JPH0643161A - 抗原抗体反応の促進方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】免疫学的測定方法における抗原抗体反応を、効
果的に促進する方法を提供する。 【構成】免疫学的測定方法における抗原抗体反応を、マ
イクロ波の照射によって促進する。 【効果】本発明の免疫学的測定方法は、反応時間を短縮
するだけでなく測定感度の著しい向上をもたらす。また
本発明による抗原抗体反応の促進は、光学測定や加熱に
対して不安定な成分への影響が小さいので、幅広い免疫
学的測定法に対して適用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的測定方法にお
ける抗原抗体反応の促進方法に関するものである。免疫
学的測定は、特異性、感度、操作性等に優れ、医学領
域、生物学領域を中心に広く利用されている技術であ
る。

【０００２】

【従来技術の問題点】一般に免疫学的測定方法における
抗原と抗体の反応速度は、両者の衝突頻度によって決定
される。すなわち両者の衝突頻度が高いほど反応は早く
進行し、感度の向上にもつながる。抗原抗体反応に参加
する各種の成分が高濃度である場合には反応も迅速に起
こることになるが、逆に低濃度の成分をより高い感度で
検出しようとするときには反応時間を長く取らなければ
ならない。そこで反応時間の短縮等を目的として、ポリ
エチレングリコールや界面活性剤等の添加が試みられた
が、特異性や効果の点で不十分なことが多かった。

【０００３】ところで免疫学的測定方法には、不溶性担
体に免疫学的活性成分を結合させたものを利用する場合
がある。不溶性担体は結合相（Ｂ）と遊離相（Ｆ）の分
離（Ｂ／Ｆ分離）や、抗原抗体反応を不溶性粒子担体の
凝集として検出するために用いられる。ところが不溶性
担体に免疫学的活性成分を固定した場合には、抗原と抗
体の両方が液相中に存在する場合と比べ、両者の出会い
の機会が制限されていることになる。抗原抗体反応に参
加する成分の運動性が、不溶性担体上に固定されること
によって制限されるためである。したがって、不溶性担
体を利用する免疫学的測定方法においては、抗原抗体反
応の促進が一層大きな課題となる。

【０００４】そこで、振とう、かくはん、加熱等による
外部からのエネルギーで不溶性担体そのもの、あるいは
液相側に含まれる免疫学的活性成分に運動性を与えて反
応を促進する方法が提案されている。振とうやかくはん
は、不溶性担体そのものを振動させるのに有効な手段で
あるが、特殊な装置を要する場合もある。ことに反応と
平行して光学測定を行いたい場合には、駆動系を光学系
と組み合わせる必要があり、装置はどうしても複雑にな
る。更に光学測定時の振とうやかくはんは測定誤差につ
ながる光学的な揺らぎを生じる場合がある。特に抗原と
抗体の両者が不溶性粒子担体上に固定されているような
場合には、不溶性粒子担体の振動が光学的測定精度を大
きく左右する。ハプテンを、抗ハプテン抗体結合粒子と
ハプテン結合粒子で凝集阻止反応によって検出しようと
する場合等がこのケースに相当する。加えて十分なかく
はんや振とうを行うためには、ある程度の液量が必要と
なる点も見逃せない。試薬量や検体量は、できるだけ小
量であった方が経済的であることは言うまでもない。

【０００５】加温による免疫反応の促進は機械化も容易
なことから広く利用されてはいるものの、その促進効果
は十分なものとは言い難い。したがってより強い促進効
果を得るためにはかなりの高温が必要となるので、温度
に対して敏感な抗原等を用いる場合には適用できない。
これら反応促進技術の他にも、超音波照射（特開昭６１
−６６１５０、特開昭６１−７１９５７）や、高分子物
質の添加（特開昭６１−７９１６４）による方法が提案
されているが、未だ実用化されていないのが現状であ
る。

【０００６】

【発明の課題】本発明の課題は、免疫学的測定方法にお
ける抗原抗体反応をより効果的に促進する方法を提供す
ることにある。

【０００７】

【発明の構成】本発明は、免疫学的測定方法における抗
原抗体反応を、マイクロ波照射によって促進することを
特徴とする抗原抗体反応の促進方法である。

【０００８】本発明の対象となる免疫学的測定方法と
は、粒子凝集反応法、免疫比濁反応法、免疫沈降反応
法、あるいは不溶性担体上に固定された免疫学的活性成
分と標識された免疫学的活性成分とを利用するもの等で
ある。いずれにせよ本発明の主な目的は抗原抗体反応の
促進にあるので、免疫学的測定方法の種類は問わない。
ただし、先に述べたように免疫学的活性成分が不溶性担
体状に固定されている場合には、反応速度の点で不利に
なりやすいため本発明による効果は大きいといえる。

【０００９】免疫学的測定方法として不溶性担体や標識
を利用するものを反応促進の対象とするときには、その
不溶性担体や標識の中に導電性素材を実質的に含まない
ように注意する必要がある。金属等の導電気性素材を含
むものはマイクロ波の照射対象として好ましくないため
である。しかし現在利用されている不溶性担体の多く
は、ポリスチレンやゼラチン等の高分子重合体、コレス
テロールやレシチン等の脂質、シリカ、ガラス、顔料、
細菌菌体や動物血球等の天然粒子で構成されているた
め、現実にはほとんど全ての免疫学的測定用方法に対し
て適用可能と言うことができる。逆に本発明に不適当な
不溶性担体とは、たとえば磁気によるＢ／Ｆ分離を目的
とした磁性体封入ラテックス粒子等で、どちらかという
と例外的な試薬であるといえよう。標識についても、酵
素、蛍光物質、発光物質等、その多くはマイクロ波の照
射が可能である。

【００１０】これら不溶性担体は、表面に抗原、ハプテ
ン、抗体、抗体断片、それらの変性物等の免疫学的活性
成分を、物理吸着や化学結合によって担持しており、粒
子凝集反応、酵素、発光、ラジオアイソトープ等の標識
による免疫検定他各種分析系に利用される。またこの不
溶性担体は、粒子状、数mm径のビーズ状、容器壁等測定
系に合わせて適当な形状とすることもできる。抗原成分
としては天然由来のもの、化学合成したもの、遺伝子操
作によって得られた組み換え抗原等が、また抗体として
はモノクローナル抗体やその断片等が利用できることは
言うまでもない。

【００１１】このような免疫学的測定用試薬と被検体
を、ガラス、合成樹脂等のマイクロ波透過性容器に入れ
て市販のマイクロ波加熱装置によりマイクロ波照射を行
う。マイクロ波とは、周波数が３００MHz から３００GH
z （波長が１m から１mm）の電磁波につけられた通称で
あり、この波長帯はテレビ放送等の各種通信用に広く利
用されている。家庭用の電子レンジや癌の温熱療法等
は、このような電磁波をエネルギーとして誘電体の加熱
に応用したもので、使用する周波数はＩＳＭ周波数帯と
して国際的に定められている。わが国では２４５０MHz
帯が主に利用されている（高周波の基礎と応用、東京電
気大学出版局）。マイクロ波のこのような性質から免疫
学的活性成分に対して破壊作用を及ぼすように思われる
が、意外にも実際にはきわめて効果的な反応促進作用を
示すのである。

【００１２】本発明に利用するマイクロ波も基本的には
同じ電磁波である。しかし本発明においてはマイクロ波
を加熱のための手段としてではなく、免疫学的測定方法
における抗原抗体反応を促進するために利用している。
したがって本発明に好適なマイクロ波は、周波数につい
ては同じ帯域を用いるが、出力の点では数十W から数百
W 程度、さらに具体的にはおよそ５０〜５００W 程度の
ものが利用しやすい。これは本発明におけるマイクロ波
の照射効果が主として出力、照射時間、反応液量等に支
配されるため、出力があまり大きくなると照射時間のわ
ずかな変動が大きな影響を持つようになり、結果として
測定自身の再現性を確保しにくくなることが予想される
ためである。また極端な場合には、ほんのわずかな照射
にもかかわらず試薬の変性を起こすような温度上昇につ
ながる可能性もあるので、本発明に用いるマイクロ波の
出力は低い方が扱い易いといえる。

【００１３】マイクロ波の照射は、抗原と抗体の反応の
場に対して行う。粒子凝集反応のように、抗原抗体反応
と平行して反応液を光学測定する場合であっても、マイ
クロ波の照射は可能である。もちろんマイクロ波の照射
後に光学測定することもできる。マイクロ波照射の条件
を更に具体的に示せば、ポリスチレンラテックス粒子を
不溶性担体として０．１％程度含んだ免疫学的測定用試
薬と検体希釈液等からなる反応液５mlに対し、周波数２
４５０MHz 、出力１００W のマイクロ波を照射する場
合、３０秒から３分程度で十分な効果を得ることができ
る。出力や照射時間は、反応液量、反応液中の水分含量
等にも左右されるので、不必要な温度上昇を起こさない
範囲内で、十分な効果が期待できる条件を適宜設定して
やればよい。マイクロ波の照射にあたっては、赤外線温
度センサー等によって温度を管理すれば、試薬の変性や
分散媒の蒸発等につながる不必要な温度上昇を容易に防
止することができるので便利である。

【００１４】

【発明の作用】本発明におけるマイクロ波照射は、免疫
学的測定方法における抗原と抗体の反応を促進する作用
を有する。実施例の結果からも分かるように、マイクロ
波照射によって加温操作では達成することができない、
非常に良好な反応促進効果を得られる。このことは、マ
イクロ波が単なる加熱作用を持つのみではなく、マイク
ロ波に固有の反応促進作用が存在することを示してい
る。以下、実施例に基づいて本発明を詳しく説明する。

【００１５】

【実施例】

実施例１．マイクロ波照射による抗原抗体反応の促進 Ｃ反応性蛋白（ＣＲＰ）−抗ＣＲＰ抗体間の反応のマイ
クロ波照射による促進 １−１．抗ＣＲＰ抗体結合ラテックス試薬の調製 抗ヒトＣＲＰ抗体のアンモニウム緩衝溶液（抗体濃度：
０．１mg/ml ）１０mlに、平均粒径が０．１０９μのポ
リスチレンラテックス（ダウ・ケミカル社製、固形分濃
度：１０重量％）１mlを加え、３７℃に加温して１時間
かくはんした後、２〜４℃に冷却下３０分間遠心分離
（１００００rpm ）を行なった。上清を傾斜除去し、沈
澱した抗ヒトＣＲＰ抗体結合ラテックスをアンモニウム
緩衝液で遠心洗浄後、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）含有アンモニウム緩衝液で１００mlに希釈し、抗
ヒトＣＲＰ抗体結合ラテックス試薬を得た。

【００１６】１−２．血清ＣＲＰの測定 １−１で調製した抗ヒトＣＲＰ抗体結合ラテックス試薬
５mlをガラス製サンプル瓶に採り、ＣＲＰ含有血清
（７．３および１４．５μg/ml）２００μl を添加後２
４５０MHz 、出力１００W および５０W のマイクロ波を
照射して一定時間毎に反応液の６５０nmにおける吸光度
（光路長：５mm）を測定した。なおマイクロ波照射中の
温度は、赤外線温度センサーを利用して３７℃に保っ
た。一方対照として、同じく５mlの抗ヒトＣＲＰ抗体結
合ラテックス試薬を試験管に採り、これに同じＣＲＰ含
有血清を添加し３７℃の水浴中で加温しながら一定時間
毎に同じ条件で吸光度測定した。結果は表１に示すとお
りである。

【００１７】

【表１】 出力１００W でマイクロ波を照射した場合のＣＲＰ含有
血清添加後の反応時間３分間における吸光度の増加は、
ＣＲＰ濃度７．３μg/mlのとき０．２１９（０．７７５
−０．５５６）で、３７℃加温の０．０７５に比べ２．
９倍以上であった。ＣＲＰ濃度１４．５μg/mlのときで
比較しても、マイクロ波照射を行った場合は約２．６倍
の吸光度の増加が観察された。出力５０W の場合もほぼ
同様の結果が得られた。

【００１８】実施例２．マイクロ波照射による抗原抗体
反応の促進 リウマチ因子（ＲＦ）−ヒト・イムノグロブリンＧ（Ｉ
ｇＧ）間の反応のマイクロ波照射による促進 ２−１．ヒトＩｇＧ結合ラテックス試薬の調製 ヒトＩｇＧのリン酸緩衝溶液（抗体濃度：０．３mg/ml
）１０mlに、平均粒径が０．３３０μのポリスチレン
ラテックス（ダウ・ケミカル社製、固形分濃度：１０重
量％）１mlを加え、３７℃に加温して１時間かくはんし
た後、２〜４℃に冷却下３０分間遠心分離（１００００
rpm ）を行なった。上清を傾斜除去し、沈澱したヒトＩ
ｇＧ結合ラテックスをアンモニウム緩衝液で遠心洗浄
後、０．５％ＢＳＡ含有アンモニウム緩衝液で３００ml
に希釈し、ヒトＩｇＧ結合ラテックス試薬を得た。

【００１９】２−２．血清ＲＦの測定 ２−１で調製したヒトＩｇＧ結合ラテックス試薬５mlを
ガラス製サンプル瓶に採り、ＲＦ陽性血清（１２および
４８IU/ml ）１００μl を添加後２４５０MHz、出力１
００W のマイクロ波を照射して一定時間毎に反応液の６
５０nmにおける吸光度（光路長：５mm）を測定した。な
おマイクロ波照射中の温度は、赤外線温度センサーを利
用して３７℃に保った。一方対照として、同じく５mlの
ヒトＩｇＧ結合ラテックス試薬を試験管に採り、これに
同じＲＦ陽性血清を添加し３７℃の水浴中で加温しなが
ら一定時間毎に同じ条件で吸光度測定した。結果は表２
に示すとおりである。

【００２０】

【表２】 マイクロ波を照射した場合のＲＦ含有血清添加後の反応
時間３分間における吸光度の増加は、ＲＦ値１２IU/ml
のとき０．０４９（０．６４８−０．５９９）で、３７
℃加温の０．０１６に比べ３倍以上であった。ＲＦ値４
８IU/ml のときで比較しても、マイクロ波照射を行った
場合は約２．５倍の吸光度の増加が観察された。

【００２１】比較例．マイクロ波のラテックス粒子担体
含有試薬に及ぼす影響 マイクロ波のラテックス粒子担体含有試薬に及ぼす影響
を、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）測定用試薬を
用いて観察した １−１．ｈＣＧ測定用試薬の調製 抗ｈＣＧ抗体のアンモニウム緩衝溶液（抗体濃度：０．
１mg/ml ）１０mlに、平均粒径が０．２３６μのポリス
チレンラテックス粒子分散液（ダウ・ケミカル製、固形
分濃度：１０重量％）１mlを加え、３７℃に加温して１
時間かくはんした後、２〜４℃に冷却下３０分間１００
００rpm で遠心分離を行った。上清を傾斜除去し、沈澱
した抗ｈＣＧ抗体結合ラテックスをアンモニウム緩衝液
で遠心洗浄後、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
含有アンモニウム緩衝液で１０mlに希釈し、ｈＣＧ測定
用試薬を得た。このｈＣＧ測定試薬を２〜１０℃に６ヶ
月静置した。

【００２２】１−２．マイクロ波の照射実験 １−１で調製後６ヶ月間静置保存したｈＣＧ測定用試薬
５mlをガラス製サンプル瓶に採り、２４５０MHz 、出力
１００W のマイクロ波を照射した。一定時間毎にｈＣＧ
測定用試薬を０．５％ＢＳＡ含有アンモニウム緩衝液で
２０倍に希釈し、７５０nmにおける吸光度（光路長：５
mm）を測定することによってマイクロ波照射の影響を調
査した。なおマイクロ波照射中の温度は、赤外線温度セ
ンサーを利用して３７℃に保った。一方対照として、同
じく５mlのｈＣＧ測定用試薬を試験管に採り、３７℃の
水浴中で加温しながら一定時間毎に同じ条件で吸光度測
定した。結果は表３に示すとおりである。

【００２３】

【表３】 マイクロ波照射したものは、３０秒から１分間の処理で
吸光度が急速に低下しラテックス粒子担体の速やかな分
散が確認された。一方３７℃加温のものではおよそ１時
間にわたって吸光度の緩やかな低下がみられ、ラテック
ス粒子担体の分散が少しずつ進行していること示してい
る。これらの結果から、マイクロ波の照射はラテックス
粒子担体に対して分散促進という作用を持つことが確認
された。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、免疫学的測定方法にお
ける抗原抗体反応の促進をきわめて効果的に行うことが
できる。実施例中にも示したとおり、本発明によって免
疫学的粒子凝集反応に基づく吸光度の増加量、すなわち
反応速度は３倍前後にまで増大する。この結果は、本発
明による免疫学的測定方法が、従来にない高感度な測定
を可能とすることを示している。 比較例によりマイク
ロ波を抗原抗体反応を行う前のラテックス試薬に照射し
た場合には、むしろ粒子担体の分散が促進されることを
確認した。このことはマイクロ波の照射は抗原抗体反応
に対して促進作用を持つのであって、前記実施例におけ
る反応速度の増加が単に粒子担体の非特異的な凝集促進
によって生じたものではないことを示している。したが
ってマイクロ波を使った本発明による免疫学的測定方法
は、粒子担体以外を用いる測定系に対しても有効であ
る。もちろん反応速度の向上は、感度の向上のみならず
測定時間の短縮をもたらすものでもある。また本発明に
おけるマイクロ波の照射は、低出力、短時間でその効果
を達成することができるので、温度感受性成分を用いる
場合にも適用しやすい。

Claims (3)

【整理番号】 Ｐ−０００２４６ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】免疫学的測定方法における抗原抗体反応
   を、マイクロ波照射によって促進することを特徴とする
   抗原抗体反応の促進方法
2. 【請求項２】免疫学的測定方法が、粒子凝集反応法、免
   疫比濁反応法、免疫沈降反応法から選ばれたものである
   ことを特徴とする請求項１の抗原抗体反応の促進方法
3. 【請求項３】免疫学的測定方法が、不溶性担体上に固定
   された免疫学的活性成分と標識された免疫学的活性成分
   とを利用するものであることを特徴とする請求項１の抗
   原抗体反応の促進方法