TW200407161A - Human monoclonal antibodies to influenza M2 protein and method of making and using same - Google Patents

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Toshifumi Mikayama
rong-fang Wang
Shinichiro Kato
Hilde Cheroutre
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Description

200407161 玖、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 此申請主張對2002年3月13曰申請之美國臨時申請(U.S Provisional Application)序列號碼 60/364,997之優先權。 本發明係有關與流感病毒M2蛋白質專一性結合之抗 體,更特別的是人類、人性化與嵌合單株抗體。 【先前技術】 幾乎每個冬天在所有國家造成流行或疾病之流感A或B 型病毒係已開發國家之主要的死亡原因。在美國,這些冬 天流感的流行可造成10%-20%的人生病並與每年平均 20,000人死亡,以及114,000人住院有關。目前,控制流感 之策略為每年以經抑制之全病毒或次單位疫苗行免疫注 射。流感病毒之主要的中和抗原為血球凝集素(HA)(Frace 等人.,Vaccine 17 : 2237(1999))。然而,因為HA之經常性與. 不可測之抗原變化,疫苗對不同之病毒品系通常無法提供 最適之保護性免疫力。甚且,對諸如老年病患、癌症病患 與其他因為進行中之治療與/或疾病引起免疫妥協的病患 而言,免疫注射無法提供有效保護。 血球凝集素(HA)與神經胺酸甞酶(NA)係刺激抗體產生之 兩個主要抗原。因為這兩種蛋白質之經常性抗原變化,他 們並不代表發展治療藥物之最適目標。A型流感病毒之第三 種穿膜蛋白-基.質蛋白2(M2)在病毒感染之細胞中表現很 多,故有人假設其提供病毒複製必須之穿膜質子流 (Ciampor等人,Virus Research 22:247(1992); Grambas 與 Hay, 84126 200407161
Virology 190:1 1(1992); Sugrue等人,EMB〇 Journal 9:3469 (1990))。不像HA與ΝΑ,M2係保存性的且可能代表發展以 抗體為基礎之流感病患的被動免疫治療之目標(Ito等人,J. Virology 65:5491(1991); Slepushkin等人,Vaccine 13:1399 (1995); Neirynck等人,Nature Med. 5:1 157(1999))。 據報導,以桿狀病毒表現之M2蛋白質對老鼠之免疫注 射,可增強老鼠肺部之病毒清除;並保護老鼠對抗同源與 異源A型流感病毒二者之致命激發(Slepushkin等人,Vaccine 13:1399(1995))。某更近之報告顯示,M2胞外區域與B型肝 炎病毒核心(HBc)蛋白之融合物創造一種編碼M2HBc之融 合基因,當作為疫苗使用時可提供老鼠對致命之病毒激發 90-100% 的保護(Neirynck 等人,Nature Med. 5: 1157 (1999))。利用M2HBc行免疫注射之老鼠的血清,可將此保 護被動轉移至未注射疫苗之老鼠。Zebedee等人顯示某抗 -M2之老鼠單株抗體對溶菌斑分析之流感病毒生長具中等 效果。當保溫期中有抗體存在時,A/Udorn/72病毒之溶菌斑 大小,而非其數目,會比較小。A/WSN/33品系而言,未發 現對其溶菌斑大小或數目有任何效果,此顯示該特定單株 抗體對不同之流感品系並非廣泛有效(Zebedee與Lamb,J. Virol 62:2762(1988))。當此抗體於病毒激發前一天被動轉移 至小鼠時,則注射後3-4天時之肺中的病毒複製量與接受不 相關抗體之動物者比較約少100倍(Treanor等人,J. Virol 64:1375)。然而,當於注射病毒前一天將該抗體施用於SCID 老鼠時,肺部之病毒滴定度與對照組之老鼠並無差別 84126 200407161 (Palladino等人,J. Virol· 69:2075(1995))。Mozdzanowska等 人(Virology 254:138( 1999)利用相同之鼠類抗-M2單株抗 體,14C2,可以顯示與Zebeedee等人之一致結果,即抗-M2 單株抗體在病毒溶菌斑分析中可降低病毒滴定度,但無法 降低流感品系A/PR/8/34之病毒滴定度,此顯示14C2並無法 廣泛保護對抗流感。 【發明内容】 本文揭示之完全的人類、人性化與嵌合(例如人/小鼠嵌合 體)抗-M2單株抗體可辨識A/PR/8/34與A/HK/8/68品系,顯 示其廣泛之抗A型流感的反應性。甚且,本文揭示之完全人 類、人性化與嵌合抗-M2單株抗體,當施用於已經受到A型 流感感染之小鼠時,可保護該鼠免於A型流感病毒 A/PR/8/34品系之致命激發。 因而,本發明提供包括結合流感病毒M2蛋白之人類、人. 性化與嵌合抗體之組合物;含人類、人性化與嵌合抗體之 醫藥組合物與含該抗體之套組。本發明之人類、人性化與 歲合抗體具有治療有流感危險或已患流感的病人流行感冒 的用途,包括感染前(預防)或感染後(治療);流感診斷、包 括測定病毒滴定度,包括純化或分離全病毒或M2蛋白之純 化/分離,及其他分析系統。因而,本發明亦提供使用抗體 治療(例如治療流感感染)、診斷(彳貞測樣本之流感病毒或M2 蛋白之量)與純化(純化或分離流感病毒或M2蛋白)之方法。 在一具體實施例中,其提供可專一性結合至少部分之M2 胞外區域之人類抗體。在一特別方面,該胞外區域包括胺 84126 200407161 基酸序歹|J SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序歹ij辨識號碼: 1)、其任何子序列或其胺基酸變體(例如,胺基酸之取代、 插入、刪除或加成)。在另一方面,該胺基酸取代係選自: SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD > SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、 SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD > SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、 SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 或 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(分另U為序歹4辨售线號石馬: 2-8)。 本發明之抗體包括多株與單株抗體及其混合物,其得為 IgG、IgA、IgM、IgE、IgD及其任何同型,例如 IgGi、IgG2、 IgG3或IgG4。抗體包括完整之人類、人性化與嵌合之具有. 兩個全長重.鏈與兩個全長輕鏈之(例如重鏈與輕鏈可變區 域)免疫球蛋白分子;以及維持至少部分父系的功能(M2結 合專一性、M2結合親合力或抗流感病毒活性)之重鏈與輕鏈 序列之完整人類、人性化與嵌合抗體。子序列之範例包括 Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、Fd、—單慧互vs(scF^^ 之Fvs(sdFv)與Vl或VH,或其他之完整人類或人性化的免疫 球蛋白之M2蛋白結合片段。因而,本發明抗體包括由融合 瘤或命名號碼為 2074(ATCC PTA-4025)、161(ATCC PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美 84126 200407161 國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接 受)、C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)與 L17 (ATCC 貯存號碼, 美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)之CHO細胞株生產 的抗體之重鏈可變區序列與輕鏈可變區序列。 在不同方面,本抗體係由細胞株(例如融合瘤或CHO細胞 株)所生產,其命名號碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025, 美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)、161 (ATCC貯存號 碼PTA-4026,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA)、 N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式 培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11接受)、 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國式. 培養收集站,Manassas,VA,USA) 〇 抗體進一步包括對本發明之人類、人性化與嵌合抗體具 結合專一性與結合親合力之人類、人性化與嵌合抗體。在 一個具體實施例中,有一種抗體具有對下列細胞株(例如融 合瘤或CHO細胞株)生產之抗體的結合專一性,其命名號碼 為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)、N547(ATCC貯存號 碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於 2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, 84126 -10- 200407161
Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、C40G1(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA)。在另一個具體實施例中,有一種 抗體具有下列細胞株(例如融合瘤或CHO細胞株)生產之抗 體的結合專一性,其命名號碼為2074(ATCC貯存號碼 PTA-4025,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)、 161(ATCC貯存號碼PTA-4026,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA, USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)、L66(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於 2003/3/11接受)、C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)與 L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,. USA)。 本發明之抗體另外包括,具有活體外或活體内之抑制病 毒感染之能力或抑制M2與細胞之結合的人類、人性化與喪 合抗體;該範例之抗體係由細胞株(例如融合瘤或CHO細胞 株)產生,其命名號碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025,美 國式培養收集站,Manassas,VA,USA)、161 (ATCC貯存號碼 PTA-4026,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)、 N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式 培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11 接受)、 84126 -11- 200407161 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國式 培養收集站,Manassas,VA,USA)。在一個具體實施例中, 有一種抗體經以細胞為基礎之ELIS A分析,定出其抑制 MDCK細胞之流感病毒感染的EC5G低於3.0微克/毫升。在不 同方面,該流感病毒為A型者,諸如A/PR/8/34或A/HK/8/68。 本發明之抗體進一步包括,結合二或更多之具有視情形 可出現於不同流感病毒(例如品系或分離物)之不同的胺基 酸序列之M2蛋白之人類、人性化與嵌合抗體。在一個具體 實施例中,該抗體至少會與部分之M2胞外區域序列結合。 在一特定方面,M2胞外區域序列包括胺基酸序列 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序列辨識號石馬:1)、其任 何子序列或其胺基酸變體(例如,胺基酸之取代、插入、刪 P佘或加成),諸如SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(序列辨識. 號碼:2)。在另一特定方面,M2胞外區域序列係選自: SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、 SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、 SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD > SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD# SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(分另ij為序列辨識號石馬: 2-8)。 本發明之抗體包括那些經修飾以形成寡體者,例如附著 84126 -12- 200407161 成寡合之區域(例如,白蛋白拉鍊排列)或經由交聯劑(例如 化學交聯劑)。本發明之抗體包括多體型式,例如雙體、三 體、四體或較高層次之人類、人性化與嵌合抗體之寡體。 此類抗體多體與單體抗體比較,典型地展現對M2之增高抗 體親抗原性。 本發明之抗體進一步包括,一或多種賦予可結合M2之人 類或人性化抗體特異功能或活性之異源區域。當抗體含一 或多種與抗體不同之胺基酸(亦即其非原生抗體之一部 份),該抗體即包括胺基酸異源區域。在一値具體實施例 中,異源區域包括結合蛋白(例如受體或配位體結合)、酶活 性、藥物、抗病毒劑、毒素、免疫調節劑、可偵測部份或 標籤。在一方面,該結合蛋白包括一種與流感蛋白M2具結 合專一性之人類、人性化與嵌合抗體比較具有不同結合專 一性或親合力之抗體。因此,本發明進一步提供多重專一 性與多重功能抗體(例如雙專一性與雙功能抗體,諸如分別 與兩種或多種抗原結合之抗體或具有兩種或多種功能或活 性)。 本發明之抗體可與視情形存在於一或多種流感病毒品系 或分離物之流感蛋白M2結合。因此,該抗體對M2或流感病 毒感染性、複製、增生、滴定度或與流感相關之一或多種 症狀或併發症之嚴重性或持續性,或流感病毒感染之易感 性,亦即抗流感病毒活性具有一或多種效果。在一個具體 實施例,人類、人性化與嵌合抗體可抑制一或多種流感病 毒品系或分離物之活體外或活體内之感染。在另一個具體 84126 -13- 200407161 實施例,人類、人性化與嵌合抗體可降低一或多種流感病 毒或分離物之流感病毒滴定度或流感病毒蛋白之量。在又 一個具體實施例,人類、人性化與嵌合抗體可抑制或預防 一或多種流感病毒品系或分離物之流感病毒滴定度或流感 病毒蛋白量之增加。在更一個具體實施例,人類、人性化 與嵌合抗體可保護病患免於一或多種流感病毒品系或分離 物之感染或減低易感性。在一個進一步之具體實施例,人 類、人性化與嵌合杭體可減低與一或多種流感病毒品系或 分離物相關之一或多種症狀或併發症(例如寒顫、發燒、咳 嗷、喉嚨痛、鼻充血、竇充血、鼻感染、竇感染、身體痛、 頭痛、疲倦、肺炎、支氣管炎、耳朵感染或耳朵痛)。在不 同方面,其係全身施用人類、人性化與嵌合抗體於病患(例 如靜脈内注射、皮下注射、靜脈浸潤或肌内注射)或局部施 用於黏膜組織(例如鼻道、竇、咽、喉、食道、耳朵或耳管). 或肺部。在不同方面,該流感品系係選自A/PR/8/34或 A/HK/8/68,或其他選自下列之品系H1N1、H2N2、H3N2、 H5m、H9N2、H2N;l、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、 H5N2、H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、 H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、HllNl、H7N2 與 H5N3」 本發明亦提供表現人類、人性化與嵌合抗體之宿主細 胞。細胞包括但不限於細菌、酵母菌、植物、動物(例如諸 如融合瘤細胞株與CHO細胞株之哺乳類細胞)以及諸如表 現本發明之人類、人性化與嵌合抗體之非人類的動物與植 物之全生物。 84126 -14- 200407161 本發明進一步提供編碼本發明抗體,包括其子序列與變 體之核酸。核酸包括選殖或其他遺傳操作或在溶液、細胞 或任何生物中表現之載體。 本發明亦提供包括本發明抗體之結合組合物。在一個具 體實施例,組合物包括結合流感M2蛋白之人類、人性化與 嵌合抗體與抗病毒藥。在另一個具體實施例,組合物包括 結合流感M2蛋白之人類、人性化與嵌合抗體以及抑制與流 行性感冒感染相關之一或多種症狀或併發症(例如寒顫、發 燒、咳嗷、喉嚨痛、鼻充血、身體痛、頭痛、疲倦、肺炎、 支氣管炎、竇感染或耳朵感染)。 本發明亦提供包括發明抗體與醫藥可接受載體或賦形劑 之醫藥組合物。在一個具體實施例,載體係適於施予病患 之黏膜組織(例如鼻道、竇、咽、喉、食道)或肺部者。 本發明亦提供包裝於容器之包括一或多種發明抗體之套. 組。在一個具體實施例,此套組包括對一或多種流感病毒 品系或分離物之處理(預防或治療)、抑制、防止、減低易感 性或減少病患之與流感病毒感染相關的一或多種症狀或併 發症之指示。在另一個具體實施例,該容器包括適於吸入 或鼻部施用於病患之氣溶膠、喷霧或擠壓瓶。在又一個:具 體實施例,該套組或容器包括抗病毒藥(例如一種抗體或藥 物)或抑制與流感病毒感染相關之一或多種症狀或併發症 之藥物。 本發明亦提供治療病患流感感染之方法。在一個具體實 施例,一種方法包括施予病患有效量之專一性結合流感M2 84126 -15- 200407161 之人類、人性化與嵌合抗體以治療病患之流感感染。在一 方面,該抗體係實質上同時施用或感染後施用於病患,亦 即治療處理。在另一方面,該抗體提供治療優點。在不同 一方面,治療優點包括降低或減少一或多種病毒品系之一 或多種流感感染之症狀或併發症、病毒滴定度、病毒複製 或病毒蛋白的量。可降低或減少之流感感染之症狀或併發 症包括例如寒顫、發燒、咳漱、喉p龍痛、鼻充血、竇充血、 鼻感染、竇感染、身體痛、頭痛、疲倦、肺炎、支氣管炎、 耳朵感染或耳朵痛。在又一方面,治療優點包括加速流感 感染的病患之復原。 本發明亦提供抑制病患受一或多種流感病毒品系或分離 物感染之方法。在一個具體實施例,該方法包括施予病患 有效量之專一性結合流感M2的人類、人性化與嵌合抗體, 以抑制病患之感染或降低病患受一或多種流感病毒品系或 分離物之感染的易感性。在不同一方面,該抗體係在病患 感染之前(預防)、實質上同時或之後施用。在另一方面,該 抗體提供治療優點。在不同一方面,治療優點包括降低或 減少一或多種流感感染之症狀或併發症(例如寒顫、發燒、 咳嗷、喉嚨痛、鼻充血、竇充血、鼻感染、竇感染、身體 痛、頭痛、疲倦、肺炎、支氣管炎、耳朵感染或耳朵痛)、 病毒滴定度或一或多種流感病毒品系或分離物之病毒蛋白 的量或病患對 < 或多種流感病毒品系或分離物之易感性。 本發明進一步提供防止病患之流感病毒滴定度、病毒複 製、病毒增生或病毒蛋白量增加的方法。在一個具體實施 84126 -16- 200407161 例,該方法包括施予病患有效量之專一性結合流感M2的人 類、人性化與嵌合抗體,以防止病患活體内之一或多種流 感病毒品系或分離物之病毒滴定度、病毒複製或流感病毒 蛋白的量增加之方法。 本發明亦另外提供防止病患免於一或多種流感病毒品系 或分離物感染或減少易感性之方法。在一個具體實施例, 該方法包括施予病患有效量之專一性結合流感M2之人 類、人性化與嵌合抗體,以保護病患免於感染或減少病患 受一或多種流感病毒品系或分離物之感染的易感性。在一 方面,該保護包括降低或減少與流感病毒感染相關之一或 多種症狀或併發症(例如寒顫、發燒、咳嗷、喉嘯痛、鼻充 血、竇充血、鼻感染、竇感染、身體痛、頭痛、疲倦、肺 炎、支氣管炎、耳朵感染或耳朵痛)° 本發明之方法可使用具有細胞株(例如融合瘤或CH0細· 胞株)產生之抗體的結合專一性或結合親和性的抗體來實 現,此細胞株命名號碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025, 美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)、161 (ATCC貝宁存號 碼PTA-4026,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)、 N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式 培養收集站,%&1^5 8&8,\^,113八,八1^(^於2003/3/11接受)、 C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/11接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國式 培養收集站,Manassas,VA,USA)。施用於病患之前,抗體 84126 -17- 200407161 可包括於醫藥可接受載體或賦形劑。 本發明之方法,包括治療、診斷與純化/分離,皆適用任 何流感病毒品系/分離物或品系/分離物之組合。在不同具體 實施例,該流感病毒品系係選自A/PR/8/34或A/HK/8/68, 或其他選自下列之品系H1N;1、H2N2、H3N2、H5N卜H9N2、 H2N卜 H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、H2N3、 H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6N;l、 H13N6、H7N1、H11N1、H7N2與 H5N3。 【實施方式】 本發明至少部分係根據人類、人性化與嵌合抗體之抗-M2 單株抗體。數種本發明之抗體具對抗不同之根據趨異性A 型流感病毒品系的不同M2胞外區域序列之廣泛反應性。本 發明之人類抗-M2單株抗體之被動轉移可保護動物免於 A/PR/8/34流感病毒之致死劑量激發,不論是預防(病毒感染. 前)與治療(病毒感染後)之流感病毒模型。因而,本發明抗 體具有治療廣泛之流感病毒品系或分離物之用途。此外, 因為發明抗體係人類者,其較不會因重複施用謗發高敏感 且較在病患(例如,人類)活體内會維持較長時間。 因此,根據本發明,我們提供具有流感病毒M2蛋白結合 專一性之人類、人性化與嵌合抗體。在一個具體實施例, 其提供具有流感病毒M2胞外區域結合專一性之人類、人性 化與嵌合抗體。·在一特別方面,胞外區域包括胺基酸序列 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序歹 ij 辨識號碼:1)、其部 分或其胺基酸變體(例如,胺基酸之取代、插入、刪除或加 84126 -18- 200407161 成),諸如SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD(為序歹J辨識號 碼:2)。在一特別方面,胞外區域具有選自下列之胺基酸 取代物: SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、 SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、 SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、 SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 與 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(分另為序列辨!线號石馬: 2-8)。 ’’抗體”之用語意指分別經由重與輕鏈之可變區域,VH與 VL與其他分子(抗原)結合之蛋白質。”抗體”意指諸如IgM、 IgG、IgA、IgE、IgD之任何免疫球蛋白分子,及其任何亞 類。’’抗體”之用語除非有其他說明,亦指免疫球蛋白分子 之功能片段,諸如 Fab、Fab’、(Fab’)2、Fv、Fd、scFv與 sdFv。 ’’M2抗體n或n抗-M2抗體”之用語意指具流感病毒M2蛋白 之結合專一性之抗體。專一性結合係指對M2蛋白質上之抗 原決定羞有選擇性。亦即,若與非M2蛋白質_—結全不致於明_ 顯干擾對M2之偵測。利用此藝已知之分析,得區分選擇性 結合與非選擇性結合。 本發明之抗體範例為,命名號碼2074(ATCC貯存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 84126 -19- 200407161 2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、C40G1(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於2003/3/1 1接受)、LI 7(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA)與 C40、L30、L40、S212、S80、S900(* 別為ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, US A)。重鏈可變區序列與輕鏈可變區序列之範例分別為序 列辨識號碼:11與序列辨識號碼:12所揭示者。 如本文所用者,”單株"之用語當指向抗體時,意指根據、 取得或衍生自任何真核、原核或噬菌體選殖系之單一選殖 系的抗體。因而,本文”單株”抗體之定義係指結構而非生 產方法。正如本文所用者,我們給予融合瘤或其他細胞株 之特定名稱、數字號碼或其他記號,諸如號碼2074、161、 N547、L66與C40G1等,亦用以指稱抗體名稱。 ”人類”之用語當指稱抗體時,意指該抗體之胺基酸序列 完全為人類者。因而,”人類M2抗體”或”人類抗-M2抗體·· 意指具有人類免疫球蛋白胺基酸序列之抗體,亦即與M2具 結合專一性之人類重與輕鏈可變區與恆定區。亦即,所有 抗體胺基酸皆為人類或存在於人類抗體__。i此,例如非人 類之抗體可能經由已存在於人類抗體之胺基酸殘基取代非 人之胺基酸殘基而做成全人類者。在人類抗體、CDR區域 圖譜與人類抗體共識殘基出現之胺基酸殘基係此藝所知 者 ° (例如參照 Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第 4 版 US Department of Health and Human 84126 -20- 200407161
Services. Public Health Service(1987);以及 Chothia與 Lesk J. Mol· Biol· 186:65 1(1987))。在 Padlan Mol. Immunol· 31:169 (1994)與 Padlan Mol. Immunol· 28:489(1991)說明,根據22個 已知人類VHIII序列之調查的人類VH亞組III的共識序列與 根據3 0個已知人類/c I序列之調查的人類VL /c -鏈亞組I的共 識序列。 π人性化π用語當意指抗體時,意指該抗體之胺基酸序列 具有專一性結合位於接受者之人類免疫球蛋白分子之所需 抗原(例如M2)之一或多種決定區(CDRs)的非人類(例如小 鼠、大鼠、山羊、兔子等等)胺基酸殘基;以及做為CDRs 兩脅之胺基酸殘基的Fv骨架區域(FR)的一或多種人類之胺 基酸殘基。免疫球蛋白之人類骨架殘基得以對應之非人類 殘基取代。因而,在人類骨架區之殘基經對應之非人類CDR 捐助者抗體殘基取代,以改變例如一般係改善抗原親和力· 或專一性。.此外,人性化抗體可能包括既非人類抗體亦非 捐助者CDR或骨架序列之殘基。例如,在人類抗體或捐助 者之非人類抗體未發現之特定位置的骨架取代,可能經預 測出能改善人類抗體在該位置之結合親和力或專一性。根 據分子模式化之抗體骨架與CDR取代係此藝所熟加者,_例_ 如,將CDR與骨架殘基之作用模式化,以辨識對抗原結合 重要之骨架殘基並做序列比較,以辨識特定位置之不尋常 骨架殘基(例如參照美國專利號碼5,585,089與Riechmann等 人,Nature 332:323(1988))。此藝中提及”靈長類’’之抗體係為 本文所用的π人性化’’意義所涵蓋,除了接受者之人類免疫 84126 -21 - 200407161 球蛋白分子與骨架區域胺基酸殘基之外,其餘可為除了任 何人類殘基外之任何靈長類之殘基。 如本文所用者,'’嵌合”之用語及其文法上的變異,當意 指抗體時,指該抗體之胺基酸序列包含一或多種衍生自、 取自或分離自或根據兩種或多種不同物種之部分。亦即, 例如抗體之一部份可為人類者(例如恆定區)而抗體之另一 部份為非人類者(例如鼠類可變區)。因此,嵌合抗體係其不 同部分來自不同物種之抗體分子。不像人性化抗體,嵌合 抗體在其抗體之任何區域皆得有不同物種序列。嵌合抗體 之實例為具小鼠λ輕鏈與人類τ重鏈之抗體號碼2074。 如本文所用者,”Μ2Π、ΠΜ2蛋白π、ΠΜ2序列”與,%2區域π 之用語意指分離自、根據或出現於任何自然或人造之流感 病毒品系或分離物的M2蛋白序列之全部或部分(例如諸如 胞外區域之子序列)。因此,M2之用語及其類似物包括由病· 毒在生命週期突變產生或對應選擇壓力(例如藥物治療、宿 主細胞向性或感染性之擴展等)自然產生之M2序列變體,以 及重組或合成產生之M2序列。 本發明之M2抗體包括具有/c或;I輕鏈序列抗體,不論是 如全長之_自1產立抗體、其混合物(亦即7C與λ—鏈序列之融 合物)即是以下詳述之其子序列。自然產生抗體分子包含兩 種/C與兩種λ輕鏈。/C與λ輕鏈間之主要差別在怪定區之 序列。 本發明之M2抗體包括具有本文例示之具M2抗體結合專 一性之抗體,例如具有下列抗體之結合專一性,其命名號 84126 -22- 200407161 碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、161(ATCC貯存號碼 PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)、L66(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/1 1接受)、C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11 接受)、LI7(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA)與C40、 L30、L40、S212、S80、S900(分另,J為ATCC貝宁存號石馬,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。在一方面,M2抗體係 具有重(H)鏈或輕(L)鏈或其子序列,正如下列任何之一所揭 示:號碼2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、161(ATCC貯存號 碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA, USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)、L66(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於· 2003/3/11接受)、C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/11接受)、L17(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)與C40、 L30、L40、S212、S80、S900(分別為ATCC貝宁存號石馬,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA),其限制條件為,該該 抗體之重或輕鏈序列或子序列,具有下列者之結合專一 性:號碼2074(ATCC貯存號碼PTA_4025)、161(ATCC貯存號 碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)、L66(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 84126 -23- 200407161 2003/3/1 1接受)、C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/1 1接受)、L17(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)與C40、 L3 0、L40、S212、S80、S900(分另為ATCC貝宁存號石馬,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 ”結合專一性”之用語當提及抗體之使用時,意指該抗體 如參考抗體般,專一性結合相同抗原決定基之全部或部 分。因此,具有命名號碼為2074抗體之結合專一性之m2抗 體,可如命名號碼為2074之M2抗體般,專一性結合相同抗 原決定基之全部或部分;具有命名為16 1抗體之結合專一性 之M2抗體,可如命名為161之M2抗體般,專一性結合相同 抗原決定基之全部或部分;具有命名為N547抗體之結合專 一性之M2抗體,可如命名為N5 47之M2抗體般,專一性結 合相同抗原決定基之全部或部分;具有命名為L66抗體之結. 合專一性之M2抗體,可如命名為L6、6之M2抗體般,專一性 結合相同抗原決定基之全部或部分;具有命名號碼為 CM0G1抗體之結合專一性之M2抗體,可如命名號碼為 C40G1之M2抗體般,專一性結合相同抗原決定基之全部或 ~ ,— 口—匕-~~ 〇 ….——. ..________________________________________________________ 抗原決足基之部分意指抗原決定基之部份或子序列。例 如,若一抗原決定基包括8個連續胺基酸;因而,子序列以 及抗原決定基之一部份可能為該8個胺基酸序列之抗原決 定基内之7個或更少之胺基酸。此外,若一抗原決定基包 括非連續胺基酸序列,諸如彼此非連續之5個胺基酸序列與 84126 -24- 200407161 8個胺基酸序列者;但因蛋白質纏繞而形成抗原決定基,因 而,其子序列與該抗原決定基之一部份可能若非該5個胺基 酸序列即是單獨該8個胺基酸序列。 具有本文例示之M2抗體結合專一性之抗體,會與下列之 抗體有結合競爭:號碼2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、 161(A丁CC貯存號碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接 受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC 於 2003/3/11接受)、C40G1(ATCC 貯存號碼,美 國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/1 1 接 受)、L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, 1^八)與040、1^30、1^40、3212、880、3900(分別為入1[(:(:貯 存號碼’美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)。具有本 文例示之M2抗體結合專一性之本發明抗體,可能利用任何· 此藝已知之方法足其競爭性結合之特徵,例如本文揭示之 免疫分析法。因為其結合親和力可能與例示之抗體者有所 不同,該抗體在其與M2結合之競爭能力上會有不同。在特 定具體貫把例’该抗體可1¾爭性抑制結合達至少9 5 %、至 少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少 65%、至少60%、至少55%、至少5〇%、至少45%、至少40%、 至少35%或至少30%或更少。 抗原決定基典型地為短的胺基酸序列,例如約5-15個胺 基酸長度。辨識抗原決定基之系統性技術係此藝所熟知 者,且在例如美國專利號碼4,708,871中有所說明。簡言之, 84126 -25- 200407161 可能合成衍生自M2抗原之一組重疊寡肽並結合於固相排 列之在每個栓上具獨特寡肽的栓之上。栓之排列可能包括 96井微滴定盤,使我們可同時分析96個寡肽,例如與抗-M2 單株抗體之結合。替代地,目前已有市售之噬菌體展現的 肽圖庫套組(New England BioLabs)可做抗原決定基之圖譜 分析。利用這些方法,可決定每個可能的連續胺基酸亞組 之結合親和力,以辨識特定的抗體所結合之抗原決定基。 當使用抗原決定基長度之肽序列,對產生與該肽序列結合 之抗體的動物免疫注射時,亦可利用推測以決定抗原決定 本發明之M2抗體亦包括具相同結合親和力,且實質上與 本文例示之M2抗體具相同結合親和力之人類、人性化與嵌 合抗體。例如,一種本發明之M2抗體可能之親和力大於或 小於參考抗體之親和力之2-5、5-10、10-100、100-1000或 1000-10000倍。因此,在另外之具體實施例中,本發明提供 具有相同結合親和力且實質上具有如下列抗體之相同結合 親和力的M2抗體:號碼2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、 161(ATCC貯存號碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC於 2003/从 受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)、C40G1(ATCC 貯存號碼,美 國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11 接 受)、L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, 113八)與€40、130、1^40、3212、380、3900(分別為八11(:(:貯 84126 -26- 200407161 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,US A);其限制 條件為,該重鏈或輕鏈序列或其子序列,具有下列者之結 合專一性··號碼 2074(ATCC 貯存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收 集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、 L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、C40G1(ATCC 貯存號碼,美 國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接 受)、L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA)與 C40、L30、L40、S212、S80、S900(分另丨J 為 ATCC貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 正如本文所用者,”相同”之用語當意指抗體之結合親合 力時,意謂其解離常數(KD)係在參考抗體約5-100倍之内(親 合力比參考抗體大或小5-100倍)。’’實質相同”之用語當意指 抗體結合親合力時,意謂其解離常數(KD)係在參考抗體約 5-5000倍之内(親合力比參考抗體大或小5-5000倍)。 本發明另外包括之抗體具有下列抗體之結合親和力:號 碼2074(八丁(:0:貯存號碼?丁八-4025)、161(入1[(:(:貯存號碼 PTA-4026) ^ N547(AXCCJ^ ^ ^ Μ ^ ^ ^ Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)、L66(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/11接受)、C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/1 1接受)、L17(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)與C4〇、 84126 -27- 200407161 L3 0、L40、S212、S80、S900(分別為ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA),而對M2之結合親和力 的解離常數(KD)小於 5χ1(Γ2Μ、1〇-2Μ、5χ1〇-3Μ、10·3Μ、 5χ10-4Μ、1〇,4Μ、5χ1(Γ5Μ、1〇-5Μ、5><1(Γ6Μ、1(Γ6Μ、 5χ1(Τ7Μ、1〇·7Μ、5χ10-8Μ、1(Τ8Μ、5χ1(Τ9Μ、1(Τ9Μ、 5χ1(Τ10Μ、1〇“〇Μ、5χ1(ΤηΜ、1(ΤΠΜ、5><1(Γ12Μ、10·12Μ、 5χ1(Τ13Μ、1〇-13Μ、5χ1(Γ14Μ、10·14Μ、5><1(Τ15Μ與 10-15Μ。 本發明之人類M2抗體至少包括具有本文例示之一或多 種抗-流感病毒部分活性之M2抗體(例如,抑制流感病毒在 活體内或活體外之感染細胞,抑制流感病毒增生或複製’ 減少與流感病毒感染相關之一或多種症狀或併發症,減低 對流感病毒感染之易感性等等)。因此,在另外之具體實施 例中,本發明提供至少具有一或多種下列抗體之部分抗流 感病毒活性的M2抗體包括:號碼2074(ATCC貯存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 20〇3/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/11接受)、C40G1(ATCC 貯存號碼’美國式培養收喜站,Manassas,VA,USA,ATCC 於2003/3/1 1接受)、LI 7(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA)與 C40、L30、L40、S212、S80、S900(* 別為ATCC貯存號碼’美國式培養收集站,Manassas,VA, USA)。 ·*活性”之用吾當用來比較抗體與參考抗體時,亦謂該抗 84126 -28- 200407161 體至少具有參考抗體之部分活性,例如結合親和力、結合 專一性或抗流感活性。因此,具有命名為N547之M2抗體活 性之抗體,至少具有部分之命名為N547的M2抗體之一或多 種活性;具有命名為L66之M2抗體活性之抗體,至少具有 部分之命名為L66的M2抗體之一或多種活性;具有命名為 C40G1之M2抗體活性之抗體,至少具有部分之命名為 C40G1的M2抗體之一或多種活性;諸如此類等等。”至少部 分’’之用語意指該抗體可能活性較低,然而該抗體至少維持 參考的M2抗體之某些活性,例如對M2抗體之至少部分結合 親和力,至少部分之抗-流感病毒活性等。 具有例示之人類M2抗體活性之抗體可利用具有盤-結合 之M2肽做為塗覆抗原(ELIS A)之結合分析,對病毒感染之 MDCK細胞上之M2蛋白的結合分析(以細胞為基礎之ELISA) 與M2肽(M2胞外部分)對抗體與病毒感染之MDCK細胞上之· M2結合的特定抑制等辨識出。另外之分析包括使用流感病 毒之活體外細胞感染性分析(Zebedee等人 J. Virology 62:2762( 1988))以及如實例1、3及4所例示之活體内動物分 析。 生產人類抗體之方法係本文所揭示-且係此藝所熟知者。 例如,如本文揭示者,我們使用與KLH或BSA共輛結合之 M2蛋白來免疫注射人類跨染色體KM小鼠(W0 02/43478)或 HAC小鼠(WO 02/092812)。KM小鼠或HAC小鼠會表現人類 免疫球蛋白基因。利用傳統融合瘤技術,我們分離對M2抗 原為高度反應者之源於免疫注射小鼠的胰臟細胞並與骨髓 84126 -29- 200407161 瘤細胞融合。得到12個會與M2肽與/或M2-BSA共輛體反 應,但不會與BSA或KLH載體結合之單株抗體,命名號碼 為 2074、C40、L17、L30、L40、L66、N547、S212、S80、 S900、F1與F2。生產人類抗體之科技全貌請參考Lonberg與 Huszar,Int· Rev· Immunol· 13:65(1995)。無法表現内生性免 疫球蛋白之具有一或多種人類免疫球蛋白基因(/c或λ)之 基因轉殖動物請參考例如美國專利號碼5,939,598之說明。 人類抗體亦可由諸如Abgenix. Inc· (Freemont,CA)與 Genpharm (San Jose,CA)等零售商購得。另外之生產人類抗 體與人類單株抗體之方法說明請參考(例如WO 98/24893、 W〇 92/01047、WO 96/34096、WO 96/33735,美國專利號碼 5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、 5,545,806、5,814,318、5,885,793、5,916,771 與 5,939,598)。 利用其他包括融合瘤、重組的、與嗟菌體表現技術或其‘ 組合可很方便生產M2單株抗體(請參照美國專利號碼 4,902,614、4,543,439 與 4,411,993 ;亦參照 Monoclonal Antibodies, Hvbridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press,Kennett,McKearn與 Bechtol(編者), 1980,以及 Harlow 等人,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版,1988)。本方法 可能使用之另外技術包括M2親和力純化、非變性膠純化、 HPLC或RP-HPLC、蛋白A管柱之純化或任何這些技術的組 合。利用ELISA分析可決定抗體同型,例如利用小鼠Ig-吸 附之抗人類Ig可辨識人類Ig。 84126 -30- 200407161 利用多種此藝已知之技術可將抗體人性化,例如包括 CDR-移植(歐洲專利239,400、W0 91/09967、美國專利號碼 5,225,539、5,530,101與5,5 85,089)、鑲面板或再表面化(歐洲 專利 592,106、歐洲專利 519,596,Padlan,Molecular Immunol· 28:489(1991),Studnicka等人,Protein Engineering 7: 805 (1994),Roguska等人,Proc· Natl. Acad· Sci. USA 91: 969 (1994))與鏈混合(美國專利號碼5,565,332)。人類共識序列 (Padlan, Mol. Immunol. 3 1:169(1994)# Padlan, Mol. Immunol. 28:489(1991))先前已被用來將抗體人性化(Carter等人 Proc.Natl· Acad· Sci. USA 89:4285(1992)與 Presta 等人 J_ Immunol. 151:2623(1993)) o 生產後合抗體之方法係此藝所熟知(例如Morrison, Science 229:1202(1985),Oi 等人,Bio Techniques 4··214 (1986),Gillies等人,(1989) J. Immunol· Methods 125:191 以及 美國專利號碼 5,807,715、4,816,567 與 4,816,397)。源於一物 種之抗體的可變區域經另一物種之可變區域取代之嵌合蛋 白的說明請參照例如Munro,Nature 312:597(1984), Neuberger等人,Nature 312:604(1984),Sharon等人,Nature 309:164(丄984—Pxoc. Natl. Acad- Sci. USA 81:685 1(1984),Boulianne等人,Nature 312:643(1984),Capon 等人,Nature 337:525(1989)與 Traunecker 等人,Nature 339: 68(1989)。 適於生產抗體之M2蛋白得利用多種此藝熟知之標準蛋 白純化方法之任何一種或重組表現技術來生產。例如,M2 84126 -31 - 200407161 可用諸如固相合成之標準肽合成技術生產。該蛋白之部分 得包含諸如T7標籤或聚組胺酸序列之胺基酸序列,以促進 表現或合成的M2之純化。M2肽可在細胞表現,而且該細胞 生產之蛋白質亦可純化。M2蛋白可利用重組技術做為較大 蛋白之部分來表現。 適於生產免疫反應之M2型式包括全長度M2之肽子序列 (例如典型地4-5個胺基酸或更多)。另外型式之m2包括含M2 之製備物或萃取物、部分純化之M2以及表現M2之細胞或病 毒或此種表現細胞或病毒之製備物。 得免疫注射之動物包括小鼠、兔子、大鼠、綿羊、山羊、 天竺鼠,此類動物得經遣傳修飾以包括人類IgG基因位置。 此外,為增強免疫反應,可將M2偶合於另一個蛋白,諸如 卵白蛋白或血氰蛋白(KLH)、甲狀腺球蛋白與破傷風類毒素 或混合以諸如Freund之完全或不完全佐劑之佐劑。起始與 任何選擇性之後續免疫注射皆得經腹膜内、肌内、眼内或 皮下途徑。後續免疫注射得與M2抗原製備物為相同或不同 濃度,且得為規則或不規則間隔。 因此,在另一個具體實施例,本發明提供生產人類M2抗 —體.方..法包括具一或多象抗,流感氣毒 性為諸如抑制流感病毒感染、複製、增生、滴定度或抑制 病毒複製、增生或低定度之增加或減輕與流感病毒感染相 關之一或多種症狀或併發症之嚴重性或持續性,或對感染 之易感性,或具有抗不同流感病毒品系或分離物之廣泛反 應性。在一個具體實施例,該法包括施予能表現人類免疫 84126 -32- 200407161 球蛋白之動物(例如小鼠)M2或其免疫生成片段,篩選動物 以表現人類M2抗體、選取生產人類M2抗體之動物,由該生 產人類M2抗體之動物分離抗體並決定是否該人類M2抗體 會與M2結合。在另一個具體實施例,該法包括施予能表現 人類免疫球蛋白之動物(例如小鼠)人類M2或其免疫生成片 段,由該生產人類M2抗體之小鼠分離胰臟細胞,將該細胞 與骨髓瘤細胞融合以生產融合瘤細胞,並篩選可表現抗-流 感活性之人類M2抗體的融合瘤。 本發明進一步提供經修飾之人類M2抗體。修飾之實例包 括抗體之一或多種胺基酸取代、加成或刪減,其限制條件 為該經修飾之抗體有全部或部份未經修飾之M2抗體活 性,例如抗-流感活性。 有一修飾之特別實例為本發明之抗體係經改變以具有不 同同型或亞類,例如經由取代重鏈之恆定區(例如參照實例 2)。將M2抗體C40由IgG4變成IgGl之Ig亞類的改變可改善 抗流感病毒活性。因此,修飾包括由本發明抗體刪除大區 域之胺基酸序列並以另外之胺基酸序列取代,不管該序列 比刪除者之長度長或短。 本發明包括之M2抗體的另外修飾為抗體衍生物,亦即任 何形式分子與抗體之共價附著。抗體衍生物之特定實例包 括經糖化、乙醯化、磷酸化、醯胺化、甲醯化、泛素與利 用保護/阻斷基團之衍生反應與任何無數之化學修飾。 個別胺基酸取代可能係以相同胺基酸,除了以自然產生 之L-胺基酸取代D-型胺基酸外。胺基酸取代得為保守或非 84126 -33- 200407161 保守者’而且得在抗體之怪定區或可變區。在丨亙定區或可 變區之一個或一些保守胺基酸的取代似乎是可忍受的。保 守胺基酸取代之特定實例為,lie、Va卜Leu或Ala彼此之間, Lys與Arg彼此之間,Glu與Asp彼此之間以及Gin與Asn彼此 之間。在高可變區之多重胺基酸之非保守取代似乎會影響 結合活性、專一性或抗體功能或活性。因此,可分析在高 可變區域之取代的效果,以辨識那些至少維持未經取代抗 體之部分結合活性、專一性或抗體功能或活性者。只要經 取代之抗體至少維持部分未修飾之人類M2抗體之結合專 一性、結合親和力或抗流感病毒活性,此類具有胺基酸取 代之抗體亦包括。 因而,本發明之人類單株M2抗體包括如本文所述之子序 列(例如片段)與修飾型式(例如序列變體)。在特定具體實施 例中,人類M2抗體子序列包括Fab、Fab1與(Fab’)2、Fd、單 鏈Fvs(scFv)、單鏈抗體、雙硫键連結之Fvs(sdFv)與VL或VH 區域片段。在特別方面Fab、FaV與(Fab’)2、Fd、單鏈 Fvs(scFv)、單鏈抗體、雙硫鍵連結之Fvs(sdFv)與VL或Vh、 區域子序列具相同結合親和力、實質上相同之結合親和 力、相同的結合專一性或一或多種抗流感活性例如,如參 考之M2抗體般(例如全長度或未修飾M2抗體)在活體外或 活體内抑制流感病毒感染細胞之效力。包括單鏈抗體之M2 結合抗體子序列,包括單獨可變區或組合全部或部分之一 或多種下列者:樞紐區域、CHI、CH2與CH3區域。亦包括 任何可變區與樞紐區域、CHI、CH2與CH3區域之任何組合。 84126 -34- 200407161 本發明之M2抗體子序列(例如Fab、Fabf、(Fab’)2、Fd、 scFv、sdFv與VL或VH)得利用抗體之蛋白酶水解製備,例如 利用胃蛋白酶或木瓜酵素消化全抗體。’’功能子序列π與’’功 能片段’’之用語當指向本發明之抗體時,意指如完整參考蛋 白般,至少維持部分之一或多種功能或活性之抗體的部分。 抗體片段可利用胃蛋白酶之酶切斷生產,提供名為 (Fabf)2之片段。此片段得利用硫醇還原劑進一步切斷以生 產3.5S Fabf單價片段。另外,利用胃蛋白酶之酶切斷可直 接產生兩個單價Fab’片段與Fc片段(例如參照Goldenberg, 美國專利號碼4,036,945與4,331,647,以及Edelman等人 Methods in Enzymology 1:422(1967)) 〇 亦可使用其他切斷抗 體之方法,諸如分離重鏈形成單價輕-重鏈片段、進一步切 斷片段,或其他酶或化學法。基因技術包括M2抗體基因在 諸如Cos細胞或E. coli等宿主細胞之全部或部分表現。重組 宿主細胞合成完整或諸如scFv之單一抗體鏈(例如參照 Whitlow 等人,在 Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97(1991),Bird等人,Science 242:423(1988)與 美國專利號碼4,946,778)。單鏈Fvs與抗體之生產可採用下 列:吴國專利號碼4,946,778與5,258,498,Huston等人,
Methods Enzymol· 203:46(1991),Shu等人,proc· Natl. Acad. Sci. USA 90:7995(1993)與 Skerra 等人,science 240:1038 (1988)。 另一個具有胺基酸加成之修飾的]V12抗體之特定例子 為,附著第二個賦予抗體不同或互補功能之異源序列亦即 84126 -35- 200407161 兴源區域。例如,諸如T7或聚組胺酸之胺基酸標籤可附著 於M2抗體’以便促進對—或流感病毒之純化或偵剛。然 叫’另一個實例為附著於M2抗體之抗病毒,以便指向受病 母心、木之細胞以殺病毒、抑制增生、抑制複製等。因此, 在其他具體實施例,本發明提供M2抗體與抗體上之異源區 域其中琢區域賦予明顯功能,亦即異源性功能之區域。 /、源區域不限胺基酸殘基。因此,異源區域可由多種不 同』怨之小或大的功能部分組成。此種部分包括核酸、肽、 糖爿曰貝或诸如藥物(例如抗病毒)之小的有機化合物。 連接子序列可插在抗體序列與異源區域間,使該二部分 土 V 4刀維持明顯功能或活性。連接子序列得具一或多種 月匕匕括了促進或與兩種區域作用之可,資曲之構型、無 丟开y成有秩序之二級結構的能力或厭水或充電特性。在蛋 白質可彎曲部分之典型胺基酸為Gly、入犯與3^。諸如几厂 人ia之其他幾近中性的胺基酸,亦可做連接子序列之用。 可改變連接子序列之長度而不明顯影響融合蛋白之功能或 活性(例如參照美國專利號碼6,087,329)。 井源區域之另外的實例為可偵測之標籤。因此,在另一 個具體實施何,本發I提供經標籤之可偵測的人類麗2抗 體。 可偵測標籤之特定實例包括,螢光基、色基、放射同位 素(例如S35、!^2·、]^25)、電子密度試劑、酶、配位體與受體。 酉孝典型地係利用其活性來偵測。例如練根過氧化酶即通常 利用其可轉化諸如之3,3,,5,5,-四甲基對二胺基聯苯(TMB) 84126 -36- 200407161 受質成可定量之藍色色素而偵測。配位體可結合其他分 子,諸如可結合抗生物素蛋白或鏈酶抗生蛋白之生物素、 可結合A蛋白之lgG等。 應了解M2抗體可能有兩種或多種變體、修飾或標籤。例 如,單株抗體可偶合於生物素以使用抗生物素蛋白偵測其 是否存在,以及利用I125便能提供可偵測信號。其他改變與 可能性對此藝之一般技術者而言很清楚,且經認定為本發 明範疇所涵蓋。 本發明進一步提供編碼本發明之人類M2抗體的核酸,包 括修飾型、片段、嵌合體等。在特定具體實施例,編碼完 整或單鏈之M2抗體之核酸為,命名號碼2074(ATCC貯存號 碼 PTA-4025)、161(ATCC貯存號碼 PTA-4026)、N547(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、 C4〇Gl (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)、L17(ATCC貯存號碼,美國式 培養收集站,Manassas,VA,USA)與 C40、L30、L40、S212、 S80、S900(分別為入丁⑶貯存號碼’美國式培養收集站, Manassas,VA,USA) 〇 π核酸”或”聚核甞酸”之用語交互使用以意指所有型式之 核酸,包括去氧核糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)。核酸得 為雙股、單股或三股,直鏈或圓形。核酸包括基因體DNA、 cDNA與反我核。RNA核紅得為剪切或未剪切之mRNA、 84126 -37- 200407161 rRNA、tRNA或反義者。本發明之核酸包括天然、合成以及 核苷酸類似物與衍生物。此類經改變或修飾之聚核苷酸包 括例如提供核酸酶抗性之類似物。 核酸得為任何一種長度。例如,任何下列之子序列:號 碼2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、161(ATCC貯存號碼 PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、L66(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/1 1接受)、C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11接受)、L17(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)與C40、 L3 0、L40、S212、S80、S900(分另J為ATCC貝宁存號石馬,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)之編碼具一或多種抗流 感病毒活性之蛋白。在一個特定具體實施例,核酸包括序 列辨識號碼:9與序列辨識號碼:10之重鏈可變區序列與輕 鏈可變區序列。在另一個特定具體實施例,編碼重鏈可變 區序列與輕鏈可變區序列之核酸係如序列辨識號碼:11與 序列辨識號碼:12所示者。 因為遣傳密碼退化,核.酸包括湘對於下列編碼序列為退 化之序列者:號碼2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、 161(ATCC貯存號碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接 受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、C40G1(ATCC 貯存號碼,美 84126 -38- 200407161 國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接 受)、L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA)#C40 > L30 ^ L40 ^ S212 ^ S80 > S900(^^J Λ ATCCIt 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)其子序列 與本文揭示之修飾型。 核酸得使用任何熟知之標準選殖與化學合成方法生產, 而且經由位置指定突變形成,或其他熟諳此藝者已知之重 組技術故意改變。聚核苷酸之純度得經由定序、膠電泳及 其類似者決定。 本發明之核酸得插入其核酸序列之表現係由本文命名為 ’’表現匣子’’的”表現控制單元”所影響或調節之核酸建構 物。"表現控制單元”之用語意指調節或影響其操作上連結 之核酸序列表現的一或多種核酸序列單元。表現控制單元 適當者得包括啟動子、增強子、轉錄終結子、基因沉默子、 蛋白質編碼基因前之開始密碼子(例如ATG)等等。 操作上連結核酸序列之表現控制單元可控制轉錄,而且 適當者還包括核酸序列之轉譯。f’操作上連結’’之用語意指 鄰接,其參考成分之關係允許其以所欲方式表現功能。典 型之表現控制單元係與_基因之—5’或丄鄰接,但亦可在插入序 列中。 表現控制單元包括構造上活化轉錄之單元,其為可謗導 (亦即活化時需外部信號)或為可去壓制(亦即需關掉轉錄之 信號;當該信號失去時轉錄即活化或’’去壓制π)。本發明之 表現匣子亦包括足以使特定細胞型態或組織之基因表現受 84126 -39- 200407161 控制之控制單元(亦即組織專一性控制單元)。典型地這種單 元係位於編碼序列之上游或下游(亦即5 ’與3f)。啟動子一般 位於編碼序列之51。可使用由重組DNA或合成技術產生之 啟動子提供本發明聚核甞酸之轉錄。π啟動子π意指足以指 引轉錄之最低限度的序列單元。 得將本發明之核苷酸插入質體以傳播入宿主細胞及所需 之後續基因操作。質體為可在宿主中安定傳播之核酸,質 體得視情形含表現控制單元,以驅使宿主細胞之編碼M2抗 體的核酸之表現。本文所用載體係與質體為相同名稱,且 亦可包括在宿主細胞表現之表現控制單元。質體與載體一 般至少包含可在細胞傳播之複製起源與啟動子。因而,質 體與載體可用以例如,基因操作編碼M2抗體之核酸、生產 M2抗體或反義者,並在宿主或生物體中表現該M2抗體。 可由融合瘤中分離出編碼抗體之重鏈與輕鏈可變區之核 酸,或編碼全長度之重鏈與輕鏈者。得將分離之核酸插入 適當表現載體,並導入諸如酵母菌或CHO細胞之可培養來 生產重組M2抗體之適當宿主細胞。 細菌系統啟動子包括Τ7與諸如嗟菌體λ之pL、plac、 pt工p、ptac(ptrp-lac雜合啟動子)之可謗發的啟動子與四環黴 素反應性啟動子。昆蟲細胞系統啟動子包括結構性或誘發 性啟動子(例如蜆皮素)。哺乳類細胞構造啟動子包括 SV40、RSV、牛乳突狀病毒(BPV)與其他病毒啟動子,或衍 生自哺乳類基因體之謗發性啟動子(例如金屬硫蛋白IIA啟 動子、熱休克啟動子、)或源於哺乳類病毒(例如,腺病毒晚 84126 -40- 200407161 期啟動子、誘發性小鼠乳房瘤病毒長終端重複)。替代地, 可將逆轉錄病毒基因體做基因修飾,以導入適當宿主細胞 中並指引M2抗體之表現。 表現系統進一步包括設計供活體内使用之載體。特別之 非限制性實例包括,腺病毒載體(美國專利號碼5,700,470與 5,731,172)、腺病毒相關載體(美國專利號碼5,604,090)、疱 疹單純病毒載體(美國專利號碼5,501,979)、逆轉錄病毒載體 (美國專利號碼 5,624,820、5,693,508 與 5,674,703)、BPV 載體 (美國專利號碼5,719,054)與CMV載體(美國專利號碼 5,561,063) 〇 酵母菌載體包括結構性與謗導性載體(例如參照Ausubel 等人,於·· Current Protocols in Molecular Biology,第 2冊, 第 13章,編者,Greene Publish. Assoc.&Wiley Interscience, 1988; Grant等人,Methods in Enzvmologv· 153:516(1987), 編者 Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152: 673(1987),編者 Berger & Kimmel,Acad. Press,N.Y·與 Strathern 等人,The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982)編者 Cold Spring Harbor Press,第 I 與II冊)。可使用諸如ADH與LEU2之結構性酵母啟動子或諸 如 GAL之謗導性啟動子(R. Rothstein於:DNA Cloning, A Practical Approach,第 11 冊,第 3 章,編者 D.M· Glover, IRL Press,Wash:,D.C.,1986)。經由例如同系重組,以促進 外來核酸序列整合入酵母菌染色體之載體係此藝所熟知 者。當插入之聚核苷酸對更傳統之載體太大時(例如大於約 84126 -41 - 200407161 12千鹼對),典型地使用酵母菌人工染色體(YAC)。 本發明亦提供包括編碼人類M2抗體之核酸的宿主細 胞。在一個具體實施例,該宿主細胞為原核細胞。在另一 個具體實施例,該宿主細胞為真核細胞。在不同方面,該 真核細胞為酵母菌或哺乳類(例如人類、靈長類等等)細胞。 如本文所用者,’1宿主細胞”為可導入核酸之傳布、轉錄 或編碼M2抗體表現之細胞。該用語亦包括任何宿主細胞之 子代或亞選殖系。子代細胞與亞選殖系不需與父系細胞一 致,因為可能在複製與增生時有突變發生。然而,我們認 為此類細胞為本發明之宿主細胞。 宿主細胞包括但不限於,諸如細菌與酵母菌之微生物與 植物、昆蟲及哺乳類細胞。例如,經重組嗟菌體核酸、質 體核酸或粘接質體核酸表現載體轉型之細菌,經重組酵母 菌表現載體轉型之酵母菌,經重組病毒表現載體(例如花椰 菜鑲嵌病毒、CaMV、煙草鑲嵌病毒、TMV)感染或經重組 質體表現載體(例如Ti質體)轉型之植物細胞系統,經重組病 毒表現載體(例如桿狀病毒)感染之昆蟲細胞系統與經重組 病毒表現載體(例如逆轉錄病毒、腺病毒、疫苗病毒)感染之 動物細胞系統或經工程操作以安定表現之轉型動物細胞系 統。 表現載體亦可含賦予對選擇性壓力之抗性的選擇性標示 物或可辨識標示物(例如点-半乳糖酶),藉此允許具欲選取 載體之細胞能生長與擴展。替代地,選擇性標示物得位於 與含本發明的聚核苷酸之第一種載體共轉感染入宿主細胞 84126 -42- 200407161 之第二種載體上。 選擇性系統包括但不限於,分別可在tk-、hgprt-或aprt-細胞使用之泡疹單純病毒胸苷激酶基因(Wigler等人,Cell 11:223(1977)),黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因 (Szybalska等人,Proc. Natl. Acad· Sci. USA 48:2026(1962))與 腺口票呤鱗酸核糖基轉移酶(Lowy等人,Cell 22:817 (1980))。 另外,可使用抗代謝物抗體做為選取賦予甲氨喋呤抗性之 dhfr基礎(O’Hare等人,Proc· Natl· Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)),賦予霉酚酸抗性之gpt基因(Mulligan等人,?1*〇(:· Natl. Acad. Sci. USA 78:2072(1981)),賦予胺基配糖體G-418 抗性之新黴素基因(Colberre-Garapin等人,J. Mol· Biol. 150: 1(1981)),嘌呤黴素,與賦予對高黴素抗性之高黴素基因 (Santeire等人,Gene 30:147(1984))。另外之可選擇基因包括 允許細胞利用吲嗓取代色胺酸之trpB、允許細胞利用· histinol取代組胺酸之hisD(Hartman等人,Proc· Natl· Acad. Sci. USA 85:8047(1988))與賦予對鳥胺酸去羧基酶抑制劑 -2-(二氟甲基)-DL-鳥胺酸,DFMO抗性之ODC(鳥胺酸去竣 基酶)(McConlogue(1987)於:Current Communications Jn Molecular Biology, _C〇m—Spring 丑arbor Laboratory)。 治療病患流感病毒感染之方法包括,施予病患一種有效 量之可專一性結合流感病毒M2蛋白之人類、人性化與嵌合 抗體,以治療病患之流感病毒感染。該抗體可在病患感染 前施與抗體亦即預防,實質上與感染同時施用或感染後亦 即治療處理。 84126 -43- 200407161 本發明方法包括提供病患治療優點,例如減少或降低一 或多種與流感病毒感染相關之症狀或併發症,減少或抑制 一或多種流感病毒品系或分離物之病毒滴定度、病毒複 製、病毒增生或病毒蛋白的量增加之方法。可減少或降低 之與流感病毒感染相關之症狀或併發症包括例如寒顫、發 燒、咳漱、喉p龍痛、鼻充血、竇充血、鼻感染、竇感染、 身體痛、頭痛、疲倦、肺炎、支氣管炎、耳朵感染或耳朵 痛。治療優點,亦得包括減低病患對流感病毒感染之易感 性或加速流感病毒感染的病患之復原。 在一個具體實施例,該方法包括施予病患有效量之專一 性結合流感病毒M2之人類、人性化與後合抗體,以抑制病 患之病毒感染或降低病患受一或多種流感病毒品系或分離 物所感染的易感性。在不同方面,該抗體係在病患感染之 前(預防)、實質上同時或之後(治療)施用。該抗體能提供治 療優點,包括例如減少或減輕流感病毒感染之一或多種症 狀或併發症之嚴重性或持續期(例如寒顫、發燒、咳嗷、喉 嚨痛、鼻充血、竇充血、鼻感染、竇感染、身體痛、頭痛、 疲倦、肺炎、支氣管炎、耳朵感染或耳朵痛)、病毒滴定度 或一或-多種流感病毒品系或分離物之病毒务 對一或多種流感病毒品系或分離物感染之易感性。 本發明進一步提供對病患之治療優點與因而防止或抑制 流感病毒滴定度、病毒複製、病毒增生或流感病毒蛋白的 量增加之方法。在一個具體實施例,該方法包括施予病患 有效量之專一性結合流感病毒M2之人類、人性化與嵌合抗 84126 -44- 200407161 體,以防止一或多種流感病毒品系或分離物在病患活體内 之病毒滴定度、病毒複製或病毒蛋白的量增加之方法。 本發明另外提供保護病患免於受一或多種流感病毒或分 離物感染、減低病患對流感病毒感染之易感性並加速感染 的病患復原之方法。在一個具體實施例’该方法包括施予 病患有效量之專一性結合流感病毒M2之人類、人性化與嵌 合抗體,以保護病患免於一或多種流感病毒品系或分離物 之感染、有效減低病患對流感病毒感染之易感性或加速感 染的病患之復原。 本發明方法得以任何具有與下列細胞株(例如融合瘤或 CHO細胞株)生產之抗體相同之結合專一性,或具有實質上 相同結合親合力之抗體來實現··號碼2074(ATCC貯存號碼 PTA-4025,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)、 161(ATCC貯存號碼PTA-4026,美國式培養收 VA,USA)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)、L66(ATCC 貯 存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/11接受)、C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/11接受)、L17(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA)與C40、 L3 0、L40、S212、S80、S900(分別為ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 本發明之方法,包括治療、診斷與純化/分離,皆適用任 何流感病毒品系/分離物或品系/分離物之組合。該流感病毒 84126 -45- 200407161 品系之特定的非限定實例為,A/PR/8/34或A/HK/8/68,或 其他選自下列之品系H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H9N2、 H2N 卜 H4N6、H6N2、H7N2、H7N3 、H4N8、H5N2、H2N3、 H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、H2N3、H6m、 H13N6、H7N1、H11N1、H7N2與 H5N3。 本發明之人類、人性化與嵌合抗體可單獨使用或與具有 抗-流感病毒活性之藥劑聯合使用,該活性包括例如抑制流 感病毒感染、複製、增生或減輕與流感病毒感染相關之一 或多種症狀或併發症之嚴重性或持續性。此類組合之實例 包括,含二或更多之具有不同結合專一性、結合親合力、 或在活體外或活體内抑制流感病毒感染細胞之效率的不同 M2抗體。據此,聯合組合物包括提供之M2抗體以及根據本 發明方法使用此種聯合物之方法。 本發明方法包括治療流感或與流感病毒感染相關之病症 或併發症,因此可改善病患病情、減輕與流感病毒感染相 關之一或多種症狀或併發症之嚴重性或持續性、或減少病 患症狀發展或受到感染之風險,例如對流感病毒感染之易 感性。因而,改善包括減少或降低一或多種與流感病毒感染 相關之病毒增生、複製或低定度或症狀或併發症。改善亦 包括減少用來治療具有流感病毒感染風險之病患的劑量頻 率或抗病毒藥或其他藥物,或減輕與流感病毒感染相關之 症狀或併發症。 改善未必完全減輕與流感病毒感染相關之任何或全部症 狀或併發症。而且,治療得為任何可測量或可彳貞測之抗流 84126 -46- 200407161 =毒的效果或改善。因此,t病患之病情或相關症 Γ逐步改善或部分減輕,或μ期或長期抑制病情惡 匕時,即達令人滿意的臨床終點。 者?:::療”患包括彼已感染或有流感病毒感染風險 =、目“患亦包括彼具有發展與流感病毒相關症狀 =之風險者。因而,本發明方法適用於治療具有流感病 母心染風險之病患或與流感病毒感染相關之併發症。因 而’包括預防方法。 、適於治療之風險下的病患包括,暴露於其他有流感病毒 《病患的病患’或因病毒感染性或細胞向性、免疫易感性 (例如’免疫妥協的病患)或環境因素等改變之流感病毒感染 增加之情形。 M2抗體得做為單一或多重劑量施用,例如每週一次達約 =10週,或適當時可長達例如,可減輕—或多種與流感· 病母感染相關之症狀或併發症之嚴重性。劑量可改變,視 :治療為預防或治療性者,與治療相關之病症或併發症之 嚴重性,所要的臨床終點,先前或同時的治療,病患之一 般健康、年齡、性別或種族與其他熟諳此藝之技術人員了 解又因素。熟請此藝—者會了舞〒 點之足夠量所需的時機之因素。劑量得經實驗決定或利用 動物疾病模式或視情形之人類臨床診斷來決定。 π病患π用語意指動物,典型地為哺乳類動物,諸如非人 類又靈長類(猿猴、長臂猿、黑猩猩、紅毛猩猩、猴子)、家 庭動物(狗與貓)、農場動物(馬、牛、山羊、綿羊、豬)、實 84126 -47- 200407161 驗動物(小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠)與人類。病患包括動物 疾病模式,例如本文例示之流感病毒感染之小鼠動物模式。 本發明之M2抗體,包括其修飾型、變體與子序列與編碼 M2抗體之核酸,其得併入醫藥組合物。此類醫藥組合物具 有在活體内或在細胞内施予病患之用途。 施予病患前’得將抗體包括於醫藥可接受載體或賦形 劑。如本文所用者,π醫藥可接受”與”生理可接受”包括與施 用之醫藥組合物相容之溶劑(水性或非水性)、溶液、乳液、 分散劑媒介、塗覆物、等張與吸收促進或延遲劑。此種處 方得包含於錠劑(塗覆或未經塗覆)、膠囊(硬或軟)、微珠、 乳液、粉劑、顆粒、結晶、懸浮液、糖聚或舰劑。組合物 中亦得併入補充之活性化合物(例如防腐劑、抗菌劑、抗病 毒劑或抗真菌劑)。 可將醫藥組合物處方成與特定施用途徑相容者。因此, 醫藥組合物包括適用於不同施用途徑之載體、稀釋劑或賦 形劑。 對穿黏膜或穿皮施用時,在處方中使用適於滲透障礙之 穿透劑。此類穿透劑通常為此藝所熟知,並包括例如穿黏 膜施用清潔劑、―膽鹽與叛鏠抱酸衍生物。對穿皮施用—而―言, 將活性化合物處方成如此藝一般所熟知者之氣溶膠、噴 劑、油貫、軟骨或乳霜。 適於本發明方法與組合物之醫藥處方與輸送系統係此藝 所熟知者(例如參照 Remington^ Pharmaceutical (1990)第 18版,Mack Publishing Co.,Easton,PA; The Merck 84126 -48- 200407161
Index (1996)第 12版,Merck Publishing Group,Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms;] Technonic Publishing Co” Inc·,Lancaster,Pa.,(1993);與 Poznansky等人,Drug Delivery Systems, R.L. Juliano,編者, Oxford,Ν·Υ.(1980),253-3 15 頁)。 為了容易施用與劑量一致性,得將該醫藥處方包裝成單 位劑量型式。本文所用單位劑量型式,意指適於所治療病 人的單一劑量之物理不連續單位,每個單位含經計算在聯 合醫藥載體或賦形劑後可產生所需治療效果之預決定量的 活性成分。 本發明提供包括M2抗體之套組、編碼M2抗體之核酸及其 醫藥處方’包裝於適當包裝材料。套組典型包括標籤或包 裝之插入物包括說明成分或其中成分之活體外、活體内或 細胞内使用之指示。套組得含有此類成分之集合,例如兩 種或更多之人類M2抗體單獨或與抗病毒藥或藥物組合。 包裝材料”用語意指容納套組成分之物理結構。包裝材 料得維持成分無菌,並能做成一般為此目的之通常的使用 材料(例如紙、波浪型纖維、玻璃、塑膠、錫箔紙、安訊等 等)。標籤或包裝插入物―得包括適當―寫成之指示。 因而’本發明套組得另外包括以本發明之方法使用該套 組成分之標藏或指示。該指示得包括任何實現本文所述發 明方法的指示,·包括治療、偵測、檢測或診斷法。因此, 該套組得包括例如具有一或多種本文所述抗流感活性之人 類M2抗體,加上以本發明之治療方法施用該抗體之指示。 84126 -49- 200407161 該指示得以f’印刷品π呈現,例如在套組内或附於套組之 紙張或厚紙板上,或在附於套組或包裝材料之標籤上,或 附著於含該套組成分之小瓶或管子。該指示得另外包括於 電腦可讀取之媒介,諸如、磁碟(軟碟或硬碟)、諸如CD-或 D VD-ROM/RAM之光學CD、磁帶、諸如RAM與ROM之電子 貯存媒介以及這些之諸如磁性/光學貯存媒介的混種。 本發明套組得在所包含之人類M2抗體的醫藥處方外,另 包括生長培養液(例如,供生產M2抗體細胞株之用)、緩衝 劑或防腐劑或安定劑。該套組之每個成分皆得包含於個別 容器,而且所有不同容器皆得包含在單一包裝。本發明套 組得設計供冷藏。本發明套組得進一步設計成含生產人類 M2抗體之融合瘤或其他宿主細胞(例如,CHO細胞)。可將 套組中之細胞維持於適當貯存條件備用。例如,包括一或 多種融合瘤或其他細胞之套組得包含適當細胞貯存培養液 (例如10-20%DMSO之諸如DMEM、α -MEM等等的組織培養 生長培養液)使得細胞得解滚並生長。 本發明之人類M2抗體具有分離、偵測或純化M2多肽之用 途。此類方法包括令經懷疑含M2之樣本(在溶液中、在固 -相、在活體外或在活體内,貪袁 抗體於允許結合條件下接觸,並偵測M2存在或純化結合之 M2蛋白。 — 因而,本發明亦提供偵測受測樣本之M2或流感病毒的方 法。在一個具體實施例,該方法包括令具有或經懷疑含M2 或流感病毒之樣本於允許偵測樣本中M2條件下與人類M2 84126 -50- 200407161 抗體接觸,並決足是否受測樣本中有M2存在。%2或流感病 毒之偵測可利用諸如免疫沉澱、西方污潰雜合、免疫組織 化學染色或流動細胞計數法。 M2與流感病毒偵測法在偵測1^2與流感病毒之診斷法中 有"用途例如’在,瓦感病毒量增加或減少係與流感病毒 感染I發展或回歸相關時,本發明抗體即具有偵測任何M2 或流感病毒增加或減少之用途。此外,在減低%2或流感病 毒f之處理治療後,需偵測%2或流感病毒之量時;不論在 治療則、其期間或之後,長或短期,皆可使用本發明抗體 偵測這種M2或流感病毒量的增加或減少。 因而,本發明亦提供偵測病患之受測樣本(含生物流體、 細胞或組織或諸如活體組織檢查之器官樣本)是否存在M2 或流感病毒之方法。在一個具體實施例,該方法包括令來 自病患之具有或經懷疑含M2或流感病毒之樣本,於允許偵 測M2或流感病毒條件下,與人類%2或流感病毒抗體接觸; 並決足是否病患之受測樣本中有M2或流感病毒存在。 亦可使用人類M2抗體以偵測是否有m2或流感病毒存 在,以進行病患之診斷或追蹤治療,或測定病患之活體内 的M2量。例如,如上述般令經懷凝含M2或流感病毒 於允许I生結合之條件下與M2抗體一起保溫,彳貞測到M2 或流感病毒之存在。 - 除非有其他定義’本文所用之全部技術與科學用語,皆 與一般熟請本發明所屬技藝的人所知者具相同意義。儘 管,可使用類似或相當本文所述之方法與材料以實現或測 84126 -51 - 200407161 試本發明,本文仍說明適當之方法與材料。 本文所引用之全部應用、出版品、專利與其他參考資料、 GenBank之引用與ATCC之引用,皆全文並列於此供參考。 若有衝突時,悉以包括定義之專利說明書為準。 如本文所用者,除非另有其他詳述,否則’’一個’’、”與π 以及’’該”皆包括複數之參考。因此,例如提到π —個M2抗體 π即包括該抗體之複數型,而提到” 一種抗流感活性或功能π 可包括所提之一或多種活性或功能等等。 本發明之一些具體實施例已有說明。然而,應了解在不 偏離本發明精神與範疇之情形可做不同修飾。據此,下列 實例係欲說明而非限制申請專利範圍所述之發明範疇。 實例 實例1 此實例說明不同材料與方法。 肽合成與肽-KLH共親體:利用Multiple Peptide Systems (San Diego, CA)合成M2肽。經HPLC後肽純度>95%。然後 以相同條件,將M2肽與KLH(M2-KLH)以及BSA(M2-BSA) 共輛結合。M2肽之23個胺基酸胞外序列為:SLLTEVETPI RNEWGCRCNDSSD(序列辨識號碼:1)。 小鼠(懷有人類免疫球蛋白區域之人類染色體片段的人 轉-染色體小鼠(Ishida 與 Lonberg,IBCVs 11th Antibody Engineering Meeting. Abstract(2000);與 Kataoka,S. IBC’s 13th Antibody Engineering Meeting. Abstract(2002))係得自曰 本麒麟釀造(Kirin Brewery)公司並收容於La Jolla Institute 84126 -52- 200407161 for Allergy and Immunology之動物設施。C57BL/6J小鼠係購 自 Bar Harbor,ME 的 Jackson Laboratories 並收容於 La Jolla Institute for Allergy and Immunology動物設施。 免疫注射:將 M2-KLH 或 M2-BSA 之 PBS(GIBC〇 BRL, Rockville,MD)混以等量完全 Freund’s佐劑(CFA)(Sigma,St. Louis,M〇)並製備乳液。令小鼠同時接受20微克之M2-KLH 或M2-BSA之CFA皮下免疫注射,並於21天後皮下追加注射 20微克之M2_KLH或M2-BSA之不完全Freund’s佐劑(IFA) (Sigma,St· Louis,M〇)或腹膜注射 RIBI(Corixa,Hamilton MT),再經21天後重複一次。在融合前3天,進行不含佐劑 之10微克M2肽之最終腹膜與靜脈内注射係。 ELISA:融合瘤生產之抗體滴定度與抗體專一性以及抗體 係由ELISA決定。簡言之,以濃度1微克/毫升,利用碳酸鹽 缓衝液(pH9.6),經4°C隔夜或37°C 1小時,將50微升之· M2-BS A或M2肽塗覆於96井平底盤(Nunc,Denmark)。以 PBS/0.1% Tween20洗兩次,以 PBS/1% BSA(Sigma,St. Louis, MO)經37°C 30分鐘阻斷平盤,將抗體或血清加入井中並保 溫平盤於37°C 1小時。洗4次後,將稀釋之HRP共輛結合之 山羊抗-人類免疫球蛋白r -鏈專一性抗體(Jackson Immunor-esearch Laboratory,West Grove,PA)力口 入井中,並保 溫於37°C 1小時。洗4次後,添加TMB受質溶液(DAKO, CA) 並保溫於室溫30分鐘。利用微盤讀取機測450nm之光密度。
同型ELISA :經ELISA決定融合瘤生產之抗體同型。簡言 之,以濃度1微克/毫升,利用碳酸鹽緩衝液(PH9.6),經4°C 84126 -53- 200407161 隔夜或37°C1小時,將50微升之M2-BSA或M2肽塗覆於96井 平底盤(Nunc,Denmark)。以 PBS/0.1% Tween 20洗兩次,經 PBS/1% BSA(Sigma,St· Louis,MO)室溫 1小時阻斷平盤,將 抗體加入井中,保溫平盤於室溫1小時。洗3次後,將兩種 稀釋之HRP_共輛結合之小鼠抗-人類IgGl、IgG2、IgG3與 IgG4重鏈偵測抗體(Zymed,San Francisco, CA)加入井中,並 保溫於室溫1小時。洗3次後,添加TMB受質溶液(DAKO, CA) 並保溫於室溫30分鐘。利用微盤讀取機測450nm之光密度。 以流感A型病毒感染細胞為基礎之ELIS A :將150微升/井 之 1·5χ105 細胞 / 毫升之 MDCK 細胞(Madin-Darby Canine Kidney上皮細胞;ATCC,Rockville,MD),鋪於96井平底盤 (Falcon®)並以7%C〇2培養48小時。48小時後,以PBS洗平底 盤兩次,並以30微升之100倍TCID5〇流感A型病毒(A/PR/8/34 或A/HK/8/68; ATCC,Rockville,MD)於室溫之定時旋轉下感 染30分鐘。感染後,以PBS洗一次,並添加含150微升之1 微克 / 毫升胰蛋白酶(TPCK-treated,Worthington,Biochem. Corp·)之最低必須培養液(Minimal Essential Media) (Invitrogen Corp,CA)而且保溫平盤27小時。感染後,以 PBS/l%FCS(GIBCO BRL,Rockville,MD)洗細胞單層 3次,並 以PBS/1%BSA/5%FCS於室溫阻斷30分鐘。稀釋抗體並於每 個井中加入50微升,於室溫保溫45分鐘。洗4次後,在每個 井中加入50微升之稀釋成1: 3000之HRP共軛結合之兔子抗-人類免疫球蛋白T -鏈抗體(DAKO,Denmark),並將平盤保 溫於室溫30分鐘。洗5次後,添加1〇〇微升之含TMB受質 84126 -54- 200407161 (DAKO,Denmark)的 1 毫莫耳濃度之 Levamisole 溶液(Vector Laboratories Inc· Burlingame,CA)並於室溫保溫平盤 15 分 鐘。將50微升上澄液轉移至含100微升停止溶液(1當量濃度 H2S〇4)之新的96井平盤(Nunc,Denmark)並利用微盤讀取機 測定450nm之光密度(OD)。如前述計算每個抗體之ECw (Sette等人Nature 328:395(1987))。將10微克/毫升之號碼 2074抗體的OD資料設成100%之内在對照組。 以流感A都病毒感染細胞為基礎之ELISA的肽競爭:如上 述製備病毒感染之MDCK細胞。混合M2肽與抗M2抗體並保 溫於室溫30分鐘。保溫後,添加50微升之肽與抗體混合物 以阻斷細胞,並保溫於室溫30分鐘。洗4次後,在每個井中 加入50微升之稀釋成1 : 3000的HRP共軛結合之兔子抗-人類 免疫球蛋白r -鏈抗體(DAKO,Denmark),並保溫平盤於室 溫30分鐘。洗5次後,添加100微升之含TMB受質(DAK0, Denmark)的 1 毫莫耳濃度 Levamisole 溶液(yect〇r Laboratories Inc. Burlingame,CA)並於室溫保溫平盤 15 分 鐘。將50微升上澄液轉移至含100微升停止溶液(1當量濃度 ΗβΟ4)之新的96井平盤(Nunc, Denmark)並利用微盤讀取機 測定450nm時之光密度。 融合瘤生產:選取有最高抗體滴定度之小氣以生產單株 抗體。收取胰臟並將其單一細胞懸浮液與骨髓瘤細胞株 (SP2/0-Agl4)(ATCC, Rockville, MD)以 3 : 1 比例經 50%PEG(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)融合。以最 適密度將融合物鋪於96井平盤,並培養於37°C培養箱中之 84126 -55- 200407161 含 5%C02 的完全 RPMI-10培養液(RPMI 1640加上 10%FCS, 1 %非必需胺基酸,2毫莫耳濃度L-麩胺醯胺,50微莫耳濃度 2-ME,100單位/毫升青黴素與1〇〇微克/毫升鏈黴素硫酸 鹽)。每種融合物皆經ELISA篩選約2000個融合瘤生長槽。 將與M2肽為正結合之細胞轉移至24井平盤並進行4回合之 限制稀釋以取得單株抗體。以流感A型病毒感染細胞為基礎 之ELISA進一步證實抗-M2單株抗體。 抗體純化:為純化抗體,將融合瘤培養於Integra系統 (INTEGRA Bioscience,Inc· Ijamsville,MD)加上融合瘤 -SFM(GIBCO BRL,Rockville,MD)。人類單株抗體係使用 Protein A-Sepharose Fast Flow 膠(Amersham Pharmacia Cat# 17-0618-02, Uppsala,Sweden)由培養液中純化出。簡言 之,將含適當量之管柱容量的抗體之調整過的培養液以0.22 微米圓盤滤器過滤(Minisarto-plus,Sartorius Cat#17822, Gettingen,Germany)並負載於2.0毫升之以磷酸緩衝鹽液 (PBS)平衡之 Protein A-Sepharose Fast Flow管柱。以逾40 毫 升之PBS洗管柱,並以0.1莫耳濃度Gly-HC卜 ρΗ3·6、0.15 莫耳濃度NaCl溶離抗體。在最初之1.0毫升溶離緩衝液通過 後,以5.0毫升/管體積收集3個不同之溶離部分,並立即以 250微升之1莫耳濃度Tris-HCl、ρΗ8·0中和之。重複此純化 過程直至所有調整過之培養液都處理過。以人類IgG-專-一 性ELISA決定抗體濃度,並收集含抗體之所有部分而且以離 心濃縮器(Vivaspin 20, 30,000MWCO : Sartorius Cat#VS2022, Gettingen,Germany)濃縮。 84126 -56- 200407161 為去除熱原,濃縮樣本以緩衝液交換成ρΗ6·6之20毫莫耳 濃度磷酸鈉,負載於以相同緩衝液平衡過之0.5毫升 SP-Sepharose HP 管柱(Amersham Pharmacia Cat#17-1087-01, Uppsala,Sweden)。為去除熱原,首先讓樣本通過與 SP-Sepharose HP 管柱系列連接之 2 毫升 Q-Sepharose Fast Flow 管柱(Amersham Pharmacia Cat# 17-0510-01,Uppsala, Sweden)。施用後,移去Q-Sepharose Fast Flow管柱,以 0至 0.5莫耳濃度線性梯度之氯化鈉溶離抗體。以280nm偵測抗 體並總合含抗體部分。經離心濃縮器濃縮樣本並利用 NAP25 去鹽管柱(Amersham Pharmacia Cat#17-0852-02, Uppsala,Sweden)將樣本緩衝液交換入PBS。以人類IgG專一 性ELISA定量抗體濃度。據Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 分析(Associates of Cape Cod,Inc·,Falmouth,ΜΑ)定出樣本 之熱原量小於0.13 EU/毫克蛋白。 人類抗-M2抗體(C40)基因之分離:離心收集生產C40抗體 (同型:IgG4)之培養的融合瘤細胞(113C-40-H-22),利用 ISOGEN (NIPPONGENE,Co·,Ltd)由這些細胞純化240微克 之總 RNA,其後並利用 Oligotex TM-dT30<Super>(Takara Shuzo,CO·,Ltd·,Japan)由 120 微克總 RNA 純化 3 微克聚 A + RNA。使Ji] SMART RACE cDNA放大套組(Clontech,Co·,Ltd·, CA)由以融合瘤細胞為來源之聚A+ RNA選殖免疫球蛋白-基 因可變區cDNA。簡言之,第一股cDNA係以逆轉錄酶由2微 克聚A+RNA製成。以此cDNA為模板,進行聚核酶鏈反應 (PCR)以放大包括引導體序列之重鏈與輕鏈可變區(分另U為 84126 -57- 200407161 HV與 LV)。該反應如下·· 2·5 單位 TaKaRa LA TaqTM DNA 聚合酶(Takara Shuzo,Co·,)、〇·2微莫耳濃度之一邊引子(對 重鏈:IgGlp,對輕鏈:hk-2,參照表1)、0.2微莫耳濃度之 另一邊引子(附於SMART RACE套組之UMP引子)、各自為 400微莫耳濃度之dNTP混合物、LA PCR緩衝液II(Mg2+正) (終濃度為lx)與cDNA模板。 熱循環程式為94°C 5分鐘,其後為94°C 10秒鐘30循環,68 °C 1分鐘,並72°c 7分鐘之延長。經乙醇沉澱與後續之瓊脂 膠電泳,收集放大之DNA片段;並經QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen Co·,Ltd.,Germany)純化。兩種 PCR放大產物之核 苷酸序列(HV與LV)係以特定引子(HV : hh-4,LV : hk-5與 hk-6,引子序列請參照表1)證實。將純化之HV與LV的DNA 片段整合入pGEM⑧-T Easy Vector System(Promega Co·),將 每個質體建構物電孔動化入大腸桿菌細胞然後選殖。利用· 特定引子(SP6與T7,參照表1)分析質體建構物之每個插入 之核甞酸序列(HV與LV)。質體建構物之HV與LV的核钻酸序 列與PCR產物者完全一致。HV與LV之核^:酸序列與這些胺 基酸序列如下。 C40重鏈可變區(HV)—之cDNA的核—誓酸序列」(也 子(ATG)-至可變區終點)- ATGAAGCACC TGTGCTTCTT CCTCCTGOTG GTGGCGGCTC CCAGATGGGT CCTGTCCCAG 60 CtGGAGCTGC AGGAGTCGGG CCCAGGACTG GTGAAGCCTT CGGAGACCCT GTCCCTCACC 120 TGCACTGTCT CTGGTGGTTC CATCAGCAGT AGTTTTT!ftCT ACTGTGGCTG GATCCGCCAG 180 84126 -58- 200407161 GCCCCAGGGA AGGGGCTGGA GTGGATTGGG AGTATCTATT ATCGTGGGAG CACCTACTAC 2-4 0 AACCCGTCCC TCAAGAGTCG AGTCACCATA TCCGTAGAC^ CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC 300 CTGAAGCTGA GCTCTC3TGAC CGCCGQ^GAC ACGGCTGTGT ATTACTGTGC GJ^GACGGGTT 360 ACTATGGTTC GGGGAGTTAA GGGGGACTAC TTTGACTACT QGGQCCAGGG AACCCTGGTC 420 ACCGTCTCCT CA 432 (序列辨識號碼· 9) C40輕鏈可變區(LV)之cDNA的核苷酸序列,(由起始密碼 子(ATG)至可變區終點)_ ATGAGGGTCC TCGCTCAGCT CCTGGGGCTC CTGCTGCTCT GTTTCCCAGG TGCCAGATGT 60 GACATCCAGA TGACCCAGTC TTCCATCCTCA CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CAGAGTCACC 120 ATCAGTTGTC GGGCGAGTCA GGGTATTAGC AGCTGGTTAG CCTC3GTATCA GCAGAAACCJI 180 GAGAAAGTCC CTAAGTCCCT GATCTATGCT GCATCCAGTT TGCAAAGTGG GOTCCCA.TCA 240 AGGTTCAGCG GCAGTGGATC TGGGAGAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGCAGCCT 300 GAAGATTTTG CAA-CTTATTA CTGCCAACAG TATAATTATT ACCCGCTCAC TTTCGGCGGA 350 GOGACCAAGG TGGAGATCAA ACGA 334 (序列辨識號碼:1 0) C40重鏈可變區(HV)之cDNA的胺基酸序列,(引導者序列 (下畫線者)與可變區)- MKHLTOPLLL VAAPRWVLSQ LQLQESGPGXi VKPSETLSLT CTVSGGSISS SFYYCGWIRQ 60 PPGKGLEWIG SlYraGSTYY NPSLKSRVTI SVDTSKNQFS LKLSSVTAAT TAVYYCARRV 120 TMVROVKGDY FDYWGQGTLV TVSS 144 (序列辨識號碼:1 1 ) C40輕鏈可變區(LV)之cDNA的胺基酸序列,(引導者序列 -59- 84126 200407161 (下畫線者)與可變區)- MRVLAQLLGL LLLCFPGARC DlQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCIU^SQGIS SVILAWYQQKP 60 EKVPKSLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YNYYPLTFGG 120 GTKVEIKR 128 (序列辨識號碼·· 1 2) 同型改變之人類抗-M2抗體(C40-IgGl型)之表現盤體的 產生· 為產生IgGl型同型轉變之C40抗體(最初同型為IgG4),我 們建構新的DNA載體。簡言之,LV的PCR引子對係設計成 在LV兩端具有限制酶之敏感區域者。所用引子對為 M240L5BGL與M240L3BSI(表1),並以LV之質體建構物為模 板。將純化之LV的PCR放大產物再選殖入pGEM®-T Easy Vector System(Promega Co· Ltd·)。證實插入物之核誓酸序 列。以兩種限制酶,Bglll與BsiWI消化質體DNA,並分離〇·4 千鹼對DNA插入物(參照圖1之片段Α)且經瓊脂膠電泳純 化。 以質體載體(IDEC Pharmaceuticals, CA, N5KG1-Val Lark(美國專利號碼6,001,358之N5KG1修飾載體))做為生產 含有JgGl輕鏈與重鏈恆定區的IgGl之表現載體。以Bglll與 BsiWI等·兩種酶消化該載體DNA,並以鹼性磷酸酶(Takara Shuzo, CO.,Ltd·,Japan)做後續處理,將DNA端去磷酸化。 以瓊脂膠電泳與DNA純化套組分離8.9千鹼對之DNA片段 (片段B)。 以 T4 DNA接合酶(Takara Shuzo, CO·,Ltd·,Japan)接合 A與 84126 -60- 200407161 B等兩個DNA片段,並將接合建構物(N5KG1_C40Lv)電孔動 化入大腸桿菌DH5cc品系以生成轉型體。選取正的大腸桿菌 轉型體。 做為第二步驟,以如下方式將HV插入N5KGl_C40Lv DNA 載體:以兩種DNA限制酶,Nhel與Sail消化DNA載體,後續 並去磷酸化。分離9.2千鹼對之DNA片段(片段C)。類似輕鏈 建構物般,HV的PCR之引子對亦設計成在HV兩端具有限制 酶之敏感區域。所用引子對為M240H5SAL與M240H3NHE (表1),並以HV之質體建構物為模板。將純化之HV的PCR 放大產物再選殖入pGEM'T Easy Vector System。證實再選 殖之建構物中的插入物核:y:酸序列。以兩種限制酶,Nhel 與Sail消化質體DNA,並分離0.44千鹼對DNA插入物(參照圖 1之片段D)且經瓊脂膠電泳純化。 以丁4 DNA接合酶接合C與D之兩個DNA片段,並將接合建· 構物(N5KG1_M2C40)電孔動化入大腸桿菌DH5a品系以生 成轉型體。選取正的大腸桿菌轉型體。純化此表現載體, 並證實LV與HV區域之核苷酸序列。在此過程中未導入任何 突變。 合成之DNA引子(序列辨識號碼13_301 號碼 名稱 序列5’至31 長度 13 IgGl TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTTGTG 31-體 14 hk-2 GTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGC 26-體 15 hh-4 GGTCGGAGGGGGAAGACCGATGG 23-體 16 hk-5 AGGCACACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTC 30-體 84126 -61 - 200407161 17 hh-6 GGTCCGGGAGATCATGAGGGTGTCCTT 27-體 18 SP6 GATTTAGGTGACACTATAG 19-體 19 T7 TAATACGACTCACTATAGGG 20-體 20 M240L5BGL AGAGAGAGAGATCTCTCACCATGAGGGTCCT CGCTCAGC 丁 CCTG 44-體 21 M240L3BSI CTCTCTCTCGTACGTTTGATCTCCACCTTG GTCC 34-體 22 M240H5SAL AGAGAGAGGTCGACACCATGAAGCACCT GTGGTTCTTCCT 40-體 23 M240H3NHE CTCTCTCTGCTAGCTGAGGAGACGGTACC AGG 33-體 24 SEQU1783 GGTACGTGAACCGTCAGATCGCCTGGA 27-體 25 SEQU4618 TCTATATAAGCAGAGCTGGGTACGTCC 27-體 26 hh-1 CCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCAC 30-體 27 CMVH903F GACACCCTCATGATCTCCCGGACC 24-體· 28 CMVHF1283 CGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAG 24-體 29 CMVHR1303 TGTTCTCCGGCTGCCCATTGCTCT 24-體 30 hk-1 TGGCTGACCATCTGTCTTCATCTTC 26-體 同型改變之人類抗-M2抗體(IgG4-型C40)之表現裁體的 產生: ........ ._ _________________— — —______________________ ——…. ___________ 為生產IgG4型C40之DNA建構物,使用N5KG4PE DNA載 體取代N5KG1-Val Lark載體。該DNA載體含IgG4之輕鏈與 重鏈的恆定區。生成C40之IgG4載體之程序與IgGl-型C40 者相同。 由CHO細胞生產重組人類抗·Μ2抗體: 84126 -62- 200407161 為生產重組抗體,將生成之DNA載體轉感染入宿主細 胞,並由轉感染細胞之上澄液分離重組抗體。簡言之,其 係利用電孔動化將DNA載體轉感染入Chinese Hamster Ovary細胞(CHO細胞,ATCC#CRL-9096)dhfV-缺陷品系之宿 主細胞。以DNA限制酶,AscI將20微克純化之DNA表現載 體N5KG1_M2C40直線化,並利用別〇1^(1電孔動化器(350乂 500μΡ)將DNA轉感染入4χ10ό之CHO細胞。將轉感染細胞接 種入96井培養盤,並將細胞培養於含Geneticin(Gibco-BRL) 之培養液,以選取含DNA載體之CHO細胞。選取數種安定 之轉感染品系後,以ELISA篩選高的人類IgG生產者,並用 來生產重組抗體。 重組抗體蛋白之分離與純化: 以 EX-CELL培養液 325-PE(JRH Bioscience,Co·,Ltd·)培養 表現重組抗體之CHO細胞。如下述,使用10公升用過的培· 養來純化抗體蛋白:令上澄液通過MabSelect Protein A管柱 (Amersham Pharmacia Biotech,Co·,Ltd·)。為使抗體能吸附 在蛋白A,使用磷酸緩衝鹽液(PBS),溶離時則使用20毫莫 耳濃度擰檬酸鈉緩衝液與50毫莫耳濃度氯化鈉(pH2.7)。溶 雞部分之pH」_使用50毫莫耳濃度磷酸鈉緩街液(pH7.0)調成一 5.5。進;步純化抗體時係使用SP Sepharose管拄(Amersham Pharmacia Biotech,Co·,Ltd.),並以 PBS為溶離緩衝液。 純化之抗體以Super Cup 100 Capsule膜漉器(孔動大小為 直徑0.22微米)過濾除菌。純化的抗體之濃度以280nm之分 光光譜法測定,其中1毫克/毫升之蛋白於280nm時之OD為 84126 -63- 200407161 1.4。由10升CHO細胞培養上澄液純化出17毫克重組 C40-IgGl 抗體。 實例2 : 此實例說明人類與嵌合M2單株抗體之生產與定特徵。 根據衍生自M2胞外區域序列並共軛結合於KLH或BSA以 做為載體之合成的M2肽,對KM小鼠或HAC小鼠免疫注射。 經M2肽為塗覆抗原之ELISA偵測,大部分之小鼠皆以高低 定數回應M2抗原。數種抗-M2之人類單株抗體係利用6個高 反應者之胰臟細胞與骨髓瘤細胞融合物所產生。如表2所 示,取得12個會與M2肽與/或M2-BSA共軛體反應,但對 BSA、KLH(免疫注射之載體)、mGAD(合成之衍生自小鼠麩 胺酸去羧基酶(GAD)之不相關的肽,胺基酸246-266)則無回 應之單株抗體(命名號碼2074、C40、L17、L30、L40、L66、 N547、S212、S80、S900、F1 與 F2)。C40Gl(IgGl)與 C40G4(IgG4) 之編碼序列係選殖自最初之C40基因,並於CHO細胞表現 (實例1)。 人類/小鼠嵌合單株抗體號碼2074與完全之人類抗體 C40G1、S212、S80、S900、N547、L66、F1 與 F2為 IgGl 同 型。C40為IgG4同型、L40為IgG3同型而抗體L17與L30為IgG2 同型(表2)。 84126 -64- 200407161 表2·衍生‘自轉染色體小鼠之抗-M2人類單株抗體之特徵 mAbs 同型 輕鏈 M2 肽* 感染細胞 上之M2** BAS OVA KLH mGAD*%% C40 IgG4 K +1 + 2 - C40G1 IgGl K + + - - - - L17 IgG2 L + + - - - - L30 IgG2 L + + - - - - L40 IgG3 L + + - - - 一 L66 IgGl L + + - - - - N547 IgGl L + + - - - - S212 IgGl L + + - - - - S80 IgGl L + + - - - - S900 IgGl L + + - - - - F1 IgGl K + + - - 一 - F2 IgGl K + + - - - - : M2蛋白最常見之胞外部分,該序列為: SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序列辨識號碼:1) ": 以10微克/毫升與A/PR/8/34或A/HK/8/68感染之 MDCK細胞上表現之M2結合情形 …: 衍生自小鼠麵胺酸去叛基酶(mGAD)位置246-266之 合成的月太 1 : 正之定義為OD450nn^f為負之2·倍以上 2 : 負於〇D450nm時低於0.1 所有抗體都能辨識於流感病毒A/PR/8/34或A/HK/8/68品 84126 -65- 200407161 系感染之MDCK細胞所表現的M2,顯示即使胞外區域序列 有些微不同,該抗體能辨識由兩種不同品系表現之原生型 M2(圖2)。甚且,當呈現M2肽時,抗體與該感染細胞之結合 受專一性抑制(代表性資料請參照表3)。 此二病毒品系之Μ 2序列胞外部分間之差兴僅單一胺基 酸:A/PR/8/34品系之M2胞外部分位置20之天冬胺酸經取代 成苷胺酸。衍生自Α/ΗΚ/8/68序列,所謂普遍的M2胞外部 分,係大部分流感病毒品系所共有(Neirynck等人,Nature Med. 5:1 157(1999))。然而,此一突變廢除一不同的小鼠抗 -M2 單株抗體,14C2之結合(Gerhard等人,Immunological Rev. 159:95(1997)) 〇 號碼 2074、Ν547、L66 ' L17、C40G1 對 A/PR/8/34病毒 品系之抗體反應性相當,並為抗體C40G4、S212與S80者之 約3-5倍大,且超過F1與F2之100倍以上(圖2與表4)。 關於對A/HK/8/68感染細胞上之M2的反應,S212、S80、 S900、F1與F2約比其他抗體小100倍(表4)。如預期,符合不 相關之人類抗-HS A抗體(抗-人類血清白蛋白)之同型,未顯 示任何反應性。 84126 66- 200407161 表3 :在含20微克/毫升之M2肽情形下,mAbs對病毒感染 之MDCK細胞上之M2結合之專一性抑制。 MAbs* A/PR/8/34 M2 OD450 2074 - - 0.051 + - 0.904 + + 0.142 N547 - - 0.065 + - 0.504 + + 0.062 L66 - - 0.051 + - 0.931 + + 0.113 C40G1 - - 0.051 + - 0.799 + + 0.195 * :所有使用之抗體濃度皆為1微克/毫升。 表4 :抗-M2抗體對感染兩種流感A型病毒品系之MDCK細 胞上之原生M2的結合能力。 Abs* 對受 A/PR/8/34 與 A/HK/8/68 感染之 MDCK細胞上之M2的EC5G(微克/毫升) mAbs A/PR/8/34 A/HK/8/68 2074 ' 0.0891 0.1873 C40G1 0.1826 0.0971 C40G4 0.3007 0.8414 S212 0.5001 >10** S80 0.2176 >l〇** 84126 -67- 200407161 S900 0.2063 >10** N547 0.1042 0.4661 L17 0.1511 0.5968 L30 0.1747 3.4914 L66 0.1169 0.2289 F1 >10** >10** F2 >10** >10** : 號碼2074於10微克/毫升時之OD45G設為供EC5G計算 時之100%。背景低於0.1。 : 這些Abs是很弱的結合者,而且10微克/毫升時之 〇D450甚至低於相同濃度之號碼2074者之一半。 抗-M2抗體對突變M2肽之結合活性係利用8種經過報導 之流感A型病毒的不同M2肽(表5,序列辨識號碼:1-8)經 ELISA分析所完成。抗-M2抗體號碼2074、C40、C40G卜L66 與N547顯示對M2肽以及最初之M2肽的結合活性(表6)。尤 其是,C40G1與N547會與本研究所用之全部8種M2肽結合。 A/HK/8/68與A/PR/8/34病毒品系分別具有序列辨識號 碼:1與9之M2蛋白的肽序列。因為,上述之抗-M2抗體會 與受這兩種病毒品系所感染之MD C K細胞表面的Μ 2肽結 合,故遠些抗體也可以與揭示為序列辨識號碼:9之Μ2(亦 即表5之M2G)肽結合。 — 這些結果顯示本發明之抗-M2抗體對結合不同M2之突變 肽具有廣泛專一性,此由突變之流感Α型病毒品系可知。 84126 -68- 表5 M2類似物之序列
M2類似物 M2 M2K M2? M2SG M2PG M2BG M2TGS M2TGE M2G 3ΐ^Ι^ΤΕνΕΤί>ΙΚΝΕΐίσαΚζ;ΝΒ 1 2 3 4 5 6 7 8 9
SLPTEVETPIRN2WGCSCNDSSD £^evetpirnewgcrCNdssd ==B v E T P 工 R 竺 s w G c R c n d s g d -Ltevetpirnewgcrcngssd s^ltevetpiritewecrcn〇ssd SLLTEVETPTR1TGKGCRCs^ssd SLLTEVE2pTR1j§W£CRcJDss^
fJ^T SVETPIRNEWQC R n S S D 下標之粗體字母係與最初之M2序列比較之突變區(序列 辨識5虎碼· 1) _表6 抗-M2抗體對M2類似物之廣合活性 mAbs M2* M2TGE M2EG M2TSG -灰 < 秸合活, —.— M2K M2SG M2P M2FG 2074 +1 + + + + + 2 + C40 + + + + + + + + C40G1 + + + + + + + + L66 + + + + + + - - N547 + + + + …+ + 屮 一 +---------- ΐνί2蛋白最常見之胞外部分為: SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序列辨識號碼:1) 正之定義為〇1)45〇11111時為負之2-倍以上 2 : 負於OD450nm時低於0.1 實例3 69- 84126 200407161 此實例說明動物模式研究顯示動物於感染流感病毒前後 施予本發明之M2單株抗體可保護其對抗病毒之致命激發。 抗-M2 mAb對小鼠流感A型病毒模式之預防處理(病毒感 染前)的活體内效率 為評估在動物模式中抗-M2人類/小鼠嵌合單株抗體之效 率,將抗體號碼2074以200微克/小鼠腹膜内施用於雌性 €5731^/61小鼠(8-10週大)。治療起始後一天,將麻醉之小鼠 (15微升/克愛佛丁(Avertin)(l : 1重量/體積2,2,2_三溴乙醇: 第三戊基-OH,Sigma,St. Louis, MO))鼻内感染30微升(300 pfu/30微升)致死劑量之流感病毒A/PR/8/34(ATCC)。感染兩 天後,令小鼠腹膜内接受另一劑量之號碼2074抗體(200微 克/小鼠)。每天觀測小鼠做存活分析達27天。此期間後犧牲 尚存之小鼠,去除肺部以偵測病毒並做組織分析。存活率 分析列於圖5。做對照組,使用的是與KM小鼠產生之人類 單株抗體抗-HSA IgGl抗體符合之同型(Kirin,Japan)。結果 說明請參照表5。 在對照組中,12隻中有11隻在感染後18天内死亡。相形 之下,抗-M2抗體號碼2074治療之小鼠則受明顯保護。經27 天觀察,12隻中有10隻仍存活。感染27天後犧牲存活小鼠 (10隻來1抗-^12處理組而1隻為對照組)並取出肺部進行病 毒滴定度與組織分析。經病毒溶菌斑分析,這兩組小鼠之 肺部皆未發現可偵測病毒;然而,對正對照組而言, 八/111^/8/68之滴定度為5.95\103?£1;/毫升(表5)。此資料顯示 施予抗-M2抗體可預防小鼠肺部病毒滴定度之增加,而且實 84126 -70- 200407161 質上可促進小鼠活體内之病毒清除。 表5 : A/PR/8/34感染27天後由小鼠肺部之病毒滴定度 樣本 稀釋 溶菌斑數目 pfU/毫升 1-L1* 10'1 0 <50** 1-L2 ι〇-ι 0 <50 1-L3 1CT1 0 <50 1-L4 10-1 0 <50 1-L5 10'1 0 <50 1-L11 10'1 0 <50 A/HK/8/68*** 1〇·3 59.5 5.95x10s : A/PR/8/68感染小鼠之肺均質液。 L1-L5 :抗-M2抗體治療組之樣本。 L11 :同型符合抗體治療組之樣本。(對照組) ": 病毒偵測之門檻為50 pfU/毫升。 : 分析中做為正對照組之病毒。 抗-M2 mAb對小鼠流感A型病毒模式之治療處理(病毒感 染後)的活體内效率 以30微升致死劑量之流感病毒A/PR/8/34(ATCC)鼻内感 染雌性〇576176了小鼠(8-10週大)。麻醉時使用上述之愛佛 丁。每关觀測小鼠達24天做存活分析。 為評估抗-M2單株抗體對流感病毒之治療處理效率,於 病毒感染後施與抗體。C57BL/6J小鼠接受致死劑量之流感 病毒A/PR/8/34病毒激發2與4天後,以腹膜注射方式每次施 予200微克/小鼠之抗-M2抗體號碼2074(總共12隻)。對照組 84126 -71 - 200407161 接受同型符合之不相關的人類單株抗體(日本麟麟釀造公 司之抗-HSA(IgGl))。 在對照組,12隻中有11隻在感染後18天内死亡(圖6)。在 抗體號碼2074組,病毒激發經過24天,12隻中有9隻仍存 活。因此,抗-M2人類/小鼠嵌合單株抗體號碼2074明顯增 加感染A/PR/8/34病毒的小鼠之存活率。 資料顯示抗-M2抗體即使在病毒感染後施用仍有效。此意 味抗體不僅具有預防亦有治療用途。 另進行兩組評估研究。令C57BL/6J小鼠接受致死劑量之 流感病毒A/PR/8/34病毒激發,1、2與3天後,以腹膜内注射 (每組小鼠=8-12隻)方式每次施予200微克/小鼠之抗-M2抗 體 C40G1、C40G4、L30、FI、F2與號碼 2074(做正對照組)。 對照組(總數8或12隻小鼠)接受抗-HSA專一性人類IgGl抗 體注射。與對照組比較,L30、C40G4、F1與F2抗體並未延· 長病毒感染之小鼠的存活(圖3A、B)。對照之下,C40G1抗 體顯示對病毒激發之清楚保護,而且這組隻小鼠即使在感 染後30天仍全部存活(圖3A)。 C40G1、L30與C40G抗體對A/PR/8/34感染細胞(圖4B、表 4)表現之M2或M2-BS A共輛體(圖4A)之結合親和力,彼此間 未有明顧不同。C40G1與C40G4因為皆來自C40抗體,故具 相同之抗原結合位置。因為,L30 (IgG2)與C40G4 (IgG4)未 顯示對病毒激發之保護,而C40G1則明顯保護,對活體内使 用而言,IgGl型抗體具較好之中選潛力。相形之下,F1與 F2抗體儘管與M2-BSA共軛體結合良好,然而,對病毒感染 84126 -72- 200407161 細胞上之M2結合力卻很差(圖4A、B、表4)。F1與F2對病毒 感染細胞上之M2結合力差,可能是其在活體内缺少保護性 之說明。 【圖式簡單說明】 圖1說明C40抗體(C40Lv(序列辨識號碼:1〇))免疫球蛋白 輕鏈之可變區的核苷酸與氨基酸序列以及(C40Hv(序列辨 識號碼:10))重鏈者。 圖 2顯示抗體號碼 2074、N547、L66與 C40G1 與 A)A/PR/8/34 與B)A/HK/8/68病毒感染之MDCK細胞上之M2結合。 圖3顯示A)C40G卜C40G4與L30以及B)號碼2074、F1與F2 抗體的保護效果之比較,而且IgGl同型M2抗體與對病毒感 染MDCK細胞上之M2具弱結合親和力之抗體(亦即F1與F2) 比較提供動物免於致死病毒激發之較大保護。 圖4說明M2抗體與A)M2肽/BSA以及B)流感病毒感染細胞 表現之M2的結合比較。 圖5顯示施予號碼2074之M2抗體對動物之預防保護。 圖6顯示施予號碼2074之M2抗體對動物之治療保護。 84126 73- 200407161 序列表 < 110 >雙子星科學公司 Mikayama, Toshifumi Wang,Rongfang
Kato, Shinichiro Cheroutre, Hilde < 120 >抗流感M2蛋白質之人類單株抗體及其製備 < 130>相關申請案號〇21286-0302340 、 久1更用方法 <M0>待指定(台灣申請案號) < 141 >2003-03-13(台灣案申請曰) < 150 > 60/364,997(主張優先權之基礎案申請案號) <151>2002-03-13(優先權曰) <160 >30個序列
< 170 > Patentln 3· 1 版軟體 <210>序列辨識號碼1 <211>序列長度23 <212>序列類型PRT < 213 >流感病毒 < 400 >序列辨識號碼1 S«r Leu Leu Thr Glu Val GJ-U Thr Pro lie Arg Asn GlU Trp Gly Cy» 1 5 15
Arg Cy$ Asn Asp Ser Ser Asp 20 <2X〇> 2 <211> 23
<212> PRT <213>流感病毒 <4〇〇> 2
Ser Len L«u Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 15 10 _ — .........................................................….
Lys Cys Asn Asp Ser Ser Asp 20 84126 200407161 <210> 3 <211? 23 <212> PR7 <213>流感病毒 <400> 3
Ser Leu Pro Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15
Arg Cys Afin Asp Ser Ser Asp 20 <210> 4 <211> 23 <212> PRT - <213>流感病毒 <400> 4
Ser Leu Leu Tbx Glu. Val Glu Thr Pro lie Arg Ser Glu Trp Gly Cy» 1 5 10 15
Arg Cys Aan Asp Ser Gly* Asp 20 <210> 5 <211> 23
<212> PRT <213>流感病毒 <400> 5
Ser Phe Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Gly Cys 1 5 10 15
Arg Cys Asn Gly Ser Ser Asp 20 <210> $ <211> 23
<212> PRT 祕病―毒— <400> β
Ser I^eu Leu T3xc Glu Val Glu Thr Pro lie Arg Asn Glu Trp Glu Cyss 15 10 15
Arg Cys Aen Qly Ser Ser Asp 20 84126 200407161 <210> 7 <211> 23 <212> PRT <213> 流感病毒 <400> 7
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Thr Arg Asn Gly Trp Gly Cys 15 10 IS
Arg Cys Ser Asp ser Ser Asp 20 <210> 8 <211> 23 <212> PRT <213> 流感病毒 <400> 8
Ser Leu Leu Thr Glu V^lI Glu Tlir Pro lie Arg Asn Gly Trp Glu Cys 15 10 IS
Arg Cys Asn Asp ser Ser Asp 20 <21C> d <211> 432 <212> DNA <213> 人類 <400> 3 60 120 180 240 300 360 420 atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatgggt cctgtcccag ctgcagctgc aggagtcggg cccaggactg gtgaagcctt cggagaccct gtccctcacc tgcactgtct ctggtggttc catcagcagt agftttttact actgtggctg gatccgccag cccccaggga aggggctgga gtggattggg agtatctatt atcgtgggag cacctactac aacccgtccc tcaagagtcg agtaaccata tccgtagacau cgtccaagaa ccagttctcc ctgaagctga gctctgtgac cgccgcagac acggctgtgt: attactgtgc gagacgggtt actatggttc ggggagrnaa gggggactac tttgactact: ggggccaggg aaccctggtc accgtctcct ca 432 200407161 <210> 10 <211> 384 <212> DNA <213> 人類 <400> 10 atgagggtcc tcgctcagct cctggggctc ctgctgctct gtttcccagg tgccagatgt gac^ttccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca gagaaagtcc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataattatt acccgctcac tttcggcgga g-ggaccaagg tggagatcaa acga <210> <211> <212> <213>
11 144 PRT 人類 <400> 11
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp X 5 10 15
Val Lau Ser Gin Leu Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ly« 20 2$ 30
Pro ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Tiir Val Ser Gly Gly Ser lie 35 40 45
Ser Ser Ser Phe Tyr Tyr Cys Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys 50 55 60
Gly Leu Glu Trp lie Gly Ser lie Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr 65 70 ____________ 75________________________________ 80 ._ …----------------------------------------------—
Asxi Pro Ser Leu Lys Ser Arg val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys _ 85 90 95 84126 -4- 200407161
Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala 100 lOS 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Val Thr Met Val Arg Gly Val Lys Gly 115 120 125
Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 I40 <?210> <2H> <212> <213> X2 128 PRT人類 <400> 12
Met Arg Val Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro 15 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly 35 40 45 .lie Ser* Trp Leu Ala Trp Tyr Glti Gin Lys Pro Glu Iiys Val Pro 50 5S 60
Lys Ser Leu lie Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ptie Thr Leu Tlir lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin <31n Tyr Asn 100 105 110
Tyr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 115 120 125 84126 200407161 <210> 13
<211=> 31 <2X2i> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>人工序列說明:引子 <4〇0> 13 tcttgtccac cttggtgttg ctgggcttgt g 31 <210> <211> <212> <213> 14 26 DNA Artifi cial
Sequence <220><223>人工序列說明··引子 <4〇0> 14 gttgaagctc tttgtgacgg gcgagc 26
<210> 15 <211> 23 <212 > DNA <213> Artificial Sequence <220><223>人工序列說明··引子 <400> 15
ggtgccaggg ggaagaccga tgg 23 <210> <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223>人工序列說明··引子<4〇〇> 16 aggcacacaa cagaggcagt tccagatttc 30 -6- 200407161 <2XO> 17 <21X> 27
<212> DNA
Artificial Sequence <220> <223>人工序列說明··引子 <400> 17 ggtccgggag atcatgaggg tgtcctt <2X0> 18 <2ll> 19
<212> DNA <213> Artificial segiience <22〇> <2幻> 人工序列說明:引子 <400> 18 gatttaggtg acactatag
<^χα> ΐ9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <22〇> <2:23>人工序列說明:引子
<400> IS taatacgact cactataggg <210> 20 <211> 44
<212> DNA <213> Artificial Sequence _ -------------------------------- -----------—--------- ---------------- "" <220> 人工序列說明:引子 <400> 20 ag-ag-agagag atctctcacc atgagggtcc tcgctcagct cctg 200407161 <210> 21 <211> 34
<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>人工序列說明:引子 <400> 21 ctctatctcg tacgtttg-at ctccaccttg gtcc
<210> 22 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>人工序列說明:引子 <400> 22 agagagaggt cgacaccatg aagcacctgt ggttcttcct <210> 23 <211> 33
<212> DNA c2l3> Artificial Sequence <220> <223>人工序列說明:引子 <400> 23
Gi^ctctctgc tagctgagga gacggtgacc agg <210> 24 <2ll> 27
<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223>人工序列說明:引子 <400> 24 ggtacgtgaa ccgtcagatc gcctgga 84126 200407161 <2X〇> <21X> <212 > <213 > <22〇> <223 > 25 27 DNA Artificial Sequence 人工序列說明··引子 25 <400> tctatataag cagagctggg tacgtcc 27 <2λ0> <211> <212> <213 > <220> <223> 26 30 DUJA Artificial Sequence 人工序列說明:引子 <40〇> 26 ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac 30 <210> <211> <212> <2L3> <220> <22 3 > 27 24 Dim Artificial Sequence 人工序列說明:引子 <400?» 27 gacaccctca tgatctcccg ga.cc 24 <210> <211> <2L2> <213> c220> <223> 28 24 DNA Artificial Sequence 】人工序列說明:引子 <400> 28 cgacatcgcc gtggagrtggg agag 24 200407161 <210> <211> <212> <213 > <220> <223 > 29 24 DNA Artificial Sequence 人工序列說明:引子 <400> 2$ tgttctccgg ctgcccattg ctct: 24 <2L0> <211> <212> <213> <220> <223> 30 26 DNA Artificial Sequence 人工序列說明:引子 <400> 30 tggctgcacc atctgtctt-C atcttc 26 84126 -10-

Claims (1)

  1. 200407161 拾、申請專利範圍: 1. 一種專一性結合流感病毒蛋白質M2之抗體,其中該抗體 包括人類、人性化或嵌合之單株抗體。 2. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體至少與部分 之M2胞外區域或M2胞外區域之子序列結合。 3. 根據申請專利範圍第2項之抗體,其中該胞外區域包括胺 基酸序列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序列辨1线號 碼:1)。 4. 根據申請專利範圍第3項之抗體,其中該子序列包括 SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序歹 ij 辨識號碼:1)中之4 或多個連續的胺基酸。 5. 根據申請專利範圍第2項之抗體,其中該胞外區域包括該 胺基酸序列SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(序列辨識號 碼:1)之胺基酸取代、插入、刪除或加成。 6. 根據申請專利範圍第5項之抗體,其中該胞外區域包括具 有選自下列之胺基酸取代的序列: SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、 SXLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD ^ SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、 SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、 SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 或 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(分別為序歹辨識號 碼· 2 - 8 ) 〇 84126 200407161 7. 根據申請專利範圍第5項之抗體,該子序列包括選自下列 任何之一的4或多個連續之胺基酸·· SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、 SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、 SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、 SLLTEVE 丁 PTRNGWGCRCSDSSD 或 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(分另ij 為序歹ij 辨識號 碼· 2 - 8) 〇 8. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體係選自 IgG、Ig人、IgM、IgE與 IgD 同型。 9. 根據申請專利範圍第8項之抗體,其中該同型係選自 IgGi、IgG2、IgG3與 IgG4。 10. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體係由下列之 融合瘤或由CHO細胞株所生產··命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、 N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, ~ USA, ATCC^ 2003/3/1 1¾ ¾ ) > L66(ATCCIt #^ ^ ® 式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11 接 受)、C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)與 L17(ATCC 貯存號碼, 美國式培養收集站,Manassas,VA,USA) 〇 11·根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體具有下列之 84126 200407161 融合瘤或CHO細胞株所產生的抗體之結合專一性:命名 號碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、161(ATCC貯存號 碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、L66(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於2003/3/1 1接受)、C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養 收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11 接受)與 L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA, USA)。 12. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體具有與融合 瘤或CHO細胞株所產生之抗體相同或實質上相同之結合 親和力:命名號碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、 161(ATCC貯存號碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美 國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11 接受)、L6 6 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1接受)、C40G1(ATCC 貯存號 碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA) 〇 13. 根據申請專利範圍第12項之抗體,其中該親和力為參考 抗體之約5-100倍範圍,或為參考抗體之約5-5000倍範圍。 14·根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體不論在活體 外或活體内,皆抑制細胞之病毒感染、病毒增生或病毒 複製。 84126 200407161 15. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體不論在活體 外或活體内,皆抑制流感病毒與細胞之結合。 16. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體抑制病患之 病毒滴定度之增加、減低病毒滴定度、減少病毒複製或 增生、或減少一或多種與流感病毒感染相關之症狀或併 發症。 17. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體在該病患已 經暴露於或感染病毒時,能抑制病患之病毒滴定度增 加、減低病毒滴定度、減少病毒複製或增生、或減少一 或多種與流感病毒感染相關之症狀或併發症。 18. 根據申請專利範圍第16或17項之抗體,其中該症狀或併 發症係選自包括寒顫、發燒、咳漱、喉澈痛、鼻充血、 竇充血、鼻感染、竇感染、身體痛、頭痛、疲倦、肺炎、 支氣管炎、耳朵感染與耳朵痛。 19·根據申請專利範圍第16或17項之抗體,其中該抗體具有 下列之融合瘤或CHO細胞株所產生之抗體之結合專一性 . λ · 或結合親和力:命名號碼為2074(ATCC貯存號碼ΡΤΑ-4025)、161(ATCC貯存號碼 PTA-4026)、N547(ATCC貯存 號碼,美國式掩養收集益了―ManRsas,TO「仍 2〇03/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas, VA,USA, ATCC 於 2003/3/11 接受)_、 C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/11接受)與L17(ATCC野存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 84126 200407161
    20.根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體抑制病患之 病毒感染,而且該抗體具有與下列之融合瘤或CHO細胞 株所產生之抗體相同或實質上相同之結合專一性或結合 親和力:命名號碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、 161(ATCC貯存號碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美 國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/1 1 接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1接受)、C40G1(ATCC 貯存號 碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA) 〇 21. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體可減低病患 對病毒感染之易感性。 22. 根據申請專利範圍第21項之抗體,其中該抗體具有下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生之抗體之結合專一性或相 r
    同或實質上相同之結合親和力:命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美―國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11 接受)、 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA) 0 23. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該流感病毒包括流 84126 200407161 感A型病毒。 24. 根據申請專利範圍第23項之抗體,其中該流感病毒包括 A/PR/8/34、A/HK/8/68、H1N卜 H2N2、H3N2、H5N;l、H9N2、 H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3 、H4N8、 H5N2、 H2N3 v H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、 H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2與 H5N3 〇 25. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體以細胞為基 礎之ELIS A分析,定出其抑制MDCK細胞之流感病毒感染 的EC5〇低於3.0微克/毫升。 26. 根據申請專利範圍第25項之抗體,其中該流感病毒包括 A/PR/8/34、A/HK/8/68、H1N1、H2N2、H3N2、H5m、H9N2、 H2N1、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3 、H4N8、 H5N2、 H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、 H2N3、H6N1、H13N6、H7N卜 H11N1、H7N2與 H5N3 〇 27. 根據申請專利範圍第25項之抗體,其中該抗體具有下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生之抗體之結合專一性或相 同或實質上相同之結合親和力··命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547 鴒,美國I ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、 C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA) 〇 84126 -6- 200407161 28.根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體以細胞為基 礎之五1^3人分析,定出其抑制]^12與]\1〇〇1^細胞結合的£(:50 低於3.0微克/毫弁。 29·根據申請專利範圍第28項之抗體,其中該抗體具有下列 之融合瘤或CHO細胞株所產)生之抗體之結合專一性或相 同或實質上相同之結合親和力:命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼PTA-4025)、161(ATCC貯存號碼 PTA-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/11接受)、 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 30. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體可專一性結 合二或多種流感病毒品系或分離物。 31. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體可專一性結 合二或多種具有不同序列之M2蛋白質。 32. 根據申請專利範圍第31項之抗體,其中該M2蛋白質包括 胞外區域。 33. 根據申請專利範圍第32項之抗體,其中該M2蛋白質胞外 區域係選自:· SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、 SLLTEVETPIRNEWGCKCNDSSD、 SLPTEVETPIRNEWGCRCNDSSD、 84126 200407161 SLLTEVETPIRSEWGCRCNDSGD、 SFLTEVETPIRNEWGCRCNGSSD、 SLLTEVETPIRNEWECRCNGSSD、 SLLTEVETPTRNGWGCRCSDSSD 或 SLLTEVETPIRNGWECRCNDSSD(分;^ 為序歹4 辨 1线號 碼:1-8)。 34. —種根據申請專利範圍第1項之抗體之胺基酸子序列。 35. 根據申請專利範圍第34項之抗體,其中該子序列具有根 據申請專利範圍第1項之抗體之結合專一性或結合親和 力。 36. 根據申請專利範圍第34項之抗體,其中該子序列係選自 重鏈與輕鏈可變區(VH與VL)、Fab、Fab·、(Fab’)2、Fv、 Fd、scFv與 sdFv 0 37. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體包括抗體多 體。 38. 根據申請專利範圍第1項之抗體或其子序列,其進一步包 括一或多種異源區域。 39. 根據申請專利範圍第38項之抗體,其中該異源區域包括 胺基酸序i。— _ __________________________________________________________________________________________________________ 40. 根據申-請專利範圍第3 8項之抗體,其中該異源區域包括 結合蛋白、酶活性、藥物、抗病毒、毒素、免疫調節劑-、 可偵測部份或·標籤。 41· 一種根據申請專利範圍第1項之雙專一性或雙功能抗體。 42· —種表現根據申請專利範圍第1項之抗體之宿主細胞。 84126 200407161 43. 根據申請專利範圍第42項之細胞,其中該抗體具有下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生之抗體之結合專一性或相 同或實質上相同之結合親和力:命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC貯存號碼 PTA-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11接受)、 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 44. 根據申請專利範圍第42項之細胞,其中該抗體係由下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生:命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,· ATCC於2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11接受)、 C4〇Gl (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/11接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA) 〇 45. 根據申〜請專利範圍第42項之細胞,其中該細胞為細菌、 酵母菌、植物或動物。 - 46· —種表現根據申請專利範圍第1項之抗體之非人類之基 因轉殖動物或植物。 47. —種編碼由下列之融合瘤或CHO細胞株生產之抗體之核 84126 -9- 200407161 酸··命名號碼為2074(ATCC貯存號碼PTA-4025)、161 (ATCC貯存號碼PTA-4026)、N547(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接 受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1接受)、C40G1(ATCC 貯存號 碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/11接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站, Manassas,VA,USA) 〇 48. 根據申請專利範圍第4 7項之核酸,其進一步包括載體。 49. 根據申請專利範圍第1項之抗體,其進一步包括抗病毒 劑。 50·根據申請專利範圍第1項之抗體,其進一步包括抑制一或 多種與流感病毒感染相關之症狀或併發症之藥劑。 51.根據申凊專利範圍第50項之抗體,其中該症狀或併發症 係選自包括寒顫、發燒、咳嗷、喉嚨痛、鼻充血、竇充 血、鼻感染 '竇感染、身體痛、頭痛、疲倦、肺炎、支 氣管炎、耳朵感染與耳朵痛。 52· —種包括根據申請專利範圍第1項之抗體之醫藥組合物 及醫藥可接受載體或賦形劑。 53· —種包〜括根據申請專利範圍第丨項之抗體之套組,及治 療、抑制、防止或減低病患受一或多種流感病毒品系或 分離物感染之易感性之指示。 54.根據申請專利範圍第53项之套組,其進一步包括將抗體 傳送入黏膜組織之製造物。 84126 •10- 55·根據申社去n 於,專利範圍第53項之套組,其中該製造物包括適 吸入或由鼻腔施予病患之吸入器、氣溶膠、喷霧器或 擠壓瓶。 56.根據由4主^ %專利範圍第53項之套組,其中該黏膜組織包括 鼻道、鼻竇、嘴巴、咽、喉或肺部。 5 7 土 Ε據中請專利範圍印項之套組,其進-步包括抗病毒 劑。 58·根據申請專利範圍第53項之套組,其進一步包括抑制一 或夕種與流感病毒感染相關之症狀或併發症之藥劑。 種/σ療病患之流感病毒感染之方法,包括施予病患有 —里之了專性結合流感病毒M2之人類、人性化或嵌合 的單株抗體,以治療病患之流感病毒感染。 6Q«中請專利範圍第59項之方法,其中該抗體係於病患 感染之前、實質上同時或之後施用。 61·根據申請專利範圍第59項之方法,其中該抗體係於病患 感染實質上同時或之後施用。 " 62·根據申請專利範圍第59項之方法,其中該施用提供治療 iS·處0 63·根據申請專利範圍第59項之方法,其中該治療益處包括 抑制氟患之病毒滴定度増加、減少病毒滴定度、抑制病 毒複製之增加、減少病毒複製、抑制病毒增生之増加或 減少病毒増生或減輕一或多種與病毒感染相關之症狀1 併發症。 $ 64·根據申請專利範圍第63項之方法,其中該症狀或併發症 84126 -11- 200407161 係選自寒顫、發燒、咳漱、喉嚨痛、鼻充血、竇充血、 鼻感染、竇感染、身體痛、頭痛、疲倦、肺炎、支氣管 炎、耳朵感染或耳朵痛。 65·根據申請專利範圍第59項之方法,其中該治療益處包括 加速病患由流感病毒感染之復原。 66. 根據申請專利範圍第5 9項之方法,其中該抗體具有下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生之抗體之結合專一性或相 同或實質上相同之結合親和力:命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11接受)、 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 67. 根據申請專利範圍第59項之方法,其中該抗體係由下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生:命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,—Manassas,VA,. USA, ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於 2003/3/1 1接受)、 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/11接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas, VA,USA)。 84126 -12- 200407161 68·根據申請專利範圍第59項之方法,其中該抗體以細胞為 基礎之ELISA分析,定出其抑制MDCK細胞之流感病毒感 染的EC5〇低於3.0微克/毫升。 69. 根據申請專利範圍第59項之方法,其中該流感病毒品系 包括 A/PR/8/34、A/HK/8/68、H1N:1、H2N2、H3N2、H5N1、 H9N2、H2N :l、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3、H4N8、H5N2、 H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、 H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2與 H5N3。 70. —種抑制病患受一或多種流感病毒品系或分離物感染之 方法,包括施予病患有效量之可專一性結合流感病毒M2 之人類、人性化或嵌合之單株抗體,以抑制病患受一或 多種流感病毒品系或分離物感染。 71. 根據申請專利範圍第70項之方法,其中該抗體係於病患 感染病毒之前、實質上同時或之後施用。 72. 根據申請專利範圍第70項之方法,其中該抗體係與病患 之病毒感染實質上同時或之後施用。 73. 根據申請專利範圍第70項之方法,其中該施用提供治療 益處。 74. 根據申請專利範圍第70項之方法,其中該治療益處包括 保護病患免於病毒感染或減輕病患免於病毒感染之易感 性。 - 75·根據申請專利·範圍第70項之方法,其中該抗體具有下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生之抗體之結合專一性或相 i 同或實質上相同之結合親和力:命名號碼為2074(ATCC貯 84126 -13- 200407161
    存號碼 ΡΤΑ-4025)、161(ATCC 貯存號碼 ΡΤΑ-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/11接受)、 C40G1(ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA) 〇 76.根據申請專利範圍第70項之方法,其中該抗體係由下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生:命名號碼為2074(ATCC貯 存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA,USA, ATCC於2003/3/11接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培 養收集站,Manassas,VA,USA,ATCC於2003/3/11 接受)、 C40G1 (ATCC貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 77·根據申請專利範圍第70項之方法,其中該抗體以細胞為 基礎之ELISA分析,定出其抑制MDCK細胞之流感病毒感 —_染的EC 5 q盤並3 ·滕„克/毫止。—_______________________ _ . _ — . _ 78.根據申請專利範圍第70項之方法,其中該流感病毒品系 包括 A/PR/8/34、A/HK/8/68、H1N卜 H2N2、H3N2、H5N1-、 H9N2、H2N;l、H4N6、H6N2、H7N2、H7N3 、H4N8、 H5N2、 H2N3、H11N9、H3N8、H1N2、H11N2、H11N9、H7N7、 H2N3、H6N1、H13N6、H7N1、H11N1、H7N2與 H5N3。 84126 -14- 200407161 79·根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體包括由下列 之融合瘤或CHO細胞株所產生之抗體的重鏈可變區序列 與輕鏈可變區序列:命名號碼為2〇74(ATCC貯存號碼 PTA-4025)、161(ATCC 貯存號碼 PTA-4026)、N547(ATCC 貯存號碼,美國式培養收集站,Manassas, VA,USA,ATCC 於2003/3/1 1接受)、L66(ATCC貯存號碼,美國式培養收集 站,Manassas,VA,USA,ATCC 於 2003/3/1 1 接受)、 C40G1 (ATCC貝宁存號碼,美國式培養收集站,Manassas,VA, USA,ATCC於2003/3/1 1接受)與L17(ATCC貯存號碼,美國 式培養收集站,Manassas,VA,USA)。 80.根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體包括由序列 辨識號碼9與序列辨識號碼10之核酸序列,或相對於序列 辨識號碼9與序列辨識號碼10為退化之核酸序列所編碼 的重鏈可變區序列與輕鏈可變區序列。 81·根據申請專利範圍第1項之抗體,其中該抗體包括由序列 辨識號碼11與序列辨識號碼12所設定的重鏈可變區序列 與輕鏈可變區序列。 82·根據申請專利範圍第79-81項中任一項之抗體,其中該抗 體包括人類IgGl亞型。 84126 -15 -
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