TW200427839A - Method of microwave-assisted protein array fabrication and full automatic protein array system - Google Patents

Description

200427839 玖、發明說明： 【發明所屬技術領域】 本發明係關於快速的蛋白質陣列製作之方法與全自動 蛋白質陣列系統，且特別係關於由微波促進蛋白質陣列製 作方法與全自動蛋白質陣列系統。 【先前技術】 為了要維持蛋白質之立體結構及其功能活性，要製造蛋 白質陣歹ij ( p r 〇 t e i n a r r a y )或稱蛋白質晶片，相對上要比 基因晶片複雜很多，有了基因晶片的技術為基礎，蛋白質 晶片繼承了相關的技術平台而進一步向上發展，但仍需克 服以下幾點關鍵技術，例如如何有效地固定蛋白質 (immobilize protein)到晶片上、選取適當的捕捉蛋白質 (capture protein)、以及如何判讀實驗的結果等。 目前以玻璃為載體的蛋白質陣列（晶片）製造，主要是 依據 Gavin MacBeath 及 Stuart Schreiber 在 2000 年， S c i e n c e 2 8 9 : 1 7 6 0 - 3所發表的製作方法。將捕捉蛋白質以 含有4 0 %甘油的點製溶液（s p〇11 i n g s〇1 u t i〇η )稀釋後，利 用點製機（a r r a y e r )點製在含醛基表面的玻片上，再於室溫 或 41中靜置三小時或過夜，使得點上去的蛋白質可以固 定在玻片上。 製作完成的蛋白質陣列在進行檢測步驟之前，需進行阻 斷（b丨〇 c k i n g )步驟，以防止後續實驗出現高背景的情況。 習知技術中阻斷作用所需時間多為一小時左右，整個利用 蛋白質陣列檢測的過程需時至少6小時，或至隔天才能得 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 5 200427839 到判讀之結果。如此，在製作及檢測的過程中耗費許多時 間。 【發明内容】 本發明利用微波能量移轉的方法，不但減少了蛋白質陣 列製作時程，也縮短了阻斷作用所需時間。在製程方面， 捕捉蛋白質無須加任何甘油之類的物質，在利用任何點製 機點製在經醛基高分子表面處理的玻片上後，立即放入微 波爐中以強微波加熱，即可加速蛋白質的固定。隨後，再 將蛋白質陣列放入P B S M ( P B S緩衝液加上脫脂奶粉其重量/ 體積為2 % )中以微波進行阻斷作用；之後以P B S T ( P B S緩衝 液+Tween2 0，其重量/重量為0.0 2 5 %)，利用攪拌子攪動清 洗，之後再以PBS缓衝液浸潤，離心甩乾後即可進行後續 檢測實驗，或予以冷藏備用。檢測實驗係利用蛋白質互動 (i n t e r a c t i ο η )原理，如抗體與抗原間之結合、蛋白質與蛋 白質之結合、或是酵素（enzyme)與基質（substrate)之結合 等。結果顯示除了可以快速的方法製成蛋白質陣列外，同 時並能兼具檢測之高敏感度，以及良好的保存特性。 【實施方式】 絕大部分的蛋白質及多肽類分子在結構的外圍都有大 量裸露的帶正電胺基酸如 a r g i n i n e及 1 y s i n e，它們所含 的 N Η 2胺基，當與表面具有活性酿基之載體（c a r r i e r )(如 玻片）接觸時，胺基會與醛基產生化學反應，胺基氮原子 上之電子對會與醛基上的碳原子反應，隨後透過脫水反 應，便形成所謂的S c h i f ί基共價結合，而使蛋白質固定於 6 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 200427839 載體上。利用此原理，不同的蛋白質可以被密集的微陣列 點製成蛋白質陣列（晶片），並以例如免疫螢光反應法，檢 測檢體中目標蛋白質表現情形。但是依習知技術之此實驗 反應過程需要非常長的時間才能達到有效且具有可信度的 結果。 本發明係改良並發展出新的實驗方法，可縮短蛋白質陣 列（晶片）的製作及檢測時間，於6 0至9 0分鐘以内完成整 個流程。 以微波方式輔助固定蛋白質分子於玻璃（或其他固態材 質）載體的獨特技術，主要是加速上述之脫水反應而使蛋 白質分子與醛基之間形成S c h i f f基共價鍵結。如圖1 a之 示意圖。 高頻率的微波不會造成分子的離子化（i ο n i z a t i ο η 〇 f ηι ο 1 e c u 1 e s )及化學鍵的破壞，而是引起雙極性分子如水分 子，使其在溶液中前後移動或旋轉，再加上少部分的離子 傳導機制，將使蛋白質溶液中分子之移動依電場方向排 列，使得點製在玻片上的蛋白質具有一致的排列方向，同 時微波作用可使得蛋白質結構改變而展開，如圖1 b所示。 此外，微波能量的移轉是從蛋白質溶液之内部中開始，而 均勻地向外展開；加熱時載體本身並不會過度發熱，可避 免一旦載體被加熱，蛋白質溶液會很快地被蒸發掉；最後， 微波能量的移轉會隨著電源的關閉而立即停止，而不會有 能量的繼續移轉，因此微波能量具有可加快蛋白質分子與 玻片載體表面的官能基碰撞反應的速度之功能，使後續的 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 7 200427839 化學反應能更有效率。 因此本發明利用微波技術縮短蛋白質陣歹|J ( p r〇t e i η a r r a y )製作及檢測時間之方法，以抗原陣歹](a η ΐ i g e n a r r a y )為例，包含下歹1J步驟： a .將抗原蛋白以點製機點製於含醛基表面之玻片上； b .將上述玻片以微波處理3 0至9 0秒，較佳為5 0至7 0 秒； c .加入進行阻斷（b 1 〇 c k i n g )作用之P B S Μ緩衝液，其重 量/體積為2 %之脫脂奶粉於P B S緩衝液進行微波阻斷 處理1至5分鐘，較佳為2至4分鐘； d .分別以 P B S T緩衝液，其重量/重量為0 . 0 2 5 %之 T w e e η 2 0於P B S緩衝液中，及以P B S緩衝液清洗，並 以1 2 0 0 R P Μ離心甩乾； e . —級抗體（稀釋於P B S Μ Τ緩衝液（P B S緩衝液、脫脂奶 粉及T w e e η 2 0 ))於室溫反應3 0分鐘，並重複步驟d 清洗， ί .二級抗體（稀釋於P B S Μ T緩衝液（P B S緩衝液、脫脂奶 粉及T w e e η 2 0 ))於室溫反應3 0分鐘，並重複步驟d 清洗；以及 g .以晶片掃描儀判讀。 其中該微波強度的定義為頻率介於300MHz至300GHz之 電磁波，其波長分別為1 m m至1 m，應用於加熱的微波，其 通常強度係介於2 4 5 0 Μ Η z 土 5 ◦ Μ Η z。本發明使用之微波強度 即為 2.00 至 3.00 GHz。 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 8 200427839 更詳細的說明，本發明可應用於表面含醛基玻片（如 Associates 及 Telechem International, Inc 製之表 醛基玻片），或其他具類似表面結構的醛基塗層玻片、 聚賴氨酸塗層玻片及F A S T玻片（S S，硝化纖維）等。 itb外，運用此技術可以快速地製成檢測個體中抗體 原陣列，抗原的種類可包括細胞萃取物、病毒感染細 取物、cDNA 表現質體轉染（transfected)細胞萃取物 組蛋白、重組嗤茵體、多胜肽（polypeptides)等，運 圍包括（1 )、傳染病偵測如B型肝炎、C型肝炎、S A R S 病毒感染寺，（2)、自體免疫疾病之檢測。 此技術也可製成抗體陣列（a n t i b 〇 d y a r r a y )，即將 點製在玻片上後，運用在偵測檢體中之抗原。因此， 術在臨床檢驗上亦可運用於一全自動化之蛋白質陣 統 。 以下配合實施例進一步說明本發明，但不應將其解 限制本發明之範圍。 (實施例1 :疱疹病毒抗原陣列） 抗源之取得： 以單純疱疹病毒第一型（H S V - 1 )的國際株 K 0 S感染 細胞（H e ρ - 2 )後，在顯微鏡下觀察是否有出現細胞病變 (cytopathi c effect ； CPE)，若有貝U 以 5cc 之 PBS 緩 將細胞刮下，並以反覆冰凍解凍方式將細胞打破，離 取上清液並測其蛋白質的濃度。 蛋白質陣列（晶片）之製法： 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 9 CEL 面含 及多 之抗 胞萃 、重 用範 冠狀 抗體 此技 列系 釋為 喉癌 現象 衝液 心後 200427839 1 . 將上述感染細胞萃取物取2 0 μ 1加入9 6孔盤中，以 1鋼針點製於醛基塗層玻片上； 2. 待點製完成，置入微波爐（SAMPO公司，天廚）以能 量強度2 · 4 5 G Η ζ (約8 0 0 W )進行微波加熱6 0秒； 3 . 以P B S Μ緩衝液微波力π熱3分鐘以進行阻斷作用； 4 . 加入室溫之P B S Τ緩衝液以攪動只授動清洗3分鐘， 之後再以P B S緩衝液浸潤2分鐘，離心1 2 0 0 R Ρ Μ甩 乾約1分鐘； 5 . 加入受單純范療病毒第一型感染病患血清（一級抗 體），於室溫反應3 0分鐘，然後重複進行步驟4之 清洗動作； 6 . 加入二級抗體，於室溫反應3 0分鐘，然後重複進行 步驟4之清洗動作； 7 · 以晶片掃描儀（A X ο n G e n e p i X 4 Ο Ο Ο Β )判讀結果。 (比較例1 ··製作及檢測時間之比較） 將實施例 1 中所製備的檢體樣品，以習知的方法 (Science 2000，289 : 1760-1763; Nature Medicine 2002, ν ο 1 . 8， Ν ο . 3 )製作蛋白質陣歹，步驟及反應間依下表所 述 ： 326\專利說明書(補件)\92屬\芯寶科技-924502 10 200427839 表 1、 習 知 蛋 白 質 陣 列 製法之操 作 步驟及時 間 習 知 蛋 白 質 陣 列 製 法 步驟 反應時間 點 製 溶 液 PBS 加 上 4 0 %甘油 3 小時至 隔 夜 阻 斷 作 用 溶 液 1 小時以 上 清 洗 溶 液 清 洗 及 甩 乾 3 0至40 分 鐘 一 級 抗 體 反 應 1 小時以 上 清 洗 溶 液 清 洗 及 甩 乾 30 至 40 分 鐘 二 級 抗 體 反 應 1 小時以 上 清 洗 溶 液 清 洗 及 甩 乾 30 至 40 分 鐘 從點製檢體到送至晶片掃描儀判讀結果總時間至少需 要 6小時至隔天才能完成，而經微波促進之蛋白質陣列製 法則可縮短至6 0至9 0分鐘以下。以微波處理之二步驟分 別與傳統方法相對步驟所需時間比較如下表2所示： 表2製作蛋白質陣列所需時間之比較 製 作 方 法 使 用 玻 片 固 定 蛋 白 質 阻 斷 作 用 時 時 間 間 習 知 方 法 醛 基 塗 層 3 小 時 以 上 1 小 時 以 上 微 波 促 進 醛 基 塗 層 1 分 鐘 以 内 3 分 鐘 以 内 法 (比較例2 :蛋白質陣列檢測敏感度之比較） 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 11 200427839 以習知方法（S c i e n c e 2 0 0 0，2 8 9 : 1 7 6 0 - 1 7 6 3 ; N a t u r Medicine 2002, vol. 8，N o · 3 )及微波促進法，分別將 I g G作為抗原點製在醛基塗層玻片上，再加上以螢光劑 或C y 5標記之兔子抗人類I g G抗體進行反應，最後以 4 0 0 0 B Laser S c a η n e r作訊號伯測。結果顯示，以不 度之人類I g G分別連續點製在玻片上六次，再分別以 稀釋濃度的抗人類I g G抗體（1 : 1 0 0及1 : 2 0 0 )進行反J 得之螢光影像進行分析後，發現微波促進法較習知方 得到略強的螢光強度，亦即微波促進法具有略高的偵 感性。 實驗結果如圖2 a、2 b (習知方法）及圖2 c、2 d (微波 法）所示，不同濃度之人類I g G分別以二種稀釋濃度的 (1 ·. 1 0 0及1 : 2 0 0 )進行反應，所得之螢光強度統計迴 結果，微波促進法之r2值為0 . 9 5 1及0 . 9 6 8，略高於 方法之0.942及0.950。 (實施例2 :蛋白質陣列之保存） 將無感染及感染單純范療病毒之細胞由培養瓶中刮 下，以反覆冰凍解凍方式將細胞打破，將該細胞萃取 別點製在玻片上連續四次共四片，點製完成後將玻片 3 0至9 0秒，之後於4 °C冰箱中分別儲藏一天、一週、 月及二個月。當儲存時間到達之後，分別取出以一級 (小鼠抗疱疹病毒第一型g D抗體），及二級抗體（以螢 C y 3標記之兔子抗小氣I g G抗體）進行免疫反應，結果 3所示，經微波處理過後之蛋白質陣列至少可以儲存. 326\專利說明書(補件)\92屬\芯寶科技-924502 12 人類 I Cy 3 Axon 同濃 二種 ί，所 法可 測敏 促進 抗體 歸的 習知 物分 微波 一個 抗體 光劑 如圖 二個 200427839 月仍可保存抗原的穩定性。若再經防腐劑的使用及/或儲存 於-2 0 °C以下，儲存時間應可再延長至六個月以上。 此外，本發明之蛋白質陣列快速製作方法除了操作時間 短外，尚具有另一項特色，即從點製樣品至晶片掃描之過 程，可大量且同時進行。本發明亦可運用於「全自動化蛋 白質陣列系統」之研發及應用，將可節省大量的時間及耗 材，可運用在臨床檢驗。因此該「全自動化蛋白質陣列系 統」主要包含以下部分： 電腦管理裝置（1 0 ); 編碼裝置（2 0 )，可將待測玻片（1 1 )貼上條碼以提供 檢體資訊； 冷藏裝置（3 0 )，以儲存欲被點製之抗原或抗體； 機器手臂裝置（4 0 )，可分別進行點製樣品之動作； 微波裝置（5 0 )，可加速固定蛋白質及阻斷作用的時間； 微量分注裝置（6 0 )，可將蛋白質陣列進行一連串清洗、 抗體抗原反應等免疫染色實驗步驟；及 晶片判讀裝置（7 0 )，可掃描免疫染色檢測結果之訊號。 該全自動蛋白質陣列系統之檢測流程，如圖 4 之方塊 圖，將電腦管理裝置（1 0 )連結至上述各個裝置，以軟體 控制及設定各檢測步驟流程，首先將各待製作之玻片（11 ) 於編碼裝置（2 0 )貼上特定條碼，隨後機器手臂裝置（4 0 ) 會根據輸入之檢測項目至冷藏裝置（3 0 )中沾取抗原或抗 體並進行點製動作。點製完畢，蛋白質陣列隨即送入微波 裝置（5 0 )以微波固定蛋白質及後續阻斷作用，並輔以加 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 13 200427839 入試劑時可分隔玻片上檢體之分隔構件（1 2 )，以微量分注 裝置（6 0 )吸取試劑容器（61)中之緩衝試劑及偵測抗體 進行各實驗步驟，完成後於晶片判讀裝置（7 0 )進行掃描 判讀結果，並於電腦管理裝置（1 0 )中進行分析，如此將 可大大節省人力，並減低人為操作的誤差。 此外，由於本發明之快速蛋白質陣列製作方法可運用於 各種蛋白質檢體，將其固定及阻斷作用的製作程序可由約 4 小時縮短為數分鐘，更可略提高偵測敏感度。因此本發 明所揭露之方法之應用範圍已涵蓋目前蛋白質陣列所常用 之各種檢體，其廣泛應用性（如上述實施例）可應用於現有 蛋白質陣列之製作過程之改良，進而縮短大部分之蛋白質 陣列檢測之時間。 現今的生醫感測器研發以多功能、微小化，及平行處理 等陣列或晶片概念為主軸，以提供封閉式無菌反應條件， 並具有下列如高產量及多目標平行分析能力、需樣品與化 學藥品量少、分析速度快、反應及偵測速度提高、分析系 統輕便、與成本低，可直接應用於現場診斷節省時間等特 點為發展目標，「全自動蛋白質陣列系統」則提供了符合上 述條件之一快速簡便的感測設備。 本發明可在不離開本發明之精神及基本特徵下作成各 種特定之例示。本發明之範圍為由隨附之申請專利範圍所 限定，而並非由上述說明所限制，所有與申請專利範圍意 義相等之變化均應包含於本發明中。 【圖示簡單說明】 14 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 200427839 圖1 ( a )表示蛋白質胺基會與玻片上醛基產生化學反 應，胺基氮原子上之電子對會與醛基上的碳原子反應，隨 後透過脫水反應，便形成所謂的S c h i f f基共價結合，而使 蛋白質固定於載體上； 圖1 ( b )為微波促使蛋白質排列方向一致性及結構展開 之示意圖。 圖2 ( a )為以習知方法對不同濃度之人類I g G以稀釋濃度 1 : 1 0 0的抗體進行反應，所得之螢光強度統計迴歸的結果； 圖2 ( b )為以習知方法對不同濃度之人類I g G以稀釋濃度 1 : 2 0 0的抗體進行反應，所得之螢光強度統計迴歸的結果； 圖2 ( c )為以微波促進法對不同濃度之人類I g G以稀釋濃 度 1 : 1 0 0的抗體進行反應，所得之螢光強度統計迴歸的結 果； 圖2 ( d )為以微波促進法對不同濃度之人類I g G以稀釋濃 度 1 : 2 0 0的抗體進行反應，所得之螢光強度統計迴歸的結 果。 圖3為經微波處理過後之蛋白質陣列於4 °C冰箱中儲藏 一天、一週、一月、二月的結果。 圖4為全自動蛋白質陣列系統之檢測方塊圖。 (元件符號說明） 10 電腦管理裝置 11 玻片 12 分隔構件 2 0 編碼裝置 15 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 200427839 3 0 冷藏裝置 40 機器手臂裝置 5 0 微波裝置 6 0 微量分注裝置 6 1 試劑容器 7 0 晶片判讀裝置 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 16

Claims (1)

1. 200427839 拾、申請專利範圍： 1 . 一種由微波促進蛋白質陣列製作之方法，其方法包含 下列步驟： 將蛋白質點製於含醛基表面之玻片，以製成蛋白質陣 列， 將蛋白質陣列放入P B S M ( P B S緩衝液加上脫脂奶粉其重 量/體積為2 % )中進行阻斷作用， 以PBST(PBS緩衝液+ Tween20，其重量/重量為0.025 %) 清洗， 再以P B S緩衝液浸潤，離心甩乾後進行檢測實驗，或予 以冷藏備用； 其特徵在於以微波方式固定點製陣列，及以微波方式加 速阻斷作用。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中該微波強度為 2. 0 0 至 3.00 GHz ° 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其微波固定點製陣列 的時間為3 0至9 0秒。 4 .如申請專利範圍第1項之方法，其微波加速阻斷作用 之時間為1至5分鐘。 5 .如申請專利範圍第1項之方法，可運用在含醛基表面 玻片及、多聚賴氨酸塗層玻片及F A S T玻片（S S，硝化纖維） 等。 6 .如申請專利範圍第1項之方法，該蛋白質種類包括各 式抗體、抗原及基質（substrate)。 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 17 200427839 7 . —種全自動蛋白質陣列系統，包含： 一電腦管理裝置，對該全自動蛋白質陣列系統設定檢測 流程，及分析掃描結果，並輸出結果報告； 一編碼裝置，由該電腦管理裝置之設定，將一待製備玻 片貼上條碼，作為對應檢體偵測結果之資訊儲存管理； 一冷藏裝置，由該電腦管理裝置之設定，冷藏儲存欲被 點製之蛋白質，如抗原或抗體； 一機器手臂裝置，由該電腦管理裝置設定點製流程，從 該冷藏裝置中取蛋白質樣品，並將其點製於該編碼後之玻 片； 一微波裝置，由該電腦管理裝置設定微波強度及時間， 將該蛋白質固定於該玻片上，並進行阻斷作用； 一微量分注裝置，由該電腦管理裝置設定檢測流程，將 該玻片進行清洗、抗體抗原反應等免疫染色實驗操作；及 一晶片判讀裝置，掃描該玻片之免疫染色檢測結果，並 將檢測之訊號送至該電腦管理裝置。 326\專利說明書(補件)\92-06\芯寶科技-924502 18 200427839 拾壹、圖式： 326\專利說明書(補件)\92屬\芯寶科技-924502 19