTS4 -C2564G)位置2564基因型，於周邊血管病變（此為周邊 血管疾病）發病（年齡）對所分析之同齡群病患產生之影 響。可自圖8看出，具G2546G基因型之病患早年曾經歷 15 周邊血管病變之可能性高於具G2546C或C2546C (最頻繁 變異體）基因型之病患。 圖 9 : ADAMTS4 參照序列 NM_005099.2 (ADAMTS4 -A820G)位置820基因型，於初次心臟病發（此處Ml=心肌 梗塞）發病（年齡）對所分析之同齡群病患產生之影響。可 20 自圖8看出’具A820G基因型之病患早年曾經歷初次心 肌梗塞之可能性高於具G820G或Α820Α基因型之病患。 圖 10: ADAMTS4 參照序列 ΝΜ—005099.2 (ADAMTS4 -A820G)位置820基因型，對同齡群中初次（年齡）pTcA (經 70 200817678 皮腔内冠狀動脈血管成形術）之影響，具A820 A基因型 之病患早年進行PTCA之可能性高於具G820G或A820G 基因型之病患。 圖 11 ·· ADAMTS4 參照序列 NM-005099.2 (ADAMTS-G635A)位置635基因型，於初次PTCA (經皮腔 内冠狀動脈血管成形術）（年齡）對所分析之同齡群病患產 生之影響。可自圖11看出，具A635A基因型之病患早年 需承受PTCA手術之風險高於具G635G或G635A基因型 之病患。 10 圖 12 : ADAMTS4 參照序列 AY044847.1 (ADAMTS4 -A10570G)位置10570基因型，於周邊血管病變（此為周 邊血管疾病）之發病（年齡)對所分析之同齡群病患產生之影 響。可自圖12看出，具G10570G基因型之病^早年羅= 周邊血管疾病之風險高於具G10570A變異體^最頻繁^ 15 異體A10570A之病患。 、’' 71

Claims (1)

1. 200817678 十、申請專利範圍： 1 · 一種—或多個ADAMTS4單核苷酸多形現象(SNP)或 鬼白質多形現象之用途，其用於鑑別自待檢驗個體所 取知生物樣本内之心jk管及周邊血管病變或發展心血 盲及周邊血管病變之風險增加。 種ADAMTS4蛋白質或核酸或其功能性片段之用 途’其用於鑑別自待檢驗個體取得之生物樣本内之心 血管及周邊血管病變或發展心血管及周邊i管病變之 風險增加。 3· 一種鑑別個體内心血管及周邊血管病變或發展心血管 及周邊血管病變之風險增加之方法，其包括檢驗自個 體所採得樣本·· a) 出現於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者，位 置 635、820、835、2564 及 10570 中一或多處之 核苷酸類型，出現於該一或多位置之核芽酸類型 對該個體罹患或發展心血管及周邊血管病變之風 險具指標性；或 b) 出現於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈位置77及72〇 之一或二者之胺基酸類型，出現於該_或多位置 之胺基酸類型對該個體罹患或發展心血管及$、真 血管病變之風險具指標性； ^ & c) ADAMTS4 mRNA及/或該樣本出現之蛋& μ 是否與一或多件參考樣本不同，出現數旦、里 72 里之改變 20 200817678 病變之風險增 表不罹患或發展心血管及周邊血管 加0 4. -種測定罹患心血管及周邊血管病變風險之方法，豆 包括分析個體分離;^太φ义、+、 /、 吓㈣刀私本中則述SNp或蛋白質多形現 夕項之存在，與根據年齡及出現於ADAMTS4 基因位置 635、820、835、2564 及 1〇570 或 ADAMTS4 a白貝位置77或720中一或多處之核苷酸或胺基酸類 型’計鼻預計風險。 一種一或多項ADAMTS4單核苷酸多形現象(SNp)或 蛋白質多形現象作為調整用藥劑量以適於預防及/或 治療心血管及周邊血管病變之用途。 一種ADAMTS4蛋白質或核酸或其功能性片段作為 調整用藥劑量以適於預防及/或治療心血管及周邊血 管病變之用途。 7. —種調整用藥劑量以適於預防及/或治療個體内心血 管及周邊血管病變之方法，該方法包括檢驗自該個體 取得樣本 a) 出現於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者，位 置 635、820、835、2564 及 10570 中一或多處之 20 核苷酸類型，該劑量依出現於該一或多位置之核 苷酸類型調整；或 b) 出現於ADAMTS4蛋白質胺基酸鏈位置77及720 之一或二者之胺基酸類型，該劑量依出現於該一 73 200817678 或二處之胺基酸類型調整；或 c) ADAMTS4 mRNA及/或該樣本出現之蛋白質數量 是否與一或多件參考樣本不同，該劑量依自個體 採得樣本内蛋白質及/或mRNA之量是否與一或 多件參考樣本不同調整。 8. 一種一或多項ADAMTS4單核苷酸多形現象(SNP)或 蛋白質多形現象作為鑑別個體之用途，該個體對預防 及/或治療心血管及周邊血管病變用藥有反應。 10 5 9. 一種ADAMTS4蛋白質或核酸或其功能性片段作為 鑑別個體之用途，該個體對預防及/或治療心血管及周 邊血管病變用藥有反應。 10. —種ADAMTS4蛋白質或核酸或其功能性片段或其衍 生物作為鑑別預防及/或治療心血管及周邊血管病變 有效物質之用途。 11. 一種分析自待檢驗個體體内所取得生物樣本，偵測 ADAMTS4之機構作為診斷心血管及周邊血管病變或 心血管及周邊血管病變素因之用途，其藉由分析自被 檢驗個體身體中採得之生物樣本而得。 12. 一種用於診斷心血管及周邊血管病變或心血管及周邊 血管病變素因之測試套組，該測試套組包括至少一種 於生物樣本内偵測ADAMTS4之機構。 13. 如申請專利範圍第3或7項之方法，其包括檢驗所採 74 20 200817678 樣本ADAMTS4基因對偶基因之一或二者是否具一或 • 多種以下基因組變異體·· / a) 於ADAMTS4基因組序列之位置635的腺苷； b) 於ADAMTS4基因組序列之位置82〇的腺苷； 5 C)於ADAMTS4基因組序列之位置835的胸腺嘧 口定； d) 於ADAMTS4基因組序列之位置2564的鳥苷； e) 於ADAMTS4基因組序列之位置1〇57〇的鳥苷； -或多項該等變異體之存在，表示中請專利範圍第3 10 項之方法中之風險增加在一或多項該等基因組變異體 之存在根據申請專利範圍第7項之方法中用藥劑量= 調整。 14·如申請專利範圍第3或7項之方法，其包括檢驗所採 樣本是否含有具以下一或二種蛋白質變里 is ADAMTS4 蛋白質： a·於多胜肽鏈位置77之蘇胺酸；及/或 b· 於多胜肽鏈位置720之丙胺酸； -或二項該等變異體之存在，表示申請專利範圍第3 項之方法中該個體罹患或發展心血管及周邊 20 之風險增加，且在一或二項該等基因組變異體之存: 下，根據申請專利範圍第7項之方法中用藥劑量:調 整。 75 200817678 l5.如中請專利範㈣3或7項之方法，其包括檢驗所採 樣本ADAMTS4基_偶基因之-或二者是否具-或 多項以下基因組變異體： a.腺皆以外之核苷酸，且較優為鳥苦，於adamtS4 基因對偶基目之-或二者的adamtS4基因組序 列位置635 ; b· 腺苷以外之核苷酸，且釦版* & + «又且季父優為鳥苷，於ADAMTS4 基因對偶基因之一或-水 4 —者的ADAMTS4基因組序 列位置820; 10 c. 胸腺嘧啶以外之核苦酸 ADAMTS4基因對偶基目 因組序列位置835; ’且較優為胞核普，於 之二者的ADAMTS4基 15 d. e. 鳥普以外之核苦酿 且較優為胞核苷，於 ADAMTS4基因對偶基因之一或二者的 ADAMTS4基因組序列位置2564 ; ^ 鳥音以外之核芽酸，且知 優為腺苷，於ADAMTS4 基因對偶基因之一或-本从 A—者的ADAMTS4基因序列 位置10570 ; 或夕項α亥專麦異體之存在，表示申請專利範圍第3 項之方法中该個體罹患或發展心血管及周邊血管病變 之風險降低，且在一或多項該等基因組變異體之存在 下，根據申请專利範圍第7項之方法中用藥劑量被調 彰：〇 76 20 200817678 16. 如申請專利範圍第3或7項之方法，其包括檢驗所採 ' 樣本是否含有具以下一或二種蛋白質變異體之 . ADAMTS4蛋白質： a. 蘇胺酸以外之胺基酸，且較優為丙胺酸，於 5 ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置77 ; b. 丙胺酸以外之胺基酸，且較優為脯胺酸，於 ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置720 ; 一或二項該等變異體之存在，表示申請專利範圍第3 項之方法中該個體罹患或發展心血管及周邊血管病變 1〇 之風險降低，且在一或二項該等基因組變異體之存在 下，根據申請專利範圍第7項之方法中用藥劑量被調 整。 17. 根據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測試 套組，其中ADAMTS4屬哺乳類動物所有，而較優為 5 人類之ADAMTS4。 18. 根據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測試 套組，其中心血管病變係心絞痛、不穩定心絞痛、心 肌梗塞、早期心肌梗塞、周邊血管病變、高血壓、中 風、PRIND、TIA或必需進行冠狀動脈成形手術之病 20 變。 19. 根據前述申請專利範圍中任項之用途、方法或測試套 組，其包括分析個體所採樣本，其中所採樣本經測驗 為具有葡萄糖代謝病變之個體，較優為罹患糖尿病 77 200817678 者’而更優為罹患第I型糖尿病者。 20. 21. 虞前範圍中任一項之用途、方法或測試 t羅患:肌：採樣本，經測驗為編 ίΐ康前ΪΙ請專利範圍中任一項之用途、方法或測試 ，、、且〜、中樣本係屬哺乳類動物者，且較優為人類樣 本0 22.根據前f請專利範圍中任一項之用途、方法或測試 套組’八中樣本係組織樣本、切片樣本、細胞抽出液、 10

   一或多個細胞或採取之體液。 23.根據前述申請專利範圍第！ 5 η τ5 + / 巧罕&囷乐i至U項中任一項之用途或 方法，其中ADAMTS4係以分離分子使用。 24·根據申請專利範圍第卜2、5或8項中任一項之用途， 其中位置635、820、835、2564及1〇57〇之一或多處 SNP被分析。 2 5 ·根據申明專利範圍弟6、9或1 〇項中任一項之用途， 其中核酸包含ADAMTS4基因組序列位置635、820、 835、2564 及 10570 之一或多處 SNP。 26.根據申請專利範圍第24或25項中任一項之用途或方 法，其中SNP為： a· 於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者的 ADAMTS4基因組序列位置635之腺苦； 78 20 200817678 b. 於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者的 • ADAMTS4基因組序列位置820之腺苷； c. 於 ADAMTS4基因對偶基因其中之一的 ADAMTS4基因組序列位置835之胸腺嘧啶； 5 d. 於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者的 ADAMTS4基因組序列位置2564之鳥苷； e.於ADAMTS4基因對偶基因之一或二者的 ADAMTS4基因組序列位置10570之鳥苷。 27. 根據申請專利範圍第1、2或4至6項中任一項之用途 1〇 或申請專利範圍第3項之方法，其中以下蛋白質多形 現象中一或二者之鑑別表示疾病或風險增加： a. 於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置77之蘇胺 酸； b. 於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈之位置720之丙胺 j 酸。 28. 根據申請專利範圍第1、2、6或8至11項中任一項之 用途或申請專利範圍第3、7、14或16項中任一項之 方法，其中ADAMTS4基因内位置635、820、835、 2564及/或10570之核苷酸類型係以一或多種適合之 20 引子或探針方法測定。 29. 根據申請專利範圍第29項之用途或方法，其中核苷酸 類型係以PCR、南方墨點法、陣列-或晶片-雜交方法 79 200817678 鑑別。 * 30.根據申請專利範圍第11項之用途或申請專利範圍第 • 12項之測試套組，其中偵測之機構係偵測ADAMTS4 之DNA之機構。 5 31.根據申請專利範圍第30項之用途或測試套組，其中該 機構係引子或引子組、適合之探針或序列專一性抗 DNA抗體。 32. 根據申請專利範圍第2、6、8或9項中任一項之用途 或申請專利範圍第3或7項之方法，分析其中mRNA ίο 量之改變，較優為於標準狀況下使用一或多種適合增 幅 ADAMTS4 cDNA之引子或一或多種適合與 ADAMTS4 cDNA或mRNA雜交之探針。 33. 根據申請專利範圍第32項之用途或方法，其中mRNA 之量係以PCR、北方墨點法、陣列或晶片雜交方法分 Ί 析。 34. 根據申請專利範圍第11項之用途或申請專利範圍第 12項之測試套組，其中偵測機構係偵測生物樣本中出 現之ADAMTS4mRNA及/或蛋白質之機構。 35. 根據申請專利範圍第34項之用途或測試套組，其中偵 20 測ADAMTS4蛋白質之機構為抗體· 36.根據申請專利範圍第2、6、8或9項之用途或申請專 利範圍第3或7項之方法，其中ADAMTS4蛋白質之 200817678 量之改變被測定。 37. 根據申請專利範圍第1，6或36項中任一項之用途或方 法，其中蛋白質經由至少一種抗體之輔助偵測。 38. 根據申請專利範圍第37項之用途、方法或測試套組， 其中偵測係以ELISA、西方墨點法或蛋白質晶片進行。 39. 根據申請專利範圍第36或37項之用途、方法或測試 套組，其中偵測係以免疫組織化學或免疫幅射化學偵 測方法進行。 10

   40. 根據前述申請專利範圍中任一項之用途、方法或測試 套組，其中該基因組之ADAMTS4核酸序列係定義於 SEQ ID No. 1或16之序列，視情況而定為與位置 635、820、835、2564及10570中一或多處之核苷酸 有所差異。 41. 根據申請專利範圍第40項之用途、方法或測試套組， 其中序列具一或多以下SNP : a. 於ADAMTS4基因組序列之位置635之腺苷； b. 於ADAMTS4基因組序列之位置820之腺苷； c. 於ADAMTS4基因組序列之位置835之胸腺嘧啶； d. 於ADAMTS4基因組序列之位置2564之鳥苷；及 /或 e. 於ADAMTS4基因組序列之位置10570之鳥苷。 根據申請專利範圍第28至33項中任一項之方法、用 81 42 20 200817678 途或測試套組，其特徵在於包含一或多種定義於SEQ ID Νο·5、6、8、9、11、12、14或15序列的引子之引 • 子組’或定義於SEQ ID No· 4、7、10或13序列之探 針。 5 43·根據申請專利範圍第1〇項之用途，其中此 ADAMTS4核酸或其片段包括位置635、820、835、 2564及10570中-或多處’且較優為亦包括關於基因 組核酸序列之一或多項以下Snp· a· 於位置635之腺:g：; ίο b. 於位置820之腺苦； c·於位置835之胸腺嘧咬； d· 於位置2564之鳥替； e· 於位置10570之鳥芽。 44. 根據申請專利範圍第1〇項之用途，盆中使用 15 ADAMTS4蛋白質或其片段，其包括位置77及720 中-或二者之胺基酸，並包括以下蛋白質多形現象之 -或二者：纽肽鏈巾，於位置77之蘇魏或於位置 720之丙胺酸。 45. —種分離核酸，其具有一根據SEQidn〇. 之 2〇 ADAMTS4基因組序列，且包括一或多項以下sw ·· a. 於ADAMTS4基因組序列之位置635之腺苦； b. 於ADAMTS4基因組序列之位置82〇之腺苷； 82 200817678 c. 於ADAMTS4基因組序列之位置835之胸腺嘴唆； • d. 於ADAMTS4基因組序列之位置2564之鳥苷；及 * /或 e. 於ADAMTS4基因組序列之位置10570之鳥苷。 5 46. —種分離ADAMTS4蛋白質，其具一或二項以下蛋白 質多形現象： a) 於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈位置77之蘇胺酸； b) 於ADAMTS4蛋白質多胜肽鏈位置720之丙胺酸。 47. 根據申請專利範圍46之分離ADAMTS4蛋白質，其 ίο 具SEQ ID No· 3、17、18或19其中之一序列。 48. —種具有核酸序列 SEQIDNo.5、6、8、9、ll、12、 14或15之核酸引子。 49. 一種具有核酸序列SEQ ID No. 4、7、10或13之核酸 探針。 83