TW200538153A - Feline calicivirus vaccines - Google Patents
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Description
200538153 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種用於使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒免疫 力之疫苗。本發明亦係關於一種編碼經分離之貓嵌杯狀病 毒之衣殼蛋白的核酸選殖。本發明進一步係關於一種包含 經分離之貓嵌杯狀病毒的活疫苗或死疫苗、一種包含經分 離之貓嵌杯狀病毒之衣殼蛋白的次單位疫苗、一種包含經 分離之I苗後杯狀病毒之核酸選殖的核酸疫苗，及一種包含 編碼經分離之貓嵌杯狀病毒之衣殼蛋白之核酸的重組病毒 載體疫苗。本發明亦係關於一種用以識別適用於製造疫苗 組合物之貓嵌杯狀病毒的方法，及用於診斷經受貓嵌杯狀 病毒感染之猫的分析法。 【先前技術】 嵌杯狀病毒係為一小病毒科，其具有正股、未分段、多 腺苷酸化RNA基因體，該等無套膜（non-enveloped)病毒之 浮力密度範圍從1.36至1.39 g/ml(Oglesby，A.S·等人， Biochemical and biophysical properties of vesicular exanthema of swine virus, Virology 44，第 329-341 頁 (1971) ; Burroughs，J.N 及 Brown，F·，Physico-chemical evidence for re-classification of the caliciviruses，J. Gen. Virol，22，第 281-285 頁（1974) ; Soergel，Μ·Ε.等人，
Biophysical comparisons of calicivirus serotypes isolated from pinnipeds，Intervirology，第 5，239-244 頁（1 975)) 〇 該 科成員包括I苗嵌杯狀病毒（feline calicivirus ; FCV)、San 98582.doc 200538153
Miguel海獅病毒（San Miguwel sea lion virus ; SMSV)、豬 小疮療病毒（Vesicular exanthema virus ; VEV)及人類欲杯 狀病毒（Schaffer，F.L. ，Caliciviruses 於·· Comparative Virology，14(Fraenkel-Conrat，H.及 Wagner，R·版），第 249-284 頁（1979)) 〇 貓經FCV感染所產生的疾病症狀顯著地有差異，端視所 涉及之病毒株、曝露嚴重程度及宿主抵抗力而定。某些病 毒株顯然很少引起或不會引起疾病症狀。低毒性病毒株不 會產生或僅會產生中等程度的發燒，但卻會產生舌頭、硬 鰐及鼻部之潰瘍。高致病力病毒株會產生發燒、厭食、抑 鬱、呼吸困難或呼吸急促，並常致死，在新生動物中尤為 如此。除了高毒性病毒株產生之肺炎症狀外，可能會但不 一定會發生舌頭、硬鰐及鼻部的潰瘍。FCV病毒株業已證 明在某種程度上為尿道炎膀胱炎綜合症之原因。 業經證明FCV是從咽喉排出，且可在貓帶原者之糞便中 至少存在一年。因為康復的貓常成為帶原者，所以排出物 是病毒持續存於自然界中之原因。 FCV感染之發病率趨於增高，且具有嚴重肺炎症狀之幼 貓的死亡率可能接近100%。特徵為舌頭潰瘍之輕微疾病 很少具有致命性。 由極高毒性或肺炎性FCV所引起的疾病首先會出現發燒 (104-105°F)及厭食。發燒在經過初期時升高後傾向於波 動，但在疾病之過程中溫度則維持在高溫。呼吸急促或呼 吸困難出現在初期發燒溫度上升後不久，且聽診可以聽到 98582.doc 200538153
肺部水泡診音。除了明顯的呼吸窘迫之外，抑鬱傾向於明 顯，且受感染的貓可能會遭受急性貓瘟。死亡發生於症狀 發作的幾天内。FCV感染之純肺炎形式看起來在新生（14_ 21天）及斷奶的直至四個月大的小貓中最普遍。曝露於高 毒性FCV之年長易感貓會顯示出聯想到滲出性肺炎之初期 症狀，而後在貓康復時變成增生性及間質性肺炎。在此年 齡群中，口部及鼻部潰瘍通常不會與肺炎同時發生。FCV 亦會引起多發性關節炎及跛行綜合症。另外，更新的高毒 性病毒株會引起臉部水腫。 儘管用於使貓產生對抗FCV免疫力之疫苗具有可用性， 但是目前尚無疫苗證明具有可完全對抗所有？(：从病毒株及 分離株之保護力。在某些貓中，目前某些疫苗甚至會引起 疾病。因此，需要一種提供予貓保護力以對抗Fcv相關疾 病之有效疫苗。 引用文獻 美國專利文獻 3937812 1976年2月 Bittle等人 3944469 1976年3月 Bittle等人 4486530 1984年12月 David等人 4786589 1988年11月 Rounds等人 5169789 1992年12月 Bernstein 等人 5229293 1993年7月 Matsuura 等人 5266313 1993年11月 Esposito 等人 5338683 1994年8月 Paoletti 等人 98582.doc 200538153
5494807 1996年2月 5559041 1996年9月 5561064 1996年10月 5580859 1996年12月 5585100 1996年12月 5589384 1996年12月 5589466 1996年12月 5620845 1997年4月 5656448 1997年8月 5693761 1997年12月 5693762 1997年12月 5695928 1997年12月 5703055 1997年12月 5716784 1998年2月 5716822 1998年2月 5718901 1998年2月 5725863 1998年3月 5728587 1998年3月 5800821 1998年9月 5977322 1999年11月 6010703 2000年1月 6355246 2002年3月 國外專利文獻 0484382 1995年3月
Paoletti 等人 Kang等人 Marquet 等人 Feigner Mond等人 Liscombe Feigner Gould等人 Kang等人 Queen等人 Queen等人 Stewart 等人 Feigner DiCesare Wardley Wardley Daniels 等人 Kang等人 Acheson 等人 Marks等人 Maes等人 Kruger等人
EP 98582.doc 200538153
2004/083390 WO 其它公開案
Burroughs，J.N及 Brown，F·，J· Gen. Virol·，22，第 281-285 頁（1974);
Clarke及 Lambden於 J· Gen. Virol. 78: 291-301(1997);
Motin等人，Infect· Immun. 64: 4313-4318(1996);
Oglesby，A.S_ 等人，Virology 44,第 329-341 頁（1971);
Soergel，Μ.Ε·等人，Intervirology，5，第 239-244 頁 (1975)；
Yokoyama，N.等人，Vaccine，第 14卷，第 17/18期，第 1657-1663頁（1996) 〇 【發明内容】 本發明包括一種用於使描產生對抗雜嵌》杯狀病毒免疫力 之疫苗，其包含產生免疫反應之有效劑量FCV-Diva病毒株 及醫藥上可接受之載劑。本發明亦提供一種疫苗，其中 Diva病毒株包含以下揭示之編碼SEQ ID NO : 2之核酸。 本發明亦提供一種疫苗，其中Diva病毒株包含以下揭示之 編碼SEQ ID NO : 1之核酸。視需要該疫苗可包括一佐 劑。該疫苗之FCV-Diva病毒株可為失活的或其可為活的或 經活減毒的。視需要該疫苗可含有至少一種選自由下列各 病毒株組成之群的其它貓嵌杯狀病毒病毒株：FCV-F9、 FCV-M8、FCV-255及FCV-2280。視需要該疫苗可含有至 少一種選自由下列各病原體組成之群的其它貓病原體··貓 痕療病毒、1¾白血·病病毒、猫免疫缺乏病毒、1¾彼衣餘及 98582.doc -10- 200538153 I苗痕病毒、狂犬病病毒及支氣管敗血性博德特拉菌 (Bordetella bronchiseptica) 〇 本發明亦包括一種使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒免疫力之 疫苗，其包括：用以產生免疫反應之有效量之編碼FCV-
Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之核酸及醫藥上可接
受之載劑，其中核酸係以人工操縱方式連接至異種啟動子 序列。視需要可將該核酸插入質體或重組病毒載體中。所 用之重組病毒可包括但不限於貓疱疹病毒、浣熊痘病毒、 金絲雀痘病毒、腺病毒、勝利基森林（Semlicki Forest)病 毒、辛德比斯（sindbis)病毒及牛痘病毒。在一較佳實施例 中，該核酸編碼包含SEQ ID NO : 2之胺基酸或其特異免 疫原性片段之衣殼蛋白。在另一較佳實施例中，編碼衣殼 蛋白之核酸是編碼特異免疫原性片段（SEQ ID NO : 2)之 SEQ ID NO : 1或其片段。SEQ ID NO : 1及所編碼的胺基 酸序列SEQ ID NO ·· 2轉載如下。 M CST CAN VLK Y Y N W D P H FRL·
1 ATGTGCTCAA CCTGCGCTAA CGTGCTTAAA TACTATAACT GGGATCCCCA CTTTAGGCTT VI NP NKF LSV GFCD NPL MCC 61 GTTATCAACC CCAACAAGTT TCTTTCTGTT GGTTTCTGTG ATAATCCGCT TATGTQTTGT Y P E L LPE FGT VWDC DQS P L Q
121 TATCCCGAAT TGCTTCCTGA ATTTGGAACG GTGTGGGACT GTGATCAGTC TCCACTTCAA IYLE S I L GDD EWSS T Y E AID
181 ATTTACCTAG AATCTATCCT TGGTGATGAT GAATGGAGTT CCACATACGA GGCAATTQAC PCVP PMH W D E A G K I FQP HPG
241 CCATGCGTGC CACCAATGCA CTGGGATGAA GCTGGCAAGA TCTTTCAQCC ACACCCTGGT VLMH Η I I GEV Λ K A W D P N LPN
301 GTTTTGATGC ACCACATTAT TGGAGAAGTT GCTAAGOCTT GGGACCCGAA CCTTCCCAAC FRLE ADD 6 S I T T P E Q G T TV G
361 T7CCGTTTGG AAGCTGATGA TGGTTCCATC ACCACCCCCG AGCAGGGAAC TACAGTTGGC G V I A EPS V Q M S A A A DMA TGK
421 GGAGTCATTG CTGAGCCGAG TGTCCAMTG TCAGCGGCTG CTGACATGGC AACTQGCAAA SVDS EWE A F F SFHT SVN W S T
481 AGCGTTGACT CTGAGTGGGA AGCTTTCTTC TCTTTTCACA CCAGTGTCAA CTGGAGTACA SETQ GKI LFK Q S L G P L L N P Y
541 TCCGAAACCC AAGGAAAGAT TCTATTCAAG CAAAGCTTGG GGCCTCTTCT CAACCCATAC L T H L AKL Y V A WSGS I E V RFS
60X CTCACGCATC TTGCTAAACT TTATGTCGCA TGGTCTGGCT CTATTGAAGT GAGATTCTCT ISGS GVF 6 6 K L A A I V V P P G I
661 ATTTCTGGGT CTGGTGTTTT CGGAGGAAAA CTGGCTGCAA TTGTTGTGCC ACCTGGAATC E P I Q STS MLQ YPHV L F D A H Q
721 GAGCCQATCC AAAGCACTTC AATGCTTCAG TATCCTCACG TTCTATTTGA CGCTCGTCAG VEPV IFT IPD LRST L Y H L M S
781 GTGGAACCTG TGATCTTTAC TATCCCTGAT CTTAGAAGTA CCCTCTATCA CCTTATGTCT -11- 98582.doc 200538153
841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981
GAT
TDT TSL VIM IYND LIN P Y A UTACTGACA CTACTTCTTT AGTGATCATG ATATACAATQ ATCTCATTAA CCCTTATGCT NDSN SSG CIV T V E T K P G PDF AATGATTCTA ACTCATCTGG GTGCATTGTT ACTGTGGAAA CAAAACCGGG TCCTGACTTC KFHL LKP PGS N L T H G S V PCD AAATTCCATT TATTGAAACC TCCTGGTTCT ATGTTAACTC ATGGCTCTGT CCCGTGTGAC L I P K SSS LWI GNRF W S D I T D CTAATACCAA AGTCTTCTTC TCTTTGGATT GGAAATAQGT TCTGGTCTGA TATCACTGAT FVIR P P V F Q A N R H F DFN QET TTTGTTATTC GGCCATTTGT GTTCCAAGCT AACCGTCACT TTGATTTCAA CCAAGAGACG AGWS TPR F R P I T V T ISQ KEG GCAGGTTGGA GTACACCAAG ATTCAGACCA ATCACAGTCA CAATTAGTCA AAAAGAAGGT EMLG I G V A T D YIVP GIP DGW GAAATGCTTG GGATTGGCGT AGCCACTGAT TATATTGTAC CAGGCATACC TGATGGATGG PDTT IP N ELI PAGD Y A I TNQ CCAGATACAA CAATACCTAA TGAGCTCATT CCGGCTGGTG ATTATGCTAT TACCAATCAG SGND I Q T K E E Y E S λ Mil S N N AGTGGCAATG ATATACAAAC AAAAGAGGAA TACGAATCTG CCATGATAAT CAGCAACAAC T N P K S Μ Y ICG S L Q R A W G N K K ACAAATTTCA AAAGCATGTA CATTTGTGGG TCCCTTCAAC GA6C6TGGG6 TAATAAGAAA VSNT API T T A T V K B NKL IPS GTGTCTAACA CTGCTTTCAT TACTACTGCT ACGGTAAAGG AAAACAAATT AATTCCCAGC
N T I D QTK I A I AATACCATTG ACCAAACAAA GATTGCAATT Q T S D DTL ALL CAAACATCTG ATGACACATT GGCTTTACTT GADR EKV V R I GGTGCTGATA GGGAGAAAGT TGTGCX3CATT G NHP I F Y RNS GGCAACCATC CAATCTTCTA TAGGAATTCT D V P N SQI L Η T GATGTGTTTA ACTCGCAGAT CTTGCACACC LSPD SFA V Y R CTATCACCTG ACTCTTTTGC TGTTTATAGG IGID SDG F S P ATAGGCATTG ATAGTGATGG ATTCTCCTTT FPLT A S Y M G N TTTCCTCTTA CTGCCTCCTA CATGGGAAAT IRST MTK L ATTAGGAGCA CAATGACAAA ATTA
Q D N Η V N AAGACA ATCACGTCAA G Y T G I G E GGGTACACAG GAATTGGTGA G V L P E A 6 GGTGTCCTTC CAGAAGCTGG Μ K L 6 Y V I ATGAAATTAG GTTATGTTAT S R Q 1» S L N TCTAGACAAC TATCACTGM I I D S N G S ATAATTGATT CTAATGGATC V G V S S I G GTTQGTGTTT CTTCTATCGG Q L A K I R L CAATTGGCAA AGATTCGACT
TTCC
R D V TCX3CGATGTG E A I AGAAGCAATT A R G CGCGCGCG6T K S I CAAATCTATA N Y L CAACTACCTT W F D TTGGTTTGAT K L E ΤΑΑΑΤΤΑΟΑλ A S N TGCCTCAAAC 本發明亦包括一種使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒免疫力之 疫苗，其包括用以產生免疫反應之有效量之經分離FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段，及醫藥上可接受之 載劑。在一較佳實施例中，FCV-Diva衣殼蛋白包含SEQ ID NO : 2之胺基酸序列或其特異免疫原性片段。 本發明包括一種使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒免疫力之方 法，包括將有效量之任何本文所述的組合物投與貓。本發 明包括本文所述之用作疫苗的任何物質或組合物。本發明 亦包括任何本文所述之用於製造疫苗的組合物，該疫苗係 用於治療或預防動物中因貓嵌杯狀病毒感染所引起的疾病 或病症。 12- 98582.doc 200538153 本發明亦包括一種用於使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒免疫 力之方法，其包括將於醫藥上可接受之載劑中之有效量的 選自由下列各物組成之群的疫苗投與貓：FCV-Diva活病毒 株、FCV-Diva減毒活病毒株、FCV-Diva死病毒株、經分離 的FCV-Diva衣殼蛋白及包含編碼FCV-Diva衣殼蛋白或其特 異免疫原性片段之序列之核酸。視需要該方法可包括將該 疫苗與有效劑量之衍生自其它貓病原體之疫苗一起投與， 該等病原體選自由下列各病原體組成之群：貓疱疹病毒、 猫白血病病毒、描免疫缺乏病毒、|苗彼衣菌及|苗痕病毒、 狂犬病病毒及支氣管敗血性博德特拉菌（Bordetella bronchiseptica) 〇 本發明進一步提供一種方法，其包括投用包含SEQ ID NO : 2胺基酸序列之經分離FCV_Diva衣殼蛋白。本發明提 供一種方法，其包括投用編碼FCV-Diva衣殼蛋白之核酸， 其中該核酸包含編碼SEQ ID NO : 2之特異免疫原性片段 的SEQ ID NO : 1或其片段。本發明亦提供一種方法，其 包括投用編碼FCV-Diva衣殼蛋白之核酸，其中該核酸係以 人工操縱方式連接至異種啟動子。視需要該核酸可包含於 質體或重組病毒載體中。 本發明亦包括包含SEQ ID NO : 2或其特異免疫原性片 段之經分離FCV-Diva衣殼蛋白。本發明進一步包括編碼 FC V-Diva衣殼蛋白之核酸，其含有SEQ ID NO : 1核酸序 列。 在另一實施例中本發明包括對FCV-Diva病毒株或衣殼蛋 98582.doc -13 - 200538153 白具有特異性之抗體。該等抗體可為多株或單株。本發明 亦提供含本發明抗體的自含式（self contained)套組。對 Diva病毒株具有特異性之特定揭示的單株抗體於本文中稱 為’’ 1 -4 mAb’f，且產生該抗體之融合瘤已如實例3中所揭示 寄存在 American Type Culture Collection(ATCC)中。 包含對FCV Diva病毒株或衣殼蛋白具有特異性之抗體的 組合物視需要包括可接受之載劑或稀釋劑。 在另一實施例中，本發明亦包括一種測定貓是否已揍種 疫苗或受Diva病毒株感染之方法，包括測定貓是否已產生 對FCV-Diva衣殼蛋白具有特異性之抗體。該方法可包括抗 原捕捉法、抗體捕捉法或ELISA法。在另一實施例中，本 發明包括一種測定特定FCV病毒株是否為Diva病毒株之方 法，其包括測定何種殘基佔據衣殼蛋白之位置455及458， 其中在衣殼蛋白之殘基455存在甲硫胺酸且位置458為絲胺 酸時表示該病毒株為Diva病毒株。在另一實施例中本發明 包括一種測定特定FCV病毒株是否為Diva病毒株之方法， 其包括測定選自由FCV 8-1A及1-4 mAb組成之群之抗體是 否以特異性方式結合至該FCV病毒株，其中特異性結合表 示該病毒株為Diva病毒株。 【實施方式】 本發明包括衍生自F C V- Diva病毒株之|苗後杯狀病毒疫 苗。在某些實施例中，該等疫苗包括改良活疫苗及/或死 疫苗及醫藥上可接受之載劑，該疫苗亦可包括佐劑。本發 明亦涵蓋核酸疫苗。本發明另外涵蓋次單位疫苗。 98582.doc -14- 200538153 為便明晰本揭示内容，且不作為限制，將本發明詳細說 明分成下列子部分，以描述或說明本發明之某些特徵、實 施例或應用。 定義及縮寫 在本文中提供下列定義以增進對本發明的更好理解。 術語nFCV-Divan或’’FCV-Diva病毒株π包括但不限於由 Schorr-Evans 等人Feline Medicine and Surg. 5: 217-226(2003)報導的兩種Diva貓嵌杯狀病毒病毒株。吾人已發 現由Schorr-Evans等人描述之FCV-Diva病毒株在FCV衣殼 蛋白序列之位置455及458包含獨特的胺基酸殘基。衍生自 FCV-Diva病毒株之衣殼蛋白之位置455為甲硫胺酸且位置 458為絲胺酸，而吾人已將其與衍生自其它153 FCV病毒株 之衣殼蛋白比較（出版的及未出版的），於該等位置具有不 同的胺基酸。本文中廣泛地論述測定特定FCV病毒株是否 為Diva病毒株之方法。 術語nFCV-Diva衣殼蛋白’’係指由FCV_Diva病毒株編碼之 衣殼蛋白，例如，由SEQ ID NO : 1編碼之衣殼蛋白。 術語π其特異免疫原性片段’’當與術語FCV-Diva衣殼蛋白 一起使用時意謂FC V_Diva衣殼蛋白之片段，其包括於位置 455及458之獨特殘基，且在免疫反應期間可刺激抗體或致 敏細胞之產生。 術語’’抗體’’係指具有因特異免疫反應而與特異抗原結合 之能力的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白係由輕鏈多肽及重 鏈多肽構成之血清蛋白質且可加以分類，在其中包含對廣 98582.doc -15 - 200538153 泛抗原的抗體活性。 術語’’多株抗體”係指為抗特定病原體或抗原而製造之抗 體之混合群體。通常，該群體包括各種抗體族，每個族針 對病原體或抗原之特定抗原決定部位。為了製造多株抗 體，將整個病原體或經分離的抗原藉由接種或感染引入至 宿主從而誘發宿主產生抗病原體或抗原之抗體。 術語"單株抗體”係指由所有針對特定抗原上之一個抗原 • 決定部位之單株融合瘤細胞產生的抗體。用於製造單株抗 體之抗原可作為病原體之分離蛋白質或整個病原體來提 供。融合瘤係由藉由骨髓瘤細胞與特異抗體形成細胞融合 所形成之雜交細胞組成的純系細胞株。通常，單株抗體源 自小鼠；然而單株抗體亦係指抗抗原之特定抗原決定部位 之抗體的純系群體，其係藉由噬菌體呈現技術或等同於噬 菌體呈現之方法或由非源自小鼠之雜交細胞產生。 術語”對…具有特異性，，當用於描述本發明抗體時，表示 • 本發明抗體之可變區域可識別及僅可結合FCV-Dlva衣殼蛋 白或Diva病毒株（意即可根據結合親和力之可量測差異而 自其它已知蛋白區分FCV_Dlva衣殼蛋白或自其它Fcv病毒 株區分FCV病毒株)。吾人瞭解特異性抗體亦可經由與抗體 • 之可k區域外且尤其是該分子之恆定區域中之序列相互作 用而非特異地與其它蛋白及病毒株（例如，犯从技術中的 _ S. aureus(金黃素葡萄球菌）蛋白A或其它抗體）相互作用。 為測定本發明抗體之結合特異性之筛選法在此項技術中已 熟知且經常實施。關於該等筛選法之廣泛討論參看 98582.doc -16- 200538153 專人（編）’ Antibodies A Laboratory Manual: Cold Spring
Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor，NY(1988)，第 6 章。本發明亦涵蓋可識別及可結合本發明FCV-Diva衣殼蛋 白之片段的抗體’其限制條件為該等抗體對FcV-Diva衣殼 蛋白具有特異性。本發明抗體可使用任何此項技術中熟知 且經常實施之方法製備。識別對FCV Diva病毒株具有特異 性之抗體在實例3中討論。
術語”主動免疫”包括藉由給貓接種本發明疫苗而誘發對 抗貓嵌杯狀病毒之體液免疫及/或由細胞介導之免疫。 術语π被動免疫’’係指因對貓接種包含抗FCγ-Diva之抗體 或免疫原性組份或其組份之片段的疫苗而對貓提供抗貓嵌 杯狀病毒之保護。 抗原之"免疫保護量”或"用以產生免疫反應之有效量，，為 有政誘發接文者免疫原性反應之量，其足以預防或改善因 文鈿欣杯狀病毒感染而引起之疾病（包括不利的健康效應 或其併發症）之體症或症狀。可誘發體液免疫或由細胞介 導之免疫中之任一種或兩種。可評估動物對疫苗組合物之 免疫原反應，例如，在攻毒野生型病毒株之後間接地經由 量測抗體力價、淋巴細胞增殖檢定，或直接經由監視體症 及症狀。由疫苗提供之保護性免疫可藉由量測（例如）臨床 體症(例如死亡率、患病率、溫度數)之減少及患者之總體 身體狀況及總體健康及效能來評估。免疫反應可包括(不 限於）誘發細胞及/或體液免疫。疫苗之治療有效量可視所 用之特定病毒、貓之狀況而改變且可由獸醫判定。 98582.doc -17- 200538153 在本文中使用且在此項技術中所瞭解之，，經分離的”，在 指’’經分離的”核酸或多肽時，意謂自通常在其中發現多肽 或核酸之原始細胞環境中分離。因此，僅舉例而古，如本 文所用之以本發明核酸建構之重組細胞株使用了，，經分離 的’’核酸。 另外，本發明免疫原性及疫苗組合物可包括_或多種醫 藥上可接受之載劑。如本文所使用之”醫藥上可接受之載 劑”包括任何及所有溶劑、分散培養基、塗料、佐=、穩 定劑、稀釋劑、防腐劑、抗菌及抗真菌劑、等渗劑、吸收 延緩劑及其類似試劑。該（等）載劑必須為”可接受的”，咅 謂與本發明組份相容且對欲接種之受檢者無害。通常，該 等載劑為無菌且不含熱原質。 疫苗組合物視需要可包括與疫苗相容之醫藥上可接受之 (意即無菌及無毒）液體、半固體或固體稀釋劑，其用作醫 藥媒劑、賦形劑或培養基。稀釋劑可包括水、鹽水、右旋 糖、乙醇、甘油及其類似物。其中等滲劑可包括氯化鈉、 右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。其中穩定劑包括白蛋 白。任何此項技術中已知之佐劑可用於該疫苗組合物，包 括·基於油之佐劑例如弗氏（Freund，s)完全佐劑及弗氏不 兀全佐劑，基於梅菌酸酯（myc〇late)之佐劑（例如海藻糖二 梅菌酸酯）、細菌脂多糖（LPS)、肽聚醣（意即胞壁質 (murem)、黏肽（mucopeptide)或糖蛋白（例如 N_〇paca、胞 壁醯二肽（MDP)或MDP類似物）、蛋白聚糖（例如萃取自克 田白氏肺炎菌、鏈球菌製劑（例如 98582.doc 8 200538153 OK432)、Biostim™(例如 01K2)、EP 109 942、EP 180 564 及 EP 23 1 039 之 ’’Iscoms”、氫氧化 i呂、皂素（saponin)、 DEAE-葡聚糖、中性油（例如米格利油（miglyol))、植物油 (例如花生油）、脂質體、Pluronic®多元醇。佐劑包括（但 不限於）：RIBI佐劑系統（Ribi Inc·)、明礬、氫氧化鋁凝 膠、膽固醇、水包油乳液、油包水乳液（例如弗氏完全及 不完全佐劑）、嵌段 M(Chiron，Emeryville CA)、AMPHIGEN®佐劑、皂素、 Quil A - QS-21 (Cambridge Biotech Inc. ^ Cambridge MA)-GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals，Inc.，Birmingham， AL)或其它皂素部分、單磷醯基脂質A、阿夫立定 (Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌之忌熱性腸毒素（重 組或其它）、霍亂毒素或胞壁酿二肽。免疫原性組合物可 進一步包括一或多種其它免疫調節劑例如介白素、干擾素 或其它細胞因子。免疫原性組合物亦可包括慶大黴素 (gentamicin)及硫柳汞（Merthiolate)。儘管用於本發明上下 文中之佐劑及添加劑之劑量及濃度可易於由熟練技工判 定，但是本發明涵蓋包含約50 /xg至約2000 /xg佐劑之組合 物，且較佳為約500 gg/2 ml劑量之疫苗組合物。在另一較 佳實施例中，本發明涵蓋包含約1 jitg/ml至約60 ju^g/ ml抗生 素之疫苗組合物，且更佳為小於約30 /xg/ml抗生素。 本發明免疫原性組合物視投藥途徑而定可製成各種形 式。舉例而言，免疫原性組合物可製成適用於注射使用的 無菌水溶液或分散液之形式，或利用冷凍乾燥技術製成凍 98582.doc 19 200538153 乾形式。經凍乾的免疫原性組合物通常可保持在約4°C， 且可在含或不含佐劑的穩定溶液（例如，鹽水或/及HEPES) 中復原成液態狀態。 病毒分離株之生長及FCV-Diva病毒株FCV-33585之衣殻基 因之區域E的序列測定 實例1，FCV-Diva在細胞培養中的生長 FCV 分離株 33585(Diva)得自 Cornell University Diagnostic Lab(Ithaca，New York)。在 96孔板上以極限稀 釋法純化病毒一次，並擴增經純化的病毒及進行冷凍儲 備。所用之細胞為 NLFK(Norden Laboratories Feline Kidney)細胞。生長培養基為 OptiMEM(Life Technologies; Gaithersburg，MD)，其添加有抗生素及3%放射線照射胎 牛血清（Cambrex Bio Science Rockland，Inc ; Rockland， ME)。 實例2，RT-PCR及DNA序列分析 使用 RNeasy套組（QIAGEN Inc· ; Valencia，CA)自 140 ul 病毒上清液分離病毒RNA。大約1 ug病毒RNA用於RT-PCR(Ready-To-GoTM RT-PCR珠子，Amersham Biosciences; Piscataway，NJ)。所使用的條件為：於42°C 30分鐘；於 95°C 7分鐘；接著於94°C 1分鐘、於52°C 1分鐘及於72°C 1 分鐘進行40次循環；接著最後於72°C培育7分鐘，且於4°C 保存。 三組基因特異性引子用於每個RNA樣本。FCV-N1(5’-TTCGGCCTTTTGTGTTCC-3’ SEQ ID N0 : 3)與 FCV-C1 (5、 98582.doc -20- 200538153 TTGAGAATTGAACACATC-3, SEQ ID NO : 4)產生 670 bp之 DNA片段。FCV-N1 與 FCV-C2(5，-TCCTCGCCAATCCCAGTGTA-3’ SEQ ID NO : 5)產生 580 bp 之 DNA 片段。？。¥^2(5’-CATTTCGACTTTAACCAAGA-3f SEQ ID NO : 6)與 FCV-C2 產生478 bp之DNA片段。 視RT-PCR之品質而定，使用不同的方法純化產物。若 有正確大小之單一紋帶，則使用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)。若存在多條紋帶，則使用 Qiaquick Gel Extraction Kit(Qiagen)以純化正破大小之级 帶。 約1-5 ng/ul之經純化DNA用於定序。依據對FCV衣殼蛋 白之高變區之所有公開及已知序列的種系分析，如由 Schorr-Evans 等人所報導，FCV-33585 與 FCV-Diva5 及 FCV-Diva 24極為相關（/· Fe/z’ne Me山’cme and 5 : 217- 226(2003))。圖1中顯示將來自Genbank中的83個已知FCV 衣殼蛋白序列之區域E之胺基酸序列與Diva病毒株？。^
Diva 15、FCV-Diva 24 及 FCV-Diva 33585 比較之 ClustalW 比對。該等用於比較之序列及所來源之Genbank館藏號顯 示於表1中。 表1 FCV病毒株103-1991(Genbank館藏號：AF186244) : SEQIDNO : 7
TLSNTQVPAGDYAIVNEKNNDITTRTGYESATTITNNTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTG FCV 182cvs5A(AF031875) ： SEQ ID NO ： 8
TIFGDQTPAGDYAITNDKDSDITTRSEYEAASEIKNNTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTG 98582.doc -21 - 200538153 FCV病毒株 184cvsllA(AF184952) : SEQIDNO : 9
TISEILTPVGDYAITAGNNSDITTADEYDRANVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株2024 : SEQIDNO : 10
TIPEKLVPAGNYAIANGTGNDITTAKDYDSATVIQNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV213-95(AF283778) ： SEQIDNO ： 11
TIPEKLTPVGDYAITGPSGNDIITAVDYDSAGSIRNDTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株2280(X99445) : SEQ ID NO : 12
TIPEKLTPAGNYAITTGNNSDIATATEYDHADEIKNNTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株254cvs465(AF043227) : SEQIDNO : 13
TIPEKLTPAGDYAITTGNGTDIVTAAQFDAADVIKNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株255(U07130) : SEQIDNO : 14
TIPEKLVPAGHYAIANGTGNDITTAKDYDSATVIQNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV 病毒株255 PI 持續感染純系(FCU83970) : SEQIDNO : 15
TIPEKLVPAGNYAIDNGTGNDITTAKDYDSATVIQNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株255(P5持續感染純系)(FCU83974) : SEQIDNO : 16
TIPEELVPAGDYAIANGTGNDITTAKDYDSATVIQNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株255(P(持續感染純系)(FCU83975) ·· SEQIDNO ·· 17
TIPEKLVPAGDYAIANGTGNDITTAKDYDSATVIQNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株255(P7持續感染純系)(FCU83976) : SEQIDNO : 18
TIPEKLVPAGNYAIANGTGNDITTAKDYDSGTVIQNNTNFKGMY1CGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株255(P8持續感染純系)(FCU83977) : SEQIDNO ·· 19
TISEELIPAGDYAITKRHRVTTSPHPAGYDAADVIKNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISKTA FCV病毒株255(P9持續感染純系)(FCU83978) : SEQIDNO : 20
TIPEELVPVGDYAIANETGNDIATAKDYDSATVIQNNTNFKGMYFCGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株258cvs484(AF038383) : SEQIDNO : 21
TIPDELVPAGDYAITSGNMNDITTPADYDAADVIKNNTNFRSMYICGSLQRAWGDKKISNTG FCV病毒株259cvs48A(AF184953) : SEQIDNO : 22
TIAEELIPAGDYAITDGRGNDIDTAVGYDTAQVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA 98582.doc -22- 200538153 FCV病毒株28043.87(U06645) : SEQIDNO : 23
TIPEDLIPAGDYAITKGNGTDITTSADYDSADVIKNDTNFKSMYICGALERAWGDKKISNTA FCV病毒株431 衣殼(AX078768) ·· SEQIDNO : 24
TIPEKLTPAGDYAITNGGNNDITTAADYDGASIIKNNTNFKGMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株63-1991(AX186246) : SEQIDNO : 25
TIPEKLTPAGDYAITSSDGNDITSALGYDSADVIKNGTNFRSMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株82857_91(U06648) : SEQIDNO : 26
TIPEDLIPVGDYAITKGNGTDITTSADYDSADVIKNDTNFKSMYICGPLQRAWGDKKISNPA FCV病毒株89243-91(U06651) : SEQIDNO ·· 27
TIPEDLIPAGDYAITKGNGTDITTSADYDSADVIKNDTNFKSMYICGAFQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91_1(AB029581) : SEQIDNO : 28
TISETLIPAGDYAITDAIGNDIKTASGYDAAGIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDTKISNTA FCV病毒株91-10(AB029588) : SEQIDNO : 29
TIPGELIPAGDYAITNGTGNDITTATGYDTADIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-11(AB029589) : SEQIDNO : 30
TIPEELTPAGDYAIVTTIGNDITTAAAYDAADVIVNNTKFKGMYICGSLQRAWGDKRISNTA FCV病毒株91-12(AB029590) : SEQIDNO : 31
TIPETLTPAGDYSITTADGNDITTATQYDAASVIKNTTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISATA FCV病毒株91-13(AB029591) : SEQIDNO : 32
TISEELTPAGDYAITTGSGNDITTATGYDSADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91_14(AB029592) ·· SEQIDNO : 33
TIPEELTPAGNYAITDGSGNDITTASGFDKADVIKNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-16(AB029593) : SEQIDNO : 34
TIDDKLTPAGDYAITTGAGNDITTAAAYDSADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-17(AB029594) : SEQIDNO : 35
TIDDKLTPAGDYAITTGAGNDITTAAVYDSADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-18(AB029595) : SEQIDNO : 36
TINDKLTPAGDYAITTGNGNDIATAAMYDSADVIQNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA 98582.doc -23 - 200538153 FCV病毒株91_19(AB029596) ·· SEQIDNO : 37
TIPENLTPAGDYSITNQINNDITTSAEYDAATIIHNNTNFKSMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-2(AB029582) : SEQIDNO : 38
TIAEELVPAGDYAITKGNGNDITTATDYDTADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-20(AB029597) ·· SEQIDNO : 39
TEPEDLIPAGDYAITNGTNNDIKTAAQYDSADVIINNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-22(AB029598) : SEQIDNO : 40
TIPGTLTPAGDYAIVDHTSNDIATAAKYDAAFKITNNTNFKGMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-25(AB029599) : SEQIDNO : 41
TIPETITPAGLYAIIDQTNSDIITAAGYDAATTITNNTNFKSMFICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-26(AB029600) : SEQIDNO : 42
TIPERLTPAGNYSITTDNGTDIVTADLYDAADVIKNTTNFRGMYICGSLQRAWGDKKIEIKTA FCV病毒株91-27(AB029601) : SEQIDNO : 43
TIAEELTPAGDYAITNSTGIDITTPTAYDSADVIRNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-3(AB029583) : SEQIDNO : 44
TIAESLIPAGDYAITTGSGNDIITAAEYDAADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISDAA FCV病毒株91-31(AB029602) : SEQIDNO : 45
TIAEELTPAGDYSITTRDGNDIKTAADYDAADVIKNTTNFRGMYICGSIJQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-33(AB029603) : SEQIDNO : 46
TITEELTPAGDYSITTSKGNDIVTSRDYDSADEIKNATNFRGMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91_34(AB029604) : SEQIDNO : 47
TEPGELTPAGDYAITDGGNNDITTAKGYDSANIIKNNTNFRGMYICGSLQRAW3DKKISNTA FCV病毒株91·35(ΑΒ029605) : SEQ ID NO ·· 48
TIPDKLIPAGDYAIVNQTNQYITGPKEYDSAIKITNNTNFKSMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-36(AB029606) : SEQIDNO : 49
TIPEELIPAGDYAITNETDNDIATRAAYESAIEIRNNTNFKSMYICGALHRAWGDKKISNTA 98582.doc -24- 200538153 FCV病毒株91_37(AB029607) : SEQIDNO ·· 50
TIPDDLVPVGNYSITDQRNNDIQTKEQYDAATAIKNTTSFRGMYICGALQRAWGDKKISNTG FCV病毒株91-38(A8029608) : SEQIDNO ·· 51
TIPDDLVPVGNYSITDQRNNNDIQTKEQYDAATAIKNTTSFRGMYICGALQRAWQDKKISNTG FCV病毒株91_40(AB029609) : SEQIDNO ·· 52
TIPGDLIPAGDYAIVNQLNNDITSAEGYDSAIEIRNNTNFKGMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-41(ΑΒ029610·1) : SEQIDNO ·· 53
TIPGRLIPAGNYAITNEADNDITTPSAYDAAVAIKNNTNFRGMYICGALQRAWGDKQISATA FCV病毒株91-5(AB029584) : SEQIDNO : 54
TIPEVITPVGDYAIVNQNNDDITTAAGYDAALSITNNTNFKSMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-6(AB029585) : SEQIDNO : 55
TIPEVITPVGDYAIVNQNQDDITTAAEYDAALSITNNTNFKSMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91_7(AB029586) : SEQIDNO : 56
TIPETITPTGDYTIVDQNQSDIVTAAGYDAAHSITNNTNFKSMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株91-9(AB029587) : SEQIDNO : 57
TIPGELIPAGNYAITNGAGNDITTATGYDTADIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株A4(AF109468) : SEQIDNO ·· 58
TISEELTPAGDYAITTGNGCDITTASVYDSANVIKNNTNPRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株C01(AF260320) : SEQIDNO : 59
TIAEELIPAGDYAITDGSNNDIITANGYDAADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株C28(Af260319) : SEQIDNO : 60
TIDGELTPAGDYAITTGAGSDIASAAEYDSADVIRNNTNFRGMYICGALQRAWGDKKISATA FCV病毒株C46(AF259956) : SEQIDNO : 61
TIPDBLTPAGDYAITDQRGNDITTANGYDAASEIMNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株C58(AF259394) : SEQIDNO : 62
TIGSELTPAGDYSITTGDGNDIETAAVYDAANVIRNTTNFRGMYICGSLQRAWGDKKVSNTA FCV病毒株CFI-68(FCU13992) : SEQ ID NO : 63
TIPGELVPVGDYAITNGTNNDITTAAQYDAATEIRNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA 98582.doc -25- 200538153 FCV病毒株Fl-76-77(AF184951) : SEQIDNO ·· 64
TIPGKLTPAGDYAITTANGNDIITAAGYDAADIIVNNTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株F4(P27405) : SEQIDNO : 65
TIADKLIPAGDYSITTGEGNDIKTAQAYDTAAVVKNTTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株F65(AF109465) : SEQIDNO : 66
TIPSKLVPAGGYAITAKNGNDITTAAQYDAAGEIVNNTNFKSMYICGALQRAWGDKKVSNTA FCV病毒株F9(Z11536) : SEQIDNO : 67
TIPGELIPAGDYAITNGTGNDITTATGYDTADIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株fcv255(U06646) ·· SEQIDNO ·· 68
TIPEKLVPAGHYAIANGTGNDITTGKDYDSATVIQNNTNPKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株fcvLLK(U06649) : SEQIDNO : 69
TIPEELTPAGDYAITDSTGGDITTAAKYDITDKVTNNTNFKSMYICGCLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株fpl-Bolin(U06652) : SEQIDNO : 70
TIAEKLTPTGNYSITTNSGTDIVTPSAYDTADVIRNTTEFRGMYICGALQRAWGDKKISATA FCV病毒株fpl-nci(U06653) : SEQIDNO : 71
TIPEELTPEGDYAITNRSGNDIATAEGFGSADIIKNNTNPKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株fri-nci(U06647) : SEQIDNO : 72
TIAEKLTPTGNYSITTNSGTDIVTPSGYDTADVIRNTTEFRGMYICGALQRAWGDKKISATA FCV病毒株FS(U06650) : SEQIDNO : 73
TISEELTPAGDYAITTRIGNDITTAEAYDSADVIKNNTNFRGMYICGSLRRAWGDKKISNTA FCV病毒株FT(E12464) : SEQIDNO : 74
TIADKLIPAGDYSITTGEGNDIKTAQAYDTAAVVKNTTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株G1(AX078766) : SEQIDNO : 75
TIGEELTPAGDYSITNGSGNDIATANAYDSADVITNTTNFRGMYICGALQRAWGDKKISSTA FCV病毒株JOK63(AF109466) : SEQ ID NO : 76
TIPEELTPAGDYSITNNANNDIATAADYDSTGVIKNTTNFRGMYTCGSLQRAWGDKKISSTA 98582.doc -26- 200538153 FCV病毒株KCD(L09719) ·· SEQIDNO : 77
TISEELIPAGDYAITNDIGNDITTPAGYDAADTIKNNTNFRGMYVCGSLQRAWGDKKISNTA FCV 病毒株 KSI09(X99446) ·· SEQIDNO ·· 78
TIPEDLVPAGDYAITNGKGNDITTATGYDTADIIRNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株KS20(X99447) : SEQIDNO : 79
TIPEVLTPAGNYSITTGSGNDIVTAKDYDGADVIKNTTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株KS40(X99448) ·· SEQIDNO : 80
TISERLVPAGDYAITNRVGNDITTAEGYDAADKIKNATNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株KS8(X99449) : SEQIDNO : 81
TIPEELIPAGNYAITNSTGADITTRAEYESADEIKNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株LS012(AF109467) : SEQIDNO : 82
TIPEDLVPVGNYAITTGSGNDITTASEYDSADVVRNNTNFRGMYICGALQRAWGDKQISSTA FCV病毒株LS015(AF109464) : SEQIDNO : 83
TIPSELTPAGNYAITSGSGNDIETAAEYDSADVIRNNTNFRSMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株NADC(L09718) : SEQIDNO : 84
TIAEDLTPAGDYAITSGNGNDITTGSEYDSTEVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株U1(AF357012) : SEQIDNO : 85
TIPEQLTPAGIYSITASNGTDITTAAGYDAAETIVNTTNFKSMYICGSLQRAWDDKKISNTA FCV病毒株U2(AY053460) : SEQIDNO : 86
TIGEKLVPAGDYAITNSSGNDITTASQYDTADIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV未知-1(AR198747) : SEQ ID NO : 87
TIPEQLTPAGIYSITASNGTDITTAAGYDAAETIVNTTNFKSMYICGSLQRAWDDKKISNTA FCV未知-2衣殼(AF486286) ·· SEQ ID NO : 88
TIATELIPAGDYAITTSNGNDIVTAAGYDAASEIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV未知-2(AR198746) : SEQ ID NO : 89
TIPEQLTPAGIYSITASNGTDITTAAGYDAAETIVNTTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV未知-3(AR198745) : SEQ ID NO : 90
TIPEQLTPAGIYSITASNGTVITTAAGYDAAETIVNTTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTA 98582.doc -27- 200538153 FCV病毒株Urbana(L40021) : SEQIDNO : 91
TIGEKLVPAGDYAITNGSGNDITTANQYDAADIIRNNTNFKGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V16(AF031869) : SEQIDNO : 92
TIAERLTPGGDYAITSGNNNDITTAADYDAADIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTG FCV病毒株V179(AF031870) ·· SEQIDNO : 93
TISEVLTPAGGYAITTGDNNDITTAAEYDAASVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISSTG FCV病毒株V20(AF031872) : SEQIDNO : 94
TIPEKLTPAGKYAITTGNGNDITTAQGFDSADVIKNDTNFRGMYICGSLQRAWGDKDISNTA FCV病毒株V25(AF038382) : SEQIDNO : 95
φ TIPKKLTPAGDYAITSGDGNDITTAQQYDAADVIKNNTNFKGMYVCGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V274(AF031877) : SEQIDNO : 96
TIPEKLIPAGDYAITNNGGNDITTAAAYDAADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V276(AF032106) : SEQ ID NO : 97
TISEKLIPAGDYAITNNRGNDITTAAAYDAADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V280891(AF186247) : SEQIDNO : 98
TISEELIPAGDYAISNSSGNDITTPSAYDTASVINNTTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V290892(AF184594) : SEQIDNO : 99
TIPNELIPAGDYAIVNESNNDIITKSGYESATKITNNTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTA φ FCV病毒株V3(AF038381) : SEQ ID NO : 100
TISEELIPTGDYAITNGTGNDISTSSEYDAAEVIRNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V310792(AF186245) : SEQIDNO : 101
TIPSELTPAGDYAIVNETNNDIVTRAGYESASKITNNTNFKSMYICGSLQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V61(AF031871) : SEQ ID NO : 102
- TISEVLTPAGDYAITTGDNNDITTAAEYDAASVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISSTA • FCV病毒株V66-97(FCA9721) : SEQ ID NO : 103
TIPSKLTPAGDYAITRGDGNDITTAAEYDAANTIENNTNFRSMYICGALQRAWGDKKISNTA FCV病毒株V77(AF038126) : SEQIDNO : 104
TIPEELTPAGKYAITTSIGNDIITAAAYDAADVIKNDTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA 98582.doc -28- 200538153 FCV病毒株V83(AF031876) : SEQIDNO : 105
TISEKLTPAGDYAITTSNGNDITTAKAYDTADVIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTA 示於圖 1 中之FCV_Diva病毒株（FCV-Dival 5、FCV-Diva 24及？(3¥-0卜& 33585)顯示在比較用之截短型序列之位置 32及35上具有獨特的胺基酸殘基，該等殘基對應於全長 FCV衣殼蛋白序列之位置455及458。吾人已定出編碼FCV-Diva 33585之衣殼蛋白之核酸分子的完整序列 ，且報導了 如SEQ ID NO : 1之核酸序列及如SEQ ID NO : 2之經編碼 多肽序列。 識別FCV-Diva病毒株 識別FCV-Diva病毒株可藉由測定何種殘基佔據衣殼蛋白 之位置455及458來完成。此可於蛋白質或核酸層次進行。 咸應瞭解，作為RNA病毒，可直接分析嵌杯狀病毒 RNA，但是藉由逆轉錄作用產生RNA之DNA複製則更為便 利。DNA比RNA更穩定，且用於測定DNA序列信息之方法 在技術上較簡單。使用DNA靶、引子及探針來執行雜交方 法亦更容易。 製備用於測定是否特定嵌杯狀病毒分離株為Diva病毒株 之較佳方法為逆轉錄酶-聚合酶鏈反應（reverse transcriptase-polymerase chain reaction ; RT-PCR)。通常， 貓嵌杯狀病毒RNA係使用此項技術中熟知之方法萃取自生 物樣本，該等方法例如Qiagen QIAmp Viral RNA套組 (Qiagen，Valencia，CA)。RT-PCR反應係藉由任何一種此 項技術中熟知之方法進行，例如BRL One-Step RT-PCR套 98582.doc -29- 200538153 組（Life Technologies，Bethesda，Md·)。如美國專利 6,355,246中所描述，RT-PCR引子對是位於來自編碼衣殼 蛋白之病毒基因體之區域内目標序列的側邊。例如美國專 利6,35 5,246及6,3 5 5,246描述適用於衣殼基因擴增之引子序 列。較佳為實例2中所述之引子。經PCR擴增產物在包含 溴化乙錠之瓊脂糖凝膠上進行解析，並於UV光下觀察。 1. 核苷酸序列分析 如以上實例中所述編碼FCV衣殼蛋白之E區域之核苷酸 序列的分析可使用雙脫氧鏈終止方法或Maxam Gilbert方法 (參看 Sambrook 等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manua卜第 2版，CSHP，New York(1989) ; Zyskind等人， Recombinant DNA Laboratory Manual; Acad. Press, (1988)) 來完成。儘管以上進行之序列測定係以手動方式完成，但 是應瞭解過去幾年中DNA定序領域已有顯著的進步，且本 發明涵蓋該等進步。最值得注意的是，在過去的十年中已 逐漸增加對自動化DNA序列分析之依賴度。 2. Diva病毒株特異性探針 等位基因特異性探針之設計及使用由例如Saiki等人 (Nature 324，163-166(1986)) ; Dattagupta在 EP 235,726 中； Saiki在WO 89/11548中描述。等位基因特異性探針可設計 成雜交至FCV-Diva病毒株之目標核酸區段，但其不雜交至 其它已知FCV病毒株之相應區段，此是因為在FCV-Diva病 毒株中發現存在獨特序列。雜交條件應足夠嚴格，因為在 FCV-Diva病毒株與其它已知病毒株之間之雜交強度存在顯 98582.doc -30- 200538153 著不同。將某些探針設計為雜交至目標核酸之區段，使得 相關位點對準探針之中心位置（例如於7位置處之15讯灯 於8或9位置處之16咖）。探針之該設計有益於辨別在不同 等位基因形式之間的雜交。 忒等採針之特徵為其較佳地包含8及5〇個核苷酸，且其 對雜父至其之包含FCV-Diva衣殼之E區域之序列充分互 補。本發明探針中G+c含量通常在1〇與75%之間之範圍，
較佳在35與6〇%之間，且更佳在4()與55%之間。該等探針 ^長度可在10、15、2G或跑至^⑼個核㈣之範圍内 支化，較佳為10至50個，更佳為18至35個。特佳之 度心個料酸。較佳地，⑽等位基因為在探針中心之、 、、祆苷酉文中。在尤佳之探針中，Diva標記位於探針之中 =。較短的探針可能對目標核酸序列缺乏特異性，且通常 而要較々的溫度以與模板形成足夠穩定的雜交複合物。製 =較長的徐針係昂貴的，且有時自身會雜交而形成髮夾狀 結構。用於合成募核㈣探針之方法為吾人熟知，且可應 用於本發明探針。 物11明板針常常係經標記或固定於固體支撐體上。標記 ^ 、-支撐體在此項技術中已為吾人所熟知。通常偵測 4木針為核g参^ U或不V電荷的核酸類似物，例如揭示於國 際專利申*主安^ * %案W〇 92/20702中之肽核酸及描述於美國專利 第 5,1 85,444、《 可处、 ，034,506及5，142,〇47號中之嗎啉類似物。 /、頁使铋針具有，，非延伸性’’，因為不能將額外的dNTP 加至該接私 。在其自身中及就其自身而言，類似物通常 98582.doc -31 - 200538153 為非延伸的，且核酸探針可藉由修飾探針之3,末端而具有 非延伸性’以使付#基不再具有延長之能力。例如，探針 之3末端可使用捕獲或偵測標記而進行功能化，進而消耗 或另外阻斷羥基。或者可僅僅將3,羥基斷裂、置換或修 飾。 本發明之探針適用於許多目的。其可用於對dna之南氏 (Southern)雜交或對RNA之北氏（Northern)雜交。該等探針 亦可用於偵測PCR擴增產物。藉由分析等位基因特異性探 針之雜交，可在所提供的樣本中偵測雙等位基因標記等位 基因之存在或缺失。 排列格式中咼通量（high-throughput)平行雜交特定地包 含於"雜交法”中且於下文描述。 通常成對地使用Diva特異性探針，一對中的一個成員顯 示完全匹配於Diva病毒株，而另一成員顯示完全匹配於另 一 FCV病毒株。接著可將若干對探針固定於相同載體上， 以用於同時分析目標序列之多種變體。 3· FCV-Diva特異性引子 FCV-Diva特異性引子雜交至重疊Diva特異性等位基因之 目標核酸上之位點，且僅引起引子對其顯示完全互補之等 位基因形式的擴增（參看Gibbs, Nucleic Acid Res 17 2427 2448，1989)。該引子與在末端位點雜交之第 一 ^ I千一起使 用。由兩個引子產生之擴增導致出現表示特異性等位美因 之可偵測產物。通常使用第二對引子進行對照，其中之 者在Diva特異性位點顯示為單鹼基錯配， 叨力一個顯示與 98582.doc -32- 200538153 末端位點完全互補。單驗基錯配阻止擴增且無可彳貞測產物 形成。當錯配包含於對準所述位點之寡核苷酸之最3’位置 時該方法效果最好，因為該位置最不穩定以自引子延長 (參看例如WO 93/22456)。本發明因所選擇的條件而當然 涵蓋該等具有末端錯配之引子，及形成不穩定鹼基成對且 因此無能力引起配對之引子。 4. 變性梯度凝膠電泳法 使用聚合酶鏈反應產生之擴增產物可藉由使用變性梯度 凝膠電泳法來分析。不同的等位基因可基於不同序列依賴 性熔融特性及溶液中DNA之電泳遷移加以識別。參看 Erlich編，PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification (W.H. Freeman 及 Co，New York， 1992)，第 7章。 5. 單股構象分析法 目標序列之等位基因可使用單股構象分析法區分，其藉 由改變單股PCR產物之電泳遷移來識別鹼基差異，如Orita 等人，Proc· Nat. Acad. Sci. 86，2766-2770(1989)中所述。 可如上所述產生經擴增的PCR產物，且加熱或經其它變性 以形成單股擴增產物。單股核酸可再折疊或形成部分地依 賴於鹼基序列之二級結構。單股擴增產物之不同的電泳遷 移率可與目標序列之等位基因之間的鹼基序列差異相關。 以上方法具有其它變型，包括濾紙上之FCV-Diva特異性 雜交、等位基因特異性PCR、PCR加上限制酶消化（RFLP-PCR)、變性毛細管電泳法、引子延伸及飛行時間式質譜法 98582.doc -33- 200538153 (time-of-flight mass spectrometry)及 5丨核酸酶（TAQMAN ΤΜ) 法。 尤其適用於實施本發明之方法為基於pCR之TAQMAN技 術（Heid等人，Genome Res. 6: 986-994(1996))。TAQMAN 為 Roche Molecular Systems，Inc.(Alameda，CA)之註冊商 標。用於實行基於TAQMAN之反應及偵測反應產物之方法
Elmer(Foster City，CA)。TAQMAN方法係基於使用在 51末 端經能量供體氟及在3’末端經能量抑止劑標記之寡核苷酸 探針執行RT-PCR。該探針與通常為100個核苷酸或更少核 苷酸之目標序列中之序列自上游引子或下游引子互補。在 RT-PCR反應期間，若樣本包含FCV-Diva病毒株，則該探 針藉由DNA聚合酶之5’核酸外切酶活性而降解，因抑止劑 之作用釋放氟，進而允許偵測其螢光。PCR反應中雙標記 之寡核苷酸探針的使用揭示於美國專利第5,716,784號至 DiCesare中，其以引用的方式併入本文中。 在替代性基於均質雜交之程序中，分子信標用於辨別 FCV-Diva特異性等位基因。分子信標為髮夾狀募核苷酸探 針，其報導均質溶液中特異性核酸的存在。當分子信標結 合至其目標時，其經歷恢復經内部中止之螢光團之螢光的 構象重 h (Tyagi 專又，Nature Biotechnology，16: 49-53 1 1998) 〇 用於FCV基因定型分析之較佳技術應允許大規模、自動 化分析。後者之實例為經受微量滴定板中之格式化的 98582.doc -34- 200538153 DASH(Dynamic Allele-Specific hybridization(動態等位基 因特異性雜交））(Hybaid)，及’’單一嚴格度（single-stringency)’’E)NA晶片雜交（Affymetrix)。當然應認識到此 列表係不内含的。 排列格式中高通量（high-throughput)平行雜交特定地涵 蓋於本發明中且於下文描述。
基於寡核苷酸排列之雜交法係依短寡核苷酸至經完全匹 配及錯配之目標序列變異體之雜交穩定性的差異而定。經 由包含附著於固體載體（晶片）之選定位置之寡核苷酸探針 之高密度排列的基本結構獲得對FCV序列信息之有效通 道。每個DNA晶片可含有數千至數百萬以類網格狀排列且 微型化至一角銀幣大小之個別合成的DNA探針。 晶片技術已成功地應用於許多情況。例如，已於BRC A I基因、釀酒酵母（S. cerev/hae)突變病毒株及HIV-Ι病毒之 蛋白酶基因中進行突變基因之篩選（Hacia等人， Genetics，14(4): 441-447，1996 ; Shoemaker 等人， Genei/cs，14(4): 450-456，1996 ; Kozal 等人，
Md/c/ne，2: 753-759，1996)。用於偵測特定序列之各種格 式之晶片可藉由 Affymetrix(GeneChipTM)、Hyseq(HyChip 及 HyGnostics)及 Protogene Laboratories在習知之基礎上產 生。 通常，該等方法採用與目標核酸序列區段互補之募核苷 酸探針之排列。EP785280描述用於偵測各種序列之拼貼 (tiling)策略。簡言之，通常可將排列”拼貼”以用於大量的 98582.doc -35- 200538153 斜:、列。”拼貼”通常意謂合成-組特定的寡核苦酸探 體μ與相關目標序列互補之序列及該序列之預選變異 則，列如由—或多個基本組單體之成員（意即核苦酸） 二、—或夕個所給定位置。拼貼策略進一步描述於PCT申 «月案弟WO 95/1 1995號中。在一特定態樣中，將陣列拼貼 以用於許多特異性、經識別的標記序列。詳言之將陣列拼 貼，以包括許多偵測塊，每個偵測塊係對一特定序列呈特 φ 例如可將偵測塊拼貼，以包括許多探針，其跨越 包括相關區域之序列區段。在完成與目標序列之雜交及排 列之洗蘇後，掃描該排列以測定目標序列雜交至排列上的 位置。接著分析自掃描排列之雜交資料以識別哪個等位基 因或哪些等位基因存在於樣本中。雜交及掃描可如PCT申 請案第WO 92/10092及WO 95/1 1995號及美國專利第 5,424，186號中所描述進行。 因此，在某些實施例中，晶片可包含片斷長度為約15個 φ 核苷酸之核酸序列之排列。在另外的實施例中，晶片可包 含包括至少一種以下序列之排列，該等序列包含冗卩ID NO· 1之6-800個之間的鄰接核苦酸，及與其互補之序列， 或其至少約8個連績核普酸之片斷，較佳為1 〇、15、2 〇 個，更佳為2_5、30、40、47或50個連續核苷酸，包括至少 一個Diva特異性位點。在某些實施例中，晶片可包括至少 2、3、4、5、6、7、8或更多本發明之該等核酸之排列。 其它測定FCV病毒株係否為Diva病毒株之方法可由熟習 此項技術者設想且包括基於抗體之摘測方法的方法。該等 98582.doc -36- 200538153 包括ELISA之方法於下文與"Determining Whether an Animal has been Vaccinated with a Diva Strain(測定動物是 否已接種Diva病毒株）’’相關之部分中論述。應承認一旦獲 得合適的抗血清，則其描述之方法可容易地適合於Diva病 毒株。對Diva病毒株呈特異性之抗體的識別論述於下列實 例中。 實例3 篩選Diva病毒株特異性之單株抗體 單株抗體可自商業來源獲得或内部生成。兩種分析法用 於篩選其相對於FCV-33585及F9之特異性。對於免疫螢光 分析法（IFA)，FCV-33 585儲備料用於感染含有約90%融合 率（confluency)之NLFK細胞的24孔板。在感染後約20小 時，用lx PBS將培養板沖洗兩次，且用80%丙酮固定。將 單株抗體稀釋至約2 ug/ul且添加至培養板中（0.2毫升/ 孔）。於室溫下培育1小時（搖動）後，將每個孔用lx PBS洗 滌兩次。二級抗體（抗小鼠FTTC，10 ug/ml)。於室溫下搖 動30分鐘之後，用箔片覆蓋培養板，將每個孔用lx PBS 洗滌兩次且空氣乾燥。接著於顯微鏡下觀察每個孔的 FTTC染色強度。 98582.doc -37- 200538153 表2·以各種單株抗體之FCV-33585及F9之免疫螢光法 來源 目錄/ID No. IFA F9 33585 Accurate Chemical YVS7401 - - Accurate Chemical YVS7402 - - Accurate Chemical MEDCLA309 +++ - Chemicon MAB8962 - _ Cortex Biochem CR1260M - Custom Monoclonal, Int. Sl-9 - 土 Custom Monoclonal， Int. FCV 1-43 + - Custom Monoclonal， Int. FCV8-1A 土 ++ Novocastra Lab NCL-1G9 +++ - In-house(Pfizer) 1-4 mAb 土 ++++ In-house(Pfizer) 1-12 mAb ++++ ++++ In-house(Pfizer) 3-3 mAb ++++ ++++ In-house(Pfizer) 3-5 mAb +++ ++++ In-house(Ffizer) 兔血清 ++++ +++++
以上結果表明單株抗體1-4 mAb(Pfizer)及FCV 8-1 A(Custom Monoclonals，Int·，.813 Harbor Blvd. #284, West Sacramento，CA 95091)特異性地識別存在於FCV-33585 上而非 F9上之抗 原決定 部位， 如使用 該等兩 種抗體 以F9所見之極少染色。 FCV_33585及F9之純化 分別將受FCV-33585或F9感染之NLFK細胞中之200 ml細 98582.doc -38- 200538153 胞培養上清液於10°C以3,000 rpm離心30分鐘。將25 ml上 清液轉移入Beckman Ultraclear離心管中，且將1〇 ml 1〇% 蔬糖溶液鋪於試管底部。接著將試管於1 5 °C以27，000 rpm 離心2小時。離心之後移除上清液，且將離心塊再懸浮於 250 ul無菌水中。使用Micro BCA蛋白質分析套組（pierce Chemical Co··; Rockford，IL)測定蛋白質濃度。 ELISA分析法 對於ELISA分析法，將96孔ELISA培養板上塗布1〇〇 ul濃 度為5 ug/ml(在PBS緩衝液中，pH 7.4)之純化FCV-33585或 F9病毒。將培養板於37°C在非潮濕的培養箱箱中培養（未 覆蓋）隔夜。第二天，用〇·1 ml甲醇將培養板上之病毒固 定，接著於室溫培育5分鐘。接著將培養板用蒸餾水洗滌 六次。接著藉由添加200 ul 10% lx PBS中之馬血清來阻 斷，且於4°C培養隔夜。將培養板再用蒸餾水洗滌六次。 將單株抗體以1 ug/ml之濃度添加至每個孔（100 ul/孔）（表 3)，或在 PBST(含有 0.5% Tween-20 之 lx PBS)中稀釋 1 : 100、1 : 400及1 : 2000(表4)。將每個抗體以一式三份測 試。於37°C培育1小時後，將孔用PBST洗滌6次。添加100 ul 1:2000稀釋之結合過氧化酶的AffiniPure山羊抗小鼠 IgG(H+L ； Jackson ImmunoResearch ；目錄號 715-035-150)，且將培養板於37°C培養1小時。接著將培養板用 PBST洗滌六次，且將100 ul ABTS過氧化酶基質（KPL ; Gaithersburg，Maryland ;目錄號 50-66-18)添加至每個 孔。於室溫培育10分鐘後，使用ELISA培養板讀數器將 98582.doc -39- 200538153 培養板於405-490 nm(雙波長）讀數。基於訊/雜比計算比活 度。 表3.單株抗體抗[(：¥-33585及^9病毒反應之£118入結果
來源 _ 目錄/ID No· 比活度 F9 33585 Accurate Chemical YVS7401 2.5 1.4 Accurate Chemical YVS7402 1 0 Accurate Chemical MEDCLA309 60 0.1 Chemicon MAB8962 1 8.6 Cortex Biochem CR1260M 1.5 7.1 Custom Monoclonals, Int. Sl-9 0 5.7 Custom Monoclonals, Int. FCV 1-43 1 4.3 Custom Monoclonals， Int· FCV8-1A 5 20 Maine Biotech MAB790P 1 5.7 Maine Biotech MAB791P 1.5 1 Novocastra Lab NCL-1G9 20 0 In-house(Pfizer) 1-4 mAb ‘ 4 14.3 In-house(Pfizer) 1-12 mAb 80 8.6 In-house(Pfizer) 3-3 mAb 115 101.4 In-house(Pfizer) 3-5 mAb ； 80 102.9 In-house(Pfizer) 兔血清 185 145.7 98582.doc -40- 200538153 表4·單株抗體抗FCV-33585及F9病毒反應之ELISA結果 來源 目錄/ID No· F9 1 : 100 1 : 400 1 比活度 33585 :2000 1 : 100 1 : 400 1 :2000 Accurate Chemical MEDCLA309 13 13 12 0.8 0.8 0.9 Chemicon MAB8962 1 1 ND 5 5 ND Custom Monoclonal SI-9 1 1 ND 3 4 ND Custom Monoclonal FCV 1-43 1 1 ND 2 1 ND Custom Monoclonal FCV8-1A 3 3.5 2 17 16 7 Novocastra Lab - NCL-1G9 15 22 16 0.8 0.8 0.8 In-house(Pfizer) 1-4 mAb 1 1 1 7 10 8 In-house(Pfizer) 1-12 mAb 10 15 20 6 8.5 4 In-house(Pfizer) 3-3 mAb 11 16.5 25 20 28 38 In-house(Pfizer) 3-5 mAb 10.5 13 17 17 26 31 In-house(Pfizer) 兔血清 6.5 8 4 5 7 6 緩衝液 1 1 1 1 1 1 如IFA中所見，該等結果（表3及4)表明單株抗體1 -4 mAb(P:fizer)及 FCV8-lA(Custom Monoclonals，Int.)特異性 地識別存在_於FCV-33585而非F9上之抗原決定部位。因 此，通常所用的疫苗病毒株FCV-33585及F9具有免疫學上 不同的抗原決定部位。因此在此描述之抗體可用於將Diva 病毒株自其它FCV病毒株（例如F9)中區別開來。產生吾人 命名為”1-4 mAb"之抗體之融合瘤已寄存在American Type Culture Collection，10801 University Blvd，Manassass，VA， 98582.doc -41 - 200538153 201 10-2209 中且提供 ATCC 館藏號ΡΤΑ-63 12。 本發明之疫苗 實例4 FCV_Diva 33585作為免疫原之用途 將測試動物組以FC V-Diva 3 35 85攻毒且在感染之後測試 自測試動物冬血清樣本以觀察該血清是否可中和十種FCV 病毒株（F9、33585、J-1、2280、255NVSL、100869-1、 89391、88287、Η及94580)之一組分離株。令吾人吃驚地 的是，多數分析之樣本中存在顯著的病毒中和力價，證明 攻毒病毒株33585可能為良好的疫苗病毒株。結果概述於 表5中。 表5.經FCV-Diva 33585攻毒後之中和力價 F-9 33585 J-1 2280 255NVSL 100869-1 89391 88287 Η 94580 2896 >2895 256 <12 64 181 23 45 16 64 >5792 >2895 181 <12 >2895 2048 45 32 362 1448 >5792 >2895 >2895 45 >2895 128 45 45 128 724 該等結果表明FCV Diva分離株適用於研製用於使貓產生 對抗由異種貓嵌杯狀病毒病毒株引起之疾病之免疫力的有 效疫苗。因此，本發明提供基於活的或死的FCV-Diva病毒 株之疫苗、編碼FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段 及經分離之衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之核酸疫苗。 通常期望本發明之疫苗用於使貓免疫以對抗由貓嵌杯狀病 毒之致病性病毒株引起之疾病的預防性治療。然而，亦期 望該疫苗用轸治療性治療已受貓嵌杯狀病毒之致病性病毒 98582.doc -42- 200538153 株感染的貓。例如，將包括藉由以FCV-Diva或其免疫原性 組份來使異種宿主免疫而產生之抗體之疫苗用於治療性治 療受貓嵌杯狀病毒感染之貓。然而，當用作治療性治療抗 各種疾病時，甚至期望提供主動免疫之疫苗，意即包含 FCV-Diva或其突變體或其特異免疫原性片段之疫苗係有效 的。因此，由本發明提供之免疫可為主動免疫或被動免 疫’且該疫苗之預期用途可為預防性或治療性的。 • 本發明之疫苗之任一實施例的投藥途徑包括，但不限於 經口鼻、肌肉内、腹膜内、皮内、皮下、靜脈内、動脈 内、眼内及經口以及經皮或藉由吸入或栓劑。投藥之較佳 途徑包括經口鼻、肌肉内、腹膜内、皮内及皮下注射。疫 田可藉由任何裝置投用，該等裝置包括但不限於注射器、 噴霧器、彌霧器（mister)、無針注射裝置或微粒轟擊基因 槍（生物彈轟擊法（Biolistic bombardment))。 根據待用之投藥模式將本發明之任一實施例之疫苗在醫 • 藥上可接文之載劑中調配。熟習此項技術者可容易地調配 包含活的或死的FCV-Diva、FCV-Diva衣殼蛋白或其特異 免疫原性片段、編碼FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性 . 片段之重組病毒載體或編碼FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免 • 疫原性片段之DNA分子的疫苗。在肌肉内注射為較佳的情 況下，等滲調配物係較佳。通常，為達等滲之添加劑可包 .括氣化鈉、右旋糖、甘露醇、山梨醇及乳糖。在特殊情況 下，諸如磷酸鹽緩衝鹽水之等滲溶液為較佳。調配物可進 一步提供穩定劑，例如明膠及白蛋白。在某些實施例中， 98582.doc -43- 200538153 將血管收縮劑添加至調配物中。如本發明之醫藥製劑具有 無菌及無熱原質。然而，熟習此項技術者熟知用於醫藥上 可接受之載劑之包含本發明之疫苗的較佳調配物為彼等由 美國農業部（United States Department of Agriculture)或外 國（例如加拿大或墨西哥或任一歐洲國家）相當的政府機構 頒佈之規章中批准的醫藥載劑，以用於貓嵌杯狀病毒活疫 苗、貓嵌杯狀病毒死疫苗、多肽（抗原）次單位疫苗、重組 0 病毒載體疫苗、抗體疫苗及DNA疫苗。因此，用於本發明 之疫苗之商業生產之醫藥上可接受之載劑為已由美國或外 國之合適政府機構批准或即將批准之載劑。該疫苗可進一 步與醫藥上可接受之佐劑混合。在本發明疫苗之某些調配 物中’該疫苗與其它貓疫苗組合以製造可保護貓以對抗由 其匕描病原體引起之許多疾病的多價疫苗產品。目前，貓 疫田之商業製造商及終端用戶親睞多價疫苗產品。因此， 在一較佳實施例中，本發明提供一種多價疫苗，其使貓產 參生對抗貓嵌杯狀病毒及至少一種貓其他病原體之免疫力， 車乂佳為選自由下列各病原體組成之群之貓病原體：貓疱疹 病毋、貓白血病病毒、貓免疫缺乏病毒、貓披衣菌及貓瘟 病毒。 . =之接種較佳係藉由產生完全、廣泛免疫原性反應之單 :庋田接種。在本發明之另一實施例中，貓經受一系列疫苗 -接！以產生完全、廣泛的免疫反應。當提供-系列疫苗接 種時’可於約_天至四週之間或更長間隔提供疫苗接種。 在特定實施例中，可同時在不同部位給猶接種。 98582.doc 200538153 活疫苗 在本發明之疫苗之一實施例中，該疫苗包括含FCV-Diva 之活疫苗。此項技術中已熟知當將嵌杯狀病毒病毒株藉由 口鼻途徑（感染之自然途徑）投與貓時其為致病性的，而當 藉由其它途徑例如腹膜内、肌肉内、皮内或皮下途徑投與 時通常為非致病性的（apath〇genic)。然而，在某些貓中， 例如在免疫不全的（immunocompr〇mise(i)l苗中，藉由該等 其它途控接種時，該病毒引起疾病。因此，需要包含Fcv-Diva之經減毒或經突變之變異體的特殊活疫苗，其刺激貓 的免疫系統而不引起疾病。用於製造減毒病毒之方法在此 項技術中已為吾人所熟知，且包括該等方法諸如在合適細 胞株上於細胞培養基中之連續繼代或紫外線或化學突變形 成。製造減毒病毒株之另一方法為製造對溫度敏感之變異 體且纟兄明如下。 實例5 溫度敏感FCV-Diva 33585純系之產生 紫外光曝露： 起始物質衍生自FCV-335 85，其已於Fc3Tg細胞（貓舌， ATCC CCL-176)中繼代二十次。將250微升含上清液之病 毒试樣點於培養皿上且展開至約25毫米直徑。將含病毒之 培養皿置放於層狀流動生物安全罩中距殺菌紫外線燈8.5 英11寸處。打開紫外燈共30-50秒（兩個單獨試驗中35及45 秒），1〇秒間隔。在每次曝光之間藉由緩慢分注（pipetting) 將上清液混合。 98582.doc -45- 200538153 後uv曝光處理 將經UV光處理之含病毒之上清液直接在24小時大的 Fc3Tg細胞單層上成斑，1 mi上清液之稀釋液亦如此處 理。接著全部於30°C培養90-120分鐘。將瓊脂糖覆層塗於 該等單層，且將培養板於30°C培養3-4天使得形成斑點 (plaque)以達成計數。最終結果為病毒力價減少大約3 logs 〇 溫度敏感性變異體之選擇 使用1 ml微量移液管吸頭採集斑點以將瓊脂糖包埋物 (plug)轉移至250微升液體培養培養基中。將懸浮瓊脂糖包 埋物於· 8 0 C存放。每個所採集斑點中之病毒力價藉由於 30°C及39°C在Fc3Tg細胞上之終點滴定來測定。將於3〇°C 較39°C具有顯著更高力價之包含病毒之斑點用於製備病毒 儲備物（stock)。 結果 進一步表徵一種已為吾人命名FCV33585 TS25之所選溫 度敏感性變異體。如表6所示，該FCV-33585之變異體顯示 於39°C較3(TC病毒複製之減少。 表6 TCID5〇/ml 30°C 39〇C FCV 33585 TS25 4.2χ107 <10 已於30°C在Fc3Tg細胞中繼代20次之親代病毒未顯示於 98582.doc -46- 200538153 37°C較30°C之病毒複製減少。另外，在uv光處理之後大多 數斑點於30°C及39°C均產生類似力價。 貧例6 FCV-Diva病毒株33585之減毒作用 製備FCV-Diva 33585之連續系列稀釋液（1〇-2至1〇-7)，且 將0.1 ml各稀釋液添加至内含Fc3Tg及NLFK單層細胞之6槽 孔培養盤中。於30°C培育3-4天之後，在顯微鏡下觀察細 胞培養盤槽孔之CPE(細胞病變效應）。收集具有最高稀釋 度稀釋液及具明顯CPE之槽孔的上清液，並用於再接種於 含新鮮單層細胞之槽孔以進一步繼代培養。在Fc3Tg及 NLFK細胞第7代（p7)及第17代（pl7)及隨後NLFK第44代 (P44)及Fc3Tg細胞第46代（p46)時，將病毒斑點純化兩次， 接著置於96槽孔培養盤中進行單一極限稀釋。 為評估繼代病毒之毒性表現型，將1 ml 1〇6 TCID5G/ml之 各純化病毒經口鼻接種予貓（5隻/組）。Fc3Tg及NLFK細胞 φ 第10代（p10)及第20代（P20)病毒均顯示保有與親代病毒相 當之毒性程度’並在接種4天内導致所有貓隻死亡。相反 地’以第47代（p47)(NLFK)及第49代（p49)(Fc3Tg)病毒接種 僅會導致一例死亡。丨9隻經接種之貓隻中有丨3隻會有跛 行、抑繫、打噴嚏及流鼻涕之症狀，但後來所有貓均康 復’且之後很少有臨床症狀。存活的貓隻再接種1 06 TCIDWml病毒，且將該等貓隻之血清樣本分析交互_中和 作用模式’與毒性親代病毒比較。同時進一步繼代培養病 毒’並監測其毒性及交互-中和作用模式。 98582.doc -47- 200538153 乍為另 貝例’猎由將病毒在細胞株（例如Crandall·* Reese Feline Kidney(CRFK)細胞）上連續繼代培養約1〇與 1〇〇代之間以製備FCV_Diva之減毒變異株。在細胞株上繼 代培養期間，病毒會失去其造成貓隻疾病之能力，例如， 變得無毒性或無病原性，但仍保有其在貓中複製及產生保 濩性免疫反應之能力。因此，為了製備疫苗，將貓嵌杯狀 病毒分離株FCV-Diva或其減毒或突變變異株在合適之貓細 Φ 胞株（意即CRFK細胞）上於細胞培養中生長至足以產生疫苗 之力價。根據此項技術中已熟知之方法收集嵌杯狀病毒。 接著將嵌杯狀病毒濃縮、冷凍且於7(rc存放，或冷；東乾燥 及於4C存放。在接種前將嵌杯狀病毒與醫藥上可接受之 載劑（例如鹽水溶液）及/或視需要之佐劑（例如氫氧化鋁）混 合至每毫升約ίο3至1〇8組織培養感染劑量（TCID5G/ml)之適 當劑量。除了 FCV-Diva病毒株外，活疫苗還可進一步包括 至少一種其它貓嵌杯狀病毒病毒株，較佳為選自由下列各 馨 病毋株組成之群：FCV_F9、FCV-M8、FCV-255及FCV· 2280。在一較佳實施例中，疫苗進一步包括用於使貓產生 對抗其他至少一或多種貓病原體免疫力之疫苗，該等其它 _ 豸苗病原體較佳選自由下列各病原體組成之群：貓疱疹病 毒、貓白血病病毒、貓免疫缺乏病毒、貓披衣菌及貓瘟病 • 毒、狂犬病病毒及支氣管敗血性博德特拉菌（B〇rdetella bronchiseptica) ° 礞 實例7 減毒FCV-Diva 33585作為免疫原之用途 98582.doc -48- 200538153 如上所述將溫度敏感性變異株FCV-33585 TS25及第61代 (NLFK細胞）均純化三次。將4-5隻貓之組以每隻貓1 ml 106 TCID5〇/ml經鼻内（in)及皮下（SQ)接種。一組（TS25，H)亦 接種10倍高劑量（2xl〇7 TCID5〇/ml/貓）之TS25。所有組均觀 察到最少臨床症狀，且可與彼等獲得廣泛使用的疫苗病毒 株F9比較。所有貓隻再接種1〇6 TCID5G/ml之TS25或p61病 毒。將初始接受2xl07 TCID5G/ml之TS25病毒之組別 (TS25，H)再接種 5xl〇6 TCID5〇/ml之病毒。 將每一接種疫苗貓隻之血清樣品用以進行對抗26種FCV 病毒株中每一病毒株之血清中和作用分析法（F9、J-1、 Η 、 2280 、 255NVSL 、 94580 、 100869-1 、 33585 、 88287 、 89391 、 101920-1 、 122217 、 17932-17 、 19306 、 26391-4 、 27086 > 30101-2 ^ 32561-1 - 32561-14 > 32561-15 ^ 32561-7、36069-2、41927-8、84883-02、21 及 49)。血清中和數 據用>23及> 15之臨界（cut_0ff)力價加以分析。 表7A·在IN接種之後減毒FCV_Diva 33585之中和力價 病毒株 %陽性(臨界力 價〉23) %增加(與F9力 價相比） %陽性(臨界力 價〉15) %增加(與F9力 價相比） 33585 TS25 26 0 37 16 p47N 27 4 31 p49F 22 29 p61N 15 25 F9 26 32 98582.doc -49- 200538153 表7Β·在SQ接種之後減33S85之中和力價 病毒株 %陽性(臨界力 價 >23) /〇增加(與P9力 價相比） %陽性(臨界力 價 >15) %增加(與F9力 價相比） 33585(p61) 17 6 23 35 TS25 30 88 35 106 TS25H 30 88 39 129 F9 16 17 表7A-7B)包含得自經鼻内（IN)及皮下（SQ)途徑接種而感 染之貓之血清樣本的血清中和數據。當與F9比較時，減毒 33585 之各種繼代（p61、p47 NLFK、p49 Fc3Tg 及 TS-25)不 具有較廣之交叉中和（表7A)。此外，第61代病毒之交叉中 和覆蓋度小於33585之更低代（？47、？49及丁825)。 然而，當病毒經皮下（SQ)接種時，F9獲得之TS25及 TS25 Η之交叉中和分佈顯著提高（表7B)。對於使用〉23及 >15之力價範圍，以F9獲得之TS25在覆蓋度上分別存在 88%及106%之增加。當SQ接種後每組之中和資料以力價 φ 之算術平均數（表7C)或幾何平均數（表7D)報導時可見類似 結果。 表7C·在SQ接種之後減毒FCV-Diva 33585之中和力價（算術 平均數） 病毒株 %陽性(臨界力 價 >23) °/〇增加(與F9力 價相比） %陽性(臨界力 價 >15) %增加(與F9力 價相比） 33585(p61) 19 27 27 17 TS25 42 180 46 100 TS25 ， Η 39 160 46 100 F9 15 23 98582.doc -50- 200538153 表D.在SQ接種之後減毒FCV_Diva 33585之中和力價（幾何 平均數） 病毒株 %陽性(臨界力 價 >23) %增加(與F9力 價相比） %陽性(臨界力 價 >15) %增加(與F9力 價相比） 33585(p61) 12 19 27 TS25 27 80 39 160 TS25 ， Η 31 107 35 133 F9 15 15 吾人推論，與廣泛使用之疫苗病毒株F9比較，當經皮下 投用低繼代及減毒FCV-335 85 TS25時提供較高的交叉中和 覆蓋度。 失活疫苗 在本發明之另一實施例中，疫苗包含失活的或死的含 FCV-Diva之疫苗。該失活疫苗藉由此項技術中已熟知之方 法製成。舉例而言，一旦病毒繁殖至高力價，則熟習此項 技術者不難明白病毒抗原性物質可藉由此項技術中已熟知 之方法獲得。例如，病毒抗原性物質可藉由稀釋、濃縮或 提取獲得。已使用所有該等方法來獲得合適之病毒抗原性 物質以產生疫苗。嵌杯狀病毒藉由以福爾馬林 (formalin)、/5-丙内酯（BPL)，或以二元伸乙基亞胺（BEI)， 或熟習此項技術者已知之其它方法處理而失活。 藉由福爾馬林之失活係藉由將嵌杯狀病毒懸浮液與37% 甲醛混合至0.05%之最終甲醛濃度來實行。將嵌杯狀病毒-甲醛混合物藉由於室溫下持續攪拌大約24小時而混合。接 98582.doc -51 - 200538153 著將失活後杯狀病毒混合物藉由檢定在合適猶細胞株（例 如CRFK細胞）上之生長來測試剩餘活病毒。 藉由BEI之失活係藉由將本發明之嵌杯狀病毒懸浮液與 0·1 Μ ΒΕΙ(0·175 N NaOH中之2-溴-乙胺）混合至1 mM之最 終BEI濃度來實行。將嵌杯狀病毒-BEI混合物藉由於室溫 下持續攪拌大約48小時而混合，接著添加1.0 Μ硫代硫酸 鈉至0.1 mM之最終濃度。將混合持續額外的兩小時。將失 活嵌杯狀病毒混合物藉由檢定在合適貓細胞株（例如NLFK 細胞）上之生長來測試剩餘活病毒。 將本發明之上述失活嵌杯狀病毒與任何一種醫藥載劑混 合用於將失活病毒疫苗調配至適當劑量水平。除FCV-DWa 外該失活疫苗還可進一步包括至少一種其它I结彼杯狀病毒 病毒株，較佳選自由下列各病毒株組成之群：FCV-F9、 FCV-M8、FCV-25 5及FCV-2280。在一較佳實施例中，該 疫苗進一步包括用於使貓產生對抗其他一或多種貓病原體 免疫力之疫苗，較佳為選自由下列各病原體組成之群：貓 疱疹病毒、貓白血病病毒、貓免疫缺乏病毒、貓彼衣菌及 貓瘟病毒。 重組疫苗 在本發明之另一實施例中，疫苗包括含編碼FCV_Diva衣 殼蛋白或其特異免疫原性片段之核酸之重組病毒載體，包 含SEQ ID NO : 2之胺基酸序列，或包含選自SEQ ID NO : 1之核苷酸序列。在一特定實施例中，該重組病毒載體為 使貌產生對抗貌嵌杯狀病毒及猫疮療病毒免疫力之雜疮療 98582.doc -52- 200538153 病毒。在另一實施例中，該重組病毒載體包括一或多種較 佳為選自由下列各病毒組成之群之抗原：貓疮療病毒、描 白血病病毒、貓免疫缺乏病毒、貓彼衣菌及貓瘦病毒、狂 犬病病毒及支氣管敗血性博德特拉菌（Bordetella bronchiseptica) 〇 為了製備表現FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段 之重組病毒載體，將編碼該衣殼蛋白或其特異免疫原性片 段之cDNA插入病毒載體（例如疮療病毒、痘病毒或腺病毒） 之基因體。美國專利第5,716,822號（Wardley等人）描述用於 將編碼貓嵌杯狀病毒病毒株CFI/68 FIV衣殼蛋白之DNA插 入貓疱疹病毒胸苷激酶基因之方法。包含於本發明中之其 它重組病毒栽體疫苗包括，但不限於腺病毒、腺相關病 毒、微病毒（Parvovirus)及各種痘病毒載體以表現FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段。詳言之’本發明包 括表現FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之重組痘 病毒載體疫苗，其根據美國專利第5,338,683及5,494,807號 (Paoletti等人）中任一項所教示之方法製備，該等專利教示 包括表現外來抗原之牛痘病毒或金絲雀痘病毒之重組病毒 疫苗；美國專利第5,266,313號（Esposito等人），其教示表 現狂犬病病毒抗原之重組 >完成症病毒載體，及美國專利弟 6,010,703號（Maes等人），其教示表現貓疱疹病毒gD或gB 抗原之重組浣熊痘病毒載體。 對於任一上述重組病毒載體，將編碼FCV-Diva衣殼蛋白 或其特異免疫原性片段之cDNA以人工操縱方式連接至編 98582.doc -53- 200538153 碼抗原之cDNA之51末端的真核細胞啟動子及編碼抗原之 cDNA之3’末端的真核細胞終止訊號及多（A)訊號。如本文 所使用之術語”人工操縱方式連接’’意謂將本發明之核酸（如 cDNA分子）及包含表現對照序列（例如轉錄啟動子及終止序 列）之核酸（DNA)置於載體或細胞中，使得由cDNA編碼之 抗原之表現藉由表現對照序列來調控。用於選殖DNA(例 如編碼FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之cDNA) 及將其以人工操縱方式連接至包含表現對照序列之DNA的 方法係此項技術中已熟知的。適用於在重組病毒載體中表 現FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之啟動子之實 例為巨細胞病毒迅早期（CMV)啟動子、Rous肉瘤病毒長末 端重複（RSV-LTR)啟動子、猿病毒40(SV40)迅早期啟動子 及如金屬硫蛋白（metallothionein)啟動子之誘導性啟動子。 具有終止訊號及對（A)訊號之DNA之實例為SV40晚期聚（A) 區域。適用於產生抗原之病毒表現系統之另一實例為可購 自Invitrogen之辛德比斯（Sindbis)表現系統。該等可購得 之表現載體及系統之使用係此項技術中已熟知的。 在本發明之又一實施例中，疫苗係作為引起貓中主動免 疫反應之核酸或DNA分子疫苗來提供。該DNA分子疫苗係 由具有編碼FCV-Diva之衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之 核酸序列之DN A組成。在一較佳實施例中，該DN A分子疫 苗包括SEQ ID NO : 1之核酸序列，或其編碼SEQ ID NO : 2之特異免疫原性片段之片段。將編碼衣殼蛋白或其特異 免疫原性片段之核酸以人工操縱方式於轉錄啟動子處或其 98582.doc -54- 200538153 附近連接。此舉使得當將核酸接種入貓之細胞時，衣殼蛋 白或其特異免疫原性片段能夠自核酸轉錄。該DNA分子較 佳為質體。適用於DNA疫苗之啟動子係此項技術中已熟知 的且包括（但不限於）RSV LTR啟動子、CMV迅早期啟動子 及SV40 T抗原啟動子。進一步較佳為將核酸於編碼衣殼蛋 白或其特異免疫原性片段之序列之終止密碼子處或其附近 以人工操縱方式連接至包含轉錄終止訊號及多（A)識別訊 號之核酸片段。將該DNA疫苗以醫藥上可接受之載體或類 似於彼等美國專利第5,703,055號（Feigner)中揭示之脂質或 脂質體載體提供給貓。該DNA疫苗可藉由各種方法提供給 描，例如肌肉内注射、喷口内（intrajet)注射或生物彈轟 擊。製造DNA疫苗及其使用方法在美國專利第5,589,466及 5,580,859號（Feigner)中提供。最後，用於製造醫藥級質體 DNA之方法教示於美國專利第5,561，064號（Marquet等人） 中〇 因此，使用上述方法，將表現FCV-Diva衣殼蛋白或其特 異免疫原性片段之DNA疫苗用於使貓產生對抗致病性貓嵌 杯狀病毒之免疫力。該DNA疫苗之優勢在於DNA分子便利 地繁殖為質體，其為製造疫苗之簡單且便宜的手段，且因 為該疫苗不是活的，所以許多與重組病毒載體活疫苗有關 的調控問題對DNA疫苗而言不成問題。熟習此項技術者應 瞭解本發明之DNA疫苗可包括以合成方法產生之核酸，該 等核酸係藉由此項技術中熟知之化學合成方法製得。 在本發明之又一實施例中，該疫苗係由經分離及純化的 98582.doc -55- 200538153 FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段組成。詳言之， 疫苗其中FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段包含 SEQ ID NO · 2之胺基酸序列。較佳地，該衣殼蛋白或其 特異免疫原性片段產生於產生可經分離及純化以製造疫苗 之抗原的重組細菌或真核細胞表現載體中。例如，FCV_ Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段產生於微生物（例如 細菌、酵母或真菌）、真核細胞（例如哺乳動物或昆蟲細胞） • 中，或經由重組病毒載體（例如腺病毒、痘病毒、疱疹病 毒、勝利基森林（Semlicki Forest)病毒、桿狀病毒、嗟菌 體、辛德比斯（Sindbis)病毒或仙台（Sendai)病毒）而生成。 用於產生FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之合適 細菌包括大腸桿菌（Escherichia coli)、枯草桿菌（BaciHus subtilis)，或任何其它可表現異種多肽之細菌。用於表現 FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之合適酵母種類 包括，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母（Schiz〇sacchar〇myces φ P〇mbe)、假絲酵母（Candida)，或任何其它可表現異種多肽 之酵母使用上述細囷、真核細胞或重組病毒載體以製造 用於疫苗之抗原之方法係此項技術中已熟知的。 為了製造由衣殼蛋白或其特異免疫原性片段組成之疫 _ 苗，將編碼FCV-DiVa衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之核 ， fcc置於質體中，且將該核酸以人工操縱方式連接至在微生 . 物中達成衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之表現的啟動 子合適之啟動子包括（但不限於）T7嗟菌體啟動子、T3嗤 菌體啟動子、卜半乳糖苷酶（galactosidase)啟動子及Sp6噬 98582.doc -56- 200538153 菌體啟動子。在微生物中表現FCV-Dlva衣殼蛋白或其特異 免疫原性片段使衣殼蛋白能夠使用商業上用於製造大量重 組抗原多肽之發酵技術來生產。用於分離及純化抗原之方 法此項技術中已熟知且包括例如凝膠過濾、親和層析法、 離子交換層析法或離心之方法。 為了有助於分離FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片 段，製造融合多肽其中將衣殼蛋白或其特異免疫原性片段 瞻連接至使能夠藉由親和層析法分離之另一多肽。融合多肽 較佳使用以下表現系統中之一種製造。例如，將編碼Fcv_ Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段icDNA核酸序列於5, 末端或3 ’末端連接至編碼多肽之核酸。將該等核酸在適當 密碼子閱讀框架中連接以能夠產生融合多肽，其中衣殼蛋 白或其部分之胺基及/或羧基末端融合至多肽從而簡化抗 原作為融合多肽之回收。該融合多肽亦可在純化期間防止 抗原降解。儘管包括融合多狀之疫苗係有效的，但是在苹 φ 些情況下須要在純化之後移除第二多肽。因此，亦期望融 合多肽在抗原與多肽之間之接點包含分裂位點。該分裂位 點係由以對在該位點之胺基酸序列呈特異性之酶分解之胺 基酸序列。期望之該等分裂位點之實例包括藉由腸激酶分 裂之腸激酶分裂位點、藉由因子Xa分裂之因子Xa分裂位 點及藉由GENENASE分裂之GENENASE分裂位點 (GENENASE 為 New England Biolabs，Beverly，Mass·之商 標）。以下為用於製造衣殼蛋白或其特異免疫原性片段作 為融合多肽或作為無多肽之分離抗原之方法。 98582.doc -57- 200538153 用於製造FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段作為 用於疫苗之融合多肽之原核生物表現系統之實例為可購自 Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway，N.J.之穀胱苷肽 S-轉移酶基因融合系統（Glutathione S-transferase (GST)Gene Fusion System)，其使用 pGEX_4T-l 表現載體質 體。將編碼衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之cDNA在適 當密碼子閱讀框架中與編碼GST之DNA融合。融合多肽之 GST部分允許該融合多肽使用穀胱苷肽瓊月旨糖4B親和層析 法來快速純化。在純化之後，可將融合多肽之GST部分藉 由以位點特異性蛋白酶（例如凝血酶或因子Xa)分裂來移除 以產生無GST多肽之抗原。無GST多肽之衣殼蛋白或其特 異免疫原性片段係藉由第二輪穀胱苷肽瓊脂糖4B親和層析 法而產生。 用於製造包括FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段 之疫苗的另一方法為在框架内連接編碼抗原之cDNA及編 碼聚組胺酸之DNA密碼子之方法。該聚組胺酸較佳包含六 個組胺酸殘基，其允許藉由金屬親和層析法（較佳為鎳親 和層析法）純化融合多肽。為了製造無聚組胺酸之衣殼蛋 白或其特異免疫原性片段，將分裂位點（例如腸激酶分裂 位點）在適當閱讀框架中於編碼聚組胺酸之密碼子與編碼 抗原之密碼子之間融合。該無聚組胺酸之抗原係藉由將聚 組胺酸以腸激酶分裂而移除接著藉由第二輪金屬親和層析 法結合游離聚組胺酸來製造。該方法顯示適用於製備鼠疫 耶爾森氏菌（Y· pestis)之LcrV抗原，其揭示於Motin等人， 98582.doc -58- 200538153
Infect. Immun· 64 : 4313-4318(1996)。可購自 Invitrogen， Carlsbad，California之Xpress系統為商業套組之實例，其 可用於製造且接著分離聚組胺酸-多肽融合蛋白質。 用於製造包括FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段 之疫苗之另一方法使用由Mo tin等人，Infect. Immun. 64 : 3021-3029( 1995)揭示之方法。Motin等人揭示了編碼融合 多肽之DNA，其係由編碼連接至編碼一部分蛋白質A之 DNA之抗原的DNA組成，其中將編碼腸激酶分裂位點之 DNA插入編碼蛋白質A之DNA與抗原之間的適當密碼子閱 讀框架中。蛋白質A使融合多肽能夠藉由IgG親和層析法分 離，且無蛋白質A之衣殼蛋白藉由以腸激酶分裂而產生。 接著將蛋白質A藉由IgG第二輪親和層析法移除。 用於製造包括FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段 之疫苗之另一方法係基於美國專利第5,725,863號（Daniels 等人）揭示之方法。Daniels等人方法可用於製造包括腸毒 素分子之FCV-Diva疫苗，其中每個分子插入100個以上 FCV-Diva衣殼蛋白之胺基酸殘基。用於製造可用於製造本 發明之疫苗之融合多肽疫苗的其它方法揭示於美國專利第 5,5 85，100 號（Mond)及美國專利第 5,589,384 號（Liscombe) 中。最後，可購自New England Biolabs之pMAL融合及純 化系統為用於製造融合多肽之方法之另一實例，其中將麥 芽糖結合蛋白質融合至衣殼蛋白或其特異免疫原性片段。 麥芽糖結合蛋白質有助於藉由葡哌喃聚醣親和層析法分離 融合多肽。可將麥芽糖結合蛋白質藉由上述分裂位點中之 98582.doc -59- 200538153 一個連接至抗原，其能夠製成無麥芽糖結合蛋白質之抗 原。 儘管細菌方法可用於製造用於疫苗之FC V- Diva衣殼蛋白 或其特異免疫原性片段，但是須要在真核細胞表現系統中 製造衣殼蛋白或其特異免疫原性片段。尤其有用之系統為 揭示於美國專利第5,229,293號（Matsuura)之桿狀病毒表現 系統。適用於製造衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之桿狀 病毒表現系統為得自Stratagene之pPbac及pMbac載體；及 可購自 Invitrogen，Carlsbad，Calif 之 Bac-N-Blue 載體、 pBlueBac4.5 載體、pBlueBacHis2-A，B，C 及 pMelBac。 適用於表現用於疫苗之FC V-Diva衣殼蛋白或其特異免疫 原性片段之另一真核細胞系統為酵母表現系統，例如可購 自Stratagene之ESP酵母蛋白質表現及純化系統。另一酵母 表現系統為得自Invitrogen之任一基於畢赤酵母（Pichia)之 表現系統。本發明亦包括哺乳動物表現系統。哺乳動物表 現系統之實例為得自Stratagene之LacSwitch II系統、pBK Phagemid、pXTl載體系統及pSG5載體系統；可購自 Promega Corporation，Madison，Wis.之pTargeT哺乳動物表 現載體系統、pSI哺乳動物表現載體、pCI哺乳動物表現載 體及 pAdVantage 載體；及可講自 Invitrogen 之 Ecdysone-Inducible哺乳動物表現系統、pCDM8、pcDNAl.l及 pcDNAl · Ι/Amp。 本發明進一步包括由疫苗組成之實施例，該等疫苗包括 FCV-Diva衣殼蛋白或該衣殼蛋白之特異抗原決定部位作為 98582.doc -60- 200538153 根據美國專利第5,800,821號（Acheson等人）中教示之方法 製造之熱穩定孢子傳遞系統之組份。因此，本發明提供基 因工程製造之包含編碼FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原 性片段之核酸的細菌細胞。當該重組細菌孢子疫苗經口投 與I苗時’孢子在|苗之腸胃道内發芽且細菌表現衣殼蛋白或 其特異免疫原性片段，其與貓的免疫系統接觸且引起免疫 反應。该疫苗具有熱穩定之優勢；因此其可於室溫下保存 無限長時間。 被動免疫疫苗 儘管本發明之上述實施例提供主動免疫以對抗描喪杯狀 病毒’但是本發明進一步包括提供針對貓嵌杯狀病毒之被 動免疫的疫苗。引起被動免疫以對抗貓嵌杯狀病毒之疫苗 包括抗FCV-Diva衣殼蛋白、其特異免疫原性片段或整個 FCV-Diva病毒之多株抗體或單株抗體。
為了製造包含多株抗體之被動免疫疫苗，將FCv_Diva、 其衣殼蛋白或其特異免疫原性片段注入合適宿主用於製備 抗體，較佳之宿主為馬、豬、兔、綿羊或山羊。用於自該 等宿主製造多株抗體疫苗之方法此項技術中已熟知。舉例 而言’將衣殼蛋白或其特異免疫原性片段或整個嵌杯狀病 毒FCV-Dlva與佐劑（例如弗氏完全佐劑）或可購自 Corp·，N〇rcross，Ga.之較少毒性的TlterMax混合，接著將 其藉由此項技術中已熟知之方法投與宿主。監控抗體產生 且當已產生足夠抗體時’將血清自宿主移除且較佳為自血 清回收抗體。 98582.doc -61 - 200538153 被動免疫疫苗可包括一或多種單株抗體以對抗FCV_Diva 衣殼蛋白或整個病毒FCV_Dlva或其特異免疫原性片段之一 或多個抗原決定部位。用於製造單株抗體之方法及融合瘤 係此項技術中已熟知的。儘管單株抗體可使用此項技術中 已熟知之融合瘤技術製造，但是抗抗原之單株抗體亦可根 據巫菌體呈現方法製造’例如揭示於美國專利第 5,977,322(Marks等人）。抗衣殼蛋白或其部分之貓化抗體 • 可根據已用於人源化抗體之方法製造，例如彼等揭示於美 國專利第5,693,762及5,693,761號（Queen等人）之方法。適 用於製造單株抗體之噬菌體呈現套組為可購自Amersham Pharmacia Biotech之重組噬菌體抗體系統（Rec〇mbinant Phage Antibody System) ° 測定動物是否已由Diva病毒株接種之方法 任何接種方案之重要方面在於可將抗疾病之接種動物自 受疾病感染之動物區分開。因此，本發明進一步包括用於 φ 將經本發明疫苗接種之貓自受貓嵌杯狀病毒之野病毒株感 染之描、經另一市售疫苗製劑接種之貓或從未曝露於貓嵌 杯狀病毒之|苗區分開的方法或分析法。通常，分析法為基 於免疫學之抗體捕捉式或抗原捕捉式分析法。 在任何一種分析法中，測試貓之生物樣本中抗Fcv-Diva ，之抗體之存在且視需要測試抗其它描叙杯狀病毒病毒株之 抗體之存在。抗FCV-Diva之抗體之存在表明貓係經本發明 之疫苗接種。相反，在生物樣本中存在抗除FCV-Diva外之 貓嵌杯狀病毒之抗體表明貓受除FCV-Diva外之貓嵌杯狀病 98582.doc -62- 200538153 毒感染。該分析法可進一步包括包含來自其它嵌杯狀病毒 病毒株（例如F-9)之衣殼蛋白之對照組。因此，在該等分析 法中，已由本發明疫苗接種之貓之血清樣本將與？〇…以… 抗原反應，而感染或曝露於另一貓嵌杯狀病毒之貓之樣本 將不包含抗FCV_Diva之衣殼蛋白之抗體。 通常，抗體偵測或抗原偵測分析法使用酶聯結免疫吸附 劑分析法（ELISA)實施例進行。對於抗體捕捉式eusa， 提供包含複數個孔之微量滴定板，其中第一孔或系列孔包 含經固定於孔之表面的FCV-Diva之衣殼蛋白，且第二孔或 系列孔包含自經固定於孔之表面的另一貓嵌杯狀病毒之抗 原（或市售嵌杯狀病毒疫苗之衣殼蛋白）。接著，將生物樣 本添加至包含結合抗原之孔中且允許結合抗貓嵌杯狀病毒 之杬體以形成抗原-抗體複合物。生物樣本可以無溶劑形 式或以生理溶液中之極限稀釋系列提供。樣本中之未結合 物質藉由洗滌而自抗體-抗原複合物移除。接著將該複合 _ 物與、纟σ合至編抗體之經標記抗核素（anti-species)抗體或經 心Z單株抗體反應以形成抗原-抗體_抗核素抗體複合物。 S經標記之單株或多株抗體共軛至報導配位體（例如辣根 過氧化物酶或鹼性磷酸酶）時可偵測該複合物。或者，可 將第二單株或多株抗體共輛至報導配位體，例如螢光配位 體、生物素/抗生物素蛋白染色乳膠、膠體金磁性珠粒、 放射性同位素或其類似物。藉由此項技術中熟知之偵測方 法偵測特定報導配位體。因此，已由本發明疫苗接種之貓 之樣本將產生僅抗17(：：丨；0丨”衣殼蛋白之抗體，而感染或曝 98582.doc -63 - 200538153 露於貓嵌杯狀病毒之貓之樣本將不包含抗fcv_D 一之衣殼
蛋白之抗體。 A
對於抗原捕捉式ELISA，冑供包含複數個孔之微量滴定 板，其中第-孔或連續孔包含固定於孔之表面的多株或單 ^抗體以對抗FCV_Diva之衣殼蛋白或其特異免疫原性片 段1且第二孔或連續孔包含固定於孔之表面的抗體以對抗 另一描嵌杯狀病毒病毒株之抗原（或市售嵌杯狀病毒疫苗 之衣殼蛋白或其特異免疫原性片段）。接著，將生物樣本 ^加至包含結合抗體之孔中且允許結合抗㈣杯狀病毒之 杬原以形成抗體_抗原複合物。生物樣本可以無溶劑形式 =生理溶液中之極限稀釋系列提供。樣本中之未結合物 質藉由洗滌自抗體-抗原複合物移除。接著將該複合物與 抗FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之經標記多株 4體或二;^ δ己單株抗體反應以形成抗體-抗原-抗體複合 物田、、二‘ s己之單株或多株抗體共輛至報導配位體（例如 辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶）時可偵測該複合物。或 者，可將經標記之單株或多株抗體共軛至報導配位體，例 如螢光配位體、生物素/抗生物素蛋白染色乳膠、膠體金 兹丨生珠粒、放射性同位素或其類似物。藉由此項技術中熟 知之偵測方法偵測特定報導配位體。 EUSA及其變型係此項技術中已熟知的。eLISa可作為 套組提供用於將經本發明疫苗接種之貓自未接種之貓及受 書田肷杯狀病毒感染或經市售貓嵌杯狀病毒疫苗接種之貓區 分開。 98582.doc -64- 200538153 因為能夠測試該範圍内之樣本以將受貓嵌杯狀病毒感染 之I苗自經本發明疫苗接種之貓區分開係重要的，所以本發 明進一步包括基於快速免疫擴散之方法，其設備及包括其 裝置之套組。因此，本發明可具有套組，其包括任一以下 描述之方法：美國專利第5,620,845號（G〇uld等人）、美國 專利第5,559,041號（Kang等人）、美國專利第5,656,448號 (Kang等人）、美國專利第5,728,587號（Kang等人）、美國專 利第5,695,928號（Stewart等人）、美國專利第5，169,789號 (Bernstein等人）、美國專利第4 486 53〇號（David等人）及美 國專利第4,786,589號（Roun(js等人）。儘管上述揭示了特定 的快速免疫擴散方法，但是並非理解為本發明限制於以上 所述。涵蓋上述方法之派生及修改係在本發明之範疇内。 用於將經本發明疫苗接種之貓自感染或曝露於貓嵌杯狀 病毒之描區分開之另一方法係作為疫苗提供上述融合多 肽，其中該多肽包含在接種之貓中產生通常於貓中不存在 之抗體之標記抗原決定部位。例如，該標記抗原決定部位 可來自未感染描之病原體或在貓中產生通常於貓中不存在 之抗體之合成多肽。因此，若來自貓之樣本包含抗該標記 抗原決定部位及衣殼蛋白之抗體，則將貓以本發明之疫苗 接種。根據任何上述診斷方法測試該樣本。 在不存在不適當實驗之情況下，本文揭示及主張之所有 、、且曰物及/或方法可根據本發明之揭示内容製造且執行。 仏&本發明之組合物及方法已用較佳實施例來描述，但是 熟習此項技術者顯然明白，在不偏離本發明之概念、精神 98582.doc -65 - 200538153 及範疇之情況下，可對組合物及/或方法及本文所述之步 驟或步驟之順序做出改變。更特定言之，很明顯，某些化 學上及生理上相關之藥劑可替代本文所述之藥劑而達成相 同或類似的結果。熟習此項技術者明白之所有該等類似替 代及修改據信在如由附加之專利申請範圍所定義之本發明 之精神、範疇及概念内。 【圖式簡單說明】 圖1顯示將來自Genbank内所含83個已知FCV衣殼蛋白序 ® 列之區域E之胺基酸序列與Diva病毒株FCV-Diva 15、FCV-Diva 24 及 FCV-Diva 33585相比較的 ClustalW比對。
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200538153 序列表 <110> Rong, Sing
Slade, David Ankenbauer, Robert Wheeler, David <120> 貓嵌杯狀病毒疫苗 <130> PC32028 <140> 094101582 <141〉 2005-01-19 <150> US60/537r683 <151> 2004-01-20 <160> 105 <170> Patentln version 3.2 <210> 1 <211> 2004 <212> DNA <213>貓嵌杯狀病毒 <400> 1 atgtgctcaa cctgcgctaa cgtgcttaaa tactataact gggatcccca ctttaggctt gttatcaacc ccaacaagtt tctttctgtt ggtttctgtg ataatccgct tatgtgttgt tatcccgaat tgcttcctga atttggaacg gtgtgggact gtgatcagtc tccacttcaa atttacctag aatctatcct tggtgatgat gaatggagtt ccacatacga ggcaattgac ccatgcgtgc caccaatgca ctgggatgaa gctggcaaga tctttcagcc acaccctggt gttttgatgc accacattat tggagaagtt gctaaggctt gggacccgaa ccttcccaac ttccgtttgg aagctgatga tggttccatc accacccccg agcagggaac tacagttggc ggagtcattg ctgagccgag tgtccaaatg tcagcggctg ctgacatggc aactggcaaa agcgttgact ctgagtggga agctttcttc tcttttcaca ccagtgtcaa ctggagtaca tccgaaaccc aaggaaagat tctattcaag caaagcttgg ggcctcttct caacccatac ctcacgcatc ttgctaaact ttatgtcgca tggtctggct ctattgaagt gagattctct atttctgggt ctggtgtttt cggaggaaaa ctggctgcaa ttgttgtgcc acctggaatc gagccgatcc aaagcacttc aatgcttcag tatcctcacg ttctatttga cgctcgtcag gtggaacctg tgatctttac tatccctgat cttagaagta ccctctatca ccttatgtct gatactgaca ctacttcttt agtgatcatg atatacaatg atctcattaa cccttatgct aatgattcta actcatctgg gtgcattgtt actgtggaaa caaaaccggg tcctgacttc aaattccatt tattgaaacc tcctggttct atgttaactc atggctctgt cccgtgtgac ctaataccaa agtcttcttc tctttggatt ggaaataggt tctggtctga tatcactgat tttgttattc ggccatttgt gttccaagct aaccgtcact ttgatttcaa ccaagagacg 98582.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 B40 900 960 1020 1080 1140 1200 1200
200538153 gcaggttgga gtacaccaag attcagacca atcacagtca caattagtca aaaagaaggt gaaatgcttg ggattggcgt agccactgat tatattgtac caggcatacc tgatggatgg ccagatacaa caatacctaa tgagctcatt ccggctggtg attatgctat taccaatcag agtggcaatg atatacaaac aaaagaggaa tacgaatctg ccatgataat cagcaacaac acaaatttca aaagcatgta catttgtggg tcccttcaac gagcgtgggg taataagaaa gtgtctaaca ctgctttcat tactactgct acggtaaagg aaaacaaatt aattcccagc aataccattg accaaacaaa gattgcaatt ttccaagaca atcacgtcaa tcgcgatgtg caaacatctg atgacacatt ggctttactt gggtacacag gaattggtga agaagcaatt ggtgctgata gggagaaagt tgtgcgcatt ggtgtccttc cagaagctgg cgcgcgcggt ggcaaccatc caatcttcta taggaattct atgaaattag gttatgttat caaatctata gatgtgttta actcgcagat cttgcacacc tctagacaac tatcactgaa caactacctt ctatcacctg actcttttgc tgtttatagg ataattgatt ctaatggatc ttggtttgat ataggcattg atagtgatgg attctccttt gttggtgttt cttctatcgg taaattagaa tttcctctta ctgcctccta catgggaaat caattggcaa agattcgact tgcctcaaac attaggagca caatgacaaa atta
<210> 2 <211> 668 <212> PRT <213 >貓嵌杯狀病毒 <400> 2
Met Cys Ser Thr Cys Ala Asn Val Leu Lys Tyr Tyr Asn Trp Asp Pro 15 10 15
His Phe Arg Leu Val lie Asn Pro Asn Lys Phe Leu Ser Val Gly Phe 20 25 30
Cys Asp Asn Pro Leu Met Cys Cys Tyr Pro Glu Leu Leu Pro Glu Phe 35 40 45
Gly Thr Val Trp Asp Cys Asp Gin Ser Pro Leu Gin lie Tyr Leu Glu 50 55 60
Ser lie Leu Gly Asp Asp Glu Trp Ser Ser Thr Tyr Glu Ala lie Asp 65 70 75 80
Pro Cys Val Pro Pro Met His Trp Asp Glu Ala Gly Lys lie Phe Gin 85 90 95 98582.doc -2 - 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2004 200538153
Pro His Pro Gly Val Leu Met His His He lie Gly Glu Val Ala Lys 100 1〇5 no
Ala Trp Asp Pro Asn Leu Pro Asn Phe Arg Leu Glu Ala Asp Asp Gly 115 120 125
Ser He Thr Thr Pro Glu Gin Gly Thr Thr Val Gly Gly Val He Ala 130 135 140
Glu Pro Ser Val Gin Met Ser Ala Ala Ala Asp Met Ala Thr Gly Lys 145 150 155 160
Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser Phe His Thr Ser Val 165 170 175
Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gin Gly Lys He Leu Phe Lys Gin Ser 180 185 190
Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Thr His Leu Ala Lys Leu Tyr 195 200 205
Val Ala Trp Ser Gly Ser lie Glu Val Arg Phe Ser lie Ser Gly Ser 210 215 220
Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala lie Val Val Pro Pro Gly lie 225 230 235 240
Glu Pro lie Gin Ser Thr Ser Met Leu Gin Tyr Pro His Val Leu Phe 245 250 255
Asp Ala Arg Gin Val Glu Pro Val lie Phe Thr lie Pro Asp Leu Arg 260 265 270
Ser Thr Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp Thr Thr Ser Leu Val 275 2Θ0 285 lie Met lie Tyr Asn Asp Leu lie Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ser Asn 290 295 300
Ser Ser Gly Cys He Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Pro Asp Phe 305 310 315 320
Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met Leu Thr His Gly Ser 325 330 335 98582.doc 200538153
Val Pro Cys Asp Leu lie Pro Lys Ser Ser Ser Leu Trp lie Gly Asn. 340 345 350
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Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn Gin Ser Gly Asn Asp lie Gin Thr Lys 435 440 445
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Val Ser Asn Thr Ala Phe lie Thr Thr Ala Thr Val Lys Glu Asn Lys 485 490 495
Leu lie Pro Ser Asn Thr lie Asp Gin Thr Lys lie Ala lie Phe Gin 500 505 510
Asp Asn His Val Asn Arg Asp Val Gin Thr Ser Asp Asp Thr Leu Ala 515 520 525
Leu Leu Gly Tyr Thr Gly lie Gly Glu Glu Ala lie Gly Ala Asp Arg 530 535 540
Glu Lys Val Val Arg lie Gly Val Leu Pro Glu Ala Gly Ala Arg Gly 545 550 555 560
Gly Asn His Pro lie Phe Tyr Arg Asn Ser Met Lys Leu Gly Tyr Val 565 570 575 4- 98582.doc 200538153 lie Lys Ser lie Asp Val Phe Asn Ser Gin lie Leu His Thr Ser Arg 580 585 590
Gin Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Leu Leu Ser Pro Asp Ser Phe Ala Val 595 600 605
Tyr Arg lie lie Asp Ser Asn Gly Ser Trp Phe Asp lie Gly lie Asp 610 615 620
Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Ser lie Gly Lys Leu Glu 625 630 635 640
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Leu Ala Ser Asn lie Arg Ser Thr Met Thr Lys Leu 660 665 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>基因特異性引子 <400> 3 ttcggccttt tgtgttcc <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213>人工的 <220> <223> 基因特異性引子 <400> 4 ttgagaattg aacacatc <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>基因特異性引子 <400> 5 tcctcgccaa tcccagtgta <210> 6 98582.doc 200538153 <211> 20 <212> DNA <213>人工的 <220> <223>基因特異性引子 <400> 6 catttcgact ttaaccaaga <210> 7 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223>用於比較之片段 <400> 7
Thr Leu Ser Asn Thr Gin Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Val Asn 15 10 15
Glu Lys Asn Asn Asp lie Thr Thr Arg Thr Gly Tyr Glu Ser Ala Thr 20 25 30
Thr lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Gly 50 55 60 <210> 8 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 8
Thr lie Phe Gly Asp Gin Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Asp Lys Asp Ser Asp lie Thr Thr Arg Ser Glu Tyr Glu Ala Ala Ser 20 25 30
Glu lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Gly 50 55 60 98582.doc 200538153 c210> 9 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 9
Thr lie Ser Glu He Leu Thr Pro Val Gly Asp Tyr Ala He Thr Ala 15 10 15
Gly Asn Asn Ser Asp He Thr Thr Ala Asp Glu Tyr Asp Arg Ala Asn 20 25 3〇
Val He Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 10 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 10
Thr lie Pro Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Ala Asn 15 10 IS
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Lys Asp Tyr Asp Ser Ala Thr 20 25 30
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 11 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 98582.doc 200538153 <400> 11
Thr He Pro Glu Lys Leu Thr Pro val Gly Asp Tyr Ala He Thr Gly 5 l〇 15
Pro Ser Gly Asn Asp He Xle Thr Ala Val Asp Tyr Asp Ser Ala Gly 20 25 3〇
Ser lie Arg Asn Asp Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 12 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 12
Thr He Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Gly Asn Asn Ser Asp lie Ala Thr Ala Thr Glu Tyr Asp His Ala Asp 20 25 30
Glu lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala <210> 13 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 13
Thr lie Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Gly Asn Gly Thr Asp He Val Thr Ala Ala Gin Phe Asp Ala Ala Asp 20 25 30 98582.doc 200538153
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 14 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 14
Thr lie Pro Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly His Tyr Ala lie Ala Asn 1 5 10 15
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Lys Asp Tyr Asp Ser Ala Thr 20 25 30
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 15 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 15
Thr lie Pro Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Asp Asn 15 10 15
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Lys Asp Tyr Asp Ser Ala Thr 20 25 30
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 98582.doc 200538153 <210> 16 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 16 Thr lie Pro Glu Glu Leu Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Ala Asn 15 10 15
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Lys Asp 20 25
Asp Ser Ala Thr 30
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met 35 40 lie Cys Gly Ser 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 0 12 3 1111 2 2 2 2 V<<< 17 62 PRT 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 17
Thr lie Pro Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly Asp 15 10
Ala lie Ala Asn 15
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Lys Asp Tyr Asp Ser Ala Thr 20 25 30
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met 35 40 lie Cys Gly Ser 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 0 12 3 1111 2 2 2 2 V V << 18 62 PRT 人工的
o 3 2 2 2 2 V V 比較片段 98582.doc 10- 200538153 <400> 18
Thr lie Pro Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Ala Asn 15 10 15
Gly Thr Gly Asn Asp lie 20
Thr Thr Ala Lys Asp Tyr Asp Ser Gly Thr 25 30
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 19 <211> 63 、
<212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 19
Thr lie Ser Glu Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Lys 15 10 15
Arg His Arg Val Thr Thr Ser Pro His Pro Ala Gly Tyr Asp Ala Ala 20 25 30
Asp Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly 35 40 45
Ser Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Lys Thr Ala 50 55 60 <210> 20 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <400> 20
Thr lie Pro Glu Glu Leu Val Pro Val Gly Asp Tyr Ala lie Ala Asn 1 5 10 15
Glu Thr Gly Asn Asp lie Ala Thr Ala Lys Asp Tyr Asp Ser Ala Thr 20 25 30
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr Phe Cys Gly Ser 35 40 45 -11 - 98582.doc 200538153
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asrx Thr Ala 50 55 60 <210> 21 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 21
Thr lie Pro Asp Glu Leu Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Ser 1 5 10 15
Gly Asn Asn Asn Asp He Thr Thr Pro Ala Asp Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Ser Met Tyr He Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Gly 50 55 60 <210> 22 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 _ <220> <223>比較片段 <400> 22
Thr lie Ala Glu Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asp 15 10 15
Gly Arg Gly Asn Asp lie Asp Thr Ala Val Gly Tyr Asp Thr Ala Gin 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Ara Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 5〇 55 60 <210> 23
<211> 62 <212> PRT 12- 98582.doc 200538153 <213> 人工的 <220> <223>比較片段 <400> 23
Thr lie Pro Glu Asp Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Lys 15 10 15
Gly Asn Gly Thr Asp He Thr Thr Ser Ala Asp Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asp Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Glu Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 24 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 24
Thr lie Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Gly Gly Asn Asn Asp lie Thr Thr Ala Ala Asp Tyr Asp Gly Ala Ser 20 25 30 lie lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 25 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 25
Thr lie Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Ser 15 10 15 -13- 98582.doc 200538153
Ser Asp Gly Asn Asp lie Thr Ser Ala Leu Gly Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Gly Thr Asn Phe Arg Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 26 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220>
<223> 比較片段 <400> 26
Thr lie Pro Glu Asp Leu lie Pro Val Gly Asp Tyr Ala lie Thr Lys X 5 10 15
Gly Asn Gly Thr Asp lie Thr Thr Ser Ala Asp Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asp Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Pro 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Pro Ala 50 55 60 <210> 27 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 27
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Gly Asn Gly Thr Asp lie Thr Thr Ser Ala Asp Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asp Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45 14- 98582.doc 200538153
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Thr lie Ser Glu Thr Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asp IS 10 15
Ala lie Gly Asn Asp lie Lys Thr Ala Ser Gly Tyr Asp Ala Ala Gly 20 25 30
He lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Thr Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 29 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 29
Thr lie Pro Gly Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Thr Gly Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30 lie He Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 30 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 15- )8582.doc 200538153 <220> <223> 比較片段 <400> 30
Thr lie Pro Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Val Thr 15 10 15
Thr lie Gly Asn Asp lie 20
Thr Thr Ala Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Asp 25 30
Val lie Val Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Arg lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
<210> 31 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 31
Thr He Pro Glu Thr Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ser lie Thr Thr 15 10 15
Ala Asp Gly Asn Asp He Thr Thr Ala Thr Gin Tyr Asp Ala Ala Ser 20 25 30
Val He Lys Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cya Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Ala Thr Ala 50 55 60 <210> 32 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 32
Thr lie Ser Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 1 5 10 15 16- 98582.doc 200538153
Gly Ser Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Thr Gly Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr 35 40 lie Cys Gly Ser 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
<210> 33 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223>比較片段 <400> 33 Thr lie Pro Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Thr Asp 15 10 15
Gly Ser Gly Asn Asp lie 20
Thr Thr Ala Ser Gly Phe Asp Lys Ala Asp 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met 35 40
Tyr lie Cys Gly Ser 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
<210> 34 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 34
Thr lie Asp Asp Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Gly Ala Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Ala Ala 20 25
Tyr Asp Ser Ala Asp 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45 98582.doc -17- 200538153
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 35 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 35
Thr lie Asp Asp Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 1 5 10 15
Gly Ala Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Ala Val Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val He Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 36 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 36
Thr He Asn Asp Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala He Thr Thr 1 5 10 15
Gly Asn Gly Asn Asp lie Ala Thr Ala Ala Met Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val He Gin Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 37 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 18- 98582.doc 200538153 <220> <223>比較片段 <400> 37
Thr lie Pro Glu Asn Leu Thr Pro Ala Gly Asp I*yr Ser lie Thr Asn 15 10 15
Tyr Asp Ala Ala Thr 30
Gin He Asn Asn Asp lie Thr Thr Ser Ala Glu 20 25 lie lie His Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 38 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 38
Thr He Ala Glu Glu Leu Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Lys 15 10 15
Gly Asn Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Thr Asp Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 39 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 39
Thr lie Pro Glu Asp Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15 19- 98582.doc 200538153
Gly Thr Asn Asn Asp lie Lys Thr Ala Ala Gin Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie lie Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 40 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 40
Thr lie Pro Gly Thr Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Val Asp 15 10 15
Tyr Asp Ala Ala Phe 30
His Thr Ser Aan Asp lie Ala Thr Ala Ala Lys 20 25
Lys lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 41 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 41
Thr lie Pro Glu Thr lie Thr Pro Ala Gly Leu Tyr Ala lie lie Asp 15 10 15
Gin Thr Asn Ser Asp lie lie Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Thr 20 25 30
Thr lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Phe lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala -20- 98582.doc 200538153 50 55 60 <210> 42 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 42
Thr He Pro Glu Arg Leu Thr Pro Ala Gly Asn 15 10
Ser lie Thr Thr 15
Asp Asn Gly Thr Asp He Val Thr Ala Asp Leu Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 43 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220〉 <223> 比較片段 <400> 43
Thr lie Ala Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Ser Thr Gly lie Asp lie Thr Thr Pro Thr Ala Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Arg Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala 50 55 60 Λ Λ Λ Λ 0 12 3 1111 2 2 2 2 44 62 PRT 人工的 98582.doc -21 - <220> 200538153 <223>比較片段 <400> 44
Thr He Ala Glu Ser Leu He Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 1 5 io 15
Gly Ser Gly Asn Asp lie lie Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asp Ala Ala 50 55 60
<210> 45 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 45
Thr He Ala Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ser lie Thr Thr 15 10 15
Arg Asp Gly Asn Asp He Lys Thr Ala Ala Asp Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 46 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> 比較片段 <400> 46
Thr lie Thr Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ser lie Thr Thr 1 5 10 15
Ser Lys Gly Asn Asp lie Val Thr Ser Arg Asp Tyr Asp Ser Ala Asp 98582.doc -22- 200538153 20 25 30
Tyr lie Cys Gly Ala 45
Glu lie Lys Asn Ala Thr Asn Phe Arg Gly Met 35 40
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 47 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223>比較片段 <400> 47
Thr lie Pro Gly Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asp 15 10 15
Gly Gly Asn Asn Asp lie Thr Thr Ala Lys Gly Tyr Asp Ser Ala Asn 20 25 30 lie lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Aan Thr Ala 50 55 60 <210> 48
<211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 48
Thr lie Pro Asp Lys Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Val Asn 15 10 15
Gin Thr Asn Gin Tyr lie Thr Gly Pro Lys Glu Tyr Asp Ser Ala lie 20 25 30
Lys lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45 lie Ser Asn Thr Ala 60
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys 50 55 -23- 98582.doc 200538153 <210> 49 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 49
Thr lie Pro Glu Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Glu Thr Asp Asn Asp lie Ala Thr Arg Ala Ala Tyr Glu Ser Ala lie 20 25 30
Glu lie Arg Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu His Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 50 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 50
Thr lie Pro Asp Asp Leu Val Pro Val Gly Asn Tyr Ser lie Thr Asp 15 10 15
Gin Arg Asn Asn Asp lie Gin Thr Lys Glu Gin Tyr Asp Ala Ala Thr 20 25 30
Ala lie Lys Asn Thr Thr Ser Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Gly 50 55 60 <210> 51 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 24- 98582.doc 200538153 <400> 51
Thr lie Pro Asp Asp Leu Val Pro Val Gly Asn Tyr Ser lie Thr Asp 15 10 IS
Gin Arg Asn Asn Asp He Gin Thr Lys Glu Gin Tyr Asp Ala Ala Thr 20 25 30
Ala lie Lys Asn Thr Thr Ser Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Gly 50 55 60 <210> 52 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 52
Thr lie Pro Gly Asp Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Val Asn 15 10 15
Gin Leu Asn Asn Asp lie Thr Ser Ala Glu Gly Tyr Asp Ser Ala lie 20 25 30 lie Cys Gly Ala 45
Glu lie Arg Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met 35 40
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
T工 3 2 R ^ 5 6 p Λ Λ Λ Λ Λ 0 12 3 1111 2 2 2 2 V VVV
<220> <223>比較片段 <400> 53
Thr lie Pro Gly Arg Leu lie Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Glu Ala Asp Asn Asp lie Thr Thr Pro Ser Ala Tyr Asp Ala Ala Val 20 25 30 25- 98582.doc 200538153
Ala lie Lys Asn Asn 35
Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cys Gly Ala 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Gin He Ser Ala Thr Ala 50 55 60 <210> 54 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 54
Thr He Pro Glu Val lie Thr Pro Val Gly Asp Tyr Ala He Val Asn 1 5 10 15
Gin Asn Asn Asp Asp lie Thr Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Leu 20 25 30
Ser lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 55 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220>
<223>比較片段 <400> 55
Thr lie Pro Glu Val lie Thr Pro Val Gly Asp Tyr Ala lie Val Asn 15 10 15
Gin Asn Gin Asp Asp lie Thr Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Ala Ala Leu 20 25 30
Ser lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 26- 98582.doc 200538153 <210> 56 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 56
Thr lie Pro Glu Thr lie Thr Pro Thr Gly Asp Tyr Thr lie Val Asp 15 10 15
Gin Asn Gin Ser Asp lie Val Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala His 20 25 30
Ser lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 57 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較片段 <400> 57
Thr lie Pro Gly Glu Leu lie Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Gly Ala Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Thr Gly Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30 lie lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 58 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 -27- 98582.doc 200538153 <400> 58
Thr lie Ser Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 1 5 l〇 15
Gly Asn Gly Cys Asp lie Thr Thr Ala Ser val Tyr Asp Ser Ala Asn 20 25 3〇
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 59
<211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223 >比較片段 <400> 59
Thr lie Ala Glu Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asp 15 10 15
Gly Ser Asn Asn Asp lie lie 20
Thr Ala Asn Gly Tyr Asp Ala Ala Asp 25 30
Tyr lie Cys Gly Ser 45
Val He Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met 35 40
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala
<210> 60 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較片段 <400> 60
Thr lie Asp Gly Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 l〇 15
Gly Ala Gly Ser Asp He Ala Ser Ala Ala Glu Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30 -28 - 98582.doc 200538153
Tyr He Cys Gly Ala 45
Val He Arg Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met 35 40
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Ala Thr Ala 50 55 60 <210> 61 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223 >比較序列 <400> 61
Thr lie Pro Asp Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asp 15 10 15
Gin Arg Gly Asn Asp He Thr Thr Ala Asn Gly Tyr 20 25
Asp Ala Ala Ser 30
Glu lie Met Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 62 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220>
<223>比較片段 <400> 62
Thr lie Gly Ser Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ser He Thr Thr 15 10 15
Gly Asp Gly Asn Asp lie Glu Thr Ala Ala Val Tyr Asp Ala Ala Asn 20 25 30
Val lie Arg Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys Val Ser Asn Thr Ala 50 55 60 -29- 98582.doc 200538153 <210> 63 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 63
Thr lie Pro Gly Glu Leu Val Pro Val Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 1 5 10 15
Gly Thr Asn Asn Asp lie Thr Thr Ala Ala Gin Tyr Asp Ala Ala Thr 20 25 30
Glu lie Arg Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 64 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223 >比較序列 <400> 64
Thr lie Pro Gly Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Ala Asn Gly Asn Asp lie He Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30 lie lie Val Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 65
<211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 65 -30- 98582.doc 200538153
Thr lie Ala Asp Lys Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ser lie Thr Thr 1 5 10 15
Gly Glu Gly Asn Asp He Lys Thr Ala Gin Ala Tyr Asp Thr Ala Ala 20 25 30
Val Val Lys Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 66 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 66
Thr lie Pro Ser Lys Leu Val Pro Ala Gly Gly Tyr Ala lie Thr Ala 1 5 10 15
Lys Asn Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Ala Gin Tyr Asp Ala Ala Gly 20 25 30
Glu He Val Asn Asn 35
Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys Val Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 67 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 67
Thr lie Pro Gly Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Thr Gly Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30 -31 - 98582.doc 200538153 lie lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 68 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 68
Thr lie Pro Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly His Tyr 15 10
Ala lie Ala Asn 15
Gly Thr Gly Asn Asp lie Thr Thr Gly Lys Asp Tyr 20 25
Asp Ser Ala Thr 30
Tyr lie Cys Gly Ser 45
Val lie Gin Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met 35 40
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 69 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 69
Thr He Pro Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asp 15 10 15
Ser Thr Gly Gly Asp lie Thr Thr Ala Ala Lys Tyr Asp lie Thr Asp 20 25 30
Lys Val Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Cys 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 70 -32- 98582.doc 200538153 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223 >比較序列 <400> 70
Thr lie Ala Glu Lys Leu Thr Pro Thr Gly Asn Tyr Ser lie Thr Thr 15 10 15
Asn Ser Gly Thr Asp lie Val Thr Pro Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30
Val lie Arg Asn Thr Thr Glu Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Ala Thr Ala 50 55 60 <210> 71
<211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 71
Thr He Pro Glu Glu Leu Thr Pro Glu Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Arg Ser Gly Asn Asp lie Ala Thr Ala Glu Gly Phe Gly Ser Ala Asp 20 25 30
He lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 72 <211> 62 <212> PRT <213> 人工 <220> <223〉 比較序列 <400> 72 -33- 98582.doc 200538153
Thr lie Ala Glu Lys Leu Thr Pro Thr Gly Asn Tyr Ser lie Thr Thr 15 10 15
Asn Ser Gly Thr Asp lie Val Thr Pro Ser Gly Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30
Val lie Arg Asn Thr Thr Glu Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Ala Thr Ala 50 55 60 <210> 73 <211> 62 <212> PRT <213>人工的
<220> <223>比較序列 <400> 73
Thr lie Ser Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Arg lie Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Glu Ala Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val He Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Arg Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 74 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 74
Thr lie Ala Asp Lys Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ser lie Thr Thr 15 10 15
Gly Glu Gly Asn Asp lie Lys Thr Ala Gin Ala Tyr Asp Thr Ala Ala 20 25 30
Val Val Lys Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser -34- 98582.doc 200538153 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 75 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 75
Thr lie Gly Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ser He Thr Asn 15 10 15
Gly Ser Gly Asn Asp lie Ala Thr Ala Asn Ala Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Thr Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Ser Thr Ala 50 55 60 <210> 76 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 76
Thr lie Pro Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ser lie Thr Asn 15 10 15
Asn Ala Asn Asn Asp He Ala Thr Ala Ala Asp Tyr Asp Ser Thr Gly 20 25 30
Val lie Lys Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr Thr Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Ser Thr Ala 50 55 60 <210> 77 <211> 62 98582.doc 35- 200538153 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 77
Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 10 15
Thr He Ser Glu Glu 1 5
Asp lie Gly Asn Asp 20 lie Thr Thr Pro Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Asp 25 30
Thr lie Lys Asn Asn 35
Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr Val Cys Gly Ser 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp 50
Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 55 60
0 12 3 1111 2 2 2 2 VVV V 78 62
PRT 人工的 <220> <223>比較序列 <400> 78
Leu Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 10 IS
Thr lie Pro Glu Asp 1 5
Gly Lys Gly Asn Asp 20
He lie Arg Asn Asn 35 lie Thr Thr Ala Thr Gly Tyr Asp Thr Ala Asp 25 30
Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp 50
Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 55 60 0 12 3 1111 2 2 2 2 <<<< 79 62 PRT 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 79 Thr lie Pro Glu Val
Leu Thr Pro Ala Gly Asn Tyr Ser lie Thr Thr 985S2.doc -36- 200538153 15 10 15
Gly Ser Gly Asn Asp lie Val Thr Ala Lys Asp Tyr Asp Gly Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 80 <211> 62 <212> PRT <213>人工的
<220> <223 >比較序列 <400> 80
Thr lie Ser Glu Arg Leu Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Arg Val Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Glu Gly Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Lys lie Lys Asn Ala Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
<210> 81 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 81
Thr lie Pro Glu Glu Leu lie Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Thr Asn 15 10 15
Ser Thr Gly Ala Asp lie Thr Thr Arg Ala Glu Tyr Glu Ser Ala Asp 20 25 30
Glu lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr He Cys Gly Ser 35 40 45 -37- 98582.doc 200538153
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 82 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 82
Thr He Pro Glu Asp Leu Val Pro Val Gly Asn Tyr Ala He Thr Thr 15 l〇 15
Gly Ser Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Ser Glu Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val Val Arg Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Gin lie Ser Ser Thr Ala 50 55 60 <210> 83 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 83
Thr lie Pro Ser Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asn Tyr Ala lie Thr Ser IS 10 15
Gly Ser Gly Asn Asp lie Glu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Arg Asn Asn Thr Asn Phe Arg Ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 3S 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 84
<211> 62 <212> PRT 38- 98582.doc 200538153 <213> 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 84
Thr lie Ala Glu Asp Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Ser 1 5 10 15
Gly Asn Gly Asn Asp He Thr Thr Gly ser Glu Tyr Asp Ser Thr Glu 20 25 3〇
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala
0 12 3 1111 2 2 2 2 VVV V 85 62 PRT人工的 <220><223>比較序列 <400> 85 Thr He Pro Glu Gin Leu Thr Pro Ala Gly He 15 10
Ser lie Thr Ala 15
Ser Asn Gly Thr Asp lie Thr Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Glu 20 25 30
Thr lie Val Asn Thr Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Asp Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 86 <211> 62 <212> PRT<213>人工的 <220><223>比較序列 <400> 86 Thr He Gly Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Asn 1 5 10 I5 98582.doc 39- 200538153
Ser Ser Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Ser Gin Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30 lie lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 87 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220>
<223 > 比較序列 <400> 87
Thr lie Pro Glu Gin Leu Thr Pro Ala Gly lie Tyr Ser lie Thr Ala 15 10 15
Ser Asn Gly Thr Asp lie Thr Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Glu 20 25 30
Thr lie Val Asn Thr Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Asp Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 88 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 88
Thr lie Ala Thr Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Ser Asn Gly Asn Asp lie Val Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Ser 20 25 30
Glu He Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cys Gly Ser 35 40 45 40- 98582.doc 200538153
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 89 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 89
Thr lie Pro Glu Gin Leu Thr Pro Ala Gly lie Tyr Ser lie Thr Ala 15 10 15
Ser Asn Gly Thr Asp He Thr Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Glu 20 25 30
Thr lie Val Asn Thr Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 90 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223 >比較序列 <400> 90
Thr lie Pro Glu Gin Leu Thr Pro Ala Gly lie Tyr Ser lie Thr Ala 15 10 15
Ser Asn Gly Thr Val He Thr Thr Ala Ala Gly Tyr Asp Ala Ala Glu 20 25 30
Thr lie Val Asn Thr Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 91 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 -41 - 98582.doc 200538153 <220> <223 >比較序列 <400> 91
Thr lie Gly Glu Lys Leu Val Pro Ala Gly Asp Tyr Ala He Thr Asn 15 10 15
Gly Ser Gly Asn Asp He Thr Thr Ala Asn Gin Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 3〇 lie lie Arg Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
<210> 92 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 92
Thr He Ala Glu Arg Leu Thr Pro Gly Gly Asp Tyr Ala He Thr Ser 15 10 15
Gly Asn Asn Asn Asp He Thr Thr Ala Ala Asp Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30 lie lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Gly 50 55 60 <210> 93 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 93
Thr lie Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Ala lie Thr Thr 15 l〇 15 -42- 98582.doc 200538153
Gly Asp Asn Asn Asp He Thr Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Ala Ala Ser 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Ser Thr Gly 50 55 60 <210> 94 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220>
<223 >比較序列 <400> 94
Thr lie Pro Glu Lys Leu Thr Pro Ala Gly Lys Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Gly Asn Gly Asn Asp He Thr Thr Ala Gin Gly Phe Asp Ser Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asp Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Asp lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 95 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 95
Thr lie Pro Lys Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Ser 15 10 15
Gly Asp Gly Asn Asp He Thr Thr Ala Gin Gin Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Lys Gly Met Tyr Val Cys Gly Ser 35 40 45 43 98582.doc 200538153
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys He Ser Asn Thr Ala 5〇 55 60 <210> 96 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 96
Thr He Pro Glu Lys Leu He Pro Ala Gly Asp Tyr Ala He Thr Asn 1 5 10 is
Asn Gly Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 3〇
Val lie Xjys Asn Asn Thjr Asn Phe Airg Gly Met Tyr lie Cys Gly Se3T 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 97 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 97
Thr lie Ser Glu Lys Leu He Pro Ala Gly Asp Tyr Ala He Thr Asn 1 5 10 is
Asn Arg Gly Asn Asp He Thr Thr Ala Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 98 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 44- 98582.doc 200538153 <220> <223 >比較序列 <400> 98
Thr lie Ser Glu Glu Leu lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Ser Asn 1 5 10 15
Ser Ser Gly Asn Asp lie Thr Thr Pro Ser Ala Tyr Asp Thr Ala Ser 20 25 30
Val lie Asn Asn Thr Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
<210> 99 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223 >比較序列 <400> 99
Thr lie Pro Asn C5lu I^u lie Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Val Asn 1 5 x〇 15
Glu Ser Asn Asn Asp lie lie Thr Lys Ser Gly Tyr Glu Ser Ala Thr 20 25 30
Lys lie Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
<210> 100 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 100
Thr lie Ser Glu Glu Leu lie Pro Thr Gly Asp Tyx Ala lie Thr Asn 1 5 i〇 15 -45- 98582.doc 200538153
Gly Thr Gly Asn Asp He Ser Thr Ser Ser Glu Tyr Asp Ala Ala Glu 20 25 30
Val lie Arg Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 101 <211> 62 <212> PRT <213> 人工的 <220> <223> 比較序列 <400> 101
Thr lie Pro Ser Glu Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Val Asn 15 10 15
Glu Thr Asn Asn Asp 工le Val Thr Arg Ala Gly Tyr Glu Ser Ala Ser 20 25 30
Lys He Thr Asn Asn Thr Asn Phe Lys Ser Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 102 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 102
Thr He Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 10 15
Gly Asp Asn Asn Asp He Thr Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Ala Ala Ser 20 25 30
Val lie Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Ser Thr Ala -46- 98582.doc 200538153 50 55 60 <210> 103 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 103
Thr lie Pro Ser Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Arg 1 5 10 15
Gly Asp Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Ala Ala Asn 20 25 30
Thr lie Glu Asn Asn Thr Asn Phe Arg ser Met Tyr lie Cys Gly Ala 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 104 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 <220> <223>比較序列 <400> 104
Thr lie Pro Glu Glu Leu Thr Pro Ala Gly Lys Tyr Ala lie Thr Thr
Ser lie Gly Asn Asp lie He Thr Ala Ala Ala Tyr Asp Ala Ala Asp 20 25 30
Val He Lys Asn Asp Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr lie Cys Gly Ser 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60 <210> 105 <211> 62 <212> PRT <213>人工的 9S582.doc 47- <220> 200538153 <223 >比較序列 <400> 105
Thr He Ser Glu Lys Leu Thr Pro Ala Gly Asp Tyr Ala lie Thr Thr 15 i〇 15
Ser Asn Gly Asn Asp lie Thr Thr Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Ala Asp 20 25 30
Gly Ser
Val He Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly Met Tyr He Cys 35 40 45
Leu Gin Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys lie Ser Asn Thr Ala 50 55 60
-48- 98582.doc
Claims (1)
- 200538153 十、申請專利範圍： 1. 一種疫苗，其係用於使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒之免疫 力，其包括用以產生免疫反應之有效量之FC V-Diva病毒 株及醫藥上可接受之載劑。 2. 如請求項1之疫苗，其中該FCV-Diva病毒株包含編碼SEQ ID NO : 2之核酸。 3. 如請求項1之疫苗，其中該FCV-Diva病毒株包含編碼SEQ ID NO : 1之核酸序列。 _ 4.如請求項1之疫苗，其包括一佐劑。 5. 如請求項1之疫苗，其中該FCV-Diva病毒株為經減毒的 活病毒。 6. 如請求項1之疫苗，其中該FCV-Diva病毒株經失活處 理。 7. 如請求項1之疫苗，其包括至少一種其它貓嵌杯狀病毒 病毒株，該病毒株係選自由：FCV-F9、FCV-M8、FCV-255及FCV-2280所組成之群。 ® 8.如請求項1之疫苗，其包括至少一種其它貓病原體，該 病原體係選自由·貌癌療病毒、雜白血病病毒、描免疫 缺乏病毒、_彼衣菌及豸苗痕病毒、狂犬病病毒及支氣管 • 敗血性博德特拉菌（Bordetella bronchiseptica)所組成之 - 群。 9. 一種疫苗，其係用於使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒之免疫 力，其包括用以產生免疫反應之有效量之編碼FCV-Diva 衣殼蛋白或其特異免疫原性片段之核酸及醫藥上可接受 98582.doc 200538153 之載劑，其中該核酸係以人工操縱方式連接至異種啟動 子序列。 I 〇·如請求項9之疫苗，其中該核酸係在質體中。 II ·如請求項9之疫苗，其中該核酸係在重組病毒載體中。 12·如請求項11之疫苗，其中該重組病毒載體係選自由：貓 癌療病毒、浣熊痘病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒、勝利 基森林（Semlicki Forest)病毒、辛德比斯（sindbis)病毒及 牛痘病毒所組成之群。 13·如請求項9之疫苗，其中該編碼FCV-Diva衣殼蛋白之核 酸編碼SEQ ID NO : 2之胺基酸序列或其特異免疫原性片 段。 14·如請求項9之疫苗，其中該編碼FCV-Diva衣殼蛋白之核 酸包含SEQ ID NO : 1之序列。 15_ —種疫苗，其係用於使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒之免疫 力’其包括用以產生免疫反應之有效量之經分離FCV-Diva衣殼蛋白或其特異免疫原性片段，及醫藥上可接受 之載劑。 16·如請求項15之疫苗，其中該FCV-Diva衣殼蛋白包含SEq ID NO · 2之胺基酸序列或其特異免疫原性片段。 17· —種方法，其係用於使貓產生對抗貓嵌杯狀病毒之免疫 力’其包括投與貓有效劑量之如請求項1至丨6中任一項 之疫苗。 98582.doc
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