TW200813219A

TW200813219A - Ethanol production in non-recombinant hosts

Info

Publication number: TW200813219A
Application number: TW096115240A
Authority: TW
Inventors: Keelnatham Shanmugam; Young-Nyun Kim; Lonnie O Ingram
Original assignee: Univ Florida
Priority date: 2006-05-01
Filing date: 2007-04-30
Publication date: 2008-03-16
Also published as: JP2010524428A; EP2041293A4; US20090286293A1; NZ600540A; WO2008018930A2; MY157798A; NZ572363A; EP2041293A2; CA2650505A1; WO2008018930A3; AU2007282161A1; US8465953B2; AR060841A1

Description

200813219 九、發明說明：【發明所屬之技術領域】進一步關醇的方法本發明係關於一種產生乙醇的非重組宿主，於其相關的核酸及多胜肽，以及使用細菌產生乙及套組。相關申諳索本申請案與中請於2刚年5月1日之美國臨時申㈣編號60/796, 652相關’該案的完整揭示内容以引用 = '入此處。忒併政府贊助研穿本工作部分由美國能源部補助金第DE-FG36-04GO14G19號資助。因此，政府對本發明可具有某些【先前技術】乙醇為受注目的替代性運輸燃料，以取代至少部分石^(Kheshgi等人，2000，w〇〇ley等人觸）。然而，目别於錢，乙醇是藉由❹啤_母菌（如咖__ w咖e)從玉米殿粉發酵葡萄糖而生產⑻处如等人’·5)，擴充這個製程而產生大量不利地影響食品及飼料工業。 ]而欠將θ :::維素生物質為受注目的替代原料，其月處理=，可發酵紅醇，而不影響食品 m\_’zaid咖等人，細）°與玉米殿粉酵母菌可觀數量的戍_類，該等糖類能對抗 93947 5 200813219 - 轉換複雜的糖類成為乙醇需要微生物性生物催化劑， .其有效地發酵己醣及戊醣糖類。朝著這個目標，已發展出 :·重組有機體，其為將異源性基因加進平台有機體（piatf〇rm organism)，如：酵母菌、運動發酵單胞菌（兄卯办"k) 及大腸桿菌C0;i)。例如：重組產乙醇性大腸桿菌，其包含來自運動發酵單胞g的滅及論基因，係以高效率及咼產量發酵己醣及戊醣成為乙醇（Ingram等人，1999)。此外，酵母菌及運動發酵單胞菌藉由加入戊聽利用基因的 1基因工程’產生符合重組產乙醇性大腸桿g之戊酷發酵特徵的生物催化劑（Kuyper等人，2005，M〇hagheghi等人， 2004)。【發明内容】如上所註，轉換木質纖維素原料為乙醇需要微生物性生物催化劑，其有效地發酵己醣及戊醣糖類。此微生物性生物催化劑包括重組有機體，其為將異源性基因加進平台 ^有機體，如：酵母菌及細菌，例如：運動發酵單胞菌及大腸桿菌。然而，將重組有機體用於大規模燃料生產被一些人視為疋進仃商業化的障礙。非重組產乙醇源（ethan〇1〇gen) 的發展可減少其中一項所認知的障礙，而由木質纖維素基質進行商業性乙醇生產。 ^因此，本發明係至少部分為基於一種突變的發現，該突變係於非產乙醇性微生物中使醣解作用改向而通過同質乙醇路徑（homoethanol pathway)，且根據此發現發展非重 93947 6 200813219 二產乙醇丨生从生物於厭氧條件下發酵葡萄糖及木糖為乙酉:特別疋，操縱組（〇Peron)被辨識為此同質乙醇路私=起源。更具體地，基因在如乃操縱組中被辨識為 2貝同質乙gf發酵，藉由，例如··於厭氧條件下的大腸菌。干如，，於-態樣中，本發明提供包含突變的分離的非重組Μ ’其巾，該突變使得非重組細g在厭氧條件下能夠使每莫耳（m〇le)的糖產生4莫耳的NADH。於另一態樣中，本發明提供包含具有一個或多個突變的Jpd基因之分離的非重組細菌，其中，該突變使得非重組細菌能夠在厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物。本發明亦提供編碼二氫硫辛醯胺脫氫酶 (dihydrol ip0amide dehydrogenase，LPD)多胜肽或其功能片段之分離的核酸分子。當核酸分子表現於細胞（例如：細菌）中，該細胞產生乙醇作為首要發酵產物。因此，於另一態樣中，本發明提供分離的核酸分子，其係選自於由下列所組成之組群： a) 包含至少60%與序列識別號（SEq ID N0)1或序列識別號3的核苷酸序列同源之核苷酸序列的核酸分子，或其互補物（c⑽plement); b) 包含含有序列識別號1或序列識別號3的核苷酸序列的核酸之至少1〇〇個核苷酸的片段的核酸分子，或其互補物； c) 編碼包含至少約50%與序列識別號2或序列識別號 7 93947 200813219 4的胺基酸序列同源之胺基酸序列的多胜肽之核酸分子. d)編碼包含序列識職2或序列識別號4的胺基酸序列之夕胜肽片段的核酸分子；其中，該片段包含號2或序列識別號4胺基酸序％ @ 1 · 夂斤列的至少15個連續胺基酸殘基， e) 編碼多胜肽之天㈣在的對偶變異體之核酸，該多胜狀包含序列識職2或序列識別號4的胺基酸序列；並中▲，該核酸分子於料條件下，與包含㈣朗號i或序列識別號3的核酸分子的互補物雜交； f) 包含序韻別E 1或相識職3 _㈣序列之核酸分子，或其互補物；及 g) 編碼包含序列識別號2或序列識別號4胺基酸序列之多胜狀的核酸分子；其中，當核酸分子於細胞中表現時，將使得細胞能夠產生乙醇作為首要發酵產物。本發明亦提供二氫硫辛醯胺脫氯酶多胜月太或其功能片段。當該多胜肽於細胞（例如：細菌）中表現時，該細胞產生乙醇作為首要發酵產物。因此，於另-態樣中，本發明提供多胜狀，其係選自於由下列所組成之組群： a) 包含序列識別號2或序列識別號4胺基酸序列之多胜肽片段，其中，該片段包含序列識別號2或序列識別號 4的至少15個連續胺基酸； b) 包含序列識別號2或序列識別號4胺基酸序列之多 93947 8 200813219 胜肽之天然存在的對偶變中子編碼，咳椤萨八；认其中，該多胜肽由核酸分或序列識Γ=:嚴苛條件下，與包斤夕轟別唬3的核酸分子的互補物雜交；核^序由列至白與包含序列識別號1或序列識別號3 n的核酸相同之核酸分子編碼的多胜肽，· ⑴包，至少有9〇%與序胺基酸序列㈣之絲酸相的多胜肽；Γ 的胺多Γ肽’包含序_彳號2或相識別號4 /θέ " ^ 1，/、中，當該多胜肽於細胞中表現時，將使付、、田紀此夠產生乙醇作為首要發酵產物。二㈣實施例中，於厭氧條件下，由該細胞產生的乙醇3置焉於全部非氣體發酵產物的50%。於此態樣的另一具體實施例中，於厭氧條件下，該多胜肽具有二氫硫辛醯胺脫氫酶的活性。於進一步具體實施例中，該細胞為細菌細胞。於進一步態樣中，本發明提供細菌宿主細胞，其包含編碼二氫硫辛醯胺脫氫酶多胜肽或其片段的分離的核酸分 0 於另一態樣中，本發明提供產生多胜肽之方法，該多胜肽係選自於由下列所組成之組群： a) 包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽； b) 包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽片段；其中，該片段包含序列識別號2或序列識別 93947 9 200813219 號4的至少15個連續胺基酸；及夕c )包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之夕胜肽之天然存在的對偶變異體，其中’該多胜肽由核酸分子編碼，該核酸分子於嚴苛下，與包含序列識別號1或序列識別號3的核酸分子的互補物雜交，·該方法包含於核酸分子表現的條件下，培養包合分離的核酸分子的細菌宿主細胞，該核酸分子編碼一虱硫辛醯胺脫氫酶多胜肽或其片段。於進-步態樣中’本發明提供如上述的非重組細菌，其包含如上述的分離的核酸分子。

本lx明的進-步悲樣提供包含具有一個或多個突變的 =基因之非重組細菌’其中該突變使得該非重組細菌能 °於厭乳條件下’產生乙醇作為首要發酵產物，且其中該細菌係由包含以下步驟的製程所製備： X a) 使細_候選錢株於厭氧生長條件下在富含糖的培養基中生長；及 b) 挑選產生乙醇作為主要發酵產物的突變體 (mutant) ° ;另心樣中，本發明提供產生本發明產乙醇性非重、且、、田菌的方法，該方法包含以下步驟： ^使細囷的候選突變株於厭氧生長條件下在富含糖的培養基中生長；及 b)挑選產生乙醇作為主要發酵產物的突變體。於具版Λ施例中，本發明提供上述任一態樣的分離 93947 10 200813219 的非重組細fe ’其中’ Jpd基因中的突變導致nadh不敏感性（insensitivity) 〇；於上述態樣的另一具體實施例中，該突變體係由於 ipci基因中之突變所造成。在特定具體實施例中，在該基因的突變導致NADH不敏感性。於另一態樣中，本發明提供由寡醣來源產生乙醇的方法。該方法包含將寡醣與如上述本發明之非重組細菌或宿主細胞接觸，從而由寡醣來源產生乙醇。於該方法的特定㈠具體貫施例中’券係選自於由下列所組成之組群：木質纖維素、半纖維素、纖維素、果膠及其任一組合物。於再一態樣中，本發明提供套組，其包含如上述本發明之非重組細菌或宿主細胞，及依照此處描述之方法與製程產生乙醇的說明書。於一具體實施例中，該套組包含糖來源。於另一態樣中，本發明提供新的大腸桿菌菌株，該菌株包含菌株 AH218(NRRL B-30967)、AH241(NRRL B-30968)、 i ^

AH242(NRRL B-30969) 、 SE2377(NRRL B-30970) 、 SE2378 (NRRL B-30971) 、 SE2382(NRRL B-30972) 、 SE2383(NRRL B-30973) 、 SE2384(NRRL B-30974)及 SE2385(NRRL B-30975)，其於2006年9月27日寄存於美國農業部菌種中心（NRRL)(美國伊利諾伊州皮若亞市（Peoria)大學街 1815 號）。本發明其他的特徵與優點將於下列詳細敘述與申請專利範圍中明顯得知。 11 93947 200813219 【實施方式】為了使本發明全部範圍可被清楚地了解，係提供下述定義。 I.定義如此處所使用，“非重組細菌，，及“細菌，，等詞意指包括含有或不含有異源性多核苷酸序列，且適合使用本發明組成物及方法做進一步修飾（例如：適合基因操作，例如·可併入異源性多核苷酸序列，例如：可經轉染）的細菌細胞。該名詞意指包括最初經轉染細胞的後代。於特定的 …體貝％例中，細胞為為革蘭氏陰性（Gram—negative)細菌細胞或革蘭氏陽性（Gram—pQsitive)細胞。於“源自細菌的夕核普酉夂或基因中的“源自”—詞，意圖包括得自所指白^來源（亦即··細菌）的多核苷酸部分分離物（全部或部刀）或知自所指的來源（亦即··細菌）的多胜肽純化物。在此方面，該名詞意指包含，例如：從所指多核苦酸來源相關的序列或基於該序列進行直接選殖（cloning)、PCR放大、或人工合成。厭氧ί卞件—同，意指包括不含氧氣的條件；即， =條件^氧氣實質上不存在。於本發明的某些具體實施歹1Ί乳條件包含密封的管子或容器，例如：以塞子密 ::二：二？不含氧氣的條件，係使用真空幫浦將氣㈣私除’且以氮氣取代。當氧氣漠度太低而 1::::古則氧氣為實質上不存在。“需氧條件，，-詞思如包括含有氧氣的條件，·即，氧氣存在的條件。 93947 12 200813219 產乙醇性一同意指包括微生物由碳水化合物產生乙醇作為首要發酵產物的能力。該名詞意指包括天然存在的產乙醇性有機體及含有天然存在或誘發之突變的產乙醇性有機體。 ‘非產乙醇性”一詞意指包括微生物無法由碳水化合物產生乙醇作為首要發酵產物。該名詞意指包括產生乙醇作為次要發酵產物（其含量低於全部非氣體發酵產物的 4 0 %)的微生物。、毛酵及發酵作用”等詞意指包括複雜糖類的降解或解聚合，及糖類殘基生物轉換成為乙醇、醋酸鹽及琥珀I鹽。该名詞意指包括，由碳水化合物產生乙醇，尤其，乙醇係作為首要發酵產物的酵素過程（例如··細胞的或非細肊的例如·細胞溶解物或純化的多胜肽混合物）。六“首要發酵產物，，及“主要發酵產物，，等詞於此處可又曰使用，且意指包括含量高於約全部非氣體產物的⑽ 之非氣體發酵產物。首要發酵產物為最大量的非氣體產物=本發明某些具體實施例中，首要發酵產物為乙醇。入邱非‘ίΓ㈣產物”—詞於此處使用意指包括含量低於 ^非讀發酵產物的之非氣體發酵產物。於本發明某i具體貫施例中，次要發酵產物為乙醇。機體中乙醇發料徑”-崎域❹*指包括於有 3=::。·細菌）的發酵路徑，其促使乙醇產生作為首發酵替代路徑” 一詞於此處使用意指包括其中乙醇 93947 13 200813219 不為首要發酵產物之發酵路徑。 ·, 基因於此處使用，係為引導酵素或其他多胜肽分 :子合成的核酸，例如：該核酸可包含編碼序列，例如，編碼多胜肽的連續開放讀碼區（0RF)，或其本身於有機體中產 ^作用。於有機體中的基因可被群集在操縱組，如此處所疋‘其中邊操縱組是藉由基因間DNA( inter genic DNA) 而14其他基因及/或操縱組區隔。於操縱組中個別的基因可、在沒有基因間DNA的情況下於個別基因之間重疊。此外，基因” 一詞意指包括用於所選擇目的之特定基因。基因可為在佰主細胞中内生的，或可經重組引入宿主細胞，例如·呈游離的質體或安定地插入基因組的質體（或其片段）。異源性基因為引入細胞中且對該細胞來說不是自然的基因。 pdh操縱組”及“pdh基因座（pdh l〇cus)，，等詞可父曰使用，且思指表現呈群組的充、及等基因群，及其相關的啟動子（prom〇ter)與操縱子（〇perat〇r)。依常規，“P必操縱組，，一詞指編碼操縱組的基因，而 “PDH” 一詞指由操縱組編碼的蛋白質複合物。丙酮酸脫氫酶（pyruvate dehydrogenase)的活性係負責於TCA循環及能量產生過程中之乙醢輔酶A (acetyl⑺幻的產生。操縱組一詞可包括從任何需氧性有機體的操縱組。所有需氧性有機體，從真核生物到人類，皆包含pDH的三個組成分。許多細菌具有編碼PDH的基因於操縱組中。三個基因ace五、acef與對於PDH的活性係為必要的，且這 93947 14 200813219 二個基因在所有需氧性有機體中均存在，無論它們是被組織為操縱組或是呈獨立的基因。 “二氫硫辛醯胺乙醯基轉移酶，，（ace/r)—詞意指包括丙_酸脫氫酶基因座的E2乙醯基轉移酶酵素。依常規， “ace厂一詞指二氳硫辛醯胺乙醯基轉移酶基因，而

AceF 一詞指acef基因的產物，即二氫硫辛醯胺乙醯基轉移酶多胜肽或酵素。 “PDH複合物的丙酮酸脫羧酶/脫氫酶，，·（ace幻一詞意指包括丙酮酸脫氫酶基因座的E1脫羧酶酵素。依常規， “acM” 一詞指丙酮酸脫羧酶/脫氫酶基因，而“AceE，，一詞指ace五基因的產物，即丙酮酸脫羧酶/脫氫酶多胜肽或酵素。丙酮酸脫氫酶抑制子”一詞意指包括pdh操縱組的轉錄抑制子。依常規，>嫩”—m旨㈣酸脫氫酶抑制子基因，而“PdhR” 一詞指加放基因的產物，即丙酉同酸脫氫酶抑制子多胜肽。二氫硫辛醯胺脫氫酶”—詞意指包括其為丙 :酸脫氫酶基因座或操縱組，、一部分之酵素。依 =規，“ipcT —詞指二氫硫辛醯胺脫氫酶基因，而“ 指加基因的產物，即二氫硫辛醯胺脫氫酶多胜肽或酵素。野生型⑽基因的核苦酸序列由序列識別號5表示， 3⑴圖中，而由野生型7㈣因表現的多胜肽的胺基I序列則由序列識別號6表示，顯示於第3⑻圖令。乳酸脫氫酶，，（胸）一詞意指包括於發酵條件下將 93947 15 200813219 。依常規，一詞指一詞指基因的產物，即丙酮酸鹽轉換為乳酸鹽的酵素乳酸脫氫酶基因，而“LDHA” 乳酸脫氫酶多胜肽或酵素。丙酮酸甲酸解離酶”⑽）一詞意指包括於發酵停件下將丙__轉換為乙_酶八與甲酸鹽的酵素。依常規，“P/厂一詞指丙酮酸甲酸解離酶基因，而“— 周才曰p/i基因的產物，即丙酮酸甲酸解離酶多胜肽戋酵素酒精脫氫酶，，（爾)一詞意指包括於發酵條件下將乙fe辅酶A轉換為乙醇的酵素。依常規，” 酒精脫氫酶基因，而‘‘ A ^ 曰 k… U而ADHE 一竭W从基因的產物，即酒精脫氫酶多胜肽或酵素。一 “NADH不敏感性，，一詞意指ρΜ酵素對NADjj敏感性牛低肖名5司意指包括部分降低的不敏感性或完全缺乏敏感性。、核酸”-㈣指包難酸分子，例如：包含編碼多肽之開放讀碼區的多核㈣，且該多核脊酸可進一步包括非編碼調控序列及内含子（intnDn)。此外，該名詞^ 包括-個或多個比對至功能性基因座的基因。此外，該名曰 Π旨包括用於所選擇目的之特定基因。於一具體實：例夕核普酸部分的基因涉及碳水化合物成為乙醇的生物 =中至少-個步驟。因此，該名詞意指包括任何編碼多肽（诸如：丙酮酸脫羧酶、酒精脫氫酶、分泌性多胜肽或多醣酶（例如··聚葡萄糖酶）、或其組合物）的基因。體中的基因可被群集於操縱組中，如此處所定義，其中該 93947 16 200813219 操縱組是藉由基因間DNA而與其他基因及/或操縱組區隔。於pdh操縱組中個別的基因可在沒有基因間DNA的情況下於個別基因之間重疊。同源的’’ 一詞意指包括第一個胺基酸或核苷酸序列包含足夠或最少數量的與第二個胺基酸或核苷酸序列相同或相等的胺基酸殘基或核苷酸（例如：具有相似支鏈的胺基酸殘基），如此，第一個與第二個胺基酸或核苷酸序列共有共同的結構域且/或共同的功能活性。異源性多胜肽”一詞意指包括由源自任何來源（例如：真核細胞、原核細胞、古細菌、病毒或合成的核酸片段）的異源性核酸編碼的多胜肽或其片段。刀離的夕胜肽（例如：分離的或純化的生物合成酵素）一詞係為實質上不含該多胜肽由其中所衍生之微生物體的細胞物質或其他不純的多胜肽，或當以化學合成時，貫質上不含化學前驅物或其他化學藥品。於核苷酸片段”或“多胜肽片段，，中的“片段，，一詞意指核苦酸序列或多月生肽序列的一部》，該部分實質上與其由其中所衍生出的序列至少部分相同，且其中該多胜肽保留其由其中所衍生出的序列之生物活性。 pH 一詞意指於溶液中氳離子的莫耳濃度的測量，且就其本S而論為溶液酸性或驗性的測量。根據於該= 中的標準，PH -詞用於定義溶液。平常接觸的pH、值/範^ 是介於0與14之間，0為濃鹽酸（1MHC1) 性PH)的值，而U為濃氣氧化納（1MNa〇H)的值為，、、屯水（中 93947 17 200813219

^ ρΚ 4意指質子結合親合力的測量，且通常與pH 又曰使用。冰諳技藝人士認定pK —詞用來定義蛋白質、胺基酸及胜肽。熟諳技藝人士將同樣認定於胺基酸中，羧基、月女基及離子化的尺基團的酸性強度可由結合常數Ka或更常見的Ka的負對數pKa定義。載體一詞意指包括任何適用於有興趣核苷酸序列的接合（Hgation)及轉形（transformation)至宿主細胞的質體載體。糖一詞意指包括任何含有糖分子的碳水化合物來源。此糖為解聚合作用（如需要）的潛在糖來源，且接下來根據本發明的產物及方法藉由發酵作用而進行生物轉換為乙醛，再接下來轉換為乙醇。糖來源包括澱粉（於大部分植物中燃料儲存的主要形式），及纖維素（堅固的細胞壁中主要胞外結構成分，與植物的纖維和木質組織）。該名詞意指匕括單醣類（也稱作簡單糖類（simple sugar))、寡醣類及夕醣類。於某些具體實施例中，糖包括，例如：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖及乳糖。於其他具體實施例中，糖為葡萄糖。革蘭氏陰性細菌細胞” 一詞意指包括此名詞於該領域中所認定的定義。革蘭氏陰性菌的例子包括不動桿菌屬、葡萄糖酸桿菌屬（67i/c〇卯如cier)、大腸桿菌屬（Esc/wdchia)、地桿菌屬CGeobacter)、希萬氏菌屬CShewanella)、沙氏桿菌屬、腸内桿菌屬（Enterobacter)及先雷白氏桿 n 屬（nebsieUa)。 93947 18 200813219 “革蘭氏陽性細菌” 一詞意指包括此名詞於該領域中所認定的定義。革蘭氏陽性細菌的例子包括芽胞桿菌屬 (Bacillus)、梭菌屬（cjostridiuin)、棒狀桿菌屬 ⑽）、乳酸桿菌屬 aaci〇^ci7iis)、乳酸球菌屬（Lactococcus)、酒球菌屬⑺e/?〇c〇cc似）、鏈球菌屬 (Streptococcus)反氡椁蛰屬（Eubacteriun〇。 “突變核酸分子，，或“突變基因，，等用詞，意指包括於核苷酸序列上至少有一個變更（例如··置換 (substitution)、插入（inserti〇n)、刪除（deleti〇n))的核酸分子或基因，使得可由該突變編碼的多胜肽呈現與野生型核酸分子或基因編碼的多胜肽不同的活性。胺基酸”一詞意指包括一般存在於蛋白質中的2〇個a-胺基酸。鹼性電荷胺基酸包括精胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、組胺酸及離胺酸。中性電荷胺基酸包括丙胺酸、 =胱胺酸、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酉义脯私ΓI、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酉文。I性版基酸包括天冬胺酸及麵胺酸。誘變劑一詞意指包括可根據本發明的方法用於更改核苦酸序列的任何製劑。自發性突變” 一詞意指包括在突變原（mutagen)不存在下所發生的突變。該名詞包括沒有加入誘變劑的情況下於本發明方法中發生的突變。 11 ·非重組細菌於混合酸發酵的期間，醣解作用的酵素將每莫耳的葡 93947 19 200813219 ㈣轉換為2莫耳的丙酮酸鹽’加上2莫耳的_及淨值 2莫耳的ATP。比丙酮酸鹽更少的化合物（乙醇、乳酸趟等） =產生係作為氧化麵及再生NAD+的機制，其為持^醣，作用所必要的。於酵母菌、植物及細菌（即運動發酵單胞囷）中展開的僅知同質乙醇路財，丙晴鹽係由非氧化性丙酮酸脫羧酶加以脫竣而產生二氧化碳及乙酿。於產生一 =乙％的期間’產生的乙㈣作為藉由酒精脫氫酶進行之 NADH氧化作用的電子接受者。於/报多其他種類的細菌中存在完全不同的乙醇路徑， ;該路仏巾丙gig g纽首先藉由丙酮酸甲酸解離酶轉換酿辅酶A及甲酸鹽’其為一種氧化脫叛作用，其中還原的相等物係含於甲酸鹽中且葬ώ ”、且猎由甲酸虱解離酶消散為氫氣乙醯輔酶八接著作為兩個觸分子氧化作用的 :子接文者’其係藉由綱編碼祕-酒精脫氫酶活性而 ^于。因每個乙醇需要2個咖，因此保留-半的乙_ 酶Δ且轉換為醋酸鹽及一個 _ 腸桿菌從乙醯辅酶A的乙醇: ==，天㈣^ 因為從乙酿辅酶A產生的支持同質乙醇發酵，原反應平衡係由醋酸趟的產需要2個麵。氧化還在發酵期Η違維持。此為野生型大腸桿菌 …曰±專莫耳量的醋酸鹽及乙醇的主要原因。丙酉同酸脫氯酶經惫& 輔酶Α及伴留她作用使丙酮酸鹽脫羧而成為乙酿 _ A及保遠相關的遇原物為咖。這跟μ相反，相關的還原物透過甲酸鴎，、干葡萄榼六产卩士欠孤作為中間物而消散為氫氣，且在存在，不可利用於代謝活動。藉由以觸代謝丙酉同 93947 20 200813219 酸鹽，每個丙酮酸鹽可獲得一個額外的NADH，其可用於完；全還原每個乙醯輔酶a為乙醇。雖然編碼丙酮酸脫氫酶的 :基因典型地在大腸桿菌於需氧及厭氧條件下表現，但此複合物的活性於厭氧生長期間非常低。本發明係至少部分為基於一種突變的發現，該突變係在非產乙醇性微生物中使醣解作用改向而通過同質乙醇路徑，且根據此發現發展非重組產乙醇性微生物於厭氧條件下發酵葡萄糖及木糖為乙醇。依照此改向的醣解作用，本發明非重組細菌於厭氧條件下使每莫耳的糖產生4莫耳的 NADH ’或每個丙酮酸鹽產生2個NADH。因此，於一恶樣中，本發明提供包含突變的非重組細囷，其中，該突變使得非重組細菌能夠於厭氧條件下使每莫耳的糖產生4莫耳的NADH。於一具體實施例中，該突變係位於P必操縱組中。於特定具體實施例，操縱組包含、aceM及Jpd基因。於進一步具體實施例中，該突變係在Jpd基因中。於另一具體實施例中，每莫耳的糖產生4莫耳的nadh 導致產生乙醇作為首要發酵產物。於特定具體實施例中，糖係選自於由下列所組成之組群：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖及乳糖。於另一態樣中，本發明提供包含具有一個或多個突變之Jpd基因的非重組細菌，其中，該突變使得非重組細菌旎夠於厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物。於一具體實施例中，於厭氧條件下，產生的乙醇含量 93947 21 200813219 而於全部非氣體發酵產物的50%。於進一步具體實施例中，該非重組細菌於沒有該突變時，為非產乙醇性。於再進一步具體實施例中，該非產乙醇1*生、、、田菌產生乙醇作為次要發酵產物，於一具體實施例中，產生的乙醇含量低於全部非氣體發酵產物的40%。於本發明再進一步具體實施中，於加基因的突變提供同質乙醇路徑，藉由該同質乙醇路徑使細菌產生乙醇作為首要發酵產物。、於進一步具體實施例中，於細菌中一種或多種發酵替代路t為不活化的。於一具體實施例中，替代路徑因突變而不活化。此突變包括該替代路徑中的-個或多個基因之核芽酸的刪除、置換或增加。於另一具變係在i劭基因中，例如.1J r 人九 t 基因。於再—諸實_ 體杏二基因中，例如：基因。於又一具 _ 1 酵替代路控包括藉由丙酮酸甲酸解離酶 )州）或_酸鹽的產生轉換乳酸脫氫乙醇甲酸鹽或丑錢而產生乳酸鹽。日西… 於此處所述非重組細菌及細菌細中，細菌係選自於由下列二/、體只轭例及革蘭氏陽性細菌。於某此呈、：.革闌氏陰性細菌陰性細菌。於特定且體％例中，細菌為革蘭氏由下列所組成：:群::列中’I蘭氏陰性菌係選自於腸桿菌屬、地捍菌屬菌屬、葡萄糖酸捍菌屬、大菌屬及克以沙氏桿腸内捍田白氏“屬。於其他具體實施财，細 93947 22 200813219 蘭氏陽性細®。於特定具體實施射，革蘭氏陽性細菌係 :選自於由下賴組成之組群：芽胞桿g;g、梭菌屬、棒狀 :桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬、酒球菌屬、鍵球菌屬及真桿菌屬。於更進-步具體實施例中，細菌為大腸桿菌。如上所述，本發明的非重組細菌包含一個或多個突雙，例如.於切cf基因中的突變。於一具體實施例中，該 =包含將胺基酸以另—胺基酸置換，使得該置換改變由大、又的Jpd基因表現的多胜肽之pK。於某些具體實施中，在切cf基因中的突變導致NAD{J不敏感性。換言之，帶有此突變的細胞顯露PDH酵素對NADH敏感性的降低。因此，nam 不敏感性細胞使每個葡萄糖產生4個mdh分子（2個得自，解作用，2個得自pdH反應），且全部4個MDH可用來還原2個乙醯輔酶A成為乙醇。於某些具體實施例中，即使具有高NADH/NAD比例，PDH對NADH的NADH不敏感性及其作用能力也能夠使細胞，例如··細菌細胞，成為同質乙醇生產者。 ^於一具體貫施例中，多胜肽包含序列識別號β，而突變包括於下列位置以另一胺基酸置換野生型胺基酸·· 山a)序列識別號6中第322位置或於第322位置的任一 ά而約50個位置以内的位置；或山b)序列識別號6中第354位置或於第354位置的任一端約50個位置以内的位置。 ^於某些具體實施例中，其他胺基酸為中性胺基酸，其係選自於^ 、由下列所組成之組群：丙胺酸、半胱胺酸、甘胺 93947 23 200813219 酸、異白胺酸、白胺酸、曱硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。於其他具體實施例中，其他胺基酸為鹼性胺基酸，其係選自於由下列所組成之組群：精胺酸、天冬酸胺酸、麵酿胺酸、組胺酸及離胺酸。於一具體實施例中，突變包含在第322位置以任何胺基酸置換Η，使得該胺基酸置換增加由突變的基因表現之夕胜肽的酸度。於特定具體實施例中，非重組細菌具有突變，該突變包含於序列識別號6中的第322位置置換 Η為Y。於一具體實施例中，非重組細菌為大腸桿菌菌株' SE2377，其係由於美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRLB-30970。於另一具體實施例中，非重組細菌為大腸桿菌菌株SE2383，其係由於美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號nrrlb_3〇973。於再一具體實施例中，非重組細菌為大腸桿菌菌株兕2384，豆係由於美國農業判種h的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL B-30974。於進一步具體實施例中，菌株兕2377 包含序列識別號1或其片段。於另—進—步具體實施例中，菌株SE2383含序列識別號！或其片段。於又一進一步具體實施例中’ g株SE2384含序列識職丨或其片段。於另一具體實施例中，突變包含在第354位置以任何胺基酸置換E’使得該胺基酸置換減少由突變的㈣基因表：：多胜肽的酸度。於特定具體實施例中，非重組細菌具有犬變，該突變包含於序列識別號6中的第脱位置置 93947 24 200813219 換E為K。於一具體實施例中’非重組株―其係由於美國農業部菌種中心的囷且心疋料存編號膽LB韻7卜於另一具體實施例中，非重組細菌為大腸桿菌菌株聰82，其係由於美國種中心的f存物代表且指定為寄存編號_LB-3G972 a。於 ^ 了具體實施例中’非重組細菌為大腸桿菌菌株啦挪， “係由於農業部菌種中心的寄存物代表且 =嶋侧。於進一步具體實施例中，菌株二序列識別號3或其片段。於另—進—步具體實施例中，菌株SE2382包含序列識別號3或其片段。於又一進一步具體實施财，菌株SE2385包含序列識別號3或其片段。如上述含有一個或多個突變的非重組細菌適合從糖產生乙醇。依照本發明，突變提供同質乙醇發酵路徑。於某些具體實施例中，於厭氧條件下’產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的5〇%。於-具體實施射，突變係由自發性突變所造成。於另一具體實施例中，細菌係暴露至誘變劑。於特定具體實 =例中，誘變劑係選自於由下列所組成之組群：乙基曱烷磺酸鹽、2-胺嘌呤、ICR-191、曱基曱烷磺酸鹽、N_曱基_N，_ 硝基-N-亞硝基胍。於進一步特定具體實施例中，誘變劑為乙基曱烷磺酸鹽（EMS)。 ^於另一具體實施例中，一種或多種發酵替代路徑於細菌中為不活化的。發酵替代路徑包括以丙酮酸曱酸解離酶 (Ρ/Ό及琥珀酸鹽開始，由乳酸脫氫酶、醋酸鹽、乙 93947 25 200813219 醇、甲酸鹽、I及C〇2產生乳酸鹽。於一具體實施例中，發酵替代路徑因突變而不活化。於特定的具體實施例中，發酵替代路徑是經由引入删除突變於細菌中而不活化。 111 ·分離的核酸分子及基因本發明亦提供分離的核酸分子，其編碼二氫硫辛醯胺脫氫酶（lpd)多胜肽或其片段。本發明的核酸分子包含具有 -個或多個突變的⑽基因’ #於厭氧條件下表現於本發月的、’、田ii中，將導致由細麵產生乙醇作為首要發酵產物。 +本發明的核酸分子包括DNA分子及RNA分子及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA類似物。核酸分子可為單股或雙股，但有利地為雙股DNA。於一態樣中，本發明提供分離的核酸分子，其係選自於由下列所組成之組群： —&a)包含至少6〇%與序列識別號i或序列識別號3的核苷敲序列同源之核苷酸序列的核酸分子，或其互補物； b) 包含含有序列識別號丨或序列識別號3核苷酸序列的核齩之至少1 00個核苷酸片段的核酸分子，或其互補物； c) 、、扁碼包含至少約5〇%與序列識別號2或序列識別號 4的胺基酸序列同源之胺基酸序列的多胜肽之核酸分子； d) 編碼包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序歹J之夕胜肽片段的核酸分子；其中，該片段包含至少】5 序歹i 4別號2或序列識別號4的胺基酸序列的連續胺基酸殘基； ' e) 、、扁碼多胜肽之天然存在的對偶變異體之核酸，該多 93947 26 200813219 胜肽包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列；其 :中，該核酸分子於嚴苛條件下，與包含序列識別號i或序；列識別號3的核酸分子的互補物雜交； f )包含序列谶別號1或序列識別號3的核苷酸序列之核酸分子，或其互補物；及 g)編碼包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽的核酸分子；其中，當核酸分子於細胞中表現時，將使得細胞能夠 f ' _產生乙醇作為首要發酵產物。 ▲於另:具體實施例中，於厭氧條件下，由細胞產生的乙醇s里同於全部非氣體發酵產物的5〇%。於另一具體實施例中，細胞為細菌細胞。於再一具體實施例中，細菌細胞在沒有該核酸分子的表現時，為非產乙醇性。於特定具體實施例中，非產乙醇性細菌細胞產生乙醇作為次要發酵產物；即含量低於全部非氣體發酵產物的4⑽。、；/另:具體實施财，於厭氧條件下，細菌細胞產生乙醇:為首要發酵產物。於特定具體實施例中，核酸分子 ^、田菌、”田胞的表現提供同質乙醇發酵路徑於細菌細胞内，經由該同質乙醇發酵路徑產生乙醇作為首要發酵產物。於本發明此態樣的再一具體實施例中，核酸分子包含 1 列識：號1的片段，其中，該核酸分子長度至少為100 亥苷馱，且包括T在對應於序列識別號1第997位置的位置。於另一具體實施例中，核酸分子包含序列識別號3的 93947 27 200813219 片段，其中，該核酸分子長度至少為1〇〇個核苷酸，且包 :括6在對應於序列識別號丨第1〇23位置的位置。於一具體實施例中，本發明的lpd核酸分子為至少 _、7G%、75%、m、85%、9G%、91%、92%、93%、94%、 95%' 96/0、97%、98%或更多相同於序列識別號1或序列識別號3所列的核苷酸序列或其互補物（例如：當與該核苷酸序=總長相比較時）。序列識別號i及序列識別號3分別示於第1(A)圖及第3(A)圖。於另一具體實施例中，本發明提供分離的核酸分子，其包含含有序列識別號丨或序列識別號3的核苷酸序列之核酸分子或其互補物的至少1〇〇、15〇、2〇〇、250或300 個核苷酸片段序列識別號序列識別號。於另一特定具體實施例中，本發明提供核酸分子，其編碼多胜肽，該多胜肽包含至少約50%、60%、7〇%、75%、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 ;9 8 %或更多與序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列相同的胺基酸序列，序列識別號2及序列識別號4分別示於第1(B)圖及第2(B)圖。於另一具體實施例中，核酸分子編碼多胜肽的片段，該多胜肽包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列，其中，該片段包含至少15、25、35、45、55、65個序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之連續胺基酸殘基。於進一步態樣中，本發明提供如上述的非重組細菌， 93947 28 200813219 其包含如上述的分離核酸分子。於一具體實施例中，非重組細菌從糖產生乙醇。於另—具體實施例中，糖係選自於由下列所組成之組群：葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘霖糖、半乳糖、蔗糖及乳糖。 ° 如此處描述之加基因（且依常規為斜體），包括核酸分子（例如：DNA分子或其片段），例如··於有機體中藉由基因間DNA(亦即，於有機體的染色體_中自然地位於其因兩側及/或區隔基因的插入性腿或間隔疆）而與另一土基因或其他基因區隔的多胜肽或RNA編碼核酸分子。基因可引導酵素或其他多錄分子的合成（例如：可包含編ς序列，例如，編碼多胜肽的連續開放讀碼區（〇rf))或1 可於有機體中產生作用。於有機體中的基因可群集ς操縱組，如此處所定義’其中鋪縱組是藉由基因間職而盘其他基因及/或操縱組區隔。於操縱組中的個縣因可在^ 有基因間DNA的情況下於個別基因之間重疊。久本發明-具體貫施例以突變㈣核酸分子或基因為徵。典型地，如此處所描述的突變核酸分子或突變基因包括具有包含至少有-個變更（例如：置換、插人、刪除 1酸序列之核酸分子或基因，如此由突變體編’^ ^會呈現與野生型核酸分子或基因編碼的多胜肽不同的活。：利地’突變的核酸分子或突變的基因(例如：突變的酶有增進的活性（例如：二氫硫辛_脫氫 S#活性）之LPD多胜肽。斗於一具體實施例中本發明的核酸分子於嚴苛條件 93947 29 200813219 下，與具有如序列識別號1或序列識別號3中所列的核酸 :序列之核酸分子雜交。此嚴苛條件為熟諳技藝人士所知， :且可於 Current Protocols in Molecular Biology，]ohn

Wiley & Sons，N. Y. (1 989)，6· 3· 1-6· 3· 6 中找到。特定言之’嚴苛（例如：高度嚴苛）雜交條件的非限制性例子為於6X的氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)在約45°C雜交，接著以0· 2X SSC，0· 1 % SDS於50至65°c洗滌1次或多次。有利地，於嚴苛條件下與序列識別號1、序列識別號3的序列雜交 ^ 的本發明分離核酸分子，係對應於天然存在的核酸分子。典型地，天然存在的核酸分子包括具有天然存在核苷酸序列的RNA或DNA分子。本發明的核酸分子（例如：具有序列識別號1、序列識別號3核苷酸序列的核酸分子）可使用標準分子生物技術及此處提供的序列資訊分離。例如：核酸分子可使用標準雜交及選殖技術分離（例如：於Sambrook，J.，Fritsh，E. F. , and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory \ ^

Manual. 2nd，ed·，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，1989中描述）或可由聚合酶鏈反應（polymerase chain react ion)使用根據序列識別號1及序列識別號3的序列設計的合成寡核苷酸引子分離。本發明的核酸可根據標準 PCR放大技術，使用cDNA、mRNA或選擇地，使用染色體組 DNA(gen⑽ic DNA)為模板（template)，及適當的寡核苷酸引子予以放大。於另一具體實施例中，本發明分離的核酸 30 93947 200813219 分子包含其為不於序列識別號1、序列識別號3核苦酸序列之互補物的核酸分子。額外的7加核酸序列為彼等包含序列識別號i、序列識別號3的核苷酸序列，其編碼具有如序列識別號2或序列識別號4中所列胺基酸序列的多胜肽之同源物（例如：編瑪的多胜狀對於具有如序列識別號2、序列識別號4中所列之胺基酸序列的多胜肽，具有至少30%、4〇%、5〇%、6q%、 70%、80%、90%、95%或更多相同性，且具有與該多胜肽^ 質上相同的活性），於嚴苛條件下與具有序列識別號丨、序列識別號3的核苷酸序列的核酸分子之全部或片段雜交，或與編碼具有序列識別號2、序列識別號4胺基酸序列的多胜肽之核酸分子之全部或片段雜交，或與此處所提的

Jpd核苷酸序列互補，如此當核酸序列在細胞中表現時，將導致由細胞於厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物。於一具體貫施例中，核酸分子編碼含有序列識別號2 或序列識別號4胺基酸序列的多胜肽或多胜肽之生物活性片段’其中，該多胜肽或生物活性片段保持於宿主細胞中產生乙醇的能力。於另一具體實施例中，核酸分子或基因編碼具有序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之LPD多胜肽的同源物。典型地，“同源物” 一詞包括共有至少約3 〇至35% ’有利地為至少約35至40%，更有利地為至少約4〇至50%，且更有利地為至少約6〇%、70%、80%、90%或更多 93947 31 200813219 相同於此處所述野生型多胜肽之胺基酸序列，且具有與野生型多胜肽實質上相等的功能活性或生物活性之多胜月太。 YJ如LPD同源物與具有如序列識別號2或序列識別號4 所列的胺基酸序列之多胜肽共有至少約6〇%，有利地為至少約 60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、料％ '卯％' %%、97%、98%或更多相同性，且具有與具序列識別號2或序列識別號4所列胺基酸序列的多胜肽（例如·· 具有實質上相等的二氫硫辛醯胺脫氫酶活性）實質上相等的功能活性或生物活性（即功能相等物）。於一具體實施例中，jpd核酸分子或基因包含編碼如序列識別號2或序列識別號4所列的多胜肽之核苷酸序列。於另一具體實施例中，核酸分子與具有如序列識別號1或序列識別號3所列核苷酸序列的核酸分子的全部或片#又雜父’或與具有編碼具序列識別號2或序列識別號 4任一胺基酸序列的多胜肽之核苷酸序列的核酸分子之全部或部分雜交。此雜交條件為熟諸技藝人士所知且可於仏2^6/2亡

Protocols in Molecular Biology，Ausubel 等人，eds., 了〇1111界1167&8〇1^，111(：.(1 995)，第2、4及6節發現。額外的嚴苛條件可於 Molecular Cloning: A Laboi^toir Sambrook，等人，Cold Spring Harbor Press， Cold Spring Harbor，NY(1989)，第 7，9 及 11 章發現。待定言之，嚴苛雜交條件的非限制性例子包括於4χ的氯化鈉/檸檬酸鈉（SSC)在約65至7(TC雜交（或於4Χ SSC加上 93947 32 200813219 50%甲醯胺在約42至50°C雜交），接著以ΐχ SSC於約65 ：至70c洗滌1次或多次。特定言之，高度嚴苛雜交條件的 :非限制性例子包括於IX SSC在約65至7{rc雜交（或於 SSC加上50%甲醯胺在約42至5〇t：雜交），接著以〇·3χδ汉於約65至70 C洗務1次或多次。特定言之，降低嚴苛雜交條件的非限制性例子包括於4XSSC在約5〇至6〇它雜交 (或替代地，於6X SSC加上50%甲醯胺在約40至45¾雜交），接著以2X SSC於約50至60°C洗滌1次或多次。介於上述值中間的範圍，例如··在65至7(rc或在42至 C同樣意圖包含在本發明内。在雜交及洗滌缓衝液中， (IX SSPE 為 0· 15 M NaCl，10 inM NaHzPCh，及 1· 25 mM EDTA， pH 7·4)可取代 SSC(1X SSC 為 0· 15 M NaCl 及 15 mil 檸檬

酸鈉）；洗滌係在雜交完成後，每次進行15分鐘。對預期長度少於50個鹼基對的雜交物（hybrid)，雜交溫度應少於該雜交物熔化溫度（Tm)5至1(TC，其中^係根據下列方程 u式決定。對於長度少於18個鹼基對的雜交物，Tm(t：>2( A + T鹼基的數目）+ 4( G + C鹼基的數目）。對於長度介於 18與49個鹼基對的雜交物，Tm(^) = 815 + 16 6(1〇心 [Na+])+ 〇.41(%G+C) -（600/N)，其中N為雜交物中的鹼基數，而[Na+]為在雜交緩衝液中鈉離子的濃度（[如+]於 SSC=0.165M)〇、熟悉技術的實行者亦將認可，可將額外的試劑加入雜交緩衝液及/或洗滌緩衝液中，以減少核酸分子對膜（例如：硝化纖維素或尼龍膜）的非專一性雜交，，該額外的試 93947 33 200813219 劑包括但不限定為阻斷劑（例如：BSA或鮭魚或鯡魚精子载 :肢1β潔劑（例如：SDS)、螯合劑（例如·· EDTA)、聚 :蔗糖（FlC〇U)、PVP等。當使用尼龍膜，特定言之，嚴苛雜交條件的額外非限制性例子為於Q25至Q5MNaH2p〇4, 7 % SDS 在約 65°C 雜交，接著以 0.02 M NaH2p〇4，i %SDS 於6代洗滌一次或多次，參見例如·· Church and Gilbert (1984)jPr〇C••亡7·&』·· 81:199卜 1 995(或，替代地，以〇· 2X SSC，1% SDS)。於另一具體實施例中，刀每隹的核酉夂77子包含與如此處所提的核苷酸序列互補之核㈣序列（例如··為序列識別號1或序列識別號3所列核苷酸序列的完全互補物）。 IV.多胜肽本毛明以夕胜肽為特徵（例如：突變的產乙醇性酵素，例如：二氫硫辛醯胺脫氫酶（LPD))。當該多胜肽表現於細胞（例如：細菌）中，細胞於厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物。因此，於另-態樣’本發明提供多胜肽，其係選自於由下列所組成之組群： a) 包含序列識別f虎2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽的片段，其中，該片段包含至少15個序列識別號2 或序列識別號4的連續胺基酸； b) 包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽之天然存在的對偶變異體，其中，該多胜肽由核酸分子編碼’該核酸分子於嚴苛條件下，與包含有序列識別 93947 34 200813219 號1或序列識別號3的核酸分子的互補物雜交，· 士 c)由至少有50%與包含序列識別號^或序列識別號[ 核苷酸序列的核酸相同之核酸分子編碼的多胜肽，· d) 包含至対_與序列識別號2或序列識別號居的胺基酸序列相同之胺基酸序列的多胜肽；及 e) 分離的多胜肽，包含序列識別號2或序列識別號* 的胺基酸序列；其中，當該多胜肽於細胞t表現時，將使得細胞能夠產生乙醇作為首要發酵產物。於一具體實施例中，於厭氧條件下，由該細胞產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的5〇%。於此一態樣的另一具體實施例中，於厭氧條件下，該多胜肽具有辛醯胺脫氫酶的活性。於進一步具體實施例中，該細胞^ 細菌細胞。 … 於再一具體實施例中，該細菌細胞在沒有該多胜肽表現下，非產乙醇性。於特定的具體實施例中，該非產乙醇、、田菌、、、®胞產生乙醇作為少量發酵產物；即低於全部非體發酵產物的約40%。於進一步具體實施例中，該細菌細胞於厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物，而於再進—步具體實施例中，於厭氧條件下產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的 50/。於4寸疋具體貫施例中，該多胜肽於該細菌細胞中的表現提供同質乙醇發酵路徑於該細菌細胞中。於另一具體實施例中，本發明分離的多胜肽為包含序 J戮別號2或序列識別號4胺基酸序列的多胜肽的片段， 93947 35 200813219 其中該片段包含至少15、25、35、45、55或65個序列 :識別號2或序列識別號4胺基酸序列的連續胺基酸殘基。 : 於另一具體實施例中，本發明提供分離的多胜肽t其對於序列識別號2或序列識別號4所列的胺基酸序列具有至少約 50%、60%、70%、75%、m、m、δ2%、83%、_、 85%、mm、m、89%、90%、91%、92%、93%、_、 95%'96%、97%、98%或更多相同性（例如：當與胺基酸序列全長相比）。於進一步％樣中，本發明提供細菌宿主細胞，其包含編碼二氫硫辛醯胺脫氫酶多胜肽或其片段之分離的核酸分子。於一具體實施例中，該細菌宿主細胞包含含有序列識別號1或序列識別號3核苷酸序列的載體，或其片段。於另一具體實施例中，該細菌宿主細胞包含載體ρΚγ33。本發明同樣提供產生多胜肽的方法，該多胜肽係選自 ( 於由下列所組成之組群： a) 包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽； b) 包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之夕胜肽片段，其中，該片段包含至少15個序列識別號2 或序列識別號4的連續胺基酸；及 c) 包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽之天然存在的對偶變異體，其中，該多胜肽由核酸分子編碼，該核酸分子於嚴苛 93947 36 200813219 « 條件下，與包含序列識別號1或序列識別號3的核酸分子 • 的互補物雜交； : =方法包含於核酸分子表現的條件下，培養包含分離的核I刀子的細菌宿主細胞，該核酸分子編碼二氫硫辛醉胺脫氫酶多胜肽或其片段。 1111 於一具體實施例中，該LPD多胜肽或基因產物係源自非重組產乙醇性革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。於示範的具體實施例中，該LPD多胜肽或基因產物係源自選自於由之組群的產乙醇性革蘭氏陰性微生物：不動桿 +菌屬、葡萄糖酸桿菌屬、大腸桿菌屬、地桿菌屬、希萬^ 囷屬、沙氏桿菌屬、腸内桿菌屬及克雷白氏桿菌屬。於另一具體實施例中，該LPD多胜肽或基因產物係源於=列所組成之組群的產乙醇性革蘭氏陽性微生囷屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳酉夂球囷屬、酒球菌屬、鍵球菌屬及真桿菌屬。包^本發明範圍的LPD多胜肽或基因產物為源自大 ==胜肽或基因產物’其由天然存在的細菌基因編 ·'、 7包含於本發㈣®者為源自細g的乡胜肽_ 因產物，其與天然存在的细夕3肽次基 1 7 、于隹的、、、田囷基因及/或大腸捍菌基因（例如· 不同，例如··且右你* ，、有、、工犬、交、插入或刪除的核酸的土 L1 ’但該基因編碼的多只貝上相似於本發明天然存、土、，例如.包含二氫硫辛醯胺脫氫酶活性。已廣為了解’熟諳技藝人士可誘變（❹ 保留性胺基酸置換的核酸。、、’ ”、、選乂廣為了解，相較於天 93947 37 200813219 ’、、、:存在的基因產物，熟諳技藝人士可替換、加人或冊】除胺 •基酸至某種程度而實f上不會影響基因產物（例如··二氯硫 :辛酏胺脫氫酶）的功能，其每個例子皆意圖包括在本發明的範圍中。匕&於本盔明範圍者為非重組性細菌，其包含含有突變的基因，其中，該置換在野生型基因（序列識別唬6)中為使在第322位置的η或在第354位置的£突變成貧為任何胺基酸，使得該胺基酸改變該區域的酸度。於進一 f步具體實施例中，該胺基酸在生理pH方面為中性電荷胺基酉义。於再進一步具體實施例中，該胺基酸在生理邱方面為驗性電荷胺基酸。於一具體實施例中，本發明分離的多胜肽（例如··分離的一氫硫辛醯胺脫氫酶酵素）具有序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列。於其他具體實施例中，本發明分離的多胜肽為至少一個如序列識別號2或序列識別號4所列 ^的多胜肽的同源物（例如：該分離的多胜肽包含與序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列至少約3〇至4〇%相同，有利地為約40至50%相同，更有利地為約5〇至6〇%相同，及更有利地為約60至70%、70至80%、80至90%、90至 95%或更多相同的胺基酸序列，且該分離的多胜肽具有實質上分別相似於由序列識別號2或序列識別號4胺基酸序列編碼的多胜肽的活性）。為測定兩個胺基酸序列或兩個核酸的相同度百分比 (percent identity)，係將該等序列以最理想比較效果而 93947 38 200813219 進行比對（例如：為了與第二個胺基酸或核酸序列進行最理想的比對，可引入空隙於第一個胺基酸或核酸序列的序列中）。當於第一個序列的位置被如第二個序列上相對應位置的相同胺基酸殘基或核苷酸佔據，則於此位置的分子為相同。兩個序列之間的相同度百分比為該等序列共有的相同位置數之函數（即，相同度％ =相同位置數/總位置數xl 00)，有利地為算進產生最理想比對所需的空隙數及空隙大小。兩個序列之間序列的比較與相同度百分比的測定可使用數學演算法完成。特定言之，使用數學演算法做序列比較的非限制性例子為 Karlin 與 Altschul(1 990)iYoc. icad· Sc!·· iASZ 87 : 2264-2268 的演算法，被修改在 Karl in 與 Altschul(1 993)Proc· Zcad· Sci. iASi 90:5873- 5877中。此演算法被併入Altschul等人（1 990)/· 215:403-410 的 NBLAST 與 XBLAST 程式中（第 2· 0 版）。BLAST核苷酸搜尋可以NBLAST程式（記分= 100，字長 = 12)完成，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST多胜肽搜尋可以XBLAST程式（記分=50,字長=3) 完成，以獲得與本發明的多胜肽分子同源的胺基酸序列。為獲得用於比較目的之插入有空隙的比對，可如Altschul 等人（1 997)A^/cie!.c jcids 25(1 7):3389-3402 中所描述的使用Gapped BLAST。當使用BLAST與Gapped BLAST程式，可使用個別程式（例如：XBLAST與NBLAST)的系統内定參數。參見 http: / /www. ncbi · nlm. nih· gov。另一用於序列比較的數學演算法的非限制性特定例子為 39 93947 200813219

Myers and Mi 1 ler(1988)Co/nput Appl Biosci. 4:11-17 的演算法。此演算法被併入可利用的ALIGN程式，例如：於 GENESTREAM 網路飼服器、igh Montpel 1 ier、FRANCE 或於ISREC飼服器。當利用ALIGN程式比較胺基酸序列，可使用ΡΑΜΙ20重量殘基表（weight residue table)、空隙長度剖分（gap length penalty)12與空隙罰分4。例如：本發明一具體實施例中，兩個胺基酸序列之間的相同度百分比係使用在NCBI的Blast伺服器或在歐洲生物科技學會（European Biotechnology Institute)的

Cl ustalW測定。例如··將來自各種有機體的二氫硫辛醯胺脫氫酶胺基酸序列與大腸桿菌Lpd蛋白質的胺基酸序列相比’而4寸疋序列與大腸桿菌序列的相同度百分比可由上述兩個資料庫中之任一個獲得。表7舆第9圖說明這些比較結果。括號内的值代表特定蛋白質對大腸桿菌Lpd的總相似度，且包括兩個胺基酸位置相同以及保留性置換發生的丨位置也相同。對枯草桿菌（如ciU此而言，兩個一氫石瓜辛fe基脫氫酶（dihydrolipoyl 狀⑽S幻，一個來自PDH稷合物而另一個來自乙酸甲基子醇脫氯酶，係包含在内來用於比較。

-般熟諳技藝人士將認可基於上述計算，在—範圍内的細菌種射對於LPD有高度保留性，該#細_類包含 ^於广種系么生學上相距甚遠的細菌（基於⑽核糖體RNA 列)*例* L言：革蘭氏陽性細@與革蘭氏农囷，古細菌與鏈絲菌屬（Strept⑽yCes)。 93947 40 200813219 —4丙酮酸脫氫酶酵素在所有需氧有機體内可發現，且在 - 匍萄糖轉變A能吾R士 & i * rT 、馮此里蚪為重要酵素。二氫硫辛醯胺脫氫酶

Pd:為PDH複合物三個次單位中的—個包含二個獨、的拉體（motif):黃素結合模體（胺基酸15至45)與吼唆杉一;^化物氧化還原酶模體（胺基酸^了至456)(以大腸桿® Lpd編號）。因其於ρΜ複合物中獨特的角色，數士固的—蛋白質之胺基酸序列具有顯著的同源性。 _腸#困Lpd與其他細菌Lpd之間的胺基酸序列相同度， =圍從到⑽。在大腸桿菌與人類的W的極端例子序列中有42场月文基酸相同。在Lpd的黃素結合區中（胺土酸15至45)，此序列的相同度增加到67%。於且有18 個胺基酸的此序列之次區域中（第28至55位置），除了 ^ :二基酸外’所有胺基酸都保留在大腸桿菌、人類與小鼠 1 pd序列中。於第322位置的組胺酸與於第354位置的 =酸鹽同樣保留在這些蛋白質中。因此種非常高度的序彳保雜’於本揭示内容中所述的大腸桿 =自其他有機體的Lpd蛋白質之後，預期會具伽 ^表現里。因此’本發明的方法不限定於此處所教示的菌 V•製造非重組細菌的方法本發明進一步態樣提供非重組細菌，盆包含且 ::突㈣⑽基因，其中該突變使得該非重組細菌能夠 ;生乙醇作為首要發酵產物，且其中該細菌係由包5以下步驟的製程製備·· 93947 41 200813219 a)使細菌的候選突變株於厭氧 :的培養基中生長；及厭虱生長釭件下在富含糖 ^ b)挑廷產生乙醇作為主要發酵產物的突變體。 r萨Γίί法的一具體實施财’於厭氧條件T，產生的，3里南於全部非氣體發酵產物的50%。㈣財，本發明提供產生本發明產乙醇性非重組細囷的方法，包含以下步驟： n 細菌的候選突變株於厭氧生長條件下在富含糖 ‘的t養基中生長；及 )挑述產生乙醇作為主要發酵產物的突變體。 =明前述方法與製程的具體實施例中，在富含糖的 :養基中的糖係選自於由下列所組成之組群：葡萄糖、木，且=錄、甘露糖、半乳糖、薦糖及乳糖。於本發明 ;生Ά例中’具有上述特質的非重組細菌同樣為產乙 %性。因此，本發明提供製造產乙醇性非重組細菌的方法。進一步地’本發明提供篩選所欲的產乙醇性表現型的方法。本^明的母g株特徵為當生長在富含糖的培養基中日守，於厭氧條件下低晋7辟‘女 ,,ΛΤΤ〇 · •里的乙転生產。此菌株的例子可為菌 # 42，然而，特徵為於厭氧條件下產生低量乙醇的任何菌株皆適合在本方法中使用。根據此技藝中已知的方法 enk〇andWanner，2_. Pn Natl. Acad. Sci. USA =7.6剛6645.) ’進行母菌株進一步的突變以使母菌株不 =厭氧生長（缺陷）於所有培養基中。此外，根據此技藝中廣知的做法，係為挑選目的而加入抗生素抵抗性的組合體 93947 42 200813219 、（cassette) 〇 • 典型地’挑逵過程係藉由培養生長缺陷的菌株於需氧；條件下直到達到生長的指數中期（mid exponential phase)，塗抹培養物於瓊脂上，且將培養物曝露在誘變劑下而進行。一般熟諳技藝人士將認可數種誘變劑皆可使用，包括：乙基曱烷磺酸鹽、2-胺嘌呤、ICR_191、曱基甲烷磺酸鹽、N-曱基-N，-硝基-N-亞硝基胍或任何已知會導致核苷酸序列改變的其他製劑。在厭氧條件下曝露於誘變劑「、後，將培養物轉移到需氧條件，再回到厭氧條件。生長^ 來的菌落被選出且在新鮮的培養盤上進行劃線接種 (streak)，而後於厭氧條件下生長。每個g落可分別培養且生長在適當的抗生素培養盤上，以確認突變體帶有母菌株的抗生素抵抗性。-般熟諳技藝人士將了解細菌培養程序係根據此技藝中標準步驟實行。高效液㈣析法可用來敎於㈣突變黯用的「基中發酵產物的產量。例如：乙醇、醋酸珀酸鹽可由HPLC測定。、號 =諳：藝人士將認可基於上述的例子與細菌菌株 = 本發明的方法將不限^於本申請案所教示的 VI·產生乙醇的方法於另一態樣中，本發明提供、、^L。兮士4α酿來源產生乙醇的方法。該方法包括將寡醣與如 7万本知旳姑總江本發明之非重組細菌戋宿主細胞接觸’從而由寡醣來七口次信王6 %。於該方法的特定 93947 43 200813219 ^體貝鈿例中，寡醣係選自於由下列所組成之組群：木質，裁、隹素半纖維素、纖維素、果膠及其任-組合物。 ' 本么明的栖主細胞特徵為於厭氧條件下低量的乙醇生產野生型大腸桿菌於厭氧生長期間以的比例產生乙醇與醋，鹽。於生長的穩定期（stationary phase)，野生里大腸才干菌產生乳酸鹽作為首要產物，且乙醇的部分佔全部發酵產物約2G%。在所有此等發酵中的產物包括各種 I因此導出-名詞：混合酸發酵 mentation)。於一恶樣中，本發明提供包含具一個或多個突，⑽基因的非重組細菌，其中，該突變於厭氧條件下使得該非重組細菌能夠產生乙醇作為首要發酵產物。首要發酵產物意指包括含量高於全部非氣體發酵產物的5〇% 之非氣體發酵產物。首要發酵產物為最大量的非氣體產物。典型地，發酵條件係為經選擇的，來提供最理想的pH 及温度以促進生產者宿主細胞菌株最佳生長動力學，及由 )培養物產生的酵素的催化條件（D〇ran #人，（1993) 心oteC/HK>i. Ρπ灯ess. 9:533_538)。例如··對於克雷白氏桿菌屬a—e"a)，如P2菌株，最理想條件經測定為 ^於35至37 C及pH 5.0至pH 5. 4。於此等條件下，即使是外源性加入的真菌内切gj枣酿& = 4 ^ # …困刀葡來醣鉍及外切葡聚醣酶亦為相當穩定，且持續作用很長一段時間。其他條件將於實施例中討論。料，騎技藝者將察知，只t要例行的實驗，使用於此技蟄中已知的技術，即可最佳化本發明指定的發酵反應。參見，例如：美國專利第5,424,202號及第 93947 44 200813219 5, 91 6, 787號，其特別以引用方式併入此處。、於再另一悲樣中’本發明提供套組，其包含如上述本 ,表月之非重組細菌或宿主細胞，及依照此處描述之方法與製耘產生乙醇的說明書。於一具體實施例中，該套組包含糖來源。 V11 ·範例本發明進一步由以下實施例說明，該等實施例不應對本發明構成限制。於實施例中，除非特別指明，否則係使、用以下材料及方法。材料與方法細菌菌#

於本研究中係使用大腸桿菌κ—12菌株W3110(ATCC 27325)及衍生物（菌株AH242)，其係由於美國農業部菌種中心的寄存物代表，且指定為寄存編號NRRL B—3〇967 (△ 與△ (/〇d-ρ/π))。菌株 SE2378 為菌株的產乙醇性突變體。基因〆Μ、、聊』及acef的刪除係按照Dastenko等人所述。刪除菌株係在引入轉位子（transposon) Tnl〇到中後，接著於芙莎酸卞 (fusaric acid)培養基中進行挑選而建構（Klekner等人 1991; Maloy等人1981)。其他菌株的建構係利用標準基因及分子生物技術（Maniatis等人1982; Miller等人 1972)。此處所用菌株的基因型列舉於表i，顯示如下。 93947 45 200813219 表1 :細菌菌株及相關基因型菌株相關基因型來源 W3110 野生型 ATCC27325 AH240 Δ (focA-pf 1 B)-FRT-Km-¥RT 本研究 AH241 Δ (IdhA) 本研究 AH242 A(ldhA) A (focA-pflB)-¥RT-lm-¥RT 本研究 SE2378 AH242，外加厭氧生長本研究 YK1 SE2378， Kms 本研究 YK29 AH242, Kras 本研究 YK91 YK1, Δ (adhE)-YRT-lm-YRl 本研究 YK93 YK1，△ (acef )-FRT-Km-FRT 本研究 YK96 YK1, Δ (mgsA)-¥RT-lm--¥Rl 本研究 YK152 YK29, △ (aceF)-FRT-Km-FRT 本研究 YK153 W3110, △ (acef)-FRT-Km-FRT 本研究 YK157 YK152，acer(W3110) YK152xPl(W311) YK158 YK152, acer(SE2378) YK152xPl(SE2378)

生長培養基與發酵豐富的培養基（L-肉汁（L-broth))包含（每公升）爿夷化酪蛋白腺（trypticase peptone)(10克）、酵母菌萃取物克）及氯化納（5克）（Lee等人’ 1985)。礦物鹽培養基係如之如所述（Lee專人’ 1 985)。若需要時，則加入葡萄糖及木糖。發酵係在37°C進行，如之前所述（Has〇na等人， 2004)。培養物的pH藉由加入Κ0Η維持在7 〇。分批發酵係在填滿到頂的13 X10 0 ππη的螺旋蓋管中進行，如之寸戶斤述（Patel 等人，2006)。載體與轉形 he?及在區域的基因的選殖與表現是根據描述於 93947 46 200813219 ’此技藝中的標準程序完成。用於轉形的載體除了其他普遍 ▲已知的載體外，可包括pTrc99a(GE)、pCR2· 1-T0P0、钃 pBR322、pUC19、pACYC184、pBAD24。根據於 Maniatis 等人（1989)中發現的標準程序，而使用以CaCl2為主的化學轉形方法。分析方法糖類及發酵產物由HPLC測定（Underwood等人2002)。丙酮酸脫羧酶活性在崩解的細胞製備物中測得，如之前所 ’述（Talarico 等人 2001 )。實施例1 產乙醇性非重組大腸桿菌菌株SE2377、SE2378、SE2382、 SE2383、SE2384、SE2385 的分離於此貫施例中’係描述細菌大腸桿菌的非重組產乙醇性菌株的分離。起始菌株AH242係用於所述的大腸桿菌之產同質乙醇性突變體的分離。菌株AH242由於在分別編碼乳酸脫氫酶 \ / (LDH)及丙酮酸曱酸解離酶（pFL)之7劭及基因中的突變而無法厭氧生長在含糖的豐富培養基中（Mat — Jan等人 1 989)。儘管有這些突變，aH242的需氧生長仍不被影響。 AH242的厭氧生長缺陷為MDH再氧化成為MD+缺陷的結果’ NAD為主要解酵素甘油醛—3—磷酸脫氫酶及相關ATp 產生的必需基質。LDH的缺乏會減少藉由將丙酮酸鹽還原成乳酸鹽之MDH的氧化。在正常由pFL產生的乙醯辅酶a 缺乏下；又有足夠可用的乙醯輔酶A來用於由天然醒有效 47 93947 200813219 進行的NADH氧化，及酒精脫氫酶活性。 . 於本發明中，以AH242菌株開始，-及(丙酮 f敲甲酸解離酶）的刪除係使用之前描述的方法建構 (Datsenko 及 Wanner，2000)。單一刪除突變體，AJJ240 — (/〇〇4巧/^)及為雙重突變體AH242菌株的母菌株。在刪除的位置上，插入FRT—Km—FRT組合體，因此使得菌株AH242為康黴素（kanamycin)抵抗株。因該兩個突曼囟株AH242在所有培養基中具厭氧生長缺陷。下表2 係列舉帶有於厭氧發酵路徑中的突變的大腸桿菌突變體之生長特徵。表2:帶有於厭氧發酵路徑中的突變的大腸桿菌突變體之生長特徵。 ~~(小時r — — 需~ i氧的 LB 最低營養最低營養 (+醋酸鹽、琥珀酸鹽） LB 最低營養最低營養 (+醋酸鹽、琥珀酸鹽） W3110 野生型 1.31 1.05 0.97 0.98 0. 51 0. 51 AH240 pflB 1.23 0. 95 0. 99 0.79 NG 0. 26 AH241 IdhA 1.35 0. 96 0.94 0.81 0.39 0. 30 AH242 PflB，pflA 1.21 1.18 0, 97 NG NG NG SE2378 PflB, pflA,hna 1.18 0.51 0.82 0.46 NG NGC0.21) LB ’ L-肉汁；最低營養-沒有或有補充醋酸鹽及琥珀酸鹽（各為1 毫克/亳升）的葡萄糖最低營養培養基。 NG-沒有生長。於括號中的值為在含有醋酸鹽、琥珀酸鹽及麩胺酸鹽〇毫克/亳升）的葡萄糖最低營養培養基中的生長率。 48 93947 200813219 •’ 於需氧條件下，在37°C，於200 RPM的震盪器中將產 1生的厭氧生長缺陷菌株AH242培養於5毫升的l_肉汁。在 •生長的指數中期，培養物從震盪器移走且塗抹在含糖的[一瓊脂，或含糖外加中性紅（neutral red)的氧化還原染料的 L-瓊脂。將惠特曼（Whatman)濾紙放在每個瓊脂培養基的表面。將誘變劑乙基甲烷磺酸鹽（EMS)加進濾紙片中，且將培養盤移到含有H2 + C〇2產生劑的厭氧罐，該仏+ c〇2產生劑受鈀催化劑所包圍以創造沒有&的環境。其他適合用於誘發突變的標準製劑亦可用於本發明中。將厭氧罐^立養盤放在37°C培養5天。、° < 5天後，無檢測到肉眼可見的生長在任一指定培養基中。隨後，將兩個培養皿於需氧條件下培養達2〇小時^ 此培養結束時，除了在含有紙片放置處周圍的區域，於兩個培養基的整片區域觀察到一整片細菌細胞的菌苔。於每個培養基表面的細胞則复印接種法（邮― 轉移到具有-樣成分的新鮮培養基，且放置在厭氧罐5 天。5天後’除了 EMS放置處，每個培養盤有超過⑽個菌落分佈在整個區域。31個菌落各從含葡萄糖的培養盤 (15個菌落）及含葡萄糖+ η生紅的培養盤⑴個菌落）中挑選出來，且劃線接種在新鮮的4脂+耗糖中。使培養盤於厭氧條件下生長。所有菌落皆於厭氧條件下生長。將31個突變體接種到卜肉汁+葡萄糖培養液，而在 :長後’：：突變體被轉移至“，“康黴素培表面。所有突變體於賴素存在下生長，表示 93947 49 200813219 >菌株AH242的抗生素抵抗性。 . 將31個突變體轉移到於螺旋蓋管中的L-肉汁+葡萄 •糖，且培養在37〇C而不予以混合。在檢測到肉眼可見的生長之後，將培養基從細胞分離出來，且使用高效液相層析法測定於已使用的培養基中的發酵產物（Underw〇〇d等人，2002)。表3表示31個突變體中的3〇個產生乙醇作為首要或主要的發酵產物（73%)。剩下的產物為琥珀酸鹽與醋酸鹽的組合物。、這些結果顯示來自不能生長在厭氧環境下的AH242母菌株的非重組突變體已被分離，該非重組突變體能夠生長在厭氧條件下，且產生乙醇作為首要發酵產物。 50 93947 200813219 表3 :來自大腸桿菌菌株AH242的產乙醇性突變體衍生物的發酵數據圖表消耗的分離株葡萄糖編號（毫莫耳濃度 (nM)) 琥珀酸鹽發酵產物（毫莫耳濃度）乳酸鹽甲酸鹽醋酸鹽乙醇乙醇 °/〇總產物產率 (%) SE2138 19. 7 3.7 22. 0 3. 5 7.2 8. 2 20 1 19. 7 2.8 -- —— 3. 1 31. 1 84 90 2 18. 7 2. 1 一― -- 3. 1 28.4 84 94 3 19. 7 2. 7 -- -- 3. 6 30. 6 83 92 4 19. 7 一一 -- 一一 5.4 30. 7 85 92 5CSE2383) 19.7 3. 3 -- — 3. 9 29.4 80 93 6 19.7 2. 9 — -- 3. 0 30.8 84 93 7 19.7 1. 7 — 一一 4.8 30. 3 82 93 8 19.7 2.8 0. 5 3. 3 3.4 26.8 81 85 9 19.7 2.4 -- -- 3. 1 30.4 85 91 10CSE2383) 5.6 2. 0 -- -- 2. 6 5.8 56 93 11 19.7 2.8 -- 一一 3.2 32. 0 84 96 12 19.7 3.3 0.2 -- 3. 0 30. 7 83 94 13 19. 7 2. 5 0.2 -- 2.4 32.4 86 95 14CSE2376) 19. 7 2. 3 一一 -一 2.9 33. 3 86 98 15CSE2385) 19.7 2.6 一一 -一 3. 1 32. 7 85 98 17 15. 0 1.8 -一 -- 2.4 24. 85 96 18CSE2377) 19. 7 2.3 一一 2. 7 4. 0 31.2 83 95 19CSE2378) 19. 7 2. 6 一一 -- 2· 7 33. 86 98 20 9. 9 0.9 7.6 —- 2.2 11.4 52 100 21 19. 5 1.9 -- -- 2. 6 31.9 88 93 22 19. 7 2. 5 4.9 一一 2.9 28.2 73 98 23 19. 7 2. 6 一一一一 2. 9 33. 2 86 98 24 19.7 2.5 3.8 -- 3.0 29.2 76 98 25 19.7 3. 1 一一一― 2.7 32.6 85 98 26 19. 7 2.4 4.5 -- 2. 7 27.4 74 93 27 19. 7 2. 1 0.2 -- 2. 5 32. 0 87 93 28 18.7 3.3 0. 6 3.5 4.9 26. 3 78 90 29 19. 7 3.1 ―一 —- 3.6 32. 2 81 100 30 14. 5 2.1 一一 -- 2.8 23. 5 83 98 31CSE2382) 19. 7 2. 3 一一一一 2.8 32.8 87 96 32 19. 7 2. 9 -一 —- 3. 0 32. 0 84 96 51 93947 200813219 ，實施例2 . 產乙醇性非重組細菌的生長率與發酵數據圖表 m . 於此實施例中，係描述產乙醇性非重組細菌的生長率與發酵數據圖表。從上述研究，挑選出能夠生長於厭氧條件下且產生乙醇作為首要發酵產物的突變體菌株SE2378做進一步研究。生長特徵檢驗具有於厭氧發酵路徑的突變的大腸桿菌突變體之 # 生長特徵。如上述表2中所述培養在豐富的培養基中時，將菌株SE2378的需氧生長與野生型大腸桿菌菌株W3110 比較，或與（單一或雙重（/ocZ-突變體或icfW突變體的任一者比較。在最低營養培養基中，菌株SE2378的需氧生長率為約母菌株AH242的一半。以醋酸鹽及琥珀酸鹽補充在生長培養基，使生長率恢復到接近母菌株的生長率。雖然菌株SE2378為厭氧生長，其生長率，即使在豐富的培養基中，只有AH240及AH241單一突變體的生長率約50% % (見上述表2)。菌株SE2378不在葡萄糖最低營養培養基中厭氧生長，此為與突變有關的表現型（Clark等人 1 989)。以醋酸鹽補充最低營養培養基支持突變體-菌株AH240的生長，但不支持產乙醇性衍生物菌株SE2378 的生長。菌株SE2378除了醋酸鹽外，也需要麩胺酸鹽，使之可於葡萄糖最低營養培養基中厭氧生長。之前的研究顯示產乙醇性大腸桿菌菌株K011同樣需要麩胺酸鹽達到木糖的最理想發酵（Underwood等人2004)。此種對於麩胺酸 52 93947 200813219 鹽的需要可經由添加保護性的可調節滲透壓的溶質—甜菜 ;鹼到培養基中克服。然而，在最低營養培養基t菌株 • SE2378的厭氧生長，對麩胺酸鹽的需要不能被甜菜鹼克服，表不在乙醯辅酶A通向2 —酮戊二酸（麵胺酸鹽的前驅物）的生物合成缺陷，而不是滲透的需要。乙醯輔酶A被認為經由此產乙醇源可快速地轉變為乙醇，且乙醯輔酶Ας 生物5成具速率限定性（1^_^-1丨11]丨_^叩）。有了這些補充物，於最低營養培養基中，菌株SE2378的生長率達到〆Μ 母菌株ΑΗ240的生長率。玉米浸潰液，一種低成本的培養基補充物，取代麩胺酸鹽用於使菌株SE2378在葡萄糖最低營養培養基中生長。葡萄糖發酵在使用5〇克•公升（g 1 1)葡萄糖的pH控制的發酵中（Hasone等人2004) ’在約6個小時的延遲後，菌株 SE2378以具體生長率0.46小時-,生長，且產生乙醇作為首要產物（第3圖與表4,如下）。因最接近的母菌株，AH242 不能夠厭氧生長，菌株SE2378的發酵係與野生型菌株麵的發酵比較。細於24小時内完成5〇克困二_丨葡萄糖的發酵，而突變體菌株則需要約72小時。此差異可主要歸因於細胞密度的差異（2.5毫克/毫升（mg/ml)野/生型乾煉重罝對1.7宅克/¾升突變體乾燥重量）及兩種菌株糖類代謝的最大具體速率（野生型與突變體分別為4.丨對 3.3克葡萄糖.小時-1.克細胞-1;以下表5)。菌株诎2378 產生約480笔莫耳•公升穴咖。！ pi)乙醇（22克•公升])， 93947 53 200813219 其為總產物的88%，總產物包括少量的醋酸鹽、乳酸鹽及琥珀酸鹽。相較於菌株W3110的發酵，其中乙醇以6. 6克· 公升M僅代表產物的27 %(表4)。觀察到菌株SE2378的最大具體產生率為1. 34克•小時_1 ·克細胞η(表5)，可相比已報導的酵母菌分批發酵1.6克•小時M •克細胞^的值 (Smits 等人 2000)。表4:大腸桿菌菌株SE2378與野生型菌株界31103的發酵特徵消耗的葡產物（毫莫耳濃度）菌株萄糖 (毫莫耳濃度）乙醇醋酸鹽曱酸鹽乳酸鹽琥珀酸鹽乙醇產率b 總產物產率^ 葡萄糖發酵 W3110 298+19 142+6 162±6 206±11 206±11 18±0· 7 0· 24±0· 01 0.89±0.05 SE2378 296±4 478+15 27±2 0 13±2 27±2 0.81±0. 02 0.92+0. 04 木糖發酵 W3110 333±8 191+7 215±10 248±53 32±3 57+1 0·34±0· 00 0.89+0. 02 SE2378 325±2 444+9 25±2 0 0 33+5 0.82±0_ 01 0.93+0. 02 a發酵係在pH 7. 0及37°C於補充有 50克· 公升_1糖類的L-肉汁中進行。 b乙醇產率為理論上最大值的部分（每克的糖0. 51克的乙醇） e每莫耳發酵的葡萄糖中乙醇為總產物的莫耳分數。 54 93947 200813219 表5生長在葡甸糖或木糖上之大腸桿菌菌株SE2378的生長與乙醉產生情形。 f

Yp/s qs qp W3110 葡萄糖木糖 ΤΓ44 〇Γ37 0.04 0. 04 2. 94 1. 58 〇. 50 0. 36 〇. 12 0. 18 4. 10 4. 93 〇· 49 _0. 89 具體生長率，小時葡萄糖 0. 04 1. 29 0. 61 〇. 41 3. 26 1. 34 SE2378 木糖 0. 38 0. 04 1.65 0. 53 0. 42 5. 33 2. 24 縮寫： Qs ’克消耗的糖類·公升 Yp/s，克乙醇（克基質）_ ❿，克消耗的糖（克細胞乾燥重量Γ•小乾燥重量）-1 ·小時M q 克乙知（克細胞克細胞（克基質; 心、時'· Qp，克乙醇•公升'小時木糖發酵於使用50克•公升-1木糖的厭氧發酵期間，野生型 :株聰78延遲、約8個小時（第3圖與上述表4與5 與：ΐίί體生長率為在葡萄糖上之具體生長率的80%，發酵：：告一致—等人2〇〇2)。突變體菌株來說，太:野生型W311G更快。48小時後，對菌株SE2378 的發酵產物It 1超過葡萄糖的利用。以菌株嫩378獲得克為其中2〇克·公升、自、糖。對菌株SE2378來說，使用木糖時，乙 93947 55 200813219 醇的最大具體產生率為2· 23克•小時-1 ·克細胞η。： ?3110與SE2378兩者使用木糖的具體乙醇產生率比使 :用葡萄糖高，如表5所示。此可能表示來自木糖代謝的較低能量產率（Hasona等人2004)。對於野生型而言，來自木糖的淨值ATP產量相較於每葡萄糖係& 〇 ’每木糖只有約 ^5。這將使細胞需要使用更多的木糖產生相同量的細胞質量（cfl mass)。然而，野生型對木糖消耗的具體速率只有稍微咼於對葡萄糖消耗的具體速率（4 比，較低的細胞產率與較長的發酵時間。反之，菌株邡2378 缺乏丙酮酸甲酸解離酶，此酵素在最低營養培養基中的木糖發酵為重要的（Has鳴等人2_)。因為此突變，在菌株 SE2378中來自木糖發酵的淨值計算的Ατρ產量只有每木糖 .6 7很月頒地，此較低的ΑΤρ產量在此產乙醇性突變體中驅使南木糖通量⑴ux)。來自木糖之乙醇的具體產生率為2. 23+克•小時、克細胞-,，高於酵母菌在葡萄糖上1.6 克小蚪•克細胞]的值（Smits等人2000)，以及高於帶有運動發酵單孢菌如_基因的產乙醇性大腸桿菌菌株Κ0Π對葡萄糖及木糖的乙醇具體產生率的值（約2克· 小時1 ·克細胞-1 )。這些結果顯示非重組獅78突變體從葡萄糖及木糖兩產生乙醇作為首要發酵產物。進一步地，乙醇產生率可相比於其他產乙醇性有機體。實施例3 93947 56 200813219 ' 從非重組產乙醇性大腸桿菌鑑定突變LPD基因 , 於此實施例中，描述從大腸桿菌菌株SE2377、 .SE2378、SE2382、SE2383、SE2384、SE2385 鑑定突變 LPD 基因。於非重組產乙醇性大腸桿菌突變體菌株的突變係經由共轉導（co-transduction) zac: : ΤηΐΘ而加以定位。當 aroP-pdM-ace凡F基因經由共轉導而刪除（第5圖），轉導株失去於厭氧條件下生長在含有1 %葡萄糖的LB上的能〃力，而在野生型的背景下，相同的刪除不影響厭氧的生長。此結果暗示丙酮酸脫氫酶酵素於菌株SE2378厭氧生長中的角色。於SE2377、SE2378、SE2382突變體菌株中負責產乙醇性表現型的突變，已被鑑定係定位於丙两鑀脱農酶基因座。

丙酮酸脫氫酶複合物（PDH)由三個酵素組成：丙酮酸脫氫酶/脫羧酶（酵素1，E1)、硫辛酸轉乙醯酶（酵素2，E2) 及二氫硫辛醯胺脫氫酶（酵素3，E3)次單位。儘管有aceM * 與基因的獨立啟動子之存在，已知pdhR啟動子為 pdM-aceM-ipd基因轉錄的啟動子（Quail等人1 995)。因 PDH操縱組的表現為由pdhR蛋白質負調控（Quai 1等人 1 995)，故將 SE2377、SE2378、SE2382 的 pdhR 基因予以定序（第6A圖）。菌株SE2378的序列分析顯示兩個突變位於 pdhR的編碼區域：一個是胺基酸置換（S12P)，而另一個是白胺酸的胺基酸插入成為胺基酸118。另一個G至A的核苷酸置換被發現在介於基因與ace五基因的基因間區 57 93947 200813219 "域（第6B圖）。菌株SE2377與SE2382沒有攜帶任何突變於 . 染色體組DNA的pdhR-aceEF區域中。然而，這些菌株以及 ' 菌株SE2383、SE2384與SE2385，全部具有單一突變在Ipd 基因中（第5A圖）。PdhR蛋白質為pdM-切d操縱組之對丙酮酸鹽敏感的調控者，而因此在此蛋白質的突變並不意外。除了在開始處用於轉錄ipd的起始位置外， ace五f可含有其本身之aceM-ipd的轉錄起始位置。因此，於厭氧細胞中在基因間區域的突變也可支持aceM-ipd表 p 現程度的提高。之前已報導在大腸桿菌中，需氧生長的細胞中PDH複合物的丙酮酸脫氳酶/脫羧酶活性程度約5倍高於厭氧生長的細胞（deGraef等人1 999)。這些結果提供在本發明已鑑定的產乙醇性大腸桿菌菌株中突變的位置。實施例4 在LPD基因的突變負責性表現型在此實施例中，在PDH複合物的突變，具體地為切d

/ V v"基因顯示為產乙醇性表現型的原因。菌株SE2378的初步基因分析顯示負責厭氧生長及同質乙醇產生的突變係位於或接近編碼PDH複合物的基因 (pdh 基因座：pdM、aceF、Jpc〇。為確認 PDH 對菌株 SE2378 的產乙酵性表現型為必要的’係將在基因（二鼠硫辛醯基乙醯轉移酶；PDH的E2酵素）的突變轉導進菌株YK-1，菌株YK-1為缺乏康黴素抵抗基因的菌株SE2378之衍生物。轉導菌株YK93失去厭氧生長的能力，如下列表6所示。 58 93947 200813219 ’表6 :在pc/Λ基因座帶有突變（acef)的產乙醇性大腸桿菌 , 菌株SE2378的生長特徵菌株基因型具體生長率（小時，需氧厭氧 LB 最低營養最低營養 (+醋酸鹽、琥珀酸鹽） LB 最低營養 W3110 野生型 1. 31 1. 05 0. 97 0. 98 0.51 YK153 W3110,aceF 0.46 NG 0. 55 1. 07 0.44 YK29 pflB, IdhA 1. 29 0. 99 0. 99 NG NG YK152 YK29, aceF 0. 83 NG 0. 50 NG NG YK1 pflB, IdhA, Ana+ 1. 14 0. 51 0.83 0.41 NG* YK93 XU, aceF 0. 68 NG 0.46 NG NG YK157 YK152, ace^CWSllO) 1.32 0. 96 0.87 NG NG YK157 YK152,aceF(SE2318) 1. 17 0. 51 0.80 0.45 NG* 最低營養-沒有或有補充醋酸鹽與琥珀酸鹽（各1亳克/亳升）的葡萄糖最低營養培養基。NG -沒有生長。 *該兩個產乙醇性衍生物需要醋酸鹽與麩胺酸鹽於最低營養培養基中厭氧生長，同菌株SE2378。菌株YK93的厭氧缺陷（anaerobic-minus)表現型與菌株AH242 (菌株SE2378的母菌株）的表現型相似。雖然在最低營養培養基中，aceF突變體由於細胞不能產生用於生物合成的乙醯輔酶A而具需氧缺陷（aerobic-minus)，但在厭氧生長環境下，此作用由PFL催化，因此aceF突變不影響大腸桿菌（菌株YK153，為W3110帶有acef突變，如表6 所示）的厭氧生長。菌株YK93的厭氧生長在所有測試的培養基中為有缺陷的。藉由帶有來自W3110(野生型）或 SE 2378(產乙醇源）任一者的基因之嗔菌體P1，將在菌株 59 93947 200813219 ΥΠ52的acejp突變轉導為acey，且轉導株被挑選出來於需氧條件下在最低營養培養基中生長。同樣測試轉導株之厭氧生長與發酵產物。接受來自野生型菌株W3110 ace广基因的轉導株係需氧生長於最低營養培養基中，但由於其及突變的存在而無法厭氧生長於任何測試的培養基中。所有接受來自菌株SE2378 ace广基因的轉導株係厭氧生長，且所有受測試的轉導株產生乙醇作為主要發酵產物這些結果顯示菡株SE2378的產乙醇性表現型需要完整的P必基因座與PDH活性，且符合乙醇生產的pM依賴路徑（見第8C圖）。於此種同質乙醇生產的路徑中，丙酮酸鹽由PDH氧化脫羧成乙醯辅酶A，且進一步由酒精脫氫酶還原成乙醛及乙醇（第8C圖）。刪除aceK(pDH缺陷；菌株 YK93)，其對乙醯輔酶A的產生為需要的），或刪除 ((ADH缺陷’·菌株Π91)，其對乙醇的產生為需要的）的其中一者，將導致厭氧生長負表現型，支持其在菌株SE2378 (其缺乏發酵乳酸脫氫酶及丙酮酸曱酸解離酶）中此路徑對同質乙醇產生及氧化還原反應平衡的角色。於實驗的下一組中，基因顯示為產乙醇型表現型的原因。來自野生型菌株W311〇的基因，與來自產乙醇型突變體菌株SE2378的切d基因被選殖入表現載體中，用於以IPTG為誘導劑，自tix啟動子產生LpD蛋白質。這些貝體被轉形至帶有二個刪除：/处/、及的菌株YK100中。除了這三個突變外，菌株γκι〇〇相似於菌株W3110。因為這三個刪除，菌株YK1〇〇對厭氧生長於 93947 60 200813219 所有測試的培養基中為有缺陷的，且對需氧生長於最低營 :養培養基中亦為有缺陷的。如之前討論，丙酮酸脫氫酶複 -合物（PDH)由三個酵素組成：丙酮酸脫氫酶/脫羧酶（酵素 1)、硫辛酸轉乙醯酶（酵素2)及硫辛醯胺脫氫酶（酵素3)。大腸桿菌的需氧生長會因於PDH複合物的三個成分中的任一個之突變而損害。夤體pKY32(第7A圖），其含有來自菌株W3n〇的基因（Lpd+)，或質體pKY33(第7B圖），其含有來自菌株 SE2378的突變7加基因（Lpd*)，被轉形至菌株γκι⑽中，且挑選出具胺节青黴素（ampiciUin)抵抗性的轉形株。這些轉形株為PDH陽性，如同所見其係需氧生長在最低營養培養基中；PDH複合物的酵素！與酵素2來自染色體而㈤來自貝體。只有具有攜帶來自產乙醇性菌株SE2378的⑽ 基因的質體PKY33之轉形株能夠於厭氧條件下生長。在來自菌株ΥΚ10()/ΡΠ33(命名為YK129)所使料養基中，乙醇 ^為首要發酵產物。相較而言，帶有來自_〇的天然⑽ 基因的質體ΡΚΥ32之菌株ΥΚ100則不能於厭氧條件下生長。 —總合來說，這些結果顯示LPD蛋白f負責㈣酸脫氯酶複合物於厭氧生長條件下可觀察的活性，且進一步地， W的突變型足以支持大腸桿菌的同質乙醇生產。大腸桿 :的加突變體為產乙醇性的原因是因為該突變體每葡萄糖產生4個NADH的能力。實施例5 於LPD基因的突變負責MM不敏感性 93947 61 200813219 、在此實施例中，於⑽基因的突變顯示導致勵h不敏感性。更特疋吕之，發現二氫硫辛酿胺脫氯酶（⑽）活性（其在野生型（天朗）酵素中為對NADH敏感）在突變體中被改變為對_不敏感，如第圖與第Π圖中所示。因為 ⑽為丙嗣酸脫氯酶複合物（PM)的成分，此聊的麵不敏感性便由產乙醇性突變體被帶進PDH。將大％杯菌野生型（菌株或產乙醇型突變體 (囷株SE2378)培養在葡萄糖礦物鹽培養基到生長指數中 ^ “、、:後收取細胞且製備萃取物。在細胞萃取物中的酵素活性係以㈣酸鹽與_作為基f，且以各種濃度的刪料酵素活性的抑制物而加明定。第10圖表示PDH活性 x^NADH的抑制。在上方的圖表中，膽的漢度對於野生型 (菌株W3110)與產乙醇性突變體（菌株仰2378)兩者皆為2 _ 在下方的圖表中，_濃度對於來自菌株W3110 的天然酵素為2 _ NAD，而對於來自菌株SE2378的酵辛突變型為1 mM NAD。 ” #來自大腸桿菌野生型（菌株W3110)及產乙醇性突變體 (菌株SE2378)的基因以PCR放大且選殖入蛋白質表載體pET15b。在挑選出的質體中，㈣基因的_序^藉由定序插人的DNA而驗證。誘導在質體㈣⑽基因的^ 見且純化蛋白質。酵素活性在反向反應中測得，於該反應中兩個基質為硫辛輯（3 mM)與麵（(M mM)在Q ^ 碟酸卸緩衝液⑽，含有1.5 mM EDTA)中。第U圖顯不LPD X NADH的抑制。在這些條件下，天然的酵素不具有 93947 62 200813219 可偵測的活性’如第u圖的曲線圖所示。_(反應的產物) :為酵素活性所需要的活化劑，且該活性隨著增加的膽灌 .度而增加。NADH對NAD的比例對於酵素活性的影響係針對酵素的天然型與突變型兩者而測定，而結果顯示於第^ 圖。 PDH係由所有需氧有機體產生（從細菌到人類）。此酵素將丙酮酸氧化脫缓為乙醯輔酶a、c〇4Mdh，而乙_ 酶A之後進人TCA循環做進一步氧化，而後產生能量。在大腸#菌中’ PDH於需氧及厭氧兩種條件下產生。然而，在厭氧條件下’酵素為不活化的，因為MDH抑制刪。難⑽ 通常以較高濃度存在於厭氧細胞中，因此阻止不能被缺乏 ^電子接受者的細胞氧化的麵的產生。結果，細胞每，萄糖只有產生2個咖，且第二組還原物被釋放成為氯孔°因為-個乙醯辅酶A還原成為乙醇需要兩個膽η，故野生型細胞每葡萄糖不能產生兩個乙醇。 , 在本發明的產乙醇性突變體菌株，PDH對NADH較不且敏感性。此降低的敏感性使得酵素能夠作用，即使在厭氧條件下，具有較高的咖集庫（ρ〇〇ι)。因為此生物化學的改雙’細胞可每葡萄糖產生四個NADfJ分子（兩個來自醣解作用，而兩個來自觸反應）。_NADH係全部用來還原兩们乙at辅酶A成為乙醇，使突變體成為同質乙醇生產者。在生物化學及生理上，該細胞為同質乙醇生產者，是因為刪對咖敏感性的降低，與其即使在高_〆脚比例下仍可作用的能力。 93947 63 200813219 最後，在額外的實驗中（數據未呈現），在菌株SE2378 :中發現的LPD的突變（E354K)被引入括草桿菌（需氧有機體 :的LPD類似的位置上⑴观突變支持突變體（mri)的厭氧生長。實施例6 來自其他有機體LPD序列的對照性比對在此實施例中，比較及對照來自不同有機體的二氣硫辛醯胺脫氫酶（LPD)酵素的胺基酸序列之對照性比對。〇丙酮酸脫氫酶⑽H)存在於所有需氧有機體中，從細菌到人類。LPD為PDH酵素複合物的必要成分，且它存在於，複合物及2-側氧戊二酸脫氫酶複合物兩者。在大腸桿囷中，lpd是被這兩種酵素複合物共有，而因為此需求， i加基因除了在基因上游的啟動子外，亦由獨立的啟動子轉錄。

Lpd同源物在所有生命領域皆可被發現。於細菌菌株間，Lpd蛋白質係介於458到581個胺基酸的範圍，無水的分子量為49000到62000道耳吞（Da)。來自各種系統發生學群組的細菌之20個Lpd同源物的胺基酸序列相同度於以下表7顯示。來自各種有機體的二氫硫辛醯胺脫氳酶胺基酸序列與大腸桿菌LPD蛋白質的胺基酸序列係使用於,…的Blast 伺服裔或於歐洲生物科技學會的Ciustalw進行比較。特定序列對大腸桿菌序列的相同度百分比係由兩個資料庫的其中一個獲得。在括號中的值表示特定蛋白質度對大腸桿菌 93947 64 200813219

Lpd的總相似度（s i mi 1 ar i ty)，且包括兩個胺基酸位置相 ,同和保留性置換發生的位置相同。對枯草桿菌而言，兩個二二氫硫辛醯基脫氫酶，一個來自PDH複合物而另一個來自乙醯甲基甲醇脫氳酶，係包含在内來用於比較。序列相同度的變化從巴克甲烧八疊球菌（#e tAai/osarcii/a bariferj·) (一種古細菌）24 %的低值到鼠傷寒沙門桿菌腿ii⑽）菌株LT2(—種革蘭氏陰性細菌）的98%。鼠傷寒沙門桿菌菌株LT2 LPD蛋白質為最接近於大腸桿菌〔LPD ’此符合該兩種細菌的分類，作為革蘭氏陰性細菌，在一樣的腸内桿菌科（enterobacteriaceae)。大腸桿菌菌株 W3110或MG1 655的Lpd胺基酸序列與來自下列各者的已知 Lpd序列進行比對：不動桿菌屬種sp.) ADP1、臘狀桿菌ceret/s) ATCC 10987、枯草桿囷囷株1 68、破傷風桿菌菌株麻薩諸塞/五從（Gos汁idi⑽ teia/ji sirai/3 fassacAuseMs/五狀）、麩胺酸棒狀桿菌 (Cory/3ebacteri⑽ gJi/iafflicL/ffi)菌株 ATCC13032、鐵還原地桿菌（Geo&acier /oetaniredL/ce/Js) GS-1 5、氧化葡萄糖酸桿菌（67i/co/3〇bacter oxyda/]s) 621H、酿蛋白乳酸桿菌 (LaciOibacinL/s casei) ATCC334、乳酸乳球菌乳脂亞種 (Lactococcus lactis subspecies cremoris) SKI 1、胚芽乳酸桿菌 aac^o/?acinL/sp7a;^ari//H) 巴克甲垸八 S 球菌菌株富薩羅（#ei/]a；2〇sarci/2a strain

Fusaro)、酒類酒球菌（(9e/]〇coccus oe/]i) MCW PSU-1、綠膿桿菌（Psei/dofflo/jas aer叹i/7〇sa) PA01 (ATCC15692)、球 65 93947 200813219 :紅，單胞菌 2·41 (肋〇c/〇/?ackr s灿aer〇ides2 41)、 :乳傷养沙門桿菌LT2、希萬氏菌屬種ANA-3 (^eM/3e7Ja sp

;ANA 3)、變種鏈球菌（Sir^i〇c〇cc⑽黯亡抓s) ATCC 70061 0、監色鏈黴菌（S汁epto野ces coeiicoJor) M145、考熱馱乳乙醇菌（Thenn〇anaer〇bacter ethan〇Ucus)、海洋赉光弧菌（hbrj.〇 /iscAeri)菌株ATCC 7〇〇6〇1。同源物比對於第9圖顯示[此圖將被重新編號]。當比較總相同度大知才干囷LPD顯示為最相似於其他革蘭氏陰性lpj); 、然而，§基於保留性置換計算相同度百分比，表4反映出在所檢驗的互異有機體的LPD蛋白質間較高百分比的同源物例如·枯草桿菌菌株168 LPD蛋白質的胺基酸序列相同度與大腸桿菌LPD蛋白質相比為34 %。然而，只把保留性置換計异進去，相同度分數增加到57 %。從比對圖可見，數個胺基酸為高度保留於來自非常不同的有機體群組的 20個LPD同源物群組間。在有機體間共有的殘基係以星號、（*)強调。有興趣的區域被劃上底線。所分析的不同有機體的序列間，在N端區域的序列相同度為最高。序列相同度可見於胺基酸40與55之間（大腸桿菌LPD編號），其表示可月b的κ素位置。相似度的另一區域為介於胺基酸丨8〇與 190。整個序列當中，有數個位置的胺基酸殘基保留在來自所为析的不同有機體中全部2 〇個LPD裡。值得注意的是，第322位置的胺基酸編碼組胺酸（H),且在本發明的三個菌株中（SE2377、SE2383與SE2382)，有在第322位置的組胺酸成為酪胺酸（Y)的突變。在第322位置的組胺酸被保留在 93947 66 200813219 ' 來自革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌到古細菌的全部20 . 個LPD中。其他跨越此不同的範圍而被保留的殘基包括在 : 第355位置的脯胺酸（18/20 LPD)與在第356位置的麩胺酸鹽（17/20 LPD)。表7 :大腸桿菌LPD蛋白質的胺基酸序列相同度對來自其他有機體的LPD同源物。有機體胺基酸的數目相同度％ (調整的百分比）a 不動桿菌屬種菌株ADP1 468 35(55) 臘狀桿菌菌株ATCC 10987 470 44(62) 枯草桿菌菌株168之丙Sg酸DH的E3蛋白質 470 47(64) 枯草桿菌菌株168之乙醯甲基甲醇DH的E3 蛋白質 458 35(57) 破傷風桿菌菌株麻薩諸塞/E88 589 35(58) 麩胺酸棒狀桿菌菌株ATCC 13032 469 34(53) 大腸桿菌菌株W3110或MG1655 474 100 鐵运原地桿菌GS-15 476 35(57) 氧化葡萄糖酸桿菌菌株621H 468 32(51) 酪蛋白乳酸桿菌菌株ATCC 334 471 30(52) 乳酸乳球菌乳脂亞種菌株SK11 472 40(59) 胚芽乳酸桿菌（LacioteciΠι/s 菌株 WCFSKNCIMB 8826) 470 39(58) 巴克甲烷八疊球菌菌株富薩羅 476 24(49) 酒類酒球菌菌株MCW PSU-1 473 39(59) 綠膿桿菌菌株PA01 ATCC 15692 467 37(57) 球形紅假單胞菌菌株2.4.1 462 40(58) 鼠傷寒沙門桿菌LT2 ATCC 700720 474 98(99) 希萬氏菌屬種菌株ANA-3 475 85(94) 變種鏈球菌菌株ATCC 700610 581 36(56) 藍色鏈黴菌菌株M145 486 36(55) 嗜熱厭氧乙醇菌 479 40(58) 海洋發光弧菌菌株ATCC 700601 475 86(94) 表示其為相同的且也是保留性胺基酸改變的胺基酸 67 93947 200813219 參考艾獻 . Bothast RJ and Schlicher MA. 2005. Biotechnological .- processes for conversion of corn in to ethanol. Appl. Microbiol. Biotechnol. 67: 19-25.

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Microbiol· Biotechno1· 56 :17-34· 相等物熟諳技藝人士使用不超過常規的實驗法，將認可或能夠確定許多相對於此處所述之本發明特定具體實施例的相等物。此類相等物意圖包括在此發明中。丛引用方式徘入所有此處指定的出版刊物、專利申請案及專利案全文皆特別以引用方式併入此處。【圖式簡單說明】第1(A)圖表示於鹼基997具有突變的切d基因的核酸序列（序列識別號1)，而第1(B)圖為對應的胺基酸序列列識別號2)。第2(A)圖表示於鹼基1〇93具有突變的切^基因的核酸序列（序列識別號3)，而第2(B)圖為對應的胺基酸序列 (序列識別號4)。第3(A)圖表示野生型/pcf基因的核酸序列（序列識別號5)，而第3(B)圖為對應的胺基酸序列（序列識別號6) 第4圖表示描述於37°C及pH 7.0,在含有葡萄糖或木糖（50克•公升’的LB培養基中，大腸桿菌野生型（菌株 W3110)及產乙醇性突變體（菌株SE2378)的生長與發酵^寺徵的曲線圖。圖表（A)表示野生型W3110菌株，4旦w' 幽丨个玍長於葡萄糖中；圖表（B)表示SE2378菌株，生長於葡萄糖中；圖 (C)表示野生型W3110菌株，生長於木糖中；圖表（d): 一x SE2378囷株’生長於木糖中。 93947 72 200813219 第5圖表示將刪除突變體（arop-ace五尸）（a) (aroP-:aceF)轉導至SE2378菌株（B)。於菌株SE2378的突變藉由 : 共轉導zac: : TnJ 0而加以定位。當虹0尸—加乃允一ace五f基因藉由共轉導而刪除’轉導株（C)失去於厭氧條件下生長在含有1 %葡萄糖的LB中的能力，而在野生型的背景下，相同的删除不影響厭氧的生長。第6A圖表示來自野生型W3110菌株及SE2378突變體之基因產物的胺基酸序列。菌株SE2378基因間區域 f' ' 的核酸序列顯示於第6B圖中。第7(A)圖及第7(B)圖表示在γκΐ 〇〇宿主中，用於表現 W3110或SE2378 Jpd的質體。質體ΡΚΥ32(Α)包含來自野生型菌株W3110的Jpcf基因。質體ΡΚΥ33(Β)包含來自產乙醇性突變體SE2378的Jpd基因。第8A圖至第8C圖為表示在大腸桿菌菌株SE2378、天然的大腸桿菌、及其他產乙醇性微生物中，從丙酮酸鹽產 _ 生乙醇的推測路徑之圖示。 \ / 第9圖（1/6至6/6)表示大腸桿菌K12 MG1 655之LPD 與所挑選的LPD序列之多重胺基酸序列比對（使用CLUSTAL 多重序列比對程式）’該等所挑選的LPD序列亦即來自破傷風桿菌E88、嗜熱厭氧乙醇菌、臘狀桿菌ATCC1 0987、胚芽乳酸桿菌WCFS1、乳酸乳球菌乳脂亞種SK11、酒類酒球菌 MCW PSU-1、鼠傷寒沙氏桿菌LT2、海洋發光弧菌ATCC 700601、希萬氏菌屬種 ANA-3(Sijeira/3ena sp ANA-3)、綠膿桿菌PA01(ATCC 15692)、球形紅假單胞菌2. 4. 1 73 93947 200813219 « (Rhodobacter sphaeroides 2· 4· 1 )、鐵還原地桿菌 GS- 15(Geobacier /HetaUiredi/ce/is GS-15)、不動桿菌屬種ADP1、氧化葡萄糖酸桿菌621H、麵胺酸棒狀桿菌 DSM20300、酪蛋白乳酸桿菌ATCC334、藍色鏈徽菌 M145/A3(2)(Sirepio野ces coeJicoJor M145/A3(2))、變種鏈球菌ATCC 700610、巴克甲烷八疊球菌富薩羅 (Methanosarcina barkeri Fusaro)。於胺基酸 322 的組胺酸殘基、於胺基酸355的脯胺酸殘基及於胺基酸356的麩 ’、胺酸鹽殘基均以星號（*)強調。第10圖為表示在大腸桿菌野生型菌株W3110或產乙醇性突變體菌株SE2378中，PDH活性受NADH的抑制的曲線圖。於上方的圖表中，NAD濃度對於菌株W3110及菌株 SE2378為2mM。於下方的圖表，NAD濃度對於來自菌株W3110 的天然酵素為2mM，而對於來自菌株SE2378的突變型酵素為 ImM 〇第11圖為表示LPD活性受NADH抑制的曲線圖。NADH 對NAD的比例對於酵素活性的影響係針對天然型及突變型 LPD兩者而測定。 74 93947 200813219 序列表序列識別號：1

ATGACCGCCGGAGATAAATATATAGAGGTCATGATGAGTACTGAAATCAAAA

CTCAGGTCGTGGTACTTGGGGCAGGCCCCGCAGGTTACTCCGCTGCCTTCCGT

TGCGCTGATTTAGGTCTGGAAACCGTAATCGTAGAACGTTACAACACCCTTG

GCGGTGTTTGCCTGAACGTCGGCTGTATCCCTTCTAAAGCACTGCTGCACGTA

GCAAAAGTTATCGAAGAAGCCAAAGCGCTG\GCTGAACACGGTATCGTCTTC

GGCGAACCGAAAACCGATATCGACAAGATTCGTACCTGGAAAGAGAAAGTG

ATCAATCAGCTGACCGGTGGTCTGGCTGGTATGGCGAAAGGCCGCAAAGTCA

AAGTGGTCAACGGTCTGGGTAAATTCACCGGGGCTAACACCCTGGAAGTTGA

AGGTGAGAACGGCAAAACCGTGATCAACTTCGACAACGCGATCATTGCAGCG

GGTTCTCGCCCGATCCAACTGCCGTTTATTCCGCATGAAGATCCGCGTATCTG

GGACTCCACTGACGCGCTGGAACTGAAAGAAGTACCAGAACGCCTGCTGGTA

ATGGGTGGCGGTATCATCGGTCTGGAAATGGGCACCGTTTACCACGCGCTGG

GTTCACAGATTGACGTGGTTGAAATGTTCGACCAGGTTATCCCGGCAGCTGA

CAAAGACATCGTTAAAGTCTTCACCAAGCGTATCAGCAAGAAATTCAACCTG

ATGCTGGAAACCAAAGTTACCGCCGTTGAAGCGAAAGAAGACGGCATTTATG

TGACGATGGAAGGCAAAAAAGCACCCGCTGAACCGCAGCGTTACGACGCCG

TGCTGGTAGCGATTGGTCGTGTGCCGAACGGTAAAAACCTCGACGCAGGCAA

AGCAGGCGTGGAAGTTGACGACCGTGGTTTCATCCGCGTTGACAAACAGCTG

CGTACCAACGTACCGCACATCTTTGCTATCGGCGATATCGTCGGTCAACCGAT

GCTGGCATACAAAGGTGTTCACGAAGGTCACGTTGCCGCTGAAGTTATCGCC

C3GTAAGAAACACTACTTCGATCCGAAAGTTATCCCGTCCATCGCCTATACCG

AACCAGAAGTTGCATQGGTGGGTCTGACTGAGAAAGAAfiCGAAAGAGAAAG

GCATCAGCTATGAAACCGCCACCTTCCCGTGGGCTGCTTCTGGTCGTGCTATC

GCTTCCGACTGCGCAGACGGTATGACCAAGCTGATTTTCGACAAAGAATCTC

ACCGTGTGATCGGTGGTGCGATTGTCGGTACTAACGGCGGCGAGCTGCTGGG

TGAAATCGGCCTGGCAATCGAAATGGGTTGTGATGCTGAAGACATCGCACTG

ACCATCCACGCGCACCCGACTCTGCACGAGTCTGTGGGCCTGGCGGCAGAAG

TGTTCGAAGGTAGCATTACCGACCTGCCGAACCCG 序列識別號：2

MSTEIKTQ W VLGAGPAGYS AAFRCADLGL ETVIVERYNT LGGVCLNVGC IPSKALLHVA KVIEEAKALA EHGIVFGEPK TDIDKIRTWK EKVINQLTGG LAGMAKGRKV KWNGLGKFT GANTLEVEGE NGKTVINFDN AIIAAGSRPI QLPFIPHEDP RIWDSTDALE LKEVPERLLV MGGGnGLEM GTVYHALGSQ ID WEMFDQVIPAADKDIVK VFTKRISKKF NLMLETKVTA VEAKEDGIYV TMEGKKAPAE PQRYDAVLVAIGRVPNGKNL DAGKAGVEVD DRGFIRVDKQ LRTNVPHIFAIGDIVGQPML AYKGVHEGHV AAEVTAGKKH YFDPKVIPSI, AYTEPE VAWV GLTEKEAKEK GIS YETATFP WAASGRAIAS DCADGMTKLI FDKESHRVIG GAIVGTNGGE LLGEIGLAIE MGCDAEDIAL TIHAHPTLHE S VGLAAEVFE GSITDLPNPK AKKK 75 93947 200813219 序列識別號：3

ATGACCGCCGGAGATAAATATATAGAGGTCATGATGAGTACTGAAATCAAAA CTCAGGTCTGGTACTTGGGGCAGGCCCCGCAGGTTACTCCGCTGCCTTCCGTT GCGCTGATTTAGGTCTGGAAACCGTAATCGTAGAACGTTACAACACCCTTGG CGGTGTTTGCCTGAACGTCGGCTGTATCCCTTCTAAAGCACTGCTGCACGTAG CAAAAGTTATCGAAGAAGCCAAAGCGCTGGCTGAACACGGTATCGTCTTCGG CGAACCGAAAACCGATATCGACAAGATTCGTACCTGGAAAGAGAAAGTGAT CAATCAGCTGACCGGTGGTCTGGCTGGTATGGCGAAAGGCCGCAAAGTCAAA GTGGTCAACGGTCTGGGTAAATTCACCGGGGCTAACACCCTGGAAGTTGAAG GTGAGAACGGCAAAACCGTGATCAACTTCGACAACGCGATCATTGCAGCGGG TTCTCGCCCGATCCAACTGCCGTTTATTCCGCATGAAGATCCGCGTATCTGGG ACTCCACTGACGCGCTGGAACTGAAAGAAGTACCAGAACGCCTGCTGGTAAT GGGTGGCGGTATCATCGGTCTGGAAATGGGCACCGTTTACCACGCGCTGGGT TCACAGATTGACGTGGTTGAAATGTTCGACCAGGTTATCCCGGCAGCTGACA AAGACATCGTTAAAGTCTTCACCAAGCGTATCAGCAAGAAATTCAACCTGAT f ' GCTGGAAACCAAAGTTACCGCCGTTGAAGCGAAAGAAGACGGCATTTATGTG ACGATGGAAGGCAAAAAAGCACCCGCTGAACCGCAGCGTTACGACGCCGTG CTGGTAGCGATTGGTCGTGTGCCGAACGGTAAAAACCTCGACGCAGGCAAAG CAGGCGTGGAAGTTGACGACCGTGGTTTCATCCGCGTTGACAAACAGCTGCG TACCAACGTACCGCACATCTTTGCTATCGGCGATATCGTCGGTCAACCGATGC TGGCACACAAAGGTGTTCACGAAGGTCACGTTGCCGCTGAAGTTATCGCCGG TAAGAAACACTACTTCGATCCGAAAGTTATCCCGTCCATCGCCTATACCAAA CCAGAAGTTGCATGGGTGGGTCTGACTGAGAAAGAAGCGAAAGAGAAAGGC ATCAGCTATGAAACCGCCACCTTCCCGTGGGCTGCTTCTGGTCGTGCTATCGC TTCCGACT<3CGCAGACGGTATGACGAA<3€TGATTTTCGA€AAAGAATCTCAC CGTGTGATCGGTGGTGCGATTGTCGGTACTAACGGCGGCGAGCTGCTGGGTG AAATCGGCCTGGCAATCGAAATGGGTTGTGATGCTGAAGACATCGCACTGAC CATCCACGCGCACCCGACTCTGCACGAGTCTGTGGGCCTGGCGGCAGAAGTG TTCGAAGGTAGCATTACCGACCTGCCGAACCCGAAAGCGAAGAAGAAGTAA 序列識別號

MSTEIKTQW VLGAGPAGYS AAFRCADLGL ETVIVERYNT LGGVCLNVGC IPSKALLHVA KVIEEAKALA EHGIVFGEPK TDEJKIRTWK EKVINQLTGG LAGMAKGRKV KWNGLGKFT GANTLEVEGE NGKTVINFDN AHAAGSRPI QLPFTPHEDP RIWDSTDALE LKEVPERLLV MGGGHGLEM GTVYHALGSQ IDWEMFDQVIPAADKDIVK VFTKRISKKF NLMLETKVTA VEAKEDGIYV IMEGKKAPAE PQRYDAVLVAIGRVPNGKNL DAGKAGVEVD DRGFIRVDKQLRTNVPHIFAIGDIVGQPML AHKGVHEGHV AAEVIAGKKH YFDPKVIPSIAYTKPEVAWV GLTEKEAKEK GISYETATFP WAASGRAIAS DCADGMTKLIFDKESHRVIG GAIVGTNGGE LLGEIGLAIE MGCDAEDIAL TIHAHPTLHE SVGLAAEVFE GSITDLPNPK AKKK 76 93947 200813219 序列識別號：5

ATGACCGCCGGAGATAAATATATAGAGGTCATGATGAGTACTGAAATCAAAA

CTCAGGTCGTGGTACTTGGGGCAGGCCCCGCAGGTTACTCCGCTGCCTTCCGT

TGCGCTGATTTAGGTCTGGAAACCGTAATCGTAGAACGTTACAACACCCTTG

GCGGTGTTTGCCTGAACGTCGGCTGTATCCCTTCTAAAGCACTGCTGCACGTA

GCAAAAGTTATCGAAGAAGCCAAAGCGCTGGCTGAACACGGTATCGTCTTCG

GCGAACCGAAAACCGATATCGACAAGATTCGTACCTGGAAAGAGAAAGTGA

TCAATCAGCTGACCGGTGGTCTGGCTGGTATGGCGAAAGGCCGCAAAGTCAA

AGTGGTCAACGGTCTGGGTAAATTCACCGGGGCTAACACCCTGGAAGTTGAA

GGTGAGAACGGCAAAACCGTGATGAACTTCGACAACGCGATCATTGCAGCGG

GTTCTCGCCCGATCCAACTGCCGTTTATTCCGCATGAAGATCCGCGTATCTGG

GACTCCACTGACGCGCTGGAACTGAAAGAAGTACCAGAACGCCTGCTGGTAA

TGGGTGGCGGTATCATCGGTCTGGAAATGGGCACCGTTTACCACGCGCTGGG

TTCACAGATTGACGTGGTTGAAATGTTCGACCAGGTTATCCCGGCAGCTGAC

AAAGACATCGTTAAAGTCTTCACCAAGCGTATCAGCAAGAAATTCAACCTGA

TGCTGGAAACCAAAGTTACCGCCGTTGAAGCGAAAGAAGACGGCATTTATGT

GACGATGGAAGGCAAAAAAGCACCCGCTGAACCGCAGCGTTACGACGCCGT

GCTGGTAGCGATTGGTCGTGTGCCGAACGGTAAAAACCTCGACGCAGGCAAA

GCAGGCGTGGAAGTTGACGACCGTGGTTTCATCCGCGTTGACAAACAGCTGC

GTACCAACGTACCGCACATCTTTGCTATCGGCGATATCGTCGGTCAACCGATG

CTGGCACACAAAGGTGTTCACGAAGGTCACGTTGCCGCTGAAGTTATCGCCG

GTAAGAAACACTACTTGGATCGGAAA<jTTATCCCGTC€ATCGCCTATACCGA

ACCAGAAGTTGCATGGGTGGGTCTGACTGAGAAAGAAGCGAAAGAGAAAGG

CATCAGCTATGAAACCGCCACCTTCCCGTGGGCTGCTTCTGGTCGTGCTATCG

CTTCCGACTGCGCAGACGGTATGACCAAGCTGATTTTCGACAAAGAATCTCA

CCGTGTGATCGGTGGTGCGATTGTCGGTACTAACGGCGGCGAGCTGCTC5GGT

GAAATCGGCCTGGCAATCGAAATGGGTTGTGATGCTGAAGACATCGCACTGA

CCATCCACGCGCACCCGACTCTGCACGAGTCTGTGGGCCTGGCGGCAGAAGT

GTTCGAAGGTAGCATTACCGACCTGCCGAACCCGAAAGCGAAGAAGAAGTA

A 序列識別號：6

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Claims

200813219 十、申請專利範圍： -種包含突變之分離的非重組細菌’其t，該突變使得该非重組細龍財職條件下使每莫耳的糖產生4 莫耳的NADH。 2. 如申請專利範圍第1項之分離的非重組細菌，其中，該突變位於pdh操縱組中。 3. 如申請專利範圍第2項之分離的非重組細菌，其中，該 Pdh操縱組包含pdhR、％6卯及2加基因。 κ 4. 如申請專利範圍第3項之分離的非重組細菌，其中，該突變位於該7加基因中。人 5·:申請專利範圍第！至4項中任一項之分離的非重組細囷^其中’該每莫耳的糖產生4莫耳的nadjj導致產生乙醇作為首要發酵產物。 6. ^申請專利範圍第任—項之分離的非重組細囷其中，該糖係選自於由下列所組成之組群··葡萄糖、柄、阿㈣糖、甘露糖、半m糖及乳糖。 •一種包含具有突變的⑽基因之分離的非重組細菌，其 =，該突變使得該非重組細菌能夠在厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物。 8.=申請專利範圍第5或7項中任一項之分離的非重組細菌中，於厭氧條件下，該產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的50%。 9’t申請專利範圍第1至8項中任一項之分離的非重組細囷，其中’該細菌沒有該突變時，為非產乙醇性。 93947 84 200813219 10· =申f專利範圍第9項之分離的非重組細菌，其中，乙知。為次要發酵產物且含量低於全部非氣體發酵產物的 40% ° 11. ^申請專利範圍第項中任—項之分離的非重組細囷’其中’該突變提供同質乙醇發酵路徑。 12. :申請專利範圍第m項中任一項之分離的非重組細菌/、中，在该細菌中，一種或多種的發酵替代路徑為不活化的。 13·如申請專利範圍第12項之分離的非重組細菌，其中，該發酵替代路徑包含以丙酮酸甲酸解離酶〇/7)及琥珀酉欠鹽開始，由乳酸脫氫酶、醋酸鹽、乙醇、甲酸鹽、H2及c〇2產生乳酸鹽。 14·如申請專利範圍第13項之分離的非重組細菌，其中，該發酵替代路徑因突變而不活化。 •如申明專利範圍第13項之分離的非重組細菌，其中，該突變位於該/ 基因中。 6 ·如申清專利範圍第13項之分離的非重組細菌，其中，該突變位於該p/j基因中。 17·如申請專利範圍第15或16項之分離的非重組細菌，其中’該突變位於該或p/M基因中。 1 Ο •一種分離的核酸分子，其係選自於由下列所組成之組群： a)包含至少60%與序列識別號1或序列識別號3的核苷酸序列同源之核苷酸序列的核酸分子，或其互補 85 93947 200813219 ' 物； ‘ b)包3含有序列識別號1或序列識別號3核苷酸序列 : 的核酸之至少100個核苷酸的片段的核酸分子，或其互補物； C)編碼包含至少約50%與序列識別號2或序列識別號4 的月女基S文序列同源之胺基酸序列的多胜肽之核酸八子；、d)編碼包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽片段的核酸分子；其中，該片段包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列的至少j 5 個連續胺基酸殘基； e)編碼多胜肽之天然存在的對偶變異體之核酸，該多胜肽包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列；其中，該核酸分子於嚴苛條件下，與包含序列識別5虎1或序列識別號3的核酸分子的互補物雜交· ; f)包含序列識別號1或序列識別號3的核苷酸序列的核酸分子，或其互補物；及 §)編碼包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽的核酸分子；其中，當該核酸分子於細胞中表現時，將使得該細胞能夠產生乙醇作為首要發酵產物。 19.如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子，其中，於厭氣條件下’該產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵:產物的50% 〇 93947 86 200813219 20.如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子，其中，該細胞為細菌細胞。 21 ·如申晴專利範圍第20項之分離的核酸分子，其中，該細菌細胞在沒有表現該核酸分子時，為非產乙醇性。 22·如申請專利範圍第21項之分離的核酸分子，其中，乙醇為次要發酵產物且含量低於全部非氣體發酵產物的 40% ° 23·如申睛專利範圍第19項之分離的核酸分子，其中，該細菌細胞於厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物。 24·如申請專利範圍第19項之分離的核酸分子，其中，該核酸分子於該細菌細胞中的表現提供同質乙醇發酵路徑於該細菌細胞中。 25·種如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子，其 t，該核酸分子包含序列識別號1的片段，其中，該核敲刀子至少為1 〇〇個核苷酸長且在對應於序列識別號丄第9 9 7位置的位置包括丁。 26·—種如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子，其 :，該核酸分子包含序列識別號3的片段，其中，該核 =刀子至少為1 〇〇個核苷酸長且在對應於序列識別號i 第1023位置的位置包括G。 27·種刀雔的多胜肽’其係選自於由下列所組成之組群： a)包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽片段’其中，該片段包含序列識別號2或序列識別號4的至少15個連續胺基酸； 93947 87 200813219 b) 包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽之天然存在的對偶變異體，其中，該多胜肽由核酸分子編碼，該核酸分子於嚴苛條件下，與包 έ序列識別號1或序列識別號3的核酸分子的互補物雜交； c) 由至少有50 %與包含序列識別號i或序列識別號3 核苷酸序列的核酸相同之核酸分子所編碼的多胜肽； d) 包含至少有90 %與序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列相同之胺基酸序列的多胜肽；及 e) 分離的多胜肽，包含序列識別號2或序列識別號4 的胺基酸序列；中§該多胜肽於細胞中表現時，將使得該細胞能夠產生乙醇作為首要發酵產物。 28·如申請專利範圍第27項之分離的多胜肽，其中，於厭氧ir、件下’该產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的 50% 〇如申明專利範圍第2 7項之分離的多胜肽，其中，於厭氧蝕件下’該多胜肽具有二氫硫辛醯胺脫氫酶的活性。 30·如申請專利範圍第27項之分離的多胜肽，其中，該細胞為細菌細胞。 1 ·=申凊專利範圍第3〇項之分離的多胜肽，其中，該細菌、、、田胞在/又有表現該多胜肽時，為非產乙醇性。如申明專利範圍第3 〇項之分離的多胜肽，其中，乙醇 93947 88 200813219 ΓοΓ要發酵產物且含量低於全部非氣體發酵產物的 33.ΐ申請專利範圍第27項之分離的多胜肽，其中，該細 34 It:”條件下產生乙醇作為首要發酵產物。 ·，5月專利範圍第30項之分離的多胜肽，其中，於厭 =件下It產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的 50%。 •士申明專利|巳圍f 30項之分離的多胜肽，其中，該多月狀於該細菌細胞中的表現提供同質乙醇發酵路徑於該細菌細胞中。 36*種細囷宿主細胞，包含如申請專利範圍第18至26 項中任一項之核酸分子。 37. 如申請專利範圍第％項之細菌宿主細胞，其包含載體’該載體包含序列識別號！或序列識別號3的核苦酸序列，或其片段。 38. 如申請專利範圍第3〇項之細菌宿主細胞，其中，該載體為PKY33。 39. 如申請專利範圍第36項之細菌宿主細胞，該細菌宿主細胞已被基因改造成表現該核酸分子。 4〇· —種細菌宿主細胞，包含如申請專利範圍第至35 項中任一項之多胜肽。 41·種產生多胜肽之方法，該多胜肽係選自於由下列所組成之組群： a)包含序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之 93947 89 200813219 多胜肽； b) 包3序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之夕胜肽片& ’其中’該片段包含序列識別號2或序列4別號4的至少15個連續胺基酸；及 c) 包3序列識別號2或序列識別號4的胺基酸序列之多胜肽之天然存在的對偶變異體，其中’該多胜肽由核酸分子編碼，該核酸分子於嚴苛條件下’與包含序列識別號丨或序列識別號3的核酸的互補物雜交；該方法包含於該核酸分子表現的條件下，培養如申請利範圍第3 0項之宿主細胞。 42.如中請專利範圍第丨至5項及第7項中任—項之分離的非重組細菌，其包含如申請專利範圍第18項之核酸分子0 4巧申請專利範圍第！至4項中任一項之分離的非重組細囷，其中，乙醇係由該糖產生。 44.如申请專利範圍第42《43項之分離的非重組細菌，其中，該糖係選自於由下列所組成之組群：葡萄糖、木糖、、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖及乳糖。 “申請專利範圍第⑴項中任—項之分離的非重組細囷、如申請專利範圍帛18項之分離的核酸分子、如申請專利範圍第27項之分離的多職或如申請專利範圍昂36項之細菌宿主細胞’其中，該細菌係選自於由下列所組成之組群:革蘭氏陰性細菌及革蘭氏陽性細菌。 93947 90 200813219 46·如申凊專利範圍第1至7項中任一項之分離的非重纽細 ‘ 菌、如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子、如申 / 請專利範圍第27項之分離的多胜肽或如申請專利範圍第36項之細菌宿主細胞，其中，該細菌為革蘭氏陰性細菌。 47·如申请專利範圍第丨至7項中任一項之分離的非重組細菌、如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子、如申 (χ 請專利範圍第27項之分離的多胜肽或如申請專利範圍第36項之細菌宿主細胞，其中，該革蘭氏陰性細菌係，自於由下列所組成之組群：不動桿菌屬、葡萄糖酸桿囷屬、大腸桿菌屬、地桿菌屬（k〇5acter)、希萬氏菌屬（幼ewaijena)、沙氏桿菌屬、腸内桿菌屬及克雷白氏桿菌屬（Klebsiella)。 48·=申請專利範圍第1至7項中任一項之分離的非重組細菌、如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子、如申 : f專利範圍第27項之分離的多胜肽或如申請專利範圍第=項之細菌宿主細胞，其中，該細菌為革蘭氏陽性細菌。復”請專利範圍以至7項中任一項之分離的非重叙細囷、如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子、如申，專利範圍第27項之分離的多胜肽或如中請專利範圍 :36項之細菌宿主細胞，其中，該革蘭氏陽性細菌係 ^於由下列所組成之組群：芽胞桿菌屬、梭菌屬、棒狀桿菌屬、乳酸桿菌屬、乳酸球菌屬、酒球菌屬、鍵^ 93947 91 200813219 菌屬及真桿菌屬。 :50·如申請專利範圍第1至7項中任一項之分離的非重組細 / 菌、如申請專利範圍第18項之分離的核酸分子、如申請專利範圍第27項之分離的多胜肽或如申請專利範圍弟3 6項之細囷宿主細胞，其中，該細菌為大腸桿菌。 51·如申請專利範圍第4或7項之分離的非重組細菌，其中’該突變包含於由該突變的基因表現的多胜肽中’將胺基酸以另一個胺基酸置換，其中，該置換改變該多胜肽的pK。 52·如申請專利範圍第51項之分離的非重組細菌，其中，該多胜肽包含序列識別號6且該突變包含於下列位置將野生型胺基酸以另一個胺基酸置換： a) 序列識別號6中第322位置或於第322位置的任一端約5 0個位置以内的位置；或 b) 序列識別號6中第354位置或於第354位置的任一端約5 0個位置以内的位置。 \ / . 53. 如申請專利範圍第51或52項之分離的非重組細菌，其中，該另一個胺基酸為中性胺基酸，其係選自於由下列所組成之組群：丙胺酸、半胱胺酸、甘胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸及纈胺酸。 54. 如申請專利範圍帛51或52項之分離的非重組細菌，其中，該另一個胺基酸為鹼性胺基酸，其係選自於由下列所組成之組群：精胺酸、天冬醯胺酸、麵醯胺酸、組胺 93947 92 200813219 酸及離胺酸。 :55·如申請專利範圍第52項之分離的非重組細菌，其中， / 该突變包含以任何胺基酸置換在第3 2 2位置的Η，使得該胺基酸置換增加由該突變的基因表現的該多胜肽的酸度。 56·如申請專利範圍第55項之分離的非重組細菌，其中，該突變包含於序列識別號6中第322位置的Η置換成為 Υ ° Ο 57.如申請專利範圍第52項之分離的非重組細菌，其中，該突變包含以任何胺基酸置換在第354位置的Ε，使得該胺基酸置換降低由該突變的基因表現的該多胜月太的酸度。 58. 如申請專利範圍第57項之分離的非重組細菌，其中，該突變包含於序列識別號6中第354位置的Ε置換成為 Κ。、 59. 如申請專利範圍第56項之分離的非重組細菌，其中，該細菌為大腸桿菌菌株SE2377。 60. 如申請專利範圍第59項之分離的非重組細菌，其中，該細菌包含序列識別號1，或其片段。 61. 如申請專利範圍第⑽項之分離的非重組細菌，其中，該細菌為大腸桿菌菌株SE2378。 ' 62. 如申請專利範圍第61項之分離的非重組細菌，其中，該細菌包含序列識別號3，或其片段。 /、 63·如申請專利範圍第58項之分離的非重組細菌，其中， 93947 93 200813219 礴该細菌為大腸桿菌菌株SE2382。 • 64·如申咐專利範圍第63項之分離的非重組細菌，其中， • 該細菌包含序列識別號3，或其片段。 65·如申請專利範圍第56項之分離的非重組細菌，其中，該細菌為大腸桿菌菌株SE2383。 66·如申請專利範圍第65項之分離的非重組細菌，其中，該細菌包含序列識別號1，或其片段。 ,67·如申請專利範圍第56項之分離的非重組細菌，其中， ( 該細菌為大腸桿菌菌株SE2384。 68·如申凊專利範圍第67項之分離的非重組細菌，其中，該細菌包含序列識別號1，或其片段。 69·如申請專利範圍第58項之分離的非重組細菌，其中，該細菌為大腸桿菌菌株SE2385。 7〇·如申請專利範圍第69項之分離的非重組細菌，其中，該細菌包含序列識別號3，或其片段。 u 71·如申請專利範圍第56至7〇項中任一項之分離的非重組細菌’其中，該細菌適用於從糖產生乙醇。 72·種包含具有一個或多個突變的基因之分離的非重組細菌，其中該突變使得該非重組細菌能夠於厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物，其中，該細菌係由包含以下步驟的製程所製備： a)使該細菌的候選突變株於厭氧生長條件下在富含糖的培養基中生長；及 b )挑選產生乙醇作為主要發酵產物的突變體。 93947 94 200813219 =申=利範圍第72項之方法，其中，於厭氧條件下，以生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物白勺_。 4.=產生如申請專利範圍第1至8項中任-項之非重組、、、田囷的方法，該方法包含以下步驟： a)使該細g的候選突變株於厭氧生長條件下在富含糖的培養基中生長；及 )挑4產生乙醇作為主要發酵產物的突變體。 1如申請專利範圍第74項之方法，其中，於厭氧條件下，該產生白勺乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的5〇 %。 76. 如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌或如申靖專利範圍第74項之方法，其中，該突變體係突變所造成。 77. 如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌或如申請專利範圍第74項之方法’其中，該細菌係曝露於誘變劑下。 7匕如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌或如申請專利範圍第74項之方法’其中，該誘變劑係選自於：下列所組成之組群：乙基曱烷磺酸鹽、2_胺嘌呤、 ICR-191、曱基曱烷磺酸鹽、N—甲基_N，_硝基_N_亞硝基胍。 1 79. 如申請專利範圍第78項之分離的非重組細菌或方法，其中，該誘變劑為乙基曱烷磺酸鹽。 80. 如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌或如申請專利範圍第74項之方法，其中，於該富含糖的培養^ 93947 95 200813219 二拉係選1於由下列所組成之組群：㈣糖、木糖、、甘路糖、半乳糖、蔗糖及乳糖。 81. 如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌或專利範圍第74項之方法，進—步包含於該細菌中使替月代性發酵路徑不活化的步驟。曰 82. 如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌或如士利乾圍第74項之方法’其中，該替代性發酵路徑係猎由引入删除突變於該細菌中而不活化。 83. 如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌，其中，該細菌沒有該突變時，為非產乙醇性。 /、 84. 如申請專利範圍第⑽項之分離的非重組細菌，其中，乙醇為次要發酵產物且含量低於全部非氣體發酵產物的 40% 〇 85·如申請專利範圍第巧項之分離的非重組細菌，其中，該細菌於厭氧條件下產生乙醇作為首要發酵產物。 86·如申請專利範圍第85項之分離的非重組細菌，其中，於厭氧條件下，該產生的乙醇含量高於全部非氣體發酵產物的50%。 87·如申請專利範圍第72項之分離的非重組細菌，其中，該突變提供同質乙醇發酵路徑。 8·如申％專利範圍第8了項之分離的非重組細菌，其中，在-亥細菌中，一種或多種的發酵替代路徑為不活化的。 9·如申明專利範圍第88項之分離的非重組細菌，其中，该發酵替代路線因突變而不活化。 93947 96 200813219 9〇·如申請專利範圍第88項之分離的非重組細菌，其中， ‘ 该發酵替代路徑包含以丙酮酸甲酸解離酶（p/i)及琥珀、酸鹽開始，由乳酸脫氳酶（7处）、醋酸鹽、乙醇、甲酸鹽、H2及c〇2產生乳酸鹽。 91·種自养醣來源產生乙醇的方法，包含使該寡醣與如申請專利範圍第1至8項中任一項之分離的非重組細菌或與如申請專利範圍第36項之細菌宿主細胞接觸，從而自寡醣來源產生乙醇。 92·如申凊專利範圍第9丨項之方法，其中，該寡醣係選自於由下列所組成之組群：木質纖維素、半纖維素、纖維素、果膠及其任何組合物。 93· 一種套組，係包含如申請專利範圍第1至8項中任一項之分離的非重組細菌與產生乙醇的說明書。 94·如申請專利範圍第93項之套組，進一步包含糖來源。 95· —種大腸桿菌菌株AH218，其係由美國農業部菌種中心、的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL B-30967。 96· 一種大腸桿菌菌株AH241，其係由美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL b-30968。 97. 一種大腸桿菌菌株AH242，其係由美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL B—30969。 98· —種大腸桿菌菌株SE2377，其係由美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL b—30970。 99· 一種大腸桿菌菌株SE2378，其係由美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL B—30971。 93947 97 200813219 ^ _ 100· —種大腸桿菌菌株SE2382，其係由美國農業部菌種中 .，〜的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL B-30972。 —1〇1· 一種大腸桿菌菌株SE2383，其係由美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL B-30973。 102· —種大腸桿菌菌株SE2384，其係由美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL b—3〇974。 1〇3· 一種大腸桿菌菌株SE2385，其係由美國農業部菌種中心的寄存物代表且指定為寄存編號NRRL b___3〇975。 104·如申請專利範圍第4、7或72項之分離的非重組細菌，其中，位於該^^基因的該突變導致NADH不敏感性。 105·如申明專利範圍第、74或91項之方法或如申請專利耗圍第93項之套組，其中，該突變體係由在該7如基因中的突變所造成。 106.如申請專利範圍第105項之方法或套組，其中，在該基因中的突變導致nADH不敏感性。 93947 98