TW200400262A - Antimicrobial composition - Google Patents

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200400262 玖、發明說明： 【發明所屬技術領域】 一 本發明係關於新穎唾液鏈球菌、含有該菌之組合物、以 及以唾硬鏈球菌株作為抗微生物劑之用途，特別是預防或 治療識齒。 【先前技術】 齲函係疾病，其特徵為牙齒之礦物質部份遭溶解。若 縣齒持續惡化，牙鸯之钱瑯質及象牙質將伴隨嵩髓及根尖 周組織之發炎而遭到破壞。 、交兴性鏈球菌（Ms)係一產酸性、抑制牙菌斑之鏈球菌 群，其被視為引起齲齒之主要原因。目前已辨識出七株不 同之MS菌種（已知為突變开）鏈球菌（s. _tans) ' s·加加、 cricetus S· sobrinus、S· ferus、S· macacae及汗毛鏈球 菌（S. downei))。在這七個菌種中以突變鏈球菌及s. 對人類齲齒最為重要。 過去幾年中曾發展及嘗試多種預防或至少減輕齲齒問題 之方法’其成效各不相同。曾有建議以抗生素如盤尼西林 作為治療，且療效頗佳；但其治療無選擇性地破壞有用的 及有害的細菌，導致口腔内微生物不平衡。 ，為了將口腔中微生物群之破壞降至最低，曾有人研究可 製造抗生素之微生物其抑制齲齒之能力。一群被檢定有此 方面潛力 <微生物為可製造類細菌素抑制物質（BLIS)之微 生物。鏈球菌屬、葡萄球菌屬、及腸桿菌屬中BLIS製造者 可應用於預防齲齒之潛力已經篩選出（Balakrishnan，M•等 人，Caries Res. 2001; 35: 75，）。 83654 200400262 所要尋找係造成疾病之突變鏈球菌之無病毒相似物，或 稱為效應菌株。作為細菌感染替代療法之效應菌株，該微 生物本身需不具毒性，並且不論是經由競爭性行為或是抗 生性行為可成功地與致病微生物競爭。突變鏈球菌之效應 菌株已被辨識出（Hiliman等人，J Dent Res. 1987; 66: 1092-4. James及 Tagg，N Z Dent J· 1991; 87: 80-3)，且具有強烈的抗 突變鏈球菌活性。一使用此突變鏈球菌效應株之缺點為此 菌株可能致癌。 唾液鏈球菌係一可避免此缺點之替代鏈球菌菌種。W〇 0 1 /2 7143中檢定出之唾液鏈球菌有助於治療至少部份為s sobrinus引起之齲齒。一般而言，並沒有抗MS活性之記錄， 尤其疋突’k：鏈球菌。同樣地，Balakrishnan (上述）之研究辨 識出培養於胰化酪蛋白大豆培養液酵母粹取物碳酸飼瓊脂 培養基中之唾液鏈球菌K3具有抗S. sobrinus之活性，但其 對突變鏈球菌沒有影響。 唾液鏈球菌 TOVE-R (Tanzer，J· M·等人；Infect Immun·， 1985，48: 44-50)係一可減少齲齒之拮抗菌株。尚未有報告 顯示此菌株可製造BLIS。 本申請案現辨識出可製造BLIS之唾液鏈球菌株，其對抗 造成齲齒之微生物（包括突變鏈球菌）之活性範圍相當廣泛。 本發明係關於這些新穎唾液鏈球菌株，及抗_MS之唾液鏈 球菌株於治療齲齒上之用途，或至少提供民眾一個有用的 選擇。 【發明内容】 83654 200400262 、、 方面本發明可概括地說係存在於生物學上純 ^養之垂液鏈球菌，其為唾液鏈球菌素a2製造者且具有 MS之活性，此蝻提為此菌株非唾液鏈球菌κι] (κι〕）。 *另彳面’本發明提供-生物學上純系培養之唾液鏈球 囷株’其係唾夜鏈球菌素a2製造者、並具有抗_之活性、 且其碳水化合物（醣類）之代謝對於（至少下列一項）^阿拉 伯糖胃糖、肝糖、木糖醇、及^龍膽二糖之利用或卜半乳 糖苷酶之製造具有促進作用；以及/或者對於（至少下列一項 甘油、α_甲基-D-甘露糖苷酶之利用，或鹼性磷酸酶之製造 具有抑制作用。 較佳的此菌株為可分別促進L—阿拉伯糖、菊糖、肝糖、 木糖醇、及β-龍膽二糖之利用或卜半乳糖苷酶之製造；並且 /或者可分別抑制甘油、甲基-D_甘露糖苷酶之利用或鹼性 磷酸梅之製造。 另一方面，本發明提供一生物學上純系培養之唾液鏈球 菌株Mia ’ 其置存於Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1 b5 D-38124 Braunschweig，德國，序號dSM M685，或一具有其辨識特 性之培養物。 本發明亦ί疋供一可由製造唾液鍵球菌素A:之唾液键球菌 株中取仔之卒取物，其具有抗M S之活性。此萃取物尤立且 有抗突變鏈球菌之活性。此萃取物可方便地由唾液鏈球菌 株Mia或Κ12獲得。 另一方面’本發明提供一包含唾液鍵球菌或如上述之萃 83654 200400262 取物之抗菌組合物。 又另一方面，本發明提供一同時包含唾液鏈球菌或上述 萃取物、稀釋劑、載體及/或賦形劑之治療調配物。 於一具體實施例中，此組合物或調配物更進一步包含一 弟二抗菌劑。 於一具體實施例中，該治療調配物之形式為食品或是飲 料’較佳的為乳製品。替代形式可為藥劑、錠劑、及增甜 劑。 另一方面’本發明提供一方法，其至少可抑制對唾液鏈 球菌敏感之細菌之生長；該方法包括以抑制有效劑量的本 發明唾液鏈球菌、萃取物、或組合物或調配物與敏感細菌 接觸。 較佳敏感細菌為MS ;更佳為突變鏈球菌。 另一方面，本發明提供一至少可抑制MS或突變鏈球菌生 長之方法；其包括以抑制有效劑量之下列物質與MS或突變 鏈球菌接觸： (i) 本發明之唾液鍵球菌萃取組合物或調配物；或 (ii) 唾液鏈球菌K12或其抗MS或抗突變鏈球菌之活性萃 取物’或一包含K12之組合物或調配物或其活性萃取 物。 另一方面’本發明提供一預防或治療因至少部份突變鏈 球菌所造成的識齒之方法予有此需要的個體，此方法包含 施予該個體，至少足以抑制個體口腔中突變鏈球菌生長之 劑量的下列物質： -9- 83654 200400262 (i) 一本發明之唾液鏈球菌、萃取物、組合物、或調配物；或 (ii) 唾液鏈球菌K1 2或其抗突變鏈球菌活性萃取物，或一 包含K12或其活性萃取物之組合物或調配物。 另一方面，本發明提供控制齲齒之發生率及嚴重度之方 法；其包含將本發明之唾液鏈球菌、萃取物、組合物、或 調配物，以齲齒控制劑量施予容易感染齲齒之個體的口腔 〇 於一具β豆貝施例中，鶴齒係由M S引起。於此狀況下，可 使用含有唾液鏈球菌Κ12或一抗MS之活性萃取物，或是包 含此《—者之組合物或調配物。 較佳的係將唾液鏈球菌做為食物、飲品、或健康食品之 一部份施予。 本發明惑万法可包括預前治療之預備步驟，以至少降低 已存在於個體之正常微生物群。 本發明亦關於唾液鏈球菌或萃取物於上述之組合物或方 法中之用途。 另方面本發明亦關於上述方法中唾液鏈球菌（包括K12) 及活性萃取物於抑制、控制、預防、或治療至少部份因突 變鏈球菌（更常為Ms)導致的Μ齒之用途。 雖然本發明如以上所述係、範圍廣泛，熟諳此技藝者應了 :本發明亦包含(但不限於)以下列描述作為實例之具體實 施例。 【實施方式】 由以上得之，本發明认 、 "於一万面係關於可製造唾液鏈球菌 83654 •10- 200400262 素八2及具有抗-MS活性之唾液鏈球菌株。當培養於胰化酪蛋 白大豆培養液酵母粹取物碳酸鈣瓊脂時，此唾液鏈球菌株 如期望地展現對抗廣泛MS (包括突變鏈球菌）之活性。例如 描述於WO 01/27143中之唾液鏈球菌素A2與一製造A2之唾 液键球菌株（K12株），該案係以引用的方式併入本文。 本發明之一具體實施例係關於唾液鏈球菌株Mia及具有 其辨識特性之唾液鏈球菌株。 利用可供碳水化合物研究之Apl 2〇 strep套組（bioMSrieux) 及API 50 CH (bi〇M0deux)來辨別Mia株與K12株於生化特 性上之差異。其差別概要如下： API 20 Strep套組 MIA Κ12 β -半乳糖黎酶 + _ 驗性鱗酸酶 _ +

API 50 CH +厭氧 +嗜氧 甘油 L-阿拉伯糖 α-甲基-0_甘露菩酶 菊糖 肝糖 木糖醇 β-龍膽二糖 本發明所使用之菌株以可具有至少一項與Μ丨a株區分之 生化特性為佳，至少三項較佳，至少六項更佳，以可區分 83654 -11 - 200400262 全部之生化特性為最佳。

Mia亦具有較K12強之抗Ms之活性，特別是抗突變鏈球 菌。 唾液鏈球菌株Mia係一製造BLIS之菌株，其具有對抗其他 細菌，特別是鏈球菌、更特別是MS (包括突變鏈球菌），之 活性。唾液鏈球菌株Mia於2001年12月12日置存於德國布郎 什威克之 Deutche Sammlung von Mikr〇organismen und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 b，D-38124 ;其指定 之記錄號為DSM 14685。 如以上得知，MS被視為引起齲齒之主要原因，尤其是突 變鏈球菌為特別重要。儘管製造BLIS之唾液鏈球菌株其對 杬鏈球菌之活性之前已被公開，但是製造Bus之唾液鏈球 菌株其對抗MS、尤其是突變鏈球菌，之活性係第一次被辨 識出來。 本發明之唾液鏈球g株具有廣大之抗菌活性，尤其是培 養於胰化酪蛋白大豆培養液酵母粹取物碳酸鈣瓊脂培養基 時。因此唾液鏈球菌本身和抗菌劑一樣於治療上很有效。 「治療」在本文中包括預防性的治療。治療上之用途包括 治療或預防微生物感染，尤其是鏈球菌感染。本發明之涎 鏈菌特別適用於對抗MS及突變鏈球菌。本發明之菌株或萃 取物適用之狀況包括識齒、咽喉痛及口臭。 本發明亦關於由可製造唾液鏈球菌素A:之唾液鏈球菌株 所得到之萃取物，尤其是由本發明之菌株所得到之萃取 物。同樣地，這些活性萃取物可用於治療調配物及方法中。 -12- 83654 200400262 方便地由細胞培養 萃取物可利用此項技藝所已知之方法 及離心而獲得。 「治療調配物」係將一適當々 <两又碉配物施予有 體，尤其是易患齲齒之個體；此— 固 球®株或萃取液。通常本發明<、、Α 之鏈 、、 兔又冶療碉配物係由本發明> 唾液鍵球囷株或萃取液及一可接森λα却^ 使及了接文的載體、稀釋劑 形劑組合而成。 ^ Μ 可接受載體、稀釋劑及/或賦形劑」係指將本發明之唾 液鏈球菌株或萃取液傳送給患者之媒劑，此媒劑可與細斗 細胞生存力或萃取液之活性相容。適用作為施予本發明二 存活之唾液鏈球菌減萃#液之可接受載冑已為㈣此技 藝者所熟知。通常適用之載體係為惰性，並可以是固 液態。 於一具體實施例中，該載體為藥學上的可接受之載體。 於本文中，適合與唾液鏈球菌株一起使用之藥學上可^受 載體包含（但不限於），水、緩衝生理食鹽水（如，磷酸鹽^ 衝液）、藥學上可接受培養基（如BACa，胰化酪蛋白大呈提 養液酵母粹取物碳酸鈣瓊脂）、或其他維持此菌生存能力之 溶液。此外，該等藥學上可接受載體可以是水性或非水性 溶液、懸浮液及乳液。各種適用於活的或低壓乾燥細菌之 口服投藥之藥學上可接受載體已為此項技藝所熟知（例如 參照 Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th ed·，Gennaro 等人，1990, Mack Publishing Co·，Easton，Pd.，該案以引用 方式併入本文中；及醫藥組合物，L ACTINEX™，一市隹、 83654 -13 - 200400262 π 服投藥活乳酸菌調配物）。此項技藝中已知之合適固態載 體包括（但不限於）’例如碳酸鎂、硬脂酸鎂、纖維素、滑石； 如果糖、蔑糖、甘露醇、乳糖之糖類；澱粉、麵粉和脫脂 奶粉，以及類似之食用粉劑。施予萃取物之載體同樣地已 為吾人所知。 典型之稀釋劑之時例有：澱粉、乳糖、甘露醇、高嶺土、 磷酸鈣或硫酸鹽；氯化鈉之無機鹽及粉狀糖或纖維素' 本組合物亦可包含例如錠型輔助劑（tableting aids)、樹 脂、填充劍、黏合劑、潤滑劑、溶劑、流動劑、崩散/ 防腐劑、緩衝劑、調味料、色素、增甜劑、芳香劑等較適 宜之賦形劑。具有較佳之錠劑流動性及相容性之賦形劑為

Pr〇s〇lv™(Penwest，紐約，美國）。較佳之增甜劑為異^芽 糖。 典型之黏合劑包括澱粉、明膠，類如乳糖、果糖及葡萄 糖之糖類及其類似物。天然及合成之膠亦相當方便，其7 括金合歡、藻酸鹽、甲基纖維素、聚乙晞吡咯烷酮、西= 耆膠及其類似物。聚乙二醇、乙基纖維素及臘，亦可作= 黏合劑。現今之黏合劑以Em(JexTM (penwe λ 較佳。 、，丑、心美國) 用於防止於製造過程中黏上染劑之潤滑劑包含滑溜之古 態物；如滑石、矽石、硬脂酸鎂及鈣、聚乙二醇、硬脂 及氫化植物油。 曰’、 崩散劑係可於打濕後膨脹、並分解錠劑、及釋放唾液· 球菌或萃取物之物質。崩散劑包含澱粉、黏土、纖維素/ 83654 -14- 200400262 =膠、或樹膠；特別是玉米或馬鈐薯澱粉、甲基纖維素、 瓊脂、皂土、木質纖維素、陽離子交換樹脂、海藻酸、瓜 爾豆膠、柑橘果膠、羚甲基纖維素、粉狀海绵、及十二烷 基硫酸鈉。 本發明之唾液鏈球菌或萃取物可調配成任何—種適用於 口服投藥之組合物。例如，此唾液鏈球菌株之施予可由唾 液鏈球菌培養物所製成之低壓冷凍乾燥劑或細胞糊配製而 成；或者可直接施予口腔内。此菌株或萃取物亦可以洗口 水、漱口藥、牙膏、π腔喷劑、錠劑、糖漿、牙線、口香 糖、或嚼錠等形式（但不限於）施予。 治療調配物可包括食物、舐劑、或飲料。一具體實施例 中之$物或飲料係以乳製品為基礎，其包括優路乳、起司' 牛乳、奶粉、牛奶餅乾、及調味乳。舐劑之調配物可以是 口香糖，如WO 00/05 972所描述。一較佳之調配物係將本發 明之唾液鏈球菌經冷凍乾燥後，以類似之前公開之比非德 氏（Bifidus)奶粉製法（Nagawa 等人（1988) ; J· Dairy Sci 71· 1777-1782)，使用於奶粉配方中。 一唾液鏈球菌之口服調配物係將經冷凍乾燥之唾液鍵球 菌株與調味脫脂奶粉或類似物混合，以提昇其風味。 目前本發明之較隹之唾液鏈球菌或萃取物之口服調配物 為錠劑、嚼錠、或膠囊。其中尤以錠劑為佳。依據本發明 之可吸吮錠劑包含一本發明之唾液鏈球菌株或萃取物、1 麥芽糖、及糊精。此錠劑可用直接壓縮、濕式粒化、或乾 式粒化之方式製作。此錠劑可根據已知之醫藥學技藝加以 -15- 83654 200400262 包衣。 此外，此治療調配物可含有營養物以維持細菌於此調配 物中之存活力。由以上得之，在不危及其效用下，此調配 物亦可含有調味劑、色素、芳香劑、或其他可增添此組合 物風味、及/或提昇個體服用意願之化合物。製造口服調配物 之方法已為此項技藝所熟知（如參照Remint〇n，s Sciences，18th ed.，該案已以引用方式併入此文）。 作為一般柷微生物劑使用時，調配物亦可製成其他方式 之投藥之形式’包括局部投藥之調配物（但不限於此）。 之觔所討論之K12及其活性萃取物同樣地可用上述之方 法製備’包括如上述之組合物及調配物。 此外，本發明之調配物及組合物可進一步包含一或多項 <第二抗菌劑。例如，這些辅助劑可以是抗生素，或其他 杬菌剑或產生制菌物之微生物。例如，有用的抗菌物包括 =酸鏈球菌肽及其他BUS。較佳的第二抗菌劑為bus或製 = BUS之微生物。該BLIS可以是一或多種之唾液鏈球菌素 ^ 1八2及B。其他柷菌之微生物包括已知之唾液鏈球 菌，如K12及K30。 、、本=明〈唾液鏈球菌株主要存在於舌頭表面。其與生長 ::牙囷斑〈唾夜鏈球菌(如上述之T〇VE_R)組合可以很有 本發明足凋配物及組合物可包含其他抗齲齒劑， ，】如木糖醇、氟化物、馬盧卡蜂蜜及單寧。 、麟齒〈冶療万面可將本發明之唾液鏈球菌株或萃取物 83654 -16- 200400262 施予任何易患齲齒之個體；通常被突變鏈球菌或Ms侵殖入 口腔之個體，其齲齒產生之原因至少有一部份為突變鏈球 菌，但以MS更為嚴重。 本文所使用之術浯「個體」在包括（但不限於），人、馬、 狗、貓、豬、綿羊、牛、及山羊。該個體以人為較佳。此 唾液鏈球菌株可施予任何年齡之個體，如幼年時期、青春 期、或成年期。 本發明之唾液鏈球菌或K12可有多種口服形式。例如上述 之組合物或調配物之形式，或如懸浮液、持續釋放配方（例 如一含有唾液鏈球菌株之口腔移植）或低壓冷凍乾燥粉 劑。唾液鏈球菌株之施予亦可將低壓冷凍乾燥粉劑、培養 物、或細胞糊直接塗敷於個體之牙齒或舌頭上。只要能將 治療調配物送至口腔内，任何施予形式皆適用。一具=實 施例之投藥方式係將唾液鏈球菌或萃取物直接塗敷於個^ 之牙齒上，例如經由刷牙或以牙線剔牙。 通常施予個體之唾液鏈球Μ量為可有效取代引起麟嵩之 MS菌株，或至少為宿主口腔中突變鍵球菌之劑量。「有效 取代:丨起麟鸯之MS菌株’或至少為宿主口腔中突變鏈球菌 (劑里」係指可有效地殖居於口腔中，並明顯降低引起類 齒固有之唾液鏈耗或MS菌株之唾液鏈球菌株量（例如藉 由細菌間對養分之競爭及或經由麵料 BLIS)。 ，衣 κ Φ存户：：用《術5吾「早位劑I」在本發明之治療調配物 中係心通合個體之單位劑量；每一單位包含經計算，可達 83654 -17 - 200400262 所欲之療效預定量之活性物質，及與其結合所需之稀釋 劑、載體、或賦形劑。 — 明確的劑量會因不同個體之變數，包括體型、體重、年 齡、疾病嚴重程度（如引起齲齒之固有MS之動性及/或數 量）、及對治療之反應（例如個體口腔對於菌落之敏感度）而 有所不同。決定適當之施予途徑及劑量之方法可以是消費 者認為週當的方式，或由牙醫或其他臨床醫生視情形而 足。這樣的診斷係本技藝中常慣用程序（參照例如，Remingt〇n，s

Ph_aceutical Science，8th ed.，Gen臟〇, ed·，pubHshing

Company，Easton，Pa·，1990) 〇 通常施予個體之唾液鏈球菌數量約在1〇2至i〇15細菌之 間，並以約1〇3至1〇14細菌較佳，以約1〇5至1〇丨2細菌更佳； 每-劑量正常約有w至，之集落形成單位（cfu)。一鏡劑 調配物使用3.8 X 109 CFU/ml。 為達到口腔菌落化及取代固有的造成鱗歯之⑽菌株，特 別疋大交鏈球菌’彳以施予個體多次劑量之唾液鏈球菌。 施予患者之唾液鏈球菌或萃取物可能只需要—次或重複數 次。重複之治療可以是—個月—次，一星期一;欠，一天一 次’ 一天兩次’或其他所需要之次數。方便地，投藥之進 行可以當作患者例行之口腔保健之-部份，❹，作成錠 劑、口香糖、牙膏、牙線、或漱口水中的成分。 為了促進集落化，本發明 ^ 、、 &月中一具體貫施例之處理方式包 括一預刖處理之準備步驟 驟使個體口腔中之正常微生物群 齲齒之生物體)至少得以降低。此預前處理包含施 83654 •18- 200400262 予例如（但不限於此）氯己定、乳酸過氧化酶、綠茶、或鳳梨 汁（經冷凍乾燥）之抗微生物劑；或可遵循抗生素處方例如盤 尼西林、紅黴素 '或阿莫西林施予該個體。繼而將本發明 之唾液鏈球菌或唾液鏈球菌K12施予此已縮小密度之環 境’使其恢復原有之密度。 目前較佳之齲齒治療流程包含以氯己定凝膠刷牙2至5 天’較佳為3天，之預前處理。於使用凝膠後1至4小時（以2 小時較佳）再施予一錠劑。隨後，當天每隔1至4小時（以每2 J時較佳）再施丁 2至5鍵劑（以3鍵較佳）。持續此流程2至4 天以促進集落化。每天於刷牙後服用1、2、或3錠劑（通常i 土 2叙劑）以維持療效。此療法所需之時間乃視需要而定。 、個體口腔中唾液鏈球菌株集落化之成功與否，可藉由培 養該個體π腔内之細菌及辨別鏈球菌之菌種加以確認，例 如以是否製造BLIS或其他此技藝所熟知之菌株辨別方式。 士本發明之方法及用途可進—步包含—或多項之辅助抗菌 劑’及/或如上述之抗韻齒劑。 本專利說明書中所使用之「包厶 4七如、士丄 、 匕。」一同需解讀為所指定 又特徵、整體事物、相關之步驟^八、 %次成分又存在；但不排除 一或多項其他特徵、整體事物、相 叛,、士 士 ★相關<步驟、及其成分或 群組 < 存在或增添。 万式引用下列實驗闡明。 本發明之各項範疇將以不限定 f驗 檢定

Mia菌株係由健康的成人受試者之 口腔 中隔離出來。其生 83654 -19- 200400262 長於37°C，5% C〇2，緩症涎瓊脂中時典型之唾液鏈球菌之 形態如下： 菌落形狀及大小：圓形，直徑1 -2 mm 邊界（邊緣）：完整（平滑） 正面形狀：凸狀 顏色：藍色 組織：黏液狀 以血液瓊脂[哥倫比亞基礎瓊脂（GIBCO)加5%人類血液] 培養於37X：，5% (：02時，其不溶血，並表現以下形態： 菌落形狀及大小：圓形，直徑<1 mm 邊界（邊緣）：完整（平滑） 正面形狀：凸狀 顏色：白色 組織：黏液狀 當培養於血液瓊脂或胰化酪蛋白-大豆培養液（BBL)加以 0.1%碳酸鈣補充之1.5%戴維斯瓊脂時，此細菌之生長顯得 比大部份之唾液鏈球菌更牢固地附著在瓊脂表面。該菌株 於API 20 Strep辨識代碼為5050451 ;其與唾液鏈球菌相符 合（98.4%相似度）。 將16si*RNA與GENEBANK基因庫比對，證實此菌株即為 唾液鏈球菌（99.9%相似度）。 生化特性 唾液鏈球菌MIA之生化特性係利用API 20 Strep試驗組 (bioM0rieux)及 API 5 0 CH (bioMSrieux)測出；此測試使石岌水 -20- 83654 200400262 化合物代謝之研究得以進行。 API 2 0 Strep之測試結果如下： 丙酮之產生 陽性 水解作用 陰性 β-葡萄苷酶 陽性 吡咯烷酮芳香醯苯胺酶 陰性 α-半乳糖苷酶 陰性 β-葡萄醛酸糖酶 陰性 β-半乳糖苷酶 陽性 鹼性磷酸酶 陰性 亮胺酸芳香醯苯胺酶 陽性 精胺酸雙水解酶 陰性 核糖 陰性 L-阿拉伯糖 陰性 甘露醇 陰性 山梨醇 陰性 乳糖 陽性 海藻糖 陽性 菊糖 陰性 棉子糖 陽性 澱粉 弱陽性 肝糖 陰性 β-溶血素 陰性 API 50 CH之測試結果如下： 83654 -21 - 200400262 甘油 赤蘚糖醇 D-阿拉伯糖 L -阿拉伯糖 核糖 D-木糖 侧金盞花醇 B-甲基木糖苷 半乳糖 D-葡萄糖 D-果糖 D-甘露糖 L -山梨糖 鼠李糖 半乳糖醇 肌醇 甘露醇 山梨醇 α-甲基甘露醇苷 α-甲基-D-葡萄糖苷 Ν-乙醯基葡萄糖苷 苦杏仁苷 熊果素 七葉靈 陰性 陰性 陰性 陽性（只限於厭氧狀態） 陰性 陰性 陰性 陰性 陽性 陽性 陽性 陽性 陰性 ’ 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陰性 陽性（只限於厭氧狀態） 陽性 陽性 陽性 陽性 -22- 83654 200400262 水楊苷 陽性 纖維雙糖 陽性 麥芽糖 1%性 乳糖 陽性 蜜二糖 陽性（只限於嗜氧狀態） 蔗糖 陽性 海藻糖 陽性 菊糖 陽性（只限於厭氧狀態） 松三糖 陰性 D-棉實糖 陽性 阿米酮 陽性 肝醣 陽性（只限於厭氧狀態） 木糖醇 陽性（只限於嗜氧狀態） β纖維二糖 陽性 D-吐拉糖 陰性 D -來踩糖 陰性 D-太格糖 陽性（只限於厭氧狀態） D _岩藻糖 陰性 L -岩藻糖 陰性 D-阿拉伯糖醇 陰性 L-阿拉伯糖醇 陰性 葡萄糖酸 陰性 2 ceto-葡萄糖酸 陰性 5 ceto-葡萄糖酸 陰性 83654 200400262 當唾液鏈球菌MI A培養於克莉絲汀娜尿素瓊脂時，呈尿 素陽性反應。 抑制活性 BLIS活性之延緩拮抗測試 當依據Tagg與Bannister之延緩拮抗測試，以血液為基礎 瓊脂培養基，哥倫比亞基礎瓊脂（GIBC〇)+〇.l% CaC〇3+5% 人類血液（BACa)，測試類細菌素抑制物質（BUS)之產生時， 發現Mia菌株之P-type為677。 唾液鏈球菌MIA之P-型 製造者典型（P-型）係描述細菌在對抗一組標準指示劑時 之抗微生物活性。此步驟最早係由心卯與Bannister (L ΜΜ.

Microbiol· 1979; 12: 397-411)所描述。 將唾液鏈球菌MIA培養於，5% c〇2，血液瓊脂添加 0.1%碳酸料板、或姨化路蛋白大豆酵母萃取物碳酸㈣ 脂（胰化路蛋白大豆培養液，30 g;酵母萃取物，2〇 g;碳 酸趟，2.5g;瓊脂，15g;蒸餘水，1〇〇〇_中18小時以 進行IMyping。之後，將其生長物移除，並將此平板表面以 鼠仿進行殺菌。再將9個指示菌株交又接種，再培養於Π 传Μ小時後，即發現生長已被抑制。此抑制模式 示菌株視為3組三重複，再以代碼方 :第 2，r4，i5，i6，i7’i8，)〇_“』 ;:、Λ二、或第三部份，給予其菌株呈現陽性反應 個刀： 。若沒有抑制作用則為零分。因此，各 個三重複之總分可獨特地指出抗3個指示株之反應=整= 83654 -24- 200400262 P-type代碼則寫成3個數字的順序，其連續地說明此3個三重 複中抗指示株之反應。 唾液鏈球菌株MIA於血液瓊脂添加碳酸鈣中有一 677 P-型，於胰化酪蛋白大豆酵母萃取物碳酸鈣瓊脂中為777 P-型。 這相當於9個指示株中，除了第3指示菌株外之，全有抑 制作用。此模式，如20P3菌株，為產生唾液鏈球菌素A之唾 液鏈球菌之典型模式（Ross等人，Appl. Envir· Microbiol. 1993; 59; 2014)。然而，當培養於胰化酪蛋白大豆培養液 (BBL)添加戴維斯瓊脂（1.5%)添加0.25% CaC03添加酵母萃 取物（2%) [TSBCaYE]時，其P-型為777 (也就是9個指示株全 部抑制）。此外，當作為測試指標時，另有抗多種其他細菌 (表1)之活性與此增強之抗第三指示菌株活性相關連。 表1 : Mia株於BACa及TSCaYE培養基上之抗微生物活性 細菌 以下列培養基 BACa 測試時之易感性 TSBCaYE 產芽胞梭菌 + + 產氣莢膜梭菌 + + 黏放線菌 丁 14 + + M100 + + 内氏放線菌 10301 + + 表兄鏈球菌 OMZ176 - 1 突變鏈球菌 ATCC10449 - + OMZ175 - + 633K - + H7 - + 13M -- + E49 - + -25- 83654 200400262 K58 - + K60 - + M46 - + MUTI - + MUTII - + 重白喉棒狀桿菌 - + 糞腸球菌 98 - + 鶉難腸球菌 9790 - + 無乳鏈球菌 211B + + P3 + + 乳房鏈球菌 14 + + D618 + + 短乳桿菌 - + 乾酪乳桿菌 - + 嗜酸乳桿菌 + + 肺炎鏈球菌 PK2 + + PK34 + + 黏膜炎莫氏菌 4 - + K - + 單核細胞增生李斯特菌 10403 + + 215 + + Stomatococcus mucilagenosus Coup + + 淋病奈瑟困 - + 腦膜炎奈瑟菌 - + 乳糖奈瑟菌 - + 流行感冒鳴血桿菌 30 - + 37 - + 腐生葡萄球菌 7292 _ + 科氏葡萄球菌 20260 - + 抗唾液鏈球菌活性之延緩拮抗測試測試 製造唾液鏈球菌素a2菌株其抗突變鏈球菌之抑制活性係 利用延緩拮抗測試（基本上如Tagg &Bannister[J.Med. Microbiol. 1979; 12: 397])所確立。簡言之，將直徑1 cm寬 -26- 83654 200400262 义各個製造者菌株之劃線培養物接種至含有或不含有酵母 卒取物添加物之TSBCa及BACa培養基中。在培養於37。(：之 厭養環境24小時後，將此肉眼可見之細胞生長物以破璃載 玻片移除，並將殘留於瓊脂表面之細胞曝露於氯仿中3〇分 4里將其殺此。隨後將瓊脂表面通風3 0分鐘，並以棉花棒 將已培養於陶德海威培養液（THB) 18小時之指示株，以與 原未旦、’泉培養物主十字的方向接種至平板上。在培養於3 7 〇c ，5% (v/v) C〇2 18小時後，將各個指示株之抑制擴展度記 錄下來。 TSBCaYE 培養基（每 50〇 ml)

胰化落蛋白大豆培養液 戴維斯瓊脂 酵母萃取物（Difco) CaCO, BACaYE 培養基（每 50〇 哥倫比亞血液基礎瓊脂（Difco) 2

CaC03 π ^ 0·5 ί 酵母萃取物（Difco) 1〇 其結果如表2所示。 83654 27- 200400262

Mia Mia Mia Mia K丨12 Κ：丨 12 Κ：丨 12 Κ：丨 12 Α2+Β Α2

Bana BaCaYE TSBna TSBnaYE Bana BaCaYE TSBna TSBnaYE +++ +++ ++ +++ ++ +++ ++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ + ++ +++ ++ ++ + ++ 津^^^蘇廢择||Μ4» 麒莽 ♦ i♦參；& ATCnOMZ 斤51 10449 175

13M + ++ + ++ ++ + + ++ + ++ ++ + ++ + i+ ++ ++ ++ + + ++ + ++ + ++ K：丨 56 θαΝο2-46 MutI Mus >2 :私^^^^^#^^~BACa^TSBCaJl^^^M^Bf-^^^^^MIA^K:-12^^^^^ 槔酿~vrb韙 83654 -28 - 200400262 果如表3所示。 表3 ·· Mia菌株於唾液中所產生之抑制活性 補充物 純唾液 0 Μ 〇 Μ，Cy 0 Μ，Ca 2 Cy，Ca 0 M，Cy，Ca 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 2 0 4 OMZ175 Mutll 0 0 0 0 0 2 唾液鏈球菌於活體内抗MS之活性 0 0 0 0 0 0 受試者在第一天以2。/。氯己定凝膠刷牙2分鐘，2小時候吸 吮一含有3.8 X 109集落形成單位之唾液鏈球菌mia之藥 片；之後每隔2小時再服用一藥片，共3藥片。實驗對象於 此試驗期所剩下之25天中以市售之牙膏於早晚刷牙後各吸 吮一藥片。 對知、組之文忒者於頭3天每天一次以2%氯己定凝膠清潔 牙齒，Π77在其餘時間則以市售牙膏刷牙。 於試驗開始前、及試驗期間每隔一段時間收集所有受試 者s唾液樣本，以鑑定MS之數量（菌落形成單位每毫升唾 液）。將唾液樣本以經過殺菌之生理食鹽水稀釋，並以螺旋 狀移種至突變選擇性瓊脂上；然後將平板培養於37。0之厭 氧¥境2天。鑑足服用藥片之受試者其唾液樣本中唾液鏈球 菌株MI A之數量。將稀釋過之唾液樣本以螺旋狀移種至緩 症/延瓊〗曰上，將此平板於37°C，5°/。C02培養1 8至24小時； 83654 -30- 200400262 然後清點唾液鍵球菌之集落數目。使用下列之私序判定唾 液鏈球菌MI A之集落百分比。分別將藤黃微球菌及突變鏈 球菌OMZ1 75中新生之THB培養物分散於血液瓊脂/鈣培養 基上。再將唾液鏈球菌之集落以牙籤挖至2組不同的平板 中。將平板於37°C，5% C02培養18至24小時。2組平板中之 唾液鏈球菌MI A皆會於插入培養之周圍產生抑制區塊。集 落百分比之判定係將陽性集落數目除以挖起之菌落總數。 對照組（表4)及菌落化（表5)之受試者在以2%氯己定凝膠 刷牙之後，其MS數量皆降低至17至2·4個對數值。對照組 雙試者在以凝膠刷牙1至6天後，其MS細胞計數增加至預前 處理之層次；實驗組受試者在以凝膠預前處理後達1〇〇%菌 洛化，且於剩下之測試期間維持高度的菌落化（表5)。在所 剩之27天中MS之數量仍為丨.7個對數值低於未處理前之層 次。這顯示以唾液鏈球菌MIA移植具有預防大量ms重新定

居的能力。 表4 ·: 時間(天) 預前處理 83654 -31- 200400262 表5 ··唾液鏈球菌MIA對於MS之菌落效應 時間(天） 唾液鏈球菌MIA之菌落 % MS之數量(cfli/每ml唾液） 預前處理 0 5.8 X 1〇4 1 2.5 X 102 2 1.0 X 102 3 4.0 X 102 6 100 2.0 X 102 13 98 2.0 X 102 16 100 6.0 xlO2 20 100 8.0 xlO2 23 95 2.6 x 103 27 100 1.0 χ 103 抗MS活性萃取物之製備 將一百毫升含酵母萃取物2。/。及0.25%碳酸鈣之已溶胰化 酪蛋白大豆瓊脂倒入1 L之血清瓶。將一毫升經隔夜培養之 唾液鏈球菌（培養於空氣中37°C，5% C02陶德海威培養液） 加入瓶中。將此培養物培養於37°C，厭氧狀態，18至24小 時。將一百毫升含酵母萃取物2%及0.25%碳酸鈣之胰化酪 蛋白大豆培養液加入瓶中（此培養液需預先於厭氧狀態回 溫）。再將此培養物培養於37°C，厭氧狀態，24小時。將此 培養液離心以移除細菌細胞，再加入5〇% (w/v)之硫酸銨， 並於4°C培養1 8小時。再將此樣本離心，並將沈澱物以i ml 之二次水重新懸浮。之後在血液瓊脂平板中以孔隙擴散分 析法測試此樣本之抗MS活性。將50 μΐ之此樣本加入各個孔 /同中’並將其風乾。再將此平板以氣仿處理。將指示株之 隔夜培養物在此平板上推勻，並在空氣中以37艺，5% 培養18至24小時。 -32- 83654 200400262 將對抗所有指示株之抑制區塊（孔洞邊緣至細胞生長被 抑制邊緣之距離）記錄下來（表6)。 表6 ·唾液鏈球菌μια萃取物之孔隙擴散分析 指示株 抑制區塊(mm) 藤黃微球菌丁 18 12 咽峽炎鏈球菌T29 2 突變鏈球菌H7 2 突變鏈球菌10449 3 突變鏈球菌Mutll 2 突變鏈球菌OMZ175 2 劑型實例 錠劑 成分 唾液鏈球菌 異麥芽糖 糊精ΤΜ 每945 mg之錠劑 3·8 X 109 CFU (已冷凍乾燥） 600 mg 150 mg

ProSolv HD™ 50 mg 硬脂酸鎮 1 5 mg 調味料 10 mg 所有成分係經過混合，以乾式壓縮製成錠。 工業應用 上列之結果證明唾液鏈球菌株之抗菌效果，特別是 株之抗微生物（尤其是對鏈球菌）之廣效性。這些菌株係第一 個被鑑定出具有抗]VI s，特別是抗突變鏈球菌活性，之可製 造BLIS之唾液鏈球菌。因此，這些菌株及其相關萃取物可 被應用於治療方法中，以幫助治療鏈球菌感染對個體（特別 -33- 83654 200400262 是於口腔中）所造成之有害影響。這些方法包括治療主要由 MS或突變鏈球菌索所起之齲齒。本發明之唾液鏈球菌及組 合物亦可應用於治療口臭及咽喉痛。 應了解，僅以實例之方式提供以上之描述，且各種熟諳 此技藝者所熟知之物質和技術亦可使用。 34- 83654

Claims (1)

1. 200400262 拾、申請專利範圍： 1. 一種生物學上純種培養之唾液鏈球菌株，其為唾液鏈球 菌素A2生產者，並具有抗MS之活性；但其非唾液鏈球菌 株 K12。 2. —種生物學上純種培養之唾液鏈球菌株，其為唾液鍵球 菌素A2生產者，並具有抗MS之活性，且其後水化合物之 代謝對於至少一項之L-阿拉伯糖、菊糖、肝糖、木糖醇、 及β -龍膽一糖之利用’或β -半乳糖菩酶之產生，具有促進 作用；及/或對於至少一項之甘油、甲基木糖醇替之 利用，或鹼性磷酸酶之產生，具有抑制作用。 3. 如申請專利第1項之生物學純種培養物，其中該菌株分別 有助於L-阿拉伯糖、菊糖、肝糖、木糖醇、及卜龍膽二糖 之利用，或β-半乳糖苷酶之產生；及/或會分別抑制甘油、 α-甲基-D-木糖醇芬之利用，或驗性鱗酸酶之產生。 4· 一種置存於 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH，Mascheroder Weg 1 b，D-38124， 布郎什威克，德國·序號DSM 14685之生物學上純種培養 唾液鏈球菌株Mia，或具有其辨別特性之培養物。 5· —種由可產生唾液鏈球菌素八2之唾液鏈球菌取得之萃取 物，其具有抗MS之活性。 6·如申請專利第5項之萃取物，其具有抗突變鏈球菌之活 性。 7 ·如申請專利第5或6項之萃取物，其可由如申請專利第i至 4項任一項中之唾液键球菌取得。 83654 200400262 8. 如申請專利第5或6項之萃取物，其可由唾液鏈球菌κΐ2取 得。 9. 一種抗菌組合物，其包含如申請專利第丨至4項任一項中 之唾液鏈球菌，或如申請專利第5或6項之萃取物。 1〇· —種治療調配物，包含如申請專利第丨至4項任一項中之 垂液鏈球菌’或如申請專利第5或6項之萃取物及稀釋 劑、載體、及/或賦形劑。 11 ·如申請專利第9項之組合物，其更進一步包含一或多種之 弟二抗菌劑。 12·如申請專利第11項之組合物，其中該第二抗菌劑係選自 乳酸鏈球菌素、BLIS、以及製造BLIS之微生物。 1〇·如申請專利第12項之組合物，其中該]5]118係為一或多種 選自唾液鏈球菌素A、A!、Α2及Β之BLIS。 14.如申請專利第12項之組合物，其中該產生BLIS之微生物 為Κ12及/或Κ30。 1 5 ·如申凊專利第9項之組合物，其更進一步包含一種或更多 之第二抗致癌劑。 16·如申請專利第15項之組合物，其中該第二抗致癌劑係選 自木糖鮮、馬盧卡蜂蜜、及丹寧。 1 7 •口申請專利第9項之組合物，其係為口服投藥之組合物。 •如申請專利第9項之組合物，其中該組合物包含於食品或 飲料中。 9·如申請專利第18項之組合物，其中該食物或飲料係以乳 氣阳為基礎之食品或飲料。 83654 200400262 20·如申請專利第19項之組合物，其中該食物或飲料為奶 粉、牛奶餅乾、牛奶、調味乳、優赂乳、或起司。 21·如申請專利第9項之組合物，其中該組合物為藥劑、鍵 劑、或糖劑之形式。 2 2 ·如申請專利第21項之組合物’其為鍵劑形式。 2 3 ·如申請專利第2 1項之組合物，其存在於漱口水、洗口水、 牙膏、糖聚、口腔噴劑、口香糖、或錠劑。 24.如專利申請第17至23項任一項中之組合物，其為單位劑 型。 25·如專利申請第24項之組合物，其每一劑量含有1 〇5至 1〇12 CFU之唾液鏈球菌，較佳為109至l〇1G CFU。 26. 如申請專利第1〇項之調配物，其更進一步包含一或多種 之弟二抗菌劑。 27. 如申請專利第26項之調配物，其中該第二抗菌劑係選自 乳酸鏈球菌素、BUS、及產生BUS之微生物。 28. 如申請專利第27項之調配物，其中該BUS係為一或多種 選自唾液鏈球菌素A、Ai、A2、及B之BLIS。 29·如申請專利第27項之調配物，其中該產生BLIS之微生物 為K12及/或K30。 30·如申請專利第1〇項之調配物，其更進一步包含一或多種 之弟一抗致癌劑。 3 1.如申請專利第3 0項之調配物，其中該第二抗致癌劑係選 自木糖醇、馬盧卡蜂蜜、及丹寧中選出。 32·如申請專利第10項之調配物，其係為口服投藥之調配物。 83654 200400262 3 3.如申請專利第1〇項之調配物，其中該調配物係包含於食 品或飲料中。 34·如申請專利第33項之調配物，其中該食品或飲料係以乳 製品為基礎之食品或飲料。 j 5 ·如申請專利第34項之調配物，其中該食物或飲料為奶 粉、牛奶餅乾、牛奶、調味乳、優酪乳、或起司。 3 6.如申請專利第1〇項之調配物，其中該調配物為藥錠、錠 劑、或糖劑之形式。 3 7·如申請專利第36項之調配物，其為錠劑形式。 3 8·如申請專利第36項之調配物，其存在於洗口水、漱口水、 牙膏、糖漿、口腔噴劑、膠囊、牙線、口香糖、或錠劑 中。 39·如申請專利第32至第38任何一項之調配物，其為單位劑 型。 40·如申請專利第39項之調配物，其每一劑量含有約1〇5至 1〇12 CFU之唾液鏈球菌，較佳為1〇9至1〇i〇 CFU。 41 · 一種可至少抑制對如申請專利第1至第4項任一項中之唾 液鏈球菌敏感之細菌生長之方法，該方法包括將敏感性 細菌與抑制有效量之如申請專利第1至第4項任一項中之 唾液鏈球菌、如申請專利第5或6項之萃取物，或如申請 專利第9或1 0項之組合物或調配物接觸。 42. 如申請專利第41項之方法，其中該敏感性細菌為ms。 43. 如申請專利第42項之方法，其中該敏感性細菌為突變鏈 球菌。 83654 200400262 44· 一種至少可抑制^^或突變鏈球菌生長之方法，該方法包 括將MS或突變鏈球菌與抑制有效量之下列物質接觸： (1)如申請專利第！至6項，及第9至1〇項任一項中之嗓 液鏈球菌萃取物組合物或調配物；或 (η)唾液鏈球菌K12、或其抗-MS或抗突變鏈球菌之涪性 卒取物、或一包含K12或其活性萃取物之組合物或 45· —種治療至少部分係由突變鏈球菌所引起之齲齒之醫藥 調配物，其包含有效量的： (0如申請專利第1至4項任一項中之唾液鏈球菌，或如 申晴專利第5至6項之粹取物；或者 (ii)唾液鏈球菌K12或其抗突變鏈球菌之活性粹取物 以抑制個體口腔中之突變鏈球菌生長。 46. —種控制齲齒發生率或嚴重度之醫藥組合物，包括齲齒 控制量之如中請專利第丨至4項任—項中之唾液鏈球菌= 粹取物，或如申請專利第5至6項之粹取物。 其中該齲齒係由MS所 引起。

   萃取物。 4 7 ·如申請專利第4 6項之醫藥組合物 引起。

   部分投梁。 49·如 唾： 83654 200400262 50·如申請專利第41至44項任一項中之方法，其中該唾液鏈 球菌或萃取物係以如申請專利第9或1 0項之組合物或調 配物之方式投藥。 5 1.如申請專利第41至44項任一項中之方法，其包括前治療 之準備步騾，以至少降低已存在於個體中之正常微生物 群0 52·如申請專利第5丨項之方法，其中該前治療係使用一抗微 生物劑或抗生素施行。 53. 如申請專利第52項之方法，其中該抗微生物劑為氯己定。 54. —種控制齲齒發生率或嚴重度之醫藥組合物，包括： (a) —可降低包含引起齲齒之生物體之正常微生物群 之有效量的抗生素或抗微生物劑；及 (b) 如申請專利第丨至4項任一項中之唾液鏈球菌。 55. 如申請專利第丨至4項任一項中之唾液鏈球菌，或如_請 專利第5或6項之萃取物之用途，作為製備用於抑制對如 申請專利第1至4項任一項中之唾液鏈球菌敏感之細菌生 長之組合物或調配物。 56. 如申請專利第丨至4項任一項中之唾液鏈球菌、或如申請 專利第5或第6項之萃取物、或K12'或其抗突變鏈球菌Z 活性萃取物之用途，作為製備用Μ㈣變鏈球細菌生 長之組合物或調配物。 之唾液鏈球菌、或如 5 7 · —種如申請專利第1至4項任一項中 申請專利第5或6項之萃取物、或Kl2、或其抗突變 〈活性萃取物’作為製備用於至少抑制ms細菌生長之組 83654 200400262 合物或調配物之用途。 5 8. —種如申請專利第1至第4頊任一項中之唾液鏈球菌、或 如申請專利第5或6項之萃取物、或K1 2、或其抗突變鏈球 菌之活性萃取物’作為製備用於預防上或治療上治療由 突變鏈球菌引起之識齒之組合物或調配物之用途。 5 9 _如申請專利第5 8項之用途，其中該識齒係由MS引起。 6〇· —種如申請專利第1至4項任一項中之唾液鏈球菌、戈士 申請專利第5或第6項之萃取物，作為製備用於抑制對^ 申凊專利第1至4項任一項中之唾液鏈球菌敏感之細# 、’、_ 生 長之組合物或調配物之用途。 83654 200400262 柒、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為··第（）圖。 (二) 本代表圖之元件代表符號簡單說明： 捌、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式： 83654